薛新梅[1]（2020）在《新疆和静县羊棘球蚴病流行状况及其疫苗免疫效果评价》文中研究指明在新疆,棘球蚴病（包虫病）是一种已知,具有潜在风险的人畜共患寄生虫病,对当地畜牧业的健康发展和公共卫生造成了严重的经济损失。目前羊的棘球蚴病免疫,已经纳入重大动物疫病强制免疫,成为棘球蚴病重要的防控措施之一。为了给当地羊棘球蚴病的防控工作提供有效的数据支持,本研究于2018年9月至2019年12月通过血清学、病原学鉴定、分子生物学鉴定等方法对新疆和静县羊棘球蚴病流行状况进行了调查,与此同时对强制免疫的羊棘球蚴（包虫）病基因工程亚单位疫苗进行免疫效果评价,为包虫病防控工作开展奠定了基础。论文的主要内容如下:1.新疆和静县绵羊细粒棘球蚴病血清学流行病学调查为了解和静县农区和牧区绵羊细粒棘球蚴病的感染和流行情况,本研究采集了和静县农区的5个乡镇和牧区的7个乡镇,共540份绵羊全血及90份新鲜犬粪,通过ELISA检测的方法调查了和静县绵羊细粒棘球蚴病和牧羊犬细粒棘球绦虫的感染和流行情况,并对农区乡镇和牧区乡镇感染和流行情况进行比较分析。检测结果显示:和静县绵羊细粒棘球蚴平均感染率为27.2%（147/540）,其中农区5个乡镇的感染率15.5%（35/225）,牧区7个乡镇的感染率35.5%（112/315）;和静县牧羊犬细粒棘球绦虫的感染率为15.5%,其中农区5个乡镇感染率6.6%,牧区7个乡镇的感染率24.4%,以巴音布鲁克草原上的3个乡镇的牧羊犬细粒棘球绦虫感染率较高,为37.7%～42.2%。2.新疆和静县绵羊细粒棘球蚴流行株基因分型研究为了解新疆和静县绵羊细粒棘球蚴病的感染情况及流行株基因分型,我们对和静县屠宰场的1115只1岁以上绵羊细粒棘球蚴病的感染情况进行调查和统计,并利用PCR技术对包囊病灶进行了基因分型鉴定。病原学结果统计:有225只绵羊脏器表面发现棘球蚴包囊,感染率为20.1%,其中来自农区乡镇的感染率为6.6%,来自牧区的感染率为25.8%。寄生部位结果统计:肝脏的感染率为15.1%（169/1115）,肺脏的感染率为5%（56/1115）,肝脏和肺脏同时感染的占1.5%（17/1115）。通过线粒体细胞色素氧化酶基因1（mt CO1）特异性引物对剖检的感染病料进行PCR扩增、克隆、测序和NCBI中的Blast比对,发现新疆和静县绵羊细粒棘球蚴流行株基因型以G1型为主。3.羊棘球蚴（包虫）病基因工程亚单位疫苗免疫效果评价为了解羊棘球蚴（包虫）病基因工程亚单位疫苗的免疫效果,本研究对新疆巴州和静县某种羊场的试验组和对照组（不免）的90只绵羊用羊包虫抗体试剂盒在首免后第28 d、一免后第42 d（二免后第14 d）、一免后280 d进行检测,同时随机抽取对照组和试验组的30只绵羊进行免疫效果剖检。试验结果显示:试验组90只绵羊一免第28 d用羊包虫抗体ELISA检测,阳性率为84.4%;一免后第42d（二免后第14 d）用羊包虫抗体ELISA检测,阳性率为97.7%;首免后第280 d用羊包虫抗体ELISA检测,阳性率为94.4%;对照组90只绵羊第28 d用羊包虫抗体ELISA检测,感染率为1.1%;第42 d用羊包虫抗体ELISA检测,感染率为3.3%,第280 d用羊包虫抗体ELISA检测,感染率为34.4%;病原学检测结果显示:一免后第280 d对随机抽取试验组和对照组的30只绵羊进行免疫保护效果的剖解检查,发现试验组有1只羊的的脏器有棘球蚴包囊感染率为3.3%;对照组有10只羊的的脏器有棘球蚴包囊,感染率为33.3%。综上所述,绵羊细粒棘球蚴病在和静县羊群中存在着感染,且牧区乡镇的感染率远高于农区;羊棘球蚴（包虫）病基因工程亚单位疫苗在免疫羊中产生了较高的血清抗体,且时效较长,能够有效保护绵羊免受虫卵的感染。本研究为和静县今后绵羊细粒棘球蚴病的防控工作提供了科学依据。
王炜烨[2]（2020）在《细粒棘球绦虫TSP8、TSP11基因的原核表达及免疫学初步分析》文中认为目的:细粒棘球绦虫（Echinococcus granulosus,E.g）作为包虫病（hydatidosis）的主要病原体,给我国及世界各国造成了不计其数的危害,给人民群众造成了巨大的生命威胁。自了解包虫病以来,各国均采取积极手段研究对其的防治,因此包虫病的免疫预防就成为了当前研究的热点。基于此,研制针对宿主的包虫病长效保护疫苗,将对我国包虫病的防治起到促进作用。而截至目前,四跨膜蛋白（Tetraspanin,TSP）在广泛的细胞活动过程中起到重要作用,并已发现可对寄生虫宿主免疫互作及逃避起到积极作用,已经被发现可作为多种寄生虫宿主疫苗的候选蛋白。本研究将首次对E.g四跨膜蛋白TSP8、TSP11基因进行扩增及原核表达,并对其重组蛋白免疫小鼠体内的细胞因子及抗体水平进行检测,为研究四跨膜蛋白作为细粒棘球绦虫候选疫苗抗原奠定基础。方法:（1）细粒棘球绦虫四跨膜蛋白TSP8、TSP11全长基因的克隆及序列分析根据NCBI GeneBank中细粒棘球绦虫四跨膜蛋白TSP8、TSP11的全长基因,分别对其设计特异性引物,以细粒棘球绦虫的原头蚴cDNA为PCR模板进行扩增,并将PCR产物克隆至pMD19-T载体,送至测序,通过生物信息学软件分析预测TSP8、TSP11全长基因的结构与功能,并通过SYBR GreenⅠqRT-PCR方法分析TSP8、TSP11基因在E.g原头蚴以及成虫mRNA相对转录情况。（2）细粒棘球绦虫四跨膜蛋白TSP8、TSP11主要抗原基因的克隆及原核表达为成功编码表达细粒棘球绦虫四跨膜蛋白TSP8、TSP11基因,针对其主要抗原区域序列进行了特异性引物设计,对主要抗原区域片段进行克隆并测序。在测序正确的基础上,将目的片段与表达质粒pET-32a分别进行酶切与连接以及转化,建立pET-32a-TSP重组表达载体,并使用亲和层析柱法对其进行纯化、SDS-PAGE电泳对其进行鉴定及检测、Western blot免疫印迹法对其抗原性进行检测、以及通过免疫定位分析TSP8、TSP11蛋白在虫体的具体定位。（3）细粒棘球绦虫四跨膜蛋白TSP8、TSP11免疫学特性分析试验分为4组,重组蛋白TSP8、TSP11组与PBS、佐剂对照组,每组共15只小鼠,分别对试验组进行免疫,以每只小鼠500μg蛋白含量与弗氏佐剂进行等体积混合免疫,每隔15天免疫一次,共免疫4次。第一次免疫为弗氏完全佐剂混合免疫,其余为弗氏不完全佐剂混合免疫。每次免疫后,各组取三只小鼠尾部采血并收集血清,以q-PCR方法测定Th1型（IFN-γ、TNF-β）、Th2型（IL-4、IL-5、IL-6、IL-10）两类免疫反应共6种细胞因子随免疫时间的变化、以及采用ELISA法测定其抗体水平的变化。结果:1、成功克隆到细粒棘球绦虫TSP8基因全长序列,TSP8基因共含有669个核苷酸,编码蛋白含222个氨基酸,相对分子质量为24 KDa。预测TSP8基因共含有2个潜在的N端糖基化位点,包含2个蛋白激酶磷酸化位点。编码TSP8基因的氨基酸序列共含有5个跨膜区域,推测含有4个优势B抗原表位,且qRT-PCR结果显示TSP8基因在E.g原头蚴及成虫阶段均有表达,但在成虫阶段的表达水平较高,具有统计学差异（p<0.05）。2、经克隆获得TSP11全长基因,TSP基因全长765个核苷酸,编码蛋白含254个氨基酸,相对分子质量为29.02KDa,预测其含有3个潜在的N端糖基化位点、5个蛋白激酶磷酸化位点以及1个酪氨酸激酶磷酸化位点。编码TSP11基因的氨基酸序列共含有3个跨膜区域,推测含有7个优势B抗原表位。qRT-PCR显示其在E.g原头蚴及成虫阶段均有表达,无统计学显着差异（P>0.05）。3、重组蛋白Eg-TSP8、Eg-TSP11在免疫小鼠2周时,就可在小鼠血清中检测出特异性IgG抗体,并发现在随后的加强免疫中,血清中的特异性IgG抗体水平逐次升高,表明该重组蛋白能诱导小鼠体内产生特异性的抗体,具有比较好的免疫原性。重组蛋白Eg-TSP8在首免2周后,检测到脾组织中IL-5、IL-10相对于佐剂组与PBS组有较高水平表达（P<0.01）。而重组蛋白Eg-TSP11在第三次加强免疫后,能在脾组织中检测到细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-10水平,均比佐剂组与PBS有显着高水平表达（P<0.01）。可见,重组蛋白Eg-TSP11诱导小鼠产生了Th1/Th2免疫反应,而重组蛋白Eg-TSP8主要偏向于Th2免疫反应。结论:重组蛋白Eg-TSP8、Eg-TSP11均具有免疫原性,但Eg-TSP11蛋白相较于Eg-TSP8蛋白能刺激小鼠产生Th1型免疫应答,具有成为包虫病候选疫苗抗原的潜力。
王云菲[3]（2020）在《细粒棘球绦虫TSP14以及TSP33基因的克隆、原核表达以及免疫原性初步研究》文中研究指明包虫病是由中绦期细粒棘球绦虫引起的,该病在全球范围内均有分布,我国是该病高发的国家和地区之一。该病危害性大,患者10年病死率高达94%。防控措施以吡喹酮犬犬投药月月驱虫为主,尽管有效,但是在基层难以长期坚持,而且流浪狗难以管理;针对中间宿主的EG95疫苗对移行期内的病原防控有效,但是终末宿主与中间宿主数量比达到45:1,防控成本很高;因此,建立针对终末宿主有效的免疫预防方法是防控该病的一致研究方向。国内外研究表明,四跨膜蛋白家族（TSP）在寄生虫的研究中具有很好的免疫原价值,因此,本试验针对Eg-TSP14和Eg-TSP33进行了克隆、原核表达以及免疫原性初步研究,以期为Eg-TSP14和Eg-TSP33是否具有作为疫苗候选抗原的潜力提供理论基础。目的:克隆Eg-TSP14以及Eg-TSP33基因,并构建重组pET-32a-TSP14以及pET-32a-TSP33质粒,转化至大肠杆菌中进行原核表达,并将重组蛋白免疫小鼠对其免疫原性进行初步研究。方法:（1）以细粒棘球绦虫成虫、原头蚴和包囊壁的cDNA为模板,利用荧光定量PCR技术进行扩增,分析两个基因在虫体不同发育阶段的差异表达情况。（2）克隆Eg-TSP14以及Eg-TSP33基因,构建表达重组载体pET-32a-TSP14以及pET-32a-TSP33。构建成功的载体转化至大肠杆菌感受态细胞BL21中,加入IPTG进行诱导表达,将表达后的蛋白用Ni柱进行纯化并定量。（3）纯化后的蛋白进行Western Blot,验证其反应原性。（4）将重组蛋白免疫小鼠,收集小鼠脾脏和血清,荧光定量PCR测定细胞因子变化和间接ELISA法测定抗体变化。结果:（1）荧光定量PCR结果显示,Eg-TSP14在包囊壁以及原头蚴中有表达,在包囊壁中的表达量高于原头蚴中的表达量。Eg-TSP33基因在成虫、包囊壁、原头蚴中均有表达,在包囊壁中TSP33基因表达量高于原头蚴阶段和成虫阶段。（2）克隆后的Eg-TSP14大小为270bp,Eg-TSP33为420bp,构建好的重组载体经过双酶切鉴定后,进行IPTG诱导表达并进行SDS-PAGE,重组蛋白rEg-TSP14大小27kDa,重组蛋白rEg-TSP33大小为32kDa,与预期结果大小一致,表达形式分析结果显示两者均在沉淀中以包涵体的形式表达,纯化后的重组蛋白rEg-TSP14浓度为1.4mg/mL,重组蛋白rEg-TSP33浓度为1.7mg/mL。（3）Western blot结果显示,重组蛋白rEg-TSP14以及rEg-TSP33均可与犬阳性血清发生反应,具有良好的反应原性。（4）重组蛋白rEg-TSP14以及rEg-TSP33均可以引起小鼠血清抗体水平升高。（5）细胞因子检测结果显示rEg-TSP14可以引起Th2型细胞因子的变化,与对照组相比差异显着（P<0.05）,rEg-TSP33可引起Th1型细胞因子变化。结论:Eg-TSP14和Eg-TSP33分别能在虫体不同发育阶段表达,可能在虫体发育过程中起重要作用,对其免疫原性研究发现,两个蛋白均能诱导小鼠产生免疫反应。细胞因子监测点结果推测Eg-TSP33可能会增强宿主抗感染能力,有利于在感染早期将病原体清除,而Eg-TSP14则可能在E.g.免疫逃避中发挥作用,有利于E.g.在宿主体内建立感染。
刘新伟[4]（2020）在《泡状棘球蚴和细粒棘球蚴理化分析的实验研究》文中进行了进一步梳理目的:探讨细粒棘球绦虫原头节和泡状棘球绦虫原头节体外培养的理化性质变化规律。方法:1.细粒棘球蚴原头节的采集:从感染囊型包虫病的羊肝脏病灶中提取新鲜的细粒棘球蚴原头节,处理后伊红染色,显微镜下观察原头蚴的活性并进行计数。活力达98%以上的方可进行下一步的培养及测定。2.细粒棘球蚴原头节的分组:将计数后的细粒棘球蚴原头节按照密度分为4组,分别加入装有15ml培养基的培养瓶中,此培养液和泡球蚴培养液为同一批所配制。密度分别为空白组0（个）/15ml,对照组10000（个）/15ml、20000（个）/15ml、30000（个）/15ml。细粒棘球蚴原头节和泡状棘球蚴原头节共用同一空白组。3.泡状棘球蚴原头节的采集:取饲养半年以上的种鼠进行腹腔解剖,从中获取泡球蚴原头节,处理后伊红染色,于显微镜下观察原头蚴的活性并进行计数。活力达98%以上的方可进行下一步的培养和测定。4.泡状棘球蚴原头节的分组:将计数后的泡球蚴原头节按照密度分为4组,依次加入装有15ml培养基的培养瓶中。密度分别为空白组0（个）/15ml,对照组10000（个）/15ml、20000（个）/15ml、30000（个）/15ml。5.测量的方式和时间节点的选择:为保证不改变培养液的理化指标,整个培养测定过程不允许换液。在保证不改变原头节培养密度的前提下,使用移液器对培养液进行吹打,吹打均匀后迅速吸取头节混悬液以供下一步的测量。头节分装后进行首次测量,培养1天、2天、3天、4天、5天后进行后续测量。6.PH、乳酸含量、钙离子含量、葡萄糖的测定:吸取培养液的上清液,转移至干燥的无菌EP管中。应用医疗血气分析仪测量上述指标的数值。7.原头节体内糖原含量的测定:弃去培养液的上清液后,应用糖原试剂检测盒测量原头节体内糖原含量的变化。结果:1.两种原头节体外培养时上清液PH值均呈下降趋势,且密度越大,下降趋势越明显。2.两种原头节上清液乳酸含量、钙离子含量均呈上升趋势,且密度越大,上升趋势越明显。3.两种原头节上清液葡萄糖含量均呈下降趋势,且密度越大,下降趋势越明显。4.两种原头节体内糖原含量均随着原头节的生长而逐渐累积,但后期均呈下降趋势,且密度越大,下降趋势越明显。5.经过统计学分析发现,上述指标的变化在两种原头节组内之间比较时差异有统计学意义（P<0.05）,组间比较时差异无统计学意义（P>0.05）。结论:1.泡状棘球蚴原头节和细粒棘球蚴原头节体外培养时,理化性质的变化规律相似。2.两种原头节代谢过程中均产生以乳酸为代表的酸性物质,并导致外环境PH下降。3.两种原头节生长过程中均会出现钙离子累积。4.两种原头节生长时均以外周葡萄糖为主要营养物质,摄取葡萄糖后头节将其合成糖原以供生长发育所需。
王婵[5]（2020）在《LncRNA028466在细粒棘球绦虫抗原P29诱导小鼠免疫中对脾淋巴细胞因子表达调控的初步研究》文中进行了进一步梳理目的初步探讨长链非编码RNA 028466（lncRNA 028466）在细粒棘球绦虫抗原P29（rP29）诱导小鼠产生免疫过程中对CD4+T淋巴细胞Th1和Th2细胞因子表达的调控作用,为lncRNA在寄生虫调控作用的深入研究积累资料。方法1.纯化和鉴定rP29:用亲和层析法纯化基因工程菌株诱导表达的rP29,用Western Blot鉴定。2.建立rP29小鼠免疫模型并制备各组的淋巴细胞:6-8 w雌性BALB/c小鼠24只,随机分为2组（对照组和免疫组）,每组12只,对照组不做处理,免疫组注射10μg蛋白与等体积弗氏完全佐剂的乳化剂,初次免疫后2 w,相同剂量加强免疫,加强免疫用弗氏不完全佐剂,两次免疫均是腹部皮下3点注射,总剂量100μl/只,第二次免疫后2w,无菌环境制备脾细胞悬液,分离各组淋巴细胞备用。3.验证lncRNA028466在脾淋巴细胞中的相对表达量:（1）实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测lncRNA028466在脾淋巴细胞中的相对表达量。（2）流式细胞术分选脾淋巴细胞亚群CD4+T、CD8+T和B细胞。（3）qRT-PCR检测lncRNA 028466在各淋巴亚群细胞中的相对表达量。4.构建lncRNA028466慢病毒过表达载体干预Naive CD4+T细胞:（1）用293T细胞包装慢病毒获得lncRNA028466慢病毒过表达载体,转染Naive CD4+T细胞,分为过表达组（pCDH-028466组）和对照组（vector组）,通过qRT-PCR检测细胞因子IL-2,IFN-γ,IL-4和IL-10 mRNA表达情况。（2）通过流式细胞术检测细胞因子IL-2,IFN-γ,IL-4和IL-10胞内表达情况。（3）通过ELISA检测细胞因子IL-2,IFN-γ,IL-4和IL-10上清分泌情况。5.合成siRNA028466干预Naive CD4+T细胞:（1）由试剂公司合成siRNA028466干扰片段:siRNA1、siRNA2和siRNA3,分别转染Naive CD4+T细胞,分为干扰组1（siRNA1组）、干扰组2（siRNA2组）、干扰组3（siRNA3组）和阴性对照组（negative组）,通过qRT-PCR验证三个片段的干扰效果。（2）用干扰效果较好的siRNA1转染Naive CD4+T细胞,通过qRT-PCR检测细胞因子IL-2,IFN-γ,IL-4和IL-10 mRNA表达情况。（3）通过流式细胞术检测细胞因子IL-2,IFN-γ,IL-4和IL-10胞内表达情况。（4）通过ELISA检测细胞因子IL-2,IFN-γ,IL-4和IL-10上清分泌情况。结果1.用亲和层析法纯化基因工程菌株诱导表达的rP29蛋白相对分子质量（Mr）约31000。2.验证lncRNA028466在脾淋巴细胞中的相对表达量:（1）qRT-PCR结果显示,lncRNA028466在免疫组淋巴细胞中的相对表达量明显低于对照组（P<0.0001）。（2）流式细胞术分选脾淋巴细胞亚群CD4+T、CD8+T和B细胞所占比例分别为:对照组21.6%、7.1%和56.7%,免疫组26%、8.0%和56.0%。（3）qRT-PCR结果显示,lncRNA028466在免疫组CD4+T淋巴细胞中的相对表达量明显低于对照组（P<0.01）,lncRNA028466在CD8+T和B淋巴细胞中的表达没有统计学意义（P>0.05）。3.构建lncRNA028466慢病毒过表达载体干预Naive CD4+T细胞:（1）qRT-PCR结果显示,pCDH-028466组中IFN-γ和IL-2 mRNA的相对表达低于vector组（P<0.001,P<0.001）,而pCDH-028466组中IL-4和IL-10 mRNA相对表达量高于vector组（均P<0.01）。（2）流式细胞术检测结果显示,pCDH-028466组中IFN-γ和IL-2表达低于vector组（均P<0.05）,而IL-10和IL-4在pCDH-028466组表达高于vector组（均P<0.05）。（3）ELISA结果显示,pCDH-028466组IFN-γ和IL-2水平低于vector组（P<0.01,P<0.0001）,pCDH-028466组IL-4和IL-10水平高于vector组（P<0.001,P<0.05）。4.合成siRNA028466干预Naive CD4+T细胞:（1）qRT-PCR结果显示,干扰片段1（siRNA1）组中lnc RNA028466的相对表达明显低于negative组（P<0.0001）,而干扰片段2（siRNA2）组和干扰片段3（siRNA3）组与negative组比较没有统计学意义（P>0.05）,说明siRNA1干扰效果较好,siRNA2和siRNA3无干扰作用,所以后续实验都采用siRNA1进行干预。（2）qRT-PCR结果显示,siRNA1组中IFN-γ和IL-4 m RNA的相对表达与negative组比较没有统计学意义（P>0.05）,IL-2 m RNA的相对表达量高于negative组（P<0.001）,而IL-10 m RNA相对表达量低于negative组（P<0.001）。（3）流式细胞术结果显示,IFN-γ和IL-2在siRNA1组中的表达高于negative组（均P<0.05,P<0.01）,而IL-4和IL-10在siRNA1组中表达低于negative组（均P<0.05）。（4）ELISA结果显示,IFN-γ和IL-4在siRNA1组和negative组中无显着差异,没有统计学意义（P>0.05）,siRNA1组中IL-2水平高于negative组（P<0.05）,而IL-10水平低于negative组（P<0.0001）。结论lncRNA028466在rP29免疫组CD4+T细胞中显着下调,过表达lncRNA028466可以抑制Th1相关的细胞因子IL-2和IFN-γ的表达,而沉默lnc RNA028466促进Th1细胞因子IL-2的表达,抑制Th2相关的细胞因子IL-10的表达促进Th2相关的细胞因子IL-4和IL-10的表达,因此,lnc RNA028466可能通过调控初始CD4+T细胞Th1和Th2细胞因子的表达参与P29诱导宿主产生免疫保护过程。
吴茂迪[6]（2019）在《细粒棘球绦虫PGK、E2D2基因的特征分析及EgFABP-EgA31、EgTPx-EgTrp蛋白免疫保护效果评价》文中指出细粒棘球绦虫（Echinococcus granulosus）的幼虫（细粒棘球蚴）寄生于人和多种动物的内脏器官所致的一种严重的人畜共患寄生虫病被称为细粒棘球蚴病。该病呈世界性分布,我国是高发地区之一,分布在国内23个省、市、自治区,遍布全国368个县,其中以四川西北部、新疆、青海、西藏牧区发病率最高,给我国畜牧业带来了巨大的经济损失,也给人类带来了许多环境卫生和健康安全问题。本研究扩增出细粒棘球绦虫磷酸甘油酸激酶（Eg-PGK）和泛素结合酶D2（Eg-E2D2）基因,分析其基本特征,为细粒棘球绦虫相关蛋白的研究提供重要的参考数据和资料。同时,还克隆、融合表达出细粒棘球绦虫脂肪酸结合蛋白和A31蛋白（EgFABP-EgA31）以及细粒棘球绦虫硫氧还蛋白过氧化物酶和原肌球蛋白（EgTPx-EgTrp）,免疫犬后评价其免疫保护效果。一、细粒棘球绦虫磷酸甘油酸激酶基因的克隆、表达及特征分析本研究对Eg-PGK进行了克隆和原核表达,结果显示Eg-PGK大小为1248 bp,编码了415个氨基酸。免疫印迹实验显示rEg-PGK具有反应原性。用间接免疫荧光定位方法对Eg-PGK进行定位分析,发现Eg-PGK蛋白主要分布于原头蚴的表皮、顶突沟,成虫的表皮、薄壁组织及虫卵以及可育囊和不育囊上。荧光定量PCR分析发现Eg-PGK在原头蚴阶段与18日龄童虫阶段的表达量无显着差异（p>0.05）。综上所述,Eg-PGK可能对于细粒棘球绦虫的生长发育、表皮修复及抗宿主免疫有重要作用。本研究为今后Eg-PGK的功能研究提供了基础资料。二、细粒棘球绦虫泛素结合酶D2基因的克隆、表达及特征分析本研究对Eg-E2D2进行了克隆和原核表达,结果显示Eg-E2D2大小为444 bp,编码147个氨基酸。免疫印迹实验显示rEg-E2D2具有反应原性。用间接免疫荧光定位方法对Eg-E2D2基因进行定位分析,发现Eg-E2D2蛋白分布于原头蚴的表皮、顶突沟上以及成虫虫体的薄壁组织,可育囊和不育囊上也有分布。荧光定量PCR分析发现Eg-E2D2在原头蚴阶段与18日龄童虫阶段的表达量无显着差异（p>0.05）。综上所述,Eg-E2D2可能对于细粒棘球绦虫的生长发育有重要作用,对虫体是必不可少的。本研究为今后Eg-E2D2的功能研究提供了基础资料。三、2个融合蛋白（EgFABP-EgA31、EgTPx-EgTrp）对犬的免疫保护效果评价本研究克隆、融合表达出EgFABP-EgA31和EgTPx-EgTrp重组蛋白,免疫犬后攻虫,并进行抗体水平的测定,对比格犬剖检后进行虫体的计数与长宽度测量。剖检后结果显示EgFABP-EgA31组和EgTPx-EgTrp组虫体平均数量均少于对照组（p<0.05）,减虫率分别为67.00%和55.43%,且免疫组的虫体长宽度均小于对照组。抗体水平显示免疫组均有较高的抗体水平,但EgFABP-EgA31组比EgTPx-EgTrp组抗体水平的上升与下降更稳定。EgFABP-EgA31组和EgTPx-EgTrp组对犬都具有一定的保护效果,EgFABP-EgA31组的效果优于EgTPx-EgTrp组。
蔡其刚[7]（2019）在《青南儿童棘球蚴病调查分析及AE免疫学诊断、代谢组学研究》文中研究说明棘球蚴病又称包虫病,是由棘球属绦虫的幼虫-棘球蚴寄生于人及其它动物的肝脏、肺脏等组织器官而引起的一种重要的人畜共患寄生虫病。青海省是全国罕见的棘球蚴病的高发区,流行区域主要分布于玉树藏族自治州和果洛藏族自治州各县。两型棘球蚴病（CE/AE）混合流行,且流行程度高、疫情严重。为了摸清青海南部地区儿童棘球蚴病的流行状况和流行特征、青海田鼠Em感染情况及其病原学特征、探索敏感性和特异性的早期诊断技术,本研究对青海南部地区儿童棘球蚴病的感染状况进行了调查分析研究;对青海省果洛藏族自治州久治县的青海田鼠进行了流行病学调查,并进行了Em青海田鼠株的分离、鉴定;利用分离、鉴定的青海田鼠株Em,表达和纯化了EmAgB3和EmAgB3-GGGS-Em18两个蛋白,并利用纯化的这两个蛋白分别进行了ELISA和胶体金免疫试纸条检测方法的探索;利用分离鉴定的Em青海田鼠株构建了Em沙鼠感染模型,并对构建的Em沙鼠感染模型进行了肝脏、脾脏和血浆代谢组学研究。主要研究结论如下:（1）通过采用影像学和血清学诊断方法,对青海南部地区儿童棘球蚴病感染状况进行了调查分析研究,明确了该区域儿童棘球蚴病的流行分布情况和特征。这对患棘球蚴病儿童采取早期诊断和制定最佳治疗方案,保障患病儿童尽早地正常生长发育具有重要的意义。同时,对于健康的儿童,也可以尽早地进行预防、保健及调理。（2）通过对青海省果洛藏族自治州久治县的青海田鼠进行流行病学调查,从捕获的50只青海田鼠中分离、鉴定得到了11株Em,Em感染率为22%。通过对其进行分子生物学分析,确定了Em青海田鼠分离株为亚洲型,且存在不同核苷酸位点的变异。该研究发现进一步确立了青海田鼠作为Em中间宿主在流行病学上的重要地位,这为在该地区通过控制青海田鼠的数量来降低人感染AE的风险提供了一个重要的思路。（3）通过提取Em青海田鼠分离株的基因组DNA,综合利用分子生物学和免疫学技术,克隆、表达和纯化了EmAgB3蛋白和EmAgB3-GGGS-Em18蛋白,获得了高纯度和高浓度的重组蛋白（EmAgB3蛋白的浓度为1.05 mg/mL,EmAgB3-GGGS-Em18蛋白浓度为0.5 mg/mL）。另外,通过利用3C酶酶切的方式,成功将重组EmAgB3蛋白的GST标签进行了切除。进行了纯化和蛋白复性,使其最大程度地恢复了天然EmAgB3蛋白的空间结构和生物学特性,为进一步对其进行更深入的结构、功能和应用研究奠定了物质基础。（4）通过对重组EmAgB3蛋白和重组EmAgB3-GGGS-Em18蛋白进行ELISA和胶体金试纸条技术的包装,分别建立了ELISA和胶体金免疫试纸条的诊断方法。经特异性、敏感性和符合性试验,均具有非常良好的临床诊断应用价值。（5）通过将分离鉴定的Em青海田鼠分离株进行腹腔接种沙鼠的方式,成功构建了Em沙鼠感染模型,感染率高达100%。这为将来进行更深入的针对Em青海田鼠分离株的生物学研究奠定了种子基础。（6）采集了Em沙鼠模型和正常沙鼠对照的肝脏、脾脏和血浆样本,利用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱分析技术,分别对采集的样本进行了非靶标代谢组学研究,筛选获得了数量众多的差异代谢物。肝脏代谢组学分析显示:在肝脏中检测到10493个代谢物,从中筛选出1509个差异代谢物。其中309个代谢物较正常肝脏代谢物上调,1200个代谢物下调;脾脏代谢组学分析显示:在脾脏中检测到8679个代谢物,从中筛选出1111个差异代谢物。其中586个代谢物较正常脾脏代谢物上调,525个代谢物下调;血浆代谢组学分析显示:在血浆中检测到4085个代谢物,从中筛选出316个差异代谢物。其中200个代谢物较正常血浆代谢物上调,116个代谢物下调。这些代谢组学的数据,为将来开展针对特异性代谢物的研究、筛选药物作用靶点和代谢通路提供了参考。
魏玉环,胡媛,曹建平[8]（2019）在《抗细粒棘球绦虫疫苗的研究进展》文中进行了进一步梳理细粒棘球蚴病是由细粒棘球蚴寄生引起的人兽共患寄生虫病,在全世界范围内流行,严重威胁经济发展和人民健康。犬是细粒棘球绦虫的终末宿主,牛、羊和人是细粒棘球蚴的中间宿主。目前针对棘球蚴病的药物和手术治疗效果尚不理想,疫苗作为预防和控制棘球蚴病传播的重要补充手段,研究尤为重要。本文对抗细粒棘球绦虫疫苗的研究进展进行综述,旨在为高效疫苗的进一步研制提供参考。
朱国强,闫鸿斌,李立,贾万忠[9]（2019）在《棘球蚴(包虫)病疫苗研究进展》文中研究表明棘球蚴病是由棘球属绦虫的幼虫寄生于动物（包括人）体内而引起的一类古老疾病,其中细粒棘球蚴病和多房棘球蚴病严重阻碍着畜牧业的发展和人类身体健康,造成了巨大的经济损失。棘球蚴病的有效防治需要抗棘球蚴药物和疫苗以及其他措施的综合实施。虽然一些抗棘球蚴药物作为疫病防控的重要手段已被应用,但化学药物存在耐药性、药物残留、环境污染等问题,而疫苗因具有安全、无残留、动物无休药期、符合"预防为主,治疗为辅"的方针等优点,如今得到愈来愈广泛地研究和应用,并得到了长足的发展和突破。本文对棘球蚴病不同类型疫苗的研究进展做一综述,旨在对棘球蚴病疫苗的研制和开发有更加全面系统的了解和展望。
齐文静[10]（2018）在《细粒棘球绦虫EgM123重组霍乱毒素B亚单位构建及其免疫特性鉴定》文中研究表明包虫病是由棘球绦虫的幼虫引起的人兽共患疾病,呈世界性分布。中国是包虫病高发区,25个省/自治区有病例报道,其中新疆、甘肃、宁夏、陕西、内蒙古、青海、四川和西藏为包虫病高发区,严重影响我国农牧区的经济发展和群众健康。霍乱毒素B亚单位（CTB）是一种新型的免疫佐剂,通过构建细粒棘球绦虫成虫特异表达基因EgM123与霍乱毒素B亚基融合重组为CTB-EgM123融合蛋白,并在大肠杆菌中表达为亚单位疫苗,通过免疫接种小鼠确定其免疫原性。为了构建表达系统,通过PCR扩增细粒棘球绦虫的EgM 123基因,并将其连接到含有CTB片段的下游构建为CTB-EgM123融合原核表达质粒载体pET28a-CTB-EgM123。在通过IPTG诱导,并用吸附标签-His的亲和柱纯化,通过SDS-PAGE鉴定重组蛋白分子量为35kDa。Western blotting结果显示重组蛋白被抗EgM123血清特异识别。纯化的EgM123和CTB-EgM123蛋白分别用于免疫接种小鼠。在三次接种后,通过ELISA测量针对EgM123的抗体,其滴度为（血清滴度>320,000）,ELISA也被用于测量免疫小鼠血清中的抗体IgG亚类,结果显示,免疫后1周后,IgG1,IgG2a和IgG2b为主要的抗体存在于血清中。然而,在免疫后第6周,IgG2a和IgG2b在小鼠血清中占优势;同时,在小肠组织中可以检测到IgG2a、IgG2b和IgG3抗体的表达。免疫接种后小鼠血浆中的细胞因子用流式细胞的方法测定,结果显示,CTB-EgM123免疫小鼠细胞因子IL-17A,TNF,IL-4,IL-6和IFN-γ表达上调,并且在免疫一周后,这些细胞因子在血浆中的含量高于正常对照小鼠（P<0.05）。仅接种CTB蛋白可以增加血浆中细胞因子IL-17A,IL-6和IFN-γ的水平,提示CTB作为佐剂可明显影响Th1/Th2免疫应答的平衡。然而,与正常对照小鼠中的这些细胞因子相比,EgM123蛋白仅上调细胞因子TNF和IL-6,并下调IL-4（P<0.05）,提示EgM123可在早期接种时诱导Th1应答。免疫6周后,接种CTB-EgM123的小鼠中细胞因子IL-17A和IL-6仍然高于正常对照小鼠血浆中的这些淋巴因子（P<0.05）。然而,接种EgM123的小鼠在免疫6周后诱导血浆中高水平的IL-17A,TNF,IL-6和IFN-γ,与对照组相比,差异显着（P<0.05）,表明EgM123可以诱导Th1和Th2免疫应答。本研究用流式细胞技术分析了免疫小鼠的淋巴细胞群。结果显示,免疫后第1周时,EgM123和CTB-EgM123均降低CD8+T细胞百分比,增加CD4+T细胞百分比（P<0.01）。然而,与正常对照小鼠中的细胞相比,免疫后第6周脾脏B细胞,CD4+T细胞和CD8+T细胞上调（P<0.05）,表明EgM123诱导很强的细胞免疫。本研究结果表明,重组蛋白EgM123和CTB-EgM123可以作为候选疫苗蛋白,CTB-EgM123诱导了很强的Th1和Th2免疫反应,为研发犬抗细粒棘球绦虫疫苗奠定了基础。
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 细粒棘球蚴的概述 |
| 1.2 棘球蚴病的流行状况 |
| 1.3 公共卫生风险 |
| 1.4 诊断 |
| 1.5 细粒棘球蚴疫苗研究进展 |
| 1.6 防控与治疗 |
| 1.7 自然概述 |
| 1.8 展望 |
| 第2章 新疆和静县绵羊细粒棘球蚴病血清学流行病学调查 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 新疆和静县绵羊细粒棘球蚴流行株基因分型研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 羊棘球蚴(包虫)病基因工程亚单位疫苗免疫效果评价 |
| 4.1 材料 |
| 4.2 方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.4 讨论 |
| 第5章 结论 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 细粒棘球蚴病概述 |
| 1.1 病原 |
| 1.2 诊断方法 |
| 2 细粒棘球蚴病疫苗研制研究进展 |
| 2.1 细粒棘球绦虫中间宿主疫苗研究进展 |
| 2.2 细粒棘球绦虫终末宿主疫苗研究进展 |
| 3 四跨膜蛋白的研究进展 |
| 3.1 四跨膜蛋白的功能 |
| 3.2 寄生虫四跨膜蛋白研究进展 |
| 4 细粒棘球绦虫免疫学概述 |
| 4.1 细粒棘球绦虫的免疫逃避机制 |
| 4.2 包虫病中不同Th类型细胞因子的作用 |
| 5 展望 |
| 6 结语 |
| 第二章 试验内容 |
| 试验一 细粒棘球绦虫TSP8、TSP11 基因的克隆及序列测序 |
| 1.材料 |
| 1.1 虫株、质粒和菌株 |
| 1.2 主要试剂及材料 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 2.试验方法 |
| 2.1 引物设计及合成 |
| 2.2 原头蚴总RNA的提取 |
| 2.3 反转录及目的基因的PCR扩增 |
| 2.4 RCR产物的回收、克隆以及测序 |
| 2.5 TSP基因的生物信息学分析 |
| 3.试验结果 |
| 3.1 总RNA质量检测 |
| 3.2 TSP基因的克隆 |
| 3.3 生物信息学分析 |
| 4.讨论 |
| 试验二 细粒棘球绦虫TSP8、TSP11 基因的原核表达 |
| 1.材料 |
| 1.1 质粒和菌株、血清 |
| 1.2 主要试剂及材料 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 2.试验方法 |
| 2.1 引物设计及合成 |
| 2.2 目的基因的PCR扩增 |
| 2.3 RCR产物的回收、克隆以及测序 |
| 2.4 重组表达载体的构建 |
| 2.5 重组蛋白的表达 |
| 2.6 重组蛋白的可溶性分析 |
| 2.7 SDS-PAGE电泳检测 |
| 2.8 重组蛋白的纯化 |
| 2.9 鼠抗rEg-TSP-IgG的制备 |
| 2.10 免疫印迹分析 |
| 2.11 免疫荧光鉴定 |
| 3.试验结果 |
| 3.1 TSP基因主要抗原区域的扩增 |
| 3.2 重组p ET32a-TSP质粒的鉴定 |
| 3.3 重组蛋白的表达与抗原性分析 |
| 4.讨论 |
| 试验三 重组蛋白免疫学初步分析 |
| 1.材料 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 主要试剂及材料 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 2.方法 |
| 2.1 制备特异性抗血清 |
| 2.2 重组蛋白免疫学初步分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 qPCR法检测TSP免疫小鼠体内细胞因子变化 |
| 3.2 ELISA法检测TSP免疫小鼠体内抗体水平变化 |
| 4.讨论 |
| 第三章 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
| 石河子大学硕士研究生学位论文导师评阅表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 引言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 E.granulosus形态学特点 |
| 2 E.g.生活史 |
| 3 流行病学 |
| 3.1 流行状况 |
| 3.2 流行因素 |
| 4 诊断方法 |
| 4.1 常规诊断方法 |
| 4.2 血清学诊断 |
| 5 细粒棘球蚴病防治策略 |
| 5.1 EG95 |
| 5.2 EgM蛋白家族 |
| 5.3 EgA31 |
| 5.4 Eg14-3-3 蛋白 |
| 6 四跨膜蛋白 |
| 6.1 四跨膜蛋白的生物功能 |
| 6.2 四跨膜蛋白在寄生虫中的研究进展 |
| 第二章 试验部分 |
| 试验一 细粒棘球绦虫TSP14、TSP33 基因的克隆、序列分析及不同发育阶段表达分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 细粒棘球蚴、包囊壁和成虫 |
| 1.2 主要仪器设备 |
| 1.3 主要试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 总RNA提取及反转录 |
| 2.2 引物设计与合成 |
| 2.3 Eg-TSP14 以及Eg-TSP33 基因的扩增 |
| 2.4 基因扩增产物的回收 |
| 2.5 载体的连接 |
| 2.6 连接产物的转化 |
| 2.7 菌液PCR |
| 2.8 Eg-TSP14 以及Eg-TSP33生物信息学分析 |
| 2.9 Eg-TSP14 以及Eg-TSP33实时荧光定量PCR检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 Eg-TSP14 以及Eg-TSP33 基因的克隆 |
| 3.2 Eg-TSP14 以及Eg-TSP33 基因的序列分析 |
| 3.3 Eg-TSP14 以及Eg-TSP33二级结构和三级结构 |
| 3.4 Eg-TSP14 以及Eg-TSP33 结构域分析 |
| 3.5 B细胞表位预测 |
| 3.6 同源序列比对 |
| 3.7 Eg-TSP14 以及Eg-TSP33 RT-PCR检测结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 试验二 细粒棘球绦虫TSP14 以及TSP33 非跨膜区的克隆及原核表达 |
| 1 材料 |
| 1.1 cDNA |
| 1.2 主要仪器设备 |
| 1.3 主要试剂与耗材 |
| 1.4 主要溶液配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 总RNA提取 |
| 2.2 引物设计 |
| 2.3 Eg-TSP14 以及Eg-TSP33 非跨膜区片段的克隆 |
| 2.4 Eg-TSP14 以及Eg-TSP33 非跨膜区片段的原核表达 |
| 3 结果 |
| 3.1 Eg-TSP14 以及Eg-TSP33 非跨膜区片段的扩增 |
| 3.2 重组质粒的构建及双酶切鉴定 |
| 3.3 重组蛋白的诱导表达 |
| 3.4 重组蛋白表达形式分析、纯化及定量 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 试验三 Eg-TSP14及Eg-TSP33 蛋白免疫原性初步探究 |
| 1 材料 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 主要仪器与设备 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 试剂的配方 |
| 2 方法 |
| 2.1 Eg-TSP14及Eg-TSP33 高免血清的制备 |
| 2.2 Western Blotting |
| 2.3 ELISA检测免疫小鼠的血清抗体滴度 |
| 2.4 qPCR测定细胞因子动态变化 |
| 3 结果 |
| 3.1 Western Blot |
| 3.2 间接ELISA检测免疫后小鼠抗体IgG |
| 3.3 免疫后小鼠细胞因子检测 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 全文结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 附件 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略语对照表 |
| 前言 |
| 实验材料与方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 病原材料的采集和来源 |
| 1.2 需要使用的主要仪器设备 |
| 1.3 需要使用的主要试剂和材料 |
| 1.4 试验用试剂的配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 细粒棘球绦虫原头节的收集及处理 |
| 2.2 泡状棘球绦虫原头节的收集及处理 |
| 2.3 两种原头节的分装和培养 |
| 2.4 培养上清液PH、乳酸、葡萄糖、钙离子的测定 |
| 2.5 原头节体内糖原的测定 |
| 3 统计学方法 |
| 结果 |
| 4.1 体外培养时,两种原头节培养上清液PH检测 |
| 4.2 体外培养时,两种原头节培养上清液乳酸浓度检测 |
| 4.3 体外培养时,两种原头节培养上清液钙离子浓度检测 |
| 4.4 体外培养时,两种原头节培养上清液葡萄糖浓度检测 |
| 4.5 体外培养时,两种原头节体内糖原含量检测 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 导师评阅表 |
| 摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 个人简介 |
| 开题、中期及学位论文答辩委员组成 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 细粒棘球绦虫的终末宿主疫苗研究进展 |
| 1 细粒棘球绦虫概述 |
| 2 细粒棘球绦虫的终末宿主疫苗 |
| 2.1 EgA31 重组抗原疫苗 |
| 2.2 EgM重组抗原疫苗 |
| 2.3 EgFABP重组抗原疫苗 |
| 3 展望 |
| 第二章 寄生虫磷酸甘油酸激酶基因(PGK)和泛素结合酶D2(E2D2)基因的研究进展 |
| 1 磷酸甘油酸激酶基因 |
| 1.1 概述 |
| 1.2 寄生虫的磷酸甘油酸激酶基因 |
| 2 泛素结合酶D2基因 |
| 2.1 概述 |
| 2.2 寄生虫的泛素结合酶基因 |
| 3 展望 |
| 第三章 本试验的目的与意义 |
| 第二部分 研究内容 |
| 第一章 细粒棘球绦虫磷酸甘油酸激酶的克隆、表达及特征分析 |
| 1 材料与试剂 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 虫体 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 1.5 常用缓冲溶液和培养基的配制 |
| 1.6 主要生物信息数据库和计算机软件 |
| 2 方法 |
| 2.1 细粒棘球绦虫总RNA的抽提和反转录 |
| 2.2 Eg-PGK基因的扩增 |
| 2.3 PCR产物的回收 |
| 2.4 Eg-PGK基因克隆、鉴定及转化 |
| 2.4.1 Eg-PGK基因克隆测序 |
| 2.4.2 序列比对与生物信息学分析 |
| 2.4.3 质粒提取与回收 |
| 2.4.4 目的片段连接表达载体和酶切鉴定 |
| 2.5 rEg-PGK的原核表达及纯化 |
| 2.5.1 rEg-PGK的表达 |
| 2.5.2 SDS-PAGE电泳检测 |
| 2.5.3 rEg-PGK优化诱导表达条件 |
| 2.5.4 rEg-PGK可溶性分析 |
| 2.5.5 rEg-PGK蛋白纯化 |
| 2.6 rEg-PGK反应原性分析 |
| 2.6.1 兔抗rEg-PGK-IgG的制备 |
| 2.6.2 免疫印迹 |
| 2.7 免疫荧光定位 |
| 2.7.1 兔抗rEg-PGK总 IgG制备 |
| 2.7.2 虫体蜡块的制作 |
| 2.7.3 间接免疫荧光定位 |
| 2.8 相对荧光定量PCR |
| 2.8.1 不同发育阶段虫体组织RNA提取和c DNA合成 |
| 2.8.2 qRT-PCR引物和反应 |
| 3 结果 |
| 3.1 Eg-PGK基因的扩增与生物信息学分析 |
| 3.1.1 Eg-PGK基因的扩增 |
| 3.1.2 Eg-PGK基因的生物信息学分析 |
| 3.2 rEg-PGK的表达与反应原性分析 |
| 3.2.1 IPTG浓度的优化 |
| 3.2.2 诱导时间的优化 |
| 3.2.3 诱导温度的优化 |
| 3.2.4 可溶性分析 |
| 3.2.5 rEg-PGK的原核表达与纯化 |
| 3.2.6 rEg-PGK的反应原性分析 |
| 3.3 Eg-PGK在细粒棘球绦虫各时期的定位 |
| 3.4 PGK在虫体各阶段mRNA表达水平 |
| 4 讨论 |
| 4.1 Eg-PGK的基本特征分析 |
| 4.2 Eg-PGK的反应原性、定位和转录水平 |
| 第二章 细粒棘球绦虫泛素结合酶D2的克隆、表达及特征分析 |
| 1 材料与试剂 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 虫体 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 1.5 常用缓冲溶液和培养基的配制 |
| 1.6 主要生物信息数据库和计算机软件 |
| 2 方法 |
| 2.1 细粒棘球绦虫总RNA的提取与c DNA合成 |
| 2.2 基因的扩增 |
| 2.3 PCR产物的回收 |
| 2.4 Eg-E2D2 基因克隆、鉴定及转化 |
| 2.4.1 Eg-E2D2 基因克隆测序 |
| 2.4.2 序列比对与生物信息学分析 |
| 2.4.3 质粒提取与回收 |
| 2.4.4 目的片段连接表达载体和酶切鉴定 |
| 2.5 rEg-E2D2 的原核表达及纯化 |
| 2.5.1 rEg-E2D2 的表达 |
| 2.5.2 SDS-PAGE电泳检测 |
| 2.5.3 rEg-E2D2 优化诱导表达条件 |
| 2.5.4 rEg-E2D2 可溶性分析 |
| 2.5.5 rEg-E2D2 蛋白纯化 |
| 2.6 rEg-E2D2 反应原性分析 |
| 2.6.1 兔抗rEg-E2D2-IgG的制备 |
| 2.6.2 免疫印迹 |
| 2.7 免疫荧光定位 |
| 2.7.1 兔抗rEg-E2D2总IgG制备 |
| 2.7.2 虫体蜡块的制作 |
| 2.7.3 间接免疫荧光定位 |
| 2.8 相对荧光定量PCR |
| 2.8.1 不同发育阶段虫体组织RNA提取和cDNA合成 |
| 2.8.2 qRT-PCR引物和反应 |
| 3 结果 |
| 3.1 Eg-E2D2 基因的扩增与生物信息学分析 |
| 3.1.1 Eg-E2D2 基因的扩增 |
| 3.1.2 Eg-E2D2 生物信息学分析 |
| 3.2 重组Eg-E2D2 的表达与反应原性分析 |
| 3.2.1 IPTG浓度的优化 |
| 3.2.2 诱导时间的优化 |
| 3.2.3 诱导温度的优化 |
| 3.2.4 可溶性分析 |
| 3.2.5 rEg-E2D2 的原核表达与纯化 |
| 3.2.6 rEg-E2D2 的反应原性分析 |
| 3.3 Eg-E2D2 在细粒棘球绦虫各时期的定位 |
| 3.4 E2D2在虫体各阶段m RNA表达水平 |
| 4 讨论 |
| 4.1 泛素结合酶D2蛋白功能预测分析 |
| 4.2 Eg-E2D2的反应原性、定位和转录水平 |
| 第三章 2个融合蛋白(EgFABP-EgA31、EgTPx-EgTrp)对犬的免疫保护效果评价 |
| 1 材料与试剂 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 虫体 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 1.5 常用缓冲溶液和培养基的配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 细粒棘球绦虫总RNA的提取与c DNA合成 |
| 2.2 基因的扩增 |
| 2.3 PCR产物的回收 |
| 2.4 EgFABP-EgA31、EgTPx-EgTrp基因克隆、鉴定及转化 |
| 2.4.1 Eg-FABP、EgA31、EgTPx、EgTrp基因克隆测序 |
| 2.4.2 序列比对 |
| 2.4.3 质粒提取与回收 |
| 2.4.4 目的片段连接表达载体和酶切鉴定 |
| 2.5 rEgFABP-EgA31、rEgTPx-EgTrp的原核表达及纯化 |
| 2.5.1 rEgFABP-EgA31、rEgTPx-EgTrp的表达 |
| 2.5.2 SDS-PAGE电泳检测 |
| 2.5.3 rEgFABP-EgA31、rEgTPx-EgTrp优化诱导表达条件 |
| 2.5.4 rEgFABP-EgA31、rEgTPx-EgTrp可溶性分析 |
| 2.5.5 rEgFABP-EgA31、rEgTPx-EgTrp蛋白纯化 |
| 2.6 动物免疫保护试验 |
| 2.6.1 试验分组 |
| 2.6.2 rEgFABP-EgA31、rEgTPx-EgTrp疫苗的制备 |
| 2.6.3 免疫程序 |
| 2.6.4 采血及血清处理 |
| 2.6.5 人工感染 |
| 2.6.6 剖检计数 |
| 2.6.7 血清抗体IgG间接ELISA检测 |
| 2.6.8 数据处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 EgFABP-EgA31基因、EgTPx-EgTrp基因的扩增 |
| 3.2 重组EgFABP-EgA31、EgTPx-EgTrp的表达 |
| 3.2.1 IPTG浓度的优化 |
| 3.2.2 诱导时间的优化 |
| 3.2.3 诱导温度的优化 |
| 3.2.4 可溶性分析 |
| 3.3 免疫保护试验 |
| 3.3.1 人工感染结果 |
| 3.3.2 血清抗体IgG间接ELISA检测 |
| 4 讨论 |
| 4.1 细粒棘球绦虫的终末宿主疫苗 |
| 4.2 rEgFABP-EgA31对犬的免疫保护试验 |
| 4.3 rEgTPx-EgTrp对犬的免疫保护试验 |
| 4.4 rEgFABP-EgA31和rEgTPx-EgTrp免疫保护效果的比较 |
| 第三部分 结论与创新点 |
| 1 结论 |
| 2 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
| 一、个人基本情况 |
| 二、教育及工作经历 |
| 三、获奖情况 |
| 四、攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
| 摘要 |
| SUMMARY |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 棘球蚴病简史 |
| 2 病原体及其特征 |
| 2.1 生物学分类地位 |
| 2.2 棘球属绦虫种类及其形态 |
| 2.2.1 细粒棘球绦虫 |
| 2.2.2 多房棘球绦虫 |
| 2.3 棘球绦虫的生活史 |
| 3 棘球蚴病临床症状 |
| 4 棘球蚴病的流行分布情况 |
| 5 泡型棘球蚴病动物模型构建研究进展 |
| 5.1 理想的Em动物模型应具备的特点 |
| 5.2 动物模型建立的方法 |
| 5.2.1 口服虫卵感染 |
| 5.2.2 经皮肝穿刺法 |
| 5.2.3 开腹肝穿刺法 |
| 5.2.4 切开皮肤经腹壁肌层肝穿刺法 |
| 5.2.5 门静脉分支注射法 |
| 5.2.6 腹腔注射法 |
| 5.3 动物模型评价方法 |
| 5.3.1 剖检法 |
| 5.3.2 影像学方法 |
| 5.3.3 免疫学方法 |
| 6 诊断方法研究进展 |
| 6.1 病原学检测 |
| 6.2 影像学诊断 |
| 6.3 血清免疫学诊断 |
| 6.4 DNA检测 |
| 7 分子生物学研究进展 |
| 7.1 基因组特征 |
| 7.2 棘球蚴代谢组学研究进展 |
| 7.3 棘球蚴蛋白质组学研究进展 |
| 8 棘球蚴病疫苗免疫学研究进展 |
| 8.1 基因工程疫苗 |
| 8.2 核酸(DNA)疫苗 |
| 8.3 多肽疫苗 |
| 9 本研究的目的和意义 |
| 第二章 青南地区儿童棘球蚴病感染状况的调查分析研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 调查区域 |
| 1.2 学校调查 |
| 1.3 超声检查 |
| 1.4 血清学检测 |
| 1.4.1 前期准备 |
| 1.4.2 样品检测 |
| 1.4.3 参考范围 |
| 1.4.4 结果判定 |
| 1.5 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 儿童棘球蚴病病例的地理分布情况 |
| 2.2 儿童棘球蚴病病例的性别和年龄分布情况 |
| 2.3 儿童棘球蚴病的地域分布情况 |
| 2.4 AE和 CE病变的超声分类 |
| 3 讨论 |
| 第三章 青海田鼠株多房棘球蚴的分离鉴定及系统进化分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 青海田鼠的捕获 |
| 1.2 捕获青海田鼠解剖及囊液收集 |
| 1.3 包囊HE染色 |
| 1.4 原头蚴分离及镜检 |
| 1.5 PCR分析 |
| 1.6 进化分析 |
| 1.7 Em感染的青海田鼠物种的鉴定 |
| 2 结果 |
| 2.1 样本收集 |
| 2.2 捕获青海田鼠的解剖特征 |
| 2.3 包囊原头蚴HE染色 |
| 2.4 原头蚴分离及镜检 |
| 2.5 PCR分析 |
| 2.6 进化分析 |
| 2.7 Em感染的青海田鼠物种的鉴定 |
| 3 讨论 |
| 第四章 EmAgB3 蛋白及串联EmAgB3-GGGS-Em18 蛋白的克隆表达 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 寄生虫 |
| 1.1.2 质粒及菌种 |
| 1.1.3 试剂与仪器 |
| 1.1.4 扩增用引物 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 EmAgB3及Em18 基因的克隆及序列测定 |
| 1.2.2 EmAgB3和EmAgB3-GGGS-Em18 的基因合成 |
| 1.2.3 载体酶切 |
| 1.2.4 目的片段与载体连接 |
| 1.2.5 转化E.coli DH5α感受态细胞后筛选克隆 |
| 1.2.6 诱导表达融合蛋白 |
| 1.2.7 蛋白的纯化 |
| 1.2.8 纯化蛋白的检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 EmAgB3及Em18 基因的克隆及序列测定 |
| 2.1.1 PCR产物琼脂糖凝胶电泳鉴定 |
| 2.1.2 PCR产物克隆测序鉴定 |
| 2.2 Bam HI-EmAgB3-Xho I及 Nde I-EmAgB3-GGGS-Em18-Xho I基因生物合成 |
| 2.3 重组载体酶切鉴定 |
| 2.4 融合蛋白诱导结果 |
| 2.5 融合蛋白GST/镍琼脂糖亲和层析纯化 |
| 2.6 EmAgB3 融合蛋白酶切后SDS-PAGE检测 |
| 2.7 EmAgB3 融合蛋白酶切后透析 |
| 2.8 蛋白最终Tricine-SDS-PAGE分析 |
| 2.9 目的蛋白Western blot分析 |
| 2.10 蛋白浓度测定 |
| 3 讨论 |
| 第五章 基于EmAgB3和EmAgB3-GGGS-Em18 重组蛋白的AE ELISA诊断方法的建立及应用. |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 抗原 |
| 1.1.2 血清 |
| 1.1.3 试剂 |
| 1.1.4 仪器耗材 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 基本方法 |
| 1.2.2 抗原包被用浓度及阳性血清稀释倍数的筛选 |
| 1.2.3 临界值的确定及判定方法 |
| 1.2.4 特异性检测 |
| 1.2.5 符合性检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 抗原包被用浓度及阳性血清稀释倍数确定 |
| 2.2 临界值的确定 |
| 2.3 特异性交叉检测 |
| 2.4 符合性检测 |
| 3 讨论 |
| 第六章 基于重组蛋白EmAgB3和EmAgB3-GGGS-Em18 的棘球蚴病胶体金试纸条诊断方法的建立及应用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 抗原 |
| 1.1.2 血清 |
| 1.1.3 试剂 |
| 1.1.4 仪器耗材 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 所需溶液配制 |
| 1.2.2 材料准备 |
| 1.2.3 胶体金的制备 |
| 1.2.4 胶体金标记二抗(山羊抗人Ig G Fc)及纯化 |
| 1.2.5 金标垫、样品垫处理 |
| 1.2.6 喷金与划膜 |
| 1.2.7 组装与测试 |
| 1.2.8 特异性试验 |
| 1.2.9 敏感性试验 |
| 1.2.10 符合性试验 |
| 2 结果 |
| 2.1 特异性试验 |
| 2.2 敏感性试验 |
| 2.3 符合性试验 |
| 3 讨论 |
| 第七章 Em沙鼠模型的建立及其代谢组学的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验鼠及寄生虫虫株 |
| 1.1.2 样品 |
| 1.1.3 试剂 |
| 1.1.4 仪器耗材 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 Em沙鼠模型的建立 |
| 1.2.2 代谢组学研究用样本采集 |
| 1.2.3 代谢物提取 |
| 1.2.4 上机检测 |
| 1.2.5 数据处理 |
| 1.2.6 数据分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 Em沙鼠模型的建立 |
| 2.2 沙鼠组织UHPLC-QTOF-MS检测 |
| 2.3 质量控制 |
| 2.3.1 过程质控 |
| 2.3.2 数据质控 |
| 2.4 统计分析 |
| 2.4.1 肝脏代谢组学变化 |
| 2.4.2 脾脏代谢组学变化 |
| 2.4.3 血浆代谢组学变化 |
| 3 讨论 |
| 第八章 结论与展望 |
| 1 研究结论 |
| 2 创新点 |
| 3 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
| 攻读博士学位期间参与的科研项目及发表论文 |
| 导师简介 |
| 1 抗细粒棘球绦虫疫苗的种类 |
| 1.1 传统疫苗 |
| 1.2 基因工程疫苗 |
| 1.3 DNA疫苗 |
| 1.4 合成肽疫苗 |
| 2 抗细粒棘球绦虫疫苗的研制阶段 |
| 2.1 实验室研制阶段的疫苗 |
| 2.2 现场大规模实验的疫苗 |
| 2.3 商品化的疫苗 |
| 3 展望 |
| 1 组织细胞疫苗 |
| 2 合成肽疫苗 |
| 3 基因工程重组疫苗 |
| 3.1 基因工程重组蛋白疫苗 |
| 3.1.1针对中间宿主的疫苗 |
| 3.1.2针对终末宿主的疫苗 |
| 3.2 基因工程重组病毒载体活疫苗 |
| 3.3 基因工程重组细菌载体活疫苗 |
| 4 核酸疫苗 |
| 5 转基因植物疫苗 |
| 6 多价苗和联苗 |
| 7 其他 |
| 8 小结与展望 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 包虫病的研究概况 |
| 1.2 包虫病的检测技术 |
| 1.3 包虫病的免疫机理 |
| 1.4 包虫病的疫苗进展 |
| 1.5 包虫病的治疗 |
| 1.6 霍乱毒素B亚单位的研究进展 |
| 1.7 研究的目的与意义 |
| 第2章 细粒棘球绦虫EgM123重组霍乱毒素B亚单位的构建表达纯化及小鼠抗血清的制备 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 细粒棘球绦虫重组亚单位蛋白CTB-EgM123免疫的免疫原性研究——T淋巴细胞反应 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 细粒棘球绦虫重组亚单位蛋白CTB-EgM123免疫的免疫原性研究—系统免疫和组织免疫 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
