许翠[1]（2018）在《HPV16 E6/E7通过DNA甲基化修饰导致原代角质形成细胞恶性转变的机制研究》文中研究表明高危型人乳头瘤病毒（High-risk Humanpapillomavirus,HR-HPVs）的感染（如HPV16）是细胞发生恶性转变的必要条件,E6和E7是其主要的致癌基因。HPV16可通过表观遗传学路径导致肿瘤的发生,其中研究最多的是DNA甲基化。我们设想HPV16E6/E7可以通过DNA甲基化修饰导致细胞的恶性转化。本研究将HPV16 E6/E7通过慢病毒感染的方式转入原代人包皮角质形成细胞（Human Foreskin Keratinocytes,HFKs）构建永生化细胞系并进行鉴定;观察将HPV16E6/E7转入原代细胞及分别沉默肿瘤细胞中HPV16E6或E7后,DNMTs的表达情况,目的基因的甲基化水平及表达情况;最后,将永生化细胞及宫颈癌细胞（SiHa、CaSki）进行全基因组DNA序列、全基因组RNA及DNA甲基化测序,通过数据分析,筛选并发现在细胞永生化及肿瘤细胞形成过程中发挥不同功能的目的基因,为进一步研究基因的功能奠定基础。第一部分永生化角质形成细胞的构建与鉴定目的:将HPV16E6/E7转入原代HFKs,构建永生化细胞,并对永生化HFKs进行鉴定。方法:（1）使用两步消化法及体外无血清培养基培养法分离及培养原代HFKs,观察原代HFKs的生长特性;（2）构建慢病毒质粒LV5-HPV16E6/E7,并经测序验证序列正确后,将质粒包装成高滴度慢病毒;（3）慢病毒感染传代2次的原代HFKs,嘌呤霉素筛选2周,持续培养;（4）通过实时荧光定量核酸扩增（QuantitativePCR,qPCR）及Western Blot检测永生化细胞中HPV16 E6和E7的mRNA及蛋白表达情况,CCK-8检测细胞永生化过程中细胞增殖水平的改变,Transwell实验检测永生化细胞的侵袭能力,裸鼠致瘤实验观察永生化细胞能否导致肿瘤发生。结果:（1）成功分离原代HFKs,并可在体外连续传代。连续传代10次左右原代HFKs出现衰老表现,逐渐死亡。（2）成功构建LV5-HPV16E6/E7重组质粒,并将其包装成滴度为1×109TU/mL的慢病毒。（3）将HPV16E6/E7转入原代HFKs后,可连续传代30次以上,符合永生化细胞的定义。（4）永生化细胞中HPV16 E6和E7的mRNA、蛋白表达水平明显升高;随着传代次数的增加,细胞增殖水平逐渐升高;Transwell实验表明永生化细胞不能通过Matrigel基底膜,不具有侵袭能力;将永生化细胞注射至裸鼠皮下不会形成肿瘤,永生化细胞不具有致瘤能力。结论:LV5-HPV16E6/E7慢病毒感染原代HFKs后,HPV16E6和E7可在细胞中稳定表达,并使得细胞发生永生化。永生化细胞可连续传代30次以上,但不具有肿瘤细胞的侵袭能力及致瘤能力。第二部分HPV16 E6/E7对DNA甲基化的影响目的:观察HPV16E6和E7对DNMTs表达水平及目的基因甲基化、表达水平的影响,证明HPV16 E6和E7可通过甲基化途径影响目的基因的表达。方法:（1）qPCR及Western Blot法检测慢病毒感染前HFKs（Blank）、不同代数 HPV16E6/E7HFKs（A1、A10、A20、A30）及 SiHa（阳性对照）中 4 种 DNMTs的mRNA、蛋白表达水平;（2）亚硫酸氢钠处理后测序技术检测不同组细胞中6种目的基因启动子区的甲基化水平,qPCR及Western Blot法检测不同组细胞中6种目的基因的mRNA、蛋白表达水平;（3）qPCR检测分别沉默HPV16E6或E7后不同时间点（0、24h、48h、72h、96h）4 种 DNMTs 的 mRNA 表达水平;（4）MS-HRM检测分别沉默HPV16 E6或E7后的不同时间点6种目的基因启动子区的甲基化水平,qPCR检测分别沉默HPV16 E6或E7后的不同时间点6种目的基因的mRNA表达水平。结果:（1）将HPV16E6/E7转入HFKs后,4种DNMTs的mRNA及蛋白表达水平均发生不同程度升高;而分别沉默肿瘤细胞中的HPV16 E6或E7后,4种DNMTs的mRNA表达均发生不同程度下降。（2）将HPV16E6/E7转入HFKs后,MT1G、RRAD、TFPI2启动子区甲基化水平明显升高,mRNA及蛋白表达水平下降,SPARC、SFRP1、NMES1启动子区的甲基化水平及mRNA、蛋白表达水平变化不明显;而分别沉默肿瘤细胞中的HPV16E6或E7后,6种目的基因启动子区的甲基化水平均明显下降,mRNA表达水平均显着升高。结论:HPV16E6/E7可通过影响DNMTs的表达,调控目的基因启动子区的甲基化,进而影响其表达,参与细胞的恶性转化。第三部分永生化及肿瘤细胞的全基因组DNA、RNA及甲基化测序目的:全面观察永生化过程中全基因组DNA序列、全基因组RNA及DNA甲基化变化情况,及永生化细胞与肿瘤细胞在以上方面的差异,筛选并发现在细胞永生化及最终肿瘤细胞形成过程中发挥不同功能的通路及目的基因,为进一步研究基因的功能奠定基础。方法:对Blank,A1、A15、A30,SiHa、CaSki进行全基因组DNA测序、甲基化测序、转录组测序。结果:（1）在细胞永生化过程中,非同义突变较少,DNA变异程度低;HPV16 E6/E7 HFKs与肿瘤细胞间有300多个非同义突变,DNA变异程度高。（2）在细胞发生永生化的过程中,随着传代次数的增加,其与肿瘤细胞之间甲基化差异呈缩小趋势。但传至30代时,永生化细胞与肿瘤细胞之间依旧存在较大差异。（3）筛选出细胞永生化过程中甲基化差异明显的基因及富集通路。（4）筛选出永生化细胞与肿瘤细胞间甲基化差异明显的基因及富集通路。结论:随着传代次数的增加,HPV16E6/E7HFKs与肿瘤细胞之间的甲基化差异呈缩小趋势,传至30代时,两者之间依旧存在较大差异。在细胞永生化过程中,DNA甲基化可能是一个连续且逐步发展的过程。筛选在细胞永生化及恶性转变过程中通过DNA甲基化修饰发挥关键作用的基因及通路。在细胞永生化过程中,未发现有意义的DNA突变,HPV16 E6/E7引起的DNA甲基化可能发挥了关键作用。在细胞癌变的过程中,DNA突变及甲基化可能都发挥了不可或缺的作用。
王大虎[2]（2011）在《端粒酶和PinX1基因在食管癌中的表达及生物学意义》文中进行了进一步梳理目的:食管癌（esophageal carcinoma, EC）是全世界最常见的消化道恶性肿瘤之一,我国的食管癌发病率较高,河北省磁县更是食管癌的高发区,严重影响着人们的生活质量和生命健康。端粒、端粒酶在肿瘤细胞的永生化和演进中扮演重要角色。端粒酶的激活可以导致细胞无限制地增殖和肿瘤的发生。端粒（telomere）作为分子钟控制着人类细胞的复制与衰老,与细胞的寿命密切相关。正常细胞每次分裂,端粒DNA长度会缩短55～200 bp,经历多次分裂后缩短至其下限时,细胞最终凋亡或死亡。端粒酶（telomerase）是一种以自身RNA为模板的逆转录酶,其核心组分之一端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase , hTERT）是端粒酶发挥活化作用的重要途径,它的表达调控在端粒酶活性调节中起关键作用,是细胞呈现端粒酶活性的决定因素。已有大量研究发现,在恶性肿瘤的发生中存在有端粒DNA长度的缩短,并且端粒酶的激活维持了大多数组织的端粒长度,抵消了细胞分裂导致的端粒DNA消耗。说明端粒缩短在恶性肿瘤的演变中起重要作用。已有大量研究表明,人体正常细胞除少量细胞如精原细胞、胚胎细胞、干细胞外,大多数细胞的端粒酶几乎都是无活性的,而与之相反在绝大多数恶性肿瘤中端粒酶活性高表达,表达率高达90%以上。因此端粒酶的活化可能是恶性肿瘤发生发展的多种基因改变中起到了至关重要的作用,并且可以作为最具普遍性和特异性的肿瘤分子标记物,在肿瘤的诊断和治疗中具有重要的地位。而抑制端粒酶的活性,将有可能阻止肿瘤细胞恶性增殖,这种特性使端粒酶成为当今肿瘤诊治研究的热点。本实验利用了多项实验方法检测端粒DNA长度、端粒酶hTERT蛋白含量及细胞内DNA含量在食管癌高发区现场人食管癌、异型增生及正常食管的表达,探讨与食管癌发生及生物学行为的关系,试图为食管癌的早期诊断提供客观参考指标,并为揭示食管癌的发生、发展的机制提供理论依据。采用端粒重复序列扩增反应（TRAP）-ELISA和TRAP -银染法半定量技术,检测食管癌及异型增生组织中端粒酶活性的表达,探讨端粒酶活性与食管癌发生发展及其与临床病理因素的关系。PinX1基因作为端粒酶的内源性抑制基因,近年来被认为是一种潜在的抑癌基因,其表达可能与多种肿瘤的发生发展有关。有实验证实在胃癌、大肠癌及白血病患者中PinX1表达明显下降,端粒酶活性增强。但是也有研究显示PinX1在肝癌细胞中的表达与正常组织无显着差异,而与之相应的是此类肿瘤中大部分端粒酶活性也增强。目前PinX1基因在肿瘤细胞中的作用和对端粒酶活性的调控及在细胞癌变中的机制尚不十分清楚。有关PinX1基因在食管癌中的研究国内外也鲜有报道。PinX1基因的作用越来越引起人们的重视,但到目前为止,PinX1基因在食管癌中生物学意义、作用机理国内外的报道很少,并且没有适合研究PinX1基因的食管癌细胞模型。由于基因转染已经成为治疗肿瘤等基因表达异常的有效手段,那么,通过外源性过表达PinX1基因能否抑制食管癌细胞的增殖?是否可以抑制端粒酶活性?本实验中利用多项技术,应用细胞模型研究PinX1在人食管癌、异型增生组织及正常食管组织中的表达,探讨PinX1与食管癌发生发展及与食管癌临床分期、病理分型及预后的相关性,并分析与端粒酶活性表达的相关性。研究转染PinX1基因前后细胞增殖凋亡等的变化,初步了解该基因对食管癌细胞的生物学影响。同时我们应用TRAP-ELISA和TRAP-银染法检测转染前后Eca109细胞端粒酶活性的变化,进一步探讨PinX1基因与端粒酶的关系。方法:1端粒DNA长度及端粒酶hTERT在食管癌高发区人群中的表达及生物学意义收集采集自河北省磁县食管癌高发区现场的咬检组织1000例,所有患者未接受过化疗和放疗。从中选取130例,根据病情分为3组,第1组为正常食管组织36例,第2组为异型增生组织50例,第3组为食管鳞癌组织44例。经病理组织学诊断,50例异型增生食管粘膜组织中,22例为轻度增生组织,28例为重度增生组织;44例食管鳞状细胞癌中,20例为高分化鳞癌、11例为中分化鳞癌,13例为低分化鳞癌,25例侵及纤维膜及周围软组织,19例未侵及纤维膜;20例为淋巴结转移,24例为无淋巴结转移。采用流式细胞术方法（flow cytometry, FCM）和免疫组织化学方法（immunohistochemistry, IHC）检测测端粒DNA长度、端粒酶hTERT蛋白含量及细胞内DNA含量在食管癌高发区现场人食管癌、异型增生及正常食管的表达,分析与食管癌发生及与临床病理特征的关系。2食管癌中的端粒酶活性和PinX1的表达及其生物学意义收集食管鳞状细胞癌手术切除标本130例,每例标本分别取癌组织、癌旁组织（距癌边缘2-5cm）及手术切缘正常食管粘膜（距癌边缘5cm以上）。从中选取50例食管鳞状细胞癌、异型增生及正常食管粘膜组织。经病理组织学诊断,50例食管鳞状细胞癌,39例为高中分化鳞癌,11例为低分化鳞癌,34例侵及纤维膜,16例未达到纤维膜,17例淋巴结转移,33例未转移。采用逆转录聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR）、流式细胞术方法（flow cytometry, FCM）、TRAP-ELISA和TRAP-银染法检测食管癌组织、异型增生、正常粘膜组织中端粒酶活性和PinX1基因和蛋白的表达,分析端粒酶活性和PinX1表达与食管癌临床病理特征的关系。3基因转染PinX1对食管癌Eca109细胞增殖和凋亡以及端粒酶活性的影响利用分子生物学技术构建pCDNA3.1（+）-PinX1重组质粒。采用脂质体转染方法将pCDNA3.1（+）-PinX1重组质粒转染Eca109细胞,同时也设置空载体pCDNA3.1转染组。转染72小时后用G418进行稳定转染细胞的筛选,筛选出来的阳性细胞分别命名为Eca109/PinX1、Eca109/pCDNA3.1细胞。应用激光共聚焦方法测定转染效率,MTS方法检测过表达PinX1对Eca109/ PinX1、Eca109/pCDNA3.1、Eca109细胞生长抑制作用。FCM方法检测细胞生长周期和细胞凋亡。RT-PCR、FCM、Western-blot方法检测Eca109/PinX1、Eca109/pCDNA3.1、Eca109细胞中PinX1基因及蛋白的表达,TRAP-ELISA和TRAP-银染法检测端粒酶活性在细胞中表达。结果:1端粒DNA长度及端粒酶hTERT在食管癌高发区人群中的表达及生物学意义FCM检测端粒长度结果显示,端粒DNA长度在食管癌组织中表达量与正常食管组织相比明显缩短,在食管正常组织、异型增生组织、癌组织的表达量呈现逐渐降低趋势（P<0.01）;端粒DNA长度在食管轻度增生、重度增生之间呈逐渐降低趋势,重度增生组与轻度增生组相比明显缩短（P<0.01）,轻度增生组与正常组比较无显着性差异（P>0.05）。随着细胞学分级增高,端粒DNA长度Q-FISH值逐渐降低,端粒DNA长度与细胞学分级呈负相关（r=-0.79, P <0.01）。FCM检测端粒酶hTERT基因蛋白含量,在癌、重度增生、轻度增生和正常食管的FI值分别为1.84±0.21、1.39±0.24、1.13±0.19和0.87±0.18,癌组hTERT含量高于重度增生组（P <0.01）、重度增生组高于轻度增生组（P<0.01）,轻度增生组与正常组相比无显着性差别。随着细胞学分级增高, hTERT的FI值随之升高, hTERT蛋白含量与细胞学分级呈正相关关系（r=0.83, P<0.01）。根据FI值>1.0为阳性表达的判断标准,轻度增生组、重度增生组和癌组hTERT蛋白阳性表达率分别为68.18%、92.86%和95.45%,重度增生组和癌组的表达率都高于轻度增生组（P<0.01）。FCM检测正常组、轻度增生组、重度增生组和癌组细胞DNA含量,DI值分别为1.03±0.34、1.06±0.28、1.17±0.25和1.54±0.37,正常组、轻度增生组和重度增生组的DI值呈上升趋势（P>0.05）,癌组的DI值明显高于重度增生组。DI值与细胞学分级正相关（r=0.62, P<0.01）;正常组、轻度增生组、重度增生组和癌组DNA异倍体率分别为11.11（4/36）、9.09（2/22）、28.57（8/28）和81.82（36/44）,癌组异倍体率高于重度增生组（P<0.01）,重度增生组高于轻度增生组（P<0.05）;从正常组到癌组PI值分别为10.98±4.11、14.15±4.76、18.97±5.27和28.79±5.47,随着细胞学分级的升高,PI值增大,癌组显着高于重度增生组（P<0.01）,重度增生组高于轻度增生组（P<0.05）。PI值与细胞学分级正相关（r=0.64, P<0.01）。130例食管样本的DI值与PI值高度正相关（r=0.76, P<0.01）;端粒长度Q-FISH值与端粒酶hTERT蛋白FI值负相关（r=-7.49, P<0.01）;端粒Q-FISH值与DI值负相关（r=-0.41, P<0.01）。IHC结果显示:端粒酶hTERT蛋白阳性颗粒呈棕黄色,阳性物质全部位于上皮细胞和癌细胞的核内。在异型增生组织,端粒酶hTERT蛋白的阳性表达部位主要集中在基底细胞层及其上方的细胞核内,随着食管黏膜上皮增生程度的加重,hTERT阳性细胞逐渐增多,阳性细胞带上移。正常食管粘膜组织中阳性表达率为11.1%（4/36）,异型增生组织和癌组织hTERT蛋白阳性表达率分别为44.0%（22/50）和86.37%（38/44）。三者阳性率比较,癌组织显着高于异型增生组织（P<0.01）,异型增生组织高于正常上皮组织（P<0.01）。2食管癌中的端粒酶活性和PinX1的表达及其生物学意义端粒酶活性检查结果显示,在食管癌、异型增生和正常食管组织中,阳性表达率分别为84.0%、62.0%及6.0%,食管癌及异型增生组织与正常食管粘膜比较具有显着统计学差异（P<0.05）。端粒酶活性的平均A值分别为食管癌组织1.457±0.838、食管异型增生组织0.429±0.346和正常食管粘膜组织0.073±0.039。三组间两两比较端粒酶活性的平均A值均存在高度显着统计学差异（P<0.05）。按正常食管粘膜组织、食管异型增生组织和食管鳞癌组织的序列,端粒酶阳性表达率和平均A值依次明显增高。食管癌组织中端粒酶阳性表达率与组织学分级和淋巴结转移无关,而端粒酶活性的平均A值与组织学分级和淋巴结转移有关;食管癌组织中端粒酶阳性表达率及端粒酶活性的平均A值与其他临床病例因素如年龄、性别和浸润深度等无关。RT-PCR及FCM检测PinX1结果显示,PinX1 mRNA及蛋白在食管癌组织中表达均显着低于食管正常粘膜（P <0.01）,在食管正常粘膜、异型增生、癌组织之间呈现逐渐降低趋势（P <0.05）。食管癌组织中,PinX1 mRNA和蛋白与分化程度、浸润深度及有无淋巴结转移密切相关（P <0.05）,与性别和年龄无明显相关（P >0.05）。食管癌组织中端粒酶活性表达与PinX1蛋白表达呈负相关性（rs =-0.883,P=0.000）。3基因转染PinX1对食管癌Eca109细胞增殖和凋亡以及端粒酶活性的影响应用脂质体转染方法,将pCDNA3.1（+）-PinX1重组质粒及空载体pCDNA3.1成功转染入Eca109细胞中,并应用G418成功筛选出稳定转染细胞,转染pCDNA3.1- PinX1重组质粒与空载体pCDNA3.1的阳性克隆细胞分别记为Eca109/ PinX1、Eca109/pCDNA3.1细胞。MTS法测定增殖情况结果显示,转染PinX1基因后,Eca109细胞生长明显减慢（P<0.05）;而Eca109细胞与仅转染入空载体的Eca109细胞生长比较,两者无明显差异（P>0.05）。FCM测定细胞生长周期实验结果显示,转染PinX1基因的Eca109细胞的G0/G1期细胞数（%）为70.58±5.26,明显高于未转染或仅转染空载体的食管癌Eca109细胞的G0/G1期细胞数（%）（分别为53.14±4.83及47.27±3.73）（P<0.05）。说明转染PinX1基因后,细胞的增殖明显变慢,细胞生长阻滞于G0/G1期（Fig. 3-9）。FCM测定细胞凋亡实验结果显示,流式细胞仪检测细胞凋亡表明:转染PinX1基因的Eca109细胞的凋亡率（%）为23.28±5.73,明显高于未转染或仅转染空载体的食管癌Eca109细胞的凋亡率（%）（分别为0.27±0.18及3.40±1.09）（P<0.05）。说明转染入PinX1基因后,细胞发生早期凋亡改变。RT-PCR、Western-blot和FCM检测结果显示,Eca109/ PinX1细胞中PinX1 mRNA和蛋白表达水平较Eca109/pCDNA3.1、Eca109细胞显着升高（P <0.05）。细胞端粒酶活性的检测结果显示,转染PinX1基因后,细胞端粒酶活性明显降低（P<0.05）。转染前后Eca109中端粒酶活性表达与细胞增殖指数（PI）表达呈正相关性（rs=0.451,P=0.000）。结论:1端粒DNA长度在食管癌前细胞及癌细胞中明显缩短,并且随病变程度加重而递减。端粒酶hTERT、细胞内DNA含量和PI值在食管上皮癌变发生中明显递增,提示食管癌变与三者密切相关。端粒DNA长度、端粒酶hTERT在食管癌前病变早期即出现变化,可以做为监测食管癌发生发展的参考指标。端粒酶hTERT与食管癌的临床病理特征无关,不能做为食管癌病人预后的指标。端粒缩短、端粒酶hTERT高表达都与食管癌变密切相关,有望以上述二者为靶点指导抗肿瘤的基因治疗。2食管癌及异型增生组织中存在端粒酶活性表达,并存在量的差异。端粒酶活性在异型增生即呈现高表达,随着病变的加重,端粒酶活性依次显着增高,提示端粒酶参与了食管癌的发生与发展,端粒酶的激活是食管癌的早期事件。端粒酶可望成为食管癌的病情监测及早期诊断的生物学指标。端粒酶活性A值与食管癌的组织学分级和淋结转移有关,提示食管癌端粒酶活性A值可作为判断疗效和评价预后的指标。PinX1在食管癌组织中表达显着低于食管正常组织,在食管正常组织、异型增生组织、癌组织之间呈现逐渐降低趋势。PinX1在食管癌中表达和病理分级呈负相关,分级越高,PinX1表达越低。浸润深度达到纤维膜者、有淋巴结转移者的PinX1表达要低于浸润深度未达到纤维膜者、无淋巴结转移者。认为PinX1是一种潜在的食管癌相关基因,检测PinX1的表达水平可能对评价食管癌恶性程度、转移潜能和预后评估有重要的临床价值。食管癌组织中端粒酶活性与PinX1表达呈显着负相关性,证实PinX1抑制端粒酶活性。3首次应用脂质体转染方法建立食管癌细胞株Eca109/PinX1,目前国内外文献尚未见相关报道。Eca109细胞转染PinX1基因后,细胞的增殖明显变慢,细胞生长阻滞于G0/G1期,细胞发生早期凋亡改变。Eca109细胞转染PinX1基因后,端粒酶活性明显降低,并且端粒活性与细胞增殖指数呈显着正相关,考虑在食管癌细胞中PinX1基因通过降低端粒的活性,减弱细胞的增殖,有望成为食管癌治疗的分子靶点。
罗琼[3]（2009）在《HPV16E6、E7蛋白和端粒酶在宫颈上皮内瘤变发展中的表达及意义》文中研究说明目的:研究HPV16 E6、E7蛋白和端粒酶在宫颈上皮内瘤变和宫颈癌组织的表达,探讨其与宫颈癌前病变的恶性进展之间的关系,为下一步寻找预测宫颈癌前病变转归方向的分子指标做一探索。方法:采用免疫组织化学Elivision法检测30例原发性浸润性宫颈癌（ICC）,90例宫颈上皮内瘤变（CIN）,包括CINⅠ-Ⅱ60例,CINⅢ（含原位癌）30例,10例正常宫颈组织标本中HPV16E6、E7蛋白和端粒酶的表达。实验数据的统计方法:计数资料采用χ2检验、Fisher确切概率法,强度等级资料采用秩转换的非参数检验（Kruskal-Walls H检验）,相关性检验采用Spearman相关分析。结果:1. HPV16E6蛋白在正常宫颈、CINⅠ-Ⅱ、CINⅢ和浸润性宫颈癌（ICC）组织中的阳性表达率分别为20.0%、35.0%、70.0%和86.7%,呈逐渐增高趋势。HPV16E6蛋白的表达强度ICC高于其它组织（P<0.05）,CINⅢ高于CINⅠ-Ⅱ和正常宫颈（P<0.05）; CINⅠ-Ⅱ、正常宫颈之间无明显差异（P>0.05）。2. HPV16E7蛋白在正常宫颈、CINⅠ-Ⅱ、CINⅢ和浸润性宫颈癌（ICC）组织中的阳性表达率分别为30.0%、63.3%、76.7%,96.7%,呈逐渐增高趋势。HPV16E7蛋白的表达强度ICC高于其它组织（P<0.05）,CINⅢ高于CINⅠ-Ⅱ和正常宫颈（P<0.05）,CINⅠ-Ⅱ高于正常宫颈（P<0.05）。3.端粒酶在正常宫颈、CINⅠ-Ⅱ、CINⅢ及浸润性宫颈癌中的阳性表达率分别为30.0%、41.7%、70.0%,93.3%,呈逐渐增高趋势。端粒酶的表达强度ICC高于其它组织（P<0.05）,CINⅢ高于CINⅠ-Ⅱ和正常宫颈（P<0.05）; CINⅠ-Ⅱ、正常宫颈之间无明显差异（P>0.05）。4. HPV16E6、E7蛋白和端粒酶在宫颈病变组织中表达的相关性:HPV16 E6与HPV16E7蛋白的表达呈正相关（rs =0.272,P<0.05）;HPV16E6蛋白与端粒酶的表达呈正相关（rs =0.279,P<0.05）;HPV16E7蛋白与端粒酶在宫颈病变组织中的表达呈明显正相关（rs=0.376,P<0.01）。结论:1.HPV16E6、E7蛋白和端粒酶随宫颈病变CIN的升级而阳性表达率、表达强度呈逐渐递增趋势。2.在宫颈癌变过程中HPV16E6、E7蛋白和端粒酶的阳性表达均呈正相关关系。3. HPV16E6、E7蛋白和端粒酶可能作为CIN的预后因子还需做进一步研究。
彭新荣[4]（2008）在《提高牛体细胞核移植效率的研究》文中研究指明为提高牛体细胞核移植和生产转基因动物的效率,本研究主要从囊胚发育率,囊胚细胞数和囊胚细胞凋亡指数三个方面研究了供体细胞转染端粒酶和癌化对体细胞核移植的影响,卵母细胞胞质成熟与重构胚胎发育的关系,激活方法与重构胚发育的关系,以及核移植胚胎体外培养与胚胎发育和冷冻的关系。试验研究结果如下。1、本研究首先用含人端粒酶催化亚基（hTERT）基因和报告基因EGFP的表达载体转染了牛耳成纤维细胞系,通过RT-PCR,端粒酶活性分析和Western杂交证明hTERT可以整合在牛耳成纤维细胞基因组中并表达端粒酶蛋白,人的端粒酶基因与牛的端粒酶相关基因可以互相协作,表达端粒酶蛋白。hTERT在牛耳成纤维细胞中的表达延长了细胞寿命,建立了一株染色体条带正常,贴壁生长的牛耳成纤维细胞系,命名为HBC3。2、HBC3的生长曲线仍保持正常细胞的生物学特性,EGF和胰岛素对HBC3仍有明显的促生长作用,添加EGF和胰岛素后细胞的倍增指数分别为5.1和4.7,其中EGF的促生长作用比胰岛素促生长的作用显着（P <0.05）。HBC3细胞系仍需依赖血清维持生长。但是,端粒酶的表达明显降低了血清引起的细胞凋亡,流式细胞仪进行细胞凋亡分析,结果表明,第64代的HBC3细胞凋亡率明显低于第12代的牛耳成纤维细胞（BFC）细胞,差异极显着（P <0.01）。3、HBC3做供体细胞的核移植重构胚可以发育到囊胚,重构胚的囊胚发育率与对照组差异不显着。但是,HBC3的重构胚囊胚细胞数显着少于用BFC构建的核移植胚胎,HBC3的囊胚细胞凋亡数和凋亡指数也明显少于BFC的重构胚,且差异显着（P <0.05）。4、致癌物DMBA与促癌物TPA联合作用BFC,得到两株寿命延长的细胞系,分别命名为ABF11和ABF12。ABF11的形态为长梭形,ABF12的形态为三角形,两株细胞系均有端粒酶活性,对ABF12进行了生物学特性分析,细胞在接种后,有较长的生长潜伏期,后进入对数生长期,但没有正常细胞的生长平台期,ABF12和BFC细胞系在分别在含血清的培养液生长9天的倍增指数分别为5.3和4.3,差异显着（P <0.05）,试验结果表明ABF12细胞系已经失去了细胞接触生长抑制性。传代后ABF12和BFC细胞系在无血清的培养液里生长9天的倍增指数分别为5.0和-1.2,结果表明ABF12已经失去了对血清的生长依赖性。用软琼脂培养ABF12细胞系14d, ABF12在软琼脂内生长了172个单细胞克隆,结果表明ABF12细胞已经失去了贴壁依赖性。5、ABFE12细胞用于体细胞核移植后,能支持胚胎发育至囊胚阶段,但囊胚发育率低于对照组,差异显着（P <0.05）。通过染色分析,ABF12重构胚的囊胚细胞数与对照组差异不显着,但囊胚细胞的凋亡指数明显高于对照组,二者分别为0.124和0.081,差异显着（P <0.05）。6、牛卵母细胞成熟培养液中添加EGF显着提高了牛卵母细胞成熟率,用EGF培养的卵母细胞在做为受体胞质进行体细胞核移植后,体细胞重构胚的囊胚率和囊胚细胞数均显着高于不添加EGF的对照组（P <0.05）。凋亡染色分析表明,EGF培养的卵母细胞做受体后,重构胚胎的凋亡指数为0.062,比对照组显着降低（P <0.05）。培养液中添加EGF的卵母细胞在冷冻保存和体外受精后,卵母细胞的形态正常率、受精胚胎的卵裂率和囊胚率均显着高于对照组。牛卵母细胞成熟培养液中添加VE后,牛卵母细胞成熟率和重构胚的囊胚率与对照组相比均差异不显着。凋亡染色分析表明,用VE培养的卵母细胞做受体胞质,重构胚胎的囊胚细胞凋亡指数为0.064,与对照组相比,显着降低了（P <0.05）囊胚细胞的凋亡指数。而用VE培养的卵母细胞冷冻保存后,卵母细胞的形态正常率,体外受精胚胎的卵裂率和囊胚率均与对照组差异不显着。牛卵母细胞成熟培养液中添加OCS后,牛卵母细胞成熟率显着高于添加FBS培养组（P <0.05）,用OCS成熟培养的卵母细胞做胞质受体,进行体细胞核移植后,重构胚的囊胚率显着高于添加FBS的卵母细胞组（P <0.05）。囊胚细胞染色分析表明,OCS组的囊胚细胞数显着高于FBS卵母细胞组（P <0.05）,凋亡染色分析表明,OCS组的囊胚细胞凋亡指数为0.072,显着低于对照FBS组。而且,培养液中添加OCS的卵母细胞在冷冻保存和体外受精后,受精胚胎的卵裂率和囊胚率均显着高于对照FBS组（P <0.05）。7、比较了不同浓度精子提取物胞质内注射对牛核移植重构胚胎的卵裂率和囊胚率的影响,结果发现单独注射精子提取物可以很好的支持体细胞胞重构胚发育到囊胚阶段,其中注射5mg/ml精子提取物组的重构胚卵裂率和囊胚率均显着高于其他两个注射剂量组（P <0.05）。5mg/ml精子提取物组的囊胚细胞数显着高于其他试验组（P <0.05）,而5mg/ml精子提取物组的凋亡指数为0.071,显着低于其他组（P <0.05）。其次,比较了精子提取物联合其他激活方法使用与单独使用精子提取物激活对核移植胚胎的影响。结果表明,单独注射精子提取物或联合其他方法一起使用对体细胞核移植胚胎的的卵裂率,囊胚率,囊胚细胞数和囊胚细胞凋亡指数没有显着的影响。8、比较了传统的电激活和化学激活方法对核移植胚胎的影响,以及联合使用两种激活方法（电化学法）对核移植胚胎的卵裂率和囊胚率的影响,结果表明,电化学法激活核移植胚的卵裂率和囊胚率均显着高于单独使用电激活或化学激活方法。其次,比较了精子提取物与电化学方法对核移植胚胎的影响。这两种激活方法的卵裂率和囊胚率差异不明显,但是精子提取物激活的重构胚的囊胚细胞数明显要高于电化学法（P <0.05）,精子提取物法的囊胚凋亡指数也明显（P <0.05）低于后者。9、在牛体细胞核移植胚胎培养液中添加20ng/ml EGF,重构胚的囊胚发育率为34%,显着高于不添加EGF的对照组（P﹤0.05）。添加EGF的胚胎的囊胚细胞凋亡指数为0.062,显着低于对照组的细胞凋亡指数。对EGF组和对照组的胚胎进行冷冻保存并解冻培养,EGF组胚胎在解冻24h后的存活率显着高于对照组（P﹤0.05）,在解冻48h后的存活率也显着高于对照组（P﹤0.05）。在牛体细胞核移植胚胎培养液中分别添加0.1μg/ml和1μg/ml孕酮后均显着提高了重构胚的囊胚发育率均显着高于对照组21%的囊胚率。添加0.1μg/ml和1μg/ml孕酮组的细胞凋亡指数分别为0.090和0.085,两组之间的胚胎细胞凋亡数和凋亡指数均差异不显着,与对照组相比差异也不显着。不同孕酮组胚胎在解冻24h后的存活率与对照组差异不显着。在解冻48h后的存活率与对照组差异不显着。在牛体细胞核移植胚胎培养液中添加100μg/ml抗氧化剂VE并没有对核移植胚胎的卵裂率产生不利影响。添加VE显着提高了重构胚胎的发育率,降低了囊胚的凋亡指数,对照组的细胞凋亡指数为0.090,VE组为0.037,差异极显着（P﹤0.01）。10、首先,分别在核移植胚胎的冷冻保存液中添加海藻糖和蔗糖,用海藻糖冷冻的胚胎解冻后24h和48h的存活率显着（P﹤0.05）高于添加蔗糖的试验组。其次,分别对不同发育时期的核移植重构胚胎进行冷冻保存。解冻后桑胚的24h和48h的胚胎存活率显着（P﹤0.05）低于早期囊胚组和晚期囊胚组。
金蕊[5]（2008）在《端粒酶催化亚基核仁定位的调控机制及其生物学意义研究》文中指出端粒酶逆转录酶hTERT是端粒酶复合物的核心成分之一。hTERT基因异常表达是人类细胞癌变的一个关键步骤,是造成肿瘤细胞端粒酶重新活化、端粒长度稳定性和永生化的原因。近年的研究揭示,细胞癌变不仅造成hTERT基因的异常表达,而且也使这一蛋白在细胞中的分布定位行为发生了改变。在正常原代细胞中表达的hTERT主要是聚集在细胞核的核仁结构中,但在发生转化或肿瘤细胞中,hTERT则主要弥散分布在细胞核的核仁外区域,而染色体DNA发生损伤则能诱导肿瘤细胞中核仁外分布的hTERT聚集到核仁中。这些现象提示调控hTERT核仁定位的过程对细胞癌变及肿瘤细胞的生存有影响。但目前关于调控hTERT核仁定位的结构基础、分子机制及相应的生物学意义并不清楚。在我们实验室前期的研究中鉴定出hTERT的965-981位氨基酸是介导其核仁定位的一个必需的核仁定位信号（C-NTS）,这一核仁定位信号与以往在hTERT的N端发现的核仁定位信号不同,它的突变将导致hTERT完全丧失核仁定位能力。在此基础上,本论文进一步探讨调控hTERT核仁定位的分子机制及其生物学意义的研究。在调控hTERT核仁定位的细胞生物学意义上目前存在的主要争论是这一过程本身是否与细胞内端粒酶复合物组装成熟和端粒酶发挥端粒DNA复制功能所必需的一个步骤。为阐明这一问题,我们将野生型的hTERT及丧失核仁定位能力的hTERT突变体hTERT-3A转入到正常的人成纤维细胞BJ细胞及端粒酶阴性的肿瘤细胞U2os细胞中,发现与野生型hTERT一样,完全丧失了核仁定位能力的hTERT-3A的表达同样能激活正常细胞及端粒酶阴性的肿瘤细胞的端粒酶活性。我们的实验结果首次证明了hTERT蛋白的核仁定位运输无论在正常细胞还是在肿瘤细胞都不是体内端粒酶复合物组装的必需环节,提示端粒酶的组装过程可以发生在核仁外的其它区域。随后我们又利用稳定表达hTERT及hTERT-3A的BJ细胞来研究hTERT核仁定位调控对端粒酶稳定端粒长度及促细胞永生化能力的影响。结果发现hTERT核仁定位行为的丧失并不影响端粒酶发挥其稳定端粒长度和促细胞永生化的功能。以上结果表明hTERT核仁定位行为的调节与细胞端粒酶活性调控、端粒酶稳定端粒DNA以及端粒酶的细胞永生化生物学效应无关。由于DNA损伤能够诱导肿瘤细胞中的核仁外分布的hTERT重新聚集到核仁,提示了调控肿瘤细胞hTERT的核仁定位与肿瘤细胞的DNA损伤反应有密切关系。但这种行为的调控机制和生物学意义目前还是未知的。首先我们对DNA损伤诱导的hTERT核仁聚集的调控机制进行了初步的研究。通过研究我们发现诱导hTERT核仁聚集是肿瘤细胞特异针对染色体双链DNA损伤的一种细胞学反应,而且这种DNA损伤诱导的hTERT核仁聚集在肿瘤细胞中具有普遍性。将目前发现的各种hTERT核仁定位结构域的突变体经DNA损伤药物处理然后比较它们的核仁聚集情况发现,对DNA损伤诱导的hTERT核仁聚集起决定性作用的结构域位于我们发现的hTERT的C-NTS。我们进一步揭示出双链DNA损伤诱导的hTERT核仁聚集依赖于ATM,而与p53无关。通过对hTERT蛋白结构与功能的进一步研究,我们鉴定出了hTERT C端aa932-953氨基酸序列是DNA损伤诱导其核仁定位的一个反应性调控元件。这一反应性元件位于我们先前鉴定出的hTERT C端核仁定位信号上游附近,并富含多个潜在磷酸化氨基酸残基。缺失aa932-953氨基酸序列或对其中三个潜在磷酸化位点的点突变都能造成hTERT完全丧失对DNA损伤诱导其核仁定位的反应。这一反应性调控元件的鉴定为我们进一步揭示出肿瘤细胞DNA损伤反应中调控hTERT核仁定位的信号途径及分子机制提供了有力条件。在对DNA损伤诱导的hTERT核仁聚集的调控机制进行初步研究的同时,我们又展开了对hTERT核仁聚集在肿瘤细胞DNA损伤反应中的细胞生物学意义的研究。证明肿瘤细胞DNA损伤反应过程中,hTERT的诱导性核仁聚集与其蛋白稳定性及端粒酶催化活性的调控无关。而最有意义的发现是,hTERT核仁聚集对细胞DNA损伤反应机制存在一种主动性的调控作用。通过对稳定转染野生型hTERT和hTERT-3A突变体的肿瘤细胞在DNA损伤刺激中胞内ATM、H2AX及53BP1DNA损伤分子的磷酸化灶性（foci）活化情况的检测,我们发现与稳定表达丧失DNA损伤诱导核仁定位反应能力的hTERT-3A突变体的细胞相比,稳定表达野生型hTERT细胞在DNA损伤反应中胞内ATM、H2AX及53BP1的磷酸化灶性（foci）的数目及强度显着降低。与此现象相对应的是,我们证明了稳定高表达野生型hTERT能显着提高肿瘤细胞DNA损伤反应中的短期和长期的生存能力,而突变体hTERT-3A则丧失抗DNA损伤诱导凋亡的细胞生物学效应。因此我们首次揭示出了hTERT核仁聚集具有抑制肿瘤细胞的DNA损伤反应的生物学效应,并与促进肿瘤细胞在这种应激反应中的生存有关。端粒稳定性在肿瘤发生发展中的重要作用也使端粒功能的靶向性抑制成为目前抗肿瘤治疗的一个新策略。大量研究已经证明各种因素造成端粒功能障碍也是通过诱导DNA损伤反应途径来抑制肿瘤生长。我们因此通过靶向性抑制各种已知的端粒结构蛋白表达,研究在这些不同实验条件造成的端粒损伤反应中hTERT的诱导性核仁定位情况,结果发现了只有在抑制端粒双链结合蛋白TRF2表达造成的端粒损伤才具有诱导hTERT核仁定位的反应。有意义的是,我们同样证明了在这种端粒损伤中hTERT的核仁聚集也具有抑制细胞DNA损伤反应系统活化的生物学效应。最后我们还发现抑制肿瘤细胞中内源性hTERT表达能够造成肿瘤细胞DNA损伤反应系统的活化,为hTERT本身具有一种内在性的抑制细胞DNA损伤反应的新生物学效应提供了一个有力证据。我们的研究首次证明了端粒酶合成的场所并非在核仁,hTERT的核仁定位行为与端粒酶维持端粒长度并促细胞永生化的功能无关。并对DNA损伤诱导的hTERT核仁聚集的调控机制及其生物学意义进行了初步研究,取得了比较有意义的进展。这对深入了解细胞癌变的基础研究和肿瘤治疗的应用研究具有重要的理论和现实意义。
刘官智[6]（2008）在《人毛乳头细胞永生化的实验研究》文中研究说明背景:毛乳头细胞（dermal papilla cells, DPC）在毛囊形态发生、生长周期调控及维持毛发生长发育中起重要作用,并具有在体内外条件下重建毛囊的功能。DPC功能的异常变化是导致毛囊周期失衡和脱发现象的主要起始因素。对DPC生物学功能变化的调控机制进行深入研究对毛囊生物学和毛发疾病的研究都有重大的意义。随着生物工程技术的发展,组织工程皮肤的研究和应用得到长足进展,目前已有多种商品化产品出售并用于临床。但目前以成纤维细胞和角质形成细胞为种子细胞构建的组织工程皮肤没有毛囊等皮肤附属器官,在组织结构和功能上与正常皮肤组织仍有较大差异。利用DPC诱导毛囊形成的特性,将其作为种子细胞在组织工程皮肤上重建毛囊,形成含有毛囊结构的人工皮肤替代物,将极大提高创伤愈合的质量。但DPC标本不易获得,其在通常的体外培养条件下经过十几次的传代后会停止增殖,出现衰老和死亡,且随着体外培养传代次数增多会逐渐失去其固有的一些生物学特性和功能,极大地限制了其研究和应用。建立永生化细胞系是解决体外培养条件下细胞衰老的一种常用手段。然而,以往建立细胞系的方法大多是通过转染病毒基因或癌基因诱导细胞永生化,通过这些方法建立的细胞系有许多局限性:其基因整合是随机性的,转染获得的是转化细胞而非正常细胞,其表型、核型等可发生改变。且有的转化细胞系仅通过了M1期,寿命延长,而并非永生化。研究表明,端粒酶的激活可以延缓细胞衰老,甚至使细胞永生化。人端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase, hTERT）作为端粒酶的催化亚单位和限速酶,在端粒酶活性维持中起关键作用。将外源性hTERT基因转入目的细胞,可诱导细胞端粒酶活性,使细胞永生化。hTERT介导的永生化细胞系保留了更多正常细胞的生物学特征。另外,hTERT介导的永生化细胞系已逾越M2期,同胚胎干细胞一样,是真正意义上的永生化。为此,本研究将外源性hTERT基因导入体外培养的正常人DPC,拟建立永生化人DPC系,并进一步分析该细胞系的生物学和功能学特征,以期为DPC的基础研究和临床应用提供充足的、稳定的和正常的细胞来源。目的:1.建立永生化人DPC系。2.观察体外培养条件下该细胞系的生物学和功能学特征。3.观察该细胞系在体内诱导毛囊形成的能力。方法:1.采用我科建立的“酶消化法”分离培养正常人DPC,观察体外培养DPC形态和生长情况并行α平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）免疫组化染色鉴定。2.采用脂质体转染法,将空载体质粒pIRES2-EGFP和含有hTERT基因的质粒pIRES2-EGFP-hTERT分别导入体外培养的第3代正常人DPC,经G418筛选得到阳性克隆,连续传代培养。分别采用PCR和RT-PCR法检测转染细胞内hTERT基因的整合与表达,采用端粒酶重复序列扩增（TRAP）-ELISA法检测转染细胞的端粒酶活性。3.取转染pIRES2-EGFP-hTERT第30代DPC,在倒置显微镜下观察细胞形态和生长情况,采用免疫组化检测α-SMA在细胞内的表达,采用细胞生长曲线分析和细胞周期测定观察细胞的增殖特征,采用染色体核型分析、软琼脂克隆形成实验和裸鼠致瘤实验观察细胞的转化特征,采用ELISA法检测培养上清中血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）和肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor, HGF）浓度观察细胞的分泌功能。4.将转染pIRES2-EGFP-hTERT第30代DPC与刚分离的毛囊上皮细胞混合后直接注射到裸鼠背部皮下观察其在体内诱导毛囊形成的能力。结果:1.采用我科建立的“酶消化法”分离培养了正常人DPC,体外培养的DPC形态上类似成纤维细胞,单个细胞的形态呈梭形,体积较大,具有明显的多层凝集性生长特性,表达体外培养DPC的特异性标记物α-SMA。2.利用阳离子脂质体介导的基因转染技术,将空载体质粒pIRES2-EGFP和含有hTERT基因的质粒pIRES2-EGFP-hTERT分别导入体外培养的正常人DPC,经G418筛选3周后转染空载体质粒pIRES2-EGFP组和质粒pIRES2-EGFP-hTERT组各出现1个阳性细胞克隆,分别命名为DPC-EGFP和DPC-hTERT。滤纸片法将细胞克隆移至24孔板扩大培养后DPC-EGFP细胞生长增殖能力较差,传至12代后细胞发生衰老、死亡。而DPC-hTERT细胞扩大培养后生长良好,增殖能力强,现已连续传至65代,传代中细胞生长增殖速度无明显变化。检测发现DPC和DPC-EGFP细胞无hTERT基因的整合与表达,端粒酶活性为阴性;而DPC-hTERT细胞稳定整合与表达hTERT,同时端粒酶活性转为阳性。3. DPC-hTERT形态和生长特性与低代DPC基本相同,α-SMA免疫组化染色阳性,生长增殖活跃,无明显转化特征,染色体核型正常,在软琼脂内不能生长,无裸鼠致瘤性,具有正常DPC的分泌功能。4. DPC-hTERT与刚分离的毛囊上皮细胞混合后注射到裸鼠背部皮下能诱导内含较多细胞和色素颗粒的表皮囊肿结构形成。结论:1.我们利用阳离子脂质体介导的基因转染技术,将外源性hTERT基因导入体外培养的正常人DPC,成功地建立了永生化人DPC系DPC-hTERT。2. DPC-hTERT基本上是正常细胞而无明显转化特征,保持了正常人DPC的生物学和功能学特征。可望为深入研究DPC生物学功能变化的调控机制提供理想的细胞模型,为构建含有毛囊等附件的全功能组织工程皮肤提供充足的种子细胞。
姜成威[7]（2007）在《人端粒酶逆转录酶基因转染U2OS细胞对其基质金属蛋白酶-2活性的影响》文中研究指明目的:观察hTERT基因转染U2OS细胞对其基质金属蛋白酶2和9的影响,探讨hTERT基因和端粒酶的相关性。方法:RT-PCR和TRAP-ELISA法检测和明确对U2OS细胞hTERT基因的转染效果和转染阳性细胞克隆的筛选;明胶酶谱法和RT-PCR检测转染hTERT基因对细胞MMP-2,MMP-9表达和活性的影响。结果:hTERT基因转染U2OS细胞后,细胞成功的出现hTERT mRNA和明显的端粒酶活性（p<0.05）,使该细胞分泌酶原型MMP-（272KD）降低（p<0.05）,MMP-9完全消失。结论:hTERT稳定转染U2OS细胞克隆株,使细胞分泌酶原型MMP-9完全消失、酶原型MMP-2明显减少。但MMP-2在mRNA未见明显改变。
李力力[8]（2007）在《EB病毒致瘤蛋白LMP1调节p53功能活性的研究》文中认为鼻咽癌是中国南方高发的肿瘤，具有人种和人群的易感性、家族聚集现象、低分化和高转移为主的临床病理特征，并与EB病毒高度相关。其中EB病毒编码的潜伏膜蛋白LMP1是重要的致瘤蛋白，以鼻咽癌为切入点，我们多年的研究工作一直致力于LMP1介导的信号转导通路的研究。从建立LMP1可调控表达体系入手，以细胞内重要的信号转导分子NF-κB、AP-1、STAT作为枢纽，系统地研究了LMP1介导的信号转导通路异常以及由此产生的一系列生物学效应。p53是重要的抑瘤基因，作为细胞基因组稳定性的“守护神”（guardian），p53蛋白对细胞的存活具有双面性（double faces）：p53通过作用于受损细胞的细胞周期限制点，延缓细胞周期行进，以使细胞在DNA复制和细胞分裂前修复DNA损伤保证细胞高质量存活；但当DNA损伤超过细胞的修复能力时，则促使细胞进入凋亡。在50％以上的人类肿瘤中存在有p53的突变，p53功能的丧失是人类肿瘤发生发展过程中常见的分子事件。与其他肿瘤细胞不同的是，在鼻咽癌中p53基因的突变频率很低（＜10％），且出现了p53蛋白积聚的现象。临床样本的检测发现p53的过表达与鼻咽癌的发病密切相关，p53的表达在鼻咽癌组织和癌旁组织中显着的相关性提示p53的过表达出现在鼻咽癌癌变的早期发展阶段，且随着鼻咽癌病程的发展，p53的阳性表达率及表达强度均增加，与淋巴结的转移也具有一定的相关性。在构建的LMP1转基因小鼠中也发现p53的积聚现象。这些结果强烈提示我们：p53在鼻咽癌发生和发展过程中可能具有功能活性。我们前期的研究工作发现病毒致瘤蛋白LMP1通过调节p53表达的增加，导致细胞G2／M期行进过程中重要的正性调节因子cdc2／cyclin B1复合物激酶活性下降，使其停滞于G2／M期。这提示我们p53作为一个受EB病毒LMP1调控的关键转录因子在细胞周期调节中具有重要的功能。除此之外，已有研究表明LMP1通过p53上调抗凋亡基因A20，Bcl-2，Survivin和△NP63抑制凋亡的发生。故LMP1介导p53增加而不诱导肿瘤细胞发生凋亡。研究发现，LMP1通过调节p53从而稳定EB病毒的潜伏感染，促进上皮细胞的转化，有助于宿主和病毒之间平衡的维持。这为我们从一个新的视野来研究和理解p53在EB病毒感染中的病理生理学意义提供了新的启示。一直以来，关于EB病毒转化作用的研究都是在非鼻咽上皮来源和非上皮细胞来源的细胞中进行的，EB病毒感染和其编码的致瘤蛋白LMP1所参与的信号转导通路的研究局限于肿瘤细胞中完成，不能充分阐明癌变多阶段演进过程中的分子机理以及遗传因素和环境因素在癌变过程中的相互作用关系。在国家自然科学基金委与香港研究资助局联合科研资助基金（No．30418004）的资助下，我们引进了体外处于癌变早期阶段的实验模型平台：NP69、转染了空白载体pLNSX的NP69-pLNSX和转染了LMP1的NP69-LMP1细胞模型。因此，利用永生化的鼻咽上皮NP69细胞模型探讨肿瘤的发病机理是一个很好的切入点。我们首先对NP69细胞模型中p53的特征进行了研究，在该模型中证实有大量游离的、野生型的p53的存在，且LMP1不仅能促进p53的核积聚，同时还促进p53的转录活性和蛋白水平的表达。这为我们进一步利用该细胞模型研究致瘤蛋白LMP1调节p53功能活化的分子机制提供了重要的基础。p53翻译后修饰是其最主要的激活机制，其中一个重要的机制是磷酸化。近年来p53磷酸化对p53的功能活化取得了新的进展。已有将近18个p53的磷酸化位点得到阐明，它们分别位于p53功能结构域的N端、核心区和C末端，其中以N末端和C末端较为集中，不同的磷酸化位点参与p53转录活性、稳定性和抗凋亡功能的调节。但病毒致瘤蛋白LMP1对p53磷酸化的调节尚不清楚。从众多的p53磷酸化位点中，我们选取了N末端具有代表性的p53 Ser15、Ser20和Thr81，以及C末端的Ser392作为研究对象，来阐明p53的功能活性。蛋白的磷酸化需要一种或多种蛋白激酶的作用。丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路是由一组级联活化的丝／苏氨酸蛋白激酶组成，主要包括ERK1／2、JNK和p38激酶通路，MAPK对于细胞周期的运行和基因表达具有重要调控作用。已有研究表明在UV或DNA损伤等外界环境因素的刺激下，MAPK通路的活化能使p53多位点磷酸化。新近研究证实MAPK信号级联通路在LMP1介导的肿瘤发生发展中起着非常重要的作用。因此从翻译后修饰-磷酸化的水平来研究在LMP1的作用下p53激活的分子机制将为我们深入了解LMP1致瘤的病理生理功能提供重要的启示。利用NP69细胞模型为材料，通过本研究发现，LMP1能显着促进p53 Ser 15、Ser 20、Ser 392和Thr 81位的磷酸化，进一步确定LMP1主要通过ERK1／2信号通路调节p53 Ser 15位的磷酸化；通过JNK信号通路调节p53 Ser 20位和Thr 81位的磷酸化；通过p38信号通路调节p53 Ser 392位和Ser 15位的磷酸化。其中LMP1通过JNK信号通路调节p53 Ser 20位的磷酸化程度最为显着，而p53 Ser 15位的磷酸化以ERK1／2信号通路调节为主，这提示LMP1所致的JNK信号通路的激活在p53磷酸化的调控中是一条重要的信号。进一步我们证明，LMP1所致的MAPK多条通路的异常激活导致p53多个位点的磷酸化，使p53转录活性增加，同时影响下游基因p21、MDM2蛋白水平的表达，促进反式激活能力的增强。这些科学发现为阐明LMP1通过调节p53的磷酸化参与p53的功能活化提供了新的实验证据。p53翻译后修饰的另一个重要机制是泛素化，细胞外信号严格调控着目的蛋白的泛素化，而这种调控依赖于蛋白的磷酸化。蛋白的泛素化和磷酸化协同作用，相辅相成，精确调控细胞内的信号转导通路。p53的降解是泛素化依赖性的，主要受MDM2的介导。MDM2具有泛素连接酶（E3）的作用。我们的研究表明，EB病毒LMP1能减少MDM2与p53的结合能力，由此我们推测LMP1有可能通过泛素化的途径参与p53的功能活化。目前对泛素化的研究主要集中于Lys 48和Lys 63。与Lys 48结合的多泛素链（Ubk48），作为一种信号，介导泛素修饰底物进入26S蛋白酶体，执行降解功能；与Lys 63结合的多泛素链（Ubk63）介导的泛素化在DNA损伤修复、炎症反应、胞吞作用和核糖体蛋白的合成中起重要作用，而不依赖于经典的蛋白酶体的途径。通过本研究，我们发现LMP1通过MAPK信号通路调节p53的磷酸化介导Ubk63泛素分子和p53的结合，尤以JNK通路介导的p53 Ser 20、Thr 81位的磷酸化对其泛素化的调节最为显着，这与p53的稳定性和功能活性的调节密切相关。而p53的磷酸化能抑制Ubk48与p53的结合，促进p53稳定性的调节。因此，泛素分子Ubk48和Ubk63可能通过与p53的结合，执行不同的功能，在LMP1所致的p53中发挥重要功能。综上所述，本研究证实了EB病毒致瘤病毒LMP1调节p53的组成性磷酸化谱，明确了LMP1调节p53磷酸化的关键激酶，即MAPK信号通路，提出了工作模式图，证明了p53是受LMP1调控的重要转录因子，建立了LMP1→MAPK→p53的信号转导通路，证明了磷酸化是调节p53转录活性、反式激活和稳定性的重要修饰方式，确定了LMP1通过MAPK信号通路调节p53磷酸化与泛素化之间的相关性。因此，本研究首次从翻译后修饰—磷酸化和泛素化的角度阐明了EB病毒重要的致瘤蛋白LMP1调节p53的功能活性，这为阐明p53在鼻咽癌癌变过程中的重要生物学作用提供了重要的实验依据，为全面理解LMP1的致瘤功能提供了新的理论依据和开拓了新的视野，最终为鼻咽癌和EB病毒相关其它肿瘤抗癌药物和基因治疗靶点的选择创造了条件。
冯颖[9]（2007）在《人端粒酶反转录酶基因（hTERT）构建永生化软骨细胞可行性的研究》文中研究说明本实验将分子生物学和细胞工程学技术结合,通过逆转录聚合酶链式反应,从人胚肾293细胞株中提取出目的基因hTERT,并成功地构建了真核表达载体pcDNA3.1/ Zeo（+）-hTERT载体,在体外实验中,脂质体介导人端粒酶逆转录酶基因（hTERT）转染兔软骨细胞（chondrocyte）,研究目的基因在软骨细胞中的表达情况及对软骨细胞生物学性状的影响,探讨获取大量种子细胞的方法和技术。结果表明,转染后软骨细胞端粒酶表达量显着上升,细胞存活和增殖能力明显增强,细胞表型未发生转化,具备了正常软骨细胞的生物学特性,有可能成为软骨组织工程的种子细胞得以广泛利用。
张烜,张晓东,叶丽虹[10]（2006）在《乙型肝炎病毒X蛋白与端粒酶的关系》文中研究表明端粒（telomere）是真核细胞染色体末端的重复序列,对维持染色体的稳定性具有重要作用.端粒酶（telomerase）是维持端粒长度必需的一种逆转录酶,在细胞增殖、衰老、永生化和癌变等方面具有重要的作用.在肿瘤细胞中端粒酶发生明显变化,有较高水平的表达和很强的活性,成为肿瘤细胞的重要特征之一.乙型肝炎病毒（hepatitis Bvirus）X蛋白（HBx）与肝癌的发生密切相关,HBx可以通过多种途径发挥致癌作用,其中一个重要的分子机制,即激活人端粒酶反转录酶hTERT（为端粒酶的催化亚单位）使细胞发生永生化而癌变.因此,详细阐明HBx与hTERT的关系对于揭示乙肝病毒致癌机制具有重要的意义.本文对HBV的分子结构和HBx的分子生物学特性进行了详细的阐述,对HBx与hTERT及其调控因子的关系进行了归纳和总结,有助于进一步阐明HBx的致癌机制.
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
| 缩略语 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 参考文献 |
| 技术路线图 |
| 实验材料与仪器 |
| 1. 样本来源 |
| 2. 细胞、菌株及质粒 |
| 3. 实验动物 |
| 4. 主要试剂 |
| 5. 主要耗材与仪器 |
| 第一部分 永生化角质形成细胞的构建与鉴定 |
| 第一章 原代角质形成细胞的分离与培养 |
| 一、目的 |
| 二、方法 |
| 三、结果 |
| 本章讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 HPV16 E6/E7过表达慢病毒的合成 |
| 第一节 HPV16 E6/E7慢病毒重组质粒的构建与鉴定 |
| 一、目的 |
| 二、方法 |
| 三、结果 |
| 第二节 慢病毒的包装与滴度测定 |
| 一、目的 |
| 二、方法 |
| 三、结果 |
| 本章讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 永生化角质形成细胞模型的构建及鉴定 |
| 第一节 永生化角质形成细胞的构建及细胞收集 |
| 一、目的 |
| 二、方法 |
| 三、结果 |
| 第二节 永生化角质形成细胞的鉴定 |
| 一、目的 |
| 二、方法 |
| 三、结果 |
| 本章讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 HPV16 E6/E7对DNA甲基化的影响 |
| 第一章 细胞永生化过程中HPV16 E6/E7对DNA甲基化的影响 |
| 第一节 永生化过程中HPV16 E6/E7对DNMTs表达的影响 |
| 一、目的 |
| 二、方法 |
| 三、结果 |
| 第二节 永生化过程中HPV16 E6/E7对目的基因甲基化及表达的影响 |
| 一、目的 |
| 二、方法 |
| 三、结果 |
| 本章讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 肿瘤细胞中分别沉默HPV16 E6或E7对DNA甲基化的影响 |
| 第一节 肿瘤细胞中分别沉默HPV16 E6或E7对DNMTs的影响 |
| 一、目的 |
| 二、方法 |
| 三、结果 |
| 第二节 肿瘤细胞中分别沉默HPV16 E6或E7对目的基因甲基化及表达的影响 |
| 一、目的 |
| 二、方法 |
| 三、结果 |
| 本章讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 永生化细胞及肿瘤细胞的全基因组DNA、RNA及甲基化测序 |
| 一、目的 |
| 二、方法 |
| 三、结果 |
| 本章讨论 |
| 参考文献 |
| 总结与展望 |
| 相关综述 |
| 参考文献 |
| 发表论文 |
| 个人小结 |
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 端粒DNA 长度及端粒酶hTERT 在食管癌高发区人群中的表达及生物学意义 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 食管癌中的端粒酶活性和PinX1 的表达及其生物学意义 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 基因转染PinX1 对食管癌Eca109 细胞增殖和凋亡以及端粒酶活性的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 端粒、端粒酶和PinX1 与肿瘤的关系 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 前言 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1.主要材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 免疫组化结果判断 |
| 2.4 统计处理 |
| 第3章 结果 |
| 3.1 HPV16E6 蛋白、HPV16E7 蛋白和端粒酶在宫颈病变中的表达 |
| 3.2 HPV16E6、HPV16 E7 蛋白和端粒酶在不同宫颈组织表达中的相 关性 |
| 第4章 讨论 |
| 4.1 HPV16 E6 和 E7 蛋白在不同宫颈组织中的表达与意义 |
| 4.2 端粒酶在不同宫颈组织中的表达与意义 |
| 4.3 HPV16 E6、E7 蛋白和端粒酶在宫颈病变组织中表达的相关性 |
| 第5章 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 综述 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 体外培养细胞的永生化 |
| 1.1 永生化的概念和永生化细胞的特性 |
| 1.2 细胞永生化的机理 |
| 1.2.1 端粒、端粒酶与永生化 |
| 1.2.2 p16~(INK4a)-CDK4/6-cyclin D-Rb-E2F 信号通路与永生化 |
| 1.2.3 p14ARF－MDM2-p53 信号通路与永生化 |
| 1.2.4 表观遗传与永生化 |
| 1.3 细胞永生化的方法 |
| 1.3.1 理化因素 |
| 1.3.2 转染病毒 |
| 1.3.3 转染原癌基因 |
| 1.3.4 转染TERT 基因 |
| 1.3.5 其他 |
| 1.4 细胞癌变与永生化 |
| 1.5 永生化的应用以及存在的问题 |
| 1.5.1 细胞分化与肿瘤发生的分子机制研究 |
| 1.5.2 细胞治疗与生物人工器官 |
| 1.5.3 药物代谢与毒理研究 |
| 1.5.4 生产转基因动物中的潜在应用价值 |
| 第二章 影响体细胞核移植效率的因素 |
| 2.1 胚胎凋亡与体细胞核移植 |
| 2.1.1 胚胎凋亡的影响因素 |
| 2.1.2 胚胎凋亡的检测 |
| 2.2 供体细胞与体细胞核移 |
| 2.2.1 细胞的传代次数对核移植的影响 |
| 2.2.2 供体细胞的组织来源对核移植的影响 |
| 2.2.3 细胞周期阶段对核移植的影响 |
| 2.2.4 使核供体与受体卵母细胞相协调 |
| 2.2.5 核的重编程 |
| 2.3 卵母细胞成熟 |
| 2.3.1 卵母细胞成熟的形态变化 |
| 2.3.2 卵母细胞成熟的影响因素 |
| 2.3.3 卵母细胞成熟的调控因子 |
| 2.4 重构胚激活与体细胞核移植 |
| 2.4.1 物理激活 |
| 2.4.2 化学激活 |
| 2.4.3 精子提取物激活 |
| 2.5 胚胎培养与体细胞核移植 |
| 2.6 胚胎的冷冻保存 |
| 2.6.1 冷冻保护剂的种类 |
| 2.6.2 影响胚胎冷冻的其它因素 |
| 2.6.3 影响冷冻效果的其他因素 |
| 前言 |
| 第三章 人端粒酶催化亚基转染牛耳成纤维细胞 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 细胞来源 |
| 3.1.2 试剂与用品 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 原代细胞培养和G418 致死浓度筛选 |
| 3.2.2 脂质体法转染pEGFP-hTERT 基因 |
| 3.2.3 抗性细胞克隆的挑取和保存 |
| 3.2.4 RT-PCR 检测 |
| 3.2.5 端粒酶活性检测 |
| 3.2.6 Western Blotting 检测 |
| 3.2.7 细胞软琼脂生长分析 |
| 3.2.8 染色体条带分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 基因转染与阳性单克隆的挑选 |
| 3.3.2 RT-PCR 检测阳性细胞克隆在m RNA 水平的表达 |
| 3.3.3 细胞端粒酶活性的检测 |
| 3.3.4 细胞端粒酶催化亚基的Western Blotting 分析 |
| 3.3.5 阳性细胞克隆HBC3 细胞系的传代 |
| 3.3.6 HBC3 细胞软琼脂生长分析 |
| 3.3.7 HBC3 细胞染色体条带分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 第四章 HBC3 细胞系的生物学特性检测和核移植 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 卵巢来源 |
| 4.1.2 试剂药品 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 EGF 和胰岛素对HBC3 生长的影响 |
| 4.2.2 血清饥饿对HBC3 生长和凋亡的影响 |
| 4.2.3 流式细胞仪检测BFC 和HBC3 细胞的凋亡 |
| 4.2.4 HBC3 的体细胞核移植 |
| 4.2.5 囊胚细胞计数和凋亡的影响 |
| 4.2.6 统计方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 EGF 和胰岛素对HBC3 生长的影响 |
| 4.3.2 血清饥饿对HBC3 生长和凋亡的影响 |
| 4.3.3 流式细胞仪检测HBC3 细胞的凋亡 |
| 4.3.4 不同供体细胞的核移植 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 HBC3 的生物学特性 |
| 4.4.2 端粒酶活性与核移植重构胚的发育 |
| 4.5 结论 |
| 第五章 细胞癌化对体细胞核移植的影响 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 卵巢来源 |
| 5.1.2 试剂仪器 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 牛耳成纤维细胞的化学致癌物处理 |
| 5.2.2 ABF11 和ABF12 癌化细胞系的分离和形态观察 |
| 5.2.3 ABF11 和ABF12 的端粒酶活性检测 |
| 5.2.4 ABF12 生长曲线的测定 |
| 5.2.5 血清饥饿对ABF12 生长和凋亡的影响 |
| 5.2.6 ABF12 的软琼脂生长试验 |
| 5.2.7 ABF12 的染色体条带分析 |
| 5.2.8 ABF12 的体细胞核移植试验 |
| 5.2.9 囊胚细胞计数和凋亡染色 |
| 5.2.10 统计方法 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 ABF11 和ABF12 细胞系的建立和形态观察 |
| 5.3.2 ABF11 和ABF12 的端粒酶活性检测 |
| 5.3.3 ABF12 生长曲线 |
| 5.3.4 血清饥饿对ABF12 生长的影响 |
| 5.3.5 ABF12 的软琼脂生长试验 |
| 5.3.6 ABF12 的染色体条带分析 |
| 5.3.7 ABF12 的体细胞核移植试验 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 结论 |
| 第六章 卵母细胞体外成熟对体细胞核移植的影响 |
| 6.1 材料 |
| 6.1.1 卵巢来源 |
| 6.1.2 试剂仪器 |
| 6.2 方法 |
| 6.2.1 卵母细胞的采集 |
| 6.2.2 卵母细胞体外成熟培养 |
| 6.2.3 卵母细胞的去核操作 |
| 6.2.4 供体细胞的准备 |
| 6.2.5 透明带下注射法核移植 |
| 6.2.6 核移植胚胎的激活 |
| 6.2.7 核移植胚胎的体外培养 |
| 6.2.8 卵母细胞的程序化冷冻 |
| 6.2.9 卵母细胞的体外受精和培养 |
| 6.2.10 胚胎细胞计数与凋亡染色 |
| 6.2.11 统计方法 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 成熟培养液中添加EGF 对卵母细胞成熟和胚胎发育的影响 |
| 6.3.2 成熟培养液中添加VE 对卵母细胞成熟和胚胎发育的影响 |
| 6.3.3 成熟培养液中添加血清对卵母细胞成熟和胚胎发育的影响 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 结论 |
| 第七章 核移植胚胎的激活和发育阻滞 |
| 7.1 材料 |
| 7.1.1 卵巢来源 |
| 7.1.2 精子提取物的获得 |
| 7.1.3 试剂仪器 |
| 7.2 方法 |
| 7.2.1 卵母细胞的采集和成熟培养 |
| 7.2.2 卵母细胞的去核操作 |
| 7.2.3 供体细胞的准备 |
| 7.2.4 核移植重构胚胎的构建 |
| 7.2.5 核移植胚胎的激活方法的比较 |
| 7.2.6 核移植胚胎的体外培养 |
| 7.2.7 孤雌激活胚胎与核移植胚胎体外发育阻滞的比较 |
| 7.2.8 体外受精胚胎与核移植胚胎体外发育阻滞的比较 |
| 7.2.9 胚胎细胞计数与凋亡染色 |
| 7.2.10 与统计分析 |
| 7.3 结果与分析 |
| 7.3.1 不同浓度精子提取物对体细胞核移植胚胎激活的效果 |
| 7.3.2 精子提取物结合电化学方法激活对核移植胚胎体外发育的影响 |
| 7.3.3 电激活和化学激活方法对牛体细胞核移植体外发育的影响 |
| 7.3.4 孤雌激活胚胎与核移植胚胎体外发育阻滞的比较 |
| 7.3.5 体外受精胚胎与核移植胚胎体外发育阻滞的比较 |
| 7.4 讨论 |
| 7.4.1 精子提取物对体细胞核移植胚胎的激活 |
| 7.4.2 精子提取物与电化学方法的激活效果比较 |
| 7.4.3 体细胞重构胚体外发育的阻滞 |
| 7.5 结论 |
| 第八章 重构核移植胚胎的体外培养和冷冻 |
| 8.1 材料 |
| 8.1.1 卵巢来源 |
| 8.1.2 试剂仪器 |
| 8.2 方法 |
| 8.2.1 卵母细胞的采集和成熟培养 |
| 8.2.2 卵母细胞的去核操作 |
| 8.2.3 供体细胞的准备 |
| 8.2.4 透明带下注射法核移植和电融合 |
| 8.2.5 核移植胚胎的激活 |
| 8.2.6 核移植胚胎的体外培养 |
| 8.2.7 囊胚细胞团计数和凋亡染色 |
| 8.2.8 核移植重构胚胎的程序化冷冻保存 |
| 8.3 结果与分析 |
| 8.3.1 EGF 对重构胚胎体外发育和冷冻的影响 |
| 8.3.2 孕酮对体外培养的核移植重构胚发育和冷冻保存的影响 |
| 8.3.3 VE 对核移植重构胚体外发育的影响 |
| 8.3.4 海藻糖对体外培养的核移植重构胚冷冻保存的影响 |
| 8.3.5 不同培养阶段的重构胚胎冷冻保存效果 |
| 8.4 讨论 |
| 8.4.1 EGF 对核移植胚胎体外发育和冷冻的影响 |
| 8.4.2 孕酮对核移植胚胎体外发育和冷冻的影响 |
| 8.4.3 VE 对核移植胚胎体外发育的影响 |
| 8.4.4 海藻糖对核移植胚胎冷冻效果的影响 |
| 8.4.5 不同发育时期的核移植胚胎胚胎冷冻效果分析 |
| 8.5 结论 |
| 论文总结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 缩略词 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 一、端粒与端粒酶 |
| 二、端粒酶在肿瘤细胞中的功能 |
| 三、端粒酶调控机制 |
| 材料和方法 |
| 一、材料 |
| 1 质粒 |
| 2 引物合成及序列测定 |
| 3 菌株、细胞株 |
| 4 分子生物学工具酶 |
| 5 常用分子生物学试剂盒 |
| 6 细胞培养试剂 |
| 7 Western Blot 试剂 |
| 8 端粒长度检测的试剂 |
| 9 其它常规试剂 |
| 10 大型仪器 |
| 二、方法 |
| 1 质粒构建、阳性克隆的鉴定 |
| 2 质粒提取、酶切片断、PCR 反应产物回收 |
| 3 转染质粒的制备 |
| 4 细胞培养、冻存与转染 |
| 5 蛋白质浓度的测定 |
| 6 免疫印迹（Immunoblot，IB） |
| 7 端粒酶活性检测 |
| 8 地高辛标记法检测端粒长度 |
| 9 慢病毒（Lentivirus）的制备 |
| 10 细胞生长曲线测定 |
| 11 RT-PCR |
| 12 SA-β-gal 衰老检测 |
| 13 PCR 构建点突变体 |
| 14 shRNA 载体的构建 |
| 15 Hoechst 染色计数凋亡 |
| 16 免疫荧光 |
| 17 平板克隆形成实验 |
| 结果与分析 |
| 一、hTERT 核仁定位分布调控与正常条件下的端粒酶功能无关 |
| 1 hTERT 核仁定位调控对端粒酶活性的影响 |
| 2 hTERT 核仁定位调控对端粒酶稳定端粒长度的影响 |
| 3 hTERT 核仁定位调控对端粒酶永生化功能的影响 |
| 二、DNA 损伤诱导的hTERT 核仁聚集的结构基础及调控机制 |
| 2.1 诱导hTERT 核仁聚集是肿瘤细胞特异针对染色体双链DNA 损伤的一种细胞学反应 |
| 2.2 DNA 损伤诱导的hTERT 核仁聚集在肿瘤细胞中具有普遍性 |
| 2.3 hTERT 分子中介导其DNA 损伤诱导的核仁定位的决定性元件的鉴定 |
| 2.4 染色体双链DNA 损伤诱导的hTERT 核仁聚集是通过ATM 途径介导的 |
| 2.5 hTERT 分子中存在DNA 损伤诱导的核仁聚集的反应性调控元件 |
| 三、hTERT 核仁聚集在肿瘤细胞DNA 损伤反应中的细胞生物学意义 |
| 3.1 hTERT 核仁聚集在DNA 双链断裂（DSBs）中的生物学意义 |
| 3.1.1 DNA 损伤诱导的肿瘤细胞中hTERT 的核仁聚集与其蛋白稳定性及端粒酶活性无关 |
| 3.1.2 hTERT 核仁聚集抑制DNA 损伤灶的形成 |
| 3.1.3 hTERT 核仁聚集与DNA 损伤诱导的细胞死亡的关系 |
| 3.2 hTERT 的核仁聚集与端粒损伤 |
| 3.2.1 特定形式的端粒损伤可以造成hTERT 的核仁定位 |
| 3.2.2 hTERT 核仁聚集抑制端粒损伤发生时端粒损伤灶（TIFs）的形成 |
| 3.3 降低内源性hTERT 的表达量可激活肿瘤细胞中的DNA 损伤反应 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
| 英文缩写一览表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 论文正文 人毛乳头细胞永生化的实验研究 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 永生化人毛乳头细胞系的建立 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 永生化人毛乳头细胞的生物学和功能学特征 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 永生化人毛乳头细胞在裸鼠体内诱导毛囊形成的实验研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 文献综述一 端粒、端粒酶与细胞衰老和永生化 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 毛乳头细胞生物学特性和功能研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
| 英文论着 |
| 内容提要 |
| 英汉缩略名词对照表 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 一、材料 |
| 二 主要仪器 |
| 三、实验方法 |
| 1. 载体的鉴定和载体质粒 DNA 的扩增和抽提 |
| 2. 人骨肉瘤 U2OS 细胞培养、传代、冻存和复苏 |
| 3. 培养的 U2OS 细胞转染及阳性克隆的筛选 |
| 4. 阳性克隆转染效果的检测 |
| 5. U2OS 细胞转染hTERT 阳性克隆细胞的 MMP-2 观察 |
| 结果 |
| 1. 载体的鉴定和载体质粒 DNA 的扩增和抽提 |
| 2. pCI-neo-hTERT 转染 U2OS 细胞阳性克隆的筛选 |
| 3. 转染的 U2OS 细胞阳性克隆转染效果的检测 |
| 4. hTERT 转染U2OS 细胞的 MMP-2 观察 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 永生化鼻咽上皮NP69细胞模型中p53特性研究 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 材料 |
| 1.3 方法 |
| 1.4 结果 |
| 1.4.1 永生化鼻咽上皮NP69细胞模型中存在游离的p53 |
| 1.4.2 永生化鼻咽上皮NP69细胞模型中p53以野生型的方式存在 |
| 1.4.3 永生化鼻咽上皮NP69细胞模型中p53的功能活性研究 |
| 1.5 分析与讨论 |
| 1.6 结论 |
| 第二章 LMP1通过MAPK信号通路调节p53磷酸化的研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料 |
| 2.3 方法 |
| 2.4 结果 |
| 2.4.1 LMP1调节p53多位点的磷酸化 |
| 2.4.2 LMP1通过MAPK信号转导通路调节p53磷酸化及功能活化 |
| 2.5 分析与讨论 |
| 2.6 结论 |
| 第三章 LMP1调节p53泛素化及与磷酸化的相关性研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料 |
| 3.3 方法 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 LMP1能促进p53的泛素化 |
| 3.4.2 LMP1能促进p53的泛素化与磷酸化的相关性 |
| 3.5 分析与讨论 |
| 3.6 结论 |
| 总结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间主要研究成果 |
| 提要 |
| 英文缩略词 |
| 综述 |
| 组织工程简介 |
| 软骨组织工程与种子细胞 |
| 端粒酶与细胞永生化 |
| 实验部分 |
| 实验1 真核表达载体pcDNA3.1/Zeo(+)-hTERT 的构建 |
| 实验材料和方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 实验2 软骨细胞的分离、培养和hTERT 基因转染 |
| 实验材料和方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 实验3 hTERT 在软骨细胞中的表达及转染后软骨细胞的生物学特性 |
| 实验材料和方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 致谢 |
