李梦蛟[1]（2021）在《小麦氮效率关键NRT基因的鉴定及功能解析》文中提出小麦是一种重要的粮食作物,为世界上超过三分之一人口的主粮作物。随着全球人口的增加,高产优质小麦的产出对于实现小麦农业生产的可持续发展以及保障国家的粮食安全具有重要意义。氮肥在小麦生产中扮演着重要的角色,对于小麦的增产贡献约为30%。但是,目前小麦的氮肥利用效率仅为33-50%,过量的氮肥施用不仅增加了农业投入,还造成了一系列的环境问题。因此,如何提高小麦氮效率（Nitrogen use efficiency,NUE）成为一个重要的课题。培育氮高效的小麦品种是解决这一问题的重要途径。为育成氮高效的小麦品种,需要深入了解小麦氮吸收利用的遗传及分子机制。本研究首先通过Meta分析,发现编码转运蛋白的基因在影响作物产量及NUE中的作用相比其他基因更为突出。因此,本研究对小麦基因组内可能编码硝酸盐转运蛋白（Nitrate transporter,NRT）的基因家族进行了深入分析。同时,利用候选基因关联分析定位到了显着影响小麦氮效率的目的基因Ta NRT2.1-6B,在此基础上,本研究通过非洲爪蟾卵母细胞异源表达体系验证了其硝酸盐转运活性,通过拟南芥突变体回补试验以及小麦基因过表达试验,深入解析了Ta NRT2.1-6B在调控植物氮吸收利用过程中的重要作用。本研究的主要结果如下:1.通过Meta分析,发现转基因技术可以显着提高小麦、玉米和水稻等3大粮食作物的产量、地上部生物量、氮吸收效率（Nitrogen uptake efficiency,NUp E）和氮肥偏生产力（Partial factor productivity of nitrogen,PFPN）,提高程度分别为16.7%、10.1%、16.2%和9.5%,但降低了作物的地上部氮利用效率（Shoot nitrogen utilization efficiency,SNUE）和籽粒氮利用效率（Grain nitrogen utilization efficiency,GNUE）,分别降低了6.6%和5.0%。与其他基因类型相比,编码转运蛋白的基因在提高作物产量和NUE方面的作用更加突出,对作物的产量、NUp E和PFPN分别提高了36.7%、46.1%和32.4%。转基因技术在提高作物NUE方面的效果因作物种类以及试验条件的不同而有明显差异,对水稻的产量增加最为明显,增产20.4%;盆栽条件下对作物产量和NUp E增加最为明显,分别增加了36.7%和26.8%。但基因超表达和异位表达在影响作物NUE方面无显着差异。基因超表达程度与作物NUE的提高之间无显着相关性。2.对小麦基因组内的NPF（Nitrate transporter 1 and peptide transporter family）基因家族和NRT2基因家族进行了深入分析,发现小麦基因组内存在331个NPF基因及46个NRT2基因,NPF基因主要分布在2A、2B、2D、3A、3B、3D、7A、7B和7D染色体上,主要分布在染色体的R2b区域;NRT2基因主要分布在6A、6B和6D染色体上,主要分布在染色体的R1区域;串联重复是NRT2基因在小麦基因组扩展的主要因素;分别有41和91个NPF基因与拟南芥和水稻基因组NPF基因存在共线性;有6个NRT2基因与水稻的NRT2基因存在共线性;通过加权基因共表达网络分析（Weighted gene coexpression network analysis,WGCNA）发现多个转录因子家族（b HLH、WRKY、MYB、NAC、b ZIP、GRAS等）与NPF基因或者NRT2基因共表达;非洲爪蟾卵母细胞异源表达试验发现,选定的2个NPF基因及1个NRT2基因可以在0.5 m M或10m M硝酸盐浓度下转运硝酸盐;通过基因进化分析发现NPF基因和NRT2基因的自然突变可以显着影响小麦氮效率相关性状,NPF基因和NRT2基因的多态性主要是由于基因的随机漂变引起的,而不是育种选择。3.以291个小麦品种的6个NUE相关性状与46个NRT2基因相关的170个单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism,SNP）数据进行候选基因关联分析,共得到4个显着关联的NRT2基因。基因Traes CS6B02G044300（Ta NRT2.1-6B）与6个性状中的4个性状均显着关联,且该基因的不同单倍型显着影响了小麦的产量及NUE性状。亚细胞定位试验发现Ta NRT2.1-6B主要在细胞质膜上表达;非洲爪蟾卵母细胞异源表达试验发现该基因在0.25 m M和10 m M硝酸盐浓度下均能转运硝酸盐,进一步通过硝酸盐吸收动力学试验发现该基因是一个双亲和硝酸盐转运蛋白,低氮和高氮条件下的Km值分别为0.36±0.13 m M和20.52±3.26 m M。在拟南芥atnrt1.1突变体中回补该基因,明显改善了拟南芥根系生长及15N累积量;在小麦中过表达该基因,改善了苗期小麦的根系生长、15N累积量及吸收速率,提高了不同氮环境条件下小麦成熟期的产量、根系干重、地上部干重、根系氮累积量及籽粒氮累积量;提高了低氮条件下小麦的氮收获指数、籽粒氮利用效率和地上部氮利用效率。4.通过烟草瞬时表达发现Ta NRT2.1-6B的上游160 bp以内存在影响启动子活性的重要元件,在上游1000 bp到3000 bp以内可能存在沉默子等元件影响启动子活性。通过反向Ch IP（Chromatin Immunoprecipitation）及酵母单杂交试验发现组蛋白、甲基化酶、蛋白激酶、TCP转录因子、b HLH转录因子及GRAS转录因子等可能影响着Ta NRT2.1-6B的表达。综上所述,与其他基因类型相比,转运蛋白对作物产量及NUE相关性状影响更显着;在小麦基因组内存在331个NPF基因和46个NRT2基因,NPF基因和NRT2基因的自然变异显着影响着小麦的产量及NUE相关性状;Ta NRT2.1-6B是小麦基因组内一个双亲和硝酸盐转运蛋白,过表达该基因对于提高小麦的产量及NUE具有重要作用。GRAS转录因子（Traes CS2D02G198200）可能是一个潜在的影响Ta NRT2.1-6B表达的转录因子。
李成华[2]（2021）在《刺参腐皮综合征发生的分子调控机制研究进展》文中提出2003年以来,海参产业发展速度和拓展规模均达到前所未有的水平,在国内形成了继海带、对虾、扇贝、海水鱼类养殖之后"第五次"海水养殖产业浪潮。伴随着养殖规模和密度的扩大,病害问题也日益凸显,已逐渐成为海参产业健康发展的瓶颈,对生态环境和食品安全威胁巨大,其中以腐皮综合征最具代表性。本文梳理分析了刺参Apostichopus japonicus腐皮综合征的主要病原,系统阐述了刺参应对病原感染的免疫调节机制和代表性病原致病机制研究进展,总结了刺参病害的生态防治方法,并在实现刺参产业健康可持续发展、病原致病机制及环境调控疾病发生研究等方面提出了相应发展对策,以期为构建绿色健康的刺参疾病防控策略提供参考。
李茜[3]（2021）在《APEC O1型E516摄铁基因c2515和c2516缺失株的生物学特性及C2515单克隆抗体的研制》文中研究表明禽致病性大肠杆菌（Avian pathogenic Escherichia coli,APEC）是在禽类中广泛传播,可引起禽类严重的局部和/或全身性感染的重要肠道外致病菌,给养禽业造成巨大经济损失。APEC抗原分型复杂多样,一般以O抗原为主要分型依据,常见致病性菌株包括O1、O2、O78等血清型。在肠外环境中摄取铁的能力是APEC生存的前提,为了适应贫铁环境,APEC进化出多种铁摄取系统,以满足对铁的需求,包括:SitABCD铁转运系统,血红素,肠菌素、气杆菌素、沙门菌素和耶尔森菌素等铁载体系统,然而这些铁摄取系统的许多组成部分功能仍不清楚。前期研究对本室分离、鉴定、保存的APEC O1型强毒株E516菌株进行基因组测序,以本室分离、鉴定、保存的E058（02）和E522（O78）菌株基因组序列为参考,发现了只存在于E516菌株而不存在于E058（02）和E522（O78）菌株的两个假定的铁转运基因,由于它们与尿道致病性大肠杆菌CFT073的c2515（768bp）和c2516（1059bp）基因100%同源,因此我们亦将其命名为c2515和c2516。在本研究中,我们构建了 E516 c2515和c2516基因缺失株及回补株,并通过体外和体内试验研究了它们的生物学特性和致病性。本研究通过逆转录PCR（RT-PCR）、生长特性测定、CAS试验、HD11胞内存活试验、致病性试验等方法,分析了c2515、c2516基因功能及各菌株生物学特性。RT-PCR分析表明破坏目标基因阅读框可终止其转录;CAS试验显示E516Δc2515、E516△c2516和E516Δc2515Δc2516产生铁载体的能力较E516相比有所减弱;生长曲线显示各缺失株生长速度在贫铁条件下较野生株缓慢,而在补铁后及普通LB培养基中生长速度基本一致;铁摄取试验显示与野生菌E516相比,各缺失株胞内铁含量降低;细胞感染试验表明,HD11细胞更容易清除铁摄取缺陷型的突变株。上述各试验中双基因缺失株E516Δc2515△c2516与野生株E516相比差异最为显着,E516Δc2515次之,E516Δc2516差异较小。1日龄SPF鸡半数致死量（LD50）及细菌体内定殖试验显示,与野生菌株相比,c2515和c2516基因的缺失影响了 E516菌株在鸡组织中的定殖能力,并且双基因缺失株比野生株毒力下降10倍左右。荧光定量PCR（qRT-PCR）结果表明,在E516Δc2515Δc2516双基因缺失株中,铁摄取相关基因entA,fepC和iutA的转录水平显着低于野生株。总体而言,c2515和c2516可能参与铁载体介导的铁摄取并参与APEC O1菌株E516的致病过程。以上结果提示c2515基因对E516毒力影响更大,为了从蛋白水平研究该基因的功能,我们研制了 C2515蛋白的单克隆抗体（Monoclonalantibody）。通过构建原核表达载体pET11b-c2515-His并导入E.coli BL21（DE3）,诱导表达后,对包涵体形式表达的重组蛋白进行尿素梯度变复性,纯化得到蛋白分子量为28.2 kDa的重组蛋白,与预期一致。C2515蛋白免疫BALB/c小鼠,经过方阵滴定试验,确定间接ELISA（Enzyme linked immunosorbent assay）的最佳适包被抗原浓度为:1.5 μg/mL,选择血清抗体效价最高的小鼠进行细胞融合,经三次亚克隆筛选出3株能稳定分泌C2515特异性抗体的杂交瘤细胞株:1C4、3D6、4B9,经抗体亚类试剂盒鉴定,1C4属于IgG2b亚类,3D6、4B9属于IgG1亚类,3株均属于κ轻链。Western blot结果表示,3株单克隆抗体均可与免疫原C2515蛋白特异性结合,并只能在E516菌株中检测出天然C2515蛋白而在E058和E522中未检测出,与PCR检测结果一致。C2515单抗的获得为其后续功能研究提供了可靠材料,也为进一步研究其在铁摄取系统中的作用奠定了基础。
张全艳[4]（2021）在《苹果硝态氮应答基因MdBT2调控苹果酸积累的机理研究》文中指出酸度是果实中非常重要的品质性状,酸度的高低会直接影响果实的风味及其加工品质。苹果果实中含有大量的有机酸,目前已经检测出有16种有机酸,其中苹果酸是最主要的有机酸,占到总酸量的80%以上,直接决定果实的酸度,影响果实的风味。苹果酸代谢是一个涉及合成、降解和转运的复杂生物过程。其中,苹果酸的合成可以通过细胞质糖酵解、三羧酸循环、卡尔文循环和乙醛酸循环等多种代谢途径实现。高浓度的苹果酸通过主动运输储存在液泡中。液泡型质子泵（V-ATPase和V-PPase）、苹果酸转运蛋白（ALMT）是苹果酸转运进入液泡的关键。液泡型质子泵在液泡内外建立跨膜的电化学势梯度,驱动质子泵入液泡中,使液泡酸化,并为苹果酸转运蛋白提供能量。由于液泡中的酸性环境,苹果酸跨过液泡膜后会立即被质子化,有效地将苹果酸捕获到液泡中。转录因子位于液泡型质子泵和苹果酸转运蛋白的上游,广泛参与调控苹果酸的合成与转运。其中,MYB、b HLH和WD40蛋白通过形成MBW复合体,转录激活编码液泡型质子泵和苹果酸转运蛋白的表达,从而影响苹果酸在液泡中的积累。在苹果中,R2R3-MYB转录因子MdMYB73通过直接与液泡型质子泵和苹果酸转运蛋白相关基因的启动子结合,促进苹果酸的积累。另外,MdCIbHLH1与MdMYB73相互作用,增强MdMYB73对下游相关基因的转录活性,进一步促进苹果酸的积累。植物体内苹果酸的积累受到矿质营养、温度和灌溉方式等外界环境因素和农艺措施的影响。氮素作为植物生长发育过程中所必需的大量营养元素,影响植物体内苹果酸的积累。生产中,果树种植者为了获取较高的产量和经济效益,滥用化肥（以氮肥为主）,导致果实品质下降。过量施加氮肥会降低苹果果实中苹果酸的含量,但是具体机理尚不清楚,这是本研究拟解决的科学问题。本研究以苹果材料为研究对象,探索了硝态氮影响苹果酸积累的分子机制。主要结果如下:1、高浓度的硝态氮抑制苹果中苹果酸的积累。用不同浓度的硝态氮（0、0.5、5 mM）处理苹果愈伤组织、苹果植株和苹果果实,测定苹果酸含量。结果表明,高浓度的硝态氮显着降低了苹果愈伤组织、苹果植株和苹果果实中的苹果酸含量。进一步研究表明,高浓度的硝态氮处理后,液泡型质子泵相关基因、苹果酸转运蛋白MdALMT9以及苹果酸相关的转录因子MdMYB73的表达水平显着降低,质子泵活性也降低,液泡的pH值升高。2、硝态氮应答基因MdBT2抑制苹果中苹果酸的积累。用硝态氮处理MdBT2转基因苹果植株,检测苹果酸含量、苹果酸相关基因的表达水平、质子泵活性以及液泡内的pH值。结果表明,MdBT2响应硝态氮抑制苹果酸的积累。3、MdBT2与MdCIbHLH1和MdMYB73互作。通过对硝态氮应答因子MdBT2进行酵母筛库,发现MdBT2可以与调控苹果酸积累的b HLH转录因子MdCIbHLH1和MYB转录因子MdMYB73相互作用。通过酵母双杂交、pull down以及双分子荧光互补分析,进一步验证了MdBT2与MdCIbHLH1以及MdBT2与MdMYB73的互作。4、MdBT2促进MdCIbHLH1和MdMYB73的泛素化降解。体内和体外的降解分析表明MdBT2可以影响MdCIbHLH1和MdMYB73蛋白的稳定性。泛素化结果表明MdBT2可以通过26S蛋白酶体途径泛素化降解MdCIbHLH1和MdMYB73。5、MdBT2通过影响MdCIbHLH1和MdMYB73,负调控MdALMT9的转录活性,抑制苹果酸的积累。通过对苹果果实进行瞬时注射以及对苹果愈伤组织进行GUS分析,发现MdBT2至少部分地通过MdCIbHLH1和MdMYB73,转录抑制MdALMT9的表达水平,降低质子泵的活性,负调控苹果酸的积累。本研究通过MdBT2-MdCIbHLH1/MdMYB73-MdALMT9调控模块,解析了硝态氮调节苹果酸积累的分子机制,为植物中两个关键代谢产物之间的联系提供了重要线索,并且为苹果酸的翻译后修饰调控途径提供了新的思路。这些发现不仅有助于我们理解苹果酸积累的复杂调控网络,而且对指导果树分子育种和果实品质改良具有重要意义。
彭木[5]（2021）在《生癌肠杆菌JY65的分离及其缓解水稻NaCl胁迫的分子机制解析》文中研究说明目前,土壤盐渍化是影响全球农作物减产的主要因素之一。研究者尝试利用各种方法缓解盐胁迫对植物生长的影响,包括通过基因改造培育耐盐植物、筛选耐盐植物基因型,以及接种植物的有益微生物组,如植物促生菌（PGPB）。PGPB主要存在于植物根系土壤、植物组织和叶或茎的气相表面等部位,这类微生物有利于植物生长,增加植物对非生物胁迫的耐受性。许多盐生植物会招募一些耐盐性的微生物,因此,分离自盐生植物的内生细菌将有助于缓解环境对植物的胁迫。有益的植物与微生物的相互作用在自然界中非常频繁,微生物群落为了解这些有益的相互作用提供了条件。本研究分析了碱蓬属植物共生微生物组的结构差异以及是否招募PGPB,了解可培养细菌的植物促生特性和耐盐碱能力,通过全基因组测序鉴定生癌肠杆菌JY65中参与植物促生和胁迫响应的功能基因,并明确了其调节水稻NaCl胁迫的分子机制,为植物促生菌的合理利用奠定理论基础。（1）以东北林业大学安达市盐碱地试验基地中的碱蓬属植物（盐地碱蓬和角碱蓬）为材料,采集两种植物的茎、叶、根、根际和外周土壤样品,利用Illumina MiSeq平台对其共生微生物组进行了 16S rRNA基因测序,比较不同植物种类和部位对细菌群落的影响程度以及是否存在PGPB。结果表明:碱蓬属植物细菌多样性从外周土壤到根系逐渐降低。两种碱蓬属植物在根际和组织内环境建立了非常相似的植物相关微生物群落。所有样品的优势门均为 Proteobacteria、Actinobacteria、Gemmatimonadetes、Planctomycetes、Bacteroidetes 和Acidobacteria,其中Proteobacteria在组织样品中较为丰富。碱蓬属植物的核心微生物群落为Proteobacteria和Actinobacteria,说明广泛分布的核心微生物可能在群落的稳定性和功能中发挥重要作用。两种碱蓬属植物的不同样品均有丰富的有益菌属,且与植物种类和样品类型相关的微生物群落组成存在显着性差异。细菌群落差异主要在于植物部位而非植物种类。不同植物部位的细菌分子生态网络是非随机的,具有无标度、小世界和模块性等复杂系统的拓扑特征,从而使系统具有稳定性和恢复力,且不同网络间表现出显着不同的拓扑特征。（2）通过分离和鉴定盐地碱蓬外周土壤、根际土壤、根、茎和叶样品中的可培养细菌,评估细菌的植物促生特性和耐盐碱能力。结果发现:可培养细菌主要为Proteobacteria、Firmicutes和Actinobacteria,且以嗜盐细菌为主。综合耐盐碱能力、分泌吲哚乙酸以及植物互作试验,结果表明:所有菌株具有较高的耐盐碱能力,但不同菌株的促生能力差异较大;其中JY65菌株耐盐碱能力较强、且对NaCl胁迫下的水稻株高、根长和鲜重均有显着促进效果,推测该菌株为植物促生菌。（3）通过二代高通量测序技术联合三代单分子测序技术,获得了 JY65菌株的全基因组序列并分析其参与植物促生和耐盐碱的相关基因及代谢通路。结果表明:JY65菌株基因组大小为4 916 634 bp,GC含量为55%,含有4 497个编码序列和82个tRNA。基于16S rRNA基因和平均核苷酸一致性结果,推测JY65属于生癌肠杆菌。同时,鉴定出编码植物促生特性的基因（固氮、磷酸盐溶解、分泌铁载体和IAA等）,以及编码定殖所需的基因（运动性、趋化性、粘附性和分泌系统）。在适应逆境环境方面,发现大量应对氧化应激的多种酶和调控因子,包括:抗氧化酶、Na+/H+反向转运载体、K+转运体、甘氨酸-甜菜碱转运蛋白和海藻糖等。比较不同肠杆菌属的植物促生相关基因,结果发现基因总体分类模式相似,但基因序列差异明显,其中差异主要存在于运动性、趋化性和分泌系统等方面。（4）用水培法对水稻进行NaCl胁迫试验,并接种野生型JY65和不同突变体菌株,结果证实了 JY65菌株具有缓解水稻NaCl胁迫的特性,并解析了 JY65菌株调节水稻NaCl胁迫机制,即通过分泌Na+/H+反向转运蛋白、生物膜、甜菜碱、海藻糖和T6SS等途径减轻水稻NaCl胁迫损伤,同时水稻通过激活非酶促（AsA和GSH）和酶促抗氧化系统（SOD、POD、APX、CAT）清除NaCl胁迫下活性氧的积累,并促进盐响应相关基因的表达（OsSOS1、OsHKT1;1、OsNHX1、OsNHX2、OsNHX3、OsNHX5）,维持细胞渗透胁迫平衡,最终有效缓解NaCl胁迫造成的损伤。
葛诗蓓[6]（2020）在《转录因子HY5诱导独脚金内酯和脂肪酸合成调控番茄丛枝菌根共生的机制研究》文中认为磷是植物生长发育不可或缺的元素,但土壤中的磷元素多以难溶性形态或有机形态存在,无法被植物直接吸收利用。在农业生产中有益微生物的使用能够解决这一问题,如丛枝菌根真菌（Arbuscular mycorrhiza fungi,AMF）。AMF能够与植物根系形成共生系统,为宿主植物提供水分和矿质元素,提高光合速率,改善植株形态,增强植物抗逆性。同时,丛枝菌根能减少肥料的滥用,促进碳、磷、氮的循环,平衡根际微生物群落,改良土壤结构和理化性质,实现农业生态环境的可持续发展。番茄（Solanum lycopersicum）是我国最重要的蔬菜作物之一,具有发展现代化设施产业的潜力,同时番茄也可作为模式植物应用于植物学的基础研究。基于此,本文利用遗传学、分子生物学、植物生理学、生物化学等手段,探究环境因子对番茄菌根共生的影响及其作用机制,主要研究结果如下:第一,探究环境因子对番茄根系中独脚金内酯合成和丛枝菌根共生的作用机制。设置不同的环境因子变量,证实低磷、高浓度CO2（e CO2）和高比例的红光、远红光能够提高番茄根部SLs合成基因CCD7（Carotenoid cleavage dioxygenase7）、CCD8、MAX1（More axillary growth 1）的转录水平。利用病毒诱导的基因沉默技术获得CCD7、CCD8、MAX1沉默植株,证明SLs合成基因参与e CO2调控番茄菌根共生。利用CCD7的CRISPR/Cas9突变株系,证明SLs合成基因介导红光调控番茄菌根共生,进而影响番茄通过菌根共生途径对磷的吸收与积累。第二,深入探究光信号对番茄菌根共生的调控。利用番茄光敏色素突变体材料,检测番茄根部SLs相关指标和菌根共生相关指标,证明了光敏色素phy B对番茄根部SLs合成、菌根共生和磷吸收的正向调控作用。利用不同番茄材料植株和嫁接技术比较地上部和根部phy B的作用效益,实验结果表明地上部phy B主导对番茄根部SLs合成、菌根共生和磷吸收的调控。第三,寻找地上部phy B调控番茄菌根共生的系统信号分子。通过蛋白免疫沉淀实验和嫁接实验,发现地上部phy B能够提高番茄根部光信号转录因子HY5的蛋白积累量。利用HY5的CRISPR/Cas9突变株系探究HY5是否参与地上部phy B对番茄菌根共生的调控。相关指标结果表明HY5能正向调控番茄根部SLs的合成、菌根的共生和磷的吸收,而后利用嫁接实验证明地上部HY5主导了对SLs合成的调控。第四,深入探究HY5在调控番茄菌根共生中的分子机制。通过蛋白免疫沉淀实验和嫁接实验,发现番茄中HY5蛋白具有自上而下移动的能力,印证其为地上部phy B调控番茄菌根共生的系统信号分子。通过凝胶电泳迁移实验、染色质免疫沉淀实验和双荧光素酶报告基因系统实验,相继发现HY5蛋白能够在体外、体内与SLs三个合成基因启动子上的G盒子结合,并促进其转录,有力证明了HY5在调控番茄菌根共生机制中发挥了转录因子的作用。第五,解析HY5如何番茄调控菌根共生中C16脂肪酸的合成。根据序列比对结果和基因表达结果,寻找到番茄中编码合成菌根特异性C16:0-ACP硫酯酶的基因Sl Fat Mc,明确其对番茄菌根共生的积极作用。而后发现Sl Fat Mc基因表达量和HY5蛋白在番茄菌根中的时间动态变化趋势一致。利用HY5相关番茄材料,发现HY5促进番茄菌根中Sl Fat Mc的基因表达,并提高菌根中16:0、16:1ω5脂肪酸的含量和十六碳脂肪酸的比例。通过凝胶电泳迁移实验和双荧光素酶报告基因系统实验,证明HY5能够与Sl Fat Mc基因启动子上的ACE元件结合并促进其表达。基于以上研究结果,我们明确了环境因子中低磷、e CO2和红光通过诱导SLs的合成来调控番茄菌根共生和植株对磷的吸收。深入探究光信号的调控机制,发现系统信号分子HY5自上而下移动,转录调控根系中SLs的合成基因,介导红光-phy B系统对番茄菌根共生的调控。其次,HY5能调控真菌宿主根细胞中C16脂肪酸的合成,进一步促进丛枝菌根的生长发育,促进植物与丛枝菌根真菌的物质交换。以上结论为解析植物菌根共生的作用机制奠定了基础,为设施生产中提高菌根作用效益中提供了科学依据和理论指导。
郭丽丽[7]（2020）在《西太平洋海山区微生物多样性与适应性研究》文中指出深海环境特殊,物种资源丰富,是研究生命起源与演化的最佳场所之一。深海海山不仅蕴藏着丰富的钴结核和铁锰结壳资源,还存在大量能够产生新型生物酶和活性物质的微生物资源。通过参加DY56大洋科学综合调查航次,采集西太平洋海山样品,开展重金属抗性细菌和铁锰氧化还原等细菌分离培养,获得的疑似新种开展多相分类学鉴定。针对海山样品分离的微生物,开展基因组高通量测序和分析,研究了镍抗性细菌和锰氧化细菌的适应性机制。针对一株海洋细菌进行转录组水平的研究,探讨了锌胁迫下不同生长时间的应答反应。本研究综合探讨了海山区微生物资源和海洋微生物对重金属环境的适应性机制。通过可培养的方法从西太平洋36个站位的样品分离细菌739株,隶属于76个属116个不同物种,主要类群是Alaphaproteobacteria（62%）和Gamma-proteobacteria（29%）,Erythrobacter（15%）、Alteromonas（6%）和Henriciella（6%）属,其中疑似新种50株,锰氧化细菌92株,铁还原细菌23株。海山区和非海山区微生物多样性存在明显差异。海山区域PAC25、PAC30、PAC32和PAC36站位的微生物多样性高于其它站位;结合环境因子数据分析,发现水深、硝酸盐含量、p H、活性磷酸盐含量对微生物多样性影响高于温度、溶解氧、盐度和亚硝酸盐含量。非海山区站位的细胞丰度和微生物多样性,靠近岸的大于远岸。通过开展5株海洋微生物疑似新物种的系统多相分类学鉴定,建立了5个细菌新种:Pseudooceannicola lipolyticus sp.nov.、Actibacterium pelagium sp.nov.、Muricauda maritima sp.nov.、Muricauda aequoris sp.nov.、Muricauda oceanensis sp.nov（标准菌株分别是157T、JN33T、72T、NH166T和40DY170T）,并对各属的描述进行了修订,将原本属于Oceanicola属的菌株O.flagellatus comb.nov.重新分类到Pseudooceannicola属。通过基因组分析和金属抗性梯度实验,发现分离于西太平洋海山区的新菌40DY170T含有多个金属抗性及外排转运系统的编码基因,具有多种重金属的抗性。该菌株对Mn2+、Co2+、Cd2+、Ni2+和Zn2+的最小抑制生长浓度分别为20 m M、2 m M、5 m M、5 m M和5 m M。通过生理生化实验和基因组数据的挖掘,对5株海洋细菌的适应性机制进行了研究。镍抗性菌株Sphingobium sp.DY56-G10的基因组中预测到多个csz CBA基因以及与Nre B、Nre A和Rcn R类似的镍高亲和性转运相关蛋白,还有重金属抗性的转运体及多环芳烃降解相关酶编码基因,该菌株具有重金属污染环境修复的潜在功能。对31株锰氧化细菌进行利用LBB指示剂并结合分光光度计法检测,发现18株细菌的锰氧化活性大于390μmol/L。选择Pseudoalteromonas属的3株细菌DY56-GL-22、DY56-GL-68和DY56-GL-79并以P.shioyasakiensis JCM18891T、P.arabiensis JCM 17292T和P.gelatinilytica NH153T作为参比菌株,进行基因组测序和注释分析,发现DY56-GL-22和DY56-GL-68菌株编码的细胞色素氧化酶基因数目明显多于参比菌株,DY56-GL-79菌株的基因组中独有的同源基因数目最多,虽未注释到cop A基因,但锰氧化能力却更高,可能与锰氧化过程复杂的多组分调控系统有关。转录组分析结果显示,锌抗性菌株Halomonas zincidurans B6T在锌胁迫下,0、30和90 min不同生长时间金属转运、鞭毛组装、细菌趋化性、氧化应激响应、氨基酸代谢和细胞基本代谢等差异表达基因参与的代谢通路显着富集。其中HALZIN＿RS0102520（doe C）、L-2,4氨基丁酸转氨酶的编码基因HALZIN＿RS0102525（doe D）、苏氨酸脱氨酶的编码基因HALZIN＿RS0102530,厌氧菌素合成酶的编码基因（icu C）HALZIN＿RS0111510、HALZIN＿RS0111515（hpa I）共5个基因在不同时间差异表达量都比较高,可能起到关键调控作用。
王晓璇[8]（2020）在《拮抗细菌Burkholderia seminalis R456的铁代谢及其调控机制研究》文中指出铁代谢作为微生物的基础代谢之一,维持细胞的催化代谢酶和DNA生物合成等多种重要生理过程。然而环境中有限的铁离子浓度阻碍了微生物的正常繁殖和位点适应,不仅影响各类病原细菌的致病性,也影响生防有益细菌的拮抗活性。在长期的生物进化过程中,微生物已发展出多种铁代谢途径,其中最重要的就是通过分泌高亲和力的铁螯合剂-嗜铁素来协助其在低铁环境获取铁离子;而一些被发现的新嗜铁素及相应的铁代谢途径进化经常是由水平基因转移（horizontal gene transfer,HGT）获取的外来基因（簇）所致。另一方面,铁代谢全局调控因子（Ferric uptake regulator,Fur）作为中央枢纽广泛存在于微生物中,协调不同铁代谢途径间的平衡。本实验室前期工作发现4株Burkholderia seminalis菌株S9,0901,DSM23518,和R456分别扮演了环境腐生,植物和人体病原以及拮抗生防的角色,而这些特异性的角色很大程度是由于每个菌株在长期的进化过程中能适应特定位点,通过多维组学结合表型分析,我们发现这些位点适应很大程度是由于菌株通过HGT,位点差异性表达以及甲基化等表观遗传手段丰富了各自的铁代谢途径,特别是能通过分泌抗菌物质c FP（环二肽）拮抗病原真菌的菌株R456,其基因组中存在一个HGT驱动的位点特异表达的铁相关基因簇。因此,以拮抗菌株R456为对象,深入开展来源于HGT的新型铁代谢及其与Fur之间关系研究,不仅将极大地丰富微生物铁代谢网络,也有利于更好地利用R456等有益微生物。通过研究,本文取得了以下主要结果:首先,本研究在B.seminalis R456中鉴定出了从藻类水平基因转移的新型非核糖体多肽合成酶（nonribosomal peptide synthetases,NRPSs）基因簇,这也是国际上首次发现的藻类向细菌转移的基因簇。基因组分析发现该菌株同时具有嗜铁素ornibactin和pyochelin的合成基因簇以及该水平转移基因簇NRPS-R456。该NRPS基因簇可能主要通过影响嗜铁素合成,铁胁迫生长,生物膜合成和游动性等铁代谢相关表型参与铁代谢途径。通过高效液相色谱-质谱联用,鉴定该菌株在缺铁条件可以合成ornibactin及相关同系物,两种pyochelin异构体。进一步通过制备色谱和镍离子层析柱分离纯化两类嗜铁素并鉴定其活性,结合质谱数据和该基因簇的生信分析结果,预测该基因簇合成一个具有嗜铁素活性的新型多肽;同时该基因簇核心基因的缺失显着降低ornibatcin和pyochelin合成,荧光定量PCR也显示突变体中这两种嗜铁素直接调控因子的表达明显下调。其次,本研究鉴定出上述NRPS-R456基因簇与B.seminalis R456中的传统铁代谢全局调控因子Fur存在相互作用。首先,本研究显示在富铁条件下,Fur的缺失明显使胞内铁含量上调,过氧化氢酶活性降低,过氧化氢耐受性明显减弱,证实了Fur对于铁平衡的调控作用,避免富铁条件下铁过量吸收;其次,为了明确Fur究竟通过影响哪些蛋白来行使其调控功能,我们通过原核表达并制备抗体进行免疫蛋白共沉淀,并通过细菌双杂验证由Fur抗体钓取的蛋白与Fur的互作,经质谱鉴定与Fur互作的蛋白包括核糖体蛋白S1（Rps A）,热激蛋白（Gro EL）,转录终止蛋白（Nus A）,醛脱氢酶（Adh E）,天冬氨酸连接酶（Asp S）,磷酸烯醇丙酮酸羧激酶（Pck G）和热激蛋白（Dna K）;最后,荧光定量PCR鉴定出NRPSR456和Fur在彼此的突变体中都会下调表达,生信分析发现NRPS-R456中存在一个Fur二聚体结合的识别序列,且酵母单杂显示富铁条件下Fur蛋白可以与识别序列结合,从而抑制该基因簇的表达,这些结果清楚地显示了NRPS-R456或许与Fur蛋白协同调控细菌的铁代谢。最后,本论文通过Tn5转座子突变法鉴定出NRPS-R456控制的铁代谢与细菌的拮抗能力相关。首先通过Tn5随机插入构建包含997个R456转座子突变株的突变体库;然后通过缺铁培养基筛选,获得3个明显在缺铁环境生长受限的突变体,通过对峙培养,筛选到10个拮抗水稻纹枯病菌能力明显减弱的突变体,另有1个突变体两种表型均减弱;最后通过反向PCR法鉴定插入基因,结果发现,具有双重减弱表型的突变株转座子插入至NRPS-R456（R456＿2057）中,缺铁环境生长受限的3个突变体,转座子分别插入到参与嘌呤途径的甘氨酰胺合酶（Pur L）,天冬氨酸转氨酶（Asp B）,铁硫簇蛋白;拮抗减弱的10个突变体中,有8个突变体转座子分别插入到糖基转移酶（Glycosyl transferase）,组蛋白（Histone H1）,核糖体甲基转移酶（50S ribosomal protein L11 methyltransferase）,膜完整性相关转运蛋白（Pqi C）,t RNA尿苷合成酶（Mnm G）,硫酸盐转运蛋白（Yei H）,过氧化氢酶（Catalase）,硫酸盐腺苷转移酶（Cys D）,其余3个突变体转座子均插入到质粒上,其中2个突变株的Tn5转座子插入至同一假设蛋白（R456＿6210）,1个突变株转座子插入至另一假设蛋白（R456＿6327）。综上,本论文在拮抗细菌B.seminalis R456中鉴定出一个从藻类水平转移获得的NRPS-R456基因簇,其不仅单独具有全局性的铁代谢调控功能,且与传统的铁代谢全局调控因子Fur存在相互作用,随机插入突变分析显示其特异的拮抗能力或许也很大程度与这个NRPS-R456负责的铁代谢相关,这一研究结果不仅突出了水平转移在细菌铁代谢进化中的作用,也强调了铁代谢进化在细菌适应特定生态位点进而发挥特定生物学功能中的重要性。
季兴龙[9]（2020）在《苹果MdBT2蛋白调控根系发生和抗旱性的机理研究》文中研究说明作为重要的经济作物,苹果在栽培生产过程中经常面临各种生物及非生物胁迫。在农业生产中,施加大量化肥在提高作物产量的同时,也带来了一些生产问题如作物品质和抗病性下降等。氮肥的过度使用不利于果树根系发育。植物根系主要在水分养分吸收、固定植物等方面发挥功能并能响应各种外界信号进而调控其根系形态。在长期的进化过程中,植物演化出了复杂而精细的机制来调节其根系形态。植物主要以硝态氮形式吸收氮元素,硝态氮除了能作为营养物质外,还能作为信号物质调控植物的生长发育。在苹果中,硝态氮调控根系发育的分子机理仍不清楚。大部分植物在生长发育过程中会面临干旱胁迫。轻度干旱胁迫会降低作物产量和品质,重度干旱能导致植物死亡。在中国,苹果大多栽培于丘地山岭等贫瘠、雨水较少的区域,时常面临严重的干旱胁迫。蛋白翻译后修饰在植物响应外界环境信号,调控靶蛋白稳定性和结构、功能中具有重要作用。本研究以苹果苗、愈伤组织和拟南芥等为材料,利用分子生物学的研究方法,解析了Md BT2在苹果根系发育和抗旱方面的作用:1、硝态氮影响苹果根系发育:低浓度硝态氮促进根系发育;高浓度硝态氮抑制根系发育。同时,硝态氮介导的根系发育依赖生长素途径,外源施加NPA抑制了低浓度硝态氮促进的根系发生。定量PCR结果表明:硝态氮影响生长素信号途径中相关基因的表达,说明硝态氮和生长素协同调控苹果根系发育。Md BT2是高氮响应因子。通过实验发现,Md BT2依赖生长素信号途径负调控苹果根系发育。定量PCR结果表明:Md BT2不影响生长素信号途径中Md ARF7、Md ARF8和Md IAA3及生长素运输载体Md PIN1和Md AUX1的表达,但能调控Md ARF8下游基因Md GH3.1和Md GH3.6的表达。3、Md BT2与Md ARF8和Md IAA3互作。通过酵母双杂交、Pull-down和BIFC实验技术验证了Md BT2与两者之间的互作。同时,Md BT2还能与苹果ARF和Aux/IAA蛋白家族中的其它成员互作。Md BT2和At BT2在生长素信号途径中存在不同的调控机制:Md BT2能与拟南芥ARF和Aux/IAA蛋白家族的许多成员互作;拟南芥At BT2不能与任意一个ARF蛋白互作,并且仅能与At IAA10互作。Md BT2通过泛素化途径促进Md ARF8蛋白降解;Md BT2通过泛素化途径稳定Md IAA3蛋白。酵母三杂交实验表明:Md BT2、Md IAA3和Md ARF8任意一个蛋白能增强另外两个蛋白的互作。Md ARF8促进苹果根系发育及下游基因Md GH3.1、Md GH3.2、Md GH3.5和Md GH3.6的表达。Md ARF8转基因拟南芥侧根数目显着多于野生型,表明Md ARF8是根系发育的正调控转录因子。Md IAA3和具有转录激活活性的ARF蛋白互作并抑制它们的转录活性抑制根系的发生。Md BT2依赖Md ARF8调控根系发育依赖。转基因拟南芥35S::Md ARF8-GFP+35S::Md BT2的侧根数目与35S::Md ARF8-GFP相比显着减少。3、Md BT2是生长素信号途径中的负调控因子。通过GUS染色实验发现,在拟南芥中过表达Md BT2抑制DR5::GUS信号强度。苹果愈伤GUS染色实验表明:过表达Md BT2抑制DR5::GUS信号强度;沉默Md BT2增强DR5::GUS信号强度,表明Md BT2是生长素信号途径中的负调控因子。4、Md BT2响应干旱信号负调控苹果的抗旱性。Md NAC143响应干旱信号正调控苹果的抗旱性。Md BT2通过泛素化途径降解Md NAC143蛋白调控苹果的抗旱性。本研究找到了一个响应高硝态氮和干旱胁迫逆境的关键调控因子Md BT2,并阐述了“高硝态氮-Md BT2-Md IAA3/Md ARF8-Md GH3.1/Md GH3.6”和“干旱胁迫-Md BT2-Md NAC143”的调控网络。Md BT2整合硝态氮和生长素信号在根系发育方面中起了重要作用,另外Md BT2可能通过与生长素信号途径中不同的ARF和Aux/IAA蛋白互作参与不同的生物过程。Md BT2与Md NAC143互作影响苹果的抗旱性,为苹果抗旱砧木的选育奠定了一定的基础。本研究结果对于人们了解植物,尤其是多年生苹果树如何响应外界环境信号进而调控自身生长发育有一定的理论指导意义。
周曼[10]（2020）在《新颖木质纤维素降解酶的宏基因组学挖掘及其在纤维二糖酸生产中的作用》文中指出利用储量丰富且可再生的食品和农业废弃物生产生物基能源和化学品具有重要的经济、环保价值。现有生产工艺中的主要瓶颈是缺乏高效的木质纤维素降解酶和高效、经济的产品生产工艺。木质纤维素降解酶主要包括纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶和木质素降解酶,其中果胶酶,长期以来被认为是一类不重要的辅酶,被严重低估。此外,纤维二糖酸,是一种高附加值但目前产能较低的有机酸,具有重要经济价值。因此,为了发掘高效、新颖木质纤维素降解酶及降低纤维二糖酸生产工艺成本,本研究主要通过构建具有高效木质纤维素降解能力的堆肥生境并进行宏基因组学分析,挖掘新颖木质纤维素降解酶并研究其在纤维二糖酸生产中的作用,并进一步探索统合生物加工生产纤维二糖酸中预处理工艺。论文的主要研究内容和结果如下:1.高效木质纤维素降解堆肥生境的构建及宏基因组学分析通过定向富集培养技术,构建了具有高效木质纤维素降解能力的堆肥体系（apple pomace-adapted compost microbial community,APACMC）。在富集培养过程中,堆肥体系的最高温度达68℃,呈现出堆肥典型的升温期、高温期、降温期和腐熟期四个阶段;16S r DNA高通量测序发现微生物群落结构发生了剧烈变化,具有木质纤维素降解能力的微生物群落得到了良好的富集。随后借助宏基因组学技术对该微生物群落进行高通量鸟枪测序,获得了272,516条开放阅读框;借助多种生物信息分析软件和数据库进行分类学和功能注释发现,APACMC主要由来自变形菌门、拟杆菌门、放线菌门的微生物组成;最主要的功能类型是氨基酸代谢和碳水化合物代谢。基于CAZy数据库注释发现APACMC中具有很高丰度、多样性且微生物来源广泛的碳水化合物活性酶。2.纤维素酶、半纤维素酶和木质素降解酶的宏基因组学挖掘通过刚果红染色试验和酶活测定发现APACMC具有较高的木质纤维素降解能力。APACMC中木质纤维素降解酶主要来源于变形菌门、放线菌门和拟杆菌门;功能和代谢注释分析揭示了APACMC中蕴含大量的参与碳水化合物代谢和潜在生物能源物质的合成路径。基于碳水化合物活性酶数据库挖掘到3,882条序列编码纤维素酶、半纤维素酶和木质素降解酶的基因序列;另外,基于漆酶和多铜氧化酶数据库发现了额外94条编码漆酶和多糖氧化酶的序列。同时,根据催化结构域分析发现了有大量的细菌来源的多功能酶、嗜热酶和裂解性多糖单加氧酶等具有工业应用潜能的酶。3.宏基因组学挖掘果胶降解微生物、果胶酶及嗜热果胶酶的分离、纯化及表征钌红染色和果胶降解率试验表明APACMC具有较高的果胶降解能力。COG功能注释发现APACMC中参与果胶降解的功能占总碳水化合物降解的25.8%。总计1,756条序列被注释为果胶降解酶,且大部分序列具有较高的新颖性,追溯其系统起源发现,这些序列主要来自APACMC中丰度很高的微生物。此外,从APACMC中分离得到了36株嗜热果胶降解微生物,其中Bacillus subtilis Z10具有最高的果胶酶活性;通过简并引物以及融合引物与巢式聚合酶链式反应扩增获得了一条1,263 bp编码果胶裂解酶的序列;基于生物信息学对该酶的理论等电点和理论分子量的预测,结合色谱纯化获得了果胶裂解酶Bs Pel-Z10;酶学特性表明该酶属于嗜热果胶裂解酶且具有很好的稳定性。4.宏基因组来源的新颖木质纤维素降解酶的异源表达及分析从APACMC宏基因组中筛选具有完整开放阅读框且与数据库中收录蛋白的相似度低于75%的5条来自AA10、CE15、GH43、漆酶和PL11的序列为研究对象,经过去除信号肽等一系列分析及处理后,进行基因合成。随后将编码AA10的序列无缝克隆至p ET-22b（+）表达载体上的pel B序列后;其余序列通过双酶切克隆至p ET-28a（+）载体上。将构建成功的重组质粒转导至E.coli BL 21中,获得重组工程菌,并诱导重组酶的表达。这五个重组酶都成功地实现了表达及纯化,并且都具有相应的酶活。生物信息学分析序列信息、系统发育和结构特性等表明这些酶具有较高的新颖性。5.漆酶、纤维二糖脱氢酶（CDH）和木质素在纤维二糖酸生产中的协同作用研究发现当以Avicel为底物时,添加外源氧化还原介体ABTS是实现纤维二糖酸高产的必要条件,而以小麦秸秆为发酵底物时ABTS无促进作用。向Neurospora crassa HL10发酵体系和CDH-漆酶无细胞体系中添加小麦秸秆来源的天然木质素后,发现木质素在漆酶的帮助下可以促进CDH将纤维二糖转化为纤维二糖酸。在N.crassa HL10发酵体系中添加适量的木质素可以促进纤维二糖酸的生产,而过量的木质素则造成负面作用。此外,木质素不会影响CDH和漆酶酶活。通过电子顺磁共振光谱仪发现漆酶催化木质素产生的自由基可以被CDH氧化纤维二糖产生的还原性CDH消耗,证实了木质素可以作为CDH-漆酶的氧化还原介体促进纤维二糖酸的生产。此外,停流光谱仪表明CDH和漆酶之间存在电子传递。6.工程菌N.crassa HL10直接从预处理小麦秸秆中统合生产纤维二糖酸比较了碱、稀硫酸和湿热这三种预处理的小麦秸秆作为发酵底物被N.crassa HL10统合生物加工生产纤维二糖酸的产量,结果表明碱预处理的小麦秸秆（AP-WS）具有最高的纤维二糖酸产量（45.722 m M）。此外,从这三种预处理样品中提取了残留的木质素,发现从AP-WS中提取的木质素（AP-WS-L）在N.crassa HL10以Avicel为底物的体内发酵体系和CDH-漆酶无细胞体系中都具有最好的氧化还原介导能力。FTIR、XRD和GPC结果表明这三种预处理小麦秸秆及其相应木质素在结构、纤维素结晶度、分子量等方面的差异是造成不同纤维二糖酸产量的深层原因。
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 作物氮效率研究现状 |
| 1.1.1 作物氮肥施用现状 |
| 1.1.2 提高作物氮效率研究进展 |
| 1.2 作物氮效率关键QTL研究进展 |
| 1.2.1 QTL定位 |
| 1.2.2 关联分析 |
| 1.3 硝酸盐转运蛋白(NRT)的研究进展 |
| 1.3.1 植物中NRT基因家族成员 |
| 1.3.2 NRT功能研究进展 |
| 1.3.3 NRT基因表达调控机制研究进展 |
| 1.3.4 NRT对植物NUE的影响 |
| 1.3.5 小麦中NRT研究进展 |
| 1.4 影响植物氮效率的其他基因的研究进展 |
| 1.5 研究目的、研究内容 |
| 1.5.1 研究目的 |
| 1.5.2 研究内容 |
| 1.6 技术路线 |
| 第二章 不同基因类型对作物产量及NUE的影响-Meta分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 数据收集 |
| 2.2.2 统计分析 |
| 2.3 结果分析 |
| 2.3.1 遗传转化对产量、地上部生物量及NUE相关性状的影响 |
| 2.3.2 基因类型对产量、地上部生物量及NUE相关性状的影响 |
| 2.3.3 遗传转化方法、试验条件等对产量、地上部生物量及NUE相关性状的影响 |
| 2.3.4 基因表达水平与NUE相关性状的关系 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 小麦基因组内硝酸盐转运蛋白NPF和 NRT2基因家族分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 小麦基因组中NPF和 NRT2基因的鉴定 |
| 3.2.2 小麦NPF基因和NRT2基因的motif分析、系统发育分析和基因结构分析 |
| 3.2.3 小麦NPF基因和NRT2基因的共线性分析和重复事件分析 |
| 3.2.4 小麦NPF基因和NRT2基因的加权基因共表达网络分析(WGCNA) |
| 3.2.5 NPF和 NRT2代表性基因硝酸盐转运活性验证 |
| 3.2.6 小麦中NPF基因和NRT2基因的多态性分析 |
| 3.2.7 基于主成分分析产生的小麦亚群的产量和氮素吸收差异比较 |
| 3.2.8 数据统计 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 小麦基因组内NPF基因及NRT2基因的鉴定 |
| 3.3.2 小麦NPF基因和NRT2基因的染色体分布 |
| 3.3.3 小麦NPF基因和NRT2基因共线性和重复事件分析 |
| 3.3.4 小麦NPF基因和NRT2基因的共表达分析 |
| 3.3.5 小麦中代表性NPF基因和NRT2基因的硝酸盐吸收活性试验 |
| 3.3.6 小麦自然群体中的NPF基因和NRT2基因的多态性分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 NPF基因和NRT2基因在小麦基因组中的分布 |
| 3.4.2 调控小麦NPF基因和NRT2基因表达的转录因子 |
| 3.4.3 小麦中NPF基因和NRT2基因的硝酸盐转运活性 |
| 3.4.4 小麦NPF基因和NRT2基因在小麦群体中的多态性研究 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 小麦氮效率相关性状的候选基因关联分析及关键基因的功能解析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 试验材料及试剂 |
| 4.2.1 小麦材料 |
| 4.2.2 拟南芥 |
| 4.2.3 试剂耗材 |
| 4.2.4 载体 |
| 4.3 试验方法 |
| 4.3.1 候选基因关联分析 |
| 4.3.2 TaNRT2.1-6B的亚细胞定位 |
| 4.3.3 TaNRT2.1-6B的亲和力测定 |
| 4.3.4 拟南芥atnrt1.1突变体功能互补试验 |
| 4.3.5 小麦中过表达TaNRT2.1-6B基因 |
| 4.3.6 数据统计 |
| 4.4 结果 |
| 4.4.1 291个小麦品种的表型差异及候选基因关联分析结果 |
| 4.4.2 TaNRT2.1-6B的亚细胞定位 |
| 4.4.3 TaNRT2.1-6B的亲和力测定 |
| 4.4.4 拟南芥突变体atnrt1.1回补TaNRT2.1-6B对氮吸收及根系的影响 |
| 4.4.5 过表达TaNRT2.1-6B对小麦氮吸收及根系的影响 |
| 4.4.6 过表达TaNRT2.1-6B对小麦NUE相关性状的影响 |
| 4.5 讨论 |
| 4.5.1 小麦氮效率相关性状的关联分析 |
| 4.5.2 小麦中的硝酸盐转运蛋白 |
| 4.5.3 硝酸盐转运蛋白在调控小麦生长及氮效率方面的作用 |
| 4.6 小结 |
| 第五章 TaNRT2.1-6B基因的表达调控分析 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 试验材料及试剂 |
| 5.3 试验方法 |
| 5.3.1 小麦TaNRT2.1-6B启动子活性验证 |
| 5.3.2 反向ChIP试验筛选调控TaNRT2.1-6B启动子的调控因子 |
| 5.3.3 酵母单杂交试验筛选调控TaNRT2.1-6B启动子的调控因子 |
| 5.3.4 酵母单杂交一对一验证试验 |
| 5.4 结果 |
| 5.4.1 不同启动子片段的GUS染色情况 |
| 5.4.2 TaNRT2.1-6B启动子的调控因子筛选 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 小结 |
| 第六章 研究结论、创新点及展望 |
| 6.1 研究结论 |
| 6.2 研究创新点 |
| 6.3 研究展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 1 刺参腐皮综合征流行病学调查及病原鉴定 |
| 1.1 流行特征 |
| 1.2 病症 |
| 1.3 病原 |
| 2 灿烂弧菌的致病机制 |
| 2.1 病原菌黏附 |
| 2.2 灿烂弧菌的致病因子 |
| 2.2.1 金属蛋白酶Vsm |
| 2.2.2 铁离子吸收 |
| 2.2.3 溶血素 |
| 2.2.4 分泌系统 |
| 3 刺参应对灿烂弧菌感染的免疫调节机制 |
| 3.1 刺参细胞免疫 |
| 3.1.1 体腔细胞分类 |
| 3.1.2 体腔细胞的免疫功能 |
| 1)趋化作用。 |
| 2)细胞杀伤功能。 |
| 3)吞噬功能。 |
| 4)细胞凋亡。 |
| 5)细胞自噬。 |
| 6)细胞焦亡。 |
| 3.2 刺参免疫因子功能 |
| 3.2.1 Toll样受体信号通路 |
| 1)TLR3和Toll的免疫功能分析。 |
| 2)MyD88的鉴定及功能解析。 |
| 3)IRAK1和IRAK4的功能解析。 |
| 4)NF-κB亚基的鉴定及功能分析。 |
| 5)NF-κB亚基的其他调控因子。 |
| 3.2.2 刺参JAK/STAT信号通路 |
| 3.3 刺参肠道微生物与疾病发生 |
| 3.3.1 刺参肠道微生物群落组成、结构和功能 |
| 3.3.2 刺参肠道微生物菌群的变化与疾病的发生 |
| 3.3.3 环境因子协助肠道微生物促进疾病发生 |
| 4 刺参病害生态防治 |
| 4.1 刺参抗病育种 |
| 4.2 免疫增强剂 |
| 4.2.1 中草药制剂 |
| 4.2.2 免疫多糖类 |
| 4.2.3 免疫增强类菌剂 |
| 4.3 拮抗菌剂 |
| 4.4 噬菌体在控制刺参病害微生物中的应用 |
| 5 存在问题及展望 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 禽致病性大肠杆菌的研究进展 |
| 1.1.1 病原学 |
| 1.1.2 临床症状与病理变化 |
| 1.1.3 流行病学 |
| 1.1.4 毒力因子 |
| 1.1.5 防治措施 |
| 1.2 摄铁系统的研究进展 |
| 1.2.1 铁载体的合成 |
| 1.2.2 铁载体的转运 |
| 1.2.3 铁载体对APEC毒力的影响 |
| 1.2.4 血红素摄取系统 |
| 1.3 单克隆抗体技术研究进展 |
| 1.3.1 单克隆抗体技术的发展 |
| 1.3.2 单克隆抗体的制备技术 |
| 1.3.3 单克隆抗体的应用 |
| 1.4 研究目的及意义 |
| 参考文献 |
| 第2章 c2515、c2516基因缺失株及回补株的构建 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 试验菌株、质粒和细胞 |
| 2.1.2 主要试剂及溶液配方 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 PCR方法鉴定c2515、c2516基因在E516、E058、E522中的存在 |
| 2.2.2 c2515、c2516基因缺失株的构建 |
| 2.2.3 E516菌株c2515-c2516双基因回补株的构建 |
| 2.2.4 遗传稳定性分析 |
| 2.2.5 细菌生长曲线测定 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 c2515、c2516基因鉴定结果 |
| 2.3.2 缺失株和回补株的构建 |
| 2.3.3 遗传稳定性分析结果 |
| 2.3.4 细菌生长曲线测定结果 |
| 2.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第3章 E516及其c2515、c2516基因缺失株和回补株的生物学特性 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 试验菌株和动物 |
| 3.1.2 主要试剂及溶液配方 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 分子生物学软件及数据分析软件 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 RNA提取和逆转录RT-PCR分析 |
| 3.2.2 qRT-PCR |
| 3.2.3 CAS法检测铁载体产出 |
| 3.2.4 铁摄取检测 |
| 3.2.5 1日龄鸡的半数致死量(LD50)测定 |
| 3.2.6 21日龄SPF鸡体内定居试验 |
| 3.2.7 组织病变观察 |
| 3.2.8 鸡巨噬细胞感染试验 |
| 3.2.9 数据处理 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 RT-PCR检测结果 |
| 3.3.2 qRT-PCR检测结果 |
| 3.3.3 CAS固体培养基检测结果 |
| 3.3.4 铁摄取检测结果 |
| 3.3.5 LD_(50)试验结果 |
| 3.3.6 体内定居试验结果 |
| 3.3.7 组织病变观察结果 |
| 3.3.8 鸡巨噬细胞感染试验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第4章 E516菌株C2515摄铁蛋白单克隆抗体的研制 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 试验菌株、动物和载体 |
| 4.1.2 主要试剂及溶液配方 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 引物设计与合成 |
| 4.2.2 pET11b-c2515-His原核表达质粒的构建及鉴定 |
| 4.2.3 C2515-His蛋白的诱导表达与纯化 |
| 4.2.4 单克隆抗体的制备 |
| 4.2.5 单克隆抗体的特性鉴定 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 PCR扩增及质粒酶切鉴定结果 |
| 4.3.2 C2515-His蛋白的诱导表达结果 |
| 4.3.3 表达条件的优化结果 |
| 4.3.4 C2515-His蛋白大量表达与纯化结果 |
| 4.3.5 抗原最适包被浓度和抗体最佳稀释度 |
| 4.3.6 免疫小鼠血清抗体效价测定结果 |
| 4.3.7 阳性孔杂交瘤细胞的克隆化结果 |
| 4.3.8 单抗鉴定结果 |
| 4.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 中英文缩略表 |
| 中文摘要 |
| abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 苹果酸的相关研究 |
| 1.1.1 苹果酸在植物体中的功能 |
| 1.1.2 苹果酸的合成与降解 |
| 1.1.3 苹果酸的运输 |
| 1.1.3.1 液泡型质子泵 |
| 1.1.3.2 苹果酸转运蛋白 |
| 1.1.4 苹果酸的转录调控 |
| 1.1.5 外界环境因子对植物体内苹果酸积累的影响 |
| 1.2 土壤中氮素的形态和功能 |
| 1.2.1 氮素的功能 |
| 1.2.2 氮素的形态 |
| 1.2.2.1 植物吸收转运硝态氮 |
| 1.2.2.2 植物吸收转化铵态氮 |
| 1.2.2.3 硝态氮和铵态氮的同化 |
| 1.2.2.4 硝态氮的信号途径 |
| 1.3 BTB-TAZ蛋白相关研究 |
| 1.3.1 BTB-TAZ蛋白简介 |
| 1.3.2 BT2 蛋白与激素和外界环境因子 |
| 1.3.2.1 BT2蛋白与激素 |
| 1.3.2.2 BT2蛋白与外界环境因子 |
| 1.4 泛素化修饰 |
| 1.4.1 泛素化修饰简介 |
| 1.4.2 泛素化修饰调控植物的生长发育 |
| 1.5 研究内容及意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 菌株 |
| 2.1.3 载体 |
| 2.1.4 试剂和药品 |
| 2.1.5 引物 |
| 2.1.6 培养基配方 |
| 2.1.7 溶液与缓冲液 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 植物RNA的提取 |
| 2.2.2 RNA浓度检测 |
| 2.2.3 cDNA反转录 |
| 2.2.4 基因克隆 |
| 2.2.5 PCR产物回收 |
| 2.2.6 连接 |
| 2.2.7 转化大肠杆菌 |
| 2.2.8 质粒的提取 |
| 2.2.9 测序 |
| 2.2.10 质粒的酶切 |
| 2.2.11 植物表达载体的构建 |
| 2.2.11.1 过量表达载体的构建 |
| 2.2.11.2 沉默载体的构建 |
| 2.2.11.3 启动子载体的构建 |
| 2.2.12 原核表达载体的构建 |
| 2.2.13 酵母双杂交载体的构建 |
| 2.2.14 农杆菌转化 |
| 2.2.15 植物材料的遗传转化 |
| 2.2.15.1 愈伤组织的遗传转化 |
| 2.2.15.2 苹果苗的遗传转化 |
| 2.2.15.3 苹果果实的瞬时注射 |
| 2.2.16 GUS染色 |
| 2.2.17 植物DNA的提取 |
| 2.2.18 苹果酸含量的测定 |
| 2.2.19 质子泵活性的测定 |
| 2.2.19.1 液泡膜的提取 |
| 2.2.19.2 质子泵水解活性的测定 |
| 2.2.19.3 质子泵H~+转运活性的测定 |
| 2.2.20 液泡pH的测定 |
| 2.2.20.1 原生质体的分离 |
| 2.2.20.2 液泡pH的测定 |
| 2.2.21 植物蛋白的提取 |
| 2.2.22 原核蛋白的诱导和纯化 |
| 2.2.22.1 原核蛋白的诱导 |
| 2.2.22.2 原核蛋白的纯化 |
| 2.2.23 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) |
| 2.2.24 蛋白免疫印迹(Western blotting) |
| 2.2.25 酵母双杂(Y2H) |
| 2.2.26 Pull-down |
| 2.2.27 双分子荧光互补(BiFC) |
| 2.2.28 免疫共沉淀(Co-IP) |
| 2.2.29 蛋白体外降解实验 |
| 2.2.30 蛋白体外泛素化检测 |
| 2.2.31 蛋白体内泛素化检测 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 高浓度的硝态氮抑制苹果酸的积累 |
| 3.2 硝态氮应答基因MdBT2参与调控苹果中苹果酸的积累 |
| 3.2.1 硝态氮促进MdBT2的表达水平 |
| 3.2.2 MdBT2参与调控苹果酸的积累 |
| 3.2.3 MdBT2响应硝态氮信号调控苹果酸的积累 |
| 3.3 MdBT2与MdCIbHLH1互作 |
| 3.4 MdCIbHLH1促进苹果中苹果酸的积累 |
| 3.5 MdBT2泛素化降解MdCIbHLH1 |
| 3.5.1 MdBT2影响MdCIbHLH1蛋白的稳定性 |
| 3.5.2 MdBT2参与MdCIbHLH1蛋白的泛素化降解 |
| 3.6 硝态氮参与调控MdBT2介导的MdCIbHLH1蛋白稳定性 |
| 3.6.1 硝态氮促进MdCIbHLH1蛋白的降解 |
| 3.6.2 硝态氮促进MdBT2蛋白对MdCIbHLH1蛋白的泛素化降解 |
| 3.7 MdBT2通过MdCIbHLH1调节苹果酸的积累 |
| 3.7.1 MdBT2通过MdCIbHLH1调控苹果酸的积累 |
| 3.7.2 MdBT2通过MdCIbHLH1响应硝态氮信号调控苹果酸的积累 |
| 3.7.3 MdBT2通过MdCIbHLH1抑制MdALMT9的转录水平调控苹果酸的积累 |
| 3.8 MdBT2与MdMYB73相互作用 |
| 3.9 MdBT2泛素化降解MdMYB73 |
| 3.9.1 MdBT2影响MdMYB73蛋白的稳定性 |
| 3.9.2 MdBT2泛素化降解MdMYB73蛋白 |
| 3.10 MdBT2通过MdMYB73调节苹果酸的积累 |
| 3.10.1 MdBT2通过MdMYB73调节苹果酸的积累 |
| 3.10.2 MdBT2通过MdMYB73抑制MdALMT9的转录水平调控苹果酸的积累 |
| 4 讨论 |
| 4.1 硝态氮调控苹果酸的积累 |
| 4.2 MdBT2响应硝态氮信号调控苹果酸的积累 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 7 附录 |
| 8 致谢 |
| 9 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 植物微生物组 |
| 1.2.1 植物微生物组的结构和系统发育组成 |
| 1.2.2 植物微生物组的建立及其影响因素 |
| 1.3 植物促生菌的促生机制研究 |
| 1.3.1 植物养分的可用性 |
| 1.3.2 植物激素的产生和调节 |
| 1.3.3 抑制植物病原体 |
| 1.3.4 渗透物调节 |
| 1.4 细菌全基因组测序及比较基因组学研究 |
| 1.5 细菌六型分泌系统与植物促生特性的关系 |
| 1.6 本研究的立题依据及研究内容 |
| 2 碱蓬属植物共生微生物组的结构差异与网络复杂性 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 研究地点自然概况 |
| 2.1.2 样品采集和处理方法 |
| 2.1.3 土壤理化性质的测定 |
| 2.1.4 细菌基因组DNA提取、PCR及测序 |
| 2.1.5 生物信息学分析 |
| 2.2 数据处理与分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 碱蓬属植物土壤理化性质的差异 |
| 2.3.2 碱蓬属植物共生微生物组的OTU差异 |
| 2.3.3 细菌物种分类分析 |
| 2.3.4 细菌β多样性及组间差异的统计学分析 |
| 2.3.5 碱蓬属植物共生微生物组的网络分析 |
| 2.3.6 碱蓬属植物共生微生物组中潜在的有益菌群 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 碱蓬属植物共生微生物组的结构差异 |
| 2.4.2 碱蓬属植物的核心微生物群落 |
| 2.4.3 碱蓬属植物共生微生物组的网络结构差异 |
| 2.5 本章小结 |
| 3 盐地碱蓬可培养细菌的分离鉴定及植物促生菌的筛选 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 细菌分离与纯化 |
| 3.1.3 细菌分子生物学鉴定 |
| 3.1.4 分离菌株的特性研究 |
| 3.1.5 植物促生菌的筛选 |
| 3.2 数据处理与分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 细菌分离、纯化和鉴定 |
| 3.3.2 分离菌株的特性研究 |
| 3.3.3 植物促生能力的检测 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 4 生癌肠杆菌JY65全基因组测序及植物促生相关基因的比较 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 菌株培养及基因组DNA提取 |
| 4.1.3 基因组测序和组装 |
| 4.1.4 植物促生特性相关基因分析 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 基因组序列组装和一般特征 |
| 4.2.2 数据库比对注释 |
| 4.2.3 JY65菌株系统发育分析 |
| 4.2.4 植物促生特性相关基因的分析 |
| 4.2.5 适应逆境胁迫相关基因 |
| 4.2.6 中心代谢途径和分泌系统相关基因 |
| 4.2.7 不同肠杆菌中植物促生相关基因的比较 |
| 4.2.8 不同肠杆菌Ⅵ型分泌系统的差异分析 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 本章小结 |
| 5 生癌肠杆菌JY65缓解水稻NaCl胁迫的分子机制研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 菌株、质粒和菌株培养条件 |
| 5.1.2 突变体菌株的构建 |
| 5.1.3 突变体菌株的生理指标测定 |
| 5.1.4 NaCl胁迫下突变体促生能力的评价 |
| 5.1.5 数据处理 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 不同突变体及互补菌株的构建结果 |
| 5.2.2 基因突变对菌株生长的影响 |
| 5.2.3 NaCl胁迫下不同突变体对水稻生长的影响 |
| 5.2.4 NaCl胁迫下不同突变体对水稻抗氧化系统和离子平衡的影响 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
| 东北林业大学博士学位论文修改情况确认表 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 1.引言 |
| 1.1 丛枝菌根的研究进展 |
| 1.1.1 菌根、丛枝菌根和丛枝菌根真菌的概述 |
| 1.1.2 丛枝菌根的作用 |
| 1.1.3 丛枝菌根真菌与植物根系的共生 |
| 1.2 独脚金内酯和脂肪酸的研究进展 |
| 1.2.1 独脚金内酯的生物合成 |
| 1.2.2 独脚金内酯的生物学功能 |
| 1.2.3 植物中脂肪酸的生物合成 |
| 1.2.4 植物中脂肪酸的生物学功能 |
| 1.3 外源因子对菌根共生的影响 |
| 1.3.1 营养元素对菌根共生的影响 |
| 1.3.2 植物生长调节剂类物质对菌根共生的影响 |
| 1.3.3 大气CO_2浓度和光环境对菌根共生的影响 |
| 1.4 光敏色素和HY5参与植物光信号通路的分子机制研究 |
| 1.4.1 光敏色素参与植物光信号通路的机制研究 |
| 1.4.2 HY5参与植物光信号通路的机制研究 |
| 1.5 本文研究的目的与意义 |
| 2.环境因子对番茄独脚金内酯合成和菌根共生的调控 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料、幼苗培养条件和病毒诱导的基因沉默(VIGS) |
| 2.1.2 接种丛枝菌根真菌和实验设置 |
| 2.1.3 总RNA提取、反转录与实时荧光定量 |
| 2.1.4 根系提取物的提取,独脚金内酯的检测和列当种子萌发率的检测 |
| 2.1.5 丛枝菌根真菌定殖率检测和荧光成像实验 |
| 2.1.6 植株干重和组织磷含量检测 |
| 2.1.7 数据分析 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 低磷、eCO_2和红光对番茄根系独脚金内酯合成基因表达量的影响 |
| 2.2.2 独脚金内酯合成基因参与eCO_2对番茄菌根共生的调控 |
| 2.2.3 CCD7参与红光对番茄菌根共生的调控 |
| 2.2.4 CCD7参与红光在番茄菌根对磷吸收和植株生长发育中的调控 |
| 2.3 讨论 |
| 3.地上部phyB对番茄独脚金内酯合成和菌根共生的系统调控 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料、幼苗培养条件和嫁接处理 |
| 3.1.2 接种丛枝菌根真菌和实验设置 |
| 3.1.3 总RNA提取、反转录与实时荧光定量 |
| 3.1.4 根系提取物的提取和独脚金内酯的检测 |
| 3.1.5 丛枝菌根真菌定殖率检测和荧光成像实验 |
| 3.1.6 植株干重和组织磷含量检测 |
| 3.1.7 数据分析 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 phyB促进低磷下番茄独脚金内酯的合成与积累 |
| 3.2.2 phyB调控番茄菌根的共生 |
| 3.2.3 phyB调控番茄对磷的吸收与积累 |
| 3.2.4 地上部phyB对番茄独脚金内酯合成、菌根共生和磷吸收起主要调控作用 |
| 3.3 讨论 |
| 4.地上部HY5 介导phy B对番茄独脚金内酯合成和菌根共生的系统调控 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料、幼苗培养条件和嫁接处理 |
| 4.1.2 接种丛枝菌根真菌和实验设置 |
| 4.1.3 根系蛋白提取和蛋白免疫沉淀实验 |
| 4.1.4 总RNA提取、反转录与实时荧光定量 |
| 4.1.5 根系提取物的提取和独脚金内酯的检测 |
| 4.1.6 丛枝菌根真菌定殖率检测和荧光成像实验 |
| 4.1.7 植株干重和组织磷含量检测 |
| 4.1.8 数据分析 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 地上部phyB在低磷下促进番茄根部HY5 蛋白的积累 |
| 4.2.2 HY5促进低磷下番茄根部独脚金内酯的合成与积累 |
| 4.2.3 HY5调控番茄菌根的共生 |
| 4.2.4 HY5调控番茄菌根对磷的吸收和植株的生长发育 |
| 4.2.5 地上部HY5对番茄独脚金内酯的合成与积累起主要调控作用 |
| 4.3 讨论 |
| 5.系统信号分子HY5转录调控独脚金内酯的合成 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 实验材料、幼苗培养条件和嫁接处理 |
| 5.1.2 接种丛枝菌根真菌和实验设置 |
| 5.1.3 根系蛋白提取和蛋白免疫沉淀实验 |
| 5.1.4 重组蛋白诱导和凝胶电泳迁移(EMSA) |
| 5.1.5 染色质免疫沉淀(ChIP) |
| 5.1.6 双荧光素酶报告基因系统 |
| 5.1.7 数据分析 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 HY5蛋白具备自上而下移动的能力 |
| 5.2.2 可移动的HY5 蛋白转录调控CCD7、CCD8和MAX1 |
| 5.3 讨论 |
| 6.转录因子HY5调控番茄菌根中十六碳脂肪酸的合成 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 实验材料、幼苗培养条件和病毒诱导的基因沉默(VIGS) |
| 6.1.2 系统进化树的构建 |
| 6.1.3 接种丛枝菌根真菌和实验设置 |
| 6.1.4 总RNA提取、反转录与实时荧光定量 |
| 6.1.5 丛枝菌根真菌定殖率检测和荧光成像实验 |
| 6.1.6 根系蛋白提取和蛋白免疫沉淀实验 |
| 6.1.7 脂肪酸提取与GC-MS分析 |
| 6.1.8 酵母单杂 |
| 6.1.9 重组蛋白诱导和凝胶电泳迁移(EMSA) |
| 6.1.10 双荧光素酶报告基因系统 |
| 6.1.11 数据分析 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 番茄丛枝菌根特异性C16:0-ACP硫酯酶FatM的基因筛选 |
| 6.2.2 SlFatMc调控番茄菌根的共生 |
| 6.2.3 番茄根系中Sl Fat Mc基因表达的时间动态变化 |
| 6.2.4 HY5促进番茄菌根共生和番茄菌根中十六碳脂肪酸的积累 |
| 6.2.5 HY5 转录调控SlFatMc的表达 |
| 6.3 讨论 |
| 7.结论与讨论 |
| 参考文献 |
| 附表 |
| 附图 |
| 作者简介 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 1 第一章绪论 |
| 1.1 课题背景 |
| 1.2 深海海山 |
| 1.3 海山区微生物 |
| 1.3.1 物种组成 |
| 1.3.2 功能类群 |
| 1.3.3 研究进展 |
| 1.3.4 实际应用 |
| 1.4 高通量测序技术 |
| 1.4.1 DNA测序原理及基因组学的应用 |
| 1.4.2 RNA测序原理及转录组学的应用 |
| 1.5 本文的研究内容与意义 |
| 2 第二章西太平洋海山区微生物多样性研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 样品来源 |
| 2.1.2 培养基和储存液配制 |
| 2.1.3 样品现场处理 |
| 2.1.4 环境因子测定 |
| 2.1.5 细胞计数 |
| 2.1.6 菌株分离、培养与保藏 |
| 2.1.7 16S rRNA基因序列信息分析 |
| 2.1.8 基因组树构建 |
| 2.1.9 多样性指数分析 |
| 2.1.10 相关性分析 |
| 2.2 结果与讨论 |
| 2.2.1 2015 年冬季西太平洋综合调查航次微生物多样性 |
| 2.2.2 DY48 航次西太平洋海山区微生物多样性 |
| 2.2.3 DY56 航次西太平洋海山区微生物多样性 |
| 2.3 本章小结 |
| 3 第三章5 株海洋细菌新种的多相分类学鉴定 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 菌株来源 |
| 3.1.2 表型观察 |
| 3.1.3 生理生化分析 |
| 3.1.4 遗传学分析 |
| 3.2 结果与讨论 |
| 3.2.1 菌株157 的多相分类学鉴定结果 |
| 3.2.2 菌株JN33 的多相分类学鉴定结果 |
| 3.2.3 菌株72、NH166和40DY170 的多相分类学鉴定结果 |
| 3.3 本章小结 |
| 4 第四章5 株海洋细菌的适应性机制研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 菌株来源 |
| 4.1.2 表型观察 |
| 4.1.3 细菌镍抗性检测 |
| 4.1.4 锰氧化活性检测 |
| 4.1.5 系统发育分析 |
| 4.1.6 基因组测序和分析 |
| 4.1.7 转录组测序和分析 |
| 4.1.8 荧光定量PCR验证 |
| 4.2 结果与讨论 |
| 4.2.1 镍抗性细菌Sphingobium sp.DY56-G10 的适应性研究 |
| 4.2.2 Pseudoalteromonas属三株锰氧化细菌的适应性研究 |
| 4.2.3 锌胁迫下Halomonas zincidurans B6 的转录组研究 |
| 4.3 本章小结 |
| 5 第五章总结与展望 |
| 5.1 总结 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述——细菌铁代谢与其调控机制的研究进展 |
| 1.1 细菌铁代谢的嗜铁素途径 |
| 1.1.1 ornibactin运输的铁代谢通路 |
| 1.1.2 pyochelin运输的铁代谢通路 |
| 1.1.3 不同嗜铁素之间的协调机制 |
| 1.1.4 嗜铁素直接参与的拮抗等功能 |
| 1.2 细菌铁代谢的Fur调控 |
| 1.2.1 Fur蛋白的结构 |
| 1.2.2 Fur蛋白的调控机制 |
| 1.2.3 调控Fur表达的机制 |
| 1.2.4 Fur-box |
| 1.3 HGT驱动的铁代谢进化 |
| 1.3.1 嗜铁素合成基因NRPS的 HGT进化 |
| 1.3.2 铁吸收转运的HGT进化 |
| 1.3.3 HGT间接影响铁代谢 |
| 1.3.4 HGT的检测方法 |
| 1.4 NRPS途径合成嗜铁素参与铁代谢 |
| 1.4.1 NRPS和 PKS的组成 |
| 1.4.2 嗜铁素相关NRPS的检索 |
| 1.5 本研究的目的及意义 |
| 第二章 水平转移基因簇(NRPS-R456)参与嗜铁素合成的全局调控 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 菌株与质粒 |
| 2.1.2 培养基与试剂 |
| 2.1.3 细菌基因组DNA提取和质粒提取 |
| 2.1.4 PCR体系 |
| 2.1.5 酶切及连接反应 |
| 2.1.6 热激转化实验 |
| 2.1.7 电击转化实验 |
| 2.1.8 嗜铁素基因簇的生物信息学分析 |
| 2.1.9 突变体和回补体构建 |
| 2.1.10 荧光定量PCR |
| 2.1.11 CAS检测总嗜铁素的合成 |
| 2.1.12 一步生长曲线 |
| 2.1.13 生物膜检测 |
| 2.1.14 游动性检测 |
| 2.1.15 嗜铁素的分离纯化 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 生信鉴定NRPS-R456来源于藻类 |
| 2.2.2 拮抗菌株R456对铁胁迫具有适应性 |
| 2.2.3 NRPS-R456能够影响嗜铁素合成 |
| 2.2.4 NRPS-R456能够影响游动性和生物膜合成 |
| 2.2.5 NRPS-R456影响铁胁迫下的生长速率 |
| 2.2.6 NRPS-R456合成一种新型嗜铁素 |
| 2.2.7 NRPS-R456 影响ornibactin和 pyochelin的合成 |
| 2.3 小结与讨论 |
| 第三章 Fur与 NRPS-R456 的相互作用及其在铁代谢中的作用 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 菌株和载体 |
| 3.1.2 培养基与试剂 |
| 3.1.3 细菌基因组DNA提取和质粒提取 |
| 3.1.4 PCR体系 |
| 3.1.5 酶切及连接反应 |
| 3.1.6 热激转化实验和电击转化实验 |
| 3.1.7 Fur蛋白的生物信息学分析 |
| 3.1.8 突变体和回补体的构建 |
| 3.1.9 一步生长曲线 |
| 3.1.10 ICP-MS测定胞内铁含量 |
| 3.1.11 H2O2耐受性检测 |
| 3.1.12 过氧化氢酶CAT的酶活测定 |
| 3.1.13 Fur原核表达,纯化及抗体制备 |
| 3.1.14 Western blot检测Fur蛋白的表达 |
| 3.1.15 免疫蛋白共沉淀钓取互作蛋白 |
| 3.1.16 细菌双杂 |
| 3.1.17 荧光定量PCR鉴定fur基因的表达 |
| 3.1.18 酵母单杂 |
| 3.1.19 细胞质蛋白的提取,和质谱分析 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 生信分析确定Fur的蛋白结构 |
| 3.2.2 Fur突变影响在铁胁迫下的生长速率 |
| 3.2.3 Fur缺失上调高铁条件下的胞内铁浓度 |
| 3.2.4 Fur缺失降低过氧化氢耐受性 |
| 3.2.5 Fur缺失降低过氧化氢酶活 |
| 3.2.6 Fur与 NRPS-R456 基因簇的表达有关 |
| 3.2.7 酵母单杂验证Fur对 NRPS-R456 存在调控 |
| 3.2.8 蛋白质谱鉴定Fur突变下调NRPS蛋白的表达 |
| 3.2.9 免疫蛋白共沉淀钓取Fur的互作蛋白 |
| 3.2.10 细菌双杂验证钓取蛋白和Fur存在互作 |
| 3.3 小结与讨论 |
| 第四章 转座插入鉴定出NRPS-R456调控的铁代谢与其拮抗功能相关 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 细菌和载体 |
| 4.1.2 培养基与试剂 |
| 4.1.3 细菌基因组DNA提取和质粒提取 |
| 4.1.4 PCR体系 |
| 4.1.5 酶切及连接反应 |
| 4.1.6 热激转化实验和电击转化实验 |
| 4.1.7 转座子突变体库的构建 |
| 4.1.8 转座子转化成功的鉴定 |
| 4.1.9 反向PCR鉴定转座子的插入位点 |
| 4.1.10 突变体与回补体的构建 |
| 4.1.11 一步生长曲线 |
| 4.1.12 拮抗效果检测 |
| 4.1.13 过氧化氢耐受性检测 |
| 4.1.14 游动性和生物膜检测 |
| 4.1.15 荧光定量PCR鉴定铁代谢相关基因的表达 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 成功构建R456转座子突变体库 |
| 4.2.2 筛选出多个铁代谢和拮抗功能减弱突变体 |
| 4.2.3 NRPS-R456转座突变体的双重表型减弱 |
| 4.2.4 NRPS-R456与ΔR456_584 的铁代谢减弱有关 |
| 4.2.5 NRPS-R456转座突变对菌株生长无明显影响 |
| 4.2.6 NRPS-R456转座突变后过氧化氢耐受性降低 |
| 4.2.7 NRPS-R456转座突变后生物膜合成明显减弱 |
| 4.2.8 NRPS-R456转座突变后游动性明显减弱 |
| 4.3 小结与讨论 |
| 第五章 全文小结与研究展望 |
| 5.1 全文小结 |
| 5.2 研究展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1 本研究用到的菌株和质粒 |
| 附录2 本研究用到的PCR引物列表 |
| 附录3 ornibactin同系衍生物质谱及结构分析 |
| 附录4 缩略词对照表 |
| 附录5 蛋白质非标定量质谱鉴定出的差异蛋白 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 BT蛋白 |
| 1.1.1 泛素/26S蛋白酶复合体 |
| 1.1.2 BTB/POZ蛋白 |
| 1.1.3 BTB-TAZ蛋白研究进展 |
| 1.1.3.1 BTB-TAZ蛋白与激素和胁迫信号 |
| 1.1.3.2 BTB-TAZ蛋白与光信号 |
| 1.1.3.3 BTB-TAZ蛋白与35S增强子信号 |
| 1.1.3.4 BTB-TAZ蛋白与糖信号 |
| 1.1.3.5 BTB-TAZ蛋白与氮信号 |
| 1.2 土壤中氮素的形态和功能 |
| 1.2.1 植物吸收和转运硝态氮 |
| 1.2.2 植物吸收转化铵态氮 |
| 1.2.3 植物硝态氮和铵态氮的同化 |
| 1.2.4 硝酸根是信号分子 |
| 1.2.4.1 硝态氮信号感知(图1-2) |
| 1.2.4.2 硝态氮信号转导 |
| 1.2.4.3 地上地下部氮信号的传递与整合 |
| 1.3 根系发育的分子及环境调控 |
| 1.3.1 根系的作用 |
| 1.3.1.1 根尖分生组织调控根系发育 |
| 1.3.1.2 近端分生组织和干细胞的转录调控 |
| 1.3.1.3 生长素在根系分生组织及根系伸长中的作用 |
| 1.3.2 根系分支 |
| 1.3.2.1 木质部中柱鞘细胞 |
| 1.3.2.2 侧根起始细胞的特化 |
| 1.3.2.3 侧根分支部位:建成细胞的特化与起始 |
| 1.3.2.4 侧根建成细胞的特化:候选调控因子 |
| 1.3.2.5 侧根形成 |
| 1.3.2.6 侧根出现和根系分支 |
| 1.3.2.7 侧根与不定根 |
| 1.3.3 营养元素对根系发育的作用 |
| 1.3.3.1 磷在根系发育中的作用 |
| 1.3.3.2 氮在根系发育中的作用 |
| 1.3.3.3 其它营养元素在根系发育中的作用 |
| 1.3.4 水分与干旱胁迫调控根系发育 |
| 1.4 生长素 |
| 1.4.1 生长素的生物合成 |
| 1.4.1.1 色氨酸合成途径 |
| 1.4.1.2 非色氨酸合成途径 |
| 1.4.2 生长素的信号转导途径 |
| 1.4.3 生长素的极性运输 |
| 1.4.3.1 生长素输出载体 |
| 1.4.3.2 生长素输入载体 |
| 1.5 干旱胁迫 |
| 1.5.1 植物与干旱 |
| 1.5.2 干旱与细胞和分子信号 |
| 1.5.2.1 MAPK途径 |
| 1.5.2.2 Ca~(2+)信号途径 |
| 1.5.2.3 ABA信号途径 |
| 1.5.2.4 转录因子在干旱胁迫中的作用 |
| 1.5.3 氮素与干旱的关系 |
| 1.6 研究目的及意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 菌株 |
| 2.1.3 载体 |
| 2.1.4 酶和生化试剂 |
| 2.1.5 引物 |
| 2.1.6 培养基 |
| 2.1.7 抗生素母液浓度 |
| 2.1.8 溶液与缓冲液 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 植物总RNA提取 |
| 2.2.2 cDNA反转录(定量PCR用) |
| 2.2.3 cDNA反转录(扩增基因) |
| 2.2.4 基因克隆 |
| 2.2.5 PCR产物回收 |
| 2.2.6 连接克隆载体 |
| 2.2.7 转化大肠杆菌感受态细胞 |
| 2.2.8 测序 |
| 2.2.9 质粒DNA提取 |
| 2.2.10 质粒DNA酶切 |
| 2.2.11 植物过量表达载体构建 |
| 2.2.12 反义沉默载体构建 |
| 2.2.13 原核表达载体构建 |
| 2.2.14 农杆菌转化 |
| 2.2.15 拟南芥种植 |
| 2.2.16 拟南芥遗传转化 |
| 2.2.17 苹果愈伤组织培养 |
| 2.2.18 苹果愈伤遗传转化 |
| 2.2.19 苹果组培苗培养 |
| 2.2.20 发根农杆菌侵染苹果组培苗 |
| 2.2.21 植物DNA提取 |
| 2.2.22 植物总蛋白提取 |
| 2.2.23 酵母双杂交和酵母三杂交 |
| 2.2.23.1 酵母双杂交/三杂交试剂配制 |
| 2.2.23.2 酵母双杂交/三杂交实验步骤 |
| 2.2.24 原核蛋白诱导和破碎 |
| 2.2.25 GST Pull-down实验 |
| 2.2.26 双分子荧光互补实验(BIFC) |
| 2.2.27 免疫沉淀实验 |
| 2.2.28 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) |
| 2.2.29 蛋白免疫印迹实验(Western blot) |
| 2.2.30 体内泛素结合实验 |
| 2.2.31 体内蛋白降解实验 |
| 2.2.32 体外蛋白降解实验 |
| 2.2.33 GUS组织化学染色 |
| 2.2.34 叶绿素含量测定 |
| 2.2.35 过氧化氢(H_2O_2)含量测定 |
| 2.2.36 超氧阴离子(O_2~-)测定 |
| 2.2.37 DAB和 NBT染色 |
| 2.2.37.1 DAB染色 |
| 2.2.37.2 NBT染色 |
| 2.2.38 离子渗透率测定 |
| 2.2.39 根系数目统计 |
| 2.2.40 叶片失水率的测定 |
| 2.2.41 植株干旱处理 |
| 2.2.42 生物信息学分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 MdBT2响应硝态氮调控苹果根系发生 |
| 3.1.1 MdBT2依赖生长素信号调控苹果根系发生 |
| 3.1.1.1 生长素介导硝态氮调控的苹果根系发生 |
| 3.1.1.2 MdBT2依赖生长素途径调控根系发生 |
| 3.1.2 MdBT2与MdARF8 互作 |
| 3.1.3 MdBT2 促进MdARF8 蛋白泛素化降解 |
| 3.1.4 MdARF8促进侧根发生 |
| 3.1.5 MdBT2与MdIAA3 互作 |
| 3.1.6 MdBT2 稳定MdIAA3 蛋白 |
| 3.1.7 MdBT2与At BT2(拟南芥)在生长素信号途径中存在不同的功能 |
| 3.1.8 MdBT2、MdIAA3和MdARF8 中的任一成员能增强另外两个蛋白互作的强度 |
| 3.1.9 MdBT2 介导MdARF8 调控的侧根发生 |
| 3.1.10 MdBT2是生长素信号的负调控因子 |
| 3.2 MdBT2响应干旱信号调控苹果抗旱性的机理研究 |
| 3.2.1 MdBT2参与苹果干旱响应 |
| 3.2.1.1 MdBT2负调控苹果抗旱性 |
| 3.2.1.2 干旱条件下,MdBT2促进活性氧爆发 |
| 3.2.2 MdBT2与MdNAC143 互作 |
| 3.2.3 MdBT2 负调控MdNAC143 的稳定性 |
| 3.2.4 MdNAC143响应干旱胁迫 |
| 3.2.4.1 MdNAC143 提高了苹果愈伤和转基因拟南芥对PEG6000 抗性 |
| 3.2.4.2 MdNAC143转基因拟南芥增强了干旱的抗性 |
| 3.2.4.3 干旱条件下,MdNAC143抑制了活性氧爆发 |
| 3.2.4.4 干旱条件下,MdNAC143促进了拟南芥中相关干旱标记基因的表达 |
| 3.2.5 MdBT2 通过降解MdNAC143 负调控苹果的抗旱能力 |
| 4 讨论 |
| 4.1 硝态氮调控根系发生和苹果的抗旱性 |
| 4.2 MdBT2影响生长素信号途径调控根系发育 |
| 4.3 MdBT2影响靶蛋白稳定性 |
| 4.4 MdBT2响应不同的信号介导不同生化过程 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 7 附录 |
| 7.1 本文中使用的引物 |
| 7.2 载体示意图 |
| 8 致谢 |
| 9 攻读学位期间发表及待发表的论文 |
| 中英文缩写对照表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 木质纤维素生物质 |
| 1.1.1 木质纤维素生物质的基本结构 |
| 1.1.2 果胶在木质纤维素中的作用 |
| 1.1.3 木质纤维素生物质能源生产的瓶颈 |
| 1.2 木质纤维素降解酶 |
| 1.2.1 纤维素水解酶 |
| 1.2.2 裂解性多糖单加氧酶 |
| 1.2.3 纤维二糖脱氢酶 |
| 1.2.4 半纤维素酶 |
| 1.2.5 果胶酶 |
| 1.2.6 木质素降解酶——漆酶 |
| 1.3 宏基因组学技术在挖掘木质纤维素降解酶中的应用 |
| 1.3.1 宏基因组学 |
| 1.3.2 木质纤维素降解酶的宏基因组挖掘 |
| 1.4 统合生物加工生产纤维二糖酸 |
| 1.4.1 纤维二糖酸 |
| 1.4.2 Neurospora crassa工程菌 |
| 1.4.3 LPMO、CDH、漆酶、GMC氧化还原酶、木质素与纤维素之间的关系 |
| 1.5 本文研究意义及主要研究内容 |
| 1.5.1 研究意义 |
| 1.5.2 研究内容及技术路线图 |
| 第二章 木质纤维素降解堆肥生境的构建及宏基因组学分析 |
| 2.1 试验材料与设备 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 主要试剂及耗材 |
| 2.1.3 主要仪器与设备 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 苹果渣生物质降解微生物在堆肥环境中的富集 |
| 2.2.2 堆肥的物理化学性质分析 |
| 2.2.3 16S rDNA基因高通量测序和物种系统分类 |
| 2.2.4 宏基因组测序,de novo序列组装和开放阅读框预测 |
| 2.2.5 序列提交 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 堆肥进程中理化性质的变化 |
| 2.3.2 堆肥进程中微生物群落结构的变化 |
| 2.3.3 APACMC宏基因组中的微生物多样性分析 |
| 2.3.4 APACMC宏基因组中预测基因的功能基因分类 |
| 2.3.5 APACMC宏基因组中碳水化合物活性酶的多样性、丰度和微生物来源 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 纤维素降解酶、半纤维素降解酶和木质素降解酶的宏基因组学挖掘 |
| 3.1 试验材料与设备 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 主要试剂及耗材 |
| 3.1.3 主要仪器与设备 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 木质纤维素生物质降解微生物在堆肥生境中的富集效果的评判 |
| 3.2.2 纤维素酶活和半纤维素酶活的测定 |
| 3.2.3 木质纤维素降解酶基因的注释 |
| 3.2.4 木质素降解基因的准确注释 |
| 3.2.5 特定的纤维素、半纤维素和木质素降解基因:注释及系统发育树分析 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 富集的微生物纤维素降解能力的初级评判 |
| 3.3.2 纤维素酶活和半纤维素酶活的测定 |
| 3.3.3 APACMC宏基因组中木质纤维素降解微生物组成分析 |
| 3.3.4 APACMC宏基因组中木质纤维素降解代谢潜能分析 |
| 3.3.5 木质纤维素降解酶的挖掘 |
| 3.3.6 木质纤维素降解微生物的挖掘 |
| 3.3.7 需重点关注的木质纤维素降解酶及微生物 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 宏基因组学挖掘果胶降解菌、果胶酶及嗜热果胶酶的分离、纯化和表征 |
| 4.1 试验材料与设备 |
| 4.1.1 试验材料 |
| 4.1.2 主要试剂及耗材 |
| 4.1.3 主要仪器设备 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 果胶降解微生物在堆肥生境中的富集效果的评判 |
| 4.2.2 特定果胶酶降解基因:基因注释和系统发育分析 |
| 4.2.3 果胶酶活的测定 |
| 4.2.4 嗜热果胶降解微生物的筛选分离 |
| 4.2.5 嗜热果胶降解微生物的鉴定 |
| 4.2.6 编码果胶酶基因序列的克隆、验证及测序 |
| 4.2.7 编码果胶酶的氨基酸序列比对、生物信息学分析及其三维结构模拟 |
| 4.2.8 果胶酶的分离纯化 |
| 4.2.9 温度、pH、金属离子和化学试剂对酶的影响 |
| 4.2.10 底物特异性和酶促动力学参数的测定 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 富集微生物的果胶降解能力的初级评判 |
| 4.3.2 参与果胶降解的特定COG功能分类分析 |
| 4.3.3 果胶降解酶的挖掘 |
| 4.3.4 果胶降解微生物的挖掘 |
| 4.3.5 嗜热果胶降解微生物的分离 |
| 4.3.6 嗜热细菌来源的果胶降解酶的基因克隆与测序 |
| 4.3.7 果胶酸裂解酶的纯化及分子量的确定 |
| 4.3.8 果胶酸裂解酶BsPel-Z10 的酶学特性 |
| 4.3.9 金属离子和化学试剂对BsPel-Z10 酶活的影响 |
| 4.3.10 BsPel-Z10 的底物特异性和酶动力学参数测定 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 五个宏基因组来源的新颖木质纤维素降解酶的异源表达及分析 |
| 5.1 试验材料与设备 |
| 5.1.1 试验载体与菌株 |
| 5.1.2 工具酶和试剂盒 |
| 5.1.3 主要试剂及培养基 |
| 5.1.4 主要仪器及设备 |
| 5.2 试验方法 |
| 5.2.1 新颖木质纤维素降解酶基因的验证及筛选 |
| 5.2.2 新颖木质纤维素降解酶基因的分析及合成 |
| 5.2.3 重组质粒的构建及验证 |
| 5.2.4 基因工程菌E.coli BL21 的构建及鉴定 |
| 5.2.5 重组工程菌诱导表达获得重组酶 |
| 5.2.6 重组酶的分离纯化 |
| 5.2.7 重组酶的蛋白电泳SDS-PAGE检测 |
| 5.2.8 LPMO与铜离子的结合 |
| 5.2.9 重组酶的酶活测定 |
| 5.2.10 重组酶蛋白含量测定 |
| 5.2.11 重组酶系统发育分析、蛋白结构的同源建模与分析 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 LPMO10-297291的序列分析 |
| 5.3.2 CE15-3258的序列分析 |
| 5.3.3 Lac-4805的序列分析 |
| 5.3.4 GH43-5749的序列分析 |
| 5.3.5 PL11-18811的序列分析 |
| 5.3.6 重组质粒、基因工程菌的构建及验证 |
| 5.3.7 重组酶的诱导表达、纯化及酶活测定 |
| 5.3.8 重组酶的同源建模及结构和催化活性位点分析 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 漆酶、纤维二糖脱氢酶和木质素在纤维二糖酸生产中的协同作用 |
| 6.1 试验材料与设备 |
| 6.1.1 试验菌株 |
| 6.1.2 主要试剂、耗材及培养基 |
| 6.1.3 主要仪器及设备 |
| 6.2 试验材料及方法 |
| 6.2.1 N.crassa F5ΔΔΔ和 HL10 种子的制备 |
| 6.2.2 N.crassa F5ΔΔΔ和 HL10 体内发酵试验 |
| 6.2.3 纤维二糖脱氢酶的制备及纯化 |
| 6.2.4 漆酶的制备及纯化 |
| 6.2.5 纤维二糖脱氢酶和漆酶酶活及浓度的测定 |
| 6.2.6 小麦秸秆原料的制备 |
| 6.2.7 酶解木质素的制备 |
| 6.2.8 CDH-漆酶无细胞体系将纤维二糖转化为纤维二糖酸的体外试验 |
| 6.2.9 纤维二糖酸标品的制备及标定 |
| 6.2.10 纤维二糖、纤维二糖酸、葡萄糖和葡萄糖酸浓度的测定 |
| 6.2.11 木质素对CDH和漆酶酶活的影响 |
| 6.2.12 木质纤维素组分测定 |
| 6.2.13 停流光谱仪监测CDH与漆酶之间的电子传递 |
| 6.2.14 电子顺磁共振光谱技术测定木质素自由基的形成及消耗 |
| 6.2.15 数据处理 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 CDH、漆酶酶活及纤维二糖酸标品浓度 |
| 6.3.2 外源添加氧化还原介体对N.crassa HL10 高产纤维二糖酸的必要性 |
| 6.3.3 N.crassa HL10 直接从Avicel和小麦秸秆中生产纤维二糖酸的比较 |
| 6.3.4 木质素对N.crassa HL10将Avicel转化为纤维二糖酸的影响 |
| 6.3.5 木质素对CDH-漆酶无细胞体系将纤维二糖转化为纤维二糖酸的影响 |
| 6.3.6 木质素对CDH和漆酶酶活的影响 |
| 6.3.7 CDH-木质素-漆酶体系的潜在机制 |
| 6.3.8 EPR监测木质素自由基产生及消耗 |
| 6.3.9 停流光谱仪监测CDH与漆酶之间的电子传递 |
| 6.4 小结 |
| 第七章 工程菌N.crassa直接从小麦秸秆中统合生产纤维二糖酸 |
| 7.1 试验材料与设备 |
| 7.1.1 试验菌株 |
| 7.1.2 主要试剂、耗材及培养基 |
| 7.1.3 主要仪器设备 |
| 7.2 试验方法 |
| 7.2.1 小麦秸秆的三种预处理 |
| 7.2.2 三种从预处理小麦秸秆木质素的制备 |
| 7.2.3 木质纤维素组分测定及木质素的测定 |
| 7.2.4 CDH和漆酶的制备、纯化及酶活测定 |
| 7.2.5 N.crassa HL10 种子的制备 |
| 7.2.6 不同预处理小麦秸秆的N.crassa HL10 发酵 |
| 7.2.7 三种木质素对N.crassa HL10 生产纤维二糖酸的影响 |
| 7.2.8 三种木质素对CDH-漆酶无细胞体系生产纤维二糖酸的影响 |
| 7.2.9 纤维二糖和纤维二糖酸的检测 |
| 7.2.10 木质素和酚类物质含量测定 |
| 7.2.11 三种预处理小麦秸秆及其相应木质素的傅里叶红外光谱 |
| 7.2.12 三种预处理小麦秸秆的X射线衍射分析 |
| 7.2.13 凝胶渗透色谱对三种木质素分子量的测定 |
| 7.2.14 香草醛、丁香醛和阿魏酸对CDH-漆酶无细胞体系产纤维二糖酸的影响 |
| 7.2.15 数据处理 |
| 7.3 结果与讨论 |
| 7.3.1 不同预处理对小麦秸秆中各组分的影响 |
| 7.3.2 三种预处理小麦秸秆统合生物加工生产纤维二糖酸能力比较 |
| 7.3.3 三种木质素对N.crassa HL10以Avicel为底物生产纤维二糖酸的影响 |
| 7.3.4 三种木质素对CDH-漆酶无细胞体系生产纤维二糖酸的影响 |
| 7.3.5 三种预处理小麦秸秆及其制备的相应木质素的FTIR分析 |
| 7.3.6 三种预处理小麦秸秆的XRD特性 |
| 7.3.7 三种木质素的分子大小及分布比较 |
| 7.3.8 香草醛、丁香醛和阿魏酸在CDH-漆酶无细胞体系生产中纤维二糖酸的作用 |
| 7.3.9 N.crassa HL10 从碱预处理小麦秸秆中统合生产纤维二糖酸工艺的初步构建 |
| 7.4 小结 |
| 第八章 结论、创新点与展望 |
| 8.1 结论 |
| 8.2 创新点 |
| 8.3 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
