陈诗涵[1]（2021）在《2017-2020年浙江省部分地区猫泛白细胞减少症病毒分子特征与VP2表达及应用初探》文中研究指明猫泛白细胞减少症（Feline Panleukopenia,FP）是由猫泛白细胞减少症病毒（Feline Panleukopenia Virus,FPV）引起的猫及猫科动物的一种急性高度接触性传染病,又称为猫瘟热、猫传染性肠炎、猫细小病毒感染。FPV感染宿主谱广、病死率高,尤其是猫、水貂和浣熊等幼龄动物,疫苗接种是目前预防猫泛白细胞减少症的主要途径之一。了解当前猫泛白细胞减少症病毒的遗传变异情况,对及时做出诊断和预测以及研究新型疫苗对该病的防治都具有重要意义。2017～2020年间我们从浙江某动物医院收集了 23份疑似感染FPV的临床样本。提取样本的DNA进行PCR鉴定,共20份样品为FPV阳性,在FK81细胞上传代分离病毒,并进行序列比对和遗传进化分析。选取其中一株FPV分离株ZJFPV2进行电镜观察、全基因组序列鉴定与分析。结果显示:20株FPV分离株之间的核苷酸同源性为98.7%～100.0%,分离株与37株GenBank上下载的参考株的核苷酸同源性为97.3%～100.0%,分离株与参考株同源性很高,变异不大。20株FPV分离株分别归属于G2群和G3群。对FPV的分离鉴定、分子流行病学分析可对后续开发针对FPV流行毒株的有效疫苗提供基础。PCR扩增ZJFPV2分离株VP2基因,插入原核表达载体,构建了重组质粒pET32a（+）-VP2和pET28a（+）-VP2,转化至大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）中,使用IPTG进行诱导表达。表达产物经SDS-PAGE电泳鉴定,出现了与预期相符的大小约64.6 kDa的条带,结果表明:重组质粒pET32a（+）-VP2和pET28a（+）-VP2构建成功,在大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）中进行表达。进行Western blot,WB结果表明:pET32a（+）-VP2成功融合了 His-标签蛋白。将pET32a（+）-VP2在BL21（DE3）中大量表达,使用His-标签蛋白纯化柱对表达的VP2重组蛋白进行纯化,并将其作为检测抗原,建立了间接ELISA方法。确定了反应的优化条件:抗原包被浓度为5.64 μg/mL,阴、阳性血清浓度为1:40,包被条件为4℃过夜,封闭时间为1h,显色时间为15min,该方法具有较高的重复性和特异性,这些结果为FPVVP2抗体检测奠定了基础。PCR扩增ZJFPV2分离株VP2基因,插入不同的真核载体,构建真核表达质粒pcDNA3.1（+）-VP2和pCAGGS-VP2,转染FK81细胞,间接免疫荧光结果表明:VP2基因在pcDNA3.1（+）和pCAGGS两种真核表达质粒中均表达。大提质粒pCAGGS-VP2和pcDNA3.1（+）-VP2分别免疫小鼠,设置空载体为阴性对照。小鼠三免两周后获取血清,间接ELISA方法检测小鼠血清中抗体的水平,结果显示:小鼠血清内能够检测到特异性抗体,而对照组未检出。表明本研究构建的真核重组质粒pCAGGS-VP2和pcDNA3.1（+）-VP2能够诱导小鼠产生特异性抗体,为进一步FPV核酸疫苗的研究提供了基础。
陆田甜[2]（2021）在《成都市犬细小病毒的检测和分离鉴定及精制卵黄抗体的研制》文中指出犬细小病毒（Canine parvovirus,CPV）是引起犬腹泻的重要病原之一,给养犬业带来了巨大的损失。目前CPV在我国以多种抗原型毒株共同流行,对流行毒株的流行病学调查和病原特征研究有助于该病的防控,而治疗性抗体是治疗CPV的有效手段。本研究的目的是调查2019-2020年成都市CPV的流行情况及病原生物学特征,制备针对流行毒株的精致高免卵黄抗体。取得的结果如下:1.成都市CPV的分布情况及其抗原型为了解当前四川省成都市CPV的流行及其抗原型,采用特异性检测CPV的PCR方法对2019-2020年采自成都市的121份犬腹泻粪便样本进行检测,对检测结果中的阳性样本PCR产物进行测序构建进化树。结果显示,CPV的阳性率为52.1%,63份阳性样本中New CPV-2a型、CPV-2a型及CPV-2c型分别为31%、34%、35%,其中8%的阳性样本为CPV-2a型和CPV-2c的混合感染。上述结果表明,CPV仍是目前成都市引起犬腹泻的重要病原之一,有3种抗原型CPV流行,并存在混合感染,说明成都市CPV流行毒株抗原型复杂多样。2.成功分离鉴定出一株CD-DY6-2019分离株为进一步研究CPV的生物学特性,将1株CPV-2a型和CPV-2c型混合感染阳性样本接种F81细胞进行传代培养,待出现稳定病变后对其进行PCR检测、透射电镜观察和间接免疫荧光试验。结果显示,接毒样本连续传至第6代后,CPE稳定出现在接毒后96h,初期经CPV感染的F81细胞出现圆缩,随着时间的推移细胞出现崩解脱落和典型的拉网状病变。培养物的PCR产物测序分型结果显示为CPV-2a型。间接免疫荧光试验结果显示,分离株出现明亮的特异性荧光。透射电镜可观察到符合CPV特征的病毒粒子,综上所述证实成功从混合感染阳性样本中分离出一株CPV-2a型毒株,为后续探究其生物学特性及致病性提供了物质基础。3.CD-DY6-2019分离株的基因组特征为进一步研究CD-DY6-2019分离株的分子特征,用Premier5.0软件设计了8对引物分段扩增CD-DY6-2019分离株的全基因序列,并设计了5对引物进行复核,结果显示,本研究分离得到了CD-DY6-2019分离株包含两个完整阅读框的基因序列,长度为4269bp。该分离株的核苷酸与参考毒株的核苷酸相似性为98.8%～99.9%。推导的氨基酸序列显示,其在NS1蛋白的4个氨基酸（23、247、248、443）位点发生了突变;在VP2蛋白上的8个氨基酸位点（80、91、93、103、232、305、564、568）发生了突变。这些突变对CPV的影响有待于进一步的研究。值得注意的是,遗传进化分析显示,该分离株与来自中国的2019年的猫泛白细胞减少症病毒（FPV）分离株（登录号:MN908257、MT614366）亲缘关系最近,而与Genbank里CPV的亲缘关系较远,提示该分离株是由FPV进化而来。本研究丰富了成都市CPV的流行病学资料,为CPV的遗传变异研究提供了参考。4.CPV-2c型精致高免卵黄抗体的研制本研究的目的是制备对New CPV-2a型、New CPV-2b型及CPV-2c型流行毒株均具有良好中和保护作用的CPV-2c型精致高免卵黄抗体。将分离毒株SC-14/2017(CPV-2c型,TCID50为104.5/0.1m L)制备201佐剂灭活疫苗,分点注射免疫蛋鸡,1 m L/只,每隔14天以同样方式2ml/只加强2次免疫。结果显示,三免后第15d、28d、57d获得的原始卵黄抗体中和效价分别为1:46286、1:23141、1:10953;经辛酸-PEG6000法提纯后的精制卵黄抗体的中和效价分别为1:8111、1:5758、1:4490。本研究的精制卵黄抗体对New CPV-2a型、New CPV-2b型和CPV-2c型病毒的中和效价分别为1:1024、1:1780、1:8111,说明该精制高免卵黄抗体具有良好的广谱中和作用,除对同型毒株具有较高的保护效价外,对另外两种不同抗原型毒株也具有较好的交叉保护效价,且优于市售的单克隆抗体和高免血清,为进一步生产具有广谱中和作用的抗CPV精制卵黄抗体奠定了基础。
邱月阳[3]（2020）在《20182019安徽部分地区犬细小病毒全基因组序列分析及SYBR GreenⅠ检测方法的建立》文中研究指明犬细小病毒病是由犬细小病毒（canine parvovirus,CPV）引起的一种犬的高度接触性、致死性传染病。自1978年CPV-2在美国首次发现以来,其遗传变异速率快,宿主范围持续变化,使其在检测、预防与治疗方面的困难显着增加。在我国,多个地区开展了针对犬细小病毒遗传变异情况的研究,而安徽地区的资料较少。所以对安徽地区犬细小病毒的流行情况的调查和全基因组序列分析并建立针对目前流行株的荧光定量检测方法变得十分必要和迫切。本研究在2018至2019年从安徽部分地区多家动物医院采集疑似犬细小病毒感染犬粪便或肛门拭子。根据NCBI上CPV VP2基因保守区域设计一对引物,从而对粪便样品进行鉴定并对阳性样品的CPV毒株进行分型。从阳性样本中选取10株进行全基因组克隆并对其序列进行遗传变异分析。设计针对目前流行毒株的SYBR greenⅠ荧光定量PCR检测引物,从而建立检测方法。结果表明共检测出31份阳性样本,其中New CPV-2a为3株,占总体9.68%;New CPV-2b为1株,占3.23%;CPV-2c为27株,比例为87.1%。10株CPV全基因组序列分析结果表明,从总体来看,CPV安徽分离株之间亲缘关系较近,形成单系群,与国外分离株较远。并且CPV-2a和CPV-2b亚型形成独立分支,CPV-2c亚型形成另一独立分支。NS1基因和VP2基因在遗传进化分支中出现不同步现象,为基因重组提供了依据。CPV安徽分离株在NS1上出现了D358N、A587T和V596A三个以前未发现的突变。发现了两种新的右端发夹二级结构,可能对病毒的复制产生影响。NS1基因发现两个潜在阳性选择位点。本研究建立了一种针对犬细小病毒安徽分离株的SYBR greenⅠ荧光定量PCR检测方法,能检测到5.407×101拷贝数/μL的病毒核酸,其特异性、敏感性和重复性较好。综上,安徽部分地区CPV主要流行毒株为CPV-2c亚型,同时New CPV-2a和New CPV-2b共同参与循环。本研究丰富了安徽地区CPV流行病学资料,对CPV安徽株遗传变异情况进行了深入研究,并对CPV诊断提供了可靠的荧光定量PCR诊断方法。
孟嘉欣[4]（2020）在《中国地区CCoV流行性Meta分析及2018～2019年黑龙江省CCoV分子流行病学调查》文中提出犬冠状病毒病（Canine coronavirus,CCoV）是一种具有分布广、发病率高且临床症状复杂等特点的传染性疾病。已有报道表明,冠状病毒变异会使其宿主由动物变为人,而犬作为人类日常生活伴侣与人类接触密切,所以密切关注犬冠状病毒流行与遗传变异情况对人类公共卫生具有重要意义。为全面了解中国CCoV流行情况,本试验采用Meta分析方法进行研究。首先收集并根据研究目的筛选中国19972019年发表关于国内CCoV流行情况的中英文文献,对符合要求的文献统计文章发表年份、作者、总样品数、阳性样品数、检测方法及样品来源背景等信息,并根据信息的全面性和试验详细程度进行评分估量。进一步提取文献中所有样品的背景信息数据并分为来源地区、季节、性别、免疫情况等共9个不同亚组,采用统计学方法分析不同亚组分类下CCoV流行率之间的差异及其与样品背景信息的关联性。最终通过统计学检验方法对亚组分析统计结果的异质性、文章发表偏倚性进行分析与验证。结合Meta分析结果,本研究进一步设计试验对20182019年中国黑龙江地区CCoV的流行及流行毒株遗传演化情况进行探究,收集黑龙江大庆、哈尔滨、鸡西、牡丹江、佳木斯和齐齐哈尔6个地区共378份腹泻犬粪便样品进行RT-PCR检测,统计学方法分析CCoV感染率与样品背景信息的相关性,并采用生物信息学方法对鉴定阳性毒株的M、S基因进行序列比对、同源性、遗传进化分析。Meta分析结果显示:本研究最终共筛选出24篇符合要求的文献,其中包含7个地区5 826份样品的相关信息,CCoV阳性数为2 115,总阳性率为36.3%。单组率分析结果显示:西南地区CCoV阳性率最高,为63%;华南地区CCoV阳性率最低,为6%;而东北地区CCoV阳性率为55%。2016年以前发表文献中CCoV阳性率比2016年及以后高17%,纯种犬比杂种犬CCoV感染率高39%,小于12月龄犬比大于等于12月龄犬CCoV感染率高40%,犬中CCoV-Ⅱ型的感染率比CCoV-Ⅰ型高55%,其他亚组分类中CCoV阳性率差异较小。相关性结果显示:有限的数据条件下,CCoV感染率与犬的性别、年龄、免疫情况、发病季节、品种、腹泻情况不具有相关性。RT-PCR检测结果显示:CCoV阳性样品总数为74份,总阳性率为19.58%。统计学分析结果显示大于12月龄犬低于06月龄犬CCoV感染率,秋、冬季节CCoV感染率低于春季,以上差异有统计学意义。M与S基因构建系统进化树结果显示:本试验鉴定CCoV主要流行毒株以CCoV-Ⅱ型为主,CCoV-Ⅰ型与CCoV-Ⅱ型鉴定毒株均与黑龙江本地流行毒株亲缘关系最近,而与不同基因型早期经典毒株的亲缘关系较远。37株CCoV鉴定毒株自身相比,M基因核苷酸与氨基酸同源性分别为83.2%100%和88.1%100%。与参考毒株相比,CCoV-Ⅰ型鉴定毒株与Ⅰ型原型毒株23/03的核苷酸与氨基酸同源性最高,CCoV-Ⅱ型鉴定毒株与国内早期毒株NJ17的核苷酸与氨基酸同源性最高,与341/05、CB/05的核苷酸与氨基酸同源性最低。3株CCoV-Ⅰ型鉴定毒株自身相比,S基因核苷酸与氨基酸同源性分别为97.2%98.4%和92.8%96.4%;4株CCoV-Ⅱ型鉴定毒株自身相比,S基因核苷酸与氨基酸同源性分别为85.9%100%和89.8%100%。M基因推导氨基酸序列比对结果显示:CCoV-Ⅰ型毒株整体与CCoV-Ⅱ型毒株相比,共存在4处氨基酸保守位点,分别为A129、T175、M195、E/DH202-203。S基因推导氨基酸序列比对结果显示:与CCoV-Ⅰ型经典毒株23/03、Elmo/02相比,本试验3株鉴定毒株共存在7处氨基酸一致性突变;CCoV-Ⅱ型鉴定毒株HLJ/L4、HLJ/L15及HLJ/t56与黑龙江鉴定毒株HRB-D6相比,共存在8处氨基酸一致性突变。S蛋白N-糖基化位点分析结果显示:以23/03为参考,分析发现鉴定毒株S蛋白第11941 284位氨基酸潜在N-糖基化位点,鉴定毒株HLJ/X24仅包含第1 273位N-糖基化位点,不包含第1 234位N-糖基化位点;而鉴定毒株HLJ/X4不包含这2个潜在N-糖基化位点;与参考毒株相比,CCoV-Ⅱ型鉴定毒株HLJ/L4、HLJ/L15在第1 246位多出1个N-糖基化位点,而鉴定毒株HLJ/t56在第1 246、1 340位共多出2个N-糖基化位点。M蛋白抗原性分析结果显示:CCoV-Ⅱ型第5组群鉴定毒株HLJ/X14的高抗原性氨基酸位点分布与CCoV-Ⅰ型参考毒株高度相似,主要分布在第151156、172177位氨基酸;鉴定毒株HLJ/28与参考毒株相比,在第173177位氨基酸额外多出1个高抗原性区域;CCoV-Ⅱ型鉴定毒株HLJ/J69与参考毒株相比,其在第1 2781 286位氨基酸多出1个高抗原性区域。以上研究结果表明,中国7个地区犬群中均存在CCoV感染,且CCoV-Ⅱ型毒株的流行率高于CCoV-Ⅰ型。此外,不同地区、年龄、品种犬的CCoV感染率差异较大。20182019年黑龙江地区CCoV流行毒株仍以CCoV-Ⅱ型为主,与国内外不同基因型经典毒株相比,黑龙江地区CCoV流行毒株的M、S基因均表现出较大程度变异,提示应该持续监测国内CCoV流行及遗传变异情况。
李希辰[5]（2020）在《犬细小病毒基因工程抗体的研究》文中提出犬细小病毒病是由犬细小病毒（Canine parvovirus,CPV）感染引起,严重危害犬类健康的传染病,具有发病率高、传染性强、死亡率高等特点。目前犬细小病毒病没有特效药物,目前采用的单克隆抗体在CPV感染早期有良好的治疗效果,但单克隆抗体为鼠源,具有较高的免疫原性,不能连续注射。本研究通过对已有单克隆抗体进行犬源化改造,制备适合犬用的免疫原性低的抗CPV抗体药物。首先对已有抗CPV的杂交瘤细胞株4H8进行鉴定,4H8抗体亚型为IgG2b,亲和力常数6个Ka平均值为1.02×10111 L/mol,只与CPV VLPs反应。经RACE-PCR提取4H8抗体可变区序列,用NCBI IgBLAST分析。将4H8抗体可变区序列与在ENA网站上查到的鼠源抗体恒定区序列组装,分别构建真核表达载体pcDNA3.1（+）-L和pcDNA3.1（+）-H,共转染HEK-293、HEK-293F细胞进行表达。采用间接ELISA检测鼠源CPV基因工程抗体（CA）的表达量,CA在HEK-293F细胞中的表达量为5.97 mg/L;血凝抑制、中和试验检测其生物活性,CA在HEK-293细胞上清中的血抑和中和效价分别为1:24、1:152,在HEK-293F细胞上清中的血抑和中和效价分别为1:26、1:1 290。纯化CA后进行SDS-PAGE分析在55和25 Ku处出现条带;间接免疫荧光检测,CA能与CPV发生特异性结合。确定经过改造的CA依然保持活性后,进行犬源化改造。将4H8抗体可变区序列与在NCBI网站上查到的犬源抗体恒定区序列组装,分别构建真核表达载体pcDNA3.1（+）-cL和pcDNA3.1（+）-cH,按照CA的方法进行表达和检测犬源CPV基因工程抗体（CCA）。CCA在HEK-293细胞上清中的血抑和中和效价分别为1:25、1:203,在HEK-293F细胞上清中的血抑和中和效价分别为1:29和1:2 580。CCA经Protein A亲和层析柱纯化后纯度在95%以上,血抑和中和效价分别为1:212和1:32 768。经BCA法检测CCA在HEK-293F细胞中的表达量为89.65 mg/L。SDS-PAGE分析CCA在55和25 Ku处出现条带,Western-blot检测重链能与兔抗犬IgG-HRP结合,间接免疫荧光检测CCA能中和CPV。以上结果表明,本研究在HEK-293F细胞中成功表达具有中和活性、纯度高、免疫原性低的犬源化CPV基因工程抗体。
莫若[6]（2021）在《犬细小病毒2c亚型的分离鉴定及马抗CPV-2c精制免疫球蛋白的制备》文中进行了进一步梳理犬细小病毒（Canine parvovirus,CPV）属于细小病毒科、细小病毒属成员,主要感染犬科、鼬科、浣熊科等肉食动物,感染后引起腹泻、出血性肠炎、心肌炎等临床症状,是造成犬科等肉食动物死亡的主要病原。目前,CPV已呈世界性流行,严重威胁着家养及野生肉食动物的健康,也对毛皮动物养殖造成了严重的经济损失。疫苗接种是预防该病的主要手段,但是由于CPV变异频繁,使疫苗不能完全阻止CPV的感染。由于VP2基因氨基酸的变异,犬细小病毒已经由最初的CPV-2逐渐演变成CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c等多种亚型,并在不同地区形成不同的流行趋势。因此,了解CPV地方流行特征,对该病的防治具有重要意义。此外,无针对该病的特异性治疗药物,临床普遍采用对症治疗。因而,安全快速的特异性治疗制剂是CPV治疗的首选。马源抗体的制备,相对其他抗体有着成本低、采血量大、抗体产量高的优势。因此,开展针对CPV的马抗免疫球蛋白的研究有着重要的意义。首先,本研究对长春市不同宠物医院就诊犬的粪便样品进行CPV检测,并进行了基因亚型分析与病毒分离鉴定。20份粪便样品中检测出15份CPV阳性,VP2基因氨基酸位点与遗传进化分析显示15份样品均为CPV-2c亚型。使用F81细胞成功分离到1株病毒,经间接免疫荧光、透射电镜与PCR鉴定为CPV,命名为CC/JS-01。该毒株稳定传代8代,血凝效价为1:29,病毒滴度为105.24TCID50/m L。VP2基因扩增与遗传进化分析显示该毒株与CPV-2c亚型参考毒株同属一个分支,且与中国流行株亲缘关系最近。然后,通过将CPV-2c亚型的病毒样颗粒与弗氏佐剂混合乳化制备免疫原,并对马进行免疫,经中和试验观察马血清中和抗体效价变化,而后将制备的马抗CPV高免血清通过饱和硫酸铵沉淀提取免疫球蛋白IgG,对其纯度及CPV-2c亚型的中和抗体效价进行检测。结果显示,硫酸铵沉淀所提取的IgG经SDS-PAGE分析在55KDa左右具有完整的蛋白条带,应用薄层扫描测得其纯度为91.63%,制备的马抗CPV-2c精致免疫球蛋白中和效价为1:6451.6。此外,对所制备的IgG进行无菌检验为合格,证明制得的免疫球蛋白IgG安全性良好。综上,本研究证明CPV-2c亚型是近年来长春地区的优势流行毒株,并成功分离到1株CPV-2c,制备了针对CPV-2c具有高中和效价的马抗免疫球蛋白,为长春地区犬细小病毒的综合防控提供了理论依据,也为CPV的治疗抗体的研制提供了可参考的技术方法。
巨敏莹[7]（2020）在《犬四种病毒TaqMan实时荧光定量PCR方法的建立》文中指出犬瘟热病毒（CDV）、犬副流感病毒（CPIV）、犬细小病毒（CPV）和犬腺病毒Ⅱ型（CAV-2）是引起犬常见传染病的主要病原体,给养犬业带来了严重经济损失。本研究根据四种病毒在GenBank中登录的序列,设计四条引物和四条TaqMan探针,通过优化反应条件以及敏感性、特异性和重复性试验,建立四种病毒单重TaqMan实时荧光定量PCR方法以及四重TaqMan实时荧光定量PCR方法。结果表明,四种病毒单重方法对CAV-Ⅱ、CPV、CPIV最小检出量均为101copies/μL,CDV最小检出量为102-101copies/μL,敏感性高;标准曲线线性关系良好,相关系数（R2）均大于0.990;四种病毒只在本病毒阳性模板有扩增信号,特异性强。CPV和CAV-Ⅱ两种病毒组内和组间变异系数均小于2%,CPIV和CDV两种病毒组内和组间变异系数均小于3%,重复性良好。检测了 72份样品结果均能特异性检测出四种病毒。四重方法的敏感性,CAV-Ⅱ和CDV可以达到102copies/μL,CPV和CPIV可以达到103 copies/μL,敏感性较高;标准曲线线性关系良好,相关系数（R2）均大于0.990。不同病毒之间无交叉反应且仅有阳性模板有扩增信号,特异性强。四种病毒组内和组间变异系数均小于5%,重复性良好。检测了 26份样品,同时与普通PCR方法进行复核结果一致。表明所建立的四重TaqMan荧光定量PCR检测方法具有快速、敏感、稳定等优点,可以用于四种病毒的定量检测。
翟志安[8]（2020）在《猫泛白细胞减少症病毒的分离鉴定及VP2基因遗传演化分析》文中研究表明猫泛白细胞减少症又称猫传染性肠炎和猫瘟热,是由猫泛白细胞减少症病毒（Feline panleukopenia virus,FPV）引起的急性高度接触性传染病。FPV感染宿主范围较宽且引起死亡率较高,尤其危害猫、水貂和浣熊等幼龄动物。目前,疫苗接种是预防该疾病的主要措施,为了有效地控制该病在我国猫群体中的发生和流行,了解FPV遗传变异和流行情况对新型疫苗的研发和该疾病的防治具有重要意义。为了研究FPV感染情况,2018～2019年期间从中国某动物医院收集34份疑似感染FPV的临床样品。利用F81细胞分别对所有样品进行病毒分离,22份样品使细胞产生CPE。选取其中一份血便样品进行鉴定,经分子生物学、免疫荧光、电镜观察和动物回归实验等鉴定后,分离鉴定一株FPV,命名为DL-C-3株,其第5代病毒毒价为106.08.08 TCID50/0.1 m L。为了对临床样品快速检测,建立了检测FPV TaqMan探针实时荧光定量PCR（Taq Man q PCR）诊断方法。结果显示,标准曲线相关系数（R2）值为0.9997,线性相关显着。扩增效率为104.2%,在90%～110%之间;可以特异性检出FPV;最低可检测到的质粒浓度为115 copies/μL,是PCR检测方法的10倍;Ct值的变异系数小于1%。因为临床上FPV常与疱疹病毒1型（Feline hepersvirus1,FHV-1）混合感染,所以建立了FHV-1 PCR诊断方法。结果显示,可以特异性检出FHV-1;最低可检测到的质粒浓度为37.8 copies/μL。临床样品检测结果表明,34份临床样品中22份FPV检测为阳性,FPV检出率为64.7%（22/34）;FPV和FHV-1混合感染1例（1/34）。为了分析FPV VP2基因遗传演化规律,本研究对22份FPV阳性样品提取病毒DNA,随后克隆VP2基因并测序,将获得的22份阳性样品VP2基因序列（全长1755 bp）和Genbank数据库收录的226株（215株FPV和11株CPV）VP2基因参考序列进行序列分析。同源性分析结果显示,本研究大部分样品VP2基因与亚洲FPV毒株相似性较高,与FPV标准株CU-4株相似性较低。其关键位点氨基酸类型与FPV标准株CU-4一致。22份阳性样品VP2基因中同义突变占优势且发现9处非同义突变,其中4处为新发突变。选择压力分析结果显示,发现了30个处于负向选择压力下的氨基酸位点。系统发育树分析显示,FPV形成4个基因群,12份阳性样品VP2基因与亚洲分离株聚集为第3基因群,表现出明显的亚洲地理起源特征;8份阳性样品VP2基因与世界各国分离株聚集为第4基因群。只有两份阳性样品VP2基因位于第2基因群,与国外早期分离株亲缘关系较近。本研究大部分阳性样品VP2基因发生变异,与国外早期分离株亲缘关系较远。因此,有必要使用最近流行的FPV毒株通过交叉中和实验来评估当前FPV疫苗的实际效力。我们的研究结果不仅为FPV分子流行病学调查提供了参考依据还对我国新型疫苗的研发具有重要的指导意义。
冯帆[9]（2020）在《成都市犬细小病毒的分子检测及病原生物学特征》文中进行了进一步梳理犬细小病毒（Canine parvovirus,CPV）感染犬主要表现为出血性肠炎,对幼犬的致死率高达70%,该病呈全球性流行。CPV极易发生变异,自20世纪70年代后期出现至今,已出现了多种抗原型流行毒株,包括CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c以及New CPV-2a、New CPV-2b等。对流行毒株的流行病学调查和病原特征研究有助于该病的防控,本研究的目的是调查成都市CPV的流行情况及病原生物学特征。主要研究结果如下:1.CPV的分布及其混合感染情况为了解成都市CPV的感染情况,采用CPV特异PCR方法,对2016-2018年采自成都市6家宠物医院176份幼犬腹泻粪便样本进行检测,并对CPV阳性样本中犬冠状病毒（Canine coronavirus,CCoV）、犬瘟热病毒（Canine distemper virus,CDV）、犬轮状病毒（Canine rotavirus,CRV）、犬微小病毒（Minute virus of canines,MVC）、犬腺病毒2型（Canine Adenovirus type 2,CAV-2）、犬圆环病毒（CanineCircovirus,CanineCV）、犬星状病毒（Canine astrovirus,CaAstv）和犬库布病毒（Canine Kobuviruses,CaKoV）进行PCR检测。结果显示,CPV的阳性率为72.73%,其中仅有11.72%的CPV阳性样本为单一感染,88.28%的CPV阳性样本为26种病毒混合感染,混合感染样本中其它病毒的阳性率分别为CCoV 50.78%、CDV 28.13%、CAV-2 3.13%、CRV 10.94%、MVC 8.59%、CanineCV 17.97%、CaAstv 40.63%和CaKoV 46.88%,26重病毒混合感染率分别为20.31%、34.38%、19.53%、11.72%和2.34%。本研究结果表明,CPV是成都市幼犬腹泻的主要原因,且与多种病毒混合感染现象普遍,严重影响犬腹泻的诊疗效果。2.CPV的抗原型为了解成都市CPV流行毒株的抗原型,随机选取60份CPV阳性样本（每年20份）,PCR扩增其VP2基因片段,产物测序并进行序列分析,截取每个目的片段中的501 bp进行分析,根据其第297、426位关键位点的氨基酸替换情况进行分型。结果显示,New CPV-2a型为71.67%,New CPV-2b型为11.67%,CPV-2c型为16.67%,其中2016年New CPV-2a型、New CPV-2b型和CPV-2c型的阳性率分别为75%、25%和0%,2017年为85%、5%和10%,2018年则为55%、5%和40%。本研究结果表明2016-2018年成都市有3种抗原型CPV流行,其中New CPV-2a型为优势抗原型,但呈下降趋势,而CPV-2c型则从2017年出现后快速增长到2018年的40%,成为优势流行型之一,说明成都市CPV流行毒株抗原型复杂多样,其中CPV-2c型的出现及其与现有疫苗保护力的关系值得进一步的研究。3.成功分离鉴定出3种抗原型CPV为进一步了解不同抗原型流行毒株的生物学特性,分别将选择的6份CPV阳性样本（New CPV-2a、New CPV-2b和CPV-2c阳性样本各2份）接种F81细胞,传代培养观察至少3代,对出现病变的细胞继续传代培养,待出现稳定病变后对其进行PCR和间接免疫荧光鉴定,分离毒株经空斑纯化后测定TCID50。结果显示,6个接毒样本盲传至第3代时,3种抗原型阳性样本接毒的细胞均有1个样本出现细胞病变（CPE）,连续传至第5代后,New CPV-2a型、New CPV-2b型和CPV-2c型CPE稳定出现在接毒后96 h、96 h和72 h,细胞出现圆缩、崩解脱落和典型的拉网状病变,培养物的PCR产物测序分型结果与接毒样本的抗原型相同,间接免疫荧光可见细胞特异性亮绿色荧光,证实成功分离出3种抗原型CPV,命名为SC-16/2017/China（New CPV-2a）、SC-13/2017/China（New CPV-2b）和SC-14/2017/China（CPV-2c）,其TCID50分别为103.5/0.1 mL、103.5/0.1 mL和104.7/0.1 mL。本研究成功获得了New CPV-2a型、New CPV-2b型和CPV-2c型毒株各1株,为该病毒的基础研究和应用研究奠定了物质基础。4.CPV 3个抗原型分离株的基因组特征为进一步了解CPV不同抗原型流行毒株的基因组特征和遗传进化关系,以GenBank中CPV全基因序列为模板（基因组全长约5200 bp）,用Premier 5.0软件设计了6对引物分段扩增3个抗原型分离株的全基因序列,克隆测序用DNAStar进行拼接,用Megalign和MEGA 7.0等对获得的基因组进行同源性和遗传进化分析。结果显示,本研究成功获得了3个抗原型分离株包含部分UTR和两个完整编码框的基因序列,序列长度分别为4611 bp（New CPV-2a型）、4595bp（New CPV-2b型）和4619 bp（CPV-2c型）,GenBank登录号为MT165694（New CPV-2a/SC-16/2017/China）,MT165692（New CPV-2b/SC-13/2017/China）,MT165693（CPV-2c/SC-14/2017/China）。3个抗原型分离株间的核苷酸同源性为98.8%99.8%,与GenBank中CPV基因组核苷酸同源性为98.5%99.8%。推导的氨基酸序列显示,3个抗原型分离株仅在VP2蛋白的第267位氨基酸位点出现一个共同的位点突变。New CPV-2a型分离株在NS1蛋白的第572、624位,VP2蛋白的第324、440位氨基酸位点出现突变;New CPV-2b型分离株在NS1蛋白的第19、544、545、583位,VP1独特区域的第116位氨基酸位点出现突变;CPV-2c型分离株在NS1蛋白的第60、544、545、630位,VP2蛋白的第5、324、370位,VP1独特区域的第131位氨基酸位点出现突变。这些在NS1蛋白上的位点变化可能会影响病毒感染早期的基因表达,在VP1独特区域的位点变化可能会影响病毒的感染力,而在VP2蛋白上的位点变化是否会影响其抗原性以及影响宿主体内中和抗体的产生值得进一步研究。遗传进化分析表明,本研究的New CPV-2a型分离株与2个国内的New CPV-2a型毒株（BJL-1、21-Sichuan）单独聚为一支,且这些毒株均为2015年之后的毒株,与2015年之前的中国毒株以及国外的毒株有一定的遗传距离,说明国内的该型毒株近年来出现了独特的进化趋势;本研究的New CPV-2b型分离株与3个中国的New CPV-2b型毒株（HB-1、JL-6、LZ2）单独聚为一支,与国外的New CPV-2b型毒株有一定的遗传距离,说明该型毒株在中国具有与国外不同的进化趋势;本研究的CPV-2c型分离株与2个来自四川的CPV-2c型毒株（08-Sichuan、16-Sichuan）单独聚为一支,而与国内其它地区的该型毒株具有一定的遗传距离,说明CPV-2c型毒株在四川地区具有独特的进化趋势。本研究通过对不同抗原型分离株基因组的分析揭示了流行毒株的基因组结构特征,为进一步研究CPV的遗传进化规律提供了重要参考。5.CPV 3个抗原型分离株的抗原性本研究通过比较CPV 3个抗原型毒株的抗原性,为研制具有保护多种抗原型CPV的疫苗毒株选择提供参考。分别将分离毒株SC-16/2017、SC-13/2017和SC-14/2017的TCID50调整为103.5/0.1 mL,经1.5‰甲醛灭活后制备201佐剂灭活疫苗,3种抗原型疫苗均采用腿部及颈部皮下分点注射免疫各组5只蛋鸡,1mL/只,之后每隔14 d进行二免及三免,2 mL/只。收集不同免疫时期鸡蛋,血凝抑制试验（HI）和抗体交叉中和试验测定卵黄抗体效价。结果显示,3个实验组均在首次免疫后7 d左右检测到抗体,三免后10 d卵黄抗体HI效价达到最高峰(SC-16/2017组为214,SC-13/2017组为214,SC-14/2017组为213),三免后84 d HI效价仍维持在210左右。3个抗原型卵黄抗体针对New CPV-2a型、New CPV-2b型和CPV-2c型病毒的中和效价显示,New CPV-2a型卵黄抗体中和效价分别为1:890、1:110和1:890;New CPV-2b型卵黄抗体中和效价分别为1:890、1:220和1:1780,CPV-2c型卵黄抗体中和效价分别为1:890、1:450和>1:2560。本研究结果表明3个抗原型分离株均具有较好的免疫原性,能够诱导机体产生稳定、高价的抗体。3种抗原型卵黄抗体除对同型毒株具有保护效价外,对另外2种不同抗原型毒株也具有交叉保护效价,其中CPV-2c型分离株诱导机体产生的抗体交叉保护效价高于两外两种,建议CPV-2c型毒株可作为研制具有保护多种抗原型CPV的疫苗候选毒株。
赵国清[10]（2019）在《威海地区主要毛皮动物常见病原体检测及微生态防治》文中研究表明水貂、狐狸、貉子是具有较高利用价值的毛皮动物。威海市毛皮动物养殖量位居全国地级市前列。本实验主要对威海地区的水貂、狐狸、貉子感染犬瘟热病毒、细小病毒、阿留申病毒及常发细菌病等进行了病原体检测,提出了微生态防控措施。1.对威海区域内毛皮动物养殖场,通过查阅档案、实地走访和填写调查问卷相结合的方法进行调查,掌握养殖、防疫、免疫以及主要疫病存在情况。结果表明,毛皮动物存栏量下降较大,存栏500只以上养殖场饲养量所占比重,水貂、狐狸比重约为50%,貉子比重约为20%。导致毛皮动物发病的病毒性病原主要是犬瘟热病毒、细小病毒、阿留申病毒、伪狂犬病毒、狐狸脑炎病毒等;细菌性病原主要是绿脓杆菌、沙门菌、巴氏杆菌、肺炎克雷伯氏菌、大肠杆菌、肺炎双球菌、魏氏梭菌等细菌。2.对存栏5000只以上的毛皮动物养殖场随机采集病料,共采集140份样品（分别采集肝、肺、肾、脾、肠、脑）。对样本分别进行病理解剖、病毒检测、细菌检测。结果显示,犬瘟热病毒的感染率约27.14%,细小病毒的感染率为20.71%,阿留申病毒未检出,大肠杆菌的感染率为21.42%,克雷伯氏菌的感染率为15%,沙门氏菌的感染率为10.71%,支气管败血波氏杆菌的感染率为2.14%,绿脓杆菌的感染率为11.42%。犬瘟热病毒、细小病毒、大肠杆菌、克雷伯氏菌、沙门氏菌、支气管败血波氏杆菌、绿脓杆菌7种病原的单纯感染、二重感染、三重感染的感染率分别为30%、30.71%、5.71%。水貂的致病菌感染率比狐狸、貉子更高。3.血清学分型结果显示:大肠杆菌O88是主要的流行血清型,占检出血清型的33.3%;G型绿脓杆菌是主要流行菌株,占检出血清型的35.7%。药敏试验结果显示,感染性细菌对氨苄西林等青霉素类、头孢唑林等一、二代头孢菌素、复方新诺明、呋喃妥英等的耐药率较高;比较敏感的药物有:头孢他啶、头孢吡肟等三、四代头孢菌素,妥布霉素,左氧氟沙星,哌拉西林/他唑巴坦等含有β-内酰胺酶抑制剂的药物。4.对分离到的CDV和MEV株的基因进行了测序,分离到的2株CDV的核苷酸同源性为99.8%,与6株参考毒株的核苷酸同源性为98.1%99.1%,分离到的病毒同属于Asia-I型;分离到的3株MEV的核苷酸同源性为99.7%100%,3株毒株基因与28株参考毒株的基因同源性为97.3%99.1%,分离的细小病毒与CPV位于同一进化分支上。5.为了研究饲料中添加益生菌制剂对水貂免疫功能的影响。试验采用单因素完全随机设计试验,选择60日龄雄性水貂随机分为4组,每组3个重复,每个重复5只,Ⅰ组为空白对照组饲喂基础日粮,Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组分别在基础日粮中添加0.5%、1.0%、1.5%益生菌制剂,试验期60 d,试验结束测定其免疫指标。结果表明,在基础饲料中添加益生菌制剂可以提高水貂的免疫功能。本调查揭示了威海地区主要毛皮动物感染性疾病的主要病原及其特性,找出了致病原的多重感染的发病规律,阐明了主要细菌病的病原耐药性,为威海地区毛皮动物疾病的诊断与防治提供了基础。
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第1章 综述: 猫泛白细胞减少症的研究进展 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 FPV的流行情况 |
| 1.3 FPV的病原学 |
| 1.3.1 FPV基因组及编码蛋白 |
| 1.3.2 形态特征和生物学特性 |
| 1.4 临床症状和病理变化 |
| 1.5 诊断 |
| 1.5.0 电镜观察 |
| 1.5.1 病毒分离鉴定 |
| 1.5.2 血清学检测 |
| 1.5.3 分子生物学诊断 |
| 1.6 防制 |
| 1.6.1 疫苗预防 |
| 1.6.2 血清治疗法 |
| 1.6.3 单克隆抗体治疗法 |
| 1.6.4 基因工程抗体治疗法 |
| 1.6.5 中西医结合治疗法 |
| 1.7 本研究的目的和意义 |
| 第2章 20株FPV的分离鉴定及VP2基因序列分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 生物材料 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 病料处理 |
| 2.2.2 病毒DNA的提取 |
| 2.2.3 PCR鉴定 |
| 2.2.4 病毒分离 |
| 2.2.5 VP2基因扩增 |
| 2.2.6 全基因组扩增 |
| 2.2.7 病毒电镜观察 |
| 2.2.8 VP2序列分析 |
| 2.2.9 全基因组序列分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 PCR鉴定结果 |
| 2.3.2 病毒分离结果 |
| 2.3.3 电镜观察结果 |
| 2.3.4 VP2序列分析 |
| 2.3.5 全基因组序列分析 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 FPV VP2基因的原核、真核表达及鉴定 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 生物材料 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 引物设计 |
| 3.2.2 目的基因的获取 |
| 3.2.3 VP2的原核表达载体的构建、表达及鉴定 |
| 3.2.4 VP2的真核表达载体的构建、表达及鉴定 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 目的基因克隆 |
| 3.3.2 重组质粒的酶切鉴定 |
| 3.3.3 重组VP2蛋白的SDS-PAGE鉴定 |
| 3.3.4 重组VP2蛋白的WB鉴定 |
| 3.3.5 VP2间接ELISA方法的初步建立 |
| 3.3.6 间接免疫荧光分析VP2蛋白在FK81细胞中的表达 |
| 3.3.7 小鼠体内抗体检测结果 |
| 3.4 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章：犬细小病毒的分子生物学、流行病学和免疫防控技术的研究进展 |
| 1.犬细小病毒的基因结构及遗传变异 |
| 1.1 CPV的基因组结构 |
| 1.2 CPV的遗传变异 |
| 1.2.1 CPV-2a/2b 型和New CPV-2a/2b 型的出现 |
| 1.2.2 CPV-2c型的出现 |
| 1.3 CPV的流行 |
| 1.3.1 CPV国外流行近况 |
| 1.3.2 CPV国内流行近况 |
| 2.免疫防控研究进展 |
| 2.1 疫苗研究进展 |
| 2.1.1 灭活疫苗 |
| 2.1.2 弱毒疫苗 |
| 2.1.3 核酸疫苗 |
| 2.1.4 病毒颗粒样疫苗 |
| 2.2 治疗性抗体研究进展 |
| 2.2.1 高免血清 |
| 2.2.2 单克隆抗体 |
| 2.2.3 卵黄抗体 |
| 3.问题与展望 |
| 第二章:2019-2020 年四川省成都市CPV的分子检测 |
| 1.材料 |
| 1.1 临床样本的采集 |
| 1.2 主要试剂与仪器 |
| 2.方法 |
| 2.1 病毒核酸的提取 |
| 2.2 CPV的检测 |
| 2.3 CPV阳性样本VP2 基因片段扩增 |
| 2.4 CPV阳性样本VP2 序列分析 |
| 2.4.1 CPV阳性样本的分型 |
| 2.4.2 CPV阳性样本相似性分析 |
| 2.4.3 CPV阳性样本遗传进化分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 CPV RT-PCR检测结果 |
| 3.2 CPV的序列分析 |
| 3.2.1 CPV的抗原型 |
| 3.2.2 CPV相似性分析 |
| 3.2.3 CPV遗传进化分析 |
| 4.讨论 |
| 4.1 2019-2020 年成都市CPV流行情况 |
| 4.2 CPV不同抗原型流行毒株分布情况 |
| 4.3 CPV-2a型与CPV-2c型混合感染 |
| 5.小结 |
| 第三章:CPV-2a型毒株的分离鉴定及其基因组特征 |
| 1.材料 |
| 1.1 细胞株与临床样本 |
| 1.2 主要试剂与仪器 |
| 2.方法 |
| 2.1 病毒分离培养 |
| 2.1.1 样品处理 |
| 2.1.2 分离培养 |
| 2.2 病毒鉴定 |
| 2.2.1 PCR鉴定 |
| 2.2.2 间接免疫荧光鉴定 |
| 2.2.3 透射电镜鉴定 |
| 2.2.4 病毒的空斑纯化 |
| 2.3 CPV基因组扩增及序列分析 |
| 2.3.1 引物的设计与合成 |
| 2.3.2 PCR扩增目的片段 |
| 2.3.3 PCR产物的连接、转化 |
| 2.3.4 CPV分离毒株5' 端和3' 端的RACE PCR扩增 |
| 2.3.5 CPV分离毒株基因组序列的拼接 |
| 2.3.6 CPV分离毒株基因组序列遗传进化分析 |
| 2.4 CPV基因组的核对 |
| 3.结果 |
| 3.1 病毒分离培养结果 |
| 3.2 病毒鉴定结果 |
| 3.2.1 PCR鉴定结果 |
| 3.2.2 间接免疫荧光鉴定 |
| 3.2.3 透射电镜观察 |
| 3.3 基因组分段扩增结果 |
| 3.4 CD-DY6-2019 分离株的基因组 |
| 3.5 CD-DY6-2019 分离株基因组的氨基酸位点变化 |
| 3.5.1 CD-DY6-2019 分离株NS1 蛋白氨基酸位点的变化 |
| 3.5.2 CD-DY6-2019 分离株VP2 蛋白氨基酸位点的变化 |
| 3.6 CD-DY6-2019 分离株基因组的遗传进化 |
| 3.6.1 CD-DY6-2019 分离株的相似性 |
| 3.6.2 CD-DY6-2019 分离株全基因核苷酸进化树 |
| 3.6.3 CD-DY6-2019 分离株NS1 基因氨基酸进化树 |
| 3.6.4 CD-DY6-2019 分离株VP2 基因氨基酸进化树 |
| 4.讨论 |
| 4.1 CD-DY6-2019 分离株的分离鉴定 |
| 4.2 CD-DY6-2019 分离株的基因组 |
| 4.3 CD-DY6-2019 分离株NS1 基因 |
| 4.4 CD-DY6-2019 分离株VP1及VP2 基因 |
| 5.小结 |
| 第四章:CPV-2c型精制卵黄抗体的研制 |
| 1.材料 |
| 1.1 病毒株、细胞系、实验动物 |
| 1.2 主要试剂与仪器 |
| 1.3 主要试剂的配置 |
| 1.3.1 醋酸缓冲溶液(p H=4.5)的配制 |
| 2.方法 |
| 2.1 CPV灭活疫苗的制备及质量检验 |
| 2.2 蛋鸡免疫程序 |
| 2.3 辛酸-PEG6000 法提纯卵黄抗体 |
| 2.4 卵黄抗体中和效价 |
| 2.5 精制卵黄抗体交叉中和试验 |
| 3.结果 |
| 3.1 疫苗质量 |
| 3.2 辛酸-PEG6000 法提纯卵黄抗体的提取率 |
| 3.3 卵黄抗体中和效价 |
| 3.4 精制卵黄抗体的交叉保护力评价 |
| 4.讨论 |
| 4.1 卵黄抗体的消长及交叉保护 |
| 4.2 卵黄抗体的提取 |
| 5.小结 |
| 结论和创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩写与符号清单 |
| 文献综述 |
| 1 犬细小病毒概述 |
| 2 犬细小病毒病原学特征 |
| 3 犬细小病毒诊断技术研究进展 |
| 4 犬细小病毒的治疗与预防 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病料来源与毒株 |
| 2.1.2 主要试剂和溶液配制 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 病料处理 |
| 2.2.2 引物的合成与设计 |
| 2.2.3 病料DNA提取 |
| 2.2.4 PCR反应 |
| 2.2.5 PCR产物的纯化 |
| 2.2.6 纯化产物的连接 |
| 2.2.7 转化 |
| 2.2.8 菌液PCR |
| 2.2.9 质粒DNA提取与测序 |
| 2.2.10 CPV的分型 |
| 2.2.11 CPV全基因组序列分析 |
| 2.2.12 实时荧光定量PCR重组质粒浓度测定与拷贝数计算 |
| 2.2.13 实时荧光定量PCR最佳反应参数的优化 |
| 2.2.14 实时荧光定量PCR标准曲线的建立 |
| 2.2.15 实时荧光定量PCR特异性检验 |
| 2.2.16 实时荧光定量PCR敏感性检验 |
| 2.2.17 实时荧光定量PCR重复性检验 |
| 2.2.18 临床样本检测 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 安徽部分地区CPV鉴定、全基因组克隆与序列分析结果 |
| 3.1.1 安徽部分地区CPV鉴定结果 |
| 3.1.2 安徽部分地区CPV全基因组测序结果 |
| 3.1.3 CPV全基因组结构分析 |
| 3.1.4 同源性分析 |
| 3.1.5 遗传进化分析 |
| 3.1.6 主要氨基酸位点突变分析 |
| 3.1.7 NS1和VP2蛋白选择压力 |
| 3.2 犬细小病毒SYBR green Ⅰ荧光定量检测方法的建立结果与分析 |
| 3.2.1 优化后的反应参数 |
| 3.2.2 标准曲线的建立 |
| 3.2.3 特异性实验分析 |
| 3.2.4 敏感性实验分析 |
| 3.2.5 重复性实验分析 |
| 3.2.6 临床样本检测 |
| 4 讨论 |
| 4.1 安徽部分地区CPV全基因组序列分析 |
| 4.2 犬细小病毒SYBR green Ⅰ荧光定量检测方法的建立 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 文献综述 |
| 1.1 犬冠状病毒病概述 |
| 1.1.1 国内外流行情况 |
| 1.1.2 临床症状 |
| 1.1.3 致病机制 |
| 1.1.4 诊断方法 |
| 1.1.5 预防与治疗 |
| 1.2 CCoV生物学特征 |
| 1.2.1 CCoV形态及结构 |
| 1.2.2 CCoV基因组结构 |
| 1.2.3 CCoV结构蛋白 |
| 1.3 本研究目的与意义 |
| 2 中国地区CCoV流行性Meta分析 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.2 研究方法 |
| 2.2.1 文库检索范围 |
| 2.2.2 检索策略 |
| 2.2.3 选择标准 |
| 2.2.4 数据提取 |
| 2.2.5 数据分析 |
| 2.2.6 森林图 |
| 2.2.7 偏倚分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 文献搜索结果 |
| 2.3.2 纳入文献基本情况 |
| 2.3.3 单组率Meta分析 |
| 2.3.4 中国各地区CCoV感染率相关性分析 |
| 2.4 讨论 |
| 3 黑龙江地区CCoV分子流行病学调查 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 试验样品 |
| 3.1.2 主要生化试剂 |
| 3.1.3 主要仪器设备 |
| 3.1.4 引物 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 样品处理 |
| 3.2.2 目的基因测序与遗传进化性分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 目的基因PCR扩增 |
| 3.3.2 目的基因PCR产物纯化鉴定 |
| 3.3.3 CCoV样品阳性率及基因分型 |
| 3.3.4 相关性分析 |
| 3.3.5 系统进化树分析 |
| 3.3.6 核苷酸与氨基酸同源性分析 |
| 3.3.7 序列比对分析 |
| 3.3.8 基因重组分析 |
| 3.3.9 N-糖基化位点分析 |
| 3.3.10 抗原位点分析 |
| 3.4 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 基因工程抗体 |
| 1.1.1 嵌合抗体 |
| 1.1.2 改型抗体 |
| 1.1.3 全人源抗体 |
| 1.1.4 单链抗体 |
| 1.1.5 双特异性抗体 |
| 1.2 基因工程抗体的制备 |
| 1.2.1 抗体基因的重组及表达 |
| 1.2.2 基因工程抗体表达系统 |
| 1.3 犬细小病毒的研究进展 |
| 1.3.1 犬细小病毒编码的蛋白质及其功能 |
| 1.3.2 犬细小病毒的致病机制 |
| 1.3.3 犬细小病毒的流行情况 |
| 1.3.4 犬细小病毒的现有疫苗 |
| 1.3.5 犬细小病毒的治疗研究进展 |
| 1.4 研究目的及意义 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 病毒与细胞 |
| 2.2 主要溶液及配制方法 |
| 2.3 方法 |
| 2.3.1 杂交瘤细胞株的鉴定 |
| 2.3.2 鼠源CPV基因工程抗体的制备 |
| 2.3.3 表达蛋白鼠源CPV基因工程抗体的活性鉴定 |
| 2.3.4 悬浮细胞表达鼠源CPV基因工程抗体 |
| 2.3.5 鼠源CPV基因工程抗体表达量检测 |
| 2.3.6 鼠源CPV基因工程抗体纯化 |
| 2.3.7 SDS-PAGE检测鼠源CPV基因工程抗体 |
| 2.3.8 间接免疫荧光检测鼠源CPV基因工程抗体 |
| 2.3.9 犬源化CPV基因工程抗体的制备 |
| 2.3.10 表达蛋白犬源化CPV基因工程抗体的活性鉴定 |
| 2.3.11 悬浮细胞表达犬源化CPV基因工程抗体 |
| 2.3.12 犬源化CPV基因工程抗体纯化 |
| 2.3.13 SDS-PAGE及 Western-blot检测犬源化CPV基因工程抗体 |
| 2.3.14 犬源化CPV基因工程抗体表达量检测 |
| 2.3.15 间接免疫荧光检测犬源化CPV基因工程抗体 |
| 第3章 结果 |
| 3.1 杂交瘤细胞株的鉴定 |
| 3.1.1 单克隆抗体亚型鉴定 |
| 3.1.2 单克隆抗体相对亲和力测定 |
| 3.1.3 单克隆抗体特异性测定 |
| 3.2 鼠源CPV基因工程抗体的制备 |
| 3.2.1 鼠源CPV基因工程抗体可变区序列的获得 |
| 3.2.2 鼠源抗体可变区序列分区 |
| 3.2.3 鼠源CPV基因工程抗体真核表达载体鉴定 |
| 3.3 表达鼠源CPV基因工程抗体的活性研究 |
| 3.3.1 血凝抑制检测 |
| 3.3.2 中和试验检测 |
| 3.4 鼠源CPV基因工程抗体表达量检测 |
| 3.5 SDS-PAGE检测鼠源CPV基因工程抗体 |
| 3.6 间接免疫荧光检测鼠源CPV基因工程抗体 |
| 3.7 犬源化CPV基因工程抗体表达载体构建鉴定 |
| 3.8 表达犬源化CPV基因工程抗体的活性研究 |
| 3.8.1 血凝抑制检测 |
| 3.8.2 中和实验检测 |
| 3.9 犬源化CPV基因工程抗体纯化 |
| 3.10 SDS-PAGE及 Western-blot检测犬源化CPV基因工程抗体 |
| 3.11 犬源化CPV基因工程抗体蛋白纯度分析 |
| 3.12 间接免疫荧光检测犬源化CPV基因工程抗体 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 结论 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 论文中提出的新方法和新思路 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 攻读硕士学位期间研究成果 |
| 摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 1.1 犬细小病毒病概述 |
| 1.2 犬细小病毒病原学 |
| 1.3 犬细小病毒流行病学 |
| 1.4 犬细小病毒的诊断与防治 |
| 1.5 马抗免疫球蛋白研究进展 |
| 1.6 研究目的及意义 |
| 1.7 本研究的技术路线 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 长春地区犬细小病毒流行毒株的分离与鉴定 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 马抗CPV-2c免疫球蛋白的制备 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
| 研究项目资助说明 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 1 引言 |
| 1.1 犬瘟热概述 |
| 1.1.1 犬瘟热病毒 |
| 1.1.2 犬瘟热的流行病学 |
| 1.2 犬副流感概述 |
| 1.2.1 犬副流感病毒 |
| 1.2.2 犬副流感的流行病学 |
| 1.3 犬传染性肝炎概述 |
| 1.3.1 犬腺病毒 |
| 1.3.2 犬传染性肝炎的流行病学 |
| 1.4 犬细小病毒病概述 |
| 1.4.1 犬细小病毒 |
| 1.4.2 犬细小病毒病的流行病学 |
| 1.5 病毒的检测方法 |
| 1.5.1 病毒分离鉴定 |
| 1.5.2 血清学检测 |
| 1.5.3 分子生物学检测 |
| 1.6 本研究相关病毒PCR方法的研究 |
| 1.7 本研究的目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病毒核酸及检测样品 |
| 2.1.2 主要试剂及仪器设备 |
| 2.1.3 溶液配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 CDV、CPV、CAV-Ⅱ、CPIV引物探针设计与合成 |
| 2.2.2 四种病毒单重荧光定量PCR方法的建立 |
| 2.2.3 四重荧光定量PCR方法的建立 |
| 3 结果 |
| 3.1 四种病毒单重荧光定量PCR方法建立 |
| 3.1.1 四种病毒质粒标准品制备结果 |
| 3.1.2 四种病毒单重荧光定量PCR反应体系和条件优化结果 |
| 3.1.3 四种病毒单重荧光定量PCR标准曲线建立结果 |
| 3.1.4 四种病毒单重荧光定量PCR敏感性试验结果 |
| 3.1.5 四种病毒单重荧光定量PCR的重复性试验结果 |
| 3.1.6 四种病毒单重荧光定量PCR的特异性试验结果 |
| 3.1.7 四种病毒单重荧光定量PCR样品检测结果 |
| 3.2 四重荧光定量PCR方法建立结果 |
| 3.2.1 四重荧光定量PCR反应体系优化结果 |
| 3.2.2 四重荧光定量PCR反应标准曲线建立 |
| 3.2.3 四重荧光定量PCR反应敏感性试验结果 |
| 3.2.4 四重荧光定量PCR重复性试验结果 |
| 3.2.5 四重荧光定量PCR特异性试验结果 |
| 3.2.6 四重荧光定量PCR样品检测结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 FPV流行情况 |
| 1.2 FPV概述 |
| 1.2.1 FPV形态特征及生物学特性 |
| 1.2.2 FPV基因组结构 |
| 1.2.3 FPV编码蛋白及其功能 |
| 1.2.4 FPV起源、变异与进化 |
| 1.2.5 FPV感染后临床症状和病理变化 |
| 1.3 FPV诊断方法 |
| 1.3.1 免疫荧光实验(IFA) |
| 1.3.2 酶联免疫吸附实验 |
| 1.3.3 病毒的分离与鉴定 |
| 1.3.4 电镜与免疫电镜检查 |
| 1.3.5 血凝及血凝抑制实验 |
| 1.3.6 聚合酶链式反应(PCR)检测 |
| 1.4 研究目的和意义 |
| 第二章 FPV的分离鉴定 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 样品与来源 |
| 2.1.2 主要试剂与仪器 |
| 2.1.3 细胞 |
| 2.1.4 实验动物 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 病毒分离培养 |
| 2.2.2 PCR鉴定 |
| 2.2.3 VP2基因全长扩增及测序鉴定 |
| 2.2.4 免疫荧光实验(IFA) |
| 2.2.5 TCID_(50)测定 |
| 2.2.6 电镜观察 |
| 2.2.7 动物回归实验 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 病毒分离培养 |
| 2.3.2 PCR鉴定 |
| 2.3.3 VP2基因全长扩增及序列分析 |
| 2.3.4 IFA |
| 2.3.5 TCID_(50)测定 |
| 2.3.6 电镜观察 |
| 2.3.7 动物回归实验 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 检测FPV的TaqMan qPCR和FHV-1的PCR方法的建立 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 毒株 |
| 3.1.2 主要试剂和耗材 |
| 3.1.3 实验仪器 |
| 3.1.4 引物的设计与合成 |
| 3.1.5 病毒DNA/RNA的提取 |
| 3.1.6 标准质粒的制备 |
| 3.1.7 FPV Taq Man qPCR和FHV-1 PCR反应条件的优化 |
| 3.1.8 FPV Taq Man qPCR和FHV-1 PCR特异性实验 |
| 3.1.9 FPV Taq Man qPCR和FHV-1 PCR重复性实验 |
| 3.1.10 FPV Taq Man qPCR和FHV-1 PCR敏感性实验 |
| 3.1.11 敏感性实验对比 |
| 3.1.12 临床样品检测 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 标准质粒的制备 |
| 3.2.2 FPV Taq Man qPCR和FHV-1 PCR反应条件的优化 |
| 3.2.3 FPV Taq Man qPCR和FHV-1 PCR特异性实验 |
| 3.2.4 FPV Taq Man qPCR和FHV-1 PCR重复性实验 |
| 3.2.5 FPV Taq Man qPCR和FHV-1 PCR敏感性实验 |
| 3.2.6 敏感性实验对比 |
| 3.2.7 临床样品检测 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 FPV VP2基因遗传演化分析 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 样品与来源 |
| 4.1.2 细胞 |
| 4.1.3 主要试剂与耗材 |
| 4.1.4 实验仪器 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 病毒分离培养 |
| 4.2.2 核酸提取、VP2基因PCR扩增 |
| 4.2.3 序列分析 |
| 4.2.4 选择压力分析 |
| 4.2.5 系统发育树的构建 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 病毒分离培养 |
| 4.3.2 VP2基因PCR扩增 |
| 4.3.3 序列分析 |
| 4.3.4 选择压力分析 |
| 4.3.5 系统发育树构建 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 犬细小病毒概述及其治疗性抗体的研究进展 |
| 1 犬细小病毒概述 |
| 1.1 CPV的分类 |
| 1.2 CPV的结构 |
| 1.2.1 CPV的形态结构及基因组结构 |
| 1.2.2 CPV的非结构蛋白 |
| 1.2.3 CPV的结构蛋白 |
| 1.3 CPV的起源 |
| 1.4 CPV的遗传变异 |
| 1.4.1 CPV-2a/2b型和New CPV-2a/2b型的出现 |
| 1.4.2 CPV-2c型的出现 |
| 1.5 CPV的流行 |
| 1.5.1 CPV国外流行情况 |
| 1.5.2 CPV国内流行情况 |
| 1.6 CPV的致病性 |
| 1.7 CPV的预防 |
| 2 CPV的治疗性抗体研究进展 |
| 2.1 血清抗体 |
| 2.2 单克隆抗体 |
| 2.3 卵黄抗体 |
| 3 问题与展望 |
| 第二章 犬细小病毒的分子检测及其混合感染情况 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 临床样本的采集 |
| 1.2 主要试剂与仪器 |
| 1.3 CPV的分布及其混合感染检测 |
| 1.3.1 病毒核酸的提取 |
| 1.3.2 CPV的 PCR检测 |
| 1.3.3 腹泻相关病毒的PCR检测 |
| 1.4 CPV阳性样本VP2基因片段扩增及序列分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 CPV的分布及其混合感染情况 |
| 2.1.1 CPV的分布情况 |
| 2.1.2 混合感染情况 |
| 2.2 CPV的抗原型 |
| 2.3 CPV的VP2基因序列片段分析 |
| 2.3.1 VP2基因片段的遗传进化 |
| 2.3.2 VP2基因片段的氨基酸位点变化 |
| 3 讨论 |
| 3.1 CPV的 PCR检测结果 |
| 3.2 阳性样本复杂的混合感染情况 |
| 3.3 CPV不同抗原型流行毒株分布情况 |
| 3.4 CPV的氨基酸位点变化 |
| 4 小结 |
| 第三章 CPV3种抗原型毒株的分离鉴定及其基因组特征 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 细胞株与临床样本 |
| 1.2 主要试剂与仪器 |
| 1.3 病毒分离培养 |
| 1.3.1 样品处理 |
| 1.3.2 分离培养 |
| 1.4 病毒鉴定 |
| 1.4.1 PCR鉴定 |
| 1.4.2 间接免疫荧光鉴定 |
| 1.5 病毒的空斑纯化 |
| 1.6 病毒TCID50的测定 |
| 1.7 CPV基因组扩增及序列分析 |
| 1.7.1 引物的设计与合成 |
| 1.7.2 PCR扩增目的片段 |
| 1.7.3 PCR产物的连接、转化 |
| 1.7.4 CPV分离毒株5'端和3'端的RACE PCR扩增 |
| 1.7.5 CPV分离毒株基因组序列的拼接与遗传进化分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 病毒分离培养结果 |
| 2.2 病毒鉴定结果 |
| 2.2.1 PCR鉴定结果 |
| 2.2.2 间接免疫荧光鉴定 |
| 2.3 病毒的空斑纯化 |
| 2.4病毒分离株的TCID50 |
| 2.5 基因组分段扩增结果 |
| 2.6 3个CPV分离株的基因组 |
| 2.7 3个分离株基因组的氨基酸位点变化及遗传进化 |
| 2.7.1 3个分离株基因组的氨基酸位点变化 |
| 2.7.2 3个分离株基因组的遗传进化 |
| 3 讨论 |
| 3.1 3个分离毒株的基因组 |
| 3.2 3个分离毒株的氨基酸位点变化 |
| 4 小结 |
| 第四章 3种CPV抗原型分离毒株的抗原性研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 病毒株、细胞系、实验动物 |
| 1.2 主要试剂与仪器 |
| 1.3 主要试剂的配置 |
| 1.4 CPV灭活疫苗的制备及质量检验 |
| 1.5 蛋鸡免疫程序 |
| 1.6 卵黄抗体的制备 |
| 1.7 抗体血凝抑制(HI)试验 |
| 1.8 卵黄抗体交叉中和试验 |
| 2 结果 |
| 2.1 疫苗质量 |
| 2.2 卵黄抗体消长规律 |
| 2.3 5种抗体的交叉保护力评价 |
| 3 讨论 |
| 3.1 分离毒株的抗原性 |
| 3.23 种不同抗原型卵黄抗体的交叉保护力 |
| 3.3 抗CPV卵黄抗体的制备 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录1 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| SUMMARY |
| 缩略语表 |
| 第一章 毛皮动物主要病毒性传染病研究进展 |
| 1.1.犬瘟热研究进展 |
| 1.1.1.CDV的分类与形态结构 |
| 1.1.2.CDV基因组编码蛋白及其功能 |
| 1.1.3.CDV的流行病学 |
| 1.1.4.CDV的临床症状 |
| 1.1.5.CDV的诊断技术进展 |
| 1.1.6.CDV的防治研究进展 |
| 1.2.毛皮动物细小病毒病研究进展 |
| 1.2.1.细小病毒的分类 |
| 1.2.2.生物学差异 |
| 1.2.3.MEV的研究进展 |
| 1.2.4.细小病毒疫苗的研究进展 |
| 1.3.水貂阿留申病研究进展 |
| 1.3.1.AMDV的分类与形态结构 |
| 1.3.2.AMDV的分子生物学特性 |
| 1.3.3.AMDV的流行病学与临床症状 |
| 1.3.4.AMDV的检测技术进展 |
| 1.3.5.ADM的综合防治措施 |
| 第二章 毛皮动物主要细菌性疾病研究进展 |
| 2.1.大肠杆菌病研究进展 |
| 2.1.1.病原学 |
| 2.1.2.流行病学 |
| 2.1.3.临床症状与病理变化 |
| 2.1.4.防治措施 |
| 2.2.肺炎克雷伯氏菌病研究进展 |
| 2.2.1.病原学 |
| 2.2.2.流行病学 |
| 2.2.3.临床症状与病理变化 |
| 2.2.4.防治措施 |
| 2.3.绿脓杆菌病研究进展 |
| 2.3.1.病原学 |
| 2.3.2.流行病学 |
| 2.3.3.临床症状与病理变化 |
| 2.3.4.防治措施 |
| 第三章 威海地区主要毛皮动物养殖及疾病防治情况调查 |
| 3.1.材料与方法 |
| 3.1.1.调查范围 |
| 3.1.2.调查内容 |
| 3.1.3.调查途径 |
| 3.2.结果 |
| 3.2.1.养殖概况 |
| 3.2.2.防疫情况 |
| 3.2.3.常见疫病免疫情况 |
| 3.2.4.养殖用药情况 |
| 3.2.5.主要发病情况 |
| 3.3.讨论 |
| 3.3.1.养殖数量与密度的影响 |
| 3.3.2.不同饲养管理水平的影响 |
| 3.3.3.防疫措施的影响 |
| 3.3.4.疫苗免疫的因素 |
| 3.3.5.畜牧管理体制变动的影响 |
| 3.3.6.主要疾病传播流行特点 |
| 3.4.小结 |
| 第四章 威海地区主要毛皮动物大型养殖场常见病毒的PCR检测及序列分析 |
| 4.1.材料与方法 |
| 4.1.1.样品采集 |
| 4.1.2.主要实验试剂与仪器 |
| 4.1.3.样品的处理 |
| 4.1.4.核酸的提取 |
| 4.1.5.病毒性病原的检测 |
| 4.2.结果 |
| 4.2.1.病料剖检结果 |
| 4.2.2.CDV的检测结果 |
| 4.2.3.CDV的序列分析结果 |
| 4.2.4.MEV的检测结果 |
| 4.2.5.MEV的序列分析结果 |
| 4.2.6.AMDV的检测结果 |
| 4.2.7.感染统计结果 |
| 4.3.讨论 |
| 4.3.1.病毒性疾病持续流行 |
| 4.3.2.疫苗免疫保护出现漏洞 |
| 4.4.小结 |
| 第五章 威海地区主要毛皮动物大型养殖场病原菌的分离鉴定及药物敏感性试验 |
| 5.1.材料与方法 |
| 5.1.1.样品来源 |
| 5.1.2.主要实验试剂与仪器 |
| 5.1.3.样品剖检 |
| 5.1.4.细菌的分离培养 |
| 5.1.5.细菌的纯化与染色 |
| 5.1.6.生化鉴定与药敏试验 |
| 5.1.7.血清型鉴定 |
| 5.2.结果 |
| 5.2.1.病料剖检症状 |
| 5.2.2.细菌的分离及生化鉴定结果 |
| 5.2.3.分离菌的药敏实验结果 |
| 5.2.4.血清学分型统计结果 |
| 5.2.5.感染统计结果 |
| 5.3.讨论 |
| 5.3.1.病原种类多样,混合感染突出 |
| 5.3.2.条件性致病菌感染流行普遍 |
| 5.3.3.细菌耐药性需要加强关注 |
| 5.4.小结 |
| 第六章 饲料中添加益生菌制剂对水貂免疫功能的影响 |
| 6.1.材料与方法 |
| 6.1.1.实验材料 |
| 6.1.2.实验动物及饲粮 |
| 6.1.3.实验设计与饲养管理 |
| 6.1.4.免疫指标的测定 |
| 6.1.5.疫苗抗体的测定 |
| 6.1.6.试验数据统计 |
| 6.2.结果 |
| 6.2.1.益生菌制剂对水貂免疫指标的影响 |
| 6.2.2.益生菌制剂对水貂犬瘟热疫苗抗体的影响 |
| 6.3.讨论 |
| 6.4.小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 导师简介 |
