和七一[1]（2019）在《中华按蚊与溴氰菊酯抗性相关ABC转运蛋白基因的鉴定、筛选及功能研究》文中进行了进一步梳理腺苷三磷酸结合盒转运蛋白（ATP—binding cassette transporter）,ABC转运蛋白)是一类广泛存在于古细菌、细菌和真核生物中的膜蛋白。ABC转运蛋白可以参与多种内外源有毒物质的吸收、积累和排泄,在机体组织防御过程中起着重要作用,与动物或昆虫的抗药性密切相关。中华按蚊是疟疾和马来丝虫病的重要传播媒介,广泛分布于东亚及东南亚地区。由于拟除虫菊酯类杀虫剂（尤其是溴氰菊酯）的广泛使用,中华按蚊对该类药物的抗性已日趋严重,成为蚊虫防治的主要障碍。目前,尚无关于中华按蚊ABC转运蛋白基因及其与溴氰菊酯抗性的研究报道。本研究拟通过生物信息学分析方法,对中华按蚊基因组数据库中潜在的ABC转运蛋白基因进行鉴定、并对其命名、结构域、基因结构、scaffold分布和系统发育等进行研究,为进一步研究中华按蚊ABC转运蛋白基因的功能提供重要的信息基础。通过RNA-seq和qPCR对中华按蚊中与溴氰聚酯抗性相关ABC转运蛋白基因进行筛选,采用RNAi、ATPase活性检测以及分子对接对筛选基因进行功能学研究。本文的主要研究内容和结果包括:（1）基于中华按蚊基因组数据,我们在中华按蚊中鉴定出61个ABC转运蛋白基因。根据ABC转运蛋白NBD序列的同源性,将它们分为8个亚家族,并对每个成员进行了系统命名。ABC转运蛋白基因的结构域组成形式多样,包括全分子、不完全分子、半分子以及四分之一的ABC转运蛋白基因。ABCG亚家族含有21个成员,是中华按蚊ABC亚家族中数量最多的一个,占总ABC转运蛋白基因的34%。ABCE亚家族仅含有1个ABC转运蛋白基因,是中华按蚊中数量最少的亚家族。系统进化分析发现,ABCB、ABCD、ABCE、ABCF和ABCH是中华按蚊中进化较为保守的亚家族,各亚家族基因与冈比亚按蚊和黑腹果蝇基因成对应的直系同源关系;ABCA、ABCC和ABCG亚家族基因与冈比亚按蚊ABC转运蛋白基因有明显的直系同源关系,而且ABCC和ABCG亚家族经历了基因复制事件。（2）利用RNA-seq技术,我们对三个野外抗性种群（AH-FR、CQ-FR和YN-FR）和一个实验室敏感品系（WL-LS）的所有ABC转运蛋白基因表达水平进行了分析比较。结果显示,有6个基因（AsABCG28、AsABCA5、AsABCC9、AsABCC11、AsABCG7和AsABCG23）至少在一个抗性种群中存在显着表达差异。其中,AsABCG28是唯一一个在三个种群中均显着上调的基因。qPCR结果显示,溴氰菊酯处理中华按蚊成蚊6 h后,三个ABCB基因（AsABCB1、AsABCB3和AsABCB5）显着上调表达,而AsABCG28基因在处理后12和24 h,均表现为显着上调表达。（3）通过T7试剂盒体外合成AsABCG28同源的特异dsRNA,采用饲喂法导入2日龄中华按蚊幼虫体内。qPCR结果显示,AsABCG28基因的表达量显着降低,AsABCG28基因沉默能显着提高溴氰菊酯引起中华按蚊幼虫的致死率。（4）采用质粒pPICZA构建重组质粒AsABCG28/pPICZA,线性化后电转化毕氏酵母Pichia pastrois GS115,通过Zeocin抗生素筛选得到高拷贝重组子。甲醇诱导表达24 h后收集菌体,通过组织研磨法、超速离心法及镍亲和层析法相结合纯化目标产物,每1 L发酵液可获得0.1 mg重组蛋白AsABCG28,其ATPase活性为25nmol/mg/min。在测定浓度范围内（0-1 mM）,溴氰菊酯对重组蛋白AsABCG28ATPase活性无诱导作用,而溴氰菊酯代谢产物3-苯氧基苯甲酸对ATPase活性具有显着诱导作用,且呈剂量效应关系。分子对接结果显示,3-苯氧基苯甲酸能够很好的结合在AsABCG28的TMD结构域上,结合自由能为-29.4036 kcal/mol;3-苯氧基苯甲酸羟基氧与AsABCG28的Val431形成氢键,键长为2.8?。总之,本研究为了解ABC转运蛋白基因亚家族成员提供了基础信息框架,为更好地了解和深入研究ABC转运蛋白基因在溴氰菊酯抗性中的作用奠定了重要基础。AsABCG28基因与溴氰菊酯抗性密切相关,主要通过转运溴氰菊酯代谢产物3-苯氧基苯甲酸,减少其在体内的积累,从而提高蚊虫对溴氰菊酯的抗性。
张洁蕾[2]（2018）在《HSP70-FTO轴在非酒精性脂肪性肝病中的作用及机制研究》文中研究表明非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD）是遗传-环境-代谢应激相关性疾病,发病机制尚未完全明了。热激蛋白70（heat shock protein,HSP70）在大多数生物中含量最多,在应激反应中最为敏感。肥胖相关基因（fat mass and obesity associated gene,FTO）在NAFLD中表达上调,促进NAFLD的发展。研究发现在热激的情况下,敲低FTO能促进HSP70的合成。本实验旨在观察HSP70-FTO轴在NAFLD发病过程中的作用,期望为NAFLD的防治提供新的思路。本课题通过以下三部分探究了HSP70与FTO之间的关系,及其在NAFLD中的作用及机制。一、HSP70和NAFLD之间的关系目的:探讨HSP70在NAFLD人群血清、NAFLD小鼠肝脏以及棕榈酸（PA）诱导的人肝癌HepG2细胞脂肪变性模型中的表达水平。方法:ELISA检测NAFLD人群血清中HSP70表达水平的变化;用高脂饲料制备NAFLD小鼠动物模型,qPCR、Western blot及免疫组织化学方法检测HSP70的表达及组织学定位;0.5mM PA作用人肝癌HepG2细胞24 h诱导脂肪变性模型,qPCR及Western blot检测HSP70表达水平。结果:NAFLD人群血清中HSP70表达明显增加,且与BMI、腰围、血清ALT之间呈显着正相关;免疫组化及Western结果显示,HSP70在高脂诱导的NAFLD小鼠肝脏中表达上调且入核增多;在HepG2细胞脂肪变性模型中,HSP70mRNA及蛋白水平在PA作用下表达显着增高。结论:HSP70在NAFLD中表达上调,可能与NAFLD的发病过程有密切关系。二、HSP70对NAFLD的作用目的:探讨HSP70在NAFLD中的功能及作用方法:体外实验:慢病毒转染Lenti-HSPA1A及Lenti-Vector过表达HSPA1A,油红O染色判断细胞内脂滴,ELISA检测细胞上清内甘油三酯（TG）及胆固醇（TC）水平,qPCR检测细胞内脂肪合成相关酶FAS、SCD、ACC、SREBP1C、脂肪分解相关酶ACOX、CPT-1、PPARα的mRNA水平;再给予PA刺激24 h后检测上述指标变化;慢病毒转染Si-HSPA1A及Si-Vector干扰HSP70,油红O染色判断细胞内脂滴,ELISA检测细胞上清内甘油三酯（TG）及胆固醇（TC）水平,qPCR检测脂肪合成相关酶FAS、SCD、ACC、SREBP1C、脂肪分解相关酶ACOX、CPT-1、PPARα的mRNA水平;再给予PA刺激24 h,检测上述指标变化。体内实验:正常饮食小鼠分为两组:（1）NFD+AAV-CTL组,（2）NFD+AAV-HSPA1A组;高脂喂养小鼠16周后分为两组:（1）HFD+AAV-shCTL组,（2）HFD+AAV-shHSPA1A/1B组;监测各组小鼠体重,HE及油红O染色判断肝脏脂肪变性。结果:体外实验:与仅稳定表达空慢病毒载体的细胞相比,HSP70过表达略微增加了HepG2细胞中脂滴的数量,在0.5mM PA作用24h后HSP70过表达的细胞中的脂滴数量比仅用慢病毒载体表达的细胞数量明显增加,而对照组的细胞中的脂滴数量明显增加。在细胞中过表达HSPA1A上清液的TG水平略有增加,而在细胞中过表达HSPA1A上清液TC水平显着增加,过表达的慢病毒载体的细胞与对照组相比,变化不大。在PA处理后,细胞过表达HSP70,TC和TG的分泌明显增加。此外,脂肪合成相关酶如FAS,SCD,ACC和SREBP1C以及脂肪分解相关酶如ACOX,CPT-1,和PPARα的mRNA水平用定量PCR进行检测,ACC和SREBP1C的mRNA水平在HSPA1A过表达的细胞中表达显着增加,无论是否用PA进行处理细胞,PPARα在HSPA1A过表达细胞用PA进行处理时表达下降。当HSP70被敲低时,与对照组与空白转染组细胞相比,HSP70敲减后HepG2细胞中的脂滴数量没有显着差异。在PA处理后,HSP70敲减细胞显示的脂质小滴比对照组与空载组细胞的脂滴少。在siHSPA1A转染细胞与对照组细胞相比,在HepG2细胞培养上清的TG和TC水平明显降低,无论是否用PA进行处理。我们对与脂肪合成有关的酶FAS、SCD、ACC、SREBP1C以及与脂质分解相关酶ACOX、CPT-1、PPARα的mRNA水平用定量PCR进行检测。FAS,SCD与ACC在低表达HSPA1A细胞中显着降低。同时也发现在PA处理后,FAS,SCD,ACC和SREBP1C的mRNA水平在敲减HSPA1A细胞中依然很低,另外CPT-1在PA处理后表达增高。体内实验:正常组的小鼠肝脏HE及油红O染色切片无明显病理变化,过表达HSPA1A组的肝脏切片也基本无明显变化。小鼠给予高脂饲料喂养16周,行鼠尾静脉注射AAV介导的同时干扰HSPA1A/B载体,在3周后病毒达到作用高峰,取肝脏组织,行HE染色发现高脂+AAV-shCTL组小鼠肝脏组织内内出现大量脂肪变性,尤其是汇管区域有炎症细胞浸润伴有部分点状肝细胞坏死;在高脂+AAV-shHSPA1A/B组的小鼠肝脏组织内脂肪变性程度有所减轻,炎症细胞浸润及肝细胞坏死程度也有所减轻。与此同时油红O染色发现:高脂+AAV-shCTL组小鼠肝脏组织内内出现大量脂滴弥散分布于整个肝脏,脂滴形状较大,数量多满视野;在高脂+AAV-shHSPA1A/B组的小鼠肝脏组织内脂滴数量有所减少,脂滴形状有所减小,以汇管区减少较为明显,说明肝脏组织脂肪变性程度有所减轻。而各组小鼠体重在病毒注射前后变化不明显。结论:HSP70促进脂质合成增加进而促进NAFLD的发病过程,敲低HSP70使NAFLD的脂肪变性程度减轻。说明HSP70在NAFLD发病的过程中发挥重要作用。三、探讨HSP70-FTO轴在NAFLD中的作用及机制研究目的:探讨HSP70-FTO轴在NAFLD中的作用及机制研究方法:通过Western blot,共聚焦及等方法观察HSP70对FTO的调控和共定位关系以及通过GST-pull down的方法进一步验证HSP70和FTO之间的关系。通过慢病毒转染Lenti-FTO及Lenti-Vector过表达FTO,以及通过慢病毒转染si-FTO及si-Vector敲低FTO分别采用油红O染色判断细胞内脂滴,ELISA检测细胞上清内甘油三酯（TG）及胆固醇（TC）水平,qPCR检测细胞内脂肪合成相关酶FAS、SCD、ACC、的mRNA水平;再给予PA刺激24 h,观察其对脂质合成的影响。结果:体内实验:在小鼠肝脏中过表达HSP70促进FTO表达水平增高。体外实验:我们发现过表达HSP70促进FTO表达水平增高,在PA干预24 h后蛋白水平增加。敲低HSP70能够降低FTO表达水平,在PA干预24 h后蛋白水平较干预前增加。共聚焦结果分析表明,HSP70和FTO分布在正常情况下分布在细胞胞浆,在0.5 mM PA作用24h后HSP70和FTO蛋白富集在细胞核中,表明这两种蛋白的活化。当HSP70被敲低后,FTO在细胞质中,当给定0.5mM的PA刺激后,FTO富集在细胞质膜和核膜,除了核。同样在FTO敲低后,HSP70停留在细胞胞浆,但在0.5mM的PA刺激下,HSP70在细胞核中增多。综上,这些结果表明,HSP70促进FTO核转移。GST-pull down显示:GST-FTO,His-HSP70蛋白纯化后,GST-pull down,GST-FTO结合HSP70,而GST蛋白不能结合HSP70,以上说明HSP70可以直接结合FTO。而且过表达FTO细胞内脂滴与对照组相比轻微增多,在过表达FTO的基础上再用0.5mM的棕榈酸干预24h细胞内脂滴明显增多。过表达FTO细胞上清内TC、TG含量增多与对照组相比,在过表达FTO的基础上再用0.5mM的棕榈酸干预24h细胞上清内TC、TG含量明显增多。过表达FTO细胞内脂质合成相关酶FAS,SCD及ACC mRNA表达水平增高与对照组相比,在过表达FTO的基础上再用0.5mM的棕榈酸干预24h后,其水平增加不明显。与此相反的是敲低FTO能减少细胞内脂质合成。结论:HSP70能上调NAFLD中FTO的表达。HSP70能直接结合FTO并且HSP70在高脂的作用下促进FTO核内转移。表明HSP70通过调控FTO参与NAFLD的发病过程。HSP70-FTO轴与NAFLD的发病过程密切相关。
徐扬[3]（2010）在《以CLA-1为靶标的微生物来源抗动脉粥样硬化活性化合物的分离纯化、结构鉴定及分子机制研究》文中研究说明心血管疾病在发达国家和大多数发展中国家是危害人类健康的主要杀手,而动脉粥样硬化（Atherosclerosis, AS）是多种严重心血管疾病的病理基础。目前临床上广泛应用的他汀类药物可以降低20%-40%的心血管事件。要进一步降低心血管疾病的危害,在降低低密度脂蛋白胆固醇的同时必须从预防和逆转动脉粥样硬化（atherosclerosis, AS）的新的治疗靶点出发来寻找具有新型作用机制的药物。近十几年的来研究表明,高密度脂蛋白（high density lipoprotein, HDL）的抗AS作用主要基于HDL参与的胆固醇逆转运（reverse cholesterol transport, RCT）过程,并确定清道夫受体BI （scavenger receptor class B type I, SR-BI）为功能性的HDL受体,人的高密度脂蛋白受体亦被称作CLA-1。SR-BI/CLA-1在RCT过程中起着关键作用,被认为是发现新型心血管药物潜在的新靶标。RCT的增强将有利于AS病灶积蓄的胆固醇减少和病变的逆转,因此可以通过升高SR-BI/CLA-1表达水平来加速RCT,促进机体富余胆固醇酯的清除;能升高SR-BI/CLA-1基因表达的化合物有可能成为有效治疗动脉粥样硬化性心血管疾病新型药物的先导物。为了寻找能够提高CLA-1表达水平的活性化合物,本工作选择一株阳性菌株链霉菌04-9179（鉴定为Streptomyces hygroscopicus）,对其发酵液的活性成分进行了分离纯化,利用大孔树脂HP-20柱层析、ODS柱层析和HPLC制备柱层析等色谱方法分离得到的四个纯化合物9179B、9179D、9179E和9179F,利用ESI-MS、FAB-MS、1H-NMR、13C-NMR和二维NMR等波谱解析方法对四个化合物进行了结构鉴定,确证9179B为（S,2E,4E）-7-（4-（二甲氨基）苯基）-4,6-二甲基-7-氧代庚基-2,4-烯酰胺（FL657C）,9179D为（2E,4E,6S）-7-（4-（二甲氨基）苯基）-4,6-二甲基-7-氧代-N-（（2R,3R,5S,6R）-3,4,5-三羟基-6-（羟甲基）四氢-2H-吡喃-2-氧基）庚基-2,4-烯酰胺（Trichostatin D）,9179E为（S,2E,4E）-7-（4-（二甲氨基）苯基）-N,4,6-三甲基-7-氧代庚基-2,4-烯酰胺（TrichostatinRK）,9179F为4,7-二羟基异黄酮（大豆苷元）。9179B、9179D和9179E均能在筛选模型中以微摩尔浓度上调CLA-1基因的转录活性,其活性活性作用在HepG2细胞利用RT-PCR和Western Blotting在CLA-1转录和翻译水平上得到了证实。此外,通过对PPARγ的转录激活活性和对CLA-1基因上游启动子区不同反应元件的影响的研究,初步确定了三个活性化合物的可能作用位点。9179B、9179D和9179E能够增加RAW264.7细胞对DiI-HDL的摄取。另外,9179B也能在微摩尔浓度下上调ABCA1基因的转录活性及上调HepG2细胞中ABCA1的蛋白水平。本研究利用CLA-1表达上调剂筛选模型跟踪活性,从链霉菌04-9179发酵液中分离纯化获得了4个具有上调人高密度脂蛋白受体CLA-1表达活性的化合物,并在分子和细胞水平确证了其中3个化合物的生物学活性,为寻找新型抗动脉粥样硬化药物或候选物奠定了基础,同时使利用小分子化合物深入研究SR-BI/CLA-1基因的转录调节机制成为可能,具有重要的理论和实践意义。
黄文华[4]（2010）在《牛抵抗素基因的真核表达及生物学活性鉴定》文中研究表明抵抗素是一种由白色脂肪组织的脂肪细胞分泌的新型小分子蛋白,是联系肥胖和2型糖尿病的纽带,可减弱脂肪细胞、骨骼肌细胞、肝细胞胰岛素的敏感性。国内外,抵抗素引起胰岛素抵抗的研究主要集中在小鼠和人,且机制研究尚无一致结论。而牛抵抗素与胰岛素抵抗的关系研究少之又少,已有牛抵抗素基因的原核表达、酮病牛抵抗素基因的真核表达的相关报道。但抵抗素基因真核表达产物有无活性,尚未见报道。本研究分别进行了牛抵抗素基因克隆、真核表达及表达产物生物学活性研究,为临床治疗动物糖代谢紊乱性疾病提供了科学依据。试验从18月龄牛腹部脂肪组织中提取总RNA、反转录及PCR扩增,凝胶电泳鉴定后连接T载体,再进行PCR和双酶切鉴定后送上海生工生物工程有限公司测序。结果用RT-PCR扩增获得了343bp的牛抵抗素基因的cDNA编码序列；成功将牛抵抗素基因克隆至pMD18-T载体上,构建了pMD-Res重组克隆质粒；所获得的目的基因大小为343bp,与Genbank中牛抵抗素基因的序列同源性为99%,表明所获得的基因为牛抵抗素编码基因。设计真核表达引物,进行PCR扩增,连接T载体,进行双酶切鉴定后连接真核表达载体pPICZaA,进行PCR和双酶切鉴定后测序。然后将成功构建的真核表达质粒线性化,转到酵母中进行基因重组,经表型和PCR双重筛选后进行表达条件的优化,进行酵母工程菌的增量表达,应用Dot-blot、SDS-PAGE和western-blot鉴定,浓缩纯化,得到纯化蛋白。试验结果表明成功构建出了牛抵抗素基因真核表达质粒（pPICZaA-resistin）;经过表型筛选和PCR筛选,得到5株整合成功的菌株；牛抵抗素真核表达体系的条件优化是甲醇浓度1.0%、表达时间72h,提高了蛋白表达量；经过Dot-blot筛选,得到1株特别好的重组酵母表达菌株；成功表达出牛抵抗素蛋白,分子量为14KD,并获得重组牛抵抗素蛋白。试验选取体重相似（约100±10g）的4周龄wistar大鼠20只,随机分成4组,每组5只。第Ⅰ组（自由进食,注射不含重组牛抵抗素的PBS）、第Ⅱ组（自由进食,注射含1：1重组牛抵抗素的PBS）、第Ⅲ组（禁食2d,注射不含重组牛抵抗素的PBS）、第Ⅳ组（禁食2d,注射含1：1重组牛抵抗素的PBS）。四个组均在Ⅲ、Ⅳ组小鼠开始禁食时,均同时注射上述药物（每次1.5mg/只,每隔12h注射一次,连续注射4次）。在最后一次注射（48h时）后,立即尾静脉采血记为（0min）,以后在15mmin、30mmin、60min、120min和180min分别采集全血,检测血糖和胰岛素含量。实验结果表明重组牛抵抗素不论对自由进食或禁食2d大鼠的血糖浓度和胰岛素水平均具明显提高作用,说明重组牛抵抗素具有明显的生物学活性。取培养良好的肝细胞培养板（6孔板）,每孔分别接种重组牛抵抗素0、10、50、100、300、500ng/L（共6个梯度,共6个重复）,继续培养12h,PBS洗涤细胞,然后超声破碎,收集上清,采用考马斯亮蓝染色法测定上清液中牛抵抗素蛋白的含量。每管上清中取出100μl加入基质缓冲液37℃恒温水浴8min,加入1.5mmol/L的草酰乙酸100μl,在酶标仪上读取340nm处的吸光度,根据蛋白含量及吸光度计算PEPCK酶（磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶）的比活性。结果表明PEPCK酶活性随重组牛抵抗素浓度的升高而增强,10ng/L以上的重组牛抵抗素可明显提高PEPCK活性,再次证明重组牛抵抗素具有明显的生物学活性。综上所述,本研究成功地克隆了牛抵抗素基因,成功构建出了牛抵抗素基因的真核表达质粒,表达产物（重组牛抵抗素蛋白）具有明显的生物学活性。
王龙龙[5]（2010）在《重组人载脂蛋白C-Ⅱ在毕赤酵母中的表达及大规模发酵研究》文中指出载脂蛋白（Apolipoprotein,Apo）,是构成血浆脂蛋白的蛋白质组分。其基本功能是运载脂类物质及稳定脂蛋白的结构,某些载脂蛋白还有激活脂蛋白代谢酶、识别受体等功能。载脂蛋白C-Ⅱ（Apolipoprotein C-Ⅱ,ApoC-Ⅱ）作为ApoC族中最重要的亚型之一,在参与脂类代谢中起到重要的作用,它是脂蛋白脂酶（lipoprteinlipase,LPL）的辅助因子,可激活多种来源的LPL。同时ApoC-Ⅱ还可减少乳酸脱氢酶（LDH）释放,阻止细胞的形态学变化,保护LDH诱导的内皮细胞损伤,在防止动脉粥样硬化的形成方面发挥重要的作用。但由于其通常是从人血浆中提取分离的,来源极其有限,这已成为ApoC-Ⅱ研究和应用的瓶颈。因此,采用基因工程方法生产重组人载脂蛋白C-Ⅱ（recombinant human ApoC-Ⅱ,rhApoC-Ⅱ）具有重要的意义。本研究主要进行以下几方面工作:利用已制备的pPICZα-ApoC-Ⅱ重组质粒,转化X-33毕赤酵母,构建和筛选出了高效表达rhApoC-Ⅱ的毕赤酵母工程菌;优化了rhApoC-Ⅱ毕赤酵母工程菌表达条件,确定了rhApoC-Ⅱ表达的最佳pH值及发酵时间;在此基础上进行了rhApoC-Ⅱ毕赤酵母工程菌的大规模发酵及纯化,成功制备了高纯度的rhApoC-Ⅱ,为后续对rhApoC-Ⅱ生物学功能及临床应用的研究奠定了基础。
孙波[6]（2010）在《重组人载脂蛋白A-Ⅳ在毕赤酵母中的表达及大规模发酵研究》文中研究表明1977年,人们发现了一种分子量为46 kD的酸性糖蛋白-载脂蛋白A-Ⅳ（apoA-Ⅳ）。它含有396个氨基酸,N-末端为甘氨酸,C-末端为赖氨酸。载脂蛋白A-Ⅳ（apoA-Ⅳ）是人类载脂蛋白的主要成分之一,是乳糜微粒（CM）、高密度脂蛋白（HDL）和极低密度脂蛋白（VLDL）的组成成分。血液循环中的apoA-Ⅳ主要来源于小肠,并受血浆中甘油三酯和胆固醇的调节,小肠分泌的apoA-Ⅳ可以直接进入血液循环,也可以通过淋巴系统间接进入血液循环。随着条件的不同apoA-Ⅳ可以在多种脂蛋白间重新分布,以此调节脂质代谢。apoA-Ⅳ对食物的摄入具有调控抑制作用,还能参与血脂运输和代谢,参与胆固醇逆转运,促进胆固醇脂化,而且还具有拮抗动脉粥样硬化（AS）等作用。本研究利用表达载体pPICZα-apoA-Ⅳ,成功建立重组人apoA-Ⅳ毕赤酵母表达体系。通过SDS-PAGE对发酵上清进行蛋白分析,筛选高表达菌株,并通过对发酵上清进行ELISA检测确定最佳发酵时间以及最佳发酵pH,通过?KTA explorer 100快速纯化工艺开拓系统的Mono Q HR5/5阴离子层析和SourceTM30 RPC HR 10/30反相疏水层析对表达上清进行蛋白纯化,并通过Bioflo 5000发酵罐进行大规模发酵,确定大规模发酵条件及纯化条件,为重组人apoA-Ⅳ大规模应用奠定了基础。
苏曼曼[7]（2009）在《重组人高密度脂蛋白的研究》文中指出代谢综合征患者及高脂血症诱发的CAD患者都具有明显的脂类代谢紊乱（胆固醇升高和HDL降低）,通过大量的流行病学研究已经证明血浆HDL水平与CAD呈负相关。动物试验证明,应用血浆HDL可明显预防和改善机体的脂类代谢紊乱,逆转CAD、AS的发生、发展,提示HDL有巨大的临床应用前景。目前,HDL制剂的唯一来源是血浆,其来源受限、工艺复杂、生产成本高,直接影响其推广应用。本研究应用生物工程技术成功制备出与HDL组分相似的rhHDL制剂,并对该制品的生物学活性进行了检测,取得以下结果:一、HDL蛋白组分的制备及中试规模的生产1.成功构建了重组人载脂蛋白的分泌型表达载体pPICZα-rhApoX,利用巴斯德毕赤酵母稳定分泌表达了rhApoA-I、rhApoA-II、rhApoC-I、rhApoC-II和rhApoE。2.利用80 L发酵罐进行了rhApoA-I和rhApoE中试规模发酵条件的优化,利用5 L摇瓶进行了rhApoA-II、rhApoC-I和rhApoC-II的高密度发酵试验,建立了适于大规模纯化上述五种载脂蛋白的新方法,收率分别为60%～70%,纯度达95%。二、rhHDL的生物学活性利用胆酸钠法,在体外将上述载脂蛋白成分与胆固醇、卵磷脂按照HDL2各成分的比例合成了rhHDL,并比较研究了rhHDL和天然HDL的生物学活性。1.细胞水平:rhHDL能介导巨噬细胞的胆固醇流出,具有进行RCT的功能。2.在体水平:rhHDL能调节实验性高脂血症大鼠的血脂代谢,显着降低TC、TG、AI和LDL-C,升高HDL-C;升高血清及组织中SOD活性从而抵抗自由基介导的脂质过氧化,防治动脉粥样硬化;减轻实验性高脂血症大鼠肝脏的脂肪沉积,达到对肝脏的保护作用。体内、外分析实验表明,本研究利用胆酸钠法制备的rhHDL具有与天然HDL极为相似的生物学活性。本研究的创新之处在于:1)建立了利用巴斯德毕赤酵母高效分泌表达rhApoA-II、rhApoC-I和rhApoE的真核表达系统;2)建立了rhApoA-I、rhApoA-II、rhApoC-I、rhApoC-II和rhApoE大规模纯化的新方法;3)利用胆酸钠法,在体外合成具有多种载脂蛋白成分的rhHDL;4)证实rhHDL具有与天然HDL极为相似的生物学活性。
鲍羿[8]（2008）在《以脂代谢相关受体为靶点的抗动脉粥样硬化药物筛选及药物作用机制研究》文中进行了进一步梳理目前,心脑血管疾病是世界发病率最高的疾病之一,其致死、致残率高居各类疾病之首。其中,动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）的发生是心脑血管疾病的主要病理基础。脂质代谢紊乱尤其是胆固醇代谢紊乱是目前公认的主要致病因子。调脂药物的早期研究主要集中于针对低密度脂蛋白受体（low densitylipoprotein receptor,LDLR）通路,他汀类药物是其代表药物,具有出色的降胆固醇疗效,可明显降低心脏病及卒中的风险。但是他汀类药物总的有效率仅为20～40%,因此,心血管疾病远未解决,亟需发现新作用机制的药物。近年来,在新型调脂药物研发过程中,血浆脂蛋白代谢过程中的另两个关键步骤:胆固醇逆向转运（reverse cholesterol transport,RCT）通路及泡沫细胞形成（foam cellformation）过程受到越来越多的关注。本论文围绕着这两个方面开展了相关药物筛选和作用机制研究。高密度脂蛋白（high density lipoprotein,HDL）是胆固醇逆向转运中最主要的胆固醇携带者,在这一过程中,B族I型清道夫受体SR-BI（人的同源基因命名为CLA-1）发挥了重要作用。作为HDL的受体,SR-BI参与调节肝脏对脂质的选择性摄取,介导HDL胆固醇酯选择性进入细胞;另外,在外周细胞,SR-BI能通过结合HDL促进胆固醇的外流。由于SR-BI在RCT的起始及终末步骤中都发挥了重要作用,因此被认为是抗动脉粥样硬化药物的潜在靶点之一。本研究室构建了基于细胞的高密度脂蛋白受体表达上调剂高通量筛选模型,对化合物及微生物次级代谢产物进行了大规模筛选,其中阳性菌株04-9179可有效上调CLA-1启动子的活性,从该菌株发酵液中分离得到阳性化合物9179A及阳性组分B和C。本论文第一部分针对CLA-1表达上调剂9179A进行结构确证,活性检测及相关分子作用机制研究。在前期工作基础上,经化学及生物学分析进一步确证,9179A为已知化合物Trichostatin A。检测9179A对人肝癌细胞HepG2及小鼠巨噬细胞RAW 264.7中CLA-1/SR-BI表达水平的影响,结果表明9179A可分别上调HepG2及RAW 264.7中CLA-1/SR-BI mRNA及蛋白水平。在此基础上,进一步检测9179A对HepG2和RAW 264.7细胞的脂质摄取能力以及RAW 264.7细胞胆固醇外流能力的影响,结果表明,9179A可上调HepG2细胞和RAW 264.7细胞对DiI-HDL的摄取,还可上调RAW 264.7细胞的胆固醇外流能力。对9179A分子作用机制的进一步研究提示,9179A可能通过调控含有SRE/SP1等顺式元件的启动子区域发挥上调CLA-1/SR-BI转录的作用。此外,我们还对阳性菌株04-9179中阳性组分B和C进行了分离纯化、结构鉴定和活性测定,结果表明,化合物9179B和9179C对CLA-1启动子活性的上调作用较低。细胞泡沫化是AS形成的关键步骤。巨噬细胞上存在的清道夫受体A（SR-A）和B族清道夫受体CD36可导致oxLDL被细胞无限制摄取（即在摄取时不受负反馈调控）,因此它们在泡沫细胞形成中发挥重要作用。体内、外研究显示,60～90%的巨噬细胞泡沫化是由CD36介导的。因此CD36被认为是抗动脉粥样硬化药物的潜在靶点之一。在本论文第二部分中,我们在大肠杆菌中成功表达了重组CD36可溶性受体蛋白,并以此为靶点建立了CD36拮抗剂高通量筛选模型。分别扩增人CD36全长及可溶性片段（sCD36）cDNA,将它们克隆至pGEM-T载体并测序,分别与大肠杆菌表达载体pET-30a（+）连接,构建CD36及sCD36的重组表达质粒,并将重组质粒分别转化大肠杆菌表达宿主BL21（DE3）,表达目的蛋白。经SDS-PAGE及Western Blot检测获得成功表达sCD36的重组菌株E.coliBL21（DE3）/pET-sCD36。该菌株表达的sCD36蛋白经配基结合实验及油红O染色实验证实具有配基结合活性。随后,利用该重组蛋白建立并优化了基于受体-配基竞争性结合的ELISA-like高通量药物筛选模型,并应用此模型筛选化合物640个。其中,具有抑制CD36配基结合活性的阳性化合物27个,阳性率为4.22%。对部分阳性化合物进行了活性验证,结果显示,受试化合物在细胞水平上具有抑制RAW 264.7细胞摄取oxLDL及DiI-acLDL的能力,进一步证实了构建模型的可行性。
邢晓然[9]（2008）在《重组脂蛋白脂肪酶Q402E突变体在毕赤酵母中的表达》文中研究说明脂蛋白脂肪酶（Lipoprotein lipase,LPL）是参与体内脂质代谢的主要成分之一,是催化血浆中甘油三酯（Triglyceride,TG）分解的关键酶。树鼩是不易感动脉粥样硬化动物。以往的研究表明树鼩总LPL活性远远高于人的总LPL活性,大约是人LPL活性的8倍;根据不同种属LPL氨基酸序列比较结果,以树鼩的序列为基准,对人的LPL进行定点突变得到多种人LPL突变体,经初步表达后发现Q402E突变体功能较野生型LPL明显升高。为进一步研究树鼩不易感动脉粥样硬化机理,本实验探索了脂蛋白脂肪酶Q402E突变体在毕赤酵母中的表达方法和条件,为进一步研究LPL突变体结构与功能关系提供有效的真核表达途径。[目的]构建Q402E突变体的毕赤酵母表达载体,将构建的表达质粒转染毕赤酵母X33菌株,通过调整诱导剂浓度、表达温度、表达时间和PH值,探索Q402E突变体在不同条件下的表达情况,为进一步研究LPL突变体结构与功能关系提供有效的真核表达途径。[方法]首先,通过转染DH5α而扩增本室冻存的ppcDNA3.1-Q402E质粒,并以扩增产物为模板、以带有XhoI、XbaI限制性酶切位点的核苷酸序列为引物,通过PCR法从ppcDNA3.1-Q402E质粒中获取带有上述酶切位点的Q402E序列。经XhoI、XbaI酶切消化毕赤酵母表达载体pPICZαA和所得Q402E以获得粘性末端,并通过琼脂糖凝胶电泳确定酶切效果。之后,在DNAligase作用下,将Q402E插入到pPICZαA中,构建Q402E酵母表达载体并对所构建质粒通过内侧引物法、外侧引物法和限制性内切酶分析法进行初步鉴定,并最终通过DNA序列测定明确Q402E成功插入到pPICZαA中并且没有发生异常突变。经确定后,将重组质粒转化通过CaCL2法制备TOP10F`感受态细胞、碱裂解法大量提取、聚乙二醇（PEG）沉淀法纯化。此后,将获得的重组质粒经限制性核酸内切酶SacI切割后,通过电转化方法将重组质粒转化并整合到酵母基因组,并先后通过含有100μg/ml Zeocin?的YPD平板进行Zeocin抗性筛选、MD、MM平板进行Mut+即甲醇利用型筛选。筛选后,提取筛选出的菌株基因组,并以其为模板、以含有部分LPL-Q402E核苷酸序列的寡核苷酸连为引物,通过PCR方法鉴定pPICZαA-Q402E是否成功整合到毕赤酵母基因组中。对成功整合的菌株进行复苏和扩增,并以甲醇为诱导剂进行初步表达。留取不同时间点菌液检测蛋白表达情况和表达时间段。经初步表达后,依次调整表达温度、诱导剂浓度,对比不同条件下表达情况。[结果]成功构建脂蛋白脂肪酶突变体Q402E的毕赤酵母表达载体pPICZαA-LPLQ402E,并证实其在毕赤酵母中可成功进行分泌式表达,且每毫升表达产物可在聚丙烯酰胺凝胶电泳中进行观察。重组蛋白在诱导后24小时在相应分子量处有明显蛋白条带,之后条带逐渐加重,目的蛋白表达量增加,72小时后逐渐减轻,目的蛋白量减少;降低表达温度后,相同表达时间下目的蛋白表达无明显增加、但杂蛋白条带减少;增加或减少诱导剂浓度后,表达量无明显增加。[结论]1.成功构建脂蛋白脂肪酶突变体Q402E的毕赤酵母表达载体pPICZαA-LPLQ402.重组脂蛋白脂肪酶Q402E突变体在毕赤酵母X33菌株中可进行分泌性表达3.诱导后72小时重组蛋白表达量最高;降低表达温度可减少杂蛋白含量;增加或减少诱导剂含量对表达产物无明显影响。
夏和雪[10]（2007）在《重组人载脂蛋白CⅢ在毕赤酵母中表达的研究》文中研究说明人载脂蛋白CⅢ（apoprotein-CⅢ,ApoCⅢ）是一种水溶性低分子量蛋白质,是载脂蛋白C族中含量最丰富的一类。由于ApoCⅢ在血脂代谢中的重要作用,目前对于关于它的研究越来越受到重视。本研究利用RT-PCR技术从肝组织中克隆了人apoCⅢcDNA全长序列,并以其为模板扩增出两端引入限制性内切酶位点的apoCⅢ编码序列,将其连接到经本室改造的表达载体pPICZα,并将其电转染进入毕赤酵母中。结果表明,本研究正确克隆了apoCⅢcDNA序列,在此基础上构建的重组人ApoCⅢ毕赤酵母真核表达体系经甲醇诱导可分泌ApoCⅢ蛋白。
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩略词对照表 |
| 1 绪论 |
| 1.1 研究背景与意义 |
| 1.2 国内外研究现状 |
| 1.2.1 ABC转运蛋白结构 |
| 1.2.2 ABC转运蛋白的作用机制 |
| 1.2.3 ABC转运蛋白各亚家族研究进展 |
| 1.2.4 ABC转运蛋白转运外源物质的检测方法和技术 |
| 1.2.5 ABC转运蛋白在外源物质转运和抗药性中的作用 |
| 1.3 研究目的、研究内容及创新性 |
| 1.3.1 课题研究目的 |
| 1.3.2 课题研究内容 |
| 1.3.3 课题研究的技术路线 |
| 1.3.4 课题的特色及创新点 |
| 2 中华按蚊ABC转运蛋白基因家族鉴定、特征及系统进化分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 数据来源 |
| 2.2.2 分析软件 |
| 2.2.3 中华按蚊ABC转运蛋白基因鉴定 |
| 2.2.4 中华按蚊ABC转运蛋白基因特征分析 |
| 2.2.5 中华按蚊ABC转运蛋白基因系统发育分析 |
| 2.2.6 同义替换和非同义替换检测 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 中华按蚊ABC转运蛋白基因多样性及基因组定位 |
| 2.3.2 中华按蚊ABC转运蛋白基因系统进化与特征 |
| 2.3.3 中华按蚊ABC转运蛋白基因的Ka/Ks |
| 2.4 本章小结 |
| 3 中华按蚊与溴氰菊酯抗性相关ABC转运蛋白基因的筛选 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与试剂 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 主要实验试剂 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 转录组测序样本的制备 |
| 3.3.2 中华按蚊总RNA的提取 |
| 3.3.3 总RNA浓度、纯度检测及完整性鉴定 |
| 3.3.4 中华按蚊ABC转运蛋白基因表达谱分析 |
| 3.3.5 qPCR验证 |
| 3.3.6 溴氰菊酯处理后ABC转运蛋白基因的表达谱分析 |
| 3.4 实验结果与讨论 |
| 3.4.1 野外抗性种群ABC转运蛋白基因表达谱分析 |
| 3.4.2 显着差异表达ABC转运蛋白基因的q PCR验证 |
| 3.4.3 溴氰菊酯处理后中华按蚊ABC转运蛋白基因表达谱分析 |
| 3.5 本章小结 |
| 4 RNA干扰AsABCG28 基因表达对溴氰菊酯处理后中华按蚊致死率的影响 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与试剂 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 主要实验试剂 |
| 4.2.3 实验耗材及试剂准备 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 中华按蚊总RNA的提取、浓度、纯度及完整性鉴定 |
| 4.3.2 cDNA的合成 |
| 4.3.3 AsABCG28 基因片段的扩增 |
| 4.3.4 目的片段的回收 |
| 4.3.5 PCR产物的T/A克隆 |
| 4.3.6 感受态细胞的制备 |
| 4.3.7 连接产物的转化 |
| 4.3.8 阳性菌的筛选及测序 |
| 4.3.9 质粒DNA的提取 |
| 4.3.10 AsABCG28-及GFP-dsRNA的合成 |
| 4.4 实验结果与讨论 |
| 4.4.1 中华按蚊总RNA的浓度及完整性检测 |
| 4.4.2 AsABCG28/pGEM-T重组质粒的构建 |
| 4.4.3 dsRNA的合成 |
| 4.4.4 RNAi对中华按蚊幼虫AsABCG28 基因表达及溴氰聚酯处理中华按蚊幼虫死亡率的影响 |
| 4.5 本章小结 |
| 5 AsABCG28 在毕氏酵母中的表达及其参与溴氰菊酯代谢研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料与试剂 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.2 实验主要试剂及配置方法 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 重组质粒AsABCG28/p PICZA的构建及鉴定 |
| 5.3.2 重组质粒线性化 |
| 5.3.3 重组质粒电转化导入毕氏酵母 |
| 5.3.4 毕氏酵母阳性克隆菌的鉴定 |
| 5.3.5 毕氏酵母重组子的诱导表达 |
| 5.3.6 表达产物的分离纯化 |
| 5.3.7 考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度 |
| 5.3.8 ATP酶活性检测 |
| 5.3.9 不同药物对AsABCG28 ATPase活性的影响 |
| 5.3.10 AsABCG28 同源建模及分子对接 |
| 5.4 实验结果与讨论 |
| 5.4.1 重组质粒AsABCG28/p PICZA的鉴定及线性化 |
| 5.4.2 酵母菌GS115 重组子的筛选与鉴定 |
| 5.4.3 重组蛋白AsABCG28 的诱导表达 |
| 5.4.4 重组蛋白AsABCG28 的分离纯化 |
| 5.4.5 AsABCG28 参与溴氰菊酯代谢研究 |
| 5.4.6 AsABCG28 同源建模与评估 |
| 5.4.7 AsABCG28 与药物的分子对接 |
| 5.5 本章小结 |
| 6 结论与展望 |
| 6.1 主要结论 |
| 6.2 后续工作展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| A.作者在攻读博士期间发表的论文 |
| B.作者在攻读博士期间参加科研项目情况 |
| C.作者在攻读博士期间取得的科研成果 |
| D.附表 |
| E.学位论文数据集 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词说明 |
| 绪论 |
| 第一部分 HSP70在NAFLD人群血清和小鼠肝脏以及PA诱导的HepG2 细胞脂肪变性中表达上调 |
| 1.引言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 .主要仪器设备 |
| 2.2 .实验试剂和耗材 |
| 2.3 .常用试剂配制 |
| 2.4 .实验方法 |
| 3.结果 |
| 3.1 .HSP70与NAFLD之间的相关性研究 |
| 3.2 .NAFLD小鼠肝脏组织内HSP70 的表达 |
| 3.3 .HSP70在PA诱导的HepG2 细胞脂肪变性中表达上调 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 第二部分 HSP70 对非酒精性脂肪性肝病的作用 |
| 1.引言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 .主要仪器设备 |
| 2.2 .实验试剂与耗材 |
| 2.3 .常用试剂配制 |
| 2.4 .实验方法 |
| 3.结果 |
| 3.1 .HSPA1A过表达人HepG2 细胞稳转株的构建 |
| 3.2 .HSPA1A过表达促进细胞内脂质合成增加 |
| 3.3 .HSPA1A敲低人HepG2 细胞稳转株的构建 |
| 3.4 .敲低HSPA1A降低细胞内脂质合成 |
| 3.5 .鼠尾静脉注射AAV-HSPA1A在小鼠肝脏内过表达HSPA1A |
| 3.6 .鼠尾静脉注射AAV-shHSPA1A/B在 HFD小鼠肝脏内干扰HSPA1A/B |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 第三部分 HSP70-FTO轴在非酒精性脂肪性肝病中的作用机制 |
| 1.引言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 .主要仪器设备 |
| 2.2 .实验材料与耗材 |
| 2.3 .常用试剂配制 |
| 2.4 .实验方法 |
| 3.结果 |
| 3.1 .FTO在 PA诱导的HepG2 细胞脂肪变性中表达上调 |
| 3.2 .过表达HSP70对FTO表达水平的影响 |
| 3.3 .敲低HSP70 下调FTO的表达水平 |
| 3.4 .在高脂诱导下HSP70 促进FTO核内转移 |
| 3.5 .HSP70 直接结合FTO |
| 3.6 .FTO过表达稳转株的构建 |
| 3.7 .FTO过表达促进脂质合成增加 |
| 3.8 .FTO干扰稳转株的构建 |
| 3.9 .敲低FTO敲低减少细胞内脂质合成 |
| 3.10 .IPA数据库筛选脂质合成相关分子网络图 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 博士期间完成论文和科研成果 |
| 缩略语一览表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 结果与讨论 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附图 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 文献综述 |
| 1 抵抗素基因及分子结构 |
| 2 抵抗素的分布表达和影响因素 |
| 3 抵抗素的作用机制 |
| 3.1 肝脏内胰岛素抵抗 |
| 3.2 脂肪组织内胰岛素抵抗 |
| 3.3 骨骼肌中胰岛素抵抗 |
| 4 抵抗素的生物学效应 |
| 4.1 抵抗素与胰岛素抵抗 |
| 4.2 抵抗素与肥胖的关系 |
| 4.3 抵抗素与糖尿病的关系 |
| 4.4 抵抗素与高血压的关系 |
| 4.5 抵抗素与动脉粥样硬化 |
| 4.6 抵抗素与脑梗死 |
| 4.7 抵抗素与炎症因子 |
| 4.8 抵抗素与内皮细胞的关系 |
| 4.9 抵抗素与脂肪组织代谢的关系 |
| 4.10 抵抗素与其他脂肪因子 |
| 4.11 抵抗素与肝组织的关系 |
| 5 抵抗素基因研究进展 |
| 6 研究目的意义 |
| 第二部分 试验内容 |
| 实验一 牛抵抗素基因的克隆 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 脂肪组织 |
| 1.2 主要的仪器和试剂 |
| 1.2.1 主要的仪器设备 |
| 1.2.2 主要试剂 |
| 2 抵抗素引物的设计与合成 |
| 3 试验方法 |
| 3.1 脂肪组织总RNA的提取 |
| 3.1.1 实验准备 |
| 3.1.2 提取总RNA(Trizol法) |
| 3.1.3 电泳检测 |
| 3.2 反转录(两步法) |
| 3.3 PCR扩增 |
| 3.4 PCR产物的凝胶回收 |
| 3.5 连接 |
| 3.6 转化 |
| 3.6.1 大肠杆菌DH5a感受态的制备 |
| 3.6.2 大肠杆菌转化 |
| 3.7 菌液PCR鉴定 |
| 3.8 质粒的提取及双酶切鉴定 |
| 4 讨论 |
| 4.1 总RNA提取的关键环节 |
| 4.2 选取T载体的目的及机理 |
| 4.3 同源性分析 |
| 5 小结 |
| 实验二 牛抵抗素基因在毕赤酵母中的表达及鉴定 |
| 1 试验材料 |
| 2 主要试验设备与试剂 |
| 2.1 主要试验设备 |
| 2.2 主要试剂 |
| 3 所用培养基和缓冲液的配制 |
| 4 牛抵抗素基因真核表达载体的构建 |
| 4.1 目的基因片段的获取与扩增 |
| 4.2 目的带与T载体连接 |
| 4.3 牛抵抗素基因与真核表达载体pPICZaA的连接 |
| 4.3.1 连接质粒PCR产物的回收及双酶切 |
| 4.3.2 连接及转化 |
| 5 牛抵抗素基因在酵母中表达 |
| 5.1 真核表达质粒pPICZaA-resistin的线性化和浓缩 |
| 5.1.1 真核表达质粒的线性化 |
| 5.1.2 真核表达质粒的浓缩 |
| 5.2 酵母感受态的制备及其转化 |
| 5.2.1 酵母感受态的制备 |
| 5.2.2 毕赤酵母的转化 |
| 5.2.3 毕赤酵母转化后的PCR鉴定 |
| 5.2.3.1 酵母基因组DNA的提取(玻璃珠法) |
| 5.2.3.2 酵母基因组DNA PCR鉴定 |
| 5.3 甲醇诱导表达条件的优化 |
| 5.3.1 甲醇浓度的优化 |
| 5.3.2 诱导表达时间的优化 |
| 5.4 酵母工程菌的大规模诱导表达 |
| 6 酵母中表达的重组牛抵抗素目的蛋白的鉴定 |
| 6.1 斑点法(Dot-blot)鉴定目的蛋白及其表达量 |
| 6.2 目的蛋白的SDS-PAGE鉴定和Western-blot确认 |
| 7 目的蛋白的纯化 |
| 8 讨论 |
| 8.1 酵母表达系统的选取 |
| 8.2 转化方法和表达培养基的选取 |
| 8.3 影响牛抵抗素基因表达的因素 |
| 9 小结 |
| 实验三 重组牛抵抗素生物学活性的鉴定 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 主要试剂和设备 |
| 1.3 所用培养基和缓冲液的配制 |
| 2 试验内容 |
| 2.1 重组牛抵抗素对小鼠糖耐量的影响 |
| 2.1.1 试验动物及处理 |
| 2.1.2 样品采集及处理 |
| 2.1.3 测定结果 |
| 2.1.3.1 重组牛抵抗素对小鼠血糖浓度的影响 |
| 2.1.3.2 重组牛抵抗素对小鼠血液胰岛素含量的影响 |
| 2.2 重组牛抵抗素对糖异生关键酶PEPCK活性的影响 |
| 2.2.1 犊牛肝细胞的分离培养 |
| 2.2.2 乳酸脱氢酶偶联比色法进行PEPCK酶活性的鉴定 |
| 2.2.2.1 乳酸脱氢酶偶联比色法进行PEPCK酶活性鉴定的步骤 |
| 2.2.3.2 重组目的蛋白含量的测定 |
| 2.2.3 鉴定结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 重组牛抵抗素对小鼠血糖浓度及胰岛素含量的影响 |
| 3.2 肝细胞分离培养的影响因素 |
| 3.3 乳酸脱氢酶偶联比色法测酶活性的原理及关键环节 |
| 3.4 影响PEPCK活性的机制 |
| 4 小结 |
| 研究结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 提要 |
| 英文缩略词 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 载脂蛋白概述 |
| 1.2 ApoC-Ⅱ概述 |
| 1.3 rhApoC-Ⅱ表达体系的选择 |
| 1.4 立题依据 |
| 第2章 rhApoC-Ⅱ在毕赤酵母中的表达 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 第3章 rhApoC-II 大规模发酵及纯化 |
| 3.1 rhApoC-II的大规模发酵 |
| 3.2 大规模纯化 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 研究总结 |
| 4.1 本研究的实验结果 |
| 4.2 本研究的创新之处 |
| 4.3 拟进一步的研究方案 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 提要 |
| 英文缩略词 |
| 第1章 前言 |
| 1.1 载脂蛋白A（apoA）概述 |
| 1.2 载脂蛋白A-Ⅳ（apoA-Ⅳ）概述 |
| 1.2.1 载脂蛋白A-Ⅳ（apoA-Ⅳ）的分子结构 |
| 1.2.2 载脂蛋白A-Ⅳ（apoA-Ⅳ）的生理作用 |
| 1.2.3 载脂蛋白A-Ⅳ（apoA-Ⅳ）合成与分泌的调节 |
| 1.2.4 载脂蛋白A-Ⅳ（apoA-Ⅳ）的临床作用 |
| 1.3 表达系统的选择 |
| 1.3.1 原核表达系统 |
| 1.3.2 昆虫细胞表达系统 |
| 1.3.3 哺乳动物细胞表达系统 |
| 1.3.4 酵母表达系统 |
| 1.4 立题依据 |
| 第2章 重组人载脂蛋白A-Ⅳ在毕赤酵母中表达的研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 器材及设备 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 表达载体引物 |
| 2.1.4 主要试剂的配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 重组人载脂蛋白A-Ⅳ毕赤酵母表达系统的建立 |
| 2.2.2 筛选转化阳性菌株 |
| 2.2.3 重组人载脂蛋白A-Ⅳ工程菌最佳发酵时间的确定 |
| 2.2.4 重组人载脂蛋白A-Ⅳ工程菌最佳发酵pH 的确定 |
| 2.2.5 重组人载脂蛋白A-Ⅳ蛋白的小量纯化 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 PCR 方法鉴定重组人载脂蛋白A-Ⅳ转化阳性菌株 |
| 2.3.2 高表达重组人载脂蛋白A-Ⅳ工程菌的筛选 |
| 2.3.3 重组人载脂蛋白A-Ⅳ不同时间点表达量的变化 |
| 2.3.4 重组人载脂蛋白A-Ⅳ不同pH 值表达量的差异 |
| 2.3.5 重组人载脂蛋白A-Ⅳ（apoA-Ⅳ）的小量纯化 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 重组人载脂蛋白A-Ⅳ大规模发酵研究 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 重组人载脂蛋白A-Ⅳ大规模发酵结果 |
| 3.2.2 大规模发酵时细胞湿重、OD600及apoA-Ⅳ表达量监测结果 |
| 3.2.3 重组人载脂蛋白A-Ⅳ大规模发酵ELISA 分析结果 |
| 3.2.4 蛋白含量测定 |
| 3.3 讨论 |
| 第4章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 内容提要 |
| 英文缩略词 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 脂类代谢 |
| 1.1.1 胆固醇代谢 |
| 1.1.2 三酰甘油代谢 |
| 1.2 脂蛋白代谢 |
| 1.2.1 外源性代谢途径 |
| 1.2.2 内源性代谢途径 |
| 1.2.3 HDL 代谢——胆固醇逆转运途径 |
| 1.3 HDL 的载脂蛋白组分 |
| 1.3.1 载脂蛋白A-I |
| 1.3.2 载脂蛋白A-II |
| 1.3.3 载脂蛋白A-IV |
| 1.3.4 载脂蛋白C-I |
| 1.3.5 载脂蛋白C-II |
| 1.3.6 载脂蛋白C-III |
| 1.3.7 载脂蛋白E |
| 1.4 HDL 的生物学功能 |
| 1.4.1 促进胆固醇逆转运 |
| 1.4.2 抗氧化作用 |
| 1.4.3 HDL 与抗炎作用 |
| 1.4.4 HDL 的其他作用 |
| 1.5 低HDL-C 与冠心病 |
| 1.6 低HDL-C 的处理措施 |
| 第2章 HDL 载脂蛋白成分的制备 |
| 2.1 rhApoA-I 的制备 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.1.3 结果 |
| 2.2 rhApoE 的制备 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.2 方法 |
| 2.2.3 结果 |
| 2.3 rhApoA-II 的制备 |
| 2.3.1 材料 |
| 2.3.2 方法 |
| 2.3.3 结果 |
| 2.4 rhApoC-I 的制备 |
| 2.4.1 材料 |
| 2.4.2 方法 |
| 2.4.3 结果 |
| 2.5 rhApoC-II 的制备 |
| 2.5.1 材料 |
| 2.5.2 方法 |
| 2.5.3 结果 |
| 2.6 讨论 |
| 第3章 rhHDL 的制备及活性研究 |
| 3.1 rhHDL 的制备 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.1.3 结果 |
| 3.1.4 讨论 |
| 3.2 rhHDL 介导大鼠腹腔巨噬细胞内胆固醇流出 |
| 3.2.1 材料 |
| 3.2.2 方法 |
| 3.2.3 结果 |
| 3.2.4 讨论 |
| 3.3 rhHDL 对实验性高脂血症大鼠血脂代谢的影响 |
| 3.3.1 材料 |
| 3.3.2 方法 |
| 3.3.3 结果 |
| 3.3.4 讨论 |
| 研究总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表的学术论文及取得的科研成果 |
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语一览表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一部分:以CLA-1/SR-BI为靶点的潜在抗动脉粥样硬化药物结构鉴定及分子作用机制研究 |
| 1.前言 |
| 2.材料和方法 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 9179A、B、C的提取分离、结构鉴定及活性分析 |
| 3.1.1 9179A |
| 3.1.2 9179B |
| 3.1.3 9179C |
| 3.2 9179A的作用机制研究 |
| 3.2.1 对HepG2细胞中CLA-1 mRNA、蛋白水平及功能的影响 |
| 3.2.2 对RAW 264.7细胞中SR-BI mRNA、蛋白水平及功能的影响 |
| 3.2.3 对RAW 264.7细胞中ABCA1表达水平的影响 |
| 3.2.4 对CLA-1启动子调控机制的初步探讨 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 第二部分:以CD36为靶点的抗动脉粥样硬化药物筛选模型的建立 |
| 1.前言 |
| 2.材料和方法 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 CD36在E.coli中的表达 |
| 3.1.1 CD36 cDNA片段的获得 |
| 3.1.2 CD36重组表达载体的构建 |
| 3.1.3 CD36在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达和纯化 |
| 3.1.4 重组sCD36的生物学活性验证 |
| 3.2 以CD36为靶点的模型建立、优化与评价 |
| 3.2.1 ELISA-like高通量筛选模型的建立 |
| 3.2.2 模型的优化 |
| 3.2.3 模型的评价 |
| 3.3 模型的初步应用 |
| 3.3.1 化合物筛选 |
| 3.3.2 阳性化合物的量效关系测定 |
| 3.4 阳性化合物的生物学活性分析 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 参考文献 |
| 综述:脂代谢相关受体和动脉粥样硬化药物研究 |
| 附录 |
| 一、9179B图谱 |
| 二、9179C图谱 |
| 三、相关测序结果 |
| 四、在校期间发表文章和参加学术会议情况 |
| 五、致谢 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 实验设计与技术路线 |
| 材料和方法 |
| 第一部分 构建LPL-Q402E 与毕赤酵母表达载体的重组质粒 |
| 第二部分 重组蛋白质在毕赤酵母（Pichia pastoris）中的初步表达 |
| 第三部分 重组蛋白表达条件的优化 |
| 实验结果 |
| 一、目的基因的获得及鉴定 |
| 二、插入片段 PCR 产物检测 |
| 三、pPICZ A质粒提取结果 |
| 四、目的基因及载体酶切效果判断 |
| 五、重组质粒构建及效果的判断 |
| 六、重组质粒大量提取后浓度判断 |
| 七、重组体转化毕赤酵母前线性化结果确定 |
| 八、 Mut~+和ZeoR筛选 |
| 九、PCR 法鉴定重组效果 |
| 十、重组蛋白初步表达判断：聚丙烯酰胺凝胶电泳图 |
| 十一、调整诱导温度后表达情况 |
| 十二、不同诱导剂浓度下表达情况 |
| 讨论 |
| 一、目的基因的选择 |
| 二、选择菌株 |
| 三、表达载体 |
| 四、表达条件的对比与选择 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 文献综述 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 提要 |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 前言 |
| 一、引言 |
| 二、apoCⅢ的基因结构 |
| 三、ApoCⅢ的蛋白结构 |
| 四、ApoCⅢ与血浆脂质代谢 |
| （一） ApoCⅢ抑制脂蛋白脂酶活性 |
| （二） ApoCⅢ抑制肝脏摄取TRL 及其残粒 |
| （三） 参与调节卵磷脂胆固醇酰基转移酶和胆固醇酯转移蛋白的活性 |
| （四） 转人apoCⅢ基因小鼠模型与相关疾病的研究 |
| 五、apoCⅢ基因多态性 |
| 六、酵母表达系统的优点 |
| 七、立题依据 |
| 第二章 人 ApoCⅢ克隆载体的构建 |
| 一、材料 |
| （一） 器材及设备 |
| （二） 主要试剂 |
| 二、方法 |
| （一） Trizol 法从人肝组织中提取总RNA |
| （二） RT-PCR 扩增cDNA 序列 |
| （三） 人apoCⅢ基因克隆载体的构建 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 第三章 重组人ApoCⅢ在毕赤酵母中的表达 |
| 一、材料 |
| （一） 器材、设备 |
| （二） 主要试剂及配制 |
| （三） 质粒和菌株 |
| 二、方法 |
| （一） 重组ApoCⅢ表达载体的构建 |
| （二） 毕赤酵母的转化 |
| （三） 转化阳性菌株的筛选及诱导表达 |
| （四） SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE） |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 第四章 研究总结 |
| 1. 本研究中得出的结论 |
| 2. 本研究的创新之处 |
| 参考文献 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 致谢 |
