张华[1]（2021）在《梓醇抑制NF-κB/MAPK信号通路的抗炎机制及其抗子宫内膜炎的作用研究》文中研究说明奶牛子宫内膜炎是产后奶牛多发的一种生殖系统功能障碍性疾病。临床上,个体体况不佳造成的产后免疫力下降,产后生殖道发生微生物感染,以及产后护理不周等因素均可引发奶牛子宫内膜炎,严重的可引发奶牛的不孕不育,降低奶牛的生产性能和经济价值。目前奶牛子宫内膜炎的治疗包括抗微生物药物和激素类药物。长期、频繁使用抗微生物药物和激素药物,会导致微生物对药物产生耐药性,并在牛奶及体内产生药物残留,一旦乳制品及肉类进入消费市场,则引发食品安全、环境安全并危害人类的健康。中药是天然药物,在兽医临床上具有悠久的用药历史,使用中药方剂治疗奶牛子宫内膜炎,不会产生体内药物残留和耐药性问题,但用药量大,药物有效成分的剂量很难确定,中药相互之间的作用机制并不清楚。对中药中的有效成分进行分析提纯,研究出中药中的有效成分的药理机制及用药剂量,能大大提高中药的利用率。中草药地黄的药用历史非常悠久,具有清热、止血、滋阴生津的功效,其大量有效成分已被广泛研究。梓醇是从地黄中提取的有效成分之一,目前已有动物模型研究证明,梓醇对机体肺脏、肾脏、心脏具有保护和抗炎作用,但对子宫内膜组织的抗炎药理机制研究还未见报道。本试验构建了 RAW264.7细胞炎症模型和奶牛子宫内膜上皮细胞（bEECs）炎症模型,并建立了小鼠子宫内膜炎症模型,通过梓醇干预,运用ELISA、RT-qPCR、Western blot、细胞免疫荧光检测方法,研究梓醇经由经典炎症通路NF-κB和MAPK的抗炎机制,旨在为后续治疗奶牛子宫内膜炎提供物质基础和理论依据。试验结果显示:在RAW264.7细胞培养液中添加3mM、0.3mM、0.03mM、3uM、0.3uM浓度的梓醇,分别培养6h、12h、24h,CCK-8检测显示细胞培养12h时细胞增殖速度最快,不同的培养时间、不同梓醇浓度对RAW264.7细胞增殖无显着影响,不同浓度的梓醇对RAW264.7细胞无毒性;试验选择3mM、0.3mM、0.03mM浓度的梓醇和RAW264.7细胞培养12h作为后续试验的基础设置。构建LPS刺激下的RAW264.7细胞炎症模型、梓醇干预,采用ELISA、RT-qPCR、Western blot和细胞免疫荧光检测发现,梓醇可下调LPS刺激的RAW264.7细胞分泌的炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α的水平,降低TLR4的基因和蛋白表达。进一步研究发现,梓醇通过抑制IκBa的降解和p-p65入核表达,减弱RAW264.7炎性细胞NF-κB信号通路的传导;通过下调p38、ERK、JNK磷酸化水平的表达,抑制RAW264.7炎性细胞MAPK信号通路的传导,并且随着梓醇浓度的提高,其对上述结果的抑制效果越明显。建立LPS刺激bEECs细胞炎症模型,选择对bEECs细胞增殖无显着影响的1mM、0.1mM、0.01mM浓度的梓醇做干预试验,以培养细胞增殖速度最快的12h作为后续试验的基础设置。试验先加入地塞米松、梓醇预处理1h,再加入LPS刺激作用12h,设置空白组、LPS对照组（1ug/mL）、地塞米松阳性对照组（0.5ug/mL）、梓醇干预组（1mM、0.1mM、0.01mM）。分别收集培养上清液和细胞,采用ELISA、RT-qPCR和Western blot测定基因和蛋白表达。结果显示,LPS可明显刺激bEECs细胞分泌炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α和趋化因子CXCL8、CXCL5的表达;而加入1mM、0.1mM、0.01mM浓度梓醇预处理的bEECs组,炎性因子和趋化因子的表达均呈现显着的剂量依赖性降低。细胞免疫荧光检测显示,梓醇预处理的bEECs细胞的p65入核表达受到明显抑制,TLR4/NF-κB炎性信号通路的传导也受到不同程度的抑制。构建小鼠子宫内膜炎模型和梓醇干预模型。向小鼠两侧子宫角分别注射LPS（Img/kg）刺激24h,然后分别腹腔注射1 mg/kg、10 mg/kg和100mg/kg的梓醇继续作用24h。采集小鼠血清和子宫组织,采用ELISA、RT-qPCR、Western blot和细胞免疫荧光检测等方法测定炎性因子、趋化因子、TLR4/NF-κB信号通路蛋白等的表达以及子宫组织MPO活性,结果发现,不同浓度的梓醇均可降低小鼠子宫组织MPO活性,降低小鼠血清中炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α的基因表达水平和子宫组织中趋化因子CXCL8、CXCL5的基因表达水平,并且抑制炎性小鼠子宫组织中TLR4/NF-κB信号通路的蛋白表达。结果表明,梓醇可有效改善子宫内膜的炎症状态,并且梓醇浓度越高,其抗炎越明显。综上所述,梓醇以剂量依赖方式抑制TLR4信号的传导、阻止其下游NF-κB和MAPK信号通路的表达,通过显着减低炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α和趋化因子CXCL8、CXCL5以及子宫组织的MPO活性,对子宫内膜组织实施抗炎保护作用。
高耀[2]（2021）在《基于多组学和网络药理学的逍遥散抗抑郁作用机制整合研究》文中认为选题依据:抑郁症是一种复杂的疑难疾病,临床表现为情绪低落、快感缺乏,严重影响人类的身心健康。目前抑郁症的发病机制假说众多,相互交叉,从不同角度揭示抑郁症病因和病机具有复杂性。中药以其整体观和辨证论治特点,在抑郁症的治疗方面优势明显,积累了很多宝贵的经验。逍遥散源于宋代《太平惠民和剂局方》,是疏肝解郁调和肝脾的代表方剂,在抑郁症治疗方面一直被广泛关注。现代临床和实验研究证明,该方具有确切的抗抑郁作用,已成为治疗抑郁症常用的经典方剂之一。然而目前逍遥散的报道多从单一靶点研究阐释其作用机制,而对抑郁症多靶点的特征缺乏足够的重视,难以深入地揭示其抗抑郁作用机制。与其他中药复方相似,逍遥散也是一个多成分、多靶点、多机制,以及组分之间互相作用的复杂体系,对其作用机制的研究大多是“知其然,不知其所以然”。目前关于逍遥散抗抑郁的研究主要存在以下问题:1.逍遥散抗抑郁的机制研究具有单一性,多以代谢组学或分子生物学技术为手段,缺乏同一层次的数据整合分析的方法;2.多组学数据资料不完善,缺乏从多层次“转录组-蛋白组-代谢组”整合分析的研究数据;3.逍遥散以“多成分”作用于抑郁症“多靶点”模式发挥治疗效果,尚无以“多成分-多靶点”的研究模式阐明逍遥散抗抑郁机制。因此,本研究从中药整体观的角度出发,运用多组学和网络药理学的整体研究思路,从多层次、多角度入手,系统阐释逍遥散抗抑郁的作用机理。针对这样的复杂系统,需要借助系统生物学及现代药理学实验技术的参与。首先,表征逍遥散的化学成分和构建慢性温和不可预知刺激应激（CUMS）大鼠抑郁模型,验证逍遥散抗抑郁效果及采集组学分析的样本;其次,构建逍遥散抗抑郁代谢表型研究方法和代谢表型通路优化排序方法,从代谢表型层次阐明逍遥散抗抑郁作用机制;再次,采用转录组学和蛋白质组学技术,筛选给予逍遥散后CUMS大鼠海马组织的差异基因和差异蛋白,多组学层次整合分析逍遥散抗抑郁作用机制,并进行分子生物学验证;最后,采用ADME预测和网络药理学的贡献指数模型筛选逍遥散活性成分,从“活性分子-关键通路”的角度明确逍遥散抗抑郁机制。该研究结果为采用组学和网络药理学的整合分析研究中药作用机理提供新思路和新方法,为逍遥散抗抑郁的药理机制深入研究提供基础,为逍遥散在临床上的应用提供理论依据,对中药复方现代化研究和新药研发具有重要的科学意义和临床价值。目的:（1）采用代谢表型进行同一层次的关联分析,构建代谢表型研究方法和代谢表型通路优化排序的方法,从代谢表型层次阐明逍遥散抗抑郁作用机制。（2）通过“转录组学-蛋白组学-代谢表型”的关联分析,从纵向层次找出与代谢表型关联性,从“基因-蛋白-代谢”多组学多层次角度阐明逍遥散抗抑郁机制。（3）基于实验数据的网络药理学角度出发,明确抑郁症的疾病网络,寻找逍遥散中的活性分子,从“多成分-多靶点”的立体角度,挖掘逍遥散抗抑郁的活性分子及机制研究。方法:（1）采用UPLC-MS/MS方法对逍遥散中的化学成分进行定性鉴定,明确逍遥散化学物质基础;构建CUMS大鼠抑郁模型,验证逍遥散抗抑郁作用;收集大鼠的海马组织和血清样本,为后续组学实验研究和分子实验验证提供样本支持。（2）采用代谢组学技术,分析逍遥散调节CUMS抑郁大鼠海马的代谢物及代谢通路;采用代谢表型网络和模块功能分析,聚焦逍遥散抗抑郁代谢特征,构建逍遥散抗抑郁表型网络,明确逍遥散抗抑郁的代谢表型机制;构建逍遥散抗抑郁代谢表型通路优化排序方法,明确逍遥散抗抑郁重要的代谢表型通路。（3）采用转录组学技术,分析逍遥散调节CUMS抑郁大鼠海马组织中的差异基因及重要通路,明确逍遥散在基因水平的抗抑郁机制;采用蛋白组学技术,分析逍遥散调节CUMS大鼠海马组织中的差异蛋白及重要通路,明确逍遥散在蛋白水平抗抑郁机制;采用多组学数据整合分析方法,挖掘逍遥散抗抑郁的关键通路,明确逍遥散在“基因-蛋白-代谢”多层次抗抑郁的通路;采用分子生物学方法验证逍遥散可能通过调节CUMS抑郁大鼠海马组织的氧化磷酸化和谷氨酸能突触通路发挥抗抑郁作用。（4）采用ADME分析方法,筛选逍遥散的活性分子;采用网络药理学的靶点预测、疾病网络分析和贡献指数模型,明确逍遥散抗抑郁的重要成分、重要靶点和关键通路;采用分子对接和分子生物学方法（RT-PCR和Western blot）,验证逍遥散重要成分通过调节CUMS抑郁大鼠海马组织的谷氨酸能突触通路发挥抗抑郁作用。结果:（1）本研究采用UPLC-MS/MS对逍遥散的化学成分进行了鉴定,通过对照品、文献中质谱数据与实验数据相结合的方法,共鉴定出62种成分。其中,柴胡中有14种成分,白芍中有8种成分,当归中有11种成分,白术中有4种成分,茯苓中有3种成分,甘草中有14种成分,薄荷中有4种成分和生姜有3种成分。该方法直接表征鉴定,与化学分离方法比较优势明显。逍遥散组（21.2 g生药/kg）能显着逆转CUMS引起的大鼠体重、糖水偏爱率、大鼠穿越格数、大鼠直立次数、进入中央区域次数和大鼠中央格停留时间显着性升高。（2）逍遥散抗抑郁海马代谢组学研究结果显示,与空白对照组相比,CUMS抑郁大鼠海马中共有25个差异代谢物发生了显着性变化。逍遥散干预后,共有16个差异代谢物被显着性回调。代谢表型研究发现逍遥散回调的代谢物有97个,其中在不同生物样本中调节的相同差异代谢物有34个,其中11个变化趋势一致,涉及的关键代谢功能为能量代谢和神经递质相关通路。使用CNM算法从逍遥散回调代谢网络提取9个代谢功能模块参与了逍遥散抗抑郁的机制研究。首次采用对接评分加权药理学指数（DSWMP）构建逍遥散抗抑郁代谢表型的通路优化排序方法。（3）转录组学结果显示:与模型组相比,逍遥散组大鼠海马有737个差异表达基因,其中上调基因263个,下调基因474个。与模型组/正常对照组鉴定差异基因比较,发现逍遥散回调的差异基因有106个,显着回调通路有16条,这些通路涉及γ-氨基丁酸能突触、5-羟色胺能突触、谷氨酸能突触和钙信号通路等。逍遥散可能通过调节这些通路上Adcy8、Gad1、Gad2、Htr2a、Chrna7、Erbb3、Map4k4、Nr4a1、Zfpm2、LOC100911372、Twist1、Ntng1、Robo3和Slit2发挥抗抑郁作用。蛋白组学结果显示:与模型组相比,逍遥散调节大鼠海马的差异表达蛋白有18个,其中上调13个,下调15个,与模型组/空白组鉴定的差异蛋白相比,发现逍遥散回调的差异蛋白有11个,包括RGD1311899、Krt10、Ndufab1、Cplx1、Fkbp8、Pafah1b3、Ndufs6、Sh3bgrl3、Pmm2、Fth1和Tbca。KEGG通路分析差异表达蛋白主要涉及通路为氧化磷酸化、突触小泡循环、脂质代谢、果糖和甘露糖代谢、氨基糖和核苷酸糖代谢等。多组学整合分析发现:转录组学和蛋白组学数据结果表明逍遥散通过调节CUMS抑郁大鼠氧化磷酸化通路发挥抗抑郁作用,具体的机制为逍遥散能够显着逆转CUMS抑郁大鼠海马组织中MrccⅠ活性降低,Uqcrc2 mRNA水平显着降低,Ndufs6蛋白水平升高。转录组学和代谢表型数据结果表明,逍遥散通过调节CUMS抑郁大鼠谷氨酸能突触通路发挥抗抑郁作用,具体机制为逍遥散能够显着逆转CUMS抑郁大鼠海马组织中谷氨酸含量升高,谷氨酸脱羧酶1（Gad1）和谷氨酸受体1（Glur1）活性降低,谷氨酸合成酶（Gls）和谷氨酸NMDA受体epsilon-1亚基（Grin2a）活性升高,Slc1a3 mRNA水平显着降低,Eaat2、Erk1/2和CREB蛋白水平降低,Nmdar1和Mglur1蛋白水平升高。（4）首次采用ADME方法对逍遥散中的活性成分进行了筛选,逍遥散中有16种活性化学成分,具有良好的药代动力学特征。进一步采用网络药理学的贡献指数筛选逍遥散中7个成分的贡献指数大于平均贡献指数,这些成分有6-姜酚、芍药苷、阿魏酸、藁本内酯、柴胡皂苷a、柴胡皂苷c和甘草素。分子对接验证了7个成分与通路GRM5和HTR2A有很好的亲和力,分子实验进一步发现逍遥散这些活性成分可能通过调节谷氨酸能突触通路上的Htr2a、Nmdar1、Pkc、CamkⅡ和Caspase-3发挥抗抑郁作用。结论:（1）逍遥散抗抑郁代谢表型包含97个代谢物和48条通路;代谢表型整合分析发现逍遥散抗抑郁具有调节差异代谢物的一致性、代谢表型通路的网络性和代谢表型功能的模块化。对接评分加权药理学指数可用于逍遥散抗抑郁代谢表型的通路优化排序。（2）逍遥散可以在转录层次调节106个基因,在蛋白层次调节11个蛋白发挥抗抑郁作用。转录组学和蛋白组学整合分析发现逍遥散通过调节CUMS抑郁大鼠氧化磷酸化通路发挥抗抑郁作用。转录组学和代谢表型数据整合分析发现,逍遥散通过调节CUMS抑郁大鼠谷氨酸能突触通路发挥抗抑郁作用。（3）逍遥散中6-姜酚、芍药苷、阿魏酸、藁本内酯、柴胡皂苷a、柴胡皂苷c和甘草素,这7个活性成分可能通过调节谷氨酸能突触通路发挥抗抑郁作用。
刘志文[3]（2021）在《艾可清颗粒抑制破骨细胞分化改善去卵巢大鼠骨丢失的作用机制研究》文中认为目的:绝经后骨质疏松是由于雌激素缺乏导致的骨量减少、骨的微观结构退化引起的代谢性骨骼疾病。中医理论认为绝经导致的肾脾亏虚是造成骨质疏松的主要病因。由广州中医药大学热带医学研究所研发的复方中药配方“艾可清颗粒”具有补肾健脾、益气扶阳之功效,临床用于HIV-1感染者和艾滋病患者的辅助治疗。为了进一步拓展艾可清的临床应用范围,本研究就其是否可改善绝经后肾脾亏虚所致的骨质疏松进行了研究。在本研究中,我们采用卵巢切除大鼠模型模拟绝经后妇女,探讨了艾可清对雌激素缺乏致骨丢失的体内保护作用。同时采用体外细胞模型进一步探讨了艾可清对成骨细胞活性的影响,以及对RANKL诱导的破骨细胞分化的抑制作用和机制。方法:1.艾可清对去卵巢大鼠骨丢失的作用（1）动物分组和治疗双侧卵巢切除的SD大鼠（6-8月龄）随机分为模型组（OVX）、戊酸雌二醇0.1 mg/kg/d组（EV）、艾可清1g/kg/d组（ALD）、艾可清2 g/kg/d组（AMD）和艾可清4 g/kg/d组（AHD）进行治疗,每组10只。行假手术（Sham）的10只同龄雌性大鼠为随行对照。连续给药3个月后结束治疗。（2）检测和分析:①Micro-CT扫描分析骨组织形态计量学参数、重建骨组织三维结构;②H&E染色观察骨组织病理学变化;③TRAP染色观察骨组织内破骨细胞数量;④心、肝、脾、肺、肾、子宫的脏器指数变化;血清样本中肝功能指标（ALT和AST）和肾功能指标（CRE和BUN）检测。⑤荧光定量PCR法检测骨组织中骨吸收功能相关基因（CA2、CTSK、MMP9和ATP6V0D2）和骨形成相关基因（BMP-2和Sp7）的mRNA水平。⑥Western blot法检测骨组织中骨吸收相关功能蛋白Tracp、CTSK和c-fos的表达水平。2.艾可清对成骨细胞增殖和分化的影响MC3T3-E1成骨细胞,（1）经艾可清干预48h或72h,CCK-8法检测细胞增殖活力;（2）经艾可清干预7d,ALP检测试剂盒检测ALP活性,ALP染色试剂盒检测ALP表达,评价细胞的成骨活性。3.艾可清对破骨细胞分化的影响（1）艾可清对骨髓来源巨噬细胞增殖的影响:从C57BL/6小鼠骨髓提取单核细胞,经M-CSF诱导4天得到骨髓来源的巨噬细胞（BMMs）。BMMs经艾可清干预48 h或72h后,CCK-8法检测细胞增殖活力。（2）艾可清对破骨细胞分化的影响:采用RANKL诱导BMMs向破骨细胞分化,同时加入艾可清进行干预。采用TRAP染色试剂盒染色观察破骨细胞并计数;采用免疫荧光染色观察破骨细胞F-actin环的形成。（3）破骨分化标志性基因mRNA水平检测:采用RANKL诱导BMMs向破骨细胞分化,同时加入艾可清进行干预。提取总RNA,荧光定量PCR法检测骨吸收功能基因（Car2、Tracp、Ctsk、Atp6v0d2）,破骨细胞表面受体基因（Calcr、RANK）和破骨细胞前体细胞融合基因（c-fos、Dcstamp）的mRNA水平。（4）破骨细胞标志性蛋白表达检测:采用RANKL诱导BMMs向破骨细胞分化,同时加入艾可清进行干预。提取总蛋白,Western blot法检测骨吸收功能相关蛋白Mmp9、Ctsk 和 Tracp 的表达。4.艾可清抑制破骨细胞分化的作用机制（1）艾可清对破骨分化关键转录因子的表达和核移位的影响:采用RANKL诱导BMMs向破骨细胞分化,同时加入艾可清进行干预。提取总蛋白,Western blot法检测转录因子NFATc1和c-fos的蛋白表达水平;免疫荧光法观察NFATcl和c-fos的核移位情况。（2）艾可清对破骨分化关键调节通路的影响:BMMs经艾可清预处理后再采用RANKL刺激0、5、10、20、30或60 min。提取总蛋白,Western blot法检测不同时间点 NFκB 通路（p65、p-p65、IκBα和 p-IκBα）、JNK 通路（JNK 和 p-JNK）和 p38通路（p38和p-p38）蛋白水平。（3）艾可清对p65核移位的影响:BMMs细胞用艾可清预处理后再采用RANKL刺激0、30或60 min。分别提取细胞核和细胞质蛋白,Western blot法检测p65水平;免疫荧光法观察细胞核中p65表达。（4）艾可清对RANK和TRAF6结合的影响:巨噬细胞Raw264.7用艾可清预处理后再采用RANKL刺激20 min。免疫共沉淀法观察RANK和TRAF6之间的相互作用。结果:1.艾可清对去卵巢大鼠股骨骨丢失的影响（1）显着增加股骨的骨密度、骨体积分数和骨小梁数量①Micro CT扫描:与Sham组相比,OVX组骨密度（BMD）、骨体积分数（BV/TV）和骨小梁数量（Tb.N）都明显降低;与OVX组相比,艾可清剂量依赖地增加了大鼠的BMD、BV/TV和Tb.N,且这些指标在高剂量组（AHD）中有显着增加。②H&E染色:与Sham组相比,OVX组股骨BV/TV值明显降低;与OVX组相比,艾可清剂量依赖地提高BV/TV值,其中AHD组BV/TV升高最为显着。（2）显着抑制股骨组织内破骨细胞的形成破骨细胞TRAP染色结果:与Sham组相比,OVX组大鼠骨组织内骨表面破骨细胞数（N.Oc/BS）和破骨细胞周长百分比（Oc.S/BS）明显增加;与OVX组相比,ALD组Oc.S/BS则明显降低,AMD组N.Oc/BS明显降低,而AHD组N.Oc/BS和Oc.S/BS均明显降低。（3）未见对脏器组织有不良影响①脏器指数:与Sham组相比,OVX组大鼠的心、肝、肺、肾和子宫脏器指数明显下降;与OVX组相比,除AMD和AHD组肺脏器指数明显增加外,艾可清各剂量组对其他各脏器指数无明显影响。提示艾可清可能有益肺作用。②肝肾功能生化指标:与Sham组相比,OVX组血清中ALT、AST、CRE含量无明显变化,BUN含量明显升高;与OVX组相比,艾可清各剂量组血清中ALT、AST、CRE含量无明显变化,BUN含量明显下降。提示艾可清可能对肾功能有改善作用。（4）显着抑制骨吸收相关基因的mRNA表达与Sham组相比,OVX组骨组织中骨吸收相关基因CA2、MMP9、CTSK和ATP6V0D2的mRNA表达明显升高,骨形成相关基因BMP-2和Sp7的mRNA表达水平明显降低。与OVX组相比,ALD组CA2和MMP9的mRNA水平明显下调;AMD组和AHD组CA2、MMP9和CTSK的mRNA水平明显下调;艾可清各剂量组BMP-2和Sp7的mRNA水平均无明显变化。提示艾可清的作用在于抑制骨吸收,而不是促进骨形成。（5）显着抑制骨吸收相关蛋白的表达与Sham组相比,OVX组骨组织中骨吸收相关蛋白Tracp、Ctsk和c-fos的表达明显升高;与OVX组相比,艾可清各剂量组Tracp表达明显降低,AHD组Ctsk和c-fos的蛋白水平明显下调。进一步说明艾可清是通过抑制骨吸收起到骨保护作用的。2.艾可清对MC3T3-E1成骨细胞增殖和成骨分化的影响艾可清在浓度大于50 μg/mL时对细胞增殖有抑制作用,浓度低于50 μg/mL时不影响细胞的增殖和ALP活性。说明艾可清无促成骨分化作用。3.艾可清对骨髓来源巨噬细胞增殖活力的影响艾可清在10—100μg/mL浓度范围对BMMs有明显促增殖作用。4.艾可清对RANKL诱导的破骨细胞分化的影响（1）显着抑制BMMs分化为破骨细胞（TRAP染色）:在诱导BMMs破骨分化的过程中加入艾可清干预,可浓度依赖地减少TRAP阳性细胞的数量,说明艾可清明显抑制破骨分化。艾可清在50 μg/mL浓度时几乎完全抑制了破骨细胞的形成,且对破骨分化的抑制作用具有时间依赖性。（2）显着抑制破骨细胞F-actin环形成（免疫荧光染色）:在诱导BMMs破骨分化的同时采用艾可清干预,可浓度依赖地减少破骨细胞F-actin环的面积,抑制F-actin环的形成。（3）显着抑制骨吸收功能基因的表达（荧光定量PCR）:在诱导BMMs破骨分化的同时采用艾可清干预,可浓度依赖地抑制骨吸收相关基因Car2、Tracp、Ctsk、Atp6v0d2、Dcstamp、Calcr的mRNA表达;艾可清在50 μg/mL浓度时,对骨吸收功能基因（Car2、Tracp、Ctsk、Atp6v0d2）,破骨细胞表面受体基因（Calcr、RANK）和破骨细胞前体细胞融合基因（Dcstamp、c-fos）的mRNA表达的抑制作用呈时间依赖性。（4）显着抑制骨吸收功能蛋白的表达（Western blot）:在诱导BMMs破骨分化的同时采用艾可清干预,可浓度依赖地抑制骨吸收功能蛋白Mmp9、Ctsk和Tracp的表达;艾可清在50μg/mL浓度时,对Mmp9、Ctsk和Tracp蛋白表达的抑制作用具有时间依赖性。5.艾可清抑制破骨细胞分化的作用机制（1）显着抑制破骨细胞分化关键转录因子NFATc1和c-fos的表达（Western blot）:在诱导BMMs破骨分化时加入艾可清干预,可浓度依赖地抑制转录因子NFATc1和c-fos的蛋白表达;艾可清在50 μg/mL浓度下对NFATc1和c-fos蛋白表达的抑制作用也表现出时间依赖性。说明艾可清可抑制RANKL诱导的NFATc1和c-fos表达上调。（2）显着抑制NFATc1和c-fos的核移位（免疫荧光染色）:在诱导BMMs破骨分化时加入艾可清干预,可显着抑制NFATc1和c-fos在细胞核的表达,说明艾可清可抑制RANKL诱导的NFATc1和c-fos的核移位。（3）显着抑制破骨细胞分化关键通路NFκB和MAPK的激活（Western blot）:BMMs经RANKL刺激后,NFκB通路蛋白（p65和IκBα）和MAPK通路蛋白（JNK和p38）的磷酸化（p-p65、p-IκBα、p-JNK和p-p38）水平逐渐升高,IκBα水平逐渐降低,说明NFκB和MAPK通路被激活。艾可清（50 μg/mL）干预可降低p-p65、p-IκBα、p-JNK和p-p38水平,升高IκBα水平。说明艾可清抑制RANKL诱导的NFκB和MAPK通路激活。（4）显着抑制p65的核移位（Western blot和免疫荧光染色）:BMMs细胞经RANKL刺激30和60 min后,细胞质内的p65蛋白明显减少,细胞核内的p65含量增加,说明NFκB通路被激活。艾可清（50μg/mL）干预可使细胞质内的p65表达升高,使p65停留在细胞质内并抑制其入核,说明艾可清抑制RANKL诱导的NFκB通路激活。免疫荧光染色结果进一步证实艾可清可抑制p65的核移位。（5）显着抑制RANK-TRAF6复合物的形成（免疫共沉淀）:Raw264.7细胞经RANKL刺激20 min后,增加了和TRAF6结合的RANK的水平;艾可清（50μg/mL）干预可显着减少和TRAF6结合的RANK的水平,说明艾可清抑制了 RANKL诱导的RANK和TRAF6的结合。结论:1.补肾健脾复方中药“艾可清颗粒”对雌激素缺乏诱导的骨丢失具有保护作用。其补肾健骨作用和抑制体内破骨细胞的生成和骨吸收功能有关。2.“艾可清颗粒”在体外可显着抑制破骨细胞的形成和骨吸收活性。其作用机制为抑制RANK和TRAF6的结合,从而影响RANKL介导的下游NFκB、p38和JNK通路的激活。3.“艾可清颗粒”具有预防和治疗绝经后骨质疏松的临床应用前景。
李琪[4]（2021）在《miRNA-129-1-3p在芦丁减轻吡柔比星所致心脏毒性并增敏抗乳腺癌药效中的介导作用》文中提出蒽环类药物吡柔比星（Pirarubicin,THP）是多种实体肿瘤和血液淋巴系统恶性肿瘤的常用化疗药物,疗效确切、抗肿瘤强,其中乳腺癌是以THP为一线药物进行治疗的癌症之一。在过去20年的早期诊断中,手术、放化疗和靶向治疗等显着降低了乳腺癌的死亡率。然而,存活率的提高使人们意识到抗癌治疗过程中改善THP所致心脏毒性的重要性。临床观察和研究显示THP主要毒副作用之一是心脏毒性,且往往呈进展性和不可逆性,严重限制了THP在临床上广泛和长期的使用。因此,发现新的药物靶点干预THP所致心脏毒性显得尤为重要。芦丁（Rutin,RUT）又名芸香苷,属黄酮类化合物,是《中国药典》收录的传统中药槐花的主要有效成分之一,广泛存在于槐花、银杏叶、大枣等中药材中。RUT具有抗自由基、抗脂质过氧化、抗炎、抗癌和保护心血管等药理作用。本课题组多年来一直进行RUT对心血管系统保护作用的研究,在大鼠实验中证实RUT对THP所致心脏毒性具有保护作用,并利用微小RNA（microRNA,miRNA）芯片技术构建RUT干预THP诱导大鼠心脏毒性miRNA表达谱。但RUT的具体作用机制尚未进行深入的探索,且对于RUT干预疾病发生发展过程中miRNA的作用知之甚少。本研究基于RUT干预THP诱导心肌损伤miRNA表达谱的分析结果,并通过miRbase数据库,发现miR-129-1-3p是与RUT抑制心脏毒性密切相关的一种潜在的生物标志物,且在不同物种中高度保守。随后使用Target Scan数据库搜索miR-129-1-3p的靶基因,将靶基因通过KEGG富集分析后发现,富集分析结果中的Ca2+通路与蒽环类药物所致心脏毒性的机制相关,我们对位于Ca2+通路中靶基因进行挑选,发现GRIN2D与miR-129-1-3p的靶向性最好。由此,我们推测RUT通过miR-129-1-3p直接靶向GRIN2D调节Ca2+通路,从而发挥对THP诱导的心肌细胞损伤的保护作用。随后,通过双荧光素酶报告基因实验证实,miR-129-1-3p可直接调控GRIN2D。此外,通过文献检索发现miR-129-1-3p在多种肿瘤中起到抑制作用。因此,本研究从细胞及整体动物实验对miR-129-1-3p/GRIN2D调控Ca2+通路介导的RUT减轻THP所致心脏毒性并增敏抗乳腺癌的作用进行了探索,以期系统深入地揭示miR-129-1-3p/GRIN2D在RUT干预心脏毒性和乳腺癌发生发展中所扮演的角色,从miRNA的角度阐明RUT治疗心脏毒性和乳腺癌的可能机制。（1）在心肌细胞（体外）实验中,我们采用RUT 100μM预处理,THP 5μM刺激小鼠心肌HL-1细胞24h,模拟RUT改善THP所致HL-1细胞损伤内环境,从细胞水平探讨RUT对THP诱导HL-1细胞损伤保护的具体机制。通过qPCR在HL-1细胞中进行验证,发现miR-129-1-3p在THP处理后的HL-1细胞中下调,而在RUT干预后使其上调,GRIN2D mRNA与其趋势相反,说明miR-129-1-3p/GRIN2D在RUT对THP诱导HL-1细胞损伤的保护作用中发挥重要作用。为了研究miR-129-1-3p在RUT对THP诱导的心肌细胞损伤的保护作用,将miR-129-1-3p模拟物（mimics）转染至HL-1细胞中,通过DCFH-DA、MAD、SOD、Fluo-3 AM、TUNEL和Western blot实验证实,RUT和miR-129-1-3p可以抑制THP诱导的心肌细胞氧化损伤、钙超载,使Ca2+相关通路蛋白GRIN2D、钙调蛋白-1（Calm1）、Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶IIδ（Ca MKⅡδ）和磷酸化的雷诺定受体2（Ry R2-p S2814）表达减少,肌质内皮网钙泵（SERCA2a）和钠钙交换剂1（NCX1）表达增加,并降低细胞凋亡率及抑制凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2和cleaved caspase-3的表达。（2）在乳腺癌细胞（体外）实验中,我们采用体外培养小鼠乳腺上皮HC11细胞和小鼠乳腺癌4T1细胞,通过CCK-8检测发现,100μM的RUT抑制4T1细胞增殖,且与THP发挥协同作用。qPCR检测miR-129-1-3p在两种细胞中的表达,发现4T1细胞miR-129-1-3p的表达水平低于HC11细胞,而加入RUT干预后4T1细胞miR-129-1-3p的表达水平上升,GRIN2D mRNA与其趋势相反,说明miR-129-1-3p/GRIN2D在RUT抑制小鼠乳腺癌细胞增殖的作用中也同样发挥重要作用。为了研究miR-129-1-3p对4T1细胞的抑制作用,将miR-129-1-3p mimics和miR-129-1-3p抑制物（inhibitor）分别转染至4T1细胞中,应用平板克隆、细胞划痕、Transwell、Fluo-3 AM和Western blot实验证实,miR-129-1-3p mimics可以抑制4T1细胞增殖、迁移和侵袭及其相关蛋白CD147、基质金属蛋白酶-2（MMP-2）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）、血管内皮生长因子（VEGF）蛋白的表达、抑制Ca2+水平及GRIN2D、Calm1、Ca MKⅡδ蛋白的表达,促进Bax/Bcl-2和cleaved caspase-3蛋白的表达,而miR-129-1-3p inhibitor发挥相反作用。（3）在动物（体内）实验中,采用BALB/c小鼠作为研究对象,成功构建乳腺荷瘤与THP心脏毒性小鼠复合模型。给予RUT灌胃给药或尾静脉注射miR-129-1-3p模拟物（agomirs）4周后,BALB/c小鼠的心脏毒性得到明显减轻,心电图和心肌组织病理学损伤得以改善,心肌酶指标趋于正常,心肌组织miRNA-129-1-3p表达升高,GRIN2D mRNA表达降低,使Ca2+水平降低,GRIN2D、Calm1、Ca MKⅡδ和Ry R2-p S2814蛋白表达减少,SERCA2a和NCX1的蛋白表达增加、心肌细胞凋亡减少,Bax/Bcl-2和cleaved caspase-3蛋白表达降低。并且BALB/c小鼠乳腺肿瘤的生长、肝转移及肺部炎症反应得到进一步控制,肿瘤组织中miRNA-129-1-3p表达进一步上升,GRIN2D mRNA表达进一步下降,进一步抑制肿瘤组织中Ca2+含量及GRIN2D、Calm1、Ca MKⅡδ、CD147、MMP-2、MMP-9、VEGF的表达,并进一步促进肿瘤组织细胞凋亡及其相关蛋白Bax/Bcl-2和cleaved caspase-3的表达。综上所述,本研究通过体内外实验得到以下结论:（1）体内外THP诱导小鼠HL-1细胞/心肌损伤实验证明,RUT可逆转THP诱导的HL-1细胞/心肌氧化应激损伤、小鼠心脏系数增加、血清心肌酶损伤、心电图异常及心肌组织病理学改变,对THP诱导的心脏毒性发挥保护作用。（2）RUT逆转THP诱导的小鼠HL-1细胞/心肌组织中miRNA-129-1-3p下调、GRIN2D mRNA上调、钙超载及细胞凋亡。表明RUT通过逆转THP所致小鼠心脏毒性的机制可能是通过miR-129-1-3p抑制GRIN2D表达及其调控的Ca2+通路,进而抑制心肌细胞凋亡所实现的。（3）体内外THP抑制乳腺癌实验证实,RUT可增敏THP抑制4T1细胞增殖、迁移和侵袭,抑制肿瘤生长、肝转移及肺部炎症反应,对THP抑制乳腺癌发挥增敏作用。（4）RUT增敏THP抑制4T1细胞/肿瘤组织中miRNA-129-1-3p下调、GRIN2D mRNA上调、使钙水平进一步降低并促进细胞凋亡。表明RUT通过增敏THP抑制小鼠乳腺癌的机制可能是通过miR-129-1-3p抑制GRIN2D表达及其调控的Ca2+通路,进而促进肿瘤细胞凋亡所实现的。本研究拓展了RUT的药理作用,并对miR-129-1-3p/GRIN2D的生物学功能提供了重要的补充,表明miR-129-1-3p可能是治疗THP所致心脏毒性及乳腺癌的新靶点,可作为开发治疗蒽环类药物所致心脏毒性和乳腺癌的新型药物的理论基础和实验依据。
郭璞[5]（2021）在《基于T-2毒素所致垂体氧化应激及血脑屏障损伤的研究及小分子拮抗剂的发现》文中指出T-2毒素是由多种镰刀菌（主要是拟枝孢镰刀菌）产生的次级代谢产物。近年来,T-2毒素的神经毒性受到研究人员特别关注。体内动物试验研究表明,T-2毒素的暴露使小鼠或大鼠出现包括肌无力、共济失调和厌食在内的神经系统症状,甚至在大脑中枢神经系统血管周围出现显着水肿等明显脑损伤现象。此外,T-2毒素的暴露增加血脑屏障（BBB）通透性,使得甘露醇和伊文思蓝等可以跨越BBB。体外细胞模型研究发现,T-2毒素可以在神经侧累积,表明T-2毒素可能跨越BBB而损伤大脑和垂体等器官。然而,T-2毒素是否可以直接进入大脑而损伤脑部组织器官尚不清楚。PGC-1α是一种有效的线粒体生物合成和呼吸作用的激活剂,能够调控多种ROS代谢解毒酶（SOD-1、SOD-2、GPX-1、CAT）和线粒体UCP-2的表达,降低细胞内的ROS水平和氧化应激损伤。此外,PGC-1α与脑部损伤密切相关,在多种疾病引起的BBB损伤中起保护作用。因此,保持和增加PGC-1α水平是改善由其他疾病或外界刺激等造成的脑部损伤,尤其是BBB损伤及BBB通透性改变的重要手段。本实验室前期基因组结果显示,T-2毒素孵育GH3细胞可提高细胞内PGC-1α的基因表达水平。然而,PGC-1α是否可以作为靶点减轻T-2毒素的脑损伤毒性作用尚待进一步研究。因此,本研究以T-2毒素诱导的神经毒性为切入点,研究T-2毒素在体内是否可以直接跨越BBB及PGC-1α在T-2毒素引起的脑部损伤中的作用,并以PGC-1α为靶点筛选拮抗T-2毒素毒性的小分子化合物并进行体内外验证。此外,研究小分子化合物对其他有毒有害物质引起的BBB损伤是否也具有保护作用,为开发小分子化合物作为缓解BBB损伤的药物奠定基础。1 T-2毒素进入大鼠大脑引起大鼠大脑自噬和垂体凋亡本研究采用LC-MS/MS的方法检测到实验组大鼠脑部T-2毒素的含量为0.012μg/m L。T-2毒素对大脑的损伤作用随着暴露时间的增加而减弱,表现为T-2毒素暴露后3天大脑实质明显出血,7天后出血情况有所改善;T-2毒素暴露1天后,大脑皮层线粒体出现肿胀、空泡、嵴脱落、膜结构受损等损伤,暴露7天后,大多数线粒体的结构已经恢复正常。基因和蛋白表达结果显示,T-2毒素可以显着增加脑部自噬相关基因LC3、atg5和m TOR的基因表达,并增加LC3的蛋白表达,显着降低caspase-3和Bcl-x的基因表达,caspase-9和bax表达水平无明显变化。T-2毒素对垂体的损伤作用随着暴露时间的增加而增加,T-2毒素处理后,大鼠垂体前叶充血,且在T-2毒素处理7天后,充血最明显,细胞核深染,表明垂体细胞可能已发生凋亡;T-2毒素暴露1天后,部分线粒体开始肿胀;3天后,线粒体出现肿胀、空泡、嵴脱落、膜结构受损的现象;7天后,线粒体嵴排列无序,且线粒体区变成了电子透明区。垂体组织中LC3和atg5的基因表达仅在特定时间增加表达,LC3蛋白表达无明显变化,bax、Bcl-x和caspase-3表达水平显着升高,结果表明T-2毒素可抑制大鼠脑皮层细胞凋亡,引起大鼠垂体细胞凋亡。综合分析凋亡和自噬的关系,表明T-2毒素对垂体的损伤大于其对大脑皮层的损伤作用,且T-2毒素能直接进入大脑而对脑部造成损伤作用。2 PGC-1α是GH3细胞抵抗T-2毒素引起的氧化应激的重要因子本研究采用LC-MS/MS的方法检测了GH3细胞内外T-2毒素的含量。10 n M（4.66μg/kg）和40 n M（18.66μg/kg）的T-2毒素进入GH3细胞的含量达到了7.37%和11.82%,即0.34±0.09μg/kg和2.09±0.13μg/kg,说明T-2毒素可以直接进入GH3细胞,且随着T-2毒素浓度的升高,进入细胞的T-2毒素浓度和比例增加,表明随着T-2毒素浓度的升高,可能带来更大的细胞毒性。10和40 n M的T-2毒素孵育24 h,对GH3细胞氧化应激水平进行检测,包括检测细胞ROS水平,抗氧化应激酶SOD和GSH-Px的活性,及线粒体相关抗氧化应激基因PGC-1α和Tfam的表达水平。结果显示,T-2毒素剂量依赖性增加GH3细胞ROS水平、抗氧化酶活性及PGC-1α和Tfam的表达。随后,在GH3细胞中分别沉默PGC-1α和Tfam,结果显示,GH3细胞中沉默PGC-1α的表达能显着降低抗氧化酶的活力,并抑制Tfam的表达。然而,T-2毒素加入后,氧化酶的活力会代偿性的增加。GH3细胞中沉默Tfam的表达能显着降低抗氧化酶的活力,并增加ROS的水平。上述结果说明,PGC-1α通过正调控Tfam的表达而发挥抗氧化应激的作用,提示PGC-1α是GH3细胞抵抗氧化应激的一个重要因子。3 PGC-1α是h BMEC细胞抵抗T-2毒素细胞紧密性损伤的重要基因CCK-8试验结果显示,随着T-2毒素孵育浓度的增加,h BMEC细胞的活力随剂量依赖性降低。体外构建BBB模型结果显示,T-2毒素显着降低h BMEC细胞的TEER,并增加Na F渗透系数,表明T-2毒素破坏了BBB的紧密性。此外,T-2毒素剂量依赖性增加PGC-1α、SOD、GSH-Px、IL1β、TNFα、IL6、CCL2、CLCX1和CCL3基因表达。T-2毒素剂量依赖性下调TJs（ZO-1、CLDN5和occuldin）基因和蛋白表达。上述试验结果表明T-2毒素可引起h BMEC细胞的毒性并通过降低TJs的表达而引起BBB损伤。本研究应用过表达或抑制PGC-1α的表达结合间接免疫荧光技术进一步研究PGC-1α对TJs的影响。h BMEC细胞中过表达PGC-1α能显着增加细胞膜处TJs（ZO-1、CLDN5和occludin）的荧光强度,并改善T-2毒素引起的细胞膜模糊的现象。然而,PGC-1α的抑制剂SR-18292则进一步加重T-2毒素引起的TJs表达降低,细胞间的TJs更加模糊不清甚至失去细胞间TJs。结果表明PGC-1α是h BMEC细胞抵抗T-2毒素引起的BBB损伤的重要保护因子。4中药小分子化合物激活PGC-1α而抵抗T-2毒素和LPS引起的BBB损伤双荧光素酶结合分子对接技术从166份中药小分子化合物中筛选到化合物3-131直接与人PGC-1α的启动子结合并激活PGC-1α的转录,点突变试验对结合位点进行验证,发现71-73位（-1100 bp～-1000 bp）碱基突变后,双荧光素酶活性较P7降低了70%,提示3-131与PGC-1α转录起始位点上游-1100 bp～-1000 bp（71-73位碱基）直接以氢键结合而激活PGC-1α的转活性。采用T-2毒素和LPS构建体内体外BBB损伤模型,检测细胞和动物水平Na F的渗透情况及体内外TJs的表达情况来综合分析小分子化合物3-131对BBB的保护作用。体外BBB模型结果显示,T-2毒素和LPS可以显着降低TEER,增加Na F通透性,降低TJs（ZO-1、CLDN5和occludin）的表达,加入3-131后可以增加细胞间的TJs,使细胞膜结构清晰,缓解T-2毒素或LPS带来的BBB损伤。体内动物试验模型结果显示,T-2毒素和LPS引起小鼠脑内Na F增加;脑组织结构异常,大量海马区神经元出现变性且排列出现疏松紊乱现象,胞体固缩深染,并可见纤维缠结;ZO-1、CLDN5和occludin的蛋白表达降低,IL1β和TNFα蛋白表达增加。3-131可以增加小鼠血脑屏障紧密性、减轻大脑病理损伤、缓解大脑炎症反应从而缓解T-2毒素或LPS带来的脑损伤。综上所述,本文研究了T-2毒素直接跨越BBB对脑和垂体造成的损伤作用、PGC-1α在T-2毒素引起的垂体细胞氧化应激中的作用、PGC-1α在T-2毒素引起的BBB损伤中的作用、基于PGC-1α为靶点的小分子拮抗剂筛选及小分子拮抗剂在T-2毒素和LPS外界有毒有害物质损伤BBB中的保护作用。本文从神经毒性角度出发,以PGC-1α为靶点、以BBB损伤为研究对象,为T-2毒素引起的垂体和脑部损伤提供了新的依据,为研究T-2毒素拮抗剂提供了新的研究方向,同时为研究BBB保护剂奠定了基础。
郭雪峰[6]（2021）在《基于TLR4/MyD88/NF-κB信号通路的补正续骨丸治疗激素性股骨头坏死临床与实验研究》文中研究说明目的:1.观察补正续骨丸治疗激素性股骨头坏死临床疗效,为其临床应用提供直观量化依据;2.基于网络药理学从分子水平探究补正续骨丸治疗激素性股骨头坏死的潜在活性成分及具体药理作用机制;3.基于TLR4/MyD88/NF-κB信号通路探讨补正续骨丸干预激素性股骨头坏死大鼠模型的作用机制。材料与方法:1.补正续骨丸治疗激素性股骨头坏死的临床疗效观察研究选取辽宁中医药大学附属医院骨二科收治的78例激素性股骨头坏死患者作为研究对象,研究时限为2018年09月至2019年10月,采用随机数字法将符合要求患者随机分为观察组和对照组,每组各39例。对照组给予仙灵骨葆胶囊口服,观察组给予补正续骨丸口服。两组患者均连续治疗3个月。观察两组患者治疗前后的Harris髋关节功能评分、VAS评分、SF-36评分、髋关节影像学指标与不良反应发生情况,检测两组患者治疗前后血常规、肝功能、肾功能指标变化情况。2.基于网络药理学探讨补正续骨丸治疗激素性股骨头坏死的分子机制研究应用BATMAN-TCM分析工具检索补正续骨丸的活性化合物与预测靶点,选择Dig See数据库、OMIM数据库、Gene Cards数据库对激素性股骨头坏死疾病靶点进行预测,利用Draw Venn Diagram筛选得到补正续骨丸治疗激素性股骨头坏死核心靶点,利用STRING数据库构建核心靶点PPI网络,通过Cytoscape 3.7.1构建补正续骨丸治疗激素性股骨头坏死的化合物—疾病—靶点调控网络,基于DAVID数据库对核心靶点进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。3.基于TLR4/MyD88/NF-κB信号通路的补正续骨丸干预激素性股骨头坏死大鼠疗效机制研究采用随机数字表法将成年雄性SD大鼠分为空白组、模型组、西药对照组、补正续骨丸低剂量组（中药低剂量组）、补正续骨丸中剂量组（中药中剂量组）、补正续骨丸高剂量组（中药高剂量组）,每组12只。通过注射用甲泼尼龙琥珀酸钠联合脂多糖制备激素性股骨头坏死模型。造模成功后,空白组和模型组大鼠每日二次等量生理盐水灌胃,西药对照组0.9mg/kg阿仑膦酸钠片混悬液每日一次灌胃,中药低剂量组0.045g/kg补正续骨丸混悬液每日二次灌胃,中药中剂量组0.09g/kg补正续骨丸每日二次灌胃,中药高剂量组0.18g/kg补正续骨丸混悬液每日二次灌胃,连续灌胃12周后采集大鼠血清并取出双侧股骨头,采用HE染色方法观察各组大鼠股骨头组织病理变化情况;ELISA法检测各组大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α表达水平;Western-blotting法检测各组大鼠股骨头组织TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表达水平;免疫组化法法检测各组大鼠股骨头组织TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表达水平;qRT-PCR法检测各组大鼠股骨头组织TLR4、MyD88、NF-κB p65 mRNA表达水平。结果:1.补正续骨丸治疗激素性股骨头坏死的临床疗效观察研究两组患者在性别、年龄、病程、ARCO分期、患病部位等方面的人口统计学资料与临床特征资料比较显示差异无统计学意义（P>0.05）。治疗结束后,观察组临床有效率达79.49%（31/39）明显高于对照组[56.41%（22/39）],差异具有统计学意义（P<0.05）。治疗结束后,两组患者的Harris髋关节功能评分、SF-36评分均较治疗前显着升高（P<0.05）;且观察组对于Harris髋关节功能评分、SF-36评分的上升程度显着优于对照组（P<0.05）。治疗结束后,两组患者的VAS评分均较治疗前显着降低（P<0.05）;且观察组对于VAS评分的下降程度显着优于对照组（P<0.05）。治疗结束后,观察组髋关节影像学指标结果有效率达84.62%（33/39）明显高于对照组[61.54%（24/39）],差异具有统计学意义（P<0.05）。观察组患者不良反应发生率达2.56%（1/39）,对照组不良反应发生率达7.69%（3/39）,两组患者不良反应发生率比较差异无统计学意义（P>0.05）。2.基于网络药理学探讨补正续骨丸治疗激素性股骨头坏死的分子机制研究通过BATMAN-TCM分析工具检索得到补正续骨丸活性化合物75种,活性化合物对应靶点548个;通过检索Dig See、OMIM、Gene Cards 3个疾病靶点数据库,最终纳入与激素性股骨头坏死发生发展相关靶点427个。利用Draw Venn Diagram将548个补正续骨丸活性化合物对应靶点与427个激素性股骨头坏死疾病靶点进行映射,并将其上传至STRING数据库以构建PPI网络,最终筛选到补正续骨丸治疗激素性股骨头坏死的30个核心靶点。利用Cytoscape 3.7.1构建补正续骨丸治疗激素性股骨头坏死的化合物—疾病—靶点调控网络可知,21个核心靶点能与不少于两个活性化合物相连接,41个活性化合物能与不少于两个核心靶点相连接。利用DAVID 6.8对补正续骨丸治疗激素性股骨头坏死的30个核心靶点进行GO功能富集分析可知功能途径主要涉及类固醇激素受体活性、氧化还原酶活性、脂质反应、类固醇激素反应、细胞增殖调节、活性氧代谢过程、内膜系统、线粒体、细胞器等方面。利用DAVID 6.8对补正续骨丸治疗激素性股骨头坏死的30个核心靶点进行KEGG通路富集分析可知通路途径主要涉及HIF-1信号通路、NF-κB信号通路、破骨细胞分化、TGF-β信号通路、雌激素信号通路、TNF信号通路、细胞凋亡等方面。3.基于TLR4/MyD88/NF-κB信号通路的补正续骨丸干预激素性股骨头坏死大鼠疗效机制研究各组大鼠股骨头病理形态学观察显示,空白组可见骨小梁结构完整、形态正常、排列规则,且骨小梁内空骨陷窝出现较少,软骨层较为坚厚,脂肪空泡较为少见;模型组可见骨小梁结构出现明显稀疏变细、排列极为散乱、连续性中断,且部分骨小梁出现坏死,骨小梁内出现大量空骨陷窝,软骨层较为薄弱,脂肪细胞数量形态明显增多增大或者相互融合后形成大片的脂肪空泡;西药对照组可见骨小梁结构稍显变细,排列尚为规则,偶有中断发生,骨小梁内出现空骨陷窝,软骨层相对较为坚厚,脂肪细胞存在堆积现象,脂肪空泡较为多见;中药低剂量组可见骨小梁结构略变细、排列较为散乱、部分中断,骨小梁内可见空骨陷窝增多,软骨层较为薄弱,脂肪空泡多见;中药中剂量组可见骨小梁结构变细,排列尚为规则,偶有中断发生,骨小梁内出现空骨陷窝,软骨层相对较为坚厚,脂肪细胞存在堆积现象,脂肪空泡较为多见;中药高剂量组可见骨小梁较为完整、排列尚规则,骨小梁内可见空骨陷窝,软骨层相对较厚,存在脂肪空泡。各组大鼠股骨头组织空骨陷窝率结果显示,与空白组比较,其余各组股骨头组织空骨陷窝率显着升高（P<0.01）;与模型组比较,西药对照组、中药各剂量组股骨头组织空骨陷窝率显着降低（P<0.01）;与西药对照组比较,中药低剂量组股骨头组织空骨陷窝率显着升高（P<0.01）,中药高剂量组股骨头组织空骨陷窝率显着降低（P<0.01）。各组大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α表达水平显示,与空白组比较,其余各组血清IL-1β、IL-6、TNF-α表达水平显着升高（P<0.01）;与模型组比较,西药对照组、中药各剂量组血清IL-1β、IL-6、TNF-α表达水平显着降低（P<0.01）;与西药对照组比较,中药低剂量组血清IL-1β、IL-6、TNF-α表达水平显着升高（P<0.01）,中药高剂量组血清IL-1β、IL-6、TNF-α表达水平显着降低（P<0.01）。各组大鼠股骨头组织TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表达水平显示,与空白组比较,其余各组股骨头组织TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表达水平显着升高（P<0.01）;与模型组比较,西药对照组、中药中剂量组、中药高剂量组股骨头组织TLR4、MyD88蛋白表达水平显着降低（P<0.01）,西药对照组、中药各剂量组股骨头组织NF-κB p65蛋白表达水平显着降低（P<0.05或P<0.01）;与西药对照组比较,中药低剂量组股骨头组织TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表达水平显着升高（P<0.01）,中药高剂量组股骨头组织MyD88、NF-κB p65蛋白表达水平显着降低（P<0.05或P<0.01）;与中药中剂量组比较,中药高剂量组股骨头组织TLR4蛋白表达水平显着降低（P<0.05）。各组大鼠股骨头组织TLR4、MyD88、NF-κB p65 mRNA表达水平显示,与空白组比较,其余各组股骨头组织TLR4、MyD88、NF-κB p65 mRNA表达水平显着升高（P<0.05或P<0.01）;与模型组比较,西药对照组、中药各剂量组股骨头组织TLR4、MyD88、NF-κB p65mRNA表达水平显着降低（P<0.01）;与西药对照组比较,中药低剂量组股骨头组织TLR4、MyD88、NF-κB p65 mRNA表达水平显着升高（P<0.01）。结论:1.补正续骨丸治疗激素性股骨头坏死患者临床疗效确切、安全可靠,可有效改善激素性股骨头坏死患者髋关节功能、缓解激素性股骨头坏死患者疼痛症状、提升激素性股骨头坏死患者生活质量,值得临床进一步推广使用。2.基于网络药理学初步探讨并验证了补正续骨丸治疗激素性股骨头坏死具有多成分-多靶点-多通路的整体方向调节的作用特点,预测得到TLR4/MyD88/NF-κB信号通路调控炎症反应过程可能是补正续骨丸治疗激素性股骨头坏死的潜在作用机制。3.补正续骨丸可显着改善激素性股骨头坏死大鼠模型股骨头病理学形态与降低空骨陷窝率,下调激素性股骨头坏死大鼠模型血清IL-1β、IL-6、TNF-α表达水平和股骨头组织TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白与mRNA表达水平,其作用机制则是通过抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路进而减少炎症反应从而发挥防治作用。
王文平[7]（2021）在《重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的毒性评价及重楼皂苷Ⅰ的肝毒性机制探究》文中提出研究目的:药源性肝损伤是一项严重的公共卫生问题,据调查统计,我国药源性肝损伤的发病率逐年升高;重楼是一种临床常用中药,因其抗肿瘤活性日益受到重视。重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ是重楼中3种重要的皂苷类成分,越来越多的研究和报道显示其对多种肿瘤细胞均具有杀伤作用。但重楼在抗肿瘤作用的同时毒副作用研究较少,尤其是其单体类成分。本研究围绕重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的潜在毒性及其作用机制进行深入的探索。以期为中药重楼的临床合理应用以及基于重楼皂苷单体的药物研发提供借鉴和参考。研究方法:（1）从细胞、模式生物-斑马鱼、动物3个层面进行了重楼皂苷单体的毒性评价。首先选择了 9种细胞考察了重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的细胞毒性情况,包括3种肝细胞（HepaRG、HL-7702和WRL-68细胞）,3种肾细胞（HK-2、HKC和293T细胞）和3种心脏细胞（H9c2、HUVEC和HCMEC细胞）;利用模式生物-斑马鱼模型考察不同浓度重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ对斑马鱼生存率的影响,确定了 LC50、LC10与最大非致死浓度（MNLC）;体视荧光显微镜观察重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ给药前后肝脏、肾脏和心脏的形态,统计斑马鱼的肾脏水肿率、心率和心包水肿率。利用Image-Pro Plus 5.1.0软件统计给予重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ前后斑马鱼肝脏面积和荧光强度、肾脏面积和荧光强度、心脏SV-BA距离,评价重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的潜在肝、肾、心毒性;通过HE染色和TUNEL染色观察斑马鱼给药前后肝组织病理情况及肝细胞凋亡情况;通过小鼠的急性毒性实验,得出LC50值。然后进行小鼠血清生化检测和组织病理切片分析。各个层面数据相互支持,补充验证,使研究基础更加全面可靠,结论更加合理。（2）选用HepaRG细胞研究重楼皂苷Ⅰ的肝细胞毒性机制。利用酶标仪、流式细胞仪、倒置荧光显微镜等对HepaRG细胞乳酸脱氢酶（LDH）释放、DAPI染色、活性氧（ROS）、线粒体膜电位（MMP）、细胞凋亡及细胞周期等进行测定,利用Western blot对凋亡相关蛋白进行检测;选用HUVEC细胞研究重楼皂苷Ⅰ的心血管毒性机制。从抑制新血管生成和促进心血管细胞凋亡两个方面评价了重楼皂苷Ⅰ的血管毒性机制。进行了LDH释放、细胞迁移、细胞凋亡、DAPI染色、细胞周期以及体外血管生成等研究,测定了近30个相关蛋白的表达。（3）利用TMT标记定量蛋白质组学技术检测给药组和对照组小鼠肝脏组织中的差异蛋白,对差异蛋白进行GO及Pathway通路富集分析;利用STRING11.0构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络;采用IPA软件进一步筛选出与表型相关的潜在生物标志物;利用Q300靶向代谢组学技术研究给药组和对照组小鼠血清样本中内源性代谢物的变化情况。采用PCA、OPLS-DA等分析小鼠内源性代谢物的轮廓变化。比较给药前后小鼠血清样本代谢谱的差异,寻找与重楼皂苷Ⅰ致肝毒性相关的代谢差异物及代谢调控网络。使用Cytoscape对蛋白组学和代谢组学做关联分析。采用PCR和Western blot技术对肝毒性机制中的关键蛋白进行进一步的验证。研究结果:（1）重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ毒性实验结果:重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ均具有明显的细胞毒性,能显着的促进H9c2细胞外其余8种细胞的凋亡,且呈现浓度和时间依赖性。对于H9c2细胞,3种皂苷均呈现出低剂量促进增殖,高剂量抑制增殖的作用;斑马鱼实验结果:重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ对斑马鱼的LC50分别为121、213、570 ng/mL,LC10分别为109、178、456ng/mL,MNLC分别为99、146、357ng/mL;毒性器官评价方面,重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ对斑马鱼具有显着的肝脏毒性,能明显降低斑马鱼肝脏面积和荧光强度;重楼皂苷Ⅰ能显着影响斑马鱼的心率,提示其具有心血管毒性;重楼皂苷Ⅰ和Ⅶ能降低斑马鱼肾脏面积和荧光强度,具有一定的肾毒性,但3种皂苷均未造成肾水肿;斑马鱼病理切片显示重楼皂苷Ⅰ给药组的肝组织出现空泡和严重的肝细胞坏死;TUNEL染色结果显示重楼皂苷Ⅰ给药组出现了肝细胞凋亡;动物实验结果:小鼠体内实验发现,重楼皂苷Ⅰ具有体内毒性,其LC50为24.5 mg/kg;给药组血清中ALT、AST显着升高,SOD降低;给药组病理切片显示出显着的肝细胞损伤和脂肪样变性以及一定的心脏毒性。（2）重楼皂苷Ⅰ肝细胞毒性机制:重楼皂苷Ⅰ显着升高了 HepaRG细胞中ROS水平,引起MMP下降,Cyt c从线粒体向胞浆中释放,早期及晚期凋亡细胞增多,LDH的释放量升高。改变了周期蛋白P21、cyclinA、cyclinE和CDK2的表达,诱导细胞周期阻滞。并且明显激活了凋亡通路蛋白Fas、P53、caspase-3、caspase-8、caspase-9的表达,且呈现剂量依赖关系;重楼皂苷Ⅰ血管毒性机制:重楼皂苷Ⅰ显着促进了心血管细胞LDH的释放,抑制细胞迁移和血管生成,改变周期分布,诱导细胞凋亡。给药后的细胞中VEGFR2、p-VEGFR2、Src、p-Src、PI3K、Src、P38、PLCy 等近 30 种蛋白的表达均发生了改变。（3）蛋白组学结果:共筛选出302个差异蛋白,其中上调蛋白182个,下调蛋白120个。差异蛋白具有氧化还原酶活性、催化活性等分子功能,参与了脂肪酸代谢、有机酸的代谢、药物代谢、氧化还原过程等生物过程。主要分布在细胞质和细胞内膜结合细胞器包括线粒体、内质网等;Pathway结果显示,差异蛋白在细胞色素P450酶对药物的代谢、细胞色素P450对外源物质的代谢、过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（PPARγ）等途径上富集程度较高;PPI网络分析发现差异蛋白主要聚集在三个功能区域,包括细胞色素P450酶、脂质代谢过程、氧化还原过程;IPA商业数据库筛选出9个与肝毒性相关的差异蛋白作为潜在生物标志物;代谢组学结果:给药组代谢物轮廓明显偏离对照组;通过多维和单维的差异代谢物的交集,筛选并初步鉴定出97种差异代谢物,25条代谢通路。结果归纳显示重楼皂苷Ⅰ造成了体内5个方面的代谢异常,包括氨基酸代谢、脂肪酸代谢、谷胱甘肽代谢、能量代谢、蛋白质合成;其中D-谷氨酰胺与D-谷氨酸代谢,丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢,花生四烯酸代谢,氨酰tRNA生物合成等代谢通路影响值相对较高;代表性差异代谢物为花生四烯酸、焦谷氨酸、乙醇酸、酰基肉碱等。对全文中研究的重楼皂苷Ⅰ的肝毒性情况进行了综合分析,总结并推测了重楼皂苷Ⅰ造成肝毒性的机制。采用qPCR及Western blot验证了关键蛋白Bax、CYP1A2、P53、Fas的表达,对推测的肝损伤机制进行了初步验证。研究结论:（1）细胞实验研究发现重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ均具有肝脏、肾脏、心血管细胞毒性;斑马鱼实验研究确定了 3种皂苷中毒性最强的为重楼皂苷Ⅰ,毒性最明确的毒性靶部位是肝脏和心血管;斑马鱼肝脏病理切片、TUNEL染色,小鼠生化指标、病理切片检测进一步验证了重楼皂苷Ⅰ的肝脏和心脏毒性;（2）重楼皂苷Ⅰ肝细胞毒性机制为ROS应激通路和死亡受体通路介导的细胞凋亡;心血管毒性主要作用通路为VEGFR2激活的下游PI3K/AKT/mTOR、Src/eNOS、PLCy/ERK/MEK、P38信号通路,JAK2/STAT3信号传导通路和Bcl-2家族介导的凋亡通路,从诱导心血管细胞凋亡和抑制新生血管两方面产生心血管毒性。（3）蛋白质组学和代谢组学实验结果结合全文数据推测重楼皂苷Ⅰ诱导的肝毒性机制可能为CYP450酶和脂质代谢介导的线粒体功能障碍为主体的肝细胞损伤。药物影响了:①多种CYP450酶。主要包括Ⅰ相代谢酶CYP1A1、CYP1A2和Ⅱ相代谢酶GSTA3和UGT1A1表达紊乱,呈现下调趋势。药物在体内的水解、代谢过程被减慢,随着作用时间的延长,药物毒性反应增加。未被代谢的药物作用可能作用于线粒体,造成线粒体功能障碍;也很有可能是Ⅱ相药物代谢酶下调,产生的毒性代谢中间产物作用于线粒体,进一步产生了肝脏毒性;②脂质代谢。线粒体损伤后β-氧化的功能受到影响,体内的游离脂肪酸不能被氧化而转化成甘油三脂,导致了体内脂质的蓄积。同时ATP合成减少,供能障碍。脂质蓄积还能产生脂毒性进一步影响线粒体功能,产生过量ROS;③线粒体氧化应激。过量的ROS生成诱导线粒体氧化应激,释放Cyt c,升高Bax,降低Bcl-2,进而激活caspase家族导致肝细胞凋亡。Western blot验证结果显示药物代谢酶CYP1A2显着下调以及凋亡关键蛋白Bax表达上调。qPCR结果显示凋亡相关基因P53、Bax以及Fas的表达均显着上调,验证实验佐证了机制推论的合理性。
张雯雯[8]（2021）在《益气搜风中药对心肌缺血再灌注损伤大鼠内皮功能影响与机制的研究》文中指出目的:缺血再灌注损伤可见于心、脑、肺、肾等人体多个重要器官,探究其病理机制,最大程度降低损伤,提高临床疗效越来越成为医学界的研究热点。缺血心肌再灌注（MIRI）后无复流、慢复流致使心律失常甚至再梗死等并发症严重影响血运重建治疗的临床预后,其机制涉及冠脉微循环病变。西医治疗方案尚缺乏安全有效防治冠脉微循环障碍的药物,特别是血运重建后期治疗方面,中医药能够发挥未病先防、既病防变的特色优势,临床疗效明显,较西药治疗费用更低。目前国内关于中药单体及复方防治MIRI的研究虽有一定进展,但缺乏对多靶点作用机制的深入探究。宫丽鸿教授以“风扰心络为病”理论为基础,提出益气搜风、养血解痉、通络止痛之治法,总结自身多年临床经验结合前人古方,形成益气搜风中药组方黄芪复方,寓意补养心络亏虚之气血、搜剔内扰之毒风,以助心脉气血调和、脉道息风通络,改善心肌细胞因缺血缺氧形成的组织结构与功能损伤。此法以补为通,寓通于补,通补兼施,相辅相成,补气而不留邪,剔邪而不伤正,针对本虚标实的病理特点,可谓标本兼治。本研究通过冠脉结扎法复制建立心肌缺血再灌注损伤大鼠模型,以模型大鼠为研究对象,观察益气搜风中药黄芪复方对实验大鼠内皮功能影响与炎症反应、细胞凋亡相关因子蛋白与基因的表达,从对血管内皮功能的保护作用角度,探讨益气搜风中药对缺血再灌注损伤中微循环障碍的影响,并进一步揭示其产生作用可能相关的机制途径,丰富风扰心络为病之理论内涵,并为临床推广应用提供实验依据。材料与方法:1.心肌缺血再灌注损伤模型建立与益气搜风中药对模型大鼠内皮功能影响:将120只（240±20）g SD大鼠随机分为假手术组、模型组、培哚普利组、益气搜风中药黄芪复方低中高剂量组,共6组,每组20只。根据成人（按体重60kg计算）常用剂量与实验动物用药剂量换算公式,折算出大鼠剂量,每组给予不同预处理。假手术组、模型组大鼠均予生理盐水10 mL·kg-1灌胃;益气搜风中药低、中、高剂量组分别予含黄芪复方1.8g·kg-1、3.6 g·kg-1、7.2 g·kg-1药液灌胃;培哚普利组予以含有培哚普利浓度为0.4mg·kg-1溶液灌胃。上述操作各组日1次,持续7d。第7d灌胃完毕1h采用冠脉结扎法建立心肌缺血再灌注模型;其中假手术组术中不结扎冠脉,余操作同其它各组;分别记录结扎30 min时与再灌注120 min时大鼠ECG情况;选取Ⅱ导联为实验中主要观察目标,以ST段变化作为心肌缺血标志;以ST段显着抬高判定结扎成功,以抬高的ST段回落幅度达1/2判定再灌注造模成功。造模成功后进行取材,取材前夜（即第6d）大鼠禁食不禁水。取腹主动脉取血,静置后离心,上清液-20℃保存,用于后续实验;采血后即刻处死大鼠,无菌条件下取出心脏,经灭菌生理盐水清洗以10%甲醛固定,-20℃冻存用于后续实验。采用ELISA法检测各组血清中TXA2、PGI2、s TM、s EPCR的含量,比较各组TXA2/PGI2比值。2.益气搜风中药对心肌缺血再灌注损伤模型大鼠血管内皮炎症因子的影响:取已采集的各组大鼠血清,采用ELISA法检测各组血清中IL-8、IL-6、TNF-α含量。3.益气搜风中药对心肌缺血再灌注损伤模型大鼠血管内皮细胞凋亡的影响:取已采集的各组大鼠心脏组织,电子天平称取左心室心尖部位100mg,高通量组织研磨仪研磨组织,研磨好的心肌组织置于预先配制好的500ul裂解液,以12000 rpm速度离心10 min后取上清液,经处理后采用Western Blot法测定各组Akt、P-Akt、Bax、Bcl-2蛋白表达水平,采用蛋白质定量（BCA）法测定蛋白浓度,采用ECL化学发光检测法检测,实验结果通过成像系统显示;采用RT-PCR法测定Aktm RNA、eNOS m RNA、Baxm RNA、Bcl-2 m RNA表达水平,采用引物设计软件Primer Premier 5.0设计引物,采用2-ΔΔct法对各样品中基因的表达差异进行相对定量分析。统计学处理均采用SPSS 26.0统计软件进行数据分析,Graphpad Prism 9.0.0版统计软件绘制数据分析图,计量资料以（?）表示,组间比较采用单因素方差分析,两两比较方差齐采用LSD检验。P<0.05表示存在统计学差异,P<0.01表示差异显着,P>0.05为差异不具有统计学意义。结果:1.心肌缺血再灌注损伤模型建立与益气搜风中药对模型大鼠内皮功能影响:1.1复制大鼠心肌缺血再灌注损伤模型:模型建立过程中各组大鼠存活情况:麻醉操作后,死亡1只大鼠;气管插管与术中行结扎、再灌注等操作时,因呼吸停止、大出血和室颤共造成37只大鼠死亡,其中假手术组5只、其他造模组32只。各组存活大鼠数量满足后续实验需求。造模情况:经心电图监测观察结扎时与再灌注后大鼠Ⅱ导联心电变化,筛除未符合ST段改变标准大鼠8只,成功造模总数59只,各组造模成功大鼠数量满足指标检测需求。1.2各组大鼠血清TXA2、PGI2水平及TXA2/PGI2比值:相较假手术组,模型组TXA2水平显着升高,PGI2水平显着降低,TXA2/PGI2明显升高（P<0.01）;相较模型组,培哚普利组和益气搜风中药黄芪复方各剂量组TXA2含量均显着降低,PGI2含量显着升高,TXA2/PGI2显着下降（P<0.01）;相较于培哚普利组,益气搜风中药中剂量组TXA2、PGI2含量与TXA2/PGI2均无明显差异（P>0.05）。1.3各组大鼠血清s TM、s EPCR水平:相较于假手术组,模型组s TM、s EPCR含量显着升高（P<0.01）;相较于模型组,培哚普利组和益气搜风中药各剂量组s TM、s EPCR含量均显着降低（P<0.01）;相较于培哚普利组,中药各剂量组s TM、s EPCR含量升高（P<0.05）。2.益气搜风中药对心肌缺血再灌注损伤模型大鼠血管内皮炎症因子的影响:2.1各组大鼠血清IL-6、IL-8水平:相较假手术组,模型组IL-6、IL-8含量显着升高（P<0.01）;相较模型组,培哚普利组和中药各剂量组IL-6、IL-8含量均显着降低（P<0.01）;相较于培哚普利组,中药中剂量组IL-6、IL-8含量无明显差异（P>0.05）。2.2各组大鼠血清TNF-a水平:相较假手术组,模型组TNF-a含量显着升高（P<0.01）;相较于模型组,培哚普利组和中药各剂量组TNF-a含量均显着降低（P<0.01）;相较于培哚普利组,中剂量组TNF-a含量无明显差异（P>0.05）。3.益气搜风中药对心肌缺血再灌注损伤模型大鼠血管内皮细胞凋亡的影响:3.1各组大鼠Akt、eNOS m RNA的表达:相较假手术组,模型组Akt m RNA、eNOS m RNA表达显着降低（P<0.01）;相较模型组,培哚普利组与益气搜风中药各剂量组Akt mRNA、eNOS m RNA表达均增加（P<0.05）;相较于培哚普利组,益气搜风中药中剂量组Akt mRNA、eNOS mRNA表达无明显差异（P>0.05）。3.2各组大鼠Akt、P-Akt蛋白表达与P-Akt/Akt 比值:相较假手术组,模型组Akt、P-Akt蛋白表达显着降低（P<0.01）;相较模型组,培哚普利组、益气搜风中药各剂量组Akt、P-Akt蛋白表达显着增加（P<0.01）;相较于培哚普利组,益气搜风中药中剂量组Akt蛋白表达、P-Akt/Akt 比值无明显差异（P>0.05）,高剂量组P-Akt蛋白表达无明显差异（P>0.05）。3.3各组大鼠Bcl-2、Bax mRNA的表达:相较假手术组,模型组Bcl-2 mRNA、Bax mRNA表达均升高（P<0.05）;相较模型组,培哚普利组与益气搜风中药各组Bcl-2mRNA表达均升高,Bax mRNA表达降低（P<0.05）;与培哚普利组相比,益气搜风中药中剂量组Bcl-2 mRNA、Bax mRNA表达无明显差异（P>0.05）。3.4各组大鼠Bcl-2、Bax蛋白表达与Bcl-2/Bax比值:相较假手术组,模型组Bcl-2、Bax蛋白表达均显着升高,Bcl-2/Bax比值显着降低（P<0.01）;相较模型组,培哚普利组、益气搜风中药中剂量组Bcl-2蛋白表达与Bcl-2/Bax比值均显着升高,Bax蛋白表达显着降低（P<0.01）;相较于培哚普利组,益气搜风中药中剂量组Bcl-2蛋白表达无明显差异（P>0.05）。结论:1.益气搜风中药黄芪复方能够调控血管内皮功能损伤因子的表达,提示益气搜风中药复方对MIRI大鼠血管内皮功能可能具有保护作用。2.益气搜风中药复方能够下调大鼠IL-8、IL-6、TNF-α等炎症因子的表达,提示益气搜风中药复方对MIRI大鼠心肌的保护作用可能与抑制炎性反应有关。3.益气搜风中药复方能够上调PI3K/Akt信号通路中关键靶蛋白Akt及其下游eNOS mRNA表达水平;干预Akt及P-Akt蛋白表达水平,调控P-Akt/Akt平衡;同时调控凋亡因子Bcl-2、Bax基因与蛋白的表达。提示益气搜风中药复方改善MIRI血管内皮功能的机制可能与激活PI3K/Akt信号通路活性从而调控细胞凋亡有关。
骆帝[9]（2020）在《补肾活血胶囊通过Hedgehog信号通路调控成骨、成血管防治激素性股骨头坏死的机制研究》文中提出目的:利用Western blotting方法检测不同病因造成ONFH患者的股骨头样本大致病理形态与其中成骨与成血管相关蛋白的表达情况,为后续SONFH相关基础实验与临床治疗提供一定的理论基础与参照;再通过观察补肾活血胶囊对GC相关的ONFH SD大鼠骨组织重建及血管新生的影响和对GC处理的BMSCs成骨-成血管分化的影响,进一步研究补肾活血胶囊对动物与细胞实验中的成骨、成血管及Hedgehog信号通路相关因子的影响机制。方法:1.收集本院在2017年12月至2019年12月期间接受THA手术后的ONFH与股骨颈骨折患者的股骨头样本,挑选符合标准的股骨头按病因分别归入对照组、特发组、酒精组、激素组以及创伤术后组,采用Western blotting检测不同病因坏死骨组织的成骨与成血管相关指标的蛋白表达情况。2.通过使用对SD大鼠臀肌注射MPS的方法建立GC相关的ONFH大鼠模型,随后给予不同剂量的补肾活血胶囊加以干预,8周后通过组织病理学观察、荧光定量PCR检测与Western blotting分析在不同层面综合评价补肾活血胶囊对GC相关的ONFH大鼠骨组织重建及血管新生的影响。3.运用贴壁法提纯与扩增SD大鼠的BMSCs,并使用不同剂量的补肾活血胶囊含药血清与Dex进行干预培养,观察BMSCs的生长状况、增殖能力以及分化潜能,并采用细胞划痕实验、q PCR检测与Western blotting分析细胞中成骨、成血管与Hedgehog信号通路相关因子的蛋白表达变化;同时,建立SD大鼠RAOECs与BMSCs共培养体系,并对共培养后的RAOECs进行血管生成实验和Transwell迁移实验,观察其在补肾活血胶囊含药血清与Dex干预培养下的成血管能力与细胞活性的变化。结果:1.通过观察各组股骨头样本的大致形态与冠状面,发现不同病因ONFH患者股骨头样本在大致形态与剖面具有较为相似的病理表现,同时有相似的坏死和修复的组织学特征;Western blotting结果:在成骨方面,ALP蛋白的表达除创伤术后组显着低于对照组外,其余各组间均无显着差异（P>0.05）;Collgen I蛋白只有特发组与对照组没有统计学差异（P>0.05）,其余各组表达量均显着低于对照组（P<0.05）;与对照组相比,激素组、创伤术后组的OPN蛋白表达量均显着降低（P<0.05）,而特发组、酒精组则无显着差异（P>0.05）;对照组中RUNX2的蛋白表达量分别显着高于其余各组（P<0.05）;在成血管方面,不同病因造成的ONFH股骨头样本中CD31、VEGFA与KDR血管生成相关标记物蛋白的表达较对照组均存在显着下降的情况（P<0.05）;而VWF的蛋白表达量在各组间均未有显着差异（P>0.05）;在Hedgehog信号通路方面,Shh的蛋白表达量在不同病因的ONFH患者股骨头样本内不存在显着差异（P>0.05）;与对照组相比,酒精组与创伤术后组样本中信号通路下游细胞内信号因子Gli1的蛋白表达量出现了显着下降（P<0.05）,而特发组、激素组则未见显着差异（P>0.05）;各组中细胞内信号因子Gli2的蛋白表达量较对照组均出现了显着减少（P<0.05）。2.SD大鼠干预8周后,各组大鼠股骨头样本大体观无明显差异;软件分析HE染色结果显示:CG组骨小梁面积比率显着高与MG组（P<0.05）,LDG、MDG、HDG三组数据则均显着高于MG组（P<0.05）;而大鼠空骨陷窝率情况与骨小梁面积比率趋势一致,同为CG组显着高于MG（P<0.05）且LDG、MDG、HDG剂量三组均显着高于MG组（P<0.05）;软件分析免疫组织化学染色结果显示:与CG组相比,MG组大鼠股骨头成骨相关指标ALP、Collgen I、OPN与RUNX2不同程度的表达减少（P<0.05）;而灌胃不同剂量补肾活血胶囊的三个组则显着高于MG组（P<0.05）;MG组成血管相关指标CD31、VEGFA、KDR与VWF在股骨头中的表达强度相比较CG组均有明显下降（P<0.05）,而不同剂量补肾活血胶囊灌胃组与MG组相比均有显着升高（P<0.05）;q PCR检测结果显示:在成骨方面,CG组中ALP、Collgen I和RUNX2的m RNA表达均显着高于MG组（P<0.05）;LDG组中Collgen I与RUNX2的表达显着高于MG组（P<0.05）;MDG组中ALP与Collgen I的表达显着高于MG组（P<0.05）;而HDG组Collgen I的表达显着高于MG组（P<0.05）;在成血管方面,CG中CD31、VEGFA和KDR的m RNA表达均显着高于MG组（P<0.05）;LDG组中只有VEGFA的m RNA表达量明显多于MG组（P<0.05）;MDG组中CD31与VEGFA的m RNA表达量均显着多于MG组（P<0.05）;而HDG组VEGFA的m RNA表达量明显少于MG组（P<0.05）;在Hedgehog信号通路方面,CG组中Shh、Gli1和Gli2的m RNA表达量均明显多于MG组（P<0.05）;LDG组中则有Gli1和Gli2的表达显着高于MG组（P<0.05）;MDG组与HDG组中Shh、Gli1和Gli2的m RNA表达情况均显着高于MG组（P<0.05）;Western blotting结果分析显示:CG组样本中成骨相关ALP、Collgen I、OPN和RUNX2蛋白表达均显着高于MG组,而经过补肾活血胶囊LDG组中Collgen I、OPN和RUNX2三种蛋白表达情况均显着高于MG组表达（P<0.05）;MDG组中ALP、Collgen I和OPN三种蛋白表达均显着高于MG组（P<0.05）;HDG组显中ALP与Collgen I着高于MG组（P<0.05）;CG样本中成血管相关CD31、VEGFA、KDR和VWF四种蛋白表达均显着高于MG组,而LDG组中VEGFA、KDR两种蛋白表达情况均显着高于MG组表达（P<0.05）;而MDG组中VEGFA与KDR两种蛋白表达均显着高于MG组（P<0.05）,而CD31与VWF的表达则显着低于MG组（P<0.05）;HDG组显中KDR和VWF着高于MG组（P<0.05）;CG组样本中Hedgehog信号通路相关Shh、Gli1和Gli2蛋白三种蛋白表达均显着高于MG组,而经过补肾活血胶囊干预的LDG组中仅有Gli2蛋白表达情况显着高于MG组表达（P<0.05）;而MDG组中Shh和Gli2两种蛋白表达均显着高于MG组（P<0.05）;HDG组显中也仅有Gli2蛋白的表达着高于MG组（P<0.05）。3.本研究采用贴壁法可以提纯高纯度的原代SD大鼠BMSCs;原代BMSCs可顺利进行成骨、成脂与成软骨诱导分化;不同浓度的补肾活血胶囊含药血清不进对原代BMSCs具有促进增殖的作用,并且还可显着提高经Dex处理过的原代BMSCs的增殖活性;成骨诱导3周后,茜素红染色显示不同浓度补肾活血胶囊含药血清低、中、高剂量组与对照组染色结果相似,较模型组显着升高;BMSCs划线实验24h时,CG组与LDG、MDG、HDG三组的划线平均宽度均显着低于DG组（P<0.05）,且48h时趋势与24h时保持一致;将与SD大鼠BMSCs在不同浓度补肾活血胶囊含药血清与Dex进行共培养后的RAOECs进行血管生成实验,对CG与LDG、MDG、HDG三组的血管分支数量指标均显着高于MG组（P<0.05）;而在血管分支总长度指标上,CG组总长度数值显着高于DG组（P<0.05）,而MDG与HDG组的血管分支总长度显着高于DG组（P<0.05）;Transwell迁移实验结果表明:DG组迁移的细胞数量显着少于CG组（P<0.05）;MDG组迁移细胞数则显着多与DG组（P<0.05）;而LDG、HDG组迁移细胞数与模型组不存在显着差异（P>0.05）;q PCR结果显示:在Hedgehog信号通路方面,相比较于CG组,DG组中Shh、Gli1和Gli2的m RNA表达量均出现显着减少（P<0.05）;在含药血清方面,LG、HG组中Shh、Gli1和Gli2指标的m RNA表达量均显着多于CG组（P<0.05）,而MG组中的Shh和Gli2的m RNA表达情况较CG组均出现显着提高（P<0.05）;在干预方面,与DG组相比,MDG与HDG组中Shh、Gli1和Gli2各指标的m RNA表达量均出现显着升高（P<0.05）,而LDG组中的Shh和Gli2表达均显着高于DG组（P<0.05）;成骨方面,DG组相较于CG组ALP、Collgen I和RUNX2的m RNA表达量均有显着降低（P<0.05）;在含药血清方面,LG组中ALP、Collgen I和RUNX2的m RNA表达均显着高于CG组（P<0.05）,而MG与HG组中的ALP和RUNX2表达均显着高于CG组（P<0.05）;在干预方面,MDG组中ALP、Collgen I和RUNX2的m RNA表达均显着高于DG组（P<0.05）,LDG组中Collgen I和RUNX2的表达显着高于DG组（P<0.05）,而HDG组中ALP和Collgen I的表达则显着高于DG组（P<0.05）;成血管方面:CG组的CD31、VEGFA和KDR的m RNA表达均显着高于DG组（P<0.05）;LG、MG与HG组中CD31、VEGFA和KDR的m RNA表达均显着高于CG组（P<0.05）;在干预方面,MDG与HDG组中CD31、VEGFA和KDR的m RNA表达均显着高于DG组（P<0.05）,LDG组中VEGFA和KDR的m RNA表达量皆显着多于DG组（P<0.05）;Western blotting结果分析显示:在Hedgehog信号通路方面,DG组BMSCs的Shh、Gli1和Gli2三种蛋白的表达量相较于CG组均有明显降低（P<0.05）;LG组中的Shh、Gli1和Gli2各指标蛋白表达程度较CG组有显着增加（P<0.05）;MG、HG组中Gli1的蛋白表达量与CG组相比也有显着提升（P<0.05）;干预方面,LDG与MDG组相较于DG组的Shh、Gli1和Gli2三种蛋白表达量均有显着提高（P<0.05）;而HDG组则只有Gli2蛋白表达显着高于DG组P<0.05);在成骨方面,DG组BMSCs的ALP、Collgen I、OPN和RUNX2蛋白表达水平相较于CG组均有明显降低（P<0.05）;HG组中的ALP、Collgen I、OPN和RUNX2蛋白表达量均显着均高于CG组（P<0.05）;MG组中Collgen I、OPN和RUNX2的蛋白表达量显着高于CG组（P<0.05）;LG组中Collgen I和OPN的蛋白表达量显着高于CG组（P<0.05）;干预方面,MDG与HDG组相较于DG组的ALP、Collgen I、OPN和RUNX2蛋白表达水平方面均有显着提高（P<0.05）;而LDG组则在ALP、Collgen I和RUNX2的蛋白表达量上显着高于DG组（P<0.05）;在成血管方面,CG组BMSCs的CD31、VEGFA、KDR和VWF蛋白表达水平均显着高于DG组（P<0.05）;在CD31和VEGFA蛋白表达水平方面,LG、MG与HG三组表达情况与CG组相比提升明显（P<0.05）,但KDR和VWF的蛋白表达量则没有显着差异（P>0.05）;干预方面,LDG与MDG组相较于DG组在CD31、VEGFA、KDR和VWF的蛋白表达水平上均有显着提高（P<0.05）;而HDG组则在CD31、KDR和VWF的蛋白表达量上显着高于DG组（P<0.05）。结论:1.本研究通过对临床坏死的股骨头样本进行分析,初步了探究了不同病因导致的ONFH的初步机制。2.补肾活血胶囊可以通过Hedgehog信号通路对GC相关ONFH的SD大鼠骨重建与血管新生具有一定的促进作用。3.不同浓度的补肾活血胶囊含药血清可以通过Hedgehog信号通路可以调控并促进SD大鼠BMSCs向成骨与成血管方向的分化。
孙慧娟[10]（2020）在《基于转录组与代谢组学方法研究肿节风总黄酮抑制白血病细胞生长的作用机制》文中研究表明目的:本研究旨在证明肿节风总黄酮抑制白血病K562细胞活性的基础上,采用RNA-seq技术、细胞代谢组学方法研究肿节风总黄酮干预K562细胞过程中基因表达及代谢物的变化,探究肿节风总黄酮抑制K562细胞的分子机制。方法:1.探究肿节风总黄酮对人白血病细胞活性的影响用系列浓度的肿节风总黄酮干预K562细胞24、48、72 h后,化学发光法检测细胞活力,计算IC50值,并依此确定最佳干预浓度及时间,将细胞分为空白对照组、肿节风总黄酮25、50、100μg/m L剂量组,培养48 h后,通过AO-EB染色法及流式细胞术检测细胞凋亡情况。2.肿节风总黄酮抑制白血病细胞的转录组学研究将K562细胞分为空白对照组和肿节风总黄酮100μg/m L组培养48 h,提取总RNA进行c DNA文库构建、测序及质控等步骤后,对转录组数据与人的参考基因组进行比对、对基因表达水平进行定量分析及差异表达分析,筛选出差异表达基因。将筛选的差异表达基因进一步进行GO基因功能注释、KEGG信号通路富集分析,并将差异基因导入STRING数据库进行PPI蛋白网络互作分析。最后,通过WB实验对关键信号通路进行验证。3.肿节风总黄酮抑制白血病细胞的代谢组学研究采用基于LC-MS技术的非靶向代谢组学方法,分析空白对照组和肿节风100μg/m L组干预K562细胞48 h后代谢物的变化。通过对代谢产物的多元统计分析以及数据库比对,鉴定出潜在的生物标记物,并导入Metebo Analysta 4.0在线软件进行代谢通路的富集分析,以及转录组学与代谢组学联合分析,最后综合分析结果,阐述肿节风总黄酮抑制K562细胞的作用机制。结果:1.肿节风总黄酮能够明显降低K562细胞存活率,且呈时间和剂量依赖关系,24、48、72 h的IC50分别为64.27、49.38、32.43μg/m L。依据K562细胞生长特性和IC50值设置25、50、100μg/m L三个剂量组进行后续实验。AO-EB染色和流式细胞凋亡率检测表明,与空白对照组相比,50、100μg/m L的肿节风总黄酮明显促进K562细胞凋亡（P<0.01）,而25μg/m L的肿节风总黄酮不能促进K562细胞凋亡。2.RNA-seq测序数据分析表明,在肿节风总黄酮100μg/m L组和空白对照组之间,989个基因表达量呈差异显着性（log2（Fold Change）>1,且P-adjust<0.05）,其中654个上调基因,335个下调基因。差异基因GO富集分析显示,差异表达基因有1438条显着富集的GO terms,其中涉及生物过程1057条,细胞组分145条,分子功能236条。KEGG分析结果显示,肿节风总黄酮对K562细胞的作用与MAPK信号通路、神经活性配体-受体相互作用、补体和凝血级联高度相关。差异基因蛋白互作网络分析显示,CXCL8、GNGT1、GNG12、MCHR1、FOS、CCR7、NMU、C3AR1、RPS2、S1PR1处于蛋白互作网络中核心位置。WB验证MAPK通路关键靶点,p-JNK、CDC20的表达水平降低（P<0.01）,P53、CDKN1A表达水平升高（P<0.01）;p-ERK、p-P38表达水平差异不显着。3.正、负离子模式下空白对照组和肿节风总黄酮100μg/m L组在QC样本之间都能达到很好的分离。t检验结合OPLS-DA多元分析,筛选出VIP>1,P-value<0.05的差异代谢物158个,其中正离子模式98个,负离子模式下60个,将鉴定出的代谢产物导入Metabo Analyst 4.0进行通路富集分析,显着富集到了苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成,鞘脂代谢,甘油磷脂代谢,苯丙氨酸代谢四条代谢途径上。再将转录组学筛选的差异基因和代谢组学筛选的差异代谢物进行联合分析,发现鞘脂代谢是其中最重要的代谢途径。结论:1.一定浓度的肿节风能够抑制白血病K562细胞活性,促进其凋亡。2.肿节风总黄酮可能通过降低MAPK信号通路中JNK磷酸化水平,上调P53、CDKN1A基因的表达量,下调CDC20的表达量,阻滞细胞周期,进而抑制白血病细胞的活性。3.肿节风总黄酮可能通过调节苯丙氨酸代谢、鞘脂代谢和甘油磷脂代谢通路,抑制氨基酸的分解功能,诱导细胞膜损伤,干预细胞间的信号传递,多途径地发挥抑制白血病细胞的作用。
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要英文缩略索引 |
| 前言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 子宫内膜炎 |
| 1.1 奶牛子宫的组织结构 |
| 1.1.1 子宫的位置 |
| 1.1.2 子宫的形态 |
| 1.1.3 子宫的生理作用 |
| 1.2 子宫内膜炎发病原因 |
| 1.2.1 病原微生物 |
| 1.2.2 饲养管理因素 |
| 1.2.3 其他因素 |
| 1.3 子宫内膜炎的发病机理 |
| 1.3.1 激素对子宫内膜炎的影响 |
| 1.3.2 自体免疫调节的影响 |
| 1.4 奶牛子宫内膜炎的防治 |
| 1.4.1 子宫冲洗法 |
| 1.4.2 药物灌注法 |
| 1.4.3 全身用药 |
| 1.4.4 疫苗接种 |
| 1.4.5 兽用天然药物 |
| 2 梓醇的研究进展 |
| 2.1 梓醇化学结构和药动学 |
| 2.1.1 梓醇化学结构 |
| 2.1.2 药动学 |
| 2.2 梓醇的毒理学与临床应用 |
| 2.2.1 毒理学研究 |
| 2.2.2 临床应用 |
| 2.3 炎症通路 |
| 2.3.1 NF-κB炎症通路研究 |
| 2.3.2 MAPK炎症通路研究 |
| 2.3.3 梓醇抗炎通路研究 |
| 3 研究的目的与意义 |
| 第二章 梓醇抑制LPS刺激RAW264.7细胞抗炎机制研究 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 相关试剂配制 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 RAW264.7细胞培养 |
| 2.2 RAW264.7细胞炎症造模 |
| 2.2.1 梓醇对RAW264.7细胞活力影响 |
| 2.2.2 梓醇对LPS刺激RAW264.7细胞抗炎造模 |
| 2.3 炎性因子检测 |
| 2.4 细胞免疫荧光检测 |
| 2.5 TLR4和NF-κB信号转导通路各分子基因表达情况检测 |
| 2.5.1 细胞总RNA提取 |
| 2.5.2 细胞总RNA浓度测定 |
| 2.5.3 RT-qPCR反应 |
| 2.6 TLR4和NF-κB信号转导通路各分子蛋白表达情况分析 |
| 2.6.1 细胞蛋白提取 |
| 2.6.2 BCA蛋白浓度测定 |
| 2.6.3 Western Blot |
| 3 数据分析 |
| 4 试验结果 |
| 4.1 梓醇对体外RAW264.7细胞活力无毒副作用 |
| 4.2 梓醇下调LPS刺激的RAW264.7细胞炎性因子水平 |
| 4.3 梓醇降低LPS刺激RAW264.7细胞TLR4表达 |
| 4.4 梓醇降低LPS刺激RAW264.7细胞NF-κB信号通路的传导 |
| 4.5 梓醇降低LPS刺激RAW264.7细胞MAPK信号通路的表达 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 第三章 梓醇降低bEECS炎性细胞TLR4/NF-KB信号通路的传导 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 相关试剂配制 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 bEECs细胞培养 |
| 2.2 bEECs细胞炎症造模 |
| 2.2.1 梓醇对bEECs活力影响 |
| 2.2.2 梓醇对LPS刺激bEECs细胞抗炎造模 |
| 2.3 RT-qPCR反应 |
| 2.3.1 细胞总RNA提取 |
| 2.3.2 细胞总RNA浓度测定 |
| 2.3.3 RT-qPCR反应 |
| 2.4 Western Blot |
| 2.4.1 细胞蛋白提取 |
| 2.4.2 BCA蛋白浓度测定 |
| 2.4.3 Western Blot |
| 2.5 炎性因子检测 |
| 2.6 免疫荧光检测 |
| 3 数据分析 |
| 4 试验结果 |
| 4.1 梓醇对体外bEECs细胞活力无影响 |
| 4.2 梓醇可降低LPS刺激bEECs细胞炎性因子表达 |
| 4.3 梓醇下调LPS刺激的bEECs细胞趋化因子CXCL8和CXCL5基因表达 |
| 4.4 梓醇下调LPS刺激bEECs细胞TLR4/NF-κB炎性信号通路表达 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 第四章 梓醇抗炎作用的小鼠模型验证试验 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 相关试剂配制 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 小鼠子宫内膜炎造模 |
| 2.2 小鼠子宫组织病理检查 |
| 2.3 血清炎性因子检测 |
| 2.4 小鼠子宫组织MPO含量检测 |
| 2.5 子宫组织TLR4和NF-κB信号转导通路各分子基因表达情况检测 |
| 2.5.1 组织总RNA提取 |
| 2.5.2 组织总RNA浓度测定 |
| 2.5.3 RT-qPCR反应 |
| 2.6 组织TLR4和NF-κB信号转导通路各分子蛋白表达情况检测 |
| 2.6.1 组织蛋白提取 |
| 2.6.2 BCA蛋白浓度测定 |
| 2.6.3 Western Blot |
| 3 数据分析 |
| 4 试验结果 |
| 4.1 梓醇可降低小鼠子宫内膜组织的炎症反应 |
| 4.2 梓醇可降低子宫内膜炎小鼠血清中炎性因子的表达 |
| 4.3 梓醇可下调患鼠子宫内膜组织中趋化因子表达 |
| 4.4 梓醇可下调患鼠子宫内膜组织中TLR4/NF-κB信号通路传导 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 第五章 结论与创新 |
| 1 结论 |
| 2 创新 |
| 3 有待进一步研究的内容 |
| 作者简历 |
| 成果发表 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1 引言 |
| 2 逍遥散抗抑郁研究进展 |
| 2.1 逍遥散抗抑郁化学成分研究进展 |
| 2.2 逍遥散抗抑郁药效学评价研究进展 |
| 2.3 逍遥散抗抑郁多组学研究进展 |
| 2.3.1 逍遥散抗抑郁的转录组学研究进展 |
| 2.3.2 逍遥散抗抑郁的蛋白组学研究进展 |
| 2.3.3 逍遥散抗抑郁的代谢组学研究进展 |
| 2.3.4 逍遥散抗抑郁的微生物组学研究进展 |
| 2.4 逍遥散抗抑郁分子机制研究进展 |
| 2.5 逍遥散抗抑郁多组学与分子药理学关联研究进展 |
| 2.6 逍遥散抗抑郁网络药理学研究进展 |
| 3 组学技术在中药抗抑郁作用研究进展 |
| 3.1 转录组学在中药抗抑郁作用研究进展 |
| 3.2 蛋白组学在中药抗抑郁作用研究进展 |
| 3.3 代谢组学在中药抗抑郁研究进展 |
| 3.4 代谢表型在抑郁症研究进展 |
| 3.5 其他组学在中药抗抑郁中研究进展 |
| 4 网络药理学在中药抗抑郁研究进展 |
| 4.1 网络药理学概述与研究流程 |
| 4.2 网络药理学在中药抗抑郁研究应用 |
| 4.3 网络药理学在中药抗抑郁研究存在的问题 |
| 4.4 网络药理学在中药抗抑郁研究发展趋势 |
| 5 科学问题 |
| 6 本课题研究意义、研究思路、技术路线、研究内容及主要创新点 |
| 第二章 逍遥散的化学成分表征及组学样本收集 |
| 第一节 逍遥散化学成分表征 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料与仪器 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 实验结果 |
| 1.4.1 逍遥散化学成分表征 |
| 1.5 小结与讨论 |
| 第二节 逍遥散抗抑郁药效验证与样本采集 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 逍遥散对CUMS大鼠体重的影响 |
| 2.4.2 逍遥散对CUMS大鼠糖水偏爱率的影响 |
| 2.4.3 逍遥散对CUMS大鼠旷场指标的影响 |
| 2.5 小结与讨论 |
| 2.5.1 小结 |
| 2.5.2 讨论 |
| 第三章 逍遥散抗抑郁代谢表型机制研究 |
| 第一节 基于LC-MS的逍遥散抗抑郁大鼠海马代谢组学研究 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料与仪器 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 实验结果 |
| 1.4.1 逍遥散干预CUMS抑郁大鼠的海马组织液质代谢轮廓分析 |
| 1.4.2 逍遥散干预CUMS抑郁大鼠生物标志物分析 |
| 1.4.3 逍遥散干预CUMS抑郁大鼠代谢通路分析 |
| 1.5 小结与讨论 |
| 1.5.1 小结 |
| 1.5.2 讨论 |
| 第二节 基于多生物标本代谢组学证据分析的逍遥散调节抑郁症代谢表型机制研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 逍遥散代谢组学的信息收集与分析 |
| 2.4.2 差异代谢物数量的比较分析 |
| 2.4.3 差异代谢物变化趋势的统计分析 |
| 2.4.4 通路富集分析 |
| 2.4.5 通路交互分析 |
| 2.4.6 蛋白网络模块划分与核心蛋白的识别 |
| 2.4.7 功能模块的验证分析 |
| 2.4.8 差异代谢物的验证分析 |
| 2.5 小结与讨论 |
| 2.5.1 小结 |
| 3.5.2 讨论 |
| 第三节 基于对接评分加权法的逍遥散抗抑郁代谢表型通路优化排序研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 抑郁症代谢生物标志物-酶网络分析 |
| 3.4.2 代谢生物标志物-靶点网络分析 |
| 3.4.3 重要通路的选择和分析 |
| 3.5 小结与讨论 |
| 3.5.1 小结 |
| 3.5.2 讨论 |
| 第四章 逍遥散抗抑郁CUMS大鼠海马“基因-蛋白-代谢”多组学机制研究 |
| 第一节 逍遥散对CUMS大鼠抗抑郁作用的转录组学研究 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料与仪器 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 实验结果 |
| 1.4.1 转录组数据评估 |
| 1.4.2 差异表达基因分析 |
| 1.4.3 差异表达基因的功能富集分析 |
| 1.4.4 差异表达基因的KEGG通路富集分析 |
| 1.4.5 关键基因文献验证 |
| 1.4.6 逍遥散回调差异基因分析 |
| 1.4.7 逍遥散回调差异表达基因PPI网络分析 |
| 1.4.8 逍遥散回调差异通路分析 |
| 1.4.9 逍遥散回调差异基因验证 |
| 1.5 小结与讨论 |
| 1.5.1 小结 |
| 1.5.2 讨论 |
| 第二节 基于ITRAQ技术探讨逍遥散对CUMS大鼠海马蛋白质组学研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 差异表达蛋白分析 |
| 2.4.2 逍遥散回调蛋白分析 |
| 2.4.3 逍遥散回调差异表达蛋白GO注释分析 |
| 2.4.4 逍遥散回调差异表达蛋白KEGG通路富集分析 |
| 2.4.5 逍遥散回调差异蛋白验证 |
| 2.5 小结与讨论 |
| 2.5.1 小结 |
| 2.5.2 讨论 |
| 第三节 基于转录组学和蛋白组学数据整合的逍遥散抗抑郁机制研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 基于转录组学和蛋白学数据的逍遥散抗抑郁海马组织通路整合分析 |
| 3.4.2 逍遥散对氧化磷酸化通路MrccⅠ,MrccⅢ和MrccⅣ活性的影响 |
| 3.4.3 逍遥散对氧化磷酸化通路Uqcrc2 mRNA水平的影响 |
| 3.4.4 逍遥散对氧化磷酸化通路Ndufs6 蛋白水平的影响 |
| 3.5 小结与讨论 |
| 3.5.1 小结 |
| 3.5.2 讨论 |
| 第四节 基于转录组学和代谢组学数据整合的逍遥散抗抑郁机制研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料和仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 基于转录组学和代谢组学数据的逍遥散抗抑郁海马组织通路整合分析 |
| 4.4.2 逍遥散对谷氨酸能突触通路谷氨酸含量的影响 |
| 4.4.3 逍遥散对谷氨酸能突触通路Gad1, Gls, Glur1和Grin2a水平的影响 |
| 4.4.4 逍遥散对谷氨酸能突触通路Gng12和Slc1a3 mRNA水平的影响 |
| 4.4.5 逍遥散对谷氨酸能突触通路Eaat2、Nmdar1、Mglur1、Erk1/2 和Creb蛋白水平的影响 |
| 4.5 小结与讨论 |
| 4.5.1 小结 |
| 4.5.2 讨论 |
| 第五章 逍遥散抗抑郁网络药理学及分子验证研究 |
| 第一节 基于ADME筛选逍遥散活性成分研究 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料与仪器 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 实验结果 |
| 1.4.1 逍遥散化学成分的收集 |
| 1.4.2 逍遥散化学成分的ADME预测 |
| 1.5 小结与讨论 |
| 1.5.1 小结 |
| 1.5.2 讨论 |
| 第二节 基于网络药理学逍遥散抗抑郁机制研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 逍遥散的靶点分析 |
| 2.4.2 逍遥散活性成分-靶点网络(C-T网络) |
| 2.4.3 逍遥散的靶点-疾病网络(T-D网络) |
| 2.4.4 逍遥散的靶点-通路网络(T-P网络) |
| 2.4.5 基于贡献指数筛选逍遥散活性成分 |
| 2.5 小结和讨论 |
| 2.5.1 小结 |
| 2.5.2 讨论 |
| 第三节 逍遥散抗抑郁分子生物学验证 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 逍遥散抗抑郁的重要活性成分和核心靶点对接 |
| 3.4.2 谷氨酸能突触通路验证 |
| 3.5 小结与讨论 |
| 3.5.1 小结 |
| 3.5.2 讨论 |
| 总结与展望 |
| 1 研究工作总结 |
| 2 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 主要缩略词表 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简况及联系方式 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 1.1 绝经后骨质疏松的病机及治疗研究进展 |
| 1.1.1 绝经后骨质疏松概述 |
| 1.1.2 雌激素影响绝经后骨质疏松的机制 |
| 1.1.3 绝经后骨质疏松的药物治疗 |
| 1.2 骨质疏松的中医病因及中药治疗的研究进展 |
| 1.2.1 中医对骨质疏松病因与病机的认识 |
| 1.2.2 治疗骨质疏松的常用中药 |
| 1.3 艾可清的临床应用及其组方药物的化学成分研究进展 |
| 1.3.1 艾可清的临床应用 |
| 1.3.2 艾可清组方中药的化学成分研究进展 |
| 第二章 艾可清改善去卵巢大鼠骨丢失的作用研究 |
| 1. 材料与仪器 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 第三章 艾可清对破骨细胞分化和成骨细胞分化的影响 |
| 1. 材料与仪器 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 第四章 艾可清抑制破骨细胞分化的作用机制研究 |
| 1. 材料与仪器 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校期间发表论文情况 |
| 致谢 |
| 附件 |
| 详细摘要 |
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩写词对照表 |
| 第1篇 前言 |
| 第2篇 文献综述 蒽环类药物致乳腺癌患者心脏毒性的研究进展 |
| 1.1 蒽环类药物心脏毒性临床表现 |
| 1.1.1 蒽环类药物心脏毒性发病率 |
| 1.1.2 蒽环类药物心脏毒性临床类型 |
| 1.1.3 蒽环类药物心脏毒性病理特征 |
| 1.2 蒽环类药物所致心脏毒性的发生机制 |
| 1.2.1 氧化应激 |
| 1.2.2 内质网应激和肌浆网钙稳态 |
| 1.2.3 线粒体功能障碍 |
| 1.2.4 铁调节蛋白紊乱 |
| 1.2.5 炎症反应 |
| 1.2.6 细胞自噬 |
| 1.2.7 细胞凋亡 |
| 1.3 蒽环类药物所致心脏毒性的药物防治 |
| 1.3.1 右雷佐生 |
| 1.3.2 卡维地洛 |
| 1.3.3 他汀类药物 |
| 1.3.4 辅酶Q10 |
| 1.3.5 中药 |
| 1.4 蒽环类药物所致心脏毒性与miRNAs |
| 1.4.1 miRNAs简介 |
| 1.4.2 心脏miRNAs表达的变化 |
| 1.4.3 循环miRNAs表达的变化 |
| 1.4.4 miRNAs在预防和治疗中的作用 |
| 1.5 乳腺癌与miRNAs |
| 1.5.1 诊断与分型 |
| 1.5.2 治疗 |
| 1.5.3 预后 |
| 1.6 miRNAs在蒽环类药物致乳腺癌患者心脏毒性中应用的展望 |
| 第3篇 实验研究 |
| 第1章 RUT减轻THP所致心脏毒性的miRNA生物信息学分析及miRNA-129-1-3p/GRIN2D介导的Ca~(2+)通路的构建 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 实验试剂 |
| 1.1.2 实验仪器 |
| 1.1.3 主要溶液配制 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 细胞培养 |
| 1.2.2 miRNA芯片生物信息学分析及信号通路构建 |
| 1.2.3 双荧光素酶报告基因实验 |
| 1.2.4 统计分析 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.3.1 生物信息学分析预测miR-129-1-3p靶基因和Ca~(2+)通路的联系 |
| 1.3.2 双荧光素酶报告基因实验 |
| 1.4 本章小结 |
| 第2章 miRNA-129-1-3p在 RUT减轻THP诱导的小鼠心肌细胞损伤中的介导作用 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 药品及试剂 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.1.3 主要溶液配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 实验用药配制 |
| 2.2.3 CCK-8 细胞毒性-增殖检测 |
| 2.2.4 实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qPCR) |
| 2.2.5 细胞转染 |
| 2.2.6 ROS检测 |
| 2.2.7 细胞丙二醛检测 |
| 2.2.8 超氧化物歧化酶检测 |
| 2.2.9 Fluo-3 AM钙离子检测 |
| 2.2.10 TUNEL细胞凋亡检测 |
| 2.2.11 Western blot |
| 2.2.12 统计分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 RUT、THP对心肌细胞作用的最佳浓度和时间确定 |
| 2.3.2 RUT逆转THP处理的HL-1细胞中miR-129-1-3p下调和GRIN2D mRNA上调 |
| 2.3.3 miR-129-1-3p转染至HL-1细胞中的效率评价 |
| 2.3.4 RUT和miR-129-1-3p改善THP诱导的HL-1细胞损伤 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 miRNA-129-1-3p在 RUT协同THP抑制乳腺癌4T1细胞增殖、迁移及侵袭中的介导作用 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 药品及试剂 |
| 3.1.2 实验仪器 |
| 3.1.3 主要溶液配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 HC11及4T1细胞培养 |
| 3.2.2 实验用药配置 |
| 3.2.3 CCK-8细胞毒性-增殖检测 |
| 3.2.4 qPCR |
| 3.2.5 细胞转染 |
| 3.2.6 平板克隆形成实验 |
| 3.2.7 划痕实验 |
| 3.2.8 Transwell迁移和侵袭实验 |
| 3.2.9 Fluo-3 AM钙离子检测 |
| 3.2.10 Western blot |
| 3.2.11 统计分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 RUT和/或THP对乳腺(癌)细胞作用及最佳浓度和时间确定 |
| 3.3.2 RUT协同THP上调4T1细胞miR-129-1-3p、下调GRIN2D mRNA的表达 |
| 3.3.3 miR-129-1-3p mimics/inhibitor成功转染至4T1细胞 |
| 3.3.4 miR-129-1-3p介导4T1细胞增殖、迁移、侵袭的作用 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 miRNA-129-1-3p在RUT对乳腺荷瘤与THP心脏毒性复合模型小鼠心肌保护及增敏抗肿瘤的介导作用 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 药品及试剂 |
| 4.1.2 实验仪器 |
| 4.1.3 主要溶液配制 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.14T1细胞培养 |
| 4.2.2 实验动物 |
| 4.2.3 乳腺荷瘤与心脏毒性小鼠复合模型的复制方法 |
| 4.2.4 实验分组及处理因素 |
| 4.2.5 小鼠血液标本的采集 |
| 4.2.6 小鼠肿瘤、心脏、肝脏及肺组织标本的采集 |
| 4.2.7 心电监测 |
| 4.2.8 心脏系数的测定 |
| 4.2.9 血清乳酸脱氢酶、肌酸激酶检测 |
| 4.2.10 血清MDA检测 |
| 4.2.11 血清SOD检测 |
| 4.2.12 小鼠肿瘤、心脏、肝脏及肺组织HE染色 |
| 4.2.13 肿瘤组织免疫组织化学染色 |
| 4.2.14 qPCR |
| 4.2.15 心肌与肿瘤组织中Ca~(2+)水平检测 |
| 4.2.16 TUNEL检测心肌与肿瘤组织细胞凋亡 |
| 4.2.17 Western blot |
| 4.2.18 统计分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 小鼠一般状况及体重变化 |
| 4.3.2 小鼠肿瘤生长情况 |
| 4.3.3 小鼠心电图变化 |
| 4.3.4 小鼠心脏系数变化 |
| 4.3.5 小鼠血清LDH及CK变化 |
| 4.3.6 小鼠血清MDA、SOD变化 |
| 4.3.7 小鼠肿瘤、心脏、肝脏及肺组织病理学改变 |
| 4.3.8 小鼠肿瘤组织中Ki67 变化 |
| 4.3.9 小鼠心肌和肿瘤组织中miR-129-1-3p和GRIN2D mRNA的变化 |
| 4.3.10 小鼠心肌和肿瘤组织中钙含量变化 |
| 4.3.11 小鼠心肌和肿瘤组织的细胞凋亡 |
| 4.3.12 小鼠肿瘤组织中与迁移、侵袭相关蛋白表达的变化 |
| 4.4 本章小结 |
| 第4篇 讨论 |
| 1.1 THP诱导小鼠心肌细胞损伤模型及乳腺荷瘤与THP心脏毒性复合小鼠模型的复制 |
| 1.1.1 THP诱导的小鼠心肌细胞损伤模型的复制 |
| 1.1.2 乳腺荷瘤与心脏毒性复合小鼠模型的复制 |
| 1.2 RUT改善THP所致小鼠HL-1 细胞/心肌损伤中的作用及机制 |
| 1.2.1 RUT改善THP所致小鼠HL-1 细胞/心肌损伤中的作用 |
| 1.2.2 RUT改善THP所致小鼠HL-1 细胞/心肌损伤中的作用机制 |
| 1.3 RUT增敏THP抗小鼠乳腺癌中的作用及机制 |
| 1.3.1 RUT增敏THP抗小鼠乳腺癌中的作用 |
| 1.3.2 RUT增敏THP抗小鼠乳腺癌的作用机制 |
| 第5篇 结论 |
| 创新点 |
| 今后工作展望 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 常用中英文缩略词表 |
| 1 前言 |
| 1.1 立题依据 |
| 1.2 研究进展 |
| 1.2.1 单端孢霉烯族毒素概述 |
| 1.2.2 T-2 毒素概述 |
| 1.2.3 T-2 毒素神经毒性与氧化应激研究进展 |
| 1.2.4 T-2 毒素诱导BBB损伤研究进展 |
| 1.2.5 转录共激活因子PGC-1α与氧化应激和BBB损伤的研究进展 |
| 1.2.6 基于PGC-1α的激动剂的筛选 |
| 1.3 研究内容和目标 |
| 1.3.1 研究内容 |
| 1.3.2 研究目标 |
| 2 T-2 毒素对大鼠大脑和垂体的毒性作用研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 药物与试剂 |
| 2.1.2 试剂配制 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.1.4 试验动物 |
| 2.1.5 动物分组与试验设计 |
| 2.1.6 观测指标 |
| 2.1.7 qRT-PCR检测相关基因的mRNA表达 |
| 2.1.8 Western blot方法测定蛋白表达水平 |
| 2.1.9 HE染色切片观察 |
| 2.1.10 TEM观察 |
| 2.1.11 免疫组织化学 |
| 2.1.12 T-2 毒素检测方法 |
| 2.1.13 大脑T-2 毒素提取方法 |
| 2.1.14 数据处理 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 临床观察 |
| 2.2.2 T-2 毒素对大鼠大脑和垂体的病理学损伤 |
| 2.2.3 脑和垂体超微结构观察 |
| 2.2.4 自噬相关基因表达 |
| 2.2.5 凋亡相关基因表达 |
| 2.2.6 大脑中T-2 毒素含量的检测 |
| 2.3 讨论 |
| 3 PGC-1α 在 T-2 毒素引起的 GH3 细胞氧化应激中的作用 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 细胞株 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 试剂配制 |
| 3.1.4 主要仪器 |
| 3.1.5 细胞复苏、传代和冻存 |
| 3.1.6 利用siRNA干扰PGC-1α或 Tfam基因表达 |
| 3.1.7 细胞内氧自由基检测 |
| 3.1.8 抗氧化酶SOD活性检测 |
| 3.1.9 细胞GSH-Px含量检测 |
| 3.1.10 qRT-PCR检测相关基因的m RNA表达 |
| 3.1.11 Western blot方法测定蛋白表达水平 |
| 3.1.12 T-2 毒素检测方法 |
| 3.1.13 细胞T-2 毒素提取方法 |
| 3.1.14 数据处理 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 细胞内外T-2 毒素的浓度 |
| 3.2.2 T-2 毒素引起GH3 细胞氧化应激 |
| 3.2.3 T-2 处理GH3 细胞后对PGC-1α和 Tfam表达的影响 |
| 3.2.4 PGC-1α干扰对下游基因及GH3 细胞氧化应激的影响 |
| 3.2.5 Tfam干扰对GH3 细胞氧化应激的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 4 PGC-1α 在 T-2 毒素引起的 hBMEC 细胞毒性中的作用 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 细胞株 |
| 4.1.2 质粒 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.1.4 试剂配制 |
| 4.1.5 主要仪器 |
| 4.1.6 细胞复苏、传代和冻存 |
| 4.1.7 CCK-8 法检测T-2 毒素和PGC-1α抑制剂SR-18298对h BMEC细胞活力的影响 |
| 4.1.8 h-pc DNA3.1(+)-PGC-1α过表达载体的构建 |
| 4.1.9 h-pc DNA3.1(+)-PGC-1α过表达载体转染到hBMEC细胞中 |
| 4.1.10 间接免疫荧光试验 |
| 4.1.11 细胞跨膜电阻测定 |
| 4.1.12 细胞荧光素钠透过试验 |
| 4.1.13 qRT-PCR检测相关基因的mRNA表达 |
| 4.1.14 Western blot方法测定蛋白表达水平 |
| 4.1.15 数据处理 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 T-2 毒素对HBMEC细胞毒性 |
| 4.2.2 T-2 毒素对体外BBB模型的损伤作用研究 |
| 4.2.3 PGC-1α在 T-2 毒素引起的h BMEC细胞BBB损伤中的作用 |
| 4.3 讨论 |
| 5 中药小分子化合物激活PGC-1Α在 T-2 毒素和LPS引起的血脑屏障损伤中的作用 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 细胞株 |
| 5.1.2 质粒 |
| 5.1.3 主要试剂 |
| 5.1.4 试剂配制 |
| 5.1.5 主要仪器 |
| 5.1.6 细胞复苏、传代和冻存 |
| 5.1.7 双荧光素酶报告基因试验 |
| 5.1.8 启动子活性研究 |
| 5.1.9 细胞跨膜电阻测定 |
| 5.1.10 细胞荧光素钠透过试验 |
| 5.1.11 试验动物 |
| 5.1.12 动物分组与试验设计 |
| 5.1.13 HE染色切片观察 |
| 5.1.14 免疫组织化学 |
| 5.1.15 组织荧光素钠透过试验 |
| 5.1.16 qRT-PCR检测相关基因的mRNA表达 |
| 5.1.17 数据处理 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 qRT-PCR筛选PGC-1α激活剂 |
| 5.2.2 双荧光素酶报告基因试验筛选直接激活PGC-1α的小分子化合物 |
| 5.2.3 小分子化合物作用的核心启动子区域的确定 |
| 5.2.4 3-131在T-2 毒素和LPS毒性引起的体内外Na F含量升高中的作用 |
| 5.2.5 3-131 在T-2 毒素和LPS毒性引起的细胞紧密性降低中的作用 |
| 5.2.6 3-131 在T-2 毒素和LPS毒性引起的脑组织损伤中的作用 |
| 5.3 讨论 |
| 6 全文总结 |
| 6.1 本研究的主要结果 |
| 6.2 本研究的创新点 |
| 6.3 本研究的不足之处与进一步工作计划 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 论文一 补正续骨丸治疗激素性股骨头坏死的临床疗效观察研究 |
| 材料与方法 |
| 试验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 基于网络药理学探讨补正续骨丸治疗激素性股骨头坏死的分子机制研究 |
| 材料与方法 |
| 结果与分析 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三部分 基于TLR4/MyD88/NF-κB信号通路的补正续骨丸干预激素性股骨头坏死大鼠疗效机制研究 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述一 中药治疗股骨头坏死的临床应用现状研究 |
| 参考文献 |
| 综述二 非创伤性股骨头坏死信号通路研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 在学期间科研成绩 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 综述一 重楼的药效成分、药理作用和不良反应研究现状 |
| 1 药效成分 |
| 2 药理作用 |
| 3 不良反应研究现状 |
| 4 总结与讨论 |
| 参考文献 |
| 综述二 中药药源性肝损伤机制研究进展 |
| 1 CYP代谢 |
| 2 线粒体稳态 |
| 3 氧化损伤 |
| 4 细胞凋亡 |
| 5 胆汁淤积 |
| 6 Ca~(2+)浓度平衡破坏 |
| 7 免疫激活介导的炎症因子释放 |
| 8 特异反应 |
| 9 总结与讨论 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 技术路线图 |
| 第一章 重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的体内外毒性评价 |
| 第一节 重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的细胞毒性实验 |
| 1 概述 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 第二节 模式生物-斑马鱼评价重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的毒性 |
| 1 概述 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 第三节 重楼皂苷Ⅰ的小鼠毒性实验研究 |
| 1 概述 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 第四节 小结与讨论 |
| 1 重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的细胞毒性实验 |
| 2 模式生物-斑马鱼评价重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的毒性 |
| 3 重楼皂苷Ⅰ的小鼠毒性实验研究 |
| 本章总结与讨论 |
| 第二章 重楼皂苷Ⅰ的细胞毒性机制研究 |
| 第一节 肝细胞毒性机制研究 |
| 1 概述 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 第二节 心血管细胞毒性机制研究 |
| 1 概述 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 第三节 小结与讨论 |
| 1 肝细胞毒性机制研究 |
| 2 心血管毒性机制研究 |
| 本章总结 |
| 第三章 基于蛋白组学和代谢组学探索重楼皂苷Ⅰ的体内肝毒性机制 |
| 第一节 TMT标记定量蛋白质组学 |
| 1 概述 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 5 生物信息分析 |
| 6 机制分析 |
| 7 PPI网络 |
| 8 潜在生物标志物 |
| 第二节 Q300靶向代谢组学 |
| 1 概述 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 5 通路富集 |
| 6 通路分析 |
| 7 潜在生物标志物 |
| 第三节 小结与讨论 |
| 1 TMT标记定量蛋白质组学 |
| 2 Q300靶向代谢组学 |
| 3 蛋白组学-代谢组学关联分析 |
| 第四节 重楼皂苷Ⅰ肝毒性机制验证 |
| 1 动物组织Western blot验证 |
| 2 斑马鱼qPCR实验验证 |
| 3 小结与讨论 |
| 结语 |
| 1 重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的体内外毒性评价 |
| 2 重楼皂苷Ⅰ的细胞毒性机制研究 |
| 3 重楼卓苷Ⅰ的蛋白组学和代谢组学研究 |
| 4 重楼皂苷Ⅰ肝毒性机制推测与分析 |
| 5 不足与展望 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 论文一 心肌缺血再灌注损伤模型建立与益气搜风中药对模型大鼠内皮功能影响 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 论文二 益气搜风中药对心肌缺血再灌注损伤模型大鼠血管内皮炎症因子的影响 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 论文三 益气搜风中药对心肌缺血再灌注损伤模型大鼠血管内皮细胞凋亡的影响 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述一 现代医学对心肌缺血再灌注损伤认识与研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 中医学对心肌缺血再灌注损伤的认识与研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 在学期间科研成绩 |
| 致谢 |
| 提要 |
| Abstract |
| 缩写词表 |
| 引言 |
| 第一章 不同病因的ONFH患者股骨头样本相关指标蛋白表达情况的检测与比较 |
| 1 研究目的 |
| 2 临床资料 |
| 2.1 病例收集 |
| 2.2 诊断标准 |
| 2.3 纳入标准 |
| 2.4 排除标准 |
| 2.5 病因判断标准 |
| 2.5.1 激素性股骨头坏死 |
| 2.5.2 酒精性股骨头坏死 |
| 2.5.3 特发性股骨头坏死 |
| 3 实验材料 |
| 3.1 实验样本 |
| 3.2 主要仪器 |
| 3.3 主要器械 |
| 3.4 主要试剂 |
| 4 实验方法 |
| 4.1 手术方式 |
| 4.2 股骨头样本的收集 |
| 4.3 股骨头样本的分组 |
| 4.4 Western blotting分析 |
| 4.5 统计学分析 |
| 5 实验结果 |
| 5.1 一般情况 |
| 5.1.1 患者一般情况 |
| 5.1.2 各组代表患者一般情况 |
| 5.2 各组股骨头样本一般情况 |
| 5.3 Western blotting分析 |
| 6 讨论 |
| 6.1 造成股骨头坏死的病因 |
| 6.2 股骨头坏死治疗方案 |
| 6.2.1 非手术治疗 |
| 6.2.2 手术治疗 |
| 6.3 不同病因ONFH发病机制的异同 |
| 7 结论 |
| 第二章 补肾活血胶囊基于Hedgehog信号通路对GC相关ONFH大鼠骨破坏的修复与血管再生的研究 |
| 1 研究目的 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 主要仪器 |
| 2.3 主要器械 |
| 2.4 主要药物/试剂 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 补肾活血胶囊灌胃剂的制备 |
| 3.1.1 补肾活血胶囊组成与制备条件 |
| 3.1.2 补肾活血胶囊质量控制 |
| 3.1.3 补肾活血胶囊灌胃药液制备 |
| 3.2 动物分组方法与干预措施 |
| 3.3 病理学检测 |
| 3.3.1 股骨头组织的获取 |
| 3.3.2 HE染色 |
| 3.3.3 免疫组织化学分析 |
| 3.4 荧光定量PCR检测 |
| 3.5 Western blotting分析 |
| 3.6 统计学分析 |
| 4 实验结果 |
| 4.1 一般情况 |
| 4.2 补肾活血胶囊可有效促进GC相关ONFH大鼠骨破坏的修复 |
| 4.2.1 股骨头样本大体观 |
| 4.2.2 HE染色分析 |
| 4.2.3 免疫组化学分析 |
| 4.2.4 荧光定量PCR检测 |
| 4.2.5 Western blotting分析 |
| 4.3 补肾活血胶囊可有效促进GC相关ONFH大鼠血管的再生 |
| 4.3.1 免疫组化学分析 |
| 4.3.2 荧光定量PCR检测 |
| 4.3.3 Western blotting分析 |
| 4.4 补肾活血胶囊可显着活化GC相关ONFH大鼠的Hedgehog信号通路 |
| 4.4.1 荧光定量PCR检测 |
| 4.4.2 Western blotting分析 |
| 5 讨论 |
| 5.1 激素性股骨头坏死动物模型的建立 |
| 5.1.1 模型动物的选择 |
| 5.1.2 模型的建立方法 |
| 5.1.3 动物模型的评价 |
| 5.2 中医对股骨头坏死的认识 |
| 5.3 补肾活血胶囊防治股骨头坏死的中医药基础与现代药理学探究 |
| 5.4 补肾活血胶囊对GC相关ONFH大鼠股骨头内骨破坏与血管损伤修复的促进作用 |
| 5.5 补肾活血胶囊对GC相关ONFH大鼠股骨头内Hedgehog信号通路的影响 |
| 6 小结 |
| 第三章 补肾活血胶囊含药血清通过Hedgehog信号通路调控BMSCs成骨成血管研究 |
| 1 研究目的 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 主要仪器 |
| 2.3 主要器械 |
| 2.4 主要药物/试剂 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 补肾活血胶囊含药血清的制备 |
| 3.1.1 制备补肾活血胶囊含药血清的材料 |
| 3.1.2 不同组别SD大鼠含药血清灌胃方法 |
| 3.1.3 SD大鼠补肾活血胶囊含药血清的获取 |
| 3.2 试剂的配制 |
| 3.2.1 细胞胎牛血清培养液 |
| 3.2.2 地塞米松磷酸钠配制液 |
| 3.2.3 细胞处理培养液 |
| 3.2.4 成骨诱导分化培养基 |
| 3.2.5 成脂诱导分化培养基 |
| 3.2.6 成软骨诱导分化培养基 |
| 3.3 原代BMSCs的提取与培养 |
| 3.4 原代BMSCs的鉴定 |
| 3.5 不同组别的培养与药物干预 |
| 3.6 细胞计数 |
| 3.7 BMSCs增殖检测 |
| 3.8 BMSCs成骨诱导后茜素红染色 |
| 3.9 BMSCs成脂诱导后油红O染色 |
| 3.10 BMSCs成软骨诱导行阿利辛染色 |
| 3.11 BMSCs划痕实验 |
| 3.12 RAOECs血管生成实验 |
| 3.13 RAOECs Transwell迁移实验 |
| 3.14 荧光定量PCR检测 |
| 3.15 Western blotting分析 |
| 3.16 统计学分析 |
| 4 实验结果 |
| 4.1 含药血清基本情况 |
| 4.2 SD大鼠BMSCs鉴定 |
| 4.2.1 原代细胞形态学观察情况 |
| 4.2.2 流式细胞术鉴定 |
| 4.2.3 三系诱导分化 |
| 4.3 BMSCs增殖检测 |
| 4.4 补肾活血胶囊含药血清对诱导BMSCs成骨分化的影响 |
| 4.5 BMSCs划痕实验 |
| 4.6 RAOECs血管生成实验 |
| 4.7 RAOECs Transwell迁移实验 |
| 4.8 荧光定量PCR检测 |
| 4.9 Western blotting分析 |
| 5 讨论 |
| 5.1 含药血清的制备 |
| 5.1.1 中药含药血清研究方法发展的基本情况 |
| 5.1.2 制作含药血清实验动物的选择 |
| 5.1.3 给药剂量与方案 |
| 5.1.4 血清的采集、灭活与保存 |
| 5.2 SD大鼠原代BMSCs的提取、培养与鉴定 |
| 5.3 补肾活血胶囊含药血清对BMSCs生长增殖与成骨-成血管方面的干预作用 |
| 5.4 补肾活血胶囊含药血清对BMSCs中 Hedgehog信号通路的影响 |
| 6 小结 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 综述 干细胞疗法在股骨头坏死治疗中的应用进展 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 科技查新 |
| 博士期间参与科研课题情况 |
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 引言 |
| 第一章 肿节风总黄酮对人白血病细胞活性的影响 |
| 1 实验材料和仪器 |
| 1.1 细胞株 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 主要试剂配制 |
| 2.2 细胞培养 |
| 2.3 K562细胞生长曲线的绘制 |
| 2.4 化学发光法检测肿节风总黄酮对K562细胞活力的影响 |
| 2.5 AO-EB染色法检测细胞凋亡情况 |
| 2.6 流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 2.7 统计学方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 K562细胞的生长曲线 |
| 3.2 肿节风总黄酮对K562细胞活力的影响 |
| 3.3 肿节风总黄酮对K562细胞形态的影响 |
| 3.4 Annexin V-FITC/PI双染色法检测细胞凋亡情况 |
| 4 分析与讨论 |
| 5 小结 |
| 第二章 肿节风总黄酮抑制K562细胞的转录组学研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验试剂 |
| 1.2 实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 主要试剂配制 |
| 2.2 实验分组 |
| 2.3 转录组测序 |
| 2.4 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 样品总RNA质量评估 |
| 3.2 测序数据质量评估 |
| 3.3 样本相关性分析 |
| 3.4 基因的差异表达分析 |
| 3.5 部分DEGs层次聚类分析 |
| 3.6 GO富集分析 |
| 3.7 KEGG富集分析 |
| 3.8 差异基因蛋白互作网络分析 |
| 3.9 关键基因及通路的WB验证结果 |
| 4 分析与讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 肿节风总黄酮抑制K562细胞的代谢组学分析 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验细胞 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 细胞培养及分组 |
| 2.2 细胞样品制备及代谢物提取 |
| 2.3 色谱与质谱条件 |
| 2.4 方法学验证 |
| 2.5 数据预处理 |
| 2.6 OPLS-DA多元统计分析 |
| 2.7 差异代谢物的筛选 |
| 2.8 差异代谢物的代谢通路富集分析 |
| 2.9 转录组学和代谢组学数据联合分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 方法学验证结果 |
| 3.2 数据预处理结果 |
| 3.3 OPLS-DA多元统计分析 |
| 3.4 生物标志物的筛选 |
| 3.5 差异代谢物的代谢通路富集分析 |
| 3.6 转录组学与代谢组学联合分析结果 |
| 4 分析与讨论 |
| 5 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 基于信号通路分析中药抑制白血病的作用机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
