p21~(Waf1/Cip1)在NIH3T3细胞系中表达诱导的衰老样变化

一、Senescence-like changes induced by expression of p21~(Waf1/Cip1) in NIH3T3 cell line（论文文献综述）

罗轩^[1]（2020）在《DNMT2敲除导致细胞衰老及其调控的机制研究》文中研究表明DNA甲基转移酶2（DNA methyltransferase 2,DNMT2）是核酸修饰酶家族的成员,催化甲基从辅因子S-腺苷甲硫氨酸（SAM）转移到胞嘧啶残基的第五个碳位点上形成5m C。DNMT2是高度保守的甲基转移酶,能催化DNA和RNA甲基化,最近研究发现DNMT2的DNA甲基化作用很小,而是一种高度特异的t RNAAsp甲基转移酶。细胞衰老是一种应激引起的细胞周期停滞,通过抑制细胞生长来限制衰老和受损细胞的复制。目前衰老被认为是一种由内源或外源的损害引起的应激反应;原癌基因的激活、氧化和基因毒性应激、辐射、化疗等都可以引起细胞的衰老现象。细胞衰老是肿瘤发生的天然屏障,它有助于多种疗法的抗肿瘤作用,包括放疗和化疗药物。目前仅有少数研究提出DNMT2能够抑制细胞衰老、延长果蝇寿命,但其中的机制尚未被阐明。在本研究中,我们发现DNMT2敲除在胃癌细胞AGS、人成纤维细胞BJ、鼠成纤维细胞L929的SASP（senesence-associated secretory phenotype）基因表达显着升高,而且在细胞衰老诱导剂etoposide刺激下SASP基因表达更加显着,表明DNMT2的缺失激活了衰老相关信号通路。DNMT2缺失会抑制胃癌细胞的迁移运动与修复能力,随后我们还发现DNMT2缺失的小鼠能够抑制黑色素瘤的生长。采用Kaplan-meier生存率分析DNMT2与癌症患者生存率之间的相关性,结果表明DNMT2低表达能提高癌症患者的生存率。此外,我们还进一步研究了DNMT2的生物学功能,发现DNMT2基因能促进外源DNA的表达,从而影响细胞的转染效率。这些研究结果表明了DNMT2敲除引起细胞内DNA损伤反应和衰老相关信号通路的激活,在诱导细胞衰老中起关键作用,为进一步了解DNMT2在衰老中的作用机制及相应的代谢疾病或癌症治疗提供了新思路。

黄玲^[2]（2018）在《SIRT1介导的火麻仁提取液改善衰老大鼠学习记忆障碍的机制》文中研究说明第一部分 SIRT1参与火麻仁提取液对衰老大鼠学习记忆障碍的改善过程目的:衰老是机体不可避免的复杂过程,学习与记忆力减退是衰老的标志之一。火麻仁提取液（Extract of Fructus Cannabis,EFC）具有良好的神经保护和抗衰老作用。沉默信息调节因子1（Silent information regulation 1,SIRT1）在细胞分化、衰老、凋亡、转录调节、信号转导等多种生物过程中发挥重要的作用。本部分旨在探讨SIRT1是否参与了EFC改善衰老大鼠学习和记忆障碍的过程。方法:将110只健康雄性SD大鼠（250-300g,3月龄）随机分成5个大组共11个亚组,（1）正常对照组（Control）给予生理盐水6个月作对照;（2）D-半乳糖模型组（D-galactose,D-gal）,400 mg/kg D-gal连续腹腔注射3月后给予3个月生理盐水做对照;（3）单纯EFC干预组,分为三个亚组,分别给予400 mg/kg、800 mg/kg和1600 mg/kg EFC干预3个月后给予生理盐水作对照;（4）EFC预防组,先分别预防性给予400 mg/kg、800 mg/kg和1600 mg/kg EFC干预3个月后给予400 mg/kg D-gal诱导衰老,即EFC预防组包括3个亚组:EFC-L+D-gal、EFC-M+D-gal、EFC-H+D-gal;（5）EFC治疗组,先给予400 mg/kg D-gal处理3个月后将大鼠随机分成3个亚组（D-gal+EFC-L,D-gal+EFC-M,D-gal+EFC-H）给予对应剂量EFC灌胃。D-gal和EFC干预结束后,利用Morris water maze从行为学上评估各组大鼠空间学习和记忆能力;尼氏染色检查脑组织病理学改变;免疫组织化学（Immunohistochemical,IHC）、免疫印迹（Western blot,WB）及定量逆转录聚合酶链式反应（Quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,qRT-PCR）检测SIRT1蛋白的表达变化。结果:1.在定向航行试验测试中,各实验组大鼠在第1天训练测试中的逃避潜伏期无显着差异。但从第2天到第5天,D-gal模型组的逃避潜伏期较对照组明显延长（P<0.05）,400 mg/kg和800 mg/kg EFC治疗组和预防组及单纯EFC给药组的逃避潜伏期均较D-gal模型组明显缩短（P<0.05）。2.在定向航行试验第5天,D-gal组大鼠的游泳轨迹均杂乱无序,随机分布于各个象限;400 mg/kg和800 mg/kg的EFC治疗组和预防组及单纯EFC给药组的搜台策略明显改善。1600 mg/kg EFC治疗组和预防组及单纯EFC给药组的搜台策略无明显变化。3.空间探索测试中,D-gal模型组大鼠穿越原平台位置的次数较正常对照组明显减少（P<0.05）。而400 mg/kg和800 mg/kg的EFC治疗组和预防组及单纯EFC给药组大鼠穿越原平台位置的次数较D-gal组明显增加（P<0.05）。4.病理检查显示D-gal模型组大鼠海马CA1区出现明显的细胞排列紊乱,细胞核固缩;而低中剂量的EFC预防组和治疗组的CA1区细胞形态与空白对照组无显着差异,只有少量细胞出现核固缩。5.SIRT1 mRNA和蛋白水平在D-gal组海马中低表达,而400 mg/kg和800 mg/kg EFC治疗组和预防组及单纯EFC给药组大鼠海马SIRT1表达水平较D-gal模型组均有不同程度的上调。结论:1.EFC可提高大鼠在Morris水迷宫测试中的各项成绩,对D-gal引起的空间学习及记忆损伤有一定的改善作用,但有剂量依赖性,400 mg/kg和800 mg/kg的EFC干预剂量对D-gal引起的空间学习及记忆损伤的改善作用较为明显。2.EFC能减轻D-gal对大鼠海马CA1区锥体神经元造成的损伤。3.400 mg/kg和800 mg/kg的EFC剂量能上调SIRT1 mRNA和蛋白水平的表达,进而改善衰老大鼠学习与记忆障碍。第二部分 EFC激活海马SIRT1-ADAM10-APP信号通路改善衰老大鼠学习记忆障碍目的:β淀粉样变是阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）的病理特征之一,也出现在生理性衰老的进程中。SIRT1可调控淀粉样蛋白前体（Amyloid precursor protein,APP）的剪切加工过程,同时解整合素金属蛋白酶10（A disintegrin and metalloproteinase10,ADAM10）和β分泌酶1（Beta-secretase 1,BACE1）是APP剪切和加工过程中两个重要的酶,SIRT1对APP剪切过程的调控亦可能与ADAM10和（或）BACE1有关。本研究旨在探讨SIRT1对β淀粉样变的调控是否与ADAM10和（或）BACE1有关,并进一步探讨EFC诱导SIRT1表达与β淀粉样变及EFC改善学习记忆障碍的机理。方法:1.动物实验1.1根据第一部分的结果,本部分以800 mg/kg作为EFC的干预剂量。并且为了验证EFC对SIRT1的激活作用,分别设置了SIRT1激活剂（白藜芦醇）组和SIRT1抑制剂（尼克酰胺）组。激活剂组和抑制剂组给予400 mg/kg D-gal 3个月再分别给予100 mg/kg白藜芦醇和100 mg/kg尼克酰胺的同时不给予或给予800 mg/kg的EFC 3个月。1.2利用IHC检测Aβ42在大鼠海马的表达变化;利用WB和q RT-PCR检测SIRT1、BACE1、ADAM10和APP基因的蛋白水平和m RNA水平的表达变化。2.体外实验2.1利用D-gal诱导SH-SY5Y细胞衰老,EFC作为干预因素,以SIRT1过表达慢病毒（MOI=15）、SIRT1 sh RNA干扰质粒转染细胞分别诱导细胞SIRT1过表达和表达抑制。从以下几个方面探讨EFC对D-gal致衰老细胞的作用;2.2利用衰老相关β-半乳糖苷酶染色检测各组细胞的老化程度;2.3利用免疫荧光和western blot和qRT-PCR分别检测细胞SIRT1、BACE1、ADAM10和APP基因的蛋白水平和m RNA水平的表达。结果:1.动物实验结果1.1免疫组化检测显示,Aβ42阳性细胞在衰老模型组的表达较对照组升高（P<0.05）,EFC干预后,Aβ42在EFC预防组和治疗组的表达均较模型组降低（P<0.05）。1.2利用western blot进一步验证免疫组化的结果。结果显示,Aβ42在D-gal组的表达变化与对照组相比明显增加,在EFC预防组和治疗组的表达较D-gal降低;BACE1在各组的表达水平无显着差异,ADAM10和SIRT1在衰老模型组的表达均较对照组减少（P<0.05）;EFC干预后,ADAM10和SIRT1在EFC预防组和治疗组的表达均较模型组上调（P<0.05）。另外,ADAM10和SIRT1在激活剂组的表达较模型组升高而Aβ42的表达却降低。在抑制剂组,ADAM10、SIRT1和Aβ42的表达与模型组比无差异。1.3 q RT-PCR检测结果显示,BACE1和ADAM10的m RNA在各组的表达水平均无显着差异,D-gal模型组和抑制剂组大鼠的SIRT1 m RNA表达水平较正常对照组显着下降（P<0.05）;而EFC干预后SIRT1 m RNA在EFC预防组和治疗组的表达水平与D-gal模型组相比显着升高（P<0.05）。而与正常对照组相比,D-gal模型组和抑制剂组大鼠的APP m RNA表达水平明显上调（P<0.05）;而EFC干预后APP m RNA在EFC预防组和治疗组的表达水平与D-gal模型组相比明显下调（P<0.05）。2.细胞实验结果2.1 D-gal处理组的衰老细胞明显增多,而D-gal+EFC（50 mg/ml）处理组的SA-β-Gal染色阳性的细胞数量较D-gal处理组显着减少（P<0.05）。2.2 SIRT1的mRNA和蛋白质在D-gal处理组的表达水平均较对照组降低。与D-gal处理组相比,D-gal+EFC处理组和单独EFC处理组的SIRT1的m RNA和蛋白质表达水平显着增加。为了进一步验证EFC对SIRT1表达的影响,分别用SIRT1过表达慢病毒和SIRT1 sh RNA干扰质粒转染D-gal诱导衰老的细胞,随后不给予或给予EFC处理48 h。结果显示,过表达组的SIRT1表达较模型组显着升高,而sh RNA干扰组的SIRT1表达较模型组无显着差异。D-gal处理组细胞内APP的m RNA和蛋白质表达水平均较对照组升高;与D-gal处理组相比,D-gal+EFC处理组的APP的m RNA和蛋白质表达水平明显降低。ADAM10在D-gal处理组细胞内的表达水平较对照组下调;EFC干预后,D-gal+EFC处理组的ADAM10表达水平较衰老模型组升高。BACE1的m RNA和蛋白质及ADAM10的m RNA在各处理组的表达均无显着差异。结论:1.200 mM D-gal可诱导SH-SY5Y细胞的衰老,而50 mg/ml的EFC可以改善细胞的衰老状态。2.EFC可能直接诱导SIRT1的激活。3.过表达的SIRT1可上调ADAM10的表达。4.EFC通过调控SIRT1-ADAM10-APP的途径减少Aβ的生成。第三部分 EFC激活SIRT1-YY1-CREB-BDNF信号通路改善衰老大鼠学习记忆障碍目的:突触可塑性是多种学习形式的主要细胞机制,而异常的突触可塑性可能是衰老认知障碍的主要原因。SIRT1-YY1-CREB-BDNF信号通路的活化会上调脑源性神经营养因子（Brain derived neurotrophic factor,BDNF）的表达从而加强神经元突触的可塑性。本部分旨在探讨EFC改善衰老相关认知障碍与SIRT1-YY1-CREB-BDNF信号通路的关系及其潜在分子机制。方法:本部分研究利用第一、二部分建立的动物模型和细胞模型,通过免疫组化、免疫荧光、western blot和q RT-PCR等方法检测SD大鼠海马组织和SH-SY5Y细胞内SIRT1和BDNF及SIRT1/BDNF信号通路中相关基因YY1、CREB的m RNA及蛋白水平的表达变化。结果:1.蛋白水平的检测发现:各组大鼠海马组织之间和各处理组细胞间的CREB总蛋白水平无显着性差异。SIRT1和转录因子YY1在D-gal组大鼠海马组织和D-gal处理组细胞中的表达较其对应的对照组明显降低（P<0.01）,受SIRT1和YY1共同调节的CREB的磷酸化水平（p-CREB）也随之降低（P<0.05）,最终导致与突触可塑性直接相关的蛋白BDNF表达下调。EFC干预后能够显着升高SIRT1和YY1的表达水平,进而增加其下游物质p-CREB及BDNF的表达。EFC预防组和干预组大鼠海马的SIRT1、YY1、p-CREB及BDNF的表达水平较SIRT1激活剂组无显着差异而较SIRT1抑制剂组显着升高（均为P<0.05）。2.q RT-PCR分析发现:海马YY1和CREB m RNA在各组的表达水平无显着差异,但SIRT1和BDNF m RNA在各组的表达趋势与上述western blot蛋白水平一致。与正常对照组相比,D-gal模型组和抑制剂组大鼠的SIRT1 m RNA表达水平显着下降,而EFC干预后逆转了这种降低的趋势（均为P<0.05）。各组海马BDNF m RNA的表达也与SIRT1有一样的趋势。3.为了进一步验证EFC在体内和体外可诱导SIRT1的表达和激活,在动物实验中,分别利用100 mg/kg白藜芦醇和尼克酰胺干预D-gal诱导衰老的大鼠3个月,设置SIRT1激活剂组和抑制剂组,其中抑制剂组在给予尼克酰胺的同时给予EFC。结果显示,SIRT1在EFC预防组和治疗组的表达与SIRT1在激活剂组表达无显着差异,而在抑制剂组SIRT1的表达与D-gal模型组无显着差异,综合以上结果提示EFC可以显着上调SIRT1的表达。为了进一步验证SIRT1与下游物质的关系,用SIRT1过表达慢病毒和sh RNA干扰质粒分别转染细胞,结果发现,YY1,p-CREB,BDNF在SIRT1过表达病毒转染组细胞中的表达较D-gal模型组高,但YY1,p-CREB,BDNF在sh RNA干扰质粒组细胞的表达水平较D-gal+EFC处理组降低。这一结果提示EFC诱导衰老细胞中YY1,p-CREB,BDNF的表达需要SIRT1的介导。结论:EFC通过激活SIRT1-YY1-CREB-BDNF信号通路增强突触可塑性实现对衰老的改善作用。

陈宁园^[3]（2017）在《火麻仁提取液对D-半乳糖致衰老大鼠空间学习和记忆的干预作用及其机制研究》文中进行了进一步梳理自上世纪90年代以来,人口出生率的下降和人均预期寿命的延长使中国人口老龄化的现象日益突出。随着年龄的增长,正常老年人客观上都发生脑老化,并伴随有不同程度的记忆力减退。此外,阿尔茨海默病（Alzheimer disease,AD）等神经退行性疾病引发的认知功能障碍也成为困扰老年人的一大难题。因此,研究认知衰老的相关机制,探寻延缓脑老化、改善学习和记忆障碍的有效干预措施,对实现健康老龄化和提高老年人生活质量至关重要。火麻仁提取液（Extraciton of Fructus Cannabis,EFC）的来源是火麻仁的干燥成熟果实,其主要成分是饱和脂肪酸及多不饱和脂肪酸。近年来研究发现火麻仁对中枢神经系统、心血管系统、消化系统和免疫系统等具有广泛的药理作用,在抗氧化、抗炎、抗血栓和降低血脂等方面也有良好的疗效。但火麻仁是否对与老龄相关的认知损害有预防保护作用尚不清楚。目的:用D-半乳糖（D-galactose,D-gal）建立亚急性衰老大鼠模型,观察EFC对D-gal致衰老大鼠在Morris水迷宫（Morris water maze,MWM）空间学习和记忆能力的影响,并在m RNA和蛋白水平检测与脑老化相关的基因及蛋白表达情况,探讨衰老过程中认知减退的分子生物学机制;同时进一步在细胞水平,通过D-gal诱导小鼠胚胎成纤维细胞（NIH/3T3）的老化,观察EFC干预对细胞衰老进程的影响。综上所述,本研究旨在探讨EFC对D-gal致衰老大鼠的空间学习及记忆障碍的保护作用及其机制。方法:1.将雄性SD大鼠按随机数字表法分为6组,每组8只,分组方法如下:正常对照组（control）、D-gal模型组（400mg/kg）、EFC（200mg/kg）预防组、EFC（400mg/kg）预防组、D-gal+EFC（200mg/kg）组及D-gal+EFC（400mg/kg）组。以D-gal（400mg/kg）连续腹腔注射14周的方法建立亚急性衰老模型。D-gal模型组大鼠每日给予腹腔注射D-gal 400mg/kg,每日一次,连续给药14周;正常对照组给予腹腔注射等量生理盐水。EFC预防组于D-gal造模前分别预防性给予200mg/kg、400 mg/kg EFC连续灌胃14周,随后给予D-gal腹腔注射14周。D-gal+EFC组为D-gal造模同时分别给予EFC 200mg/kg、400mg/kg灌胃,连续14周。此外,正常对照组与D-gal模型组给予等量生理盐水的灌胃。2.利用Morris水迷宫评估D-gal致衰老大鼠的空间学习及记忆能力。3.采用HE染色法观察D-gal致衰老大鼠海马锥体神经元的病理结构变化。4.WST-1法测定大鼠脑组织中的总超氧化物歧化酶（super oxide dismutase,SOD）活力及TBA法测定丙二醛（malondialdehyde,MDA）水平。5.称重并计算心脏、肝脏、脾脏和胸腺的脏器系数。6.应用免疫荧光法检测大鼠海马齿状回γ-H2AX及星形胶质细胞活化标志物GFAP的表达。7.应用定量逆转录聚合酶连锁反应（quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,q RT-PCR）技术检测并比较各组大鼠海马组织中的APP、Tau、PS1基因的m RNA的表达差异。8.免疫印迹法检测大鼠海马组织中与脑老化相关的total Tau,p-Tau、PS1蛋白的表达水平。9.以D-gal诱导NIH/3T3细胞的老化,EFC作为干预因素,从以下几方面探讨EFC对D-gal致衰老细胞的作用:9.1加载DHE荧光探针初步评估细胞内总ROS生成量后,应用FACS流式细胞仪定量分析细胞内总ROS水平。9.2检测各处理组细胞的衰老相关β-半乳糖苷酶（Senescence-associated-β-galactose,SA-β-gal）的活性。9.3免疫荧光法测定各处理组细胞的DNA损伤标志物γ-H2AX及p-ATM的表达。9.4免疫印迹法检测各处理组细胞的SIRT1、p53、p21蛋白表达水平。所得结果分述如下:第一部分EFC对D-半乳糖致衰老大鼠氧化损伤的保护作用结果:1.D-gal模型组与对照组相比,脑组织SOD活性降低,MDA水平升高（P<0.05）;EFC（400mg/kg）预防组和D-gal+EFC（400mg/kg）组与D-gal模型组相比,脑组织SOD活性明显升高而MDA水平显着下降（P<0.05）。2.D-gal模型组大鼠的心脏、肝脏、脾及胸腺系数明显降低,与对照组相比有统计学差异（P<0.05）;而EFC（400mg/kg）预防组和D-gal+EFC（400mg/kg）大鼠与D-gal模型组相比,上述各脏器系数明显升高（P<0.05）。3.大鼠海马CA1区锥体神经元HE染色结果显示,D-gal模型组与正常对照组相比,海马CA1区锥体神经元结构松散、排列稀疏,大部分细胞胞核出现核固缩,染色加深;D-gal+EFC（400mg/kg）组大鼠海马CA1区锥体神经元较D-gal模型组排列紧密,出现核固缩的细胞数量明显减少;EFC（400mg/kg）预防组大鼠海马CA1区锥体神经元形态基本正常,但锥体细胞层数较正常对照组少且细胞排列稍显疏松。结论:1.EFC可通过提高大鼠抗氧化能力,有效改善D-gal引发的衰老相关症状。2.EFC可通过提高脾和胸腺系数增强大鼠的免疫功能,从而延缓大鼠衰老。3.EFC能减轻D-gal对大鼠海马CA1区锥体神经元造成的损伤。第二部分EFC对D-半乳糖致衰老大鼠空间学习记忆障碍的改善作用结果:1.空间定向航行实验结果显示,各组大鼠在第1天测试中的搜台潜伏期和到达平台的距离无显着差异。但第2天到第5天测试结果显示,D-gal组大鼠的搜台潜伏期和到达平台距离与对照组相比,明显延长（P<0.05）。EFC（400mg/kg）预防组和D-gal+EFC（400mg/kg）组大鼠的搜台潜伏期和到达平台距离与D-gal组相比,显着缩短（P<0.05）。2.定向航行训练第5天,各组大鼠的游泳轨迹显示,D-gal模型组的游泳轨迹杂乱无序,运动轨迹随机分布于各个象限;而EFC（400mg/kg）预防组和D-gal+EFC（400mg/kg）组的游泳轨迹接近正常对照组,搜索平台的策略明显改善,其运动轨迹多位于原平台位置所在象限或相邻的象限。3.空间探索测试中,D-gal模型组大鼠穿越原平台位置的次数明显减少,在原平台象限停留的时间也显着缩短（P<0.05）。而EFC（400mg/kg）预防组和D-gal+EFC（400mg/kg）组大鼠与D-gal模型组相比,穿越原平台位置的次数明显增加,在原平台象限停留的时间延长（P<0.05）。4.D-gal模型组大鼠海马齿状回GFAP和γ-H2AX阳性表达的细胞数量,与正常对照组相比明显增多（P<0.05）,而EFC（400mg/kg）预防组和D-gal+EFC（400mg/kg）组大鼠GFAP和γ-H2AX阳性表达的细胞数量与D-gal模型组相比则明显减少（P<0.05）。结论:1.EFC可提高大鼠在Morris水迷宫测试中的各项成绩,对D-gal引起的空间学习及记忆损伤有一定的改善作用。2.EFC可通过抑制大鼠海马齿状回星形胶质细胞的活化,减少GFAP的阳性表达来达到保护海马神经元的作用,从而提高大鼠的空间学习和记忆能力。3.EFC可通过减轻大鼠海马齿状回细胞的DNA损伤,使γ-H2AX焦点的数量减少,进而改善大鼠的学习和记忆能力。第三部分EFC对D-半乳糖致衰老大鼠APP、Tau及PS1基因的影响结果:q RT-PCR检测结果显示,与对照组相比,D-gal组海马组织的APP、Tau、PS1 m RNA的相对表达量显着升高（P<0.05）;与D-gal组相比,EFC（400mg/kg）预防组和D-gal+EFC（400mg/kg）组大鼠海马组织中的APP、Tau、PS1 m RNA的相对表达量则显着下降（P<0.05）。结论:EFC可下调大鼠海马组织APP、Tau、PS1基因m RNA的表达,进而延缓D-gal致衰老大鼠的神经退行性病变,改善认知功能。第四部分EFC对D-半乳糖致衰老大鼠Tau,PS1蛋白表达的影响结果:免疫印迹检测结果显示,D-gal模型组海马组织Tau蛋白S396位点的磷酸化程度及PS1蛋白的表达水平与正常对照组相比明显升高（P<0.05）,而EFC（400mg/kg）预防组和D-gal+EFC（400mg/kg）组与D-gal模型组相比,海马组织Tau蛋白S396位点的磷酸化程度与PS1蛋白表达水平明显下降（P<0.05）。但各组间总Tau蛋白表达水平没有显着差异。结论:EFC可能通过下调Tau蛋白磷酸化程度及PS1蛋白的表达水平,以此发挥延缓脑老化的作用,改善D-gal所致的空间学习和记忆障碍。第五部分EFC对SIRT1表达及p53-p21途径的影响及其机制结果:1.ROS荧光探针（DHE）检测结果显示,与对照组相比,D-gal（400m M）处理组细胞产生的ROS荧光信号显着增强,EFC（50μg/ml）预处理24h后,ROS荧光信号明显减弱。FACS流式细胞仪定量检测结果表明,D-gal处理组细胞ROS生成百分比最高达45.2%,对照组为1.4%,D-gal+EFC组及EFC组分别为3.2%和2.5%。2.D-gal处理组的衰老细胞明显增多,40%的3T3细胞SA-β-gal染色阳性;而D-gal+EFC组及EFC组与D-gal处理组相比,SA-β-gal染色阳性的细胞数量明显减少。3.免疫荧光染色结果显示,D-gal（400m M）处理后细胞的γ-H2AX焦点数量增加、p-ATM显色加强,而用EFC（50μg/ml）预处理细胞24h后,D-gal+EFC组及EFC预防组γ-H2AX焦点数量减少、p-ATM显色明显减弱。4.免疫印迹试验检测结果显示,与对照组相比,D-gal处理组NIH/3T3细胞的SIRT1表达水平降低,p53、p21表达水平明显升高（P<0.05）,而EFC预处理细胞24h后,D-gal+EFC组及EFC组的SIRT1表达上调,p53、p21表达显着下降（P<0.05）。结论:1.EFC可能通过提高NIH/3T3细胞的抗氧化能力而抑制ROS的生成,进而延缓细胞老化,使SA-β-gal表达下调;提高DNA损伤修复能力从而减轻D-gal诱发的细胞DNA损伤,使DNA损伤标志物γ-H2AX及p-ATM表达降低。2.EFC可能通过上调NIH/3T3细胞的SIRT1表达水平而降低衰老相关蛋白p53、p21的表达,进而发挥延缓细胞衰老的作用。

杨琨^[4]（2015）在《CIRP在牦牛不同组织器官的表达及温和冷应激对细胞CIRP和HSP70表达的影响》文中研究指明在动物细胞内存在两种冷诱导RNA结合蛋白（CIRP和RBM3）。当细胞暴露于适度的冷应激及其他应激条件如:紫外线辐射、缺氧之后,这两种蛋白就会随之被诱导产生。起初学者们认为这些蛋白质对细胞增殖有抑制而非刺激作用;然而,近期学者证实CIRP具有增殖和/或原致癌基因的功能。有报道提出CIRP在小鼠原代细胞中是属于永生化基因,另外其转化作用也已经被证明,而且人类患肿瘤时,CIRP和RBM3这两个因子表达均发生上调。有学者推测CIRP可能通过抵消氧化损伤,进而参与并介导其他凋亡通路。相比于细菌和植物,目前对于哺乳动物冷休克反应的研究较少,但在某些领域例外,如适应性产热作用、耐寒性、细胞和器官的贮存等。另外,在脑损伤治疗和蛋白质合成领域,对冷应激反应的研究也相对较多。在细胞水平,一些哺乳动物细胞反应与微生物是相似的;冷应激改变细胞膜的脂质组成,并抑制蛋白质合成和细胞增殖的速率。虽然目前的研究主要涉及温度20℃以下的冷应激,但是轻度低温（25℃）就可以改变随后的细胞应答,HSP110家族的成员APG-1有明显的表现。此外,25℃应激就能诱导CIRP（冷诱导RNA结合蛋白）的表达,CIRP是哺乳动物细胞内被鉴定出的第一个冷休克蛋白质。与HSP相同的是,CIRP在37℃也表达并且可能担任一种RNA分子伴侣。哺乳动物细胞在25℃具有代谢活性,细胞可以存活,并且可以对应激刺激产生应答,因此,亚低温下哺乳动物细胞的细胞学和分子生物学研究,将可能会对医学和生物技术领域产生影响。（1）冷诱导RNA结合蛋白（cold-inducible RNA-binding protein,CIRP）调控动物机体对低温的产生相对适应性。CIRP基因在多种组织中都有表达;特别是低温、低氧及强紫外线辐射等条件都能诱导其表达。本研究选取海拔3000-5000 m的青海成年牦牛（Bos grunniens）为研究对象,利用实时荧光定量PCR、Western blot技术及免疫组化技术,提取牦牛大脑组织cDNA克隆CIRP开放阅读框（ORF）,并分析CIRP的mRNA和蛋白在牦牛大脑、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、卵巢、睾丸及皮肤中的表达与分布水平。结果显示,CIRP mRNA序列编码区长为642bp,编码213个氨基酸,编码蛋白大小约为23kD,与家牛有较高的同源性。cirp在心脏、大脑、睾丸、皮肤高表达,肺表达量最低,这些数据可能为进一步了解及研究cirp蛋白在牦牛适应高原方面所发挥的作用提供资料。（2）冷诱导rna结合蛋白是目前哺乳动物中被广泛研究的冷应激蛋白之一。分析cirp在牦牛睾丸不同发育阶段的表达变化,探究其在牦牛睾丸发育过程中所起的作用,为进一步揭示cirp在高原哺乳动物精子发生及睾丸相关功能调节过程中的作用机制提供理论依据。实验采用实时荧光定量rt-pcr（qrt-pcr）、westernblot及免疫组织化学sabc法检测1日龄、5月龄、1岁及3岁牦牛睾丸cirpmrna及蛋白的表达。rt-pcr反应扩增得到牦牛cirpmrna序列编码区长为642bp,编码213个氨基酸,编码蛋白大小约为23kd,与家牛有较高的同源性。实时荧光定量rt-pcr和westernblot实验结果显示,cirpmrna及蛋白在各年龄牦牛睾丸中均有表达,且随着年龄的增长,表达呈现上升趋势。免疫组织化学结果显示,1日龄牦牛睾丸曲细精管上皮中可观察到较弱的免疫阳性反应,阳性细胞为精原细胞;5月龄曲细精管上皮cirp表达较丰富,阳性细胞仍为精原细胞;1岁曲细精管上皮出现初级精母细胞,并与精原细胞表达阳性;3岁牦牛睾丸发育成熟,曲细精管表达强烈,阳性细胞为精原细胞和初级精母细胞且主要位于细胞核内。综上所述,牦牛睾丸中cirp表达量随年龄增长而变高,这提示cirp可能对牦牛睾丸发育及生精细胞的增殖分化具有调控和保护作用。（3）细胞冷应激反应是一个复杂的过程,它包括低温本身的应激阶段和复温后的应激阶段,本研究以牦牛卵泡颗粒细胞为研究对象,利用实时荧光定量pcr、westernblot技术,分析温和冷处理（25℃）1d、5d及复温1、2、4、8及24h条件下,细胞内cirp、hsp70及p53变化规律。结果显示,细胞在25℃培养5d,然后通过复温至37℃,会影响细胞生理状态以及诱导细胞应激反应。cirp的表达量在25℃温和冷处理第1天开始上升,并且在复温后24h左右恢复到正常水平。hsp70的表达量在37℃复温培养后逐步上升,复温8h出现峰值,随后下降。p53mrna表达水平在复温培养4h出现峰值,随后下降,并且在cirp及hsp70mrna高表达时,均有明显的下降。结果表明,低温会诱导细胞cirpmrna和蛋白表达水平的上升;hsp70能够被冷应激后的复温诱导;cirp和hsp70都具有抗应激损害和细胞凋亡的作用。这些数据将为亚低温和复温应激在各种研究和治疗领域的应用提供参考。

郭纬纬,颜立冲,左汲^[5]（2013）在《GRP75功能及与肿瘤关系的研究进展》文中指出GRP75在细胞中参与多个细胞信号途径调节细胞应激反应、促进细胞增殖、抑制细胞凋亡。近年来,GRP75在多种肿瘤组织中高表达,并且与多种肿瘤的发生及转移等都有着密切的关联。因此,对GRP75功能的研究可为肿瘤的治疗提供了新的靶点。现就GRP75蛋白的相关功能及与肿瘤之间关系的研究现状展开综述。

杜娟^[6]（2012）在《FOXC1抑制乳腺癌体内肺转移及CARM1通过位点特异性甲基化HP1γ抑制肿瘤细胞的衰老和SAHF》文中指出本论文的研究工作分为以下两大部分。在第一部分工作中,我们对FOXC1抑制乳腺癌在体内的肺转移及相关机制进行了研究。在实验室的前期工作中,我们已经证明FOXC1是Polycomb复合物的靶基因,并且可能在MDA-MB-231细胞的体外迁移中起作用,但是对于证明FOXC1在体内转移中的作用却缺乏相关证据。因此,我们通过研究高肺转移的乳腺癌MDA-MB-231HM细胞系,发现FOXC1在MDA-MB-231HM细胞中的表达比其在亲本MDA-MB-231细胞的表达低,这说明FOXC1的下调可能在乳腺癌转移中发挥作用。在MDA-MB-231HM中过表达FOXC1能够抑制细胞的体外的迁移和侵袭。我们在裸鼠体内通过尾静脉注射和乳腺脂肪垫原位注射两种方法,验证了FOXC1过表达能够抑制MDA-MB-231-HM细胞在体内的转移。通过以上体内和体外两种实验,验证了FOXC1在乳腺癌中的作用,并为FOXC1在乳腺癌的临床预后及治疗提供了理论基础。在第二部分工作中,我们对CARM1通过特异性位点甲基化HP1γ抑制肿瘤细胞的衰老和SAHF进行了研究。在实验室前期工作中,我们利用大通量siRNA进行筛选,选出能够参与肿瘤细胞衰老事件的重要基因,并从中选取CARM1（又称PRMT4）基因作进一步研究。研究发现,在衰老的MDA-MB-231及WI-38细胞中检测得出了CARM1明显地下调,并且在MDA-MB-231中过表达CARM1能够抑制阿霉素诱导的衰老及衰老相关的异染色质凝集（SAHF）。为了进一步验证CARM1在衰老及其在SAHF中的作用,我们在MDA-MB-231细胞中下调CARM1后发生了衰老及SAHF现象。而且通过体内的免疫共沉淀实验我们发现,CARM1与HP1γ存在于同一复合物中;通过质谱实验,我们证实HP1γ能够被CARM1甲基化,甲基化位点在HP1γ的第91位的精氨酸。通过点突变抑制HP1γ的91位的精氨酸甲基化,可以诱导MDA-MB-231细胞的衰老及SAHF形成现象,这证明CARM1是通过对HP1γ的91位精氨酸甲基化发挥作用。通过磷酸水解酶和western实验,通过干涉CARM1或者抑制HP1γ的91位点精氨酸的甲基化都检测到HP1γ磷酸化的显着上升。我们的实验证实了CARM1通过甲基化HP1γ的91位点抑制了HP1γ磷酸化,抑制MDA-MB-231的衰老及SAHF现象;当干涉CARM1后,HP1γ的甲基化被抑制了,磷酸化上升,促进HP1γ进入SAHF中起作用。这些结果为揭示CARM1的新功能、HP1γ翻译后修饰的功能,以及乳腺癌的潜在治疗靶标和机制提供了有力的证据。

朱亚楠^[7]（2012）在《p33ING1b在急性白血病中的表达及意义》文中研究指明背景与目的急性白血病（Acute Leukemia, AL）,已被认为是严重威胁人类身体健康的恶性肿瘤之一。该疾病的特征为原始和（或）幼稚细胞增殖发生异常,同时分化、凋亡也会受到不同程度抑制。AL的发病机制目前尚未十分明确,但有研究显示它的发生发展与原癌基因的活化、抑癌基因的灭活有关。抑癌基因是启动细胞癌变的主要因素,对细胞生长起负调控作用,基因缺失、突变或错位等诸多因素均可引起抑癌基因功能异常。生长抑制因子-1（Inhibitorof growthl,ING1）是新近发现的一种抑癌基因,在几乎所有的正常细胞中较广泛表达。ING1基因通过不同的转录剪切方式翻译出不同分子量的蛋白质,p33INGlb是ING1编码的重要蛋白质,在肿瘤的发生发展中起着非常重要的作用,其磷酸化状态决定它参与细胞周期调控等多种生物学功能。在正常组织细胞中,p33INGlb蛋白在GO进入G1期时表达量减少,在G1晚期又出现增加趋势,在S期达到最大值,接着在G2期表达水平降低。有研究表明,ING1基因核表达减少的现象在一部分良性肿瘤以及几乎所有恶性肿瘤的组织细胞中均可出现。目前p33INGlb在急性白血病患者中的表达及其可能参与的发病机制已有报道,但是应用逆转录聚合酶链反应（reverse transcriptase-polymerase chain reaction）RT-PCR法检测不同类型急性白血病患者p33INGlb的表达情况以及其与AL骨髓外浸润及复发的相关报道较少。本实验通过RT-PCR法检测p33ING1b在不同类型和不同疾病阶段急性白血病患者的骨髓单个核细胞中表达情况及表达水平的差异,分析p33INGlb与AL患者临床表现的相关性,进而探讨其在AL发生发展中可能参与的作用机制。材料与方法1研究对象65例病例来自2010年12月-2012年3月我院住院或门诊急性白血病患者,平均年龄34（15-68）岁。（1）初治组46例；男性20例,女性26例,其中急性髓系白血病（AML）32例（AML-M219例,AML-M37例,AML-M52例）,急性淋巴细胞白血病（ALL）14例；（2）完全缓解组12例；AML8例,ALL4例；（3）复发组7例；男3例,女4例；（4）正常对照组；为8名骨髓象正常的非恶性血液病患者。2实验方法RT-PCR法检测p33ING1bmRNA的表达水平：取骨髓标本,分离单个核细胞后Trizol法提取实验细胞总RNA并检测其质量及浓度,逆转录成cDNA, PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳后,将琼脂糖凝胶放入凝胶成像扫描仪中紫外线下成像,用凝胶图像分析系统观察、分析实验结果并拍照。3统计分析实验结果应用SPSS17.0统计学软件分析,对定量资料使用平均值±标准差即x±sd,采用t检验对两样本均数进行比较,应用方差分析对多样本均数比较,定性资料采用卡方检验及Fisher’s精确概率试验,采用Spearman分析相关性,以a=0.05为检验水准。结果1. p33ING1bmRNA在AL初治组、复发组、缓解组中的阳性率分别为45.7%（21/46）,42.9%（3/7）,58.3%（7/12）, p33ING1bmRNA的表达水平分别为0.203±0.106,0.389±0.027,0.627±0.202；正常对照组的阳性率为87.5%（7/8）,它们的阳性细胞率及表达水平明显低于对照组。复发组的阳性率及表达水平与缓解组比较,差异具有统计学意义（p<0.05）；复发组与初治组的阳性率差异无统计学意义（p>0.05）,但表达水平差异有统计学意义（p<0.05）；初治组的表达水平及阳性率分别为0.203-0.106、45.7%与缓解组的阳性率58.3%及表达水平0.627±0.202比较差异有统计学意义（p<0.05）2. AML患者p33ING1b的阳性表达率为45.5%（20/44）而ALL为52.38%（11/21）,两组平均表达水平分别为0.491±0.173、0.565±0.221,阳性表达率及平均表达水平差异无统计学意义（p>0.05）。3.p33ING1bmRNA的表达水平与AL的骨髓外浸润、患者的性别、年龄无明显相关性（p>0.05）结论1.p33ING1bmRNA在急性白血病中低表达,在缓解组的表达水平较初治组和复发组高,差异有统计学意义,提示p33ING1b的低表达可能与急性白血病的发生发展有关。2.p33ING1bmRNA在初治ALL和AML患者中均低表达,差异无统计学意义,提示其低表达与白血病的类型可能无关。3.p33ING1bmRNA的表达水平与急性白血病患者的性别、年龄、髓外浸润等临床特征无相关性。

李玉平^[8]（2012）在《P16蛋白在人毛乳头细胞中的表达及对其生长特性的影响》文中进行了进一步梳理目的：毛囊是毛发的主体，是一个典型的再生系统，而毛乳头细胞在毛囊发育和毛囊周期调控中起主导作用。毛乳头细胞是一种特化的成纤维细胞，诱导毛囊形成是毛乳头细胞最为显着的功能特征，但是体外培养的毛乳头细胞只有形成凝集性生长后才具有诱导毛囊形成的能力。随着传代次数的增加，毛乳头细胞的凝集性生长特性逐渐减弱。P16基因是一种定位于9p21的多种肿瘤抑制基因，主要有以下几种名称：INK4a、CDK4I、CDKN2、MST-1，其中以INK4a最常见，基因产物P16蛋白属细胞周期蛋白依赖激酶抑制剂家族，可对细胞周期起到反向调节作用，使细胞生长到一定时期后丧失其生物学特性，出现凋亡反应，遏制细胞的过度增殖，阻止肿瘤的形成。P16蛋白还参与其它程序的调控，例如衰老、侵入、血管及红细胞的生成和HPV感染等。有研究表明P16蛋白在衰老的成纤维细胞中呈过度表达，其对成纤维细胞的衰老有一定的促进作用，而毛乳头细胞作为一种特化的成纤维细胞，其P16蛋白的表达情况目前尚未见报道。本实验拟研究P16蛋白在毛乳头细胞中的表达情况，揭示体外培养的人毛乳头细胞发生衰老的可能机制，研究外源性的P16蛋白对毛乳头细胞的影响，为以后临床毛发疾病的治疗提供实验依据。方法：1毛乳头细胞的分离、培养。将改良二步酶消化法获得的毛乳头通过差速离心的方法收集，移入装有DMEM培养基（15%胎牛，1%双抗）的培养瓶中，温箱（5%CO2，37℃）内常规培养。2毛乳头细胞的鉴定、传代。通过α-平滑肌肌动蛋白染色鉴定毛乳头细胞。待细胞融合至70%-80%时用胰蛋白酶（0.25%）消化传代，放置温箱内常规培养。3应用免疫组化S-P法检测不同传代次数的毛乳头细胞P16蛋白的表达情况。4应用流式细胞术检测不同传代次数的毛乳头细胞P16蛋白的表达情况。5MTT分析法检测不同浓度的重组人P16蛋白（5ng/ml～200ng/ml）对处于对数生长的人毛乳头细胞衰老的影响。6应用统计软件SPSS13.0，采用单因素方差分析，以α=0.05的检验标准对数据进行统计分析及处理。结果：1应用“二步酶消化法”和“差速离心法”，成功分离提取出较纯的毛乳头，贴壁迅速，可见凝集性生长的特性，3-5代最显着，7-8代以后完全消失。2毛乳头细胞经过α-SMA（α-平滑肌肌动蛋白）免疫组化染色后，在倒置显微镜下可见细胞胞浆中含有大量细丝状的α-平滑肌肌动蛋白。3免疫组化S-P法检测4代、8代细胞中P16蛋白的表达情况。在倒置显微镜下可见4代细胞和8代细胞胞核P16蛋白表达分别为极弱阳性和弱阳性（±），均伴有胞浆弱阳性表达（±），两组之间有差异。空白对照组细胞胞核胞浆均为阴性表达（-）。4流式细胞术检测4代、8代细胞中P16蛋白的表达情况。P16蛋白的表达量用均道值表示。流式结果显示，4代、8代毛乳头细胞及阴性对照组中P16蛋白表达的均道值分别为-49.32±4.20、-47.38±12.99、-71.51±19.19，蛋白表达量为负值，统计分析显示各组间均无显着性差异（P>0.05）。5MTT检测外源性P16蛋白对毛乳头细胞衰老的影响。取5代处于对数生长期的细胞加入不同浓度的重组人P16，培养72h后，倒置显微镜下观察细胞形态，未见明显变化。MTT结果显示，各实验组与阴性对照组相比，在5ng/ml-25ng/ml浓度内，促衰老作用呈现剂量依赖性，统计分析有显着性差异（P<0.05），再增加细胞因子浓度，促衰老作用反而减弱。结论：1二步酶消化法可快速有效的提取较纯的毛乳头。随着传代次数的增加，毛乳头细胞的凝集性生长的特性逐渐消失。2体外培养时，毛乳头细胞中P16蛋白含量极低，随着传代次数的增加，人毛乳头细胞中P16蛋白的表达量逐渐增加，提示在毛乳头细胞的衰老过程中，P16可能发挥着较为重要的作用。这也间接证实了毛乳头细胞是一簇特化的成纤维细胞的观点。3外源性的P16蛋白对毛乳头细胞的衰老有促进作用，也间接验证了P16可能在毛乳头细胞的衰老中发挥着重要的作用。

施寒清^[9]（2010）在《细胞周期检验点蛋白Nbs1的转录调控及功能》文中研究说明Nbs1是细胞应答DNA损伤时起重要作用的蛋白,特别是在应答DNA双链断裂时。它在DSB监测、DNA损伤应答、细胞周期检验点、DNA损伤的修复和DNA复制中都起到重要作用,对维持基因组的保真性和细胞的存活有重要贡献。虽然有报道c-Myc可以调控Nbs1的表达,但是关于Nbs1的转录调控的具体机制未见报道。c-Myc是一个泛在性转录因子,在细胞中调控了大量的靶基因,影响许多细胞进程,包括了细胞增殖、生长、凋亡、能量代谢、分化等。c-Myc的表达失调与肿瘤发生和治疗密切相关,关于c-Myc对肿瘤细胞的药物敏感性的影响及其机制还有待阐明。本文探讨了Nbs1的表达调控的机制和意义以及c-Myc对肿瘤细胞的药物敏感性与Nbs1和DNA修复机制的关系。我们的研究证实了Nbs1是c-Myc的靶基因,存在于Nbs1启动子区的两个E-box序列对c-Myc结合是重要的。我们的实验结果也显示,组蛋白乙酰化酶p300参与Nbs1的表达调控,p300促进Nbs1的表达。染色质免疫沉淀表明c-Myc招募p300到Nbs1启动子,而且引起了Nbs1启动子区的组蛋白H4乙酰化。通过点突变和染色质免疫沉淀我们确定了Nbs1启动子区的两个E-box序列对c-Myc招募p300有重要作用。通过集落形成实验我们发现,过表达c-Myc和Nbs1都可以降低骨肉瘤细胞U2OS的阿霉素敏感性。通过小RNA干涉和补偿实验我们发现c-Myc对阿霉素作用的影响与其调控Nbs1有关,增强DNA损伤修复能力可能是c-Myc影响阿霉素的疗效的一个重要因素。用小RNA干涉进行的集落形成实验结果也显示,要提高c-Myc高表达细胞的阿霉素敏感性,干涉Nbs1可能比直接干涉c-Myc更有效。我们对Nbs1的表达调控的机制的研究阐明了c-Myc调控Nbs1的机制,从DNA损伤修复角度说明了c-Myc对骨肉瘤细胞药物抗性的影响机制,为肿瘤的治疗提供了依据。

杨胜辉^[10]（2010）在《载有hTERT基因逆转录病毒感染日本血吸虫童虫的研究》文中认为迄今为止,应用于血吸虫病防治实践的技术仍存在许多不足,尤在控制日本血吸虫病流行与传播方面尚无理想方法。30年前有学者提出,建立稳定生长和连续传代培养的血吸虫细胞系,可为寻求新的防治技术提供基础和条件,但通过数十年的细胞培养技术探索,一直未能实现建立可连续传代生长的血吸虫细胞系目标。本研究受哺乳动物体细胞经转导外源永生化基因后成功建立永生化细胞系的启示,开展了采用逆转录病毒载体对日本血吸虫童虫细胞进行外源基因转导的生物学理论探索,制备了载有永生化基因（hTERT）的双嗜性逆转录病毒和泛嗜性逆转录病毒,并观察了这2种逆转录病毒载体转导外源基因到日本血吸虫童虫细胞或虫体后所发生的整合、转录和表达以及对Sj细胞增殖的影响。本研究目的在于为血吸虫细胞永生化研究提供理想的转导外源基因的载体,验证外源hTERT基因能否在血吸虫体内整合、表达及其表达部位,同时探索hTERT基因表达诱导细胞增殖的可行性。[目的]探讨用双嗜性逆转录病毒载体将外源基因导入日本血吸虫（Sj）细胞的生物学理论与实验依据。[方法]从GenBank中收集褐家鼠双嗜性逆转录病毒受体（rRam-1）的氨基酸序列,应用Blastp工具对其进行序列相似性搜索,并用Cluster W2工具对相似性较高的氨基酸序列进行同源性分析；采用RPS-blast与InterproScan在线工具对rRam-1受体及其同源的氨基酸序列进行保守区域分析；进一步应用多个在线分析工具对与rRam-1同源的Sj蛋白进行蛋白二级结构、疏水性、跨膜性、信号肽、亚细胞定位以及翻译后修饰点等进行分析与预测；在生物信息学预测的基础上采用含短片段外源基因的双嗜性逆转录病毒载体感染Sj-12d童虫细胞培养物,并应用PCR与RT-PCR方法检测外源基因在Sj细胞中的整合与表达。[结果]rRam-1氨基酸残基序列相似性搜索及同源性分析显示,其氨基酸序列与多种脊椎动物的钠离子依赖性的磷酸盐运载体家族的氨基酸序列有很高的同源性,一致性均在59%以上,其中,与中国仓鼠Ram-1受体（cRam-1）和人类Ram-1 （h Ram-1）受体的氨基酸序列一致性均为93%；此外,与多种无脊椎动物磷酸盐运载体家族的氨基酸序列也有较高的同源性,氨基酸一致性在42%以上；Sj中存在2种与rRam-1受体有较高同源性的蛋白SJCHGC09605和SjCHGC05362,它们与rRam-1受体之间的氨基酸序列一致性分别为54%和61%,相似性分别为74%和72%。2种血吸虫蛋白与人类、褐家鼠及中国仓鼠的Ram-1受体蛋白处于平行的进化分枝上。保守性分析显示,2种Sj蛋白与人类、褐家鼠及中国仓鼠的Ram-1受体存在相同的PH04 Superfamily保守结构域,均为磷酸盐运载体超家族成员；二级结构显示,SJCHGC09605和SJCHGC05362蛋白中,α螺旋分别占68.97%和39.22%,跨膜区预测显示分别有7个和5个可能的区域,与疏水性预测结果完全一致；亚细胞定位及翻译后修饰位点分析显示,2种蛋白均不含信号肽序列和亚细胞定位信号,也不含糖基化、磷酸化和脂酰化等翻译后修饰位点。利用携带外源E77.43基因的双嗜性逆转录病毒感染Sj童虫细胞后,经PCR与RT-PCR检测到目的基因存在与表达,扩增的目的片段大小为330 bp,与理论值相符。[结论]双嗜性逆转录病毒rRam-1受体与日本血吸虫细胞膜上起离子转运通道或受体蛋白作用的SjCHGC09605和SjCHGC05362两种跨膜蛋白成分存在较高同源性；用载有E77.43基因的双嗜性逆转录病毒感染Sj童虫细胞获得成功,推测SjCHGC09605和SjCHGC05362两种与rRam-1受体同源的蛋白可能是Sj感染过程中起作用的分子。该结果为下一步用双嗜性逆转录病毒载体转导永生化基因至Sj细胞提供了生物学理论与实验依据。[目的]建立含永生化基因（hTERT）的稳定产逆转录病毒细胞株,观察hTERT基因转导Sj童虫细胞后的整合和表达情况以及对细胞增殖作用的影响。[方法]将从美国引进的pBABE-puro-hTERT质粒经核酸内切酶酶切、PCR扩增和测序鉴定确认；倍比稀释测定PA317细胞和NIH3T3细胞对嘌呤霉素的最高耐受浓度；用脂质体将质粒转染至PA317细胞内,经嘌呤霉素筛选获得抗性克隆并扩大培养,并通过PCR、测序、免疫荧光、Western-blot及透射电镜对抗性细胞株进行鉴定,并以NIH3T3细胞测定收集的逆转录病毒液滴度。常规制备Sj-12d童虫细胞,并在体外培养中用BrudU-ELISA法检测细胞增殖情况,PCR法检测兔线粒体特异性基因确定无宿主来源细胞污染,倍比稀释法测定Sj细胞对嘌呤霉素的最高耐受浓度；用浓缩的双嗜性逆转录病毒感染Sj-12d童虫细胞并以嘌呤霉素连续筛选培养获得抗性Sj细胞克隆,扩大培养后用PCR、RT-PCR、Western-blot检测外源hTERT基因和puror基因在细胞内的整合与表达；用3H-TdR掺入法检测嘌呤霉素抗性Sj-12d细胞的增殖能力,利用细胞计数法绘制其生长曲线,并应用TRAP-ELISA法测定其端粒酶活性。[结果]pBABE-puro-hTERT质粒经酶切、PCR和测序鉴定为目的质粒；PA317细胞和NIH3T3细胞对嘌呤霉素的最高耐受浓度为6μg/ml和3μg/ml；嘌呤霉素抗性PA317克隆扩大培养物经PCR、测序、免疫荧光以及Western-blot检测到外源hTERT基因和puror基因的整合、转录及蛋白质表达；透射电镜检测到抗性PA317细胞的培养上清及胞浆内有逆转录病毒颗粒的存在,经浓缩后测得其滴度为2×105cfu/ml。Sj-12d童虫细胞培养3d后即可见部分细胞分裂相,10-14d后可见较多分裂相,BrdU-ELISA也显示培养14d后有明显的DNA合成与增殖,其对嘌呤霉素最高耐受浓度为0.5μg/ml;双嗜性逆转录病毒感染Sj-12d细胞后经嘌呤霉素连续筛选21d可见抗性克隆形成,对扩大培养后的抗性细胞做PCR、RT-PCR和Western blot,检测到外源hTERT基因和puror基因在抗性Sj-12d细胞内的整合、转录及蛋白表达,但整合的拷贝数少,转录水平低下；3H-TdR掺入法检测显示抗性Sj-12d细胞与常规培养的Sj-12d细胞均有一定增殖能力,但二者间差异无显着性（P>0.05）；TRAP-ELISA实验未能从抗性Sj-12d细胞内检测到端粒酶活性；在培养4周内的抗性Sj-12d细胞生长相对较快,此后生长逐渐减慢,死亡细胞和退变细胞的数目逐渐增多,最后全部死亡。[结论]用pBABE-puro-hTERT逆转录病毒质粒转染PA317细胞后,成功建立含hTERT基因稳定产双嗜性逆转录病毒颗粒的细胞株；该病毒感染Sj-12d童虫细胞后可检测到外源hTERT基因和puror基因的整合、转录及蛋白表达,但整合拷贝数少,转录水平低下,未能激活Sj-12d细胞的端粒酶活性和改善细胞的增殖能力。[目的]为提高逆转录病毒对血吸虫的感染能力,探讨应用pVSV-G质粒和pBABE-puro-hTERT质粒共转染包装细胞制备泛嗜性逆转录病毒的可行性,并观察该病毒感染Sj童虫后外源基因在虫体内的整合、转录、表达及具体的表达部位情况。[方法]将pVSV-G质粒和pBABE-puro-hTERT质粒共转染GP2-293包装细胞,转染后48h收集细胞培养上清,用浓缩的上清液与Polybrene混合液感染NIH3T3细胞系,经嘌呤霉素连续筛选12d后获得抗性克隆,计数抗性克隆数目并计算病毒滴度；挑取抗性NIH3T3克隆扩大培养,以PCR检测外源hTERT基因和puror基因在细胞内的整合,采用免疫细胞化学染色法检测hTERT基因在细胞内的表达情况；将泛嗜性逆转录病毒加入到体外培养的Sj-12d童虫,感染24h后更换培养基,将虫体连续培养6d；采用PCR和Southern杂交检测外源hTERT基因在虫体内的整合,同时应用RT-PCR、Western blot及免疫组织化学染色检测外源hTERT基因在虫体内的转录、表达及定位情况。[结果]经计数后,泛嗜性逆转录病毒颗粒滴度为3.2×108,抗性NIH3T3细胞经PCR扩增出外源hTERT基因和puror基因特异性145bp和204bp目的条带,免疫细胞化学染色法检测到hTERT基因在细胞内发生了蛋白质表达,表达部位以细胞核内为主；泛嗜性逆转录病毒感染后的虫体经PCR和RT-PCR扩增出了外源hTERT基因和puror基因特异性145bp和204bp目的产物,其中,hTERT基因的转录水平较高,而puror基因的转录水平则较低,Southern杂交也显示出虫体内有外源hTERT基因的多个拷贝整合；Western blot实验显示病毒感染后的虫体内有外源hTERT基因的表达,其表达部位经免疫组织化学染色确定为在虫体的口吸盘、腹吸盘和后部体壁皮层下的表达量最多。[结论]用pVSV-G质粒和pBABE-puro-hTERT质粒共转染包装细胞后成功制备携带外源hTERT基因泛嗜性逆转录病毒,并证明该病毒感染Sj童虫活虫体后可在吸盘和后部体壁皮层下产生外源hTERT基因的多拷贝整合、转录与蛋白质表达。

二、Senescence-like changes induced by expression of p21~(Waf1/Cip1) in NIH3T3 cell line（论文开题报告）

（1）论文研究背景及目的

此处内容要求：

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例：

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

（2）本文研究方法

调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、Senescence-like changes induced by expression of p21~(Waf1/Cip1) in NIH3T3 cell line（论文提纲范文）

（1）DNMT2敲除导致细胞衰老及其调控的机制研究（论文提纲范文）

（2）SIRT1介导的火麻仁提取液改善衰老大鼠学习记忆障碍的机制（论文提纲范文）

（3）火麻仁提取液对D-半乳糖致衰老大鼠空间学习和记忆的干预作用及其机制研究（论文提纲范文）

（4）CIRP在牦牛不同组织器官的表达及温和冷应激对细胞CIRP和HSP70表达的影响（论文提纲范文）

（6）FOXC1抑制乳腺癌体内肺转移及CARM1通过位点特异性甲基化HP1γ抑制肿瘤细胞的衰老和SAHF（论文提纲范文）

（7）p33ING1b在急性白血病中的表达及意义（论文提纲范文）

（8）P16蛋白在人毛乳头细胞中的表达及对其生长特性的影响（论文提纲范文）

（9）细胞周期检验点蛋白Nbs1的转录调控及功能（论文提纲范文）

（10）载有hTERT基因逆转录病毒感染日本血吸虫童虫的研究（论文提纲范文）

四、Senescence-like changes induced by expression of p21~(Waf1/Cip1) in NIH3T3 cell line（论文参考文献）

• [1]DNMT2敲除导致细胞衰老及其调控的机制研究[D]. 罗轩. 福建师范大学, 2020(12)
• [2]SIRT1介导的火麻仁提取液改善衰老大鼠学习记忆障碍的机制[D]. 黄玲. 广西医科大学, 2018(08)
• [3]火麻仁提取液对D-半乳糖致衰老大鼠空间学习和记忆的干预作用及其机制研究[D]. 陈宁园. 广西医科大学, 2017(08)
• [4]CIRP在牦牛不同组织器官的表达及温和冷应激对细胞CIRP和HSP70表达的影响[D]. 杨琨. 甘肃农业大学, 2015(04)
• [5]GRP75功能及与肿瘤关系的研究进展[J]. 郭纬纬,颜立冲,左汲. 国际遗传学杂志, 2013(05)
• [6]FOXC1抑制乳腺癌体内肺转移及CARM1通过位点特异性甲基化HP1γ抑制肿瘤细胞的衰老和SAHF[D]. 杜娟. 东北师范大学, 2012(08)
• [7]p33ING1b在急性白血病中的表达及意义[D]. 朱亚楠. 郑州大学, 2012(10)
• [8]P16蛋白在人毛乳头细胞中的表达及对其生长特性的影响[D]. 李玉平. 河北医科大学, 2012(11)
• [9]细胞周期检验点蛋白Nbs1的转录调控及功能[D]. 施寒清. 东北师范大学, 2010(10)
• [10]载有hTERT基因逆转录病毒感染日本血吸虫童虫的研究[D]. 杨胜辉. 中南大学, 2010(11)