张玲玲[1]（2012）在《尖吻蝮蛇舌形虫若虫诊断抗原分析及cDNA文库的构建、筛选和表达评价》文中提出人舌形虫病是由蠕虫样舌形虫引起的一种罕见人兽共患寄生虫病,主要分布于非洲、东南亚等国家和地区,人因误食舌形虫虫卵或含有感染性若虫的动物内脏而感染,我国的病例主要报道于浙江、广东、山东、台湾等省市,致病虫种主要为锯齿舌状虫、尖吻蝮蛇舌形虫、串珠状蛇舌状虫、台湾孔头舌状虫。目前,诊断方法主要是基于形态学、组织病理学及放射线检查,同时结合临床表现、流行病史进行的综合诊断,而相关血清学、分子生物学检测方法的研究较少,这常常造成临床上的误诊与漏诊,因此,亟待发展快速有效的舌形虫病体外诊断试剂,而诊断抗原是研发诊断试剂的关键,基因重组抗原又是诊断抗原的重要来源之一。基于此,本研究欲以尖吻蝮蛇舌形虫若虫为材料,通过对尖吻蝮蛇舌形虫若虫粗抗原以及尖吻蝮蛇舌形虫若虫cDNA文库的构建、免疫筛选、重组蛋白的表达等研究,以期获得有价值的诊断抗原。本研究以尖吻蝮蛇舌形虫若虫为材料,采用反复冻融法制备粗抗原,并分析粗抗原的蛋白组成、免疫特性及在舌形虫病诊断中的诊断效果；同时采用Gateway技术构建尖吻蝮蛇舌形虫若虫cDNA入门文库和表达文库,应用感染小鼠混合血清免疫筛选cDNA表达文库,并对筛选到的基因进行同源性比对和生物信息学分析；最后对所筛选到的阳性克隆进行诱导表达、纯化,并应用ELISA方法评价重组蛋白用于检测小鼠血清的诊断效果。结果发现,尖吻蝮蛇舌形虫若虫粗抗原经SDS-PAGE和Western Blot分析,可见9条主带和13条次带（Mr16-150kDa）,其中有16条特异性条带被感染小鼠血清识别,5条特异性条带被舌形虫病人血清识别,与肺吸虫病、鞭虫病病人血清在约Mr34kDa处出现较微弱的交叉反应带,同其余寄生虫病病人血清未出现交叉反应带。以尖吻蝮蛇舌形虫若虫粗抗原作为包被抗原,应用ELISA方法检测舌形虫病病人、感染小鼠、正常人和其它寄生虫病病人血清的敏感性和特异性均为100%。本研究采用Gateway技术首次成功构建了尖吻蝮蛇舌形虫若虫的cDNA入门文库和表达文库,经检测,cDNA入门文库的平均滴度为1.45×105cfii/ml,库总容量为1.74×106cfu,重组率为100%,平均插入片段大小约为1.4kb,插入片段范围为0.2-4.0kb；表达文库的库总容量可达105cfu,平均插入片段大小为1.0kb,插入片段范围为0.3-2.2kb。用感染小鼠混合血清免疫筛选cDNA表达文库,初筛共获取21个阳性克隆,选取其中的7个阳性克隆（编号分别为S1、S5、A1、D1、F1、P1、P5）进行分析,测序后利用NCBI中的blastn程序对其进行同源性比对,在舌形虫物种内未发现同源性较高的基因,表明这7个序列均为尖吻蝮蛇舌形虫的新基因,其中D1同茶足柄瘤蚜茧蜂的USDA-FP185181基因同源性较高,可达77%；利用NCBI中的blastx程序分析,发现S1、S5、A1、D1、F1、P1、P5分别与冈比亚按蚊的AGAP004551-PA蛋白、斑点钝眼蜱的假定蛋白、体虱的collagen alpha-1, IV, chain precursor蛋白、熊蜂的40Sribosomal protein S5a-like蛋白、赤拟谷盗的CG8092CG8092-PA蛋白、以色列黑鳄背蝎的putative protein kinase C inhibitor、赤拟谷盗的ribosomal proteinL19e有27%、45%、56%、86%、30%、61%、86%的相似性。对7个阳性克隆中的4个克隆（A1、D1、P1、P5）进行重组表达、纯化,采用ELISA方法评价重组蛋白检测小鼠血清的敏感性分别为100%、100%、85%、100%,特异性分别为95%、90%、100%、95%。综上所述,本研究以尖吻蝮蛇舌形虫若虫为材料,制备的粗抗原应用于ELISA方法检测尖吻蝮蛇舌形虫病具有较好的诊断效果；利用Gateway技术构建的尖吻蝮蛇舌形虫若虫cDNA入门文库和表达文库,为后续舌形虫遗传学研究提供了丰富的研究材料,同时为进一步克隆和分离有应用价值的基因、筛选免疫诊断靶抗原奠定了基础；通过对cDNA文库的免疫筛选,获得7个强阳性克隆,均为尖吻蝮蛇舌形虫的新基因,对A1、D1、P1、P5四个阳性克隆进行重组表达、纯化及评价,表明4个重组蛋白用于检测小鼠血清均具有较好的敏感性和特异性,但其应用于人舌形虫病的检测仍需进一步研究。
卢艳[2]（2012）在《日本血吸虫诊断抗原的筛选、鉴定及初步评价》文中认为血吸虫病是一种严重危害人类健康和阻碍流行区社会经济发展的寄生虫病。诊断是确定感染的有效手段,在防治工作中处于重要位置。无论从个体水平确定药物化疗的对象、考核化疗的效果,还是在群体水平监测血吸虫病疫情的变化、考核血吸虫病防治效果和评估流行趋势等等,均需要以诊断结果作为评判依据之一。传统的病原学方法是诊断血吸虫病最为可靠和经典的途径,但费时、费力且敏感性不高,难以适应大规模现场防治的需求。免疫学诊断方法具有较高的敏感性、特异性和实用性等优点,在血吸虫病的监测、防治以及疗效考核等方面具有广泛的应用价值。诊断抗原的筛选和鉴定不仅是免疫学诊断研究的核心内容,并且是建立免疫学诊断方法的基础。本研究利用吡喹酮治疗前后日本血吸虫病人血清分别筛选成虫、虫卵的cDNA表达文库,寻找可用于日本血吸虫病检测或疗效考核的潜在靶点,初步筛选获得了120个阳性克隆。结合阳性克隆的反应强度、分类和插入片段的大小,将所获的17个阳性克隆的插入片段进行测序,对其DNA序列进行生物信息学分析。根据序列分析的结果,选择了10个目的基因片段进行表达,利用生物信息学软件分析编码蛋白的性质并预测其功能。以阳性克隆SJA4-6、SJA6-5、SJE18-4、SJE20-4、SJE22-1、SJE22-4、SJE28-2和SJE28-6为模板,成功构建了10个含有目的基因的重组质粒（GST tag）,重组质粒转化大肠杆菌BL21菌株,经IPTG诱导后获得了9种融合表达的重组蛋白。其中5个重组蛋白含有可溶性表达组分,4个重组蛋白为包涵体。利用亲和层析的方法对含有重组蛋白的菌体裂解液进行纯化,获得了4种纯度较高的重组蛋白,分别为rSjP1、rSjP2、rSjWSC1P和rSjEFCAB。采用免疫学方法初步评估了所获重组蛋白的免疫诊断价值,以rSjP1、rSjWSC1P和rSjEFCAB为包被抗原的间接ELISA方法可明显区分日本血吸虫病人混合血清和正常人混合血清,病人血清反应的OD值（P）均达到正常人的（N）2.1倍以上,其中重组蛋白rSjEFCAB的P/N值达到3.9,表明该蛋白具有良好的应用前景。建立了以rSjWSC1P和rSjEFCAB作为包被抗原的间接ELISA方法。该方法检测日本血吸虫病人的敏感性分别为72%（36/50）、74%（37/50）；检测非流行区正常人的假阳性率为0-3.3%（0/30-1/30）；与并殖吸虫病人无交叉反应,与囊虫病人、旋毛虫病人的交叉反应率分别为10%（1/10）和11%（1/9）,与华支睾吸虫病人的交叉反应率分别为0（0/5）和20%（1/5）。研究结果表明该方法具有较高的敏感性和特异性,重组蛋白rSjWSC1P和rSjEFCAB是日本血吸虫病潜在的诊断抗原。同时,本研究还采用免疫沉淀反应分离血吸虫病人血清中的循环抗原,利用质谱和生物信息学软件分析循环抗原的蛋白序列,寻找高丰度的循环抗原分子。鉴于禽类与哺乳类动物的遗传距离较远,来源于禽类的抗体不易发生交叉反应,本研究制备和纯化了抗血吸虫成虫抗原的卵黄抗体（IgY）,并建立了基于免疫沉淀反应（以IgY抗体做为捕捉系统）和蛋白质组学技术鉴定日本血吸虫循环抗原的方法。应用该方法从日本血吸虫病人血清中富集循环抗原,鉴定出7种蛋白组分,为循环抗原的深入研究提供了新的途径；同时为发展基于IgY和循环抗原的血吸虫病早期诊断或疗效考核方法奠定了基础。本研究为日本血吸虫病检测或疗效考核诊断抗原的筛选、鉴定以及发展相应的诊断技术提供了新的科学依据。
王素娟[3]（2010）在《日本血吸虫SJCHGC06868蛋白的研究》文中研究说明血吸虫病是一种世界性分布的严重危害人畜健康的寄生虫病。日本血吸虫是寄生于人体的五种人体血吸虫中的一种,它感染人畜等哺乳动物从而引发的日本血吸虫病主要流行于中国和其他东亚国家,迄今为止仍是我国重要的公共卫生问题之一。东方田鼠是日本血吸虫的非适宜宿主,具有天然抗日本血吸虫的能力。研究东方田鼠抗性相关的日本血吸虫靶基因,对发现血吸虫病治疗药物靶标和侯选疫苗抗原具有参考意义。本实验室用东方田鼠血清、肝脏以及肺脏等组织筛选日本血吸虫噬菌体cDNA展示文库,获得多个有效阳性克隆。本项研究对东方田鼠肝脏裂解物筛选获得的部分噬菌体展示抗原进行免疫预防效果评估,对其中能诱导较高保护效果的SJCHGC06868蛋白编码基因开展了克隆、表达、重组蛋白疫苗和DNA疫苗免疫预防效果评估、RNA干扰等研究。1、以东方田鼠肝脏裂解物筛选日本血吸虫噬菌体展示cDNA文库获得的1号、2号、4号和5号阳性噬菌体克隆免疫小鼠,评估免疫预防效果。结果显示1号和4号噬菌体克隆具有较好的免疫保护效果。与噬菌体对照组相比,1号和分别获得了28.23%减虫率和51.73%肝脏减卵率,4号克隆分别获得了24.28%减虫率和45.52%,有显着差异（P<0.05）。1号克隆展示的EST是日本血吸虫蛋白SJCHGC06713部分编码序列,该日本血吸虫蛋白编码序列经BLASTX,发现与多种生物的焦磷酸酶/磷酸二酯酶蛋白有较高同源性,经CDD分析也发现该蛋白序列含有此家族蛋白的保守结构域。4号克隆展示EST是日本血吸虫SJCHGC06868部分编码序列。2、2、参照GeneBank登录的日本血吸虫SJCHGC06868蛋白编码基因的部分序列（登录号:AY809313）设计因物,用PCR技术克隆其中的492bp（54-546）cDNA片段,然后定向插入到质粒pET-32a多克隆位点区域,构建原核表达体系。获得的重组蛋白为可溶性蛋白,大小约为36KD,可用His柱进行纯化,纯化蛋白得率约为58.3mg/L。以重组蛋白为免疫源进行动物免疫预防效果评估。与佐剂对照组和PBS对照组相比,重组蛋白免疫组获得31.63%、29.19%减虫率和55.63%、56.27%肝脏减卵率,ELISA试验表明免疫组产生了较高的抗体水平。3、将日本血吸虫SJCHGC06868蛋白编码基因中的492bp片段亚克隆到真核质粒pVAX1多克隆位点区域,构建真核表达表达质粒pVAX1-SJCHGC。以pVAX1-SJCHGC为免疫源进行免疫预防效果评估。Westernblot分析显示SJCHGC06868蛋白在小鼠注射部位的肌肉中获得表达,表达产物分子量18 KD;攻击感染试验显示,与空质粒组和空白组相比,免疫组获得了19.67%、21.96%减虫率和58.39%、58.76%肝脏减卵率;机理分析显示,免疫组小鼠产生了较高的抗体水平,CD4/CD8比值相对减少,IL-2、IL-4等细胞因子水平显着提高,说明重组真核质粒pVAX1-SJCHGC诱导小鼠产生了有效的CTL反应4、应用荧光实时定量PCR技术分析日本血吸虫SJCHGC06868蛋白编码基因在不同期别虫体的mRNA表达水平,结果显示此编码基因在从童虫到成虫的各期虫体中均有表达,但以14d童虫的表达量较高。设计合成了三条带修饰小干扰RNA分子,并在体外培养的童虫中开展RNA干扰实验。荧光实时定量分析结果显示干扰组SJCHGC06868蛋白编码基因的表达受到明显抑制,与空白对照组相比,siRNA1-4、siRNA2-244、siRNA-2-327干扰组的抑制率分别为32.6%、37.2%、44.9%;显微观察显示干扰组虫体活力减弱、存活率降低,体外干扰6天后,siRNA1-4、siRNA2-244、siRNA-2-327干扰组虫体存活率分别为61%、54%、51%,显着低于对照组。本项研究首次对日本血吸虫未知蛋白SJCHGC06868的噬菌体展示抗原、重组抗原和DNA疫苗的免疫预防效果进行了评估,证实该蛋白编码基因在日本血吸虫童虫时期高表达且表达抑制可以造成血吸虫死亡,研究结果显示该蛋白及其基因在抗血吸虫疫苗和治疗药物研究中具有较大研究价值。
宋震宇[4]（2009）在《东方田鼠抗血吸虫抗性相关靶基因（血清筛选）的研究》文中研究说明血吸虫病是世界性分布的、危害最为严重的人畜共患寄生虫病之一。东方田鼠对血吸虫具有天然抗性。探索东方田鼠抗日本血吸虫机理,筛选东方田鼠抗日本血吸虫抗性相关靶基因,对研制抗日本血吸虫疫苗和治疗药物具有重要借鉴意义。刘金明组课题组在前期研究中利用东方田鼠血清筛选日本血吸虫成虫噬菌体展示cDNA文库,获得10个阳性克隆,为寻找其中具有开发成疫苗潜力的抗原编码基因,为研制疫苗创造条件。本文对其中的8个噬菌体克隆的免疫预防效果进行观察,并对具有较高保护效果的锌指蛋白编码基因进行克隆、表达和重组蛋白免疫预防效果的研究。以8个噬菌体克隆单独或联合免疫BALB/c小鼠,和空白对照组相比,展示日本血吸虫锌指蛋白的1号噬菌体克隆免疫组在两次实验中分别获得了32.10%和31.25%的减虫率、61.14%和47.31%的肝脏减卵率,虫体合抱率分别由92.59%、57.39%下降到69.09%、41.03%;其它噬菌体克隆单独免疫组或联合免疫组在第一次实验中获得了8.02%-32.72%的减虫率和40.19%-69.53%的减卵率,但在第二次实验中未能得到验证。以RT-PCR技术从血吸虫成虫mRNA中成功克隆日本血吸虫锌指蛋白编码基因（我们将其命名为Sjznf1）的全长ORF序列,其ORF全长1014bp,编码337个氨基酸,与GenBank登陆号为AY222909和EZ000159的日本血吸虫锌指蛋白基因序列比对,核苷酸同源性分别为99.7%和99.4%;氨基酸序列同源性分别为99.4%和98.5%。其中含有一个锌指蛋白结构域。将该全长序列连接到pGEX-4T-2表达载体上,构建重组表达质粒并用大肠杆菌BL21表达,经IPTG诱导,获得表达产物为63 KDa的融合蛋白。应用重组蛋白免疫BALB/c小鼠,获得了54.62%的减虫率和75.39%的肝脏减卵率。本研究首次通过实验验证日本血吸虫环型锌指蛋白编码基因的表达产物具有良好的免疫预防效果。研究结果提示日本血吸虫环型锌指蛋白编码基因在疫苗方面具有重要研究价值。
李勉[5]（2009）在《18日龄日本血吸虫酵母双杂交cDNA文库的构建及抱雌沟蛋白相互作用因子的筛选》文中认为日本血吸虫病（Schistosomiasis japonica）是我国一种危害严重的人畜共患寄生虫病。在我国流行的血吸虫病主要是由日本血吸虫病中国大陆株引起。发育成熟的雌虫产生的大量虫卵是引起日本血吸虫病很多病理变化的主要原因,另外,排出的虫卵也是该病发生的传染源。如果将已配对的雌虫和雄虫分离,则雌虫将停止产卵并且退化至一种未发育完全的状态,如果重新将其进行配对,则其仍能够继续发育成熟。抱雌沟蛋白（SjGCP:Schistosoma japonicum gynaecophoral canal protein）存在于成虫表面尤其是雄虫表面且只局限于在配对的直接作用部位-抱雌沟进行表达。有趣的是,抱雌沟蛋白的转录表达在雌雄虫配对的同时达到高峰。这表明,抱雌沟蛋白在雌雄虫的相互作用和刺激雌虫发育成熟中发挥着潜在的作用。因此,对抱雌沟蛋白的深入研究对揭露血吸虫成熟的作用机理显得格外重要。基于这个目的,我们构建了18日龄日本血吸虫酵母双杂交cDNA文库并且用抱雌沟蛋白进行初步筛选。18日龄日本血吸虫酵母双杂交cDNA文库的构建：选取日本血吸虫18日龄虫体,用Trizol法提取虫体总RNA,以Oligo（dT）为引物反转录合成一链cDNA,再以5′amplimer和3′amplimer为引物进行LD-PCR扩增,从而得到双链cDNA.将双链cDNA用CHROMA SPINTE-400柱纯化后,用酵母杂交（Yeast mating）方法将其与PGADT7-Rec转化至感受态酵母细胞AH109,二者在酵母细胞中同源组成环形的有复制活性的cDNA文库质粒,收集缺亮氨酸（SD/-Leu）培养板上所有克隆,即为18日龄日本血吸虫酵母双杂交cDNA文库菌。转化子细胞密度大于2×107cells/mL,库容量为2.5×106 pfu/mL,插入的双链cDNA片段的长度在0.25～2.0kb之间,文库重组比率为99%,该文库具有良好的代表性。6对特异性引物均能从文库中钓取到日本血吸虫成虫相关基因。本试验利用酵母双杂交技术成功构建了日本血吸虫18日龄成虫的cDNA文库。应用于酵母双杂交系统的抱雌沟蛋白融合质粒的构建和验证：将编码抱雌沟蛋白的基因的完整的开放阅读框作为靶蛋白基因克隆至pGBKT7质粒去构建重组载体pGBKT7-SjGCP,将pGBKT7-SjGCP转至酵母Y187株的感受态细胞内。自转录活性检测、蛋白表达和毒性检测结果显示SjGCP靶蛋白适用于酵母双杂交系统。抱雌沟蛋白相互作用因子的筛选：用酵母杂交（Yeast Mating）的方法对日本血吸虫18日龄酵母双杂交cDNA文库进行筛选,对所长出的阳性克隆（蓝斑）用反复传代的方法进行筛选,我们得到了330个克隆。对随机挑选出来的5个克隆提取酵母质粒,并用电转化的方法将其分别转至大肠杆菌DH5a株后进行测序分析。我们得到了5个日本血吸虫的EST序列：SJCHGC0566829、SJCHGC09129、SJCHGC 00694、SJCHGC0607和SJCHGC05265,其分别表达日本血吸虫的twinfilin蛋白基因、collagen蛋白基因、HSP60蛋白基因和未知基因。从已拿到序列的5个克隆中随机挑选出3个克隆利用共转化的方法分析其在酵母中的相互作用。
叶春艳[6]（2009）在《华支睾吸虫cDNA文库的构建及其免疫学筛选和EST测序》文中进行了进一步梳理华支睾吸虫病是由于华支睾吸虫寄生在人体或终宿主的肝胆管内引起的一种重要的人兽共患寄生虫病,不但给渔业带来巨大的经济损失,而且也严重影响人类的健康。华支睾吸虫主要在亚洲国家流行,我国也是感染严重国家,据最近一次全国寄生虫流行病学调查数据显示（2004年公布）,全国流行区感染超过1200万。虽然对该病已引起了越来越多的重视,但是对于该寄生虫的功能基因及与宿主的相互作用和人体之间的免疫机制等仍有很多问题没有阐明。构建cDNA文库是大量获得功能基因的好方法,而且也为功能基因的进一步研奠定良好的基础。同时,通过对cDNA表达文库的免疫学筛选,可以有的放矢的获得高反应性基因,为疾病诊断及疫苗研制奠定基础。本研究以吉林流行区月亮泡镇自然感染的狗体内寄生的华支睾吸虫成虫和月亮泡真市场购买的麦穗鱼体内的囊蚴为实验材料,成功构建了成虫和囊蚴的cDNA表达文库,并以自然感染病人血清为探针,对成虫文库进行了免疫学筛选和部分EST测序,筛选到了6个高反应基因,EST测序1000个,获得一个已知序列和156个新基因。这些为该病的诊断、疫苗研制及华支睾吸虫功能基因的研究奠定了基础。
柳建发,汤治元,刘玉新,杨淑娟[7]（2008）在《免疫筛选日本血吸虫cDNA文库的研究进展》文中认为
王欣之[8]（2008）在《日本血吸虫不同发育阶段虫体差异表达基因解析》文中认为血吸虫病人兽共患,分布广泛,危害严重。上世纪90年代,巴西、中国的的科学家分别在曼氏血吸虫和日本血吸虫的基因组测序及注释方面取得重要进展,获得大量有关血吸虫基因组一般生物学意义的大量信息。本研究则针对血吸虫生活史复杂,其生长发育过程中虫体呈现显着的生理学和形态学变化的特点,以在我国流行的日本血吸虫为对象,利用大规模、高通量的基因分离分析技术,开展了不同发育阶段虫体差异表达基因分离、鉴定和解析研究,为从分子水平阐明血吸虫生长发育及其与宿主相互作用的机制建立重要基础,为疫苗和药物研究开拓新途径。主要研究结果概述如下:一、日本血吸虫7d童虫消减cDNA文库的构建及测序分析利用抑制性消减杂交（SSH）技术,以日本血吸虫7天童虫为实验组,42天成虫为驱动组,首次构建了日本血吸虫早期童虫期别差异表达消减cDNA文库。获得的文库重组率为90%,大部分cDNA插入片段在500bp左右。从文库中选取6000个克隆测序,得到5474个ESTs信息,EST大小大多在300-900bp之间,平均长度为571bp。使用在线的PHRED工具对EST进行拼接,得到1764条clusters,包含456个contigs和1306个singletons。所得的Clusters数量约占日本血吸虫基因组的11～8.8%（预计血吸虫表达基因为15000～20000个）。利用半定量PCR验证在童虫消减文库所获呈高表达的四跨膜蛋白（Tetraspanin）、细胞色素氧化酶C （cytochrome C oxidase）、还原型辅酶脱氢酶（NADH dehydrogenase）、热休克蛋白90（HSP90）、可溶性血管内皮细胞生长因子受体（Soluble vascular endothelial cell growth factor receptor）和IBI protein基因在7天童虫和42天成虫中的表达情况,结果显示,这些基因在童虫中的表达量均高于成虫。在日本血吸虫基因组数据库报道的数量有限的童虫期别差异表达基因（156条clusters）也与我们的clusters一致。这都说明本研究构建的童虫消减cDNA文库具有较高的质量。将所得的1764条Clusters与日本血吸虫基因组数据库（http:// function. chgc. sh. cn/ sj-proteome/ index. htm）进行比对,结果显示,65%（1146条）的clusters与已知日本血吸虫基因组序列一致或相似,35% （617条）clusters在日本血吸虫数据库中未见报道,约占日本血吸虫基因组的4.1%到3%。将617条日本血吸虫数据库无匹配的clusters与曼氏血吸虫数据库（http://www.sanger.ac.uk/Projects/Smansoni/）进行比对,结果显示仅有92条clusters与曼氏血吸虫同源,525条clusters在曼氏血吸虫中也未见报道。把与已知血吸虫数据库均无同源的clusters与NCBI的Nr数据库（http:// www. ncbi. nlm. nih. gov/ blast/ Blast. cgi）比对,有211条clusters和数据库无任何同源性,提示他们可能是血吸虫特有的新基因。利用生物信息学技术对1764个clusters的初步分析表明虽然只有约7.5%的cluster可查询获知其功能,但显示这些clusters都具有重要生物学意义。对所有功能明确的基因进行go分类,结果显示,所占比例最大的三类分别为:代谢进程（Metabolic process）相关分子,占31%;调节生物进程（Regulation of biological process ）相关分子,占12%,胚胎发育（Embryonic development）相关分子,占11%。通过与秀丽杆线虫同源性比对进行KEGG信号通路分析,表明有175条clusters参与到糖酵解（Glycolysis）、氨基酸代谢（Amino acid metabolism）、花生四烯酸代谢（Arachidonicacid metabolism）、嘌呤代谢（Purine metabolism）等代谢途径和细胞通讯（Cell Communication）、泛素生物合成（Ubiquinone biosynthesis）、尿素循环（Urea cycle）、氧化磷酸化（Oxidative phosphorylation）、磷酸戊糖途径（Pentose phosphate pathway）、碳固定（Carbon fixation）、蛋白酶体（Proteasome）、泛素调节的蛋白质降解（Ubiquitin mediated proteolysis）等25条信号通路中。值得一提的是,参与抗寄生虫药物丙体六氯苯降解途径（gamma-Hexachlorocyclohexane degradation）中的重要基因之一dehydrogenase与文库中chgcnewcontig406基因同源;对维持日本血吸虫在宿主血管内的生存极为重要的血管内皮细胞生长因子受体（soluble vascular endothelial cell growthor receptor）也在差异表达基因中出现。二、日本血吸虫不同发育阶段差异表达基因研究为分析日本血吸虫不同发育阶段差异表达基因状况,将5000个日本血吸虫cDNA克隆（4000个来自7d童虫消减cDNA文库的克隆和1000个来自尾蚴、雌雄虫、成虫和虫卵消减cDNA文库的克隆）定制cDNA芯片,每个克隆在芯片上重复点样3次。以7d虫体cDNA为对照,分别和日本血吸虫6个不同发育阶段（7d,13d,18d,23d,32d,42d）和42d雌虫、42d雄虫cDNA进行双通道杂交,每个阶段的样本做3次生物学重复。对每个基因杂交得到的9个杂交信号值（ratio值）用SAM软件进行分析,假阳性率（FDR）控制在5%以内,再以2倍标准筛选差异表达基因。7d虫体样本的自身杂交结果说明芯片平台可靠。再选择18个芯片杂交显示差异表达基因进行real time PCR验证,结果和芯片结果基本相符。芯片杂交结果归纳如下:1.发现了一批不同发育阶段差异表达的基因。芯片杂交结果显示,和7d虫体相比,13d虫体差异表达克隆有34个,代表22个基因,其中上调基因4个,下调基因18个,未知基因2个;18d虫体差异表达克隆有238个,代表123个基因,其中上调基因86个,下调基因37个,未知基因9个;23d虫体差异表达克隆有244个,代表136个基因,其中上调基因47个,下调基因89个,未知基因7个;32d虫体差异表达克隆有186个,代表99个基因,其中上调基因46个,下调基因53个,未知基因7个;42d虫体差异表达克隆有158个,代表95个基因,其中上调基因54个,下调基因41个,未知基因4个;42 d雌虫差异表达克隆有671个,代表基因262个,其中上调基因54个,下调基因208个基因,31个未知基因;42d雄虫差异表达克隆有171个,代表115个基因,其中上调基因94个,下调基因21个,未知基因8个。2.聚类分析表明差异基因主要归为9类变化趋势。这9类基因的变化进行深入分析可能可发现一些与虫体发育过程中生物学变化特点相关的信息或线索。go的功能分析显示,合抱前虫体（13天,18天）的差异表达基因参与转录调节活性（transcription regulator activity）,代谢（metabolism）,结合（binding）,蛋白水解（proteolysis）相关;而合抱之后的虫体（23天以后）差异表达基因,除了与代谢（metabolism）,转录调节活性（transcription regulator activity）,生物合成（biosynthesis）等基本的生物学功能之外,出现较多的是与有性生殖（sexual reproduction）,配子发育（gametogenesis）,生殖（reproduction）,产卵（oviposition）等相关的基因。这些特点的出现正和日本血吸虫发育特征相符合。23天之后的虫体处于雌雄虫合抱、性成熟,生殖产卵阶段。3.尽管目前大部分血吸虫基因都没有明确注释,对在本研究所发现的一些已知功能的差异表达基因进行功能分析发现他们在血吸虫生长发育过程中具有重要功能。一些已经得到公认的疫苗候选分子如谷胱苷肽S转移酶（glutathione S-transferase）,Sj23（23 kDa integral membrane protein ）,Ca2+结合蛋白（calcium binding protein）,四跨膜蛋白（ tetraspanin TE736）,sm20,参与重要信号通路的RAS相关蛋白,参与PKC信号通路的蛋白,一氧化氮合成酶蛋白抑制剂（neuronal nitric oxidse synthase protein inhibitor）,丝苏氨酸蛋白酶抑制剂等在本研究中也被证实在不同发育阶段呈差异表达。这也提示,血吸虫差异表达基因包括一些功能不明确的差异表达基因,都具有深入研究的价值。三、日本血吸虫新基因sj-fibrillin和sj-COG8全长cDNA的克隆与分析选择两个来自7d童虫消减cDNA文库中与数据库中已知基因无同源的日本血吸虫EST:SSH52.D11和SSH33.A7进行克隆和生物信息学分析。根据SSH52.D11的EST序列,利用RACE技术扩增得到全长2251bp的cDNA序列,含有完整ORF,大小为2058bp,编码685个氨基酸,理论分子量为79519.9,等电点为5.22。用Interpro程序（http://www.ebi.ac.uk/Interproscan）对SWISS-PROT数据库进行检索,发现该蛋白含有多个表皮生长因子功能域（EGF like domain）和表皮生长因子样钙结合位点（EGF-like calcium-binding site）,与Fibrillin蛋白家族的特点相符合（Timpl et al.,2003）,推测其属于结构蛋白Fibrillin家族,命名为sj-fibrillin。经查询表明,该基因为日本血吸虫新基因,Genbank登录号分别为1067183（08年6月公开）。分别提取7d,13d,23d,42d的虫体总RNA,选择tublin作为内参,利用荧光定量PCR法对该基因在日本血吸虫不同发育阶段虫体中的表达情况进行实验验证,结果表明该基因在7d童虫的表达量最高。选取人homo（Genebank登录号1335064）,小鼠mus musculus（Genebank登录号118136302）,光滑爪蟾Xenopus laevis（Genebank Accession number 83628282）等12个物种的fibrillin蛋白进行进化树分析,结果显示日本血吸虫的fibrillin蛋白在进化上与小鼠最接近。对该基因编码蛋白的三级结构预测表明和人的fibrillin蛋白结构相似。该基因编码的蛋白作为细胞骨架蛋白Fibrillin基因在童虫时期高表达,可能与童虫快速生长,旺盛的细胞分化有关。根据SSH33.A7的EST序列,利用RACE技术扩增得到全长2505bp的序列,含有完整的ORF,大小为2160bp,编码719个氨基酸,理论分子量为85160.4,等电点为5.03。经查询,该基因为日本血吸虫新基因,Genbank登录号为EU131676.1。分别提取7d,42d的虫体总RNA,选择tublin作为内参,利用荧光定量PCR法检测表明,该基因在童虫中的表达量高于在成虫中的表达量。利用NCBI的CDD程序（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml）对该蛋白的保守结构域进行搜索,结果显示该蛋白含有高尔基体寡居蛋白组分8（COG8）的保守结构域Dor1。选取人Homo sapiens （GeneBank登录号21166361）,小鼠Mus musculus（GeneBank登录号66392581）,斑马鱼Danio rerio（GeneBank登录号61806582）等8个物种的COG8蛋白,进行保守结构域的分析和比较。并使用最大简约法（MP）绘制进化树进行分析。结果显示,该基因编码的蛋白属于寡聚蛋白家族,并与寡聚蛋白组分8（COG8）相似,推测该基因编码日本血吸虫高尔基体寡聚蛋白组分8,命名为Sj-COG8。COG蛋白是果蝇精子发育中的重要蛋白,与动物性腺发育相关。该蛋白在日本血吸虫童虫时期高表达可能在虫体性别发育中发挥重要作用。综上,本研究首次构建了日本血吸虫早期童虫期别差异表达cDNA消减文库,发现了一批早期童虫差异表达基因、不同生长发育阶段虫体差异表达基因及日本血吸虫新基因的信息;分析显示一批在日本血吸虫不同生长发育阶段差异表达的基因在血吸虫生长发育中具有重要功能。克隆鉴定了sj-fibrillin和sj-COG8两个童虫期高表达的日本血吸虫新基因。本文结果既丰富了日本血吸虫基因组学的研究,更为分离、鉴定血吸虫生长发育关键分子、为从分子水平阐明血吸虫生长发育机制及血吸虫与宿主相互作用的机制提供了重要基础,为抗血吸虫病疫苗和新治疗药物的研制开发开拓了新途径和新思路。
孙焕[9]（2008）在《东方田鼠抗日本血吸虫相关靶基因的筛选、克隆和表达》文中指出血吸虫病是世界性分布的、危害最为严重的人畜共患寄生虫病之一。东方田鼠对血吸虫具有天然抗性。探索东方田鼠抗日本血吸虫机理,筛选东方田鼠抗日本血吸虫抗性相关基因或靶基因,对研制抗日本血吸虫疫苗和治疗药物具有重要借鉴意义。本研究首先比较东方田鼠组织器官/裂解物及血清、灭活血清对体外培养日本血吸虫童虫的杀伤效果,然后选用杀伤力较高的肝脏和肺脏裂解物分别亲和淘洗筛选日本血吸虫成虫（Sj44d）噬菌体展示cDNA文库,对获得的部分阳性克隆进行序列测定、生物信息学分析、免疫保护效果评估、全长序列的克隆和表达。1、将东方田鼠肝脏裂解物、肺脏裂解物、脾脏裂解物、肌肉裂解物、血清和灭活血清分别与日本血吸虫机械断尾童虫在体外共培养,在培22h,童虫死亡率分别为33.51%、36.33%、3.92%、16.31%、27.06%和29.32%;在培养48h,童虫死亡率分别为83.07%、69.25%、28.34%、35.91%、86.14%和83.14%。研究结果显示,除已有报道东方田鼠血清对体外培养血吸虫具有较高的杀伤作用外,本研究发现肺脏、肝脏作为血吸虫移行、发育的承载器官,其组织裂解物对血吸虫也表现显着的杀伤作用引人注目,对深入探究东方田鼠抗日本血吸虫机理有重要意义。2、用肝脏裂解物和肺脏裂解物分别筛选日本血吸虫成虫（Sj44d）噬菌体展示cDNA文库,经过三轮筛选后,随机挑取168个噬菌体克隆进行序列测定及生物信息学分析,获得了32条有效展示的EST序列,其中22条EST序列与已知血吸虫基因或表达序列标签同源,1条EST序列与其他物种基因同源,为新的血吸虫表达序列标签,9条EST序列与已知基因或表达序列标签均无同源性,为新的表达序列标签。对23条具有同源序列知识背景的EST序列的功能分析结果显示,上述EST及其编码蛋白的功能主要与血吸虫基因表达调控及蛋白质加工修饰相关。研究结果提示,东方田鼠直接或间接地影响血吸虫基因表达,使其发育畸形和延迟,为深入揭示东方田鼠天然抗血吸虫特性的分子机理提供重要基础。3、将肝脏裂解物筛选获得的除卵壳蛋白外的所有阳性噬菌体克隆进行组合后分别免疫BalB/c鼠,最高获得了32.90%的减虫率,33.33%的减雌率,95.49%的粪便减卵率,87.41%的肝脏减卵率。ELISA检测结果显示,各免疫组均产生了较高的抗血吸虫成虫可溶性抗原的特异性抗体。结果表明,本研究筛选获得的大多EST序列可为挖掘抗日本血吸虫疫苗候选抗原或药物靶标提供重要资源。4、根据筛选获得的EST序列和生物信息学分析结果,以PCR和SMART RACE技术克隆其中部分基因的全长ORF序列,共克隆了2条可能的东方田鼠抗性相关靶基因的全长ORF序列,其基因功能分别与磷酸二酯酶活性和核糖体结构组成相关。成功构建了一个全长ORF序列的重组表达质粒并在大肠杆菌中成功表达,表达产物的分子量分别为19.4kD,具有重要的学术价值和应用潜力。本论文研究发现东方田鼠肝脏、肺脏裂解物具有显着杀伤作用,首次应用东方田鼠肝脏和肺脏裂解物筛选东方田鼠抗性相关的血吸虫靶基因,获得一批具有深入研究价值的靶分子、EST序列及全长cDNA,对探索东方田鼠抗日本血吸虫的分子机理、开拓抗血吸虫疫苗和药物研究新途径具有重要意义。
李林[10]（2008）在《Sj31/32kD天然分子疫苗编码基因的鉴定及其特异性单链抗体的筛选》文中研究指明业已证明,日本血吸虫31/32kDa天然分子抗原,不仅是一种优势诊断抗原,可用于免疫诊断,同时也具有较好的抗雌虫生殖免疫的效果。为了对Sj31/32kDa分子抗原进一步深入分析,我们采用蛋白质组学研究技术,我们建立了日本血吸虫成虫可溶性抗原二维电泳图谱。对Sj31/32kDa附近的蛋白质斑点进行肽指纹图谱、质谱分析,在Sj31/32kDa附近获得了3个同源性较高的蛋白质斑点（11,20,23号）,分别与日本血吸虫-3-磷酸甘油脱氢酶（Glyceraldehyde-3-phosphate）、曼氏血吸虫组织蛋白酶B内肽酶（Cathepsin B endopeptidase）、曼氏血吸虫肌动蛋白-2（Actine-2）相匹配。有报道表明,血吸虫组织蛋白酶B内肽酶参与对宿主血红蛋白的降解,与血吸虫的生长发育有关,具有潜在的血吸虫病疫苗价值。目前国内外尚未见对该基因研究的相关报道。研究目的确定日本血吸虫组织蛋白酶B内肽酶（SjCB）是否能作为抗血吸虫病天然分子基因疫苗的靶标,及其在血吸虫体内是否有期特异性,获得针对日本血吸虫组织蛋白酶B内肽酶的特异性单链抗体,为抗血吸虫病天然分子候选疫苗编码基因的筛选及重组优势抗原诊断血吸虫病的研究奠定基础。研究方法1.收集尾蚴感染后32d的日本血吸虫成虫,制备成虫可溶性蛋白,经一维电泳、固相pH梯度双向凝胶电泳分离,选取31/2kDa附近的蛋白点进行质谱分析鉴定,凝胶图像分析软件对结果进行处理。2.以血吸虫cDNA文库为模板,设计引物扩增得到目的基因,亚克隆至pcDNA3.0载体;以成虫和尾蚴真核重组质粒分别免疫小鼠,观察其免疫保护性效果。3.将目的基因亚克隆至pQE30载体,将重组质粒转化至感受态大肠杆菌M15,IPTG诱导表达融合蛋白,并进行SDS-PAGE和Western blot分析。His-tag标签柱亲和纯化融合蛋白。4.用日本血吸虫成虫可溶性抗原（AWA）免疫BALB/C小鼠,提取小鼠脾脏RNA,RT-PCR法扩增得到全套VH和VL基因,经重叠PCR法扩增得到scFv片段,将scFv片段克隆至pCANTAB5E载体,电转化至感受态大肠杆菌TG1,经辅助噬菌体M13K07拯救,即获得日本血吸虫成虫可溶性抗原表面呈现单链抗体库。以纯化的目的融合蛋白为靶抗原,分别筛选成虫可溶性抗原单链抗体库和UV-致弱尾蚴单链抗体库,以获得相应的特异性单链抗体。研究结果1.二维电泳结果显示Sj31/32kDa附近有13个蛋白点,经MALDI-TOF-MS鉴定及分析,发现3个蛋白分子分别与曼氏血吸虫Actine-2,日本血吸虫3磷酸甘油脱氢酶,曼氏血吸虫组织蛋白酶B内肽酶有高度的同源性。2.真核重组质粒成虫pcDNA3.0/SjCB和尾蚴pcDNA3.0/SjCB得以成功构建,限制性双酶切、PCR鉴定及核苷酸测序结果显示二者基因序列具有99%的同源性;动物实验结果表明重组质粒成虫pcDNA3.0/SjCB免疫组的减虫率为38.99%,每雌减卵率为34.45%,每克肠道减卵率为40.18%,每克肝脏减卵率为43.24%;重组质粒尾蚴pcDNA3.0/SjCB免疫组的减虫率为38.36%,每雌减卵率为41.00%,每克肠道减卵率为39.30%,每克肝脏减卵率为44.87%,与对照组比较有显着差异（P＜0.05）。而重组质粒成虫pcDNA3.0/SjCB组和尾蚴pcDNA3.0/SjCB组减虫率和减卵率无显着差异（P＞0.05）。3.原核重组质粒成虫pQE30/SjCB和尾蚴pQE30/SjCB得以成功构建,限制性双酶切、PCR鉴定及核苷酸测序结果显示融合蛋白表达正确,并得以有效纯化。分别被成虫可溶性粗抗原免疫血清和UV-致弱尾蚴免疫血清识别,而不被正常鼠血清识别。4.构建了日本血吸虫成虫可溶性抗原单链抗体库,库容为4.3×108,重组率为90%,且BstNI酶切图谱呈多样性,初步筛选出了针对成虫pQE30/SjCB和尾蚴pQE30/SjCB表达的融合蛋白的特异性重组噬菌体。结论1.成功构建了成虫pcDNA3.0/SjCB和尾蚴pcDNA3.0/SjCB真核重组质粒以及成虫pQE30/SjCB和尾蚴pQE30/SjCB原核重组质粒,成虫及尾蚴SjCB基因序列无差异;原核重组蛋白具有很好的免疫反应性。2.动物实验结果表明,成虫pcDNA3.0/SjCB和尾蚴pcDNA3.0/SjCB真核重组质粒免疫小鼠后,能诱导产生部分抗日本血吸虫免疫的保护力,证明了日本血吸虫组织蛋白酶B内肽酶是抗日本血吸虫病有效的候选分子之一。3.成功构建了日本血吸虫成虫可溶性抗原单链抗体库,为抗日本血吸虫病天然分子候选疫苗编码基因的筛选及重组优势抗原用于血吸虫病诊断的研究奠定了基础。
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
| 目录 |
| 中英文全称及缩写对照 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 技术路线 |
| 第一部分 尖吻蝮蛇舌形虫若虫粗抗原的制备、组分分析及诊断效果的观察 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1.材料 |
| 2.试剂与仪器 |
| 3.方法 |
| 4.结果 |
| 5.讨论 |
| 第二部分 基于Gateway技术的尖吻蝮蛇舌形虫若虫cDNA文库的构建 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1.材料 |
| 2.试剂与仪器 |
| 3.方法 |
| 4.结果 |
| 5.讨论 |
| 第三部分 尖吻蝮蛇舌形虫若虫cDNA文库的免疫筛选 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1.材料 |
| 2.试剂与仪器 |
| 3.方法 |
| 4.结果 |
| 5.讨论 |
| 第四部分 阳性克隆的原核表达、纯化及诊断价值的初步评价 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1.材料 |
| 2.试剂与仪器 |
| 3.方法 |
| 4.结果 |
| 5,讨论 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 致谢 |
| 附录1 硕士期间论文发表、专利申请情况 |
| 附录2 登录GenBank的序列信息 |
| 附件 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 前言 |
| 1.1 血吸虫及血吸虫病 |
| 1.2 血吸虫的种类及分布 |
| 1.3 日本血吸虫的形态与生活史 |
| 1.4 血吸虫病的发病机制 |
| 1.4.1 血吸虫尾蚴所致的损害 |
| 1.4.2 血吸虫童虫所致的损害 |
| 1.4.3 血吸虫成虫所致的损害 |
| 1.4.4 血吸虫虫卵所致的损害 |
| 1.5 血吸虫病免疫诊断方法的研究进展 |
| 1.5.1 酶联免疫吸附试验(ELISA) |
| 1.5.2 酶联免疫印迹技术(ELIB) |
| 1.5.3 胶体染料试纸条法(DDIA) |
| 1.5.4 斑点金免疫渗滤法(DIGFA) |
| 1.5.5 免疫传感技术 |
| 1.6 血吸虫病免疫诊断抗原的研究进展 |
| 1.6.1 天然抗原 |
| 1.6.2 组分抗原 |
| 1.6.3 重组抗原 |
| 1.6.4 模拟抗原 |
| 1.6.5 循环抗原 |
| 1.7 小结 |
| 1.8 选题的目的、意义 |
| 1.9 实验设计方案 |
| 第2章 日本血吸虫cDNA表达文库的筛选 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 cDNA表达文库 |
| 2.2.2 血清 |
| 2.2.3 菌株 |
| 2.2.4 主要试剂与仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 筛库血清的处理 |
| 2.3.2 λZAPⅡcDNA表达文库的免疫筛选 |
| 2.3.3 阳性噬菌体删除环化为pBluscript重组质粒 |
| 2.3.4 pBluescript重组质粒的提取、鉴定 |
| 2.3.5 序列分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 cDNA表达文库的免疫学筛选 |
| 2.4.2 阳性噬菌体删除环化为pBluescript重组质粒 |
| 2.4.3 pBluescript重组质粒的提取、鉴定 |
| 2.4.4 序列分析 |
| 2.5 讨论 |
| 第3章 日本血吸虫抗原基因的克隆、表达 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 阳性克隆 |
| 3.2.2 载体与菌株 |
| 3.2.3 主要试剂与仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 表达载体的构建及鉴定 |
| 3.3.2 重组质粒在大肠杆菌中的表达和鉴定 |
| 3.3.3 重组蛋白溶解性鉴定 |
| 3.3.4 重组蛋白表达条件的优化 |
| 3.3.5 重组蛋白的纯化 |
| 3.3.6 重组蛋白浓度测定 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 表达载体的构建及鉴定 |
| 3.4.2 重组质粒在大肠杆菌中的表达和鉴定 |
| 3.4.3 重组蛋白溶解性的鉴定 |
| 3.4.4 重组蛋白的纯化 |
| 3.4.5 重组蛋白浓度测定 |
| 3.5 讨论 |
| 第4章 日本血吸虫4种重组蛋白诊断价值的初步评价 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 重组蛋白 |
| 4.2.2 血清 |
| 4.2.3 主要试剂和仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 间接ELISA试验条件的优化 |
| 4.3.2 间接ELISA方法检测血清抗体的敏感性试验 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 间接ELISA试验条件优化 |
| 4.4.2 间接ELISA方法检测血清抗体的敏感性 |
| 4.4.3 间接ELISA方法检测血清抗体的特异性 |
| 4.5 讨论 |
| 第5章 日本血吸虫循环抗原的富集、鉴定 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 实验动物 |
| 5.2.2 寄生虫 |
| 5.2.3 血清 |
| 5.2.4 主要试剂和仪器 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 日本血吸虫成虫的收集 |
| 5.3.2 成虫抗原的制备 |
| 5.3.3 抗成虫抗原IgY抗体的制备 |
| 5.3.4 IgY抗体的分离、纯化 |
| 5.3.5 IgY抗体效价的测定 |
| 5.3.6 IgY抗体的Western Blotting分析 |
| 5.3.7 免疫沉淀反应 |
| 5.3.8 循环抗原的质谱鉴定分析 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.4.1 成虫抗原的制备 |
| 5.4.2 IgY抗体的制备、纯化 |
| 5.4.3 IgY抗体的效价 |
| 5.4.4 IgY抗体的Western Blotting结果 |
| 5.4.5 免疫沉淀反应 |
| 5.4.6 质谱鉴定结果 |
| 5.5 讨论 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 发表论文及申请专利 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 日本血吸虫生活史及流行病学 |
| 1.1.1 日本血吸虫的生活史 |
| 1.1.2 日本血吸虫病的流行病学特点 |
| 1.2 东方田鼠天然抗日本血吸虫能力 |
| 1.2.1 东方田鼠天然抗日本血吸虫现象 |
| 1.2.2 东方田鼠天然抗日本血吸虫抗性机制的研究进展 |
| 1.3 噬菌体展示抗原 |
| 1.3.1 噬菌体展示技术 |
| 1.3.2 噬菌体展示系统 |
| 1.3.3 噬菌体展示cDNA 文库 |
| 1.3.4 噬菌体展示抗原 |
| 1.4 我国日本血吸虫病防治现状和发展战略 |
| 1.4.1 防治现状 |
| 1.4.2 发展战略 |
| 第二章 东方田鼠肝脏裂解物筛选日本血吸虫噬菌体文库展示抗原的免疫预防效果评估 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 噬菌体滴度测定 |
| 2.2.2 免疫保护效果 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 日本血吸虫 SJCHGC06868 基因的原核表达以及免疫保护效果评估 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 重组蛋白原核表达及纯化 |
| 3.2.2 免疫保护效果 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 日本血吸虫 SJCHGC06868 基因真核质粒的构建以及免疫保护效果评估 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 真核表达体系的构建 |
| 4.2.2 免疫保护效果 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 日本血吸虫 SJCHGC06868 基因mRNA 水平期别表达分析以及 RNA 干扰分析 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 real time PCR |
| 5.2.2 RNA 干扰 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 全文结论 |
| 6.1 噬菌体展示抗原的免疫预防效果评估 |
| 6.2 原核表达体系的构建以及免疫预防效果的评估 |
| 6.3 真核表达体系的构建以及免疫预防效果的评估 |
| 6.4 日本血吸虫SJCHGC06868 蛋白编码基因在不同期别虫体中mRNA 表达水平分析及RNA 干扰研究 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 日本血吸虫候选抗原及疫苗研究进展 |
| 1.1 候选抗原基因的获取 |
| 1.2 候选抗原基因的鉴定 |
| 1.3 日本血吸虫候选疫苗的研究 |
| 1.4 血吸虫病疫苗联合免疫 |
| 第二章 东方田鼠血清筛选噬菌体展示抗原对小鼠日本血吸虫病免疫效果观察 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 日本血吸虫锌指蛋白Sjznf1 基因的克隆与表达 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 结论 |
| 4.1 血吸虫抗性相关靶基因的免疫效果 |
| 4.2 日本血吸虫锌指蛋白基因的克隆与表达 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| 文献综述 |
| 第一部分 18日龄日本血吸虫酵母双杂交cDNA文库的构建 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 结论与讨论 |
| 第二部分 PGBKT7-SjGCP融合载体的构建及鉴定 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第三部分 应用酵母双杂交技术筛选与抱雌沟蛋白相互作用的因子 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 英文摘要 |
| 个人简历 |
| 内容提要 |
| 英文缩写词表 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 综述1 华支睾吸虫及华支睾吸虫病 |
| 综述2 CDNA 文库及其在寄生虫研究中的应用 |
| 综述3 华支睾吸虫病诊断抗原和抗体的研究进展 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 华支睾吸虫成虫 cDNA 文库的构建 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第2章 华支睾吸虫成虫CDNA 文库的免疫学筛选 |
| 2.1 材料和仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 华支睾吸虫成虫CDNA 文库的EST 测序 |
| 3.1 材料和仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 华支睾吸虫囊蚴CDNA 文库的构建 |
| 4.1 材料 |
| 4.2 方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文及取得的科研成果 |
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 筛选日本血吸虫虫卵cDNA文库 |
| 2 筛选日本血吸虫尾蚴cDNA文库 |
| 3 筛选日本血吸虫童虫cDNA文库 |
| 4 筛选日本血吸虫成虫cDNA文库 |
| 4.1 用抗血清筛选: |
| 4.2 用PCR法筛选: |
| 4.3 用紫外线致弱血吸虫血清筛选: |
| 4.4 用鼠血清筛选: |
| 4.5 用旋毛虫感染血清筛选: |
| 4.6 用牛血清筛选: |
| 4.7 用日本血吸虫雄虫感染血清筛选: |
| 4.8 用日本血吸虫雌虫感染血清筛选: |
| 4.9 用Sj病化疗后再感染人血清筛选: |
| 4.10 用生物信息学技术筛选: |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 血吸虫概述 |
| 1.1.1 血吸虫的发现 |
| 1.1.2 血吸虫的分类 |
| 1.1.3 血吸虫的生活史 |
| 1.1.4 血吸虫的基因组结构 |
| 1.1.5 我国血吸虫病概况 |
| 1.1.6 血吸虫病免疫预防研究的战略意义 |
| 1.2 血吸虫基因组及疫苗的研究进展 |
| 第二章 日本血吸虫童虫消减文库的构建及测序分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验动物 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.2.3 主要仪器 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 血吸虫不同发育阶段差异表达基因研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.3 结果 |
| 第四章 日本血吸虫新基因全长 cDNA 的克隆与分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 全文结论 |
| 5.1 日本血吸虫童虫消减文库的构建及测序分析 |
| 5.2 日本血吸虫不同发育阶段虫体差异基因解析 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 血吸虫与宿主之间的相互关系 |
| 1.1.1 日本血吸虫与宿主的相容性 |
| 1.1.2 宿主对血吸虫的免疫应答 |
| 1.1.3 血吸虫的免疫逃避 |
| 1.2 东方田鼠抗血吸虫研究 |
| 1.2.1 东方田鼠抗血吸虫现象的观察 |
| 1.2.2 东方田鼠抗血吸虫相关分子的研究 |
| 1.3 噬菌体展示技术 |
| 1.3.1 噬菌体展示系统 |
| 1.3.2 噬菌体展示技术在抗血吸虫疫苗研究中的应用 |
| 1.4 展望 |
| 第二章 东方田鼠不同组织/器官裂解物体外杀伤日本血吸虫童虫效果的比较 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 日本血吸虫机械断尾童虫的制备 |
| 2.2.2 体外杀伤效果 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 日本血吸虫抗性相关靶基因的筛选 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 东方田鼠肝脏裂解物的日本血吸虫抗性相关基因筛选 |
| 3.2.2 东方田鼠肺脏裂解物的日本血吸虫抗性相关基因筛选 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 血吸虫抗性相关靶基因的免疫效果分析 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 噬菌体滴度的粗测定 |
| 4.2.2 减虫率 |
| 4.2.3 粪便减卵率 |
| 4.2.4 肝脏减卵率 |
| 4.2.5 血清抗体水平检测 |
| 4.3 结论 |
| 第五章 血吸虫抗性相关靶基因的克隆表达 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 日本血吸虫抗性相关全长靶基因的克隆与表达 |
| 5.2.2 日本血吸虫抗性相关非全长靶基因的扩增 |
| 5.3 结论 |
| 第六章 全文结论 |
| 6.1 东方田鼠组织/器官裂解物体外杀伤日本血吸虫机械断尾童虫现象的观察 |
| 6.2 日本血吸虫抗性相关靶基因的筛选 |
| 6.3 日本血吸虫抗性相关靶基因的免疫保护性实验 |
| 6.4 日本血吸虫抗性相关靶基因的全长扩增和克隆、表达 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 日本血吸虫31/32kDa抗原的质谱分析及相关编码基因的鉴定 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二章 日本血吸虫组织蛋白酶B内肽酶真核质粒的构建及鉴定 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第三章 日本血吸虫组织蛋白酶B内肽酶真核表达质粒的DNA疫苗免疫保护性研究 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第四章 日本血吸虫组织蛋白酶B内肽酶原核质粒的构建及初步鉴定 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第五章 日本血吸虫组织蛋白酶B内肽酶融合蛋白对SjAWA单链抗体库的初步筛选 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述 血吸虫核酸疫苗候选分子的研究进展 |
| 致谢 |
| 攻读学位论文期间主要研究成果 |
