涂丽裙[1]（2020）在《转化生长因子-β2反义寡核苷酸的微生物疫苗及肿瘤疫苗的佐剂作用》文中进行了进一步梳理转化生长因子-β2（TGF-β2）对免疫应答有全方位的负调节作用,可调节几乎每一种适应性免疫应答和固有免疫应答的细胞,包括树突状细胞、T细胞、B细胞、粒细胞和固有免疫淋巴样细胞。使用免疫检查点抑制剂治疗肿瘤的成功案例提示我们:抑制免疫抑制性细胞因子TGF-β2可能是一种新的策略去研制新型疫苗佐剂。为了研制出以核酸为基础的TGF-β2的抑制剂,我们设计了三个靶向人鼠的TGF-β2 m RNA3’UTR保守区域的反义寡核苷酸,并将其命名为TIO1,TIO2,TIO3。在小鼠巨噬细胞,人单核细胞及人浆细胞样树突状细胞,TIO1,TIO2及TIO3均明显下调TGF-β2的表达。在小鼠中,TIO3和TIO1,均可显着增强微生物疫苗所诱导的抗体反应。其中TIO3为佐剂的流感疫苗可抵抗流感病毒的攻击并减轻流感病毒引起的急性肺损伤。在小鼠中,TIO3可明显下调淋巴结及脾脏细胞CD4+T细胞及CD19+B细胞上s TGF-β2的表达,上调CD19+B细胞及CD11c+DC表面CD40,CD80,CD86,CD69及MHC II分子的表达,促进CD4+T细胞和CD8+T细胞产生IFN-γ,促进CD4+T细胞产生IL-4,抑制调节性T细胞（Tregs）的产生,促进CD4+T细胞和CD19+B细胞的增殖与活化,促进流感病毒感染的小鼠的肺脏中CD4+T细胞和CD8+T细胞表面CD69的表达。总的来说,通过干扰TGF-β2的表达,TIO3或TIO1,可作为新型微生物疫苗佐剂增强疫苗诱导的抗体反应;此外,TIO3为佐剂的胶质瘤细胞裂解物疫苗可显着延长原位接种胶质瘤预防模型小鼠的生存期。TIO3可通过抑制人和小鼠的胶质瘤细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞表达TGF-β2,诱生胶质瘤特异性的CD4+T细胞和CD8+T细胞,激活NK细胞,促进CD4+T细胞和CD8+T细胞产生IFN-γ,上调胶质瘤细胞表面MHCI分子的表达进而增强胶质瘤疫苗的抗肿瘤功效。单独应用TIO3可通过抑制胶质瘤细胞表达TGF-β2、促进胶质瘤细胞表达MHC I,IL-17A及IFN-α、抑制CD4+T细胞和CD8+T细胞表达s TGF-β2、抑制Tregs的产生、促进CD4+T细胞及CD8+T细胞的增殖而明显延长原位接种胶质瘤预防模型小鼠的生存期。单独应用TIO3可通过抑制胃癌细胞表达TGF-β2,促进MHC I,IL-13,IL-15,IL-17及IFN-γ的表达而显着减少肿瘤体积、延长胃癌背部移植瘤小鼠的生存期。TGF-β2的反义寡核苷酸有潜能作为微生物疫苗和肿瘤疫苗的新型佐剂,或单独治疗胶质瘤和胃癌的候选药物。
张颖一[2]（2020）在《胃癌中差异表达mRNA、lncRNA、circRNA的鉴定分析及核心circRNA circFOXO3的功能与作用》文中研究表明目的:胃癌（gastric cancer）是一种常见的恶性肿瘤,因起病隐匿,预后较差,严重威胁人类健康。因此,早期诊断极为重要,但临床尚缺乏该病特异性的生物标记。现有的大量研究显示非编码RNA（ncRNA）在人类癌症的发生和发展中起着至关重要的作用,其中lncRNA和circRNA与m RNA通过形成复杂的竞争性内源性RNA（ce RNA）调控网络参与疾病进程。值得注意的是,目前在胃癌中仍然缺乏对lncRNA、m RNA和circRNA的系统鉴定,并且它们在胃癌中构成的复杂调控网络尚未揭示。因此,本课题旨在探索胃癌中差异表达的m RNA、lncRNA和circRNA,揭露其转录物之间的复杂相互作用,试图为后续胃癌的临床诊断提供理论依据。circRNA由于序列及结构不同于其他ncRNA,从而表现出特有的生物学活性,在许多肿瘤的发生发展中起到关键作用。circ FOXO3是circRNA家族核心成员,已有文献报道显示circ FOXO3通过发挥原癌基因的作用参与了前列腺和脑胶质瘤的发生发展,而其在胃癌中的功能未见报道。本课题拟探究circ FOXO3对于胃癌细胞增殖、周期、转移、侵袭和成瘤的影响以及是否参与胃癌的免疫应答和代谢进程,分析下游靶基因与预后的关系,探索胃癌全新的生物靶标。方法:本课题选用微阵列分析筛选了胃癌中差异表达的m RNA、lncRNA和circRNA,在11个配对胃癌样本中用q RT-PCR验证了随机选择的6个上调基因的表达,并用STRING系统构建了差异表达的m RNA介导的蛋白质-蛋白质相互作用网络、lncRNA介导的顺式调节网络以及circRNA介导的ce RNA网络。另外,使用公共数据库Kaplan-Meier Plotter评估差异表达的m RNA、lncRNA和circRNA,判断其在胃癌中的预后价值。之后采用CCK-8、流式细胞仪、transwell等实验方法检测circFOXO3敲低之后胃癌细胞的增殖,转移和侵袭的变化,并观察其对动物体内成瘤的影响。最后,使用RNA-sequencing技术检测敲低circ FOXO3之后的胃癌细胞中m RNA的表达变化差异,在STRING系统分别构建敲低circ FOXO3后上下调的基因介导的蛋白质-蛋白质相互作用网络,利用GEPIA数据库探究20个circ FOXO3下游核心基因在胃癌中的表达情况,并使用公共数据库Kaplan-Meier Plotter评估circ FOXO3核心下游基因在胃癌中的预后价值。结果:本课题发现922个m RNA、2112个lncRNA和2896个circRNA在胃癌组织中差异表达,并观察到lncRNA lnc-GLI3-4:1、LMF1、OLFM4、HKDCC1、hsa＿circ＿0058819、hsa＿circ＿0058830在胃癌中的表达相较癌旁组织显着升高。生信分析显示胃癌中差异表达的m RNAs参与调控丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢;醛固酮调节钠的重吸收;氨基糖和核苷酸糖代谢;柠檬酸盐循环（TCA循环）;BMP绑定;醛脱氢酶（NAD）活性;胺结合;支链氨基酸分解代谢过程;静脉血管发育。本课题总共鉴定出230个lncRNA-m RNA调节对,KEGG信号通路预测结果显示这些lncRNA参与调控的信号通路包括:粘附连接、醛固酮调节钠的重吸收、轴突指导、B细胞受体信号通路、ARF蛋白信号转导、G蛋白偶联谷氨酸受体结合及L-α-氨基酸跨膜转运。所构建circRNA介导的ce RNA网络共包括34个上调的circRNA,33个下调的circRNA,170个上调的m RNA,153个下调的m RNA和42个mi RNA,生物信息学分析表明这些差异表达的基因与调节支链氨基酸分解代谢过程,糖酵解/糖异生和ARF蛋白信号转导显着相关。通过对已知数据库的分析,Kaplan-Meier生存曲线显示,胃癌患者m RNA中高表达的GPER、COL8A1、GLT25D1、EPOR、ENG、SLC5A5、OMP、NDE1和REM1与较短的总生存时间显着相关;lncRNA中则是高表达的NR＿073084、ENST00000565689、LOXL1-AS1、NR＿110232、ENST00000472494（HOTTIP）和ENST00000469148（PTPRG-AS1）与较短的总生存时间显着相关,其均具有评估预后的价值。本课题发现circ FOXO3在胃癌组织中表达水平显着高于癌旁组织,敲低其能够显着抑制AGS以及N87细胞的增殖、转移和侵袭能力,阻滞细胞周期的进程,并显着抑制动物体内瘤体的增长,故其可能在胃癌中发挥着原癌基因的效应。利用RNA-sequencing技术检测敲低circ FOXO3前后胃癌细胞中m RNA的表达变化,总共得到5104个差异基因。其中2378个基因的表达水平在敲低后显着上调,2726个基因的表达水平在敲低后显着下调。生物信息学预测显示circ FOXO3敲低后上调表达的基因主要富集在防御反应、固有免疫应答、免疫反应、病毒防御反应、免疫效应过程中。circ FOXO3敲低后下调表达基因广泛参与到代谢、翻译、有机物生物合成、生物合成、细胞周期等生物进程。本课题所构建的敲低circ FOXO3后上下调基因介导的蛋白质-蛋白质相互作用网络揭露了三个上调表达/三个下调表达的核心PPI网络,其内20个circ FOXO3下游核心基因中,CDK1、MYC、BRCA1、MCM3、RFC4、MX1、ISG15、OAS1、STAT1、DDX58、IFI35、RSAD2、B2M、DDX60、IFI27在胃癌中显着高表达。有趣的是,高表达的BRCA1、IFI35、MCM3、DDX60与胃癌患者较长的总体生存时间呈现明显相关性,而高表达的MX1、ISG15、DDX58、IFI27、RPS28、RPS20则与较短总生存显着相关。结论:本课题对胃癌中差异表达的m RNA、lncRNA和circRNA进行了综合分析,首次构建了复杂的调控网络以揭示这些RNA之间的相互作用,发现某些核心m RNA和lncRNA的失调与胃癌患者的总生存时间有关,为深入理解胃癌进展的机制以及探索胃癌的潜在治疗和预后靶标提供了有用的信息。通过对调控网络中处于核心地位的环状RNA circ FOXO3的进一步研究,证明了其在胃癌组织中显着高表达,而敲低circ FOXO3则能够显着降低胃癌细胞的增殖、周期、转移、侵袭进程和体内成瘤能力,且得知其可能参与肿瘤的免疫应答和代谢进程相关的信号通路调控,并发现数个circ FOXO3核心下游基因在胃癌中显着高表达且与患者的生存时间显着关联。首次,我们阐明了circ FOXO3在胃癌中的原癌效应,为寻找胃癌全新的生物靶标提供了思路。
杨晓燕[3]（2020）在《MiR-4295和lncRNA HOTAIR在胃癌中的表达及其功能研究》文中指出背景与目的:胃癌（gastric cancer,GC）是严重危害人类健康的常见恶性肿瘤,位于全球第三大癌症死亡原因。胃癌具有发病隐匿和早期症状不明显等特点,多数患者首诊时疾病已进入进展期,且伴有淋巴结或远处器官的转移,这已成为胃癌防治的难点。因此,通过各种研究技术和手段深入研究胃癌发生、发展、转移以及耐药的分子机制,寻找早期诊断的分子标志物以及药物靶标已迫在眉睫。最近的研究表明,非编码RNAs参与了肿瘤转移和恶性转化的过程。MiR-4295是一个新发现的微小RNA（microRNA）分子,通过生物信息学分析,我们发现miR-4295与lncRNA HOTAIR存在结合位点。因此,我们的研究就从非编码RNAs入手,研究微小RNA（miR-4295）和长链非编码RNA（lncRNA HOTAIR）在胃癌生长增殖和侵袭迁移中的功能及其机制。第一部分miR-4295通过PTEN/PI3K/AKT通路调控胃癌生长和侵袭迁移的研究方法:本研究采用qRT-PCR检测胃癌细胞系SGC-7901、MGC-803、BGC-823、MKN-28和人胃粘膜上皮细胞系GES-1中及胃癌组织中miR-4295的表达情况。构建miR-4295真核质粒过表达载体及其抑制剂载体（miR-4295 inhibitor）;采用瞬时转染法将构建好的载体转染至胃癌细胞系SGC-7901、MGC-803中,qRT-PCR检测转染细胞系中miR-4295的表达。CCK-8法检测miR-4295和miR-4295 inhibitor及miR-4295联合AKT抑制剂对胃癌细胞增殖活力的影响;流式细胞术检测miR-4295联合AKT抑制剂对胃癌细胞凋亡率的影响;平板克隆法检测miR-4295和miR-4295 inhibitor对胃癌细胞克隆能力的影响;划痕实验检测miR-4295和miR-4295 inhibitor对胃癌细胞迁移能力的影响;transwell法检测miR-4295和miR-4295 inhibitor及miR-4295联合AKT抑制剂对胃癌细胞的侵袭迁移能力的影响。采用生物信息学软件miRanda、TargetScan、Pictar2、RNAhybrid、miRDB、RNA22-HAS、Targetminer、EMBL-EBI、miRWalk、DIANA-microT、mirbridge、miRNAMap和PITA在线预测miR-4295的靶基因。结合DAVID与KOBAS对miR-4295的靶基因进行GO分析及KEGG信号通路分析,分析miR-4295在胃癌细胞生物学过程中可能的分子机制。通过STRING在miR-4295的潜在靶基因中筛选出蛋白作用网络（protein-protein interaction,PPI）起关键作用的核心基因（hub gene）。通过TCGA数据库GEPIA对miR-4295靶向hub gene在胃癌中的相关性及其与胃癌患者的生存分析。利用qRT-PCR、Western blot检测miR-4295的靶基因及PI3K/AKT信号通路中相关基因的表达水平。最后采用双荧光素酶报告系统实验对miR-4295的靶基因进一步验证,明确目的miR-4295与其靶基因在胃癌中的关系。结果:1.胃癌细胞和组织中miR-4295表达水平检测。qRT-PCR结果显示（定量表达结果用Means±SD表示,SGC-7901、MGC-803、BGC-823、MKN-28分别为:1.832±0.120、2.421±0.187、1.328±0.102、1.000±0.040）,与人胃粘膜上皮细胞系GES-1（0.962±0.070）比较,SGC-7901、MGC-803、BGC-823、MKN-28胃癌细胞系miR-4295表达水平均升高,以SGC-7901、MGC-803表达水平升高最为显着;31例胃癌患者中,与正常胃粘膜组织相比,胃癌组织中miR-4295表达显着上调80.6%（25/31）;miR-4295的表达水平与胃癌的肿瘤大小及远端转移相关具有显着性（p<0.05）,而与胃癌患者的年龄、性别、组织学分级及淋巴结转移无显着相关性（p>0.05）。2.构建miR-4295过表达质粒载体和和miR-4295 inhibitor质粒载体。测序结果显示,重组的miR-4295及其inhibitor序列插入准确无误,说明重组的miR-4295和miR-4295 inhibitor质粒载体构建成功。qRT-PCR检测转染胃癌细胞中miR-4295的表达水平,结果显示:相较于miR-NC转染组,miR-4295转染后的胃癌细胞系SGC-7901、MGC-803中miR-4295的表达水平显着上调（p<0.05）;miR-4295inhibitor转染组与Anti-miR-NC转染组相比,miR-4295 inhibitor转染的胃癌细胞系SGC-7901、MGC-803中miR-4295的表达水平显着下调（p<0.05）。3.CCK-8法检测转染后胃癌细胞增殖活力。结果显示:相较于miR-NC转染组,miR-4295转染后的胃癌细胞系SGC-7901、MGC-803的增殖活力显着增加（p<0.05）;miR-4295 inhibitor转染组与Anti-miR-NC转染组相比,miR-4295 inhibitor转染的胃癌细胞系SGC-7901、MGC-803的增殖活力显着降低（p<0.05）;相较于miR-4295转染组,miR-4295联合AKT抑制剂组细胞增殖活力显着降低（p<0.05）。4.流式细胞术检测miR-4295联合AKT抑制剂处理胃癌细胞后的凋亡率。结果显示:相较于miR-NC转染组,miR-4295转染后的胃癌细胞系SGC-7901、MGC-803的凋亡率显着降低（p<0.05）;相较于miR-4295转染组,miR-4295联合AKT抑制剂处理的胃癌细胞系SGC-7901、MGC-803的凋亡率显着增加（p<0.05）。5.平板克隆形成实验检测转染后胃癌细胞的克隆能力。结果显示:相较于miR-NC转染组,miR-4295转染后的胃癌细胞系SGC-7901、MGC-803的克隆数量显着增加（p<0.05）;miR-4295 inhibitor转染组与Anti-miR-NC转染组相比,miR-4295 inhibitor转染的胃癌细胞系SGC-7901、MGC-803的克隆数量显着减少（p<0.05）。6.划痕实验检测转染后对胃癌细胞迁移的影响。划痕实验结果显示:上调胃癌细胞SGC-7901、MGC-803中miR-4295的表达,SGC-7901、MGC-803细胞在24 h时,相较于miR-NC组,miR-4295组细胞迁移间距小（p<0.05）;而下调胃癌细胞SGC-7901、MGC-803中miR-4295的表达,SGC-7901、MGC-803细胞在24 h时,相较于Anti-miR-NC组,miR-4295 inhibitor组细胞迁移间距大（p<0.05）。7.Transwell实验检测转染后对胃癌细胞迁移、侵袭的影响。结果显示:相较于miR-NC组,miR-4295组细胞迁移和侵袭数显着增加（p<0.05）;而下调胃癌细胞SGC-7901、MGC-803中miR-4295的表达,相较于Anti-miR-NC组,miR-4295 inhibitor组细胞迁移和侵袭数显着减少（p<0.05）;相较于miR-4295,miR-4295联合AKT inhibitor组细胞迁移和侵袭数显着减少（p<0.05）。8.miR-4295的潜在功能及其机制。通过14个预测软件,结果共筛选出15353个miR-4295候选靶基因。选取同时由7个生物软件预测阳性结果,共选出600个miR-4295靶基因进行后续GO、pathway分析及靶基因分子网络分析。GO功能富集分析,结果显示24条信号通路显着富集于生物学过程中（p<0.01）;12条信号通路显着富集于细胞组成中（p<0.01）;12条信号通路显着富集于细胞组成中（p<0.01）。KEGG信号通路分析,结果显示miR-4295靶基因显着富集于23条信号通路信息（p<0.01）。miR-4295靶基因蛋白互作（PPI）网络,共筛出15个hub genes,包括CUL3、PPARG、UBE2D1、FMR1、SUV39H1、RAB5A、AGO4、RNF2、PTEN、RUNX2、KMT2A、ITPKB、ESR1、DICER1和LDLR。miR-4295 hub gene PTEN与BCL2L11具有显着相关性。利用生物信息学软件预测miR-4295与PTEN及BCL2L11 3’UTR靶位点情况,结果显示:PTEN 3’UTR靶位点位于其3’UTR 412-418 bp,序列（5’-3’）为UUGCACU;BCL2L11 3’UTR靶位点位于其3’UTR4093-4099 bp,序列（5’-3’）为UUGCACU。PTEN 3’UTR及其突变体双荧光素酶质粒载体阳性克隆的测序结果显示,重组的PTEN 3’UTR及其突变体序列插入准确无误,说明psiCHECK2-PTEN-3’UTR与psiCHECK2-PTEN-mut-3’UTR重组质粒构建成功;BCL2L11 3’UTR及其突变体双荧光素酶质粒载体阳性克隆的测序结果显示,重组的BCL2L11 3’UTR及其突变体序列插入准确无误,说明GV272-BCL2L11-3’UTR与GV272-BCL2L11-mut-3’UTR重组质粒构建成功。双荧光素酶活性检测结果显示:相较于PTEN-3’UTR+miRNA-NC共转染组,PTEN 3’UTR+miR-4295共转染组的荧光素酶活性显着降低,说明miR-4295能够结合PTEN 3’UTR,抑制其表达;PTEN-3’UTR+miRNA-NC共转染组与PTEN mut-3’UTR+miR-4295共转染组相比,两组的荧光素酶活性无显着性差异,说明miR-4295不能与靶位点突变的PTEN 3’UTR结合,不能抑制其表达;PTEN3’UTR+miR-4295共转染组与PTEN mut-3’UTR+miR-4295共转染组相比,PTEN mut-3’UTR+miR-4295共转染组的荧光素酶活性显着增加,进一步说明PTEN 3’UTR靶位点突变后,miR-4295不能与其结合,进而不能抑制靶基因表达。以上结果说明miR-4295能够直接结合靶基因PTEN 3’UTR并抑制其表达。相较于BCL2L11-3’UTR+miRNA-NC共转染组,BCL2L11 3’UTR+miR-4295共转染组的荧光素酶活性显着降低,说明miR-4295能够结合BCL2L11 3’UTR,抑制其表达;BCL2L11-3’UTR+miRNA-NC共转染组与BCL2L11 mut-3’UTR+miR-4295共转染组相比,两组的荧光素酶活性无显着性差异,说明miR-4295不能与靶位点突变的BCL2L11 3’UTR结合,不能抑制其表达;BCL2L11 3’UTR+miR-4295共转染组与BCL2L11 mut-3’UTR+miR-4295共转染组相比,BCL2L11 mut-3’UTR+miR-4295共转染组的荧光素酶活性显着增加,进一步说明BCL2L11 3’UTR靶位点突变后,miR-4295不能与其结合,进而不能抑制靶基因表达。以上结果说明miR-4295能够直接结合靶基因BCL2L11 3’UTR并抑制其表达。采用qRT-PCR检测miR-4295对胃癌细胞系SGC-7901、MGC-803中靶基因及其相关基因mRNA表达的影响。结果显示:相较于miR-NC转染组,miR-4295转染组中PTEN、BCL2L11基因mRNA的水平显着降低（p<0.05）,而PI3K、AKT、mTOR基因mRNA表达水平无显着性差异;而下调胃癌细胞SGC-7901、MGC-803中miR-4295的表达,与Anti-miR-NC转染组相比,miR-4295 inhibitor转染组中PTEN、BCL2L11基因mRNA的水平显着增加（p<0.05）,而PI3K、AKT、mTOR基因mRNA表达水平无显着性差异。采用Western blot检测miR-4295对胃癌细胞系SGC-7901、MGC-803中靶基因PTEN、BCL2L11及其相关蛋白表达水平的影响。结果显示:相较于miR-NC转染组,miR-4295转染组中PTEN、BCL2L11蛋白的水平显着降低,而PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表达水平显着增加（p<0.05）;而下调胃癌细胞SGC-7901、MGC-803中miR-4295的表达,与Anti-miR-NC转染组相比,miR-4295 inhibitor转染组中PTEN、BCL2L11蛋白的水平显着上调,而PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表达水平显着降低（p<0.05）。第二部分lncRNA HOTAIR在胃癌中的表达及其功能研究方法:本研究采用qRT-PCR检测胃癌细胞系SGC-7901、MGC-803、BGC-823、MKN-28和人胃粘膜上皮细胞系GES-1中HOTAIR的表达情况。通过基于TCGA与GTEx公共数据库的GEPIA（Gene Expression Profiling Interactive Analysis）分析HOTAIR在408例胃癌中的表达水平。化学合成siHOTAIR,采用瞬时转染法将构建好的siHOTAIR转染至胃癌细胞系SGC-7901、MGC-803中,qRT-PCR检测转染细胞系中HOTAIR的表达;CCK-8法检测siHOTAIR对胃癌细胞增殖活力的影响;划痕实验检测siHOTAIR对胃癌细胞迁移能力的影响;transwell法检测siHOTAIR对胃癌细胞的侵袭迁移能力的影响。利用信息学软件UCSC（Version 2009）和StarBase v2.0预测miR-4295与HOTAIR的结合位点;采用双荧光素酶报告基因系统实验检测验证miR-4295与HOTAIR的位点结合情况。结果:1.胃癌细胞系（SGC-7901、MGC-803、BGC-823、MKN-28）分别进行HOTAIR表达水平分析。qRT-PCR检测结果显示（定量表达结果用Means±SD表示,SGC-7901、MGC-803、BGC-823、MKN-28分别为:1.000±0.1000、0.370±0.040、0.280±0.030、0.310±0.040）,与人胃粘膜上皮细胞系GES-1（0.190±0.070）比较,SGC-7901、MGC-803、BGC-823、MKN-28胃癌细胞系HOTAIR表达水平均升高。以SGC-7901、MGC-803表达水平升高最为显着。利用GEPIA分析HOTAIR在胃癌组织中的表达比正常胃粘膜组织中的表达显着升高。2.将siHOTAIR与siNC分别瞬时转染胃癌细胞系SGC-7901、MGC-803。转染48 h后,采用qRT-PCR法检测HOTAIR的表达水平。结果显示:相较于siNC转染组,siHOTAIR转染组的胃癌细胞系SGC-7901、MGC-803中HOTAIR的表达水平显着下调（p<0.05）。3.CCK-8法检测转染后胃癌细胞增殖活力。结果显示:相较于siNC转染组,siHOTAIR转染后的胃癌细胞系SGC-7901、MGC-803的增殖活力显着降低（p<0.05）。4.划痕实验检测转染后对胃癌细胞迁移的影响。划痕实验结果显示:下调胃癌细胞SGC-7901、MGC-803中HOTAIR的表达,SGC-7901、MGC-803细胞在24 h时,相较于siNC转染组,siHOTAIR转染组细胞迁移间距大（p<0.05）。5.Transwell实验检测转染后对胃癌细胞迁移、侵袭的影响。结果显示:相较于siNC转染组,siHOTAIR转染组细胞迁移和侵袭数显着减少（p<0.05）。6.StarBase v2.0 software预测miR-4295与HOTAIR位点结合情况,结果显示,HOTAIR结合位点序列（5’-3’）为UUGCACU。HOTAIR及其突变体双荧光素酶质粒载体阳性克隆的测序结果显示,重组的HOTAIR及其突变体序列插入准确无误,说明psiCHECK2-HOTAIR与psiCHECK2-HOTAIR-mut重组质粒构建成功。双荧光素酶活性检测结果显示:相较于HOTAIR+miR-NC共转染组,HOTAIR+miR-4295共转染组的荧光素酶活性显着降低,且差异具有统计学意义,说明miR-4295能够结合HOTAIR;HOTAIR mut+miR-NC共转染组与HOTAIR mut+miR-4295共转染组相比,两组的荧光素酶活性无显着性差异,说明miR-4295不能与靶位点突变的HOTAIR结合。以上结果说明miR-4295能够直接结合HOTAIR。结论:1.miR-4295、HOTAIR在胃癌细胞系SGC-7901、MGC-803、BGC-823、MKN-28和胃癌组织中均高表达,miR-4295的表达水平与胃癌的肿瘤体积大小及远端转移呈正相关。2.miR-4295可促进胃癌细胞的生长增殖和侵袭迁移,而下调miR-4295的表达可抑制胃癌细胞的生长增殖和侵袭迁移;miR-4295联合AKT抑制剂能够降低胃癌细胞的增殖和侵袭迁移能力,增加胃癌细胞凋亡率。3.PTEN、BCL2L11是miR-4295的直接靶基因;上调胃癌细胞系SGC-7901、MGC-803中miR-4295的表达,PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表达水平显着增加;下调胃癌细胞系SGC-7901、MGC-803中miR-4295的表达,PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表达水平显着降低。4.下调HOTAIR可抑制胃癌细胞增殖和侵袭迁移,且发现miR-4295与HOTAIR存在结合位点。
刘琪[4]（2020）在《miR-129-5p在胃癌中的表达及功能研究》文中指出胃癌（gastric cancer,GC）在全球范围内拥有较高发病率,据世界卫生组织统计,2012年,全球大约新发胃癌951,600例,723,100名患者死于胃癌,是因癌症导致死亡的第二大原因。手术切除是当前胃癌根治性治疗的主要方法,但是,标准手术治疗后的复发和转移导致晚期胃癌患者生存率显着降低。常规挽救性化疗获益有限,因此,胃癌治疗的新靶点和新方法亟待研究。microRNA（miRNA）是一类小的非编码RNA,通过抑制或降低其靶向mRNA的翻译来发挥转录后调控的作用。根据最近的报道,一些miRNA通过影响其下调靶标而参与了胃癌的发展和进程。例如,miR-520c通过抑制胃癌细胞中的IRF2来增强癌症细胞增殖,迁移和侵袭。miR-186通过抑制Twist1影响人胃癌细胞增殖,侵袭和迁移。miR-137通过靶向调节KLF12和MYO1C在胃癌细胞系中发挥抑癌作用。这些研究表明miRNA在胃癌发生发展中发挥了重要作用。miR-129-5p在包括胃癌在内的多种恶性肿瘤中起着抑制癌症发生发展的作用。例如,miR-129-5p通过靶向下调APC抑制喉鳞状细胞癌的生长并诱导其凋亡。在胃癌中,miR-129-5p通过下调IL-8参与了胃癌细胞的迁移和侵袭,通过抑制COL1A1降低胃癌的侵袭和增殖。可以看到,既往研究已证实miR-129-5p在胃癌发生发展中发挥了作用,具备成为治疗靶点的潜在价值,仍有继续研究发掘的必要。本文就上述难点和热点从以下三个方面进行了研究:第一部分miR-129-5p在胃癌组织和胃癌细胞系中表达差异;第二部分miR-129-5p对胃癌细胞增殖和侵袭的影响;第三部分miR-129-5p通过靶基因ADAM9参与胃癌细胞增殖和侵袭的调控。第一部分:miR-129-5p在胃癌组织和胃癌细胞系中表达差异目的:探究miR-129-5p在胃癌组织和胃癌细胞系中表达差异及其意义。方法:收集临床实施胃癌根治性切除手术患者的胃癌组织样本,采用RT-qPCR方法探究miR-129-5p在胃癌患者癌组织和癌旁组织中的表达差异,根据差异追踪患者生存时间,探索miR-129-5p与胃癌患者生存期的关系。结果:1收集临床50例行胃癌根治性切除手术患者的组织样本,通过RT-qPCR方法检测组织样本中miR-129-5p表达,结果显示不同样本间有显着差异;2根据miR-129-5p的表达差异将胃癌患者分为两组,进行生存分析,结果显示miR-129-5p高表达组患者的总体生存时间显着高于miR-129-5p低表达组;3对后期用于实验的三个胃癌细胞系（MKN-45,BGC-823和SGC-7901）及一个胃黏膜细胞系（GES-1）进行miR-129-5p表达量检测,结果显示胃癌细胞系中miR-129-5p表达明显低于胃黏膜细胞系。结论:相较于正常胃黏膜组织细胞,在胃癌组织细胞中miR-129-5p表达水平降低,较低水平的miR-129-5p表达与胃癌患者的不良预后有关。第二部分 miR-129-5p对胃癌细胞系增殖和侵袭的影响目的:在胃癌及胃黏膜细胞系中研究miR-129-5p对肿瘤细胞增殖和侵袭的影响。方法:根据 miR-129-5p 序列合成 miR-129-5p mimic 和 miR-129-5p inhibitor,转染三株胃癌细胞系及一株胃黏膜细胞系,检测细胞的增殖和侵袭能力。结果:1人工合成的miR-129-5p mimic和miR-129-5p inhibitor能有效增强和抑制miR-129-5p在细胞系中的表达;2 miR-129-5p mimics能显着降低SGC-7901和MKN-45的增殖能力,miR-129-5p inhibitor 能显着增加 SGC-7901 和 MKN-45 的增殖能力;3 miR-129-5p mimics能显着降低SGC-7901和MKN-45的侵袭能力,miR-129-5p inhibitor 能显着增加 SGC-7901 和 MKN-45 的侵袭能力。结论:体外实验表明:增强miR-129-5p的表达可降低胃癌细胞增殖和侵袭能力,抑制miR-129-5p的表达可增强胃癌细胞增殖和侵袭能力。第三部分 miR-129-5p通过靶基因ADAM9参与胃癌细胞增殖和侵袭的调控目的:探究miR-129-5p如何参与胃癌细胞增殖和侵袭的调控。方法:利用miRanda预测miR-129-5p的靶基因,结合pMIRGLO双荧光素酶报告系统验证靶基因,通过人为过表达靶基因,探究miR-129-5p参与胃癌细胞增殖和侵袭的作用形式。结果:1 miRanda预测ADAM9是miR-129-5p的靶基因,双荧光素酶报告系统验证了这一假设。2选取ADAM9表达量最低的MKN-45细胞系,pcDNA3.1质粒载体过表达ADAM9后,转染miR-129-5p mimic可以抑制ADAM9的升高,同时逆转细胞因过表达ADAM9造成的增殖力升高和侵袭力增强。结论:miR-129-5p通过靶向调控ADAM9基因参与胃癌细胞增殖和侵袭,增强miR-129-5p表达,可降低ADAM9表达水平,在胃癌中起肿瘤抑制作用。因此,miR-129-5p可能是胃癌靶向治疗的潜在目标。
刘金禄[5]（2015）在《siRNA沉默CLIC1基因对人胃癌细胞生物学行为的影响及相关机制的体外研究》文中进行了进一步梳理第一部分siRNA CLIC1重组慢病毒载体及低表达CLIC1稳转胃癌细胞株的构建及鉴定目的:用前期实验筛选获得的CLIC1 siRNA3片段构建重组慢病毒载体,进一步构建稳定低表达CLIC1的单克隆胃癌细胞株,实时荧光定量PCR筛选抑制率最好的单克隆胃癌细胞株。方法:（1）直接用前期研究已经筛选出的CLIC1 siRNA3为沉默CLIC1基因的最有效片段。制备双链DNA oligo,利用基因重组技术克隆到慢病毒表达载体GV115中,双酶切后行DNA测序鉴定重组慢病毒载体。将慢病毒包装辅助质粒和制作的含CLIC1 siRNA的重组慢病毒载体共转染293T细胞,收集病毒颗粒并用孔稀释法测定病毒滴度。另外,利用上海吉凯公司的阴性序列病毒作为阴性对照。（2）将病毒分别感染胃癌细胞株SGC-7901和MGC-803,各挑取6组GFP强表达的细胞克隆团转移种植建立两稳定单克隆细胞株,荧光定量PCR检测CLIC1抑制率,选取抑制率最好的克隆组。结果:经测序成功构建针对CLIC1的重组慢病毒RNA干扰表达载体;利用293T细胞包装重组慢病毒载体后成功收集到重组慢病毒颗粒,其病毒滴度为:1.2E+9 TU/mL;利用重组慢病毒颗粒感染两株胃癌细胞,感染效率均在80%以上;成功扩增并分别获得6组稳定低表达CLIC1的单克隆胃癌细胞株;荧光定量PCR鉴定获得抑制效率最好的单克隆胃癌细胞株;SGC-7901和MGC-803单克隆株的CLIC1抑制率分别为89.3%和93.8%。结论:成功构建CLIC1 siRNA干扰慢病毒载体,并成功获得抑制效率较好的低表达CLIC1稳转胃癌细胞株,为下一步探讨沉默CLIC1对胃癌生长的体内体外实验奠定良好的基础。第二部分siRNA沉默CLIC1基因表达后对胃癌细胞生物学行为的影响目的:探讨siRNA干扰CLIC1基因表达后对胃癌细胞生物学行为的影响。方法:用MTT法检测抑制CLIC1表达前后细胞的增殖情况;用AnnexinV-APC单染进行流式细胞技术检测,观察抑制前后各组细胞凋亡变化情况;用PI单染的方法检测各组细胞周期变化情况;用Transwell小室及Matrigel胶检测细胞侵袭和迁移能力的变化。结果:转染后24h、48h、72h、96h、120h干扰组A值均低于空白对照组和阴性对照组（均P<0.05）;SGC-7901干扰组转染后24h、48h、72h、96h、120h 的细胞增殖率分别为 27.829%、52.663%、71.785%、28.778%和20.450%;MGC-803 干扰组分别为 16.910%、42.169%、127.244%、101.388%和34.118%。SGC-7901（干扰组vs空白对照组vs阴性对照组%:0.743±0.031 vs 0.587±0.025 vs 0.597±0.032,F=26.628,P<0.01）和 MGC-803（干扰组vs空白对照组vs阴性对照组%:4.370±0.125 vs 1.453±0.166 vs 1.510±0.079,F=506.432,P<0.01）干扰组的细胞凋亡率均显着高于各自的空白对照组和阴性对照组。在SGC-7901细胞中,干扰组G0/G1期比例显着低于空白对照组及阴性对照组（F=172.299,均P<0.01）,G2/M期比例显着高于空白对照组及阴性对照组（F=2665.338,P<0.01）;在MGC-803细胞中,G2/M期细胞比例干扰组也显着高于空白对照组及阴性对照组（F=631.560,P<0.01）,G0/G1及G2/M期细胞比例均显着低于空白对照组及阴性对照组（F=889.621,P<0.01）。干扰组侵袭、迁移实验中的穿膜细胞数（SGC-7901 分别是:86.000±6.000、118.333±8.505,MGC-803:81.333±5.033、108.667土8.327）均显着低于空白对照组（SGC-7901分别是:156.667±14.843、181.667±11.719,MGC-803:168.333±17.388、185.000±11.000）和阴性对照组（SGC-7901 分别是 150.333±13.051、178.667土7.024,MGC-803:161.000土 15.716、179.333土10.408）（均 P<0.01）。结论:抑制CLIC1表达后胃癌细胞SGC-7901和MGC-803增殖增快、凋亡增加、细胞周期阻滞在G2/M期、侵袭迁移能力受到抑制。提示抑制CLIC1是胃癌基因治疗的一个潜在有效的靶点。第三部分基于iTRAQ蛋白组学技术筛选抑制CLIC1表达前后胃癌细胞SGC-7901中的差异表达蛋白目的:应用iTRAQ结合质谱分析的蛋白组学技术分析对比抑制CLIC1表达前后胃癌细胞SGC7901的差异表达蛋白。方法:提取两组细胞的总蛋白,经蛋白质酶解、iTRAQ标记、质谱分析和数据库搜索等步骤后,筛选出符合条件的蛋白质:114/115的比值≥2.0或≤0.5;最后对差异蛋白进行生物信息学分析。结果:抑制CLIC1表达后在Human数据库中共鉴定到1170个蛋白肽段,差异蛋白54个,36个上调表达,18个下调表达;Mouse数据库中鉴定到858个蛋白肽段,差异蛋白39个,上调表达24个,下调表达15个。差异蛋白主要定位于细胞内,以结合作用和生物调节作用为主。结论:筛选出了一组与CLIC1沉默相关的差异蛋白,为明确CLIC1在胃癌中的作用机制提供了线索和基础。第四部分siRNA抑制CLIC1基因表达后对胃癌细胞整合素和凋亡基因mRNA及蛋白的影响目的:探讨抑制CLIC1表达后胃癌细胞中部分凋亡和整合素相关基因及蛋白的表达情况。方法:应用实时荧光定量PCR和Western blot检测胃癌细胞中整合素（α1、α3、αv、β 1）和凋亡（Bcl-2、survivin、Fas）相关基因和蛋白的表达情况。结果:（1）SGC-7901和MGC-803干扰组细胞中整合素α3、αv和β1基因表达均显着下降（SGC-7901:52.547%、33.766%、34.132%和 MGC-803:56.500%、51.900%、76.347%）（均P<0.05）,α1 在 SGC-7901 中表达升高（干扰组vs空白对照组vs阴性对照:1.705±0.096 vs 1.000±0.014 vs 0.931±0.016）,在 MGC-803 中表达下降（0.503±0.059 vs 1.000土0.038 vs 1.011 土0.059）,差异均有统计学意义（均P<0.05）。（2）两组细胞中整合素 α3、αv和β1 蛋白表达均显着下降（SGC-7901:70.924%、35.491%、55.209%和 MGC-803:46.729%、53.765%、70.935%）（均P<0.05）,α1 在 SGC-7901中表达干扰组高于空白对照组和阴性对照组（1.577±0.021 vs 0.610±0.046 vs 0.650±0.044）,在 MGC-803 中表达下降（0.607±0.031 vs 1.123±0.040 vs 1.110±0.046）,差异均有统计学意义（均P<0.05）。（3）两干扰组中Bcl-2基因和蛋白的表达均下降（mRNA:65.200%和74.725%,蛋白:60.023%和54.023%）（均P<0.05）,Fas基因和蛋白的表达均上升（mRNA:97.702%和 173.826%,蛋白:83.091%和 76.935%）（均P<0.05）,survivin 表达不变（P>0.05）。结论:（1）从基因和蛋白水平检测发现沉默CLIC1表达后两株胃癌细胞中的整合素α3、αv、β1均下调表达;胃癌细胞SGC-7901中的整合素α1上调表达,MGC-803中则下调表达。结合整合素在肿瘤中的作用,初步认为CLIC1基因沉默通过调节整合素的表达影响胃癌的进展。（2）抑制胃癌细胞SGC-7901和MGC-803中的CLIC1表达后凋亡蛋白Fas表达上调、Bcl-2表达下调、Survivin表达无变化。结合第二部分生物学功能实验结果,Fas和Bcl-2表达的变化能促进沉默CLIC1表达后胃癌细胞SGC-7901和MGC-803的凋亡。
刘超侠,董薇,孔庆兖[6]（2009）在《survivin反义寡核苷酸诱导胃癌细胞凋亡及对多西他赛的增敏作用》文中研究说明目的探讨生存素（survivin）反义寡核苷酸（antisense oligonucleotide,ASODN）对人胃癌细胞株SGC7901的凋亡诱导、对多西他赛的化疗增敏作用。方法设计合成特异性靶向survivin ASODN。将胃癌细胞株分为空白对照组（Sham组）、单纯脂质体对照组（Lip组）、正义寡核苷酸转染对照组（Lip-SODN组）、ASODN转染组（Lip-ASODN组）。转染48 h后,Western blot法检测各组细胞survivin表达情况,流式细胞仪检测各组细胞凋亡率,MTT法检测转染细胞对多西他赛的敏感性。结果脂质体介导survivin ASODN转染后的胃癌细胞survivin蛋白表达明显下降,细胞凋亡率明显高于各对照组（P<0.05）,对多西他赛的IC50值明显低于各对照组（P<0.05）,细胞生长抑制率明显高于各对照组（P<0.05）。结论survivin ASODN转染胃癌细胞能下调survivin蛋白表达,诱导胃癌细胞凋亡,抑制细胞增殖,增强多西他赛化疗敏感性。
刘超侠,孔庆兖[7]（2009）在《Survvin反义寡核苷酸诱导人胃癌细胞凋亡的作用》文中进行了进一步梳理目的探讨生存素（Survivin）反义寡核苷酸（ASODN）诱导人胃癌细胞SGC7901凋亡的作用。方法设计合成特异性靶向Survivin的ASODN,将胃癌细胞株分为空白对照组（Sham组）、脂质体转染对照组（Lip组）、正义链转染对照组（Lip-SODN组）和ASODN转染组（Lip-ASODN组）。作用48 h后,Western blot法检测各组Survivin表达情况,流式细胞仪检测各组细胞凋亡率,免疫组化SP法检测细胞中PCNA表达情况。结果脂质体介导SurvivinASODN转染后的胃癌细胞Survivin蛋白表达明显下降;ASODN转染组细胞凋亡率明显高于各对照组（P均<0.05）,各对照组间无统计学差异（P>0.05）。ASODN转染后胃癌细胞中PCNA表达水平明显降低。结论Sur-vivin ASODN转染胃癌细胞能下调Survivin蛋白表达,诱导胃癌细胞凋亡,抑制细胞增殖,具有明显的抗癌作用。
刘超侠,孔庆兖[8]（2009）在《Survivin反义寡核苷酸诱导胃癌细胞凋亡的研究》文中指出目的探讨生存素反义寡核苷酸（ASODN）对人胃癌细胞SGC7901凋亡的诱导作用。方法设计合成特异性靶向survivin ASODN。胃癌细胞株SGC7901分为4组:空白对照组（Sham）、单纯脂质体对照组（Lip）、正义链转染对照组（Lip-SODN）、ASODN转染组（Lip-ASODN）。作用12、24、48 h后收获各组细胞。Western blot法检测各组细胞survivin表达情况,倒置显微镜观察细胞生长形态变化,流式细胞仪检测各组细胞凋亡率,免疫组化SP法检测细胞中Ki67表达。结果脂质体介导survivin ASODN转染后的胃癌细胞出现survivin蛋白表达明显下降;形态学上表现为细胞膜起泡、染色质固缩、凋亡小体形成;细胞凋亡率明显高于各对照组（P<0.05）;细胞中Ki67表达水平明显降低。结论survivin反义寡核苷酸转染胃癌细胞能下调survivin蛋白表达,诱导胃癌细胞凋亡,抑制细胞增殖,具有明显的抗癌作用。
何金兰,孔庆兖[9]（2009）在《survivin反义寡核苷酸激活caspase-3诱导SGC7901胃癌细胞凋亡的实验研究》文中研究说明目的研究转染生存素（survivin）反义寡核苷酸诱导SGC7901胃癌细胞凋亡及其可能的作用机制。方法实验分为空白对照组（Control组）、脂质体组（Lip组）、正义寡核苷酸组（Sodn组）及反义寡核苷酸组（Asodn组）。人工合成正、反义寡核苷酸,经脂质体将survivin正、反义寡核苷酸转染入胃癌细胞48h后,MTT检测细胞增殖抑制率,Western blot检测caspase-3蛋白表达改变,Hoechst染色观察细胞凋亡形态改变及流式细胞仪检测凋亡率。结果Hoechst染色荧光显微镜下Control组、Lip组及Sodn组细胞核呈正常的蓝色,而Asodn组细胞核染色增强、核质浓缩、核碎裂,呈凋亡改变;Asodn组细胞增殖抑制率、细胞凋亡率、caspase-3蛋白表达均增高,与Control组、Lip组及Sodn组相比差异均有统计学意义（P<0.05）。结论survivin反义寡核苷酸可诱导胃癌细胞凋亡,其作用机制可能是通过激活caspase-3表达,启动凋亡信号传导。
王伟强[10]（2009）在《程序性细胞死亡4增强胃癌细胞对TRAIL的敏感性及机制研究》文中指出前言肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（Tumor necrosis factor related apoptosis induced ligand,TRAIL）可选择性地诱导癌细胞凋亡,而对正常细胞无显着毒性作用,从而成为肿瘤治疗的研究热点。然而,许多肿瘤细胞对TRAIL诱导的细胞凋亡缺乏敏感性,其调控机制仍不明确,这使TRAIL的临床应用受到很大的限制。研究表明,肿瘤细胞对TRAIL的耐受性不仅仅是TRAIL受体的表达不同,更主要的是由于作用于TRAIL受体下游众多调控因子的作用。当然,肿瘤细胞对TRAIL的耐受性并不是一成不变的,化疗药物、RNA合成抑制剂或蛋白质合成抑制剂可调控TRAIL的敏感性。因此,探讨对TRAIL敏感性的调控因子及机制有助于肿瘤的治疗。基于TRAIL在肿瘤治疗中的重要作用及其面临的挑战,我们致力于寻求TRAIL的调控因子并探讨其机制。程序性细胞死亡因子4（Prgrammed cell death 4,PDCD4）作为新近发现的一种肿瘤抑制剂,可以抑制肿瘤的发生、进展及转移,并且可以提高肿瘤细胞对化疗、放疗的敏感性。既然PDCD4在肿瘤的发生、治疗及预后中起着重要的作用,那么,PDCD4能否增强胃癌细胞对TRAIL的敏感性?其调控机制如何?我们将重点放在了FLICE抑制蛋白（FLICE-inhibitory protein,FLIP）上。FLIP是凋亡抑制蛋白,是调控TRAIL诱导的细胞凋亡的重要因子。FLIP蛋白与半光天冬酶-8（Cysteine proteases with aspartate , caspase-8）有高度的结构相似性,能与caspase-8相互竞争而使其不能结合到Fas相关死亡受体包含蛋白（Fas associated DD-containing protein,FADD）,从而抑制细胞凋亡。另外,磷脂酰肌醇-3-激酶/丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（Phosphatidylinositol-3-kinase / Ser/Thr protein kinase, PI3K/Akt）途径在调控细胞的增生、存活及迁移的过程中起着重要的作用。研究表明,PDCD4可被Akt磷酸化从而抑制其活性。我们设想PI3K/Akt是PDCD4的上游调控因子。我们以往的研究发现TRAIL可以诱导胃癌细胞或肝癌细胞的凋亡,并且发现了一些可调控TRAIL敏感性的因子如端粒酶逆转录酶、DNMT1基因及阿司匹林。PDCD4对TRAIL诱导胃癌细胞凋亡的敏感性的影响国内外尚未见文献报道,为此我们观察了PDCD4对TRAIL敏感性的影响,并对FLIP和PI3K/Akt途径在此过程中的作用进行了研究。材料和方法1.细胞株和抗体人胃癌细胞株MKN28、SGC7901、BGC823于含10%标准胎牛血清的RPMI1640培养基,37℃、5%CO2孵箱内培养。可溶性重组人TRAIL购自ProSpect（以色列）;羊抗人PDCD4、鼠抗人FLIP、鼠抗人caspase-8及活化的caspase-8（cleaved-caspase-8） （p41/43）、鼠抗人Akt及磷酸化Akt（p-Akt）购自SantaCruz（美国）;鼠抗人β-actin、辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）包被的羊抗鼠二抗、兔抗羊二抗、羊抗兔二抗购自Boister（中国）。2.含PDCD4基因质粒构建和转染pBluescriptR-PDCD4质粒（Invitrogen,美国）经限制性内切酶BamH I、EcoR I双酶切后获得PDCD4 cDNA片段。将PDCD4片段亚克隆至真核表达载体pIRES2-EGFP（全军烧伤研究所）,转染至感受态大肠杆菌DH5α,接种至含30%卡那霉素的LB培养皿中,挑取单个菌落进行扩大培养,提取质粒并经酶切及测序鉴定获得含PDCD4基因的质粒,命名为pIRES2-PDCD4。利用脂质体2000（Invitrogen）转染至胃癌细胞BGC823中。转染细胞经G418筛选3 W,获得表达绿色荧光的单个细胞克隆,进行扩大培养,获得稳定过表达PDCD4的细胞系。3. PDCD4 RNA干扰针对PDCD4的短发夹RNA（short hairpin RNA,shRNA）片段（5’GTGCTTCTG AGTTACTCTA3’）亚克隆至pRNAT-U6.1/Neo载体,经测序鉴定后转染至胃癌细胞MKN28中,经G418筛选后获得干扰PDCD4表达的细胞系。4. Western Blot细胞经裂解液裂解30min,低温离心15min,取上清得细胞总蛋白。50μg蛋白加入2×上样缓冲液于100℃变性5min,经SDS-PAGE电泳分离,转移至硝酸纤维素膜上,结合特异性抗体及相应二抗,经增强化学发光剂（enhanced chemilum inescence,ECL）（ Bioster,中国）显色,经X光片曝光、显影、定影,图片经BandScan软件进行灰度分析。5.逆转录多聚酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR）细胞总RNA经Trizol（Invitrogen）提取。RT-PCR反应参照RT-PCR试剂盒（Promega,美国）操作说明书进行。β- actin作为内参照,反应产物经琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像仪（Bio-Rad ,美国）分析。6.细胞存活率和凋亡率检测胃癌细胞接种至96孔板,经TRAIL作用后,以0.5mg/ml噻唑兰（Thiazolyl blue,MTT）作用4h,加入二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide,DMSO）振摇10min,经酶标仪（BioRad,美国）于490nm波长下检测吸光度。细胞存活率为处理组吸光度值除以未处理组吸光度值。细胞核经二脒基苯基吲哚（diamidino-phenyl-indole, DAPI）染色,激光共聚焦显微镜（LSM510,META,德国）观察细胞核形态改变并计数细胞凋亡率。7.统计学分析数据以x±SD表示,配对资料进行双尾t检验,P<0.05有统计学意义。结果1. PDCD4在胃癌细胞系中的表达与TRAIL的敏感性相关我们首先通过RT-PCR方法检测了不同分化程度的胃癌细胞中PDCD4 mRNA的表达结果发现PDCD4mRNA在MKN28细胞中的表达（0.25±0.03）明显高于BGC823细胞中表达（0.12±0.01）,P<0.05。Western Blot检测发现PDCD4蛋白在MKN28细胞中表达（0.35±0.04）较BGC823细胞中表达（0.09±0.01）明显增高,P<0.05。MTT及细胞凋亡分析发现MKN28细胞对TRAIL最敏感,而BGC823细胞对TRAIL最不敏感。2.过表达PDCD4促进BGC823细胞对TRAIL的敏感性pIRES2-PDCD4转染至BGC823细胞中,经G418筛选后PDCD4蛋白和mRNA表达较未转染组明显增高,P<0.01。转染PDCD4后的BGC823细胞对TRAIL敏感性无论从时效性和量效性上均较未转染组明显增强。3.干扰PDCD4抑制MKN28细胞对TRAIL的敏感性PDCD4 shRNA转染至MKN28细胞后PDCD4表达较未干扰组明显降低,干扰效率为86%。干扰PDCD4的MKN28细胞对TRAIL敏感性较未干扰组明显降低。4.在TRAIL诱导的细胞凋亡过程中,PDCD4调控FLIP表达为了验证PDCD4对FLIP的调控作用,我们用Western Blot检测了FLIP蛋白及caspase-8的活性,结果表明在过表PDCD4的BGC823细胞中FLIP蛋白表达下降,而caspase-8活性增强。经TRAIL处理后,在过表达PDCD4的BGC823细胞中FLIP蛋白呈逐渐下降趋势,而caspase-8活性逐渐增强,并且细胞对TRAIL敏感性增强。干扰PDCD4后的MKN28细胞FLIP蛋白表达增强,caspase-8活性降低,并且经TRAIL处理后FLIP蛋白不再有下降趋势,caspase-8活性亦不呈现增高趋势,细胞对TRAIL的敏感性降低。为了探讨PDCD4调控FLIP的机制,我们用RT-PCR方法检测了PDCD4对FLIP mRNA表达的影响,结果发现过表达PDCD4后FLIP mRNA表达下降,而干扰PDCD4后FLIP mRNA表达增高。另外,经蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞后,PDCD4不再调控FLIP蛋白的表达。这表明PDCD4既调控FLIP的转录又通过调控蛋白酶体来调控FLIP蛋白的降解。5. PDCD4受PI3K/Akt途径调控首先,通过对不同胃癌细胞中Akt活性的检测,我们发现Akt活性MKN28细胞中表达最低,而在BGC823细胞中表达最高。通过LY294002抑制Akt活性后,BGC823细胞PDCD4表达增高,FLIP蛋白表达降低,caspase-8活性增强,并且细胞对TRAIL敏感性增强。结论1.PDCD4在胃癌细胞中的表达与TRAIL的敏感性相关,PDCD4表达越高,对TRAIL的敏感性越强。2.过表达PDCD4能增强BGC823细胞对TRAIL的敏感性。3.干扰PDCD4能抑制MKN28细胞对TRAIL的敏感性。4.PDCD4在TRAIL诱导的细胞凋亡过程中调控FLIP蛋白,并且这种调控作用既在转录水平,又在转录后水平。5.PDCD4本身受PI3K/Akt途径的调节。
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
| 提要 |
| 中文摘要 |
| abstract |
| 文章缩略词表 |
| 引言 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 TGF-β的概述 |
| 1.1.1 TGF-β的来源 |
| 1.1.2 TGF-β的表达 |
| 1.1.3 TGF-β的结构 |
| 1.1.4 TGF-β的信号通路 |
| 1.2 TGF-β的生物学活性 |
| 1.2.1 TGF-β对胚胎发育的调节 |
| 1.2.2 TGF-β对免疫应答的负向调节 |
| 1.2.3 TGF-β2对肿瘤的生长,侵袭及迁移的促进作用 |
| 1.2.4 TGF-β对组织损伤修复、创面愈合、瘢痕增生的促进作用及炎症反应的抑制作用 |
| 1.2.5 TGF-β2对纤维化的调节作用 |
| 1.2.6 TGF-β对肿瘤的抑制作用 |
| 1.3 靶向TGF-β2的药物 |
| 1.3.1 TGF-β2的反义寡核苷酸 |
| 1.3.2 TGF-β2的micro RNA |
| 1.3.3 TGF-β2的sh RNA |
| 1.3.4 TGF-β2的抗体 |
| 1.3.5 TGF-β2的反义基因修饰的同种异体肿瘤疫苗 |
| 1.3.6 TGF-β2的反义基因修饰的同种异体肿瘤疫苗 |
| 1.3.7 TGF-β2的抑制剂 |
| 1.4 疫苗佐剂的概述及其研究进展 |
| 1.4.1 增强第一信号的佐剂 |
| 1.4.2 增强第二信号的佐剂 |
| 1.4.3 增强第三信号的佐剂 |
| 1.4.4 抑制T细胞抑制信号的佐剂 |
| 1.4.5 改善肿瘤免疫抑制微环境的佐剂 |
| 1.4.6 病毒载体佐剂 |
| 1.4.7 其他佐剂 |
| 1.4.8 多佐剂肿瘤疫苗 |
| 1.4.9 佐剂的接种途径 |
| 1.4.10 佐剂发挥作用的机制 |
| 1.5 RNA靶向性寡核苷酸的研究进展 |
| 1.5.1 反义寡核苷酸(Antisense oligonucleotide) |
| 1.5.2 siRNA |
| 1.5.3 micro RNA |
| 1.5.4 反义寡核苷酸的化学修饰方法 |
| 第2章 材料方法 |
| 2.1 ODN及引物 |
| 2.2 实验试剂,仪器与耗材 |
| 2.3 细胞与细胞系 |
| 2.4 实验动物 |
| 2.5 IAV的扩增 |
| 2.6 IAV TCID50 的测定 |
| 2.7 IAV血凝效价的测定 |
| 2.8 聚合酶链式反应(RT-PCR) |
| 2.9 小鼠PBMC、脾脏及淋巴结单细胞悬液的制备 |
| 2.10 TIO对 TGF-β2 m RNA表达的抑制实验 |
| 2.11 流式细胞术(Flow cytometry) |
| 2.12 蛋白免疫印迹实验(Western Blotting analysis) |
| 2.13 免疫荧光技术 |
| 2.14 TIO在小鼠器官和组织中的分布检测 |
| 2.15 小鼠的免疫 |
| 2.15.1 疫苗的制备 |
| 2.15.2 小鼠的免疫和血清的收集 |
| 2.16 酶联免疫吸附试验(ELISA) |
| 2.17 流感病毒攻毒实验 |
| 2.18 小鼠肺组织的病理学观察 |
| 2.19 脑胶质瘤细胞裂解物(TCL)的制备 |
| 2.20 GL261脑胶质瘤原位模型的建立 |
| 2.21 脑胶质瘤预防模型的建立 |
| 2.22 脑胶质瘤治疗模型的建立 |
| 2.23 肿瘤周围浸润的炎性细胞的检测 |
| 2.24 肿瘤组织病理分析 |
| 2.25 胃癌背部移植瘤模型的建立 |
| 2.26 统计学分析 |
| 第3章 研究结果 |
| 3.1 靶向TGF-β2的反义寡核苷酸的设计与筛选 |
| 3.2 TIOs对 RAW264.7 细胞,U-937 细胞及CAL-1 细胞表达TGF-β2的影响 |
| 3.2.1 TIOs对 IL-4 诱导的RAW264.7 细胞TGF-β2 m RNA表达的影响 |
| 3.2.2 TIOs对 IL-4诱导的RAW264.7细胞Arg1及TNF-αmRNA表达的影响 |
| 3.2.3 TIOs对 LPS诱导的RAW264.7 细胞TGF-β2 mRNA表达的影响 |
| 3.2.4 TIOs对 LPS诱导的U-937 细胞表达TGF-β2 mRNA的影响 |
| 3.2.5 TIOs对甲型流感病毒(IAV)诱导的CAL-1 细胞TGF-β2mRNA表达的影响 |
| 3.2.6 TIOs对 IL-4/LPS诱导的RAW264.7/U-937细胞表达TGF-β2蛋白的影响 |
| 3.3 TIO3在细胞和组织中的分布 |
| 3.4 TIOs的微生物疫苗佐剂效应 |
| 3.4.1 TIOs对微生物疫苗诱导的抗体产生水平的影响 |
| 3.4.2 TIO3对流感病毒疫苗诱导的抗流感病毒效率的增强作用 |
| 3.4.3 TIO1和TIO3 的微生物疫苗佐剂效应的可能机制 |
| 3.4.4 TIOs的微生物疫苗佐剂的安全性评价 |
| 3.5 TIO的胶质瘤疫苗的佐剂作用 |
| 3.5.1 TIOs为佐剂的胶质瘤细胞裂解物疫苗对原位接种脑胶质瘤预防模型小鼠的影响 |
| 3.5.2 TIOs为佐剂的胶质瘤疫苗对原位接种胶质瘤治疗模型小鼠生存期的影响 |
| 3.6 单独应用TIO3的抗胶质瘤及抗胃癌作用 |
| 3.6.1 单独应用TIO3对脑胶质瘤原位移植瘤模型小鼠生存期的影响 |
| 3.6.2 单独应用TIO3对胃癌背部移植瘤模型小鼠体重、肿瘤大小及生存期的影响 |
| 3.6.3 单独应用TIO3对胃癌细胞腹腔种植模型小鼠生存期的影响 |
| 第4章 讨论 |
| 4.1 TIOs的微生物疫苗佐剂效应 |
| 4.1.1 TIO3对CD4~+T细胞表面s TGF-β2 表达的抑制作用 |
| 4.1.2 TIO3 对 CD19~+ B 细胞表面 sTGF-β2 表达的抑制作用 |
| 4.1.3 TIO3的药效动力学分析 |
| 4.1.4 TIO1,TIO2及TIO3 的不同功效的机理分析 |
| 4.1.5 TIO3用于微生物疫苗佐剂的副作用分析 |
| 4.1.6 TIO3用于微生物疫苗佐剂的可行性分析 |
| 4.2 TIO3的胶质瘤疫苗佐剂效应 |
| 4.2.1 TIO3 对胶质瘤细胞MHC I分子表达的上调作用 |
| 4.2.2 TIO3的胶质瘤疫苗佐剂效应的机理分析 |
| 4.3 单独应用TIO3的抗胶质瘤和抗胃癌作用 |
| 4.4 总结和展望 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 附录1 |
| 附录2 The College of Basic Medical Sciences of Jilin University Ethics Committee Approval Form |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 胃癌中差异表达的mRNA、lncRNA和circRNA调控网络的构建及分析 |
| 一、实验方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 circFOXO3在胃癌增殖和转移进程中的功能 |
| 一、材料和试剂 |
| 二、实验方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 参考文献 |
| 全文总结与展望 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表论文和参加科研工作情况说明 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词简表 |
| 前言 |
| 第一部分 miR-4295 通过PTEN/PI3K/AKT通路调控胃癌生长和侵袭迁移的研究 |
| 第1章 miR-4295在胃癌细胞系和组织中的表达 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.2.1 材料 |
| 1.2.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 细胞总RNA的提取、质量和完整性鉴定 |
| 1.3.2 胃癌细胞中miR-4295表达水平检测 |
| 1.3.3 胃癌组织中miR-4295表达水平检测 |
| 1.3.4 miR-4295与胃癌临床病理特征相关性 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第2章 miR-4295对胃癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 miR-4295阳性克隆的测序结果 |
| 2.3.2 qRT-PCR检测转染胃癌细胞中miR-4295的表达水平 |
| 2.3.3 miR-4295表达水平改变对胃癌细胞增殖活力、生长能力的影响 |
| 2.3.4 划痕及Transwell实验检测miR-4295 及其inhibitor对胃癌细胞迁移的影响 |
| 2.3.5 Transwell实验检测miR-4295 及其inhibitor对胃癌细胞侵袭的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 miR-4295的潜在靶基因筛选 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 材料 |
| 3.2.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 miR-4295潜在靶基因的功能通路和蛋白分子互作(PPI)网络关系 |
| 3.3.2 通过TCGA数据库GEPIA分析miR-4295 靶向hubgene在胃癌中的相关性分析 |
| 3.3.3 通过TCGA数据库GEPIA分析miR-4295 靶向hubgene与胃癌患者的生存分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 miR-4295促进胃癌细胞增殖和侵袭转移的分子机制 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 材料 |
| 4.2.2 方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 双荧光素酶报告系统验证miR-4295 分别与PTEN及BCL2L11基因的靶向调控关系 |
| 4.3.2 q RT-PCR检测靶基因m RNA及其下游基因m RNA表达水平的影响 |
| 4.3.3 miR-4295对PTEN蛋白及其下游蛋白表达水平的影响 |
| 4.3.4 miR-4295 联合AKT抑制剂对胃癌细胞增殖的影响 |
| 4.3.5 miR-4295 联合AKT抑制剂对胃癌细胞凋亡的影响 |
| 4.3.6 miR-4295 联合AKT抑制剂对胃癌细胞迁移的影响 |
| 4.3.7 miR-4295 联合AKT抑制剂对胃癌细胞侵袭的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第二部分 lncRNA HOTAIR在胃癌中的表达及其功能研究 |
| 第1章 lncRNA HOTAIR在胃癌细胞系和组织中的表达 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.2.1 材料 |
| 1.2.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 细胞总RNA提取、质量及完整性鉴定 |
| 1.3.2 胃癌细胞中HOTAIR表达水平检测 |
| 1.3.3 HOTAIR在 TCGA数据库胃癌组织中表达情况 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第2章 lncRNA HOTAIR对胃癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 qRT-PCR检测转染胃癌细胞中HOTAIR的表达水平 |
| 2.3.2 下调HOTAIR对胃癌细胞增殖活力、生长能力的影响 |
| 2.3.3 划痕及Transwell实验检测HOTAIR对胃癌细胞迁移的影响 |
| 2.3.4 Transwell实验检测HOTAIR对胃癌细胞侵袭的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 miR-4295与lncRNA HOTAIR相关性分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 材料 |
| 3.2.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 双荧光素酶报告系统验证miR-4295与HOTAIR的结合情况 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间主要的研究成果 |
| 基金资助 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 前言 |
| 1 胃癌的病因和发病机制 |
| 2 MIRNA在癌症中的作用 |
| 3 MIRNA在胃癌中的作用 |
| 第一部分: MIR-129-5P在胃癌组织和胃癌细胞系中的表达差异 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 第二部分: MIR-129-5P对胃癌细胞系增殖和侵袭的影响 |
| 2.1 研究背景 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三部分: MIR-129-5P通过靶基因ADAM9参与胃癌细胞增殖和侵袭的调控 |
| 3.1 研究背景 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 创新点 |
| 综述一 胃癌的新辅助治疗研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 MIRNA在癌症治疗中的探索 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 siRNA CLIC1重组慢病毒载体及低表达CLIC1稳转胃癌细胞株的构建及鉴定 |
| 材料与方法 |
| 1. 主要材料 |
| 2. 主要试剂及仪器设备 |
| 3. 实验用主要液体的配制 |
| 4. 实验方法 |
| 5. 统计学方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 第二部分 siRNA沉默CLIC1基因表达后对胃癌细胞生物学行为的影响 |
| 材料与方法 |
| 1. 主要试剂 |
| 2. 主要仪器设备 |
| 3. 实验用主要液体的配制 |
| 4. 实验方法 |
| 5. 统计学方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 第三部分 基于iTRAQ的蛋白组学技术筛选抑制CLIC1表达前后胃癌细胞SGC-7901中的差异表达蛋白 |
| 材料与方法 |
| 1. 主要试剂 |
| 2. 主要仪器设备 |
| 3. 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 第四部分 siRNA抑制CLIC1基因表达后对胃癌细胞凋亡和整合素基因及蛋白的影响 |
| 材料与方法 |
| 1. 主要试剂 |
| 2. 主要仪器设备 |
| 3. 实验用主要液体的配制 |
| 4. 实验方法 |
| 6. 统计学方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 附录 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 附件 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 细胞株培养 |
| 1.2.2 细胞分组及转染 |
| 1.2.3 Western blot法检测细胞survivin蛋白表达 |
| 1.2.4 流式细胞仪检测细胞凋亡率 |
| 1.2.5 MTT 法检测各组细胞对多西他赛的敏感性 |
| 1.3 统计学处理 |
| 2 结 果 |
| 2.1 ASODN转染后SGC7901细胞survivin蛋白表达变化 |
| 2.2 ASODN转染对细胞凋亡率的影响 |
| 2.3 ASODN转染后胃癌细胞对多西他赛敏感性的检测 |
| 3 讨 论 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 细胞分组及转染 |
| 1.2.2 Western blot法检测细胞Survivin蛋白表达 |
| 1.2.3 流式细胞术检测细胞凋亡率 |
| 1.2.4 免疫组化SP法检测细胞阳性率 |
| 1.3 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 ASODN转染后胃癌细胞Survivin蛋白表达变化 |
| 2.2 ASODN转染对胃癌细胞凋亡率的影响 |
| 2.3 ASODN转染对胃癌细胞PCNA表达水平的影响 |
| 3 讨论 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 细胞株培养: |
| 1.2.2 细胞分组及转染: |
| 1.2.3 ASODN处理前后人胃癌细胞SGC7901的形态学观察: |
| 1.2.4 Western blot 法检测细胞survivin蛋白表达: |
| 1.2.5 流式细胞术检测细胞凋亡率: |
| 1.2.6 免疫细胞化学染色 (SP法) : |
| 2 结 果 |
| 2.1 ASODN转染后SGC7901细胞survivin蛋白表达变化 |
| 2.2 ASODN转染对细胞凋亡率的影响 |
| 2.3 Survivin ASODN作用后SGC7901细胞形态学的变化 |
| 2.3 ASODN转染后对SGC7901细胞中Ki67表达水平的影响 |
| 3 讨 论 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 实验分组及细胞转染 |
| 1.2.2 MTT检测细胞增殖抑制率 |
| 1.2.3 Western blot检测caspase-3蛋白表达 |
| 1.2.4 Hoechst染色检测细胞凋亡形态改变及流式细胞仪检测细胞凋亡率 |
| 1.3 统计学处理 |
| 2 结 果 |
| 2.1 survivin反义寡核苷酸对SGC7901细胞增殖的抑制作用 |
| 2.2 caspase-3蛋白的表达 |
| 2.3 Hoechst 33258染色及流式细胞仪检测细胞凋亡结果 |
| 3 讨 论 |
| 英文缩写索引 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 论文正文 程序性细胞死亡4 增强胃癌细胞对TRAIL 的敏感性及机制研究 |
| 前言 |
| 第一部分 胃癌细胞PDCD4 的表达与对TRAIL 敏感性的关系 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 胃癌细胞PDCD4 基因转染对TRAIL 诱导细胞凋亡敏感性的影响 |
| 前言 |
| 第一章 PDCD4 真核表达载体的构建及鉴定 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 第二章 PDCD4 基因转染BGC823 细胞及鉴定 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 第三章 胃癌细胞PDCD4 基因转染对TRAIL 诱导细胞凋亡敏感性的影响 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 胃癌细胞PDCD4 RNA 干扰对TRAIL 敏感性的影响 |
| 前言 |
| 第一章 人PDCD4 RNA 干扰载体的构建 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 第二章 PDCD4 干扰质粒转染MKN28 细胞 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 第三章 干扰胃癌细胞PDCD4 表达对TRAIL 敏感性的影响 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 PDCD4 增强胃癌细胞对TRAIL 敏感性的分子机制 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 致谢 |
| 图片 |
| 文献综述 程序性细胞死亡因子4 在消化系肿瘤中的作用及调控机制 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表论文情况 |
| 英文论着 |
