李俊德[1]（2020）在《Burkholderia xenovorans LB400联苯双加氧酶的人工进化研究》文中进行了进一步梳理多氯联苯（PCBs）作为持久性有机污染物,属于典型的海洋污染物。由于多氯联苯在海岸带大量积累,已对生态系统以及人类健康造成了严重的危害与影响。Burkholderia xenovorans LB400是一株高效的多氯联苯降解菌,同时它的生存环境范围广泛,能够在土壤和海水等环境中生存并修复受多氯联苯污染的土壤和海洋。设计、构建和优化LB400工程菌将成为修复海洋环境中多氯联苯污染的有效方式。细菌的多氯联苯代谢途径与细菌的联苯代谢途径相似,启动降解的联苯双加氧酶（BPDO）的底物范围决定了该途径代谢联苯同类物的范围。BPDO的底物范围和区域专一性主要由位于双加氧酶α亚基C末端的氨基酸残基决定,这些氨基酸所在的区域被指定为区域I、II、III和IV。目前,对于联苯双加氧酶的改造主要集中于III区域和IV区域,但是尚未发现在I区域和II区域突变进化BPDO的报道。因此,本研究选择对海洋和海岸带污染严重的PCBs为底物,以降解效率高,底物谱范围广且能适应海洋环境的多氯联苯降解菌株LB400为亲本构建突变体,获得了突变体S283M,p4-S283M和RR41-S283M。通过比较亲本与突变体对联苯及选定的PCBs的催化性能,模拟突变蛋白结构和分子对接等方法探究位于催化中心II区域的Ser283Met突变对联苯双加氧酶催化性质的影响。主要研究内容和结论如下:一、本研究采用两步位点定向突变的方法,将BphAELB400（野生型）,BphAEp4（突变型）和BphAERR41（突变型）中的283位丝氨酸（Ser）突变为甲硫氨酸（Met）得到三株突变体。成功构建了bph AE基因的表达载体,并转化至Escherichia coli C41（DE3）中,将载有突变基因的Escherichia coli C41（DE3）进行诱导表达,并对其表达产物进行纯化,得到了分子量为51 k Da的Bph A和分子量为22 k Da的Bph E。二、BPDO由三部分组成,测定三组分酶系统的动力学参数是十分困难的。本研究通过检测联苯双加氧酶催化过程中对氧气的消耗,来测定联苯双加氧酶的动力学参数,并建立了氧谱法研究联苯双加氧酶对不同PCBs的特异性。目前已报到的人工改造的BphAEs对联苯的kcat/Km均低于它们的亲本酶。而在本研究中,相比于亲本酶,突变蛋白BphAES283M、BphAEp4-S283M和BphAERR41-S283M对联苯的kcat/Km值显着提升。同时,目前尚未发现对高氯代联苯的稳态动力学研究,本研究报道了BphAEs对高氯代联苯的稳态动力学研究。结果表明,Ser283Met的突变增强了BphAE对2,3’,4,4’-四氯联苯,2,2’,6,6’-四氯联苯和2,3’,4,4’,5-五氯联苯的催化活性。因此,对于与BphAELB400结构特征相似的联苯双加氧酶,将其283位点进行定点突变是进一步增强其对联苯和高氯代联苯催化活性的有效策略。三、BPDO的区域特异性会影响所形成的产物,这些产物会影响该途径的后续酶对底物的催化降解。本研究比较了野生型BphAELB400及其变体对2,2’-二氯联苯,2,5-二氯联苯和2,6-二氯联苯的催化反应,并通过GC-TOF-MS分析鉴定代谢产物。以2,2’-二氯联苯为底物时,在所有的突变蛋白中,与它们的亲本酶相比,2,3-二氢-2,3-二羟基-2’-一氯联苯与3,4-二氢-3,4-二羟基-2,2’-二氯联苯的比率明显升高。这表明联苯双加氧酶对2,2’-二氯苯的区域专一性受到Ser283Met突变的影响。以2,6-二氯联苯为底物时,与BphAEp4和BphAERR41相比,BphAEp4-S283M和BphAERR41-S283M的两种代谢产物比率发生了显着的逆转,它们都产生了更多的3,4-二羟化代谢产物。此外,本研究通过同源建模和分子对接的方法探究酶与底物的结合方式以及催化区域的空间构象,以解释突变酶的新特性。生化数据表明,Ser283Met的突变改变了催化活性空腔内底物的空间构象,从而改变了其羟基化位点。这一点在分子对接实验中得到了证实。四、Bp AELB400及其变体对不同类型多氯联苯的催化代谢能力被评估。研究发现BphAES283M能够高效地转化代谢11种多氯联苯,BphAES283M相较于其他突变蛋白,具有更广阔的代谢范围和更强的催化性能。这表明BphAES283M的Met283对联苯双加氧酶的底物选择性有重要的贡献与影响。值得注意的是,已知的联苯双加氧酶对部分PCBs的氧化能力差,尤其是高氯代多氯联苯,但研究发现BphAES283M和BphAEp4-S283M在催化3-6氯化联苯方面的能力得到了明显的提高。因此,S283M和p4-S283M在修复多氯联苯污染严重的海岸带方面具有潜在的应用价值。综上所述,本研究首次揭示了位于催化中心II区域的突变对联苯双加氧酶催化活性和底物特异性的影响及可能的机制。这对于理解其他Rieske型加氧酶中相应的283位残基功能具有十分重要的意义,同时为如何扩大联苯双加氧酶的底物范围和改变区域特异性的机制研究奠定了一定的理论基础,进而为更有效地修复受PCBs污染严重的海岸带提供了理论依据和技术支持。
孟瑶[2]（2020）在《氯化血红素（Hemin）增强玉米耐镉胁迫的生理生态机制及其大田验证研究》文中进行了进一步梳理重金属镉（Cd）毒害已经成为抑制玉米生长发育最主要的非生物胁迫之一。玉米属C4植物,生长周期短,生物量大,是广泛用于重金属污染研究的重要农作物。利用外源物质提高玉米抗镉胁迫能力是最快捷最有效的方法之一,近几年来越来越多的国内外研究者开始关注氯化血红素（Hemin）在大田作物上的应用,目前通过外源物质提高玉米耐镉胁迫的机制探讨多数试验是在单一条件之下开展,未能很好摸索清楚玉米在镉胁迫下Hemin施用后的种子萌发、叶片生长、根系发育以及大田条件下的生理生态学机制。本研究采用水培、室内分析与大田验证相结合手段,从表型、生理、分子、生态等展开,解析Hemin对玉米在镉胁迫下的响应及缓解机制,并为Hemin应用到大田抗逆生产提供试验依据。主要结论如下:1.Hemin促进了镉胁迫下幼苗干物质积累能力,增强了植株水分利用能力,调控了形态建成镉胁迫下,玉米幼苗生长矮小,生长迟缓,叶色发黄,根系短。镉胁迫下Hemin处理可增加新根发生量,使根系更加粗壮,根毛发生量多而白。Hemin+Cd处理通过增加根体积,扩大根表面积,提高根系活力,改善根系特征参数和根系耐性指数来增强根系对水分和养分的吸收。2.Hemin调控了镉胁迫下幼苗镉含量、分布及其转运,提高了耐镉胁迫能力Hemin+Cd处理后的TF下降,抑制了镉的转运和富集。同时通过NPT和PCs的螯合作用,增强幼苗对Cd的螯合解毒作用。Hemin+Cd处理的根系不同亚细胞中,可溶性组分和细胞壁的镉含量增加,而细胞器的镉含量降低,从而减少Cd从地下部位向地上部位的转运。HMA3基因在叶片和根系中的表达量上升,其中根系HMA3基因量均高于叶片。3.Hemin维持了镉胁迫下叶片细胞超微结构稳定性,改善了光合及叶绿素荧光参数,光合酶活性提高Hemin+Cd处理后的叶片光合速率（Pn）、气孔导度（gs）和蒸腾速率（Tr）等参数值增加,荧光参数的光化学淬灭（q P）数值,光化学量子效率数值（Fv/Fm）、电子传递速率数值（ETR）以及等增加显着,这有利于PSII光合系统的改善。Hemin处理促进镉胁迫下叶片光合色素含量的提升,改善了Chla和Chlb参数比值,叶片光合关键酶活性（RUBPCase和PEPCase）提升,总叶黄素循环库（VAZ）数值提升,叶黄素循环（DEPS）去环氧化作用增强显着,这能有效缓解镉胁迫对叶片光合作用的气孔限制和非气孔限制。4.Hemin介导了镉胁迫下叶片蔗糖代谢关键酶活性的增加Hemin处理可以显着增强镉胁迫下蔗糖磷酸合成酶（SPS）和蔗糖合成酶（SS）的活性,降低了可溶性酸性转化酶（SAInv）和碱性/中性转化酶（A/N-Inv）的活性,表明Hemin在促进蔗糖合成的同时抑制了蔗糖的分解,从而促进了蔗糖在玉米叶片中的积累。5.Hemin提升了镉胁迫下叶片活性氧代谢能力及抗氧化系统的平衡Hemin有效降低了镉胁迫下叶片中膜脂过氧化物（TBARS）含量,同时As A-GSH循环关键酶活性测定表明,Hemin减缓了镉胁迫下叶片中的脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR）活性和单脱氢抗坏血酸还原酶（MDHAR）活性的下降幅度,同时促进了镉胁迫下叶片中谷胱甘肽还原酶（GR）酶活性和抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的增加幅度。As A-GSH循环的物质分析表明,Hemin促进了镉胁迫下还原态抗坏血酸（As A）和还原态谷胱甘肽（GSH）的含量增加,降低了氧化型抗坏血酸（DHA）和还原态谷胱甘肽（GSSG）的含量,As A/DHA和GSH/GSSG比值增加,这有利于维持镉胁迫下细胞膜结构和功能的完整性。6.Hemin促进了镉胁迫下叶片渗透调节物质含量的平衡Hemin有效增加了玉米耐镉胁迫的能力,增加了可溶性糖、可溶性蛋白、游离氨基酸和脯氨酸含量积累,有助于亚细胞结构的稳定,改善细胞水状态,从而缓解镉胁迫对叶片组织的影响,有利于维持光合作用并改善植物生长。7.Hemin介导了镉胁迫下根系伤流及叶片中氮代谢营养元素及关键酶活性的提升镉胁迫下,叶片中NH4+的含量和游离氨基酸均显着增加,而木质部NO3-的含量及氮代谢氨同化酶及转氨酶活性均有所降低。而Hemin处理可以增加镉胁迫下的木质部NO3-转运速率。Hemin可通过降低GS/GOGAT途径的减弱引起谷氨酸含量降低,增强氨同化酶GS/GOGAT和GDH活性以及转氨酶（GOT和GPT）活性,缓解氨毒害作用和氮代谢紊乱。8.Hemin诱导了镉胁迫下叶片和根系内源激素含量变化及其激素比例的适应性平衡Hemin处理能够提高镉胁迫下激素比值（IAA/ABA、ZR/ABA和GA/ABA）的参数数值,并且能够激素水平维持相对平衡。这是由于Hemin能够增加镉胁迫下促进型激素（IAA、ZR和GA）含量,减少抑制型激素ABA含量,有效降低镉胁迫下叶片Me JA和SA含量的因素驱动,这有利于维持叶片衰老和根系功能的正常进行,减轻镉胁迫对玉米生长的不利影响。9.Hemin激发了镉胁迫下叶片和根系次生代谢产物含量的提升以及PAL酶活性增加Hemin处理能够增加镉胁迫下根系的丁布、总酚含量以及苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性,且对地下部的直接诱导作用高于地上部。与CK处理相比,Hemin处理提高了根系和叶片中的丁布、总酚含量以及PAL活性。Hemin处理玉米地下部能直接影响到处理部位（根系）的化学防御反应,这对于玉米镉胁迫抗逆特性具有重要意义。10.Hemin改变了镉胁迫下叶片多胺PAs含量及其酶代谢,增强了玉米耐镉胁迫能力Hemin处理促进镉胁迫下玉米的多胺代谢进程,数据表明Hemin处理促进了结合态PAs和束缚态PAs含量的增加和积累,促进了游离态Put向游离态Spm和Spd的转化积累进程。Hemin处理降低了镉胁迫下叶片中的PAO活性,而DAO、ODC和SAMDC酶活性也随之增加。11.Hemin促进了模拟大田镉胁迫下种子的萌发,为逆境下玉米高产奠定群体基础Hemin+Cd处理后发芽率、发芽势、活力指数和贮藏物质转运率增加,萌发淀粉关键酶（α-淀粉酶和β-淀粉酶）活性增加,这有利于提高萌发种子胚乳淀粉的转化效率。Hemin处理可以显着改善Cd对幼苗胚根、胚芽形态指标的影响,这对胚芽鞘顶土出苗,根系形态建成有利。12.Hemin促进了大田镉胁迫下玉米叶片和根系的生长发育,产量与光热水资源利用效率协同提高,为玉米抗逆生产提供试验依据和技术途径（1）Hemin增强大田镉胁迫下叶片净光合速率及叶绿素含量、叶片衰老延缓,改善了光合产物的积累与分配适宜浓度的Hemin处理能够保证镉胁迫下玉米在花后保持着较高的净光合速率,植株具有较高的叶绿素含量,保持了较大的绿叶面积。叶片衰老特性分析表明,Hemin处理增加了胁迫植株的RGLAm,LAD和tmax值,降低了Vm和Vmax值。外源Hemin喷施处理后的叶片衰老显着延缓,特别表现为光合作用时间的显着增加,这为光合物质积累提供保障。（2）Hemin优化了大田镉胁迫下玉米根系生长特性参数,提升了根系活力和伤流量,优化了根系伤流中矿质元素及氨基酸含量Hemin可通过提高根系活力和根系伤流来改善根系对水分和养分的吸收。Hemin+Cd处理后的根系伤流丝氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和缬氨酸含量增加,促进了玉米根系物质循环的能力和水平。Hemin+Cd处理后有利于提高镉胁迫下根系伤流中的矿质元素含量,在植株营养生长向生殖生长转折变化期的矿质元素流量增加显着,有利于增加镉胁迫下大田后期根系生长的水分和营养吸收能力。（3）Hemin改善了大田镉胁迫下玉米籽粒灌浆淀粉特性、促进了淀粉合成关键酶活性及基因的表达Hemin+Cd处理加速减少了籽粒达到最大灌浆速率时的天数(Tmax),更快的达到最大灌浆速率,并提高了最大灌浆速率(Vmax)和平均灌浆速率（Vm）,而对灌浆活跃期（P）影响不显着。Hemin处理后的籽粒淀粉含量增加,提升镉胁迫下玉米籽粒品质的效应显着,其中直链淀粉的增加幅度较大。籽粒淀粉合成关键酶SBE、GBSS、AGPcase和SSS四种酶的活性均呈现单峰曲线变化,镉胁迫处理抑制了玉米籽粒淀粉合成关键酶活性,而Hemin+Cd处理则增加了玉米籽粒淀粉合成关键酶活性。Hemin处理显着上调了花后30d的籽粒淀粉Zm SH1、Zm SH2、Zm WX1和Zm AE1基因的表达。这说明,镉胁迫下,适宜浓度的Hemin处理对玉米灌浆过程中淀粉合成具有直接调控作用,从而促进了玉米籽粒灌浆和最终粒重增加。（4）Hemin增加了大田镉胁迫下玉米产量,提升了植株对于光热水资源的利用效率,实现镉胁迫下玉米产量与效率的协同提升Hemin+Cd处理后玉米籽粒的穗粒数,千粒重和穗数增加,其中千粒重增加幅度较大,穗长和穗粗增加,秃尖长减少。Hemin+Cd处理显着增加了玉米光能利用效率（RUE）、热量利用效率（HUE）和水分利用效（WUE）,实现镉胁迫下玉米产量与效率的协同提升,研究将为Hemin应用到玉米大田抗逆生产提供实践依据。
周曼[3]（2020）在《新颖木质纤维素降解酶的宏基因组学挖掘及其在纤维二糖酸生产中的作用》文中研究说明利用储量丰富且可再生的食品和农业废弃物生产生物基能源和化学品具有重要的经济、环保价值。现有生产工艺中的主要瓶颈是缺乏高效的木质纤维素降解酶和高效、经济的产品生产工艺。木质纤维素降解酶主要包括纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶和木质素降解酶,其中果胶酶,长期以来被认为是一类不重要的辅酶,被严重低估。此外,纤维二糖酸,是一种高附加值但目前产能较低的有机酸,具有重要经济价值。因此,为了发掘高效、新颖木质纤维素降解酶及降低纤维二糖酸生产工艺成本,本研究主要通过构建具有高效木质纤维素降解能力的堆肥生境并进行宏基因组学分析,挖掘新颖木质纤维素降解酶并研究其在纤维二糖酸生产中的作用,并进一步探索统合生物加工生产纤维二糖酸中预处理工艺。论文的主要研究内容和结果如下:1.高效木质纤维素降解堆肥生境的构建及宏基因组学分析通过定向富集培养技术,构建了具有高效木质纤维素降解能力的堆肥体系（apple pomace-adapted compost microbial community,APACMC）。在富集培养过程中,堆肥体系的最高温度达68℃,呈现出堆肥典型的升温期、高温期、降温期和腐熟期四个阶段;16S r DNA高通量测序发现微生物群落结构发生了剧烈变化,具有木质纤维素降解能力的微生物群落得到了良好的富集。随后借助宏基因组学技术对该微生物群落进行高通量鸟枪测序,获得了272,516条开放阅读框;借助多种生物信息分析软件和数据库进行分类学和功能注释发现,APACMC主要由来自变形菌门、拟杆菌门、放线菌门的微生物组成;最主要的功能类型是氨基酸代谢和碳水化合物代谢。基于CAZy数据库注释发现APACMC中具有很高丰度、多样性且微生物来源广泛的碳水化合物活性酶。2.纤维素酶、半纤维素酶和木质素降解酶的宏基因组学挖掘通过刚果红染色试验和酶活测定发现APACMC具有较高的木质纤维素降解能力。APACMC中木质纤维素降解酶主要来源于变形菌门、放线菌门和拟杆菌门;功能和代谢注释分析揭示了APACMC中蕴含大量的参与碳水化合物代谢和潜在生物能源物质的合成路径。基于碳水化合物活性酶数据库挖掘到3,882条序列编码纤维素酶、半纤维素酶和木质素降解酶的基因序列;另外,基于漆酶和多铜氧化酶数据库发现了额外94条编码漆酶和多糖氧化酶的序列。同时,根据催化结构域分析发现了有大量的细菌来源的多功能酶、嗜热酶和裂解性多糖单加氧酶等具有工业应用潜能的酶。3.宏基因组学挖掘果胶降解微生物、果胶酶及嗜热果胶酶的分离、纯化及表征钌红染色和果胶降解率试验表明APACMC具有较高的果胶降解能力。COG功能注释发现APACMC中参与果胶降解的功能占总碳水化合物降解的25.8%。总计1,756条序列被注释为果胶降解酶,且大部分序列具有较高的新颖性,追溯其系统起源发现,这些序列主要来自APACMC中丰度很高的微生物。此外,从APACMC中分离得到了36株嗜热果胶降解微生物,其中Bacillus subtilis Z10具有最高的果胶酶活性;通过简并引物以及融合引物与巢式聚合酶链式反应扩增获得了一条1,263 bp编码果胶裂解酶的序列;基于生物信息学对该酶的理论等电点和理论分子量的预测,结合色谱纯化获得了果胶裂解酶Bs Pel-Z10;酶学特性表明该酶属于嗜热果胶裂解酶且具有很好的稳定性。4.宏基因组来源的新颖木质纤维素降解酶的异源表达及分析从APACMC宏基因组中筛选具有完整开放阅读框且与数据库中收录蛋白的相似度低于75%的5条来自AA10、CE15、GH43、漆酶和PL11的序列为研究对象,经过去除信号肽等一系列分析及处理后,进行基因合成。随后将编码AA10的序列无缝克隆至p ET-22b（+）表达载体上的pel B序列后;其余序列通过双酶切克隆至p ET-28a（+）载体上。将构建成功的重组质粒转导至E.coli BL 21中,获得重组工程菌,并诱导重组酶的表达。这五个重组酶都成功地实现了表达及纯化,并且都具有相应的酶活。生物信息学分析序列信息、系统发育和结构特性等表明这些酶具有较高的新颖性。5.漆酶、纤维二糖脱氢酶（CDH）和木质素在纤维二糖酸生产中的协同作用研究发现当以Avicel为底物时,添加外源氧化还原介体ABTS是实现纤维二糖酸高产的必要条件,而以小麦秸秆为发酵底物时ABTS无促进作用。向Neurospora crassa HL10发酵体系和CDH-漆酶无细胞体系中添加小麦秸秆来源的天然木质素后,发现木质素在漆酶的帮助下可以促进CDH将纤维二糖转化为纤维二糖酸。在N.crassa HL10发酵体系中添加适量的木质素可以促进纤维二糖酸的生产,而过量的木质素则造成负面作用。此外,木质素不会影响CDH和漆酶酶活。通过电子顺磁共振光谱仪发现漆酶催化木质素产生的自由基可以被CDH氧化纤维二糖产生的还原性CDH消耗,证实了木质素可以作为CDH-漆酶的氧化还原介体促进纤维二糖酸的生产。此外,停流光谱仪表明CDH和漆酶之间存在电子传递。6.工程菌N.crassa HL10直接从预处理小麦秸秆中统合生产纤维二糖酸比较了碱、稀硫酸和湿热这三种预处理的小麦秸秆作为发酵底物被N.crassa HL10统合生物加工生产纤维二糖酸的产量,结果表明碱预处理的小麦秸秆（AP-WS）具有最高的纤维二糖酸产量（45.722 m M）。此外,从这三种预处理样品中提取了残留的木质素,发现从AP-WS中提取的木质素（AP-WS-L）在N.crassa HL10以Avicel为底物的体内发酵体系和CDH-漆酶无细胞体系中都具有最好的氧化还原介导能力。FTIR、XRD和GPC结果表明这三种预处理小麦秸秆及其相应木质素在结构、纤维素结晶度、分子量等方面的差异是造成不同纤维二糖酸产量的深层原因。
李锋[4]（2019）在《白蚁肠道降解木质素细菌资源挖掘及代谢过程与机制研究》文中研究表明化石能源的大量消耗带来严重的环境污染,促使人们开发清洁可再生能源替代化石能源。在众多可再生能源原料中,仅有木质纤维素可以直接转化为液体燃料或高附加值化学品。然而,难降解的木质素阻碍了木质纤维素的高值化利用。木质素是一类由苯丙烷基通过不同类型化学键连接构成的高分子聚合物,其储量仅次于纤维素位于全球生物质总量的第二位。自然界中存在多种生物转化系统可以高效降解木质素,如真菌、细菌和白蚁等。细菌具有丰富的多样性并且生长速度快、环境适应能力强和基因操作简便等特点,在木质素生物降解方面起着重要作用。白蚁肠道共生细菌可以帮助宿主高效降解木质纤维素,已经受到研究者们的广泛关注,但关于肠道共生细菌降解木质素的功能还缺乏系统深入的认识。本文以云南西双版纳采集的海南土白蚁（Odontotermes hainanensis）、土垅大白蚁（Macrotermes annandalei）、黑翅土白蚁（Odontotermes formosanus）和巴基斯坦小白蚁（Microtermes pakistanicus）为研究对象,挖掘白蚁肠道可培养的木质素降解细菌资源,并挑选木质素降解能力突出的细菌,对其进行木质素和木质纤维素降解特性研究,同时结合转录组测序技术研究细菌中木质素降解相关酶基因的功能,揭示其降解木质素的分子机制。主要研究结果如下:（1）以碱木质素为唯一碳源,成功从白蚁肠道筛选分离得到96株菌株,经16S rRNA基因序列鉴定,它们分布于变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌菌门、放线菌门四大门类,在属水平上分布于21个属,种水平上分布于33个种;其中肠杆菌科细菌占绝大多数,首次从白蚁肠道中分离到Kosakonia属和假柠檬酸杆菌属（Pseudocitrobacter）细菌。（2）以P.anthropi MP-4和R.ornithinolytica MP-132为研究对象,考察它们对碱木质素的降解特性。两株细菌在木质素培养基中培养时COD去除率均可达到50%以上,同时,测得P.anthropi MP-4和R.ornithinolytica MP-132分泌漆酶活力分别为37.67 U/L和32 U/L,木质素过氧化物酶活力分别为84.5 U/L和105.6U/L。降解后碱木质素微观形态、红外特征峰及热解特性分析,表明碱木质素化学结构被破坏,如侧链、苯环骨架结构、芳醚键、碳碳键等。（3）系统研究了R.ornithinolytica MP-132降解不同类型木质素的特性。在pH为8时,碱木质素降解率最高达到25.3%。FTIR分析降解前后木质素结构表明细菌破坏了木质素的芳香环结构和使不同类型化学键断裂,如甲基或亚甲基的C–H键、C=O键和紫丁香基/愈创木酚基甲氧基的C–O键等。从木质素热分解特性来分析,降解前后木质素样品的热分解（TG/DTG）曲线存在较大不同,如热分解的起始和终止温度、失重速率和失重峰值点。由此证明降解前后木质素的侧链含量、官能团种类及连接化学键的类型等存在差异。（4）以松木屑为碳源,研究R.ornithinolytica MP-132对松木及其木质素的降解特性。在松木屑降解过程中,R.ornithinolytica MP-132分泌的木质素过氧化物酶、漆酶、纤维素酶和木聚糖酶的活力分别为142.6 U/L、55.97 U/L、2.92 U/mL和2.08 U/mL。同时纤维素、半纤维素和木质素降解率分别可达到28.78%、32.9%和30%。此外,通过XRD和FTIR分析发现处理后的松木结晶度明显降低,以及红外特征峰出现强度降低、位移和消失的现象。SEM对松木微观结构进行观察,发现处理后松木表面变得松散和出现孔洞。热解实验结果证实松木中木质素热裂解特性发生显着变化。（5）为了阐明R.ornithinolytica MP-132降解木质素分子机制,对其进行转录组测序及生物学信息分析。测序结果共得到差异表达基因共2644个,对其进行GO富集分析发现归入到生物过程中有1277个,分子功能的差异基因837个,细胞组分的差异基因277个。经KEGG富集pathways分析,共富集到104条代谢通路,其中大部分与异源物质降解或者代谢有关。转录组测序序列中含有丰富的木质素降解酶基因,如β-酮己二酸代谢途径相关基因、原儿茶酸-3,4-双加氧酶和儿茶酚-1,2-双加氧酶等。综合以上结果,推断R.ornithinolytica MP-132的木质素降解途径:首先,细菌将木质素解聚为各种类型小分子芳香族化合物,这些小分子化合物经经过一系列氧化还原反应后进入到以苯甲酸为中心的代谢途径。苯甲酸类物质转化为原儿茶酸或者儿茶酚后,经原儿茶酸-3,4-双加氧酶或者儿茶酚-1,2-双加氧酶催化苯环开环,然后进入到β-酮己二酸代谢途径,最终通过三羧酸循环完成木质素矿化。
都玉印[5]（2019）在《血红素加氧酶1抑制鸭坦布苏病毒在体外复制作用的研究》文中指出鸭坦布苏病毒病是由鸭坦布苏病毒（Duck Tembusu virus,DTMUV）感染引起鸭的一种以发育缓慢、产蛋量骤降和瘫痪等为特征的传染病。DTMUV是单股正链RNA病毒,属于黄病毒科、黄病毒属、恩塔亚病毒群,它不但可以感染鸭,而且还可以感染鸡、鹅等禽类,对包括人类在内的哺乳动物具有潜在的健康威胁。血红素加氧酶（HO）是细胞的一种催化血红素降解的起始酶和非常重要的限速酶,血红素加氧酶1（HO-1）是HO的一种亚型,它是在机体内正常存在的一种重要的内源性保护蛋白,其活性不仅与机体的抗炎、抗氧化、抗凋亡等功能密切相关,而且在病毒的感染及复制过程中发挥着非常重要的调控作用,但是对不同病毒调控作用不尽相同。DTMUV感染能否影响细胞中HO-1的表达以及HO-1在DTMUV感染细胞的过程中发挥什么作用尚不清楚。因此本研究拟通过试验明确DTMUV感染对宿主细胞HO-1表达的影响及HO-1在DTMUV感染细胞过程中的作用及其作用机制,从而为该病的防治提供理论依据。DTMUV感染对细胞HO-1基因表达的影响。以实验室保存DTMUV毒株接种鸭胚成纤维细胞（DEF细胞）,同时设未接毒对照组,分别收集感染不同时间段的接毒细胞和对照组细胞,提取各组样品的总RNA进行反转录,以荧光定量PCR方法检测细胞HO-1的表达量。试验结果表明,随着DTMUV感染时间的延长,细胞内HO-1的表达量先短暂升高,随后迅速下降到较低水平,表明DTMUV的感染可以抑制细胞内HO-1基因的表达。上调HO-1的表达对DTMUV在DEF细胞上感染的影响。为探索HO-1在DTMUV感染过程中的作用,本试验使用HO-1的特异性诱导剂——钴原卟啉（CoPP）及构建特异性表达质粒诱导细胞HO-1基因的表达,以检测其对DTMUV感染的影响。结果表明,特异性质粒和CoPP均可以显着上调HO-1基因和蛋白的表达水平而不影响细胞的活性,HO-1的基因表达量与特异性质粒转染含量及CoPP浓度均呈正相关,而DTMUV基因表达水平与其呈负相关,转染HO-1过表达质粒后,细胞内病毒的增殖受到了显着抑制。试验中使用最适浓度的特异性质粒及CoPP处理细胞可使细胞中HO-1的表达量显着上调,随着感染时间的延长,细胞中DTMUV的E基因表达量逐渐降低,表明上调HO-1的表达可以有效抑制DTMUV的感染。下调HO-1的表达对DTMUV感染的影响。为明确HO-1的作用我们利用si RNA特异性沉默HO-1基因以降低HO-1的表达量,然后检测HO-1基因沉默后的细胞中E基因的表达情况。结果表明,转染si RNA的细胞HO-1的基因表达量明显降低,而细胞中E基因表达量明显升高,随着si RNA浓度的升高,HO-1蛋白的表达量逐渐减少,细胞中病毒的含量显着增多,从而说明特异性降低HO-1的表达量可以促进DTMUV在细胞上的增殖。HO-1抑制DTMUV感染的作用机制研究。为了弄清HO-1抑制DTMUV感染的机理,我们在DTMUV感染细胞前、后分别用CoPP处理细胞,结果表明,无论感染前还是感染后处理细胞,均能抑制DTMUV的感染,且结果无显着差异。用biliverdin、CORM及Fe Cl3溶液分别模拟HO-1的三种催化产物biliverdin、CO和Fe2+处理细胞发现,只有用Fe Cl3处理的细胞HO-1的m RNA表达水平明显升高且病毒E基因表达量明显降低,从而说明CoPP促进细胞抑制DTMUV感染的作用与病毒感染的时期无关,在此过程中细胞对病毒感染的抑制作用是由HO-1的催化产物Fe2+介导的。
彭琛琛[6]（2019）在《热葡萄糖土杆菌W-2中有机硫脱除关键途径的功能研究》文中研究指明原油中存在各种形式的有机硫化合物,这些有机硫化合物可导致原油乳化、降低油品质量,并在燃烧过程中释放大量二氧化硫。化石燃料中的硫化合物会带来全球性的环境问题,为了减少燃料燃烧对环境的危害并满足日益严格的排放标准,应严格降低燃料中的硫含量。目前,加氢脱硫（Hydrodesulfurization,HDS）广泛用于有机硫脱除。然而,HDS的处理导致产品轻质化,汽油和柴油的粘度降低,因此不适合生产高粘度的重质船舶燃料油。生物脱硫（Biodesulfurization,BDS）是一种有前途的脱除原油中有机硫的方法,并具有独特的优点,如环境友好型的处理方式和适度的反应条件。目前,已报道的生物脱硫菌株不断增加,但大部分属于常温菌,对嗜热菌的研究仍然欠缺。本研究中,热葡萄糖土杆菌W-2（Geobacillus thermoglucosidasius W-2）是一株高效脱除有机硫的细菌,对两种初始总硫含量分别为2.81%（高硫）和0.46%（低硫）重油的脱硫率分别达到约40%和55%。为了从基因水平寻找负责有机硫脱除的关键途径和基因,以原油中常见的模式含硫化合物二苯并噻吩（Dibenzothiophene,DBT）、苯并噻吩（Benzothiophene,BT）为诱导物进行诱导培养。转录组分析表明一些转运蛋白基因和几个关键脱硫基因（SsuD1/SsuE1和SsuD2/SsuE2）响应DBT的诱导,呈现显着性的上调表达。这些脱硫相关基因被认为行使将有机硫转化为无机硫的关键功能。进一步对嗜热烷基磺酸盐单加氧酶系统SsuD1/SsuE1和SsuD2/SsuE2的功能表征显示,SsuD1/SsuE1和SsuD2/SsuE2表现出较好的热稳定性、pH稳定性以及广泛的有机硫底物适用性。两套有机硫生物脱除系统的存在可能赋予菌株W-2更好的生存能力和更高的有机硫脱除能力。综上,本文系统地研究了热葡萄糖土杆菌W-2对重油的有机硫脱除能力,获得两套有机硫生物脱除系统SsuD1/SsuE1和SsuD2/SsuE2,进一步的酶学表征揭示SsuD1/SsuE1和SsuD2/SsuE2具有很好的抗逆性。这种特殊的硫代谢作用不仅为工业应用提供可能,而且增强了人们对微生物在自然界硫循环中所起作用的认知。
曾海春[7]（2019）在《真菌窗烷类杀虫活性倍半萜penifulvin A生物合成的研究》文中研究指明Penifulvin A是由灰黄青霉菌（Penicillium griseofulvum NRRL 35584）产生的具有独特结构的倍半萜类天然产物,其拥有五个立体手性中心,结构中的四个稠环共用中心的季碳原子,形成一个罕见的二氧-[5.5.5.6]-窗烷结构,且其中的两个γ-内酯环和δ-内酯环共享一个手性缩醛中心。生物活性研究显示,penifulvin A具有高效专一的草地贪夜蛾的幼虫（农作物主要害虫之一,尤其是玉米）杀虫活性,被评价为最具开发价值的创新型生物农药之一。鉴于其新颖独特的化学结构以及良好的生物活性,penifulvin A引起了化学家和生物学家广泛关注,目前化学家已借助逆合成分析和间位-光环加成反应实现了penifulvin A的化学全合成,但在立体选择性构建二氧-[5.5.5.6]-窗烷骨架时仍存在一定难度。相对于化学全合成,penifulvin A的生物合成机制却一直未见报道。因此,penifulvin A生物合成途径的研究,有望指导化学仿生合成,同时其特殊的化学结构也必然蕴藏着独特的酶学合成机制。基于此目标,本课题从P.griseofulvum NRRL 35584中鉴定了penifulvin A生物合成基因簇（peni）,通过生物信息学分析、体内基因敲除、化合物喂养、体外生物酶催化以及异源生物合成的方法与手段,系统阐明了penifulvin A的生物合成机制,由此深刻解析了自然界中独特窗烷骨架结构的生物合成过程,为后续通过组合生物合成技术对不同窗烷类型天然产物进行改造,从而获得结构更加新颖、杀虫活性更强的衍生物,奠定了坚实的理论和物质基础。本研究完成工作如下:（1）Penifulvin A的发酵条件及其检测分离方法的确定。外界环境因素是影响微生物代谢谱变化的重要原因,为了确定研究penifulvin A生物合成的物质基础,首先确定了P.griseofulvum NRRL 35584在实验室培养条件下生产penifulvin A的条件。小量发酵实验显示,P.griseofulvum NRRL35584在25℃,大米培养基上发酵七天的条件下,能够稳定生产penifulvin A,并通过后续的分离和结构鉴定进行验证。Penifulvin A生产及其检测分离条件的确定,为后续各突变株培养条件和中间体的检测与分离奠定了良好的工作基础。（2）Penifulvin A生物合成基因簇（peni）的鉴定。通过真菌次级代谢基因簇分析网站（anti-SMASH fungal version）预测发现,P.griseofulvum NRRL 35584的全基因组中含有六个萜类次级代谢产物生物合成相关的基因簇。利用结构导向的萜类环化酶系统进化树分析策略,scaffold 14中的萜类生物合成基因簇（peni）被认为与penifulvin A的产生可能有关。生物信息学分析表明,peni基因簇中共含有六个基因,除了倍半萜环化酶基因（peniA）外,还有细胞色素P450单氧化酶基因（peniB）,核黄素依赖的单氧化酶基因（peniC）,两个双氧化酶基因（peniD和peniF）以及一个未知功能蛋白基因（peniE）。RT-PCR结果显示,peni基因簇的转录与penifulvin A的产生成对应关系。倍半萜环化酶基因（peniA）的进一步敲除结果显示,基因peniA敲除突变株完全丧失了penifulvinA的生产能力,由此清晰地明确了peni基因簇与penifulvinA生产的相关性。peni基因簇的确定,是阐明penifulvin A生物合成机理的重要前提。（3）Penifulvin A生物合成相关基因的确定。peniBpeniF五个基因的逐个敲除以及peniDpeniF三个基因同时敲除的结果显示,peniB或peniC的单基因缺失,P.griseofulvum NRRL 35584均会丧失penifulvin A的生产能力。但是,peniDpeniF三个基因的单独缺失或同时缺失,均不会影响penifulvin A的产生。该结果表明,peni基因簇中仅peniApeniC三个基因可能与penifulvin A的生物合成相关。进一步的研究显示,通过在异源宿主A.nidulans A1145中共表达peniApeniC三个基因,penifulvin A能够高效产生,证明penifulvin A的生物合成确实仅需要peniA、peniB和peniC三个基因参与。通过基因敲除及其异源宿主生产结果揭示了自然界中独特二氧-[5.5.5.6]-窗烷杂环的构建过程仅需三个基因参与。（4）倍半萜环化酶PeniA催化功能的研究。通过大肠杆菌中异源表达peniA基因,获得了可溶性的PeniA重组蛋白。体外酶活实验表明,1)PeniA能够催化法呢基焦磷酸（FPP）环化为化合物209,经GC-MS数据库比对确定,该化合物与角三环倍半萜silphinene的断裂碎片一致;2)PeniA对FPP显示出严格的底物选择性,并不能催化GPP和GGPP生产对应的环化产物。酵母异源表达实验证实,基因peniA的酵母高表达菌株能够高效生产化合物209,进一步的分离与核磁鉴定证实209确实为三环倍半萜silphinene。因此,PeniA为之前并未报道过的silphinene倍半萜环化酶。通过对PeniA体外催化功能的研究以及silphinene结构的确认,我们推导了PeniA催化FPP到silphinene的整个环化机理。化合物209的化学喂养结果表明,其能够恢复ΔpeniA突变株penifulvin A的生产能力,从而证实了silphinene为penifulvin A合成的重要前体,这为后续氧化后修饰酶（PeniB和PeniC）催化功能的研究提供了重要的物质支撑。（5）细胞色素P450氧化酶PeniB催化功能的研究。生物信息学分析显示,PeniB为细胞色素P450单加氧酶。peniA和peniB基因的共表达A.nidulans菌株（AN-peniAB）产生三个产物,分别为silphinene-15-oic acid（203）、γ-lactone-2-hydroxy[5.5.5.5]fenestrane（210）和γ-lactone-2-keto[5.5.5.5]fenestrane（211）,该结果说明,PeniB作为多功能P450氧化酶,其能够连续催化silphinene的多步氧化反应。PeniB微粒体复合物的体外酶活实验结果表明了PeniB的氧化过程,1)催化209中C-15位甲基的三步氧化反应得到羧基产物203;2)PeniB氧化化合物203得到化合物210;3)PeniB继续催化化合物210 C-2羟基的脱氢反应得到211。化合物203/210/211分别化学喂养ΔpeniA突变株均能恢复penifulvin A的产生,由此证明了PeniB对化合物209的三步氧化产物均为penifulvin A生物合成的重要中间体,其中化合物203到化合物210的转化过程,是构建第一个γ-内酯环的关键一步。由此,推导了PeniB可能通过催化化合物203 C-15位的羧基自由基加成C1-C2的双键或者C-15的羧基进攻C1-C2位的环氧两种机理得到210。为了验证PeniB的反应机理,首先通过化学衍生的方法,获得了化合物203的C-15羧基甲酯化产物214。PeniB与化合物214的体外酶活结果显示,PeniB的催化活性被完全抑制,由此说明C-15位羧基自由基的生成对化合物210中γ-内酯环的形成至关重要。（6）Baeyer-Villiger氧化酶PeniC催化功能的研究。从化合物211到最终产物penifulvin A,需要C1-C2位的位置专一选择性的Baeyer-Villiger氧化反应。生物信息学分析表明,PeniC确实为核黄素依赖的Baeyer-Villiger氧化酶,其可能负责了化合物211到penifulvin A的转化。peniA、peniB和peniC三个基因共表达A.nidulans（AN-peniABC）确实能够检测到终产物penifulvin A的产生。我们试图在大肠杆菌中得到可溶性PeniC蛋白去验证其催化化合物211到penifulvin A的转化,但经过多种尝试,PeniC或者其与其它标签的融合蛋白在大肠杆菌中均为不可溶表达。化合物211分别喂养ΔpeniB及ΔpeniC突变株的实验表明,211虽然能够恢复ΔpeniB突变株penifulvin A的产生,但是其并不能恢复ΔpeniC突变株penifulvin A的产生。由此间接证明了PeniC是催化化合物211形成penifulvin A的关键酶,通过催化C1-C2位的Baeyer-Villiger氧化反应形成δ-内酯环。（7）Penifulvin A生物合成途径的推导。通过对peniA、peniB和peniC基因功能及其对应蛋白催化功能的研究,推导了penifulvin A生物合成的可能途径,1)PeniA催化线性FPP前体环化得到角三环骨架倍半萜silphinene（209）;2)PeniB催化209经多步氧化反应得到211,其间完成了γ-内酯环的构建;3)PeniC催化211发生C1-C2位的Baeyer-Villiger氧化反应形成δ-内酯环,从而得到终产物penifulvin A。Penifulvin A生物合成途径的阐明,为自然界中其它窗烷类天然产物生物合成的研究以及penifulvin类衍生物的合成生物学改造奠定了良好的基础。
赵清泉[8]（2019）在《偏肿革裥菌在木质环境下转录组分析与关键基因挖掘》文中研究说明木质素是一种复杂致密、非常稳定的网状结构物质,也是非常难降解的天然芳香族聚合物,是地球上继植物多糖纤维素后第二大丰富的生物可再生资源,木质素的降解不仅关乎到造纸等行业的发展,同时也影响着可再生性能源利用的发展。白腐菌因其特有的细胞外降解酶系,是迄今为止最有效、最主要的木质素降解微生物,可彻底降解木质素成为CO2和水,白腐菌对木质纤维基质的降解在自然界的碳素循环中起着关键作用,可为其他微生物类群提供大量易于吸收的植物多糖类物质,同时白腐菌对木质素的降解也是以绿色、无污染的方式进行。偏肿革裥菌（Lenzitesgibbosa）是我国东北林区常见的一种多孔菌科（Polyporaceae）白腐菌,生长在多种阔叶树的倒木、枯立木或活立木上,引起木材海绵状白色腐朽,也是一种生长速度较快、对木材和木质素分解能力较强的白腐菌,为了在分子层面上深入探索L.gibbosa降解木材和木质素的机理,本文利用HiSeq高通量测序技术对在木质和非木质条件下5个时间点的L.gibosa菌体样本进行了转录组测序,对差异表达的基因进行了功能注释与富集分析,对降解木质素的关键酶基因和关键通路进行了挖掘,并利用荧光定量PCR对重要的关键基因进行了表达量验证,主要研究结果如下:1、对在杨树木屑、水稻稻草、玉米秸秆3种不同木质纤维基质下的L.gibbo木质素降解酶系统进行了酶活检测,结果表明3种不同木质纤维基质均能使L.gibbosa的漆酶（laccase）和锰过氧化物酶（MnP）活性提高,其中木屑对2种酶活的促进作用最为明显,稻草次之、秸秆最差,这与3者成分中木质素含量排序一致（木质素含量杨树木屑最高、水稻稻草次之、秸秆最低）。在30d的检测时间内,木屑组的2种酶活始终保持增长,而秸秆组和稻草组的酶活在试验后期出现波动甚至降低。以上数据揭示了L.gibbosa降解不同类型木质基质时酶的活性变化规律,为后续结合转录组测序数据联合分析找到木质素降解酶关键基因奠定了基础。2、利用HiSeq高通量测序技术,对L.gibbosa在木质和非木质条件处理下的菌丝体进行了转录组测序与分析,从转录水平分析了L.gibbosa对木材与木质素降解的相关生物过程与代谢途径,结果表明 L.gibbosa对木材与木质素的分解代谢与氧化还原反应过程密切相关、与木质素分解等生物过程密切相关,与碳代谢、芳香化合物降解等通路密切相关。本研究得到一条与木质素降解有关的COG分类关键类目Q类（Secondary metabolites biosynthesis,transport and catabolism）,一条木质素降解基因本体（Gene Ontology）关键类目（term）:G00046274（Lignin catabolic process）,一条木质素降解关键通路ko01220（Degradation of aromatic compounds）;通过表达量差异分析、差异表达基因的功能注释与分析,进一步得到一系列与木质素降解有关的关键酶及基因:NAD-P 结合结构域蛋白酶、NADP-dependent alcohol dehydrogenase 6（含 GroES2 域）、CYP450、Alcohol dehydrogenase（含 GroES1 域）、MnP2、MnP3、Versatile peroxidase VPL1（VP,MnP10s）、MrP1、Laccase D、Laccasel、LiP9、LiP2 等,为最终筛选L.gibbosa降解木质素的关键酶基因缩小了范围,为后续开展功能基因研究奠定了基础。3、结合转录组测序与酶活检测数据,进行加权基因共表达网络构建与分析,得到与漆酶和MnP相关的2个基因模块,即turquoise模块和blue模块。利用统计学方法得到 blue模块的82个关键基因（hub gene）,turquoise模块的261个hub genes,在这些hub genes中,利用COG、GO、KEGG注释分析,进一步缩小关键基因范围,结合转录组差异分析,确定了最终的11个关键基因:gene 14284、gene 11466、gene1 1537、gene 3902、gene 5357、gene6568、gene713、gene7760、gene 7855、gene 7857、gene 8611。4、对筛选到的11个L.gibbosa木质素降解关键酶基因进行qPCR检测,选择木屑、稻草、秸秆3种底物处理,结果表明木屑组的基因表达差异最为显着,秸秆与稻草组次之,这些基因在不同类型的纤维基质中都差异表达,表明它们都为L.gibbosa降解木质素的关键基因。5、通过RT-PCR技术克隆了 L gibbosa三条基因即mnpl0s（VP）、laccase D、cyp450,分析得到mnp10s（VP）基因CDS全长1089bp,编码362个氨基酸,含有“ligninase”保守结构域,属于plant peroxidase超家族蛋白;laccase D基因CDS全长1608bp,编码 535 个氨基酸,含有“CouRO 1 Tv-LCC like”和“CouRO 3 Tv-LCC like”两个保守结构域,属于Cupredoxin超家族蛋白;cyp450-up1基因CDS全长2001bp,编码666个氨基酸,属于P450超家族蛋白。以上研究为完整揭示偏肿革裥菌降解木材与木质素的机理奠定了重要的分子基础。
王超[9]（2018）在《纳米筒状血红素酶的仿生构建及其催化氧化性能和应用研究》文中研究说明生物体系中的催化氧化由金属酶催化,在常压、室温和水相的条件下进行,这完全符合绿色化学的理念。自本世纪初以来,许多科学家致力于构建具有催化活性的人工金属酶。而在众多的构建方法中,利用主客体相互作用的方法将客体血红素直接引入到主体蛋白中,是目前最为简单直接的方法之一,利用该方法构建的酶称之为人工血红素酶。但是由于蛋白质结构与性质的差异,以及对客体分子结合力的不同,该方法还存在很多问题,如重组体系结构稳定性及功能性不高,选择特异性不突出,理论研究不彻底等。我们仍需要进行更多的人工酶合成及功能化方面的研究,以得到稳定性更好、功能性更完善、催化活性更高的人工酶,扩展其在生物分析和环境监测等方面的应用。本论文主要对人工血红素酶的合成、性质进行了研究,并对其实际应用价值进行了探索。本研究中选用的主题蛋白是伴侣素Gro EL,它是由两个七元环背对背堆叠形成的直径约为13.7nm,长度约为14.6nm的圆筒状结构十四聚体蛋白质复合物,其功能是辅助错误折叠的蛋白进行正确的折叠。在本研究中,它一方面可以作为结合血红素的载体,另一方面可以作为纳米尺度的反应容器。主要内容概述如下:1)本论文通过表面活性剂透析法,利用GroEL和催化活性中心血红素Hemin,合成了具有类过氧化物酶活性的人工金属酶,并考察了温度、p H值、浓度对酶活的影响,以及人工酶的稳定性。Gro EL有效地分散并固定了Hemin分子,并且Gro EL的分子结构没有明显的改变。构建的Hemin-Gro EL人工酶在适宜条件下具有较高的酶活性,并且在催化实验中,其动力学行为遵循乒乓机制。2)使用3,3’,5,5’-四甲基联苯胺（TMB）和邻苯二胺（OPD）等模型底物,成功建立了基于Hemin-Gro EL人工酶的比色检测方法。通过比色反应的动力学分析,发现Hemin-Gro EL同样具有类过氧化物酶活性,同时遵循典型的米氏动力学和乒乓机制。基于Hemin-Gro EL的比色检测实验可以实现对溶液中H2O2和葡萄糖的检测。此外,该人工酶也可以用于儿茶酚的氧化去除,为临床分析和环境检测等应用提供了重要的参考依据。3)利用荧光底物高香草酸（HVA）成功建立了基于Hemin-Gro EL人工酶的荧光检测方法。经过荧光反应的动力学和底物的竞争性抑制实验分析,表明Hemin-Gro EL人工酶的底物特异性不强,可降低甚至消除其底物抑制作用。Hemin-Gro EL的荧光检测实验,表明该人工酶不仅可以对溶液中H2O2、葡萄糖进行测定,还可用于相关底物酶的检测,如葡萄糖氧化酶,是极具潜力的新型人工酶。
许家明[10]（2018）在《长顺绿壳蛋鸡的选育研究》文中研究说明绿壳蛋属于高档蛋,在我国许多大中城市的发展前景较大。但是,现阶段绿壳蛋鸡品种或配套系数量较少,蛋壳颜色受到多基因的影响,不同蛋色类型的形成机理尚未完全解析。本试验以地方特色品种贵州长顺绿壳蛋鸡为素材,初步调研该品种的外貌特征和生产性能,并在此基础上针对该品种绿壳率和产蛋率较低,蛋色差异较大的问题,重点开展以下科研工作:通过常规选育结合EAV-HP片段分子标记提高长顺绿壳蛋鸡的绿壳率;通过拟合生长和产蛋模型,解析其生长规律和产蛋规律;通过比较不同蛋色类型鸡蛋品质和蛋壳色素的差异,为市场推广提供数据支撑,为探究不同蛋色的形成原因提供参考依据;最后通过RT-PCR技术探讨血红素氧合酶1（HO-1）基因以及胆绿素还原酶A（BLVRA）在蛋壳腺的表达情况,初步解析不同类型绿壳蛋蛋色形成的分子机理。结果如下:1.F0代通过EAV-HP片段分子标记辅助选育绿壳纯合公鸡,结合母鸡表型选育,提高了F1代母鸡绿壳率10.1%和公鸡纯合基因型频率11.22%,加快了育种进展。2.F1代长顺绿壳蛋鸡母鸡最适合的生长模型为Gompertz模型,公鸡为Logistic模型,最适合的产蛋模型为McMillan模型。3.F1代所产鸡蛋中,绿壳组蛋形指数显着大于褐色组（P<0.05）,褐色组蛋黄颜色显着大于酱色组（P<0.05）。酱色组和褐色组的△b值,△E值和原卟啉浓度均极显着高于绿壳组（P<0.01）,△L极显着小于绿壳组（P<0.01）。褐色组△a值>酱色组>绿壳组,三者之间差异均极显着（P<0.01）。绿壳组内比较,深绿组蛋重和蛋壳厚度极显着大于浅绿组（P<0.01）,浅绿组蛋黄颜色极显着大于深绿组（P<0.01）。深绿组除了△L和△a值极显着小于浅绿组外（P<0.01）,△b值,△E值,原卟啉浓度和胆绿素浓度均极显着大于浅绿组（P<0.01）。4.△L值与其它各指标均呈极显着负相关（P<0.01）,△E值和原卟啉与其它各指标均呈极显着正相关（P<0.01）,△a值与胆绿素浓度无显着相关（P>0.05）,与其它各指标均呈极显着正相关（P<0.01）,△b值与胆绿素浓度呈显着正相关（P<0.05）,与其它各指标均呈极显着正相关（P<0.01）。5.酱色组和浅绿组子宫部HO-1基因的相对表达量极显着高于深绿组和褐色组（P<0.01）,浅绿组BLVA基因的相对表达量极显着高于其它三组（P<0.01）。结果表明,利用EAV-HP片段分子标记提高长顺绿壳蛋鸡绿壳率的方案是可行,长顺绿壳蛋鸡在蛋用和肉用方面皆有较大的选育潜力,可通过本品种选育进一步提纯复壮,开发出不同的肉用和蛋用的专门化品系。长顺绿壳鸡蛋符合优质鸡蛋的特点,各蛋色组之间蛋品质差异不大。酱色蛋形成的原因是蛋壳中同时含有高浓度的原卟啉和胆绿素。Lab色度系统的△a值在多类型蛋色的选育中,是较为理想的代替蛋壳原卟啉含量的指标,并非是代替蛋壳胆绿素含量的理想指标。HO-1和BLVRA基因是选淘浅绿蛋和酱色蛋的重要候选基因。
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 引言 |
| 1.1 多氯联苯概述 |
| 1.1.1 多氯联苯的来源 |
| 1.1.2 多氯联苯的理化性质 |
| 1.2 海岸带的多氯联苯污染 |
| 1.2.1 国外海岸带受多氯联苯的污染情况 |
| 1.2.2 国内海岸带受多氯联苯的污染情况 |
| 1.3 多氯联苯的修复方法 |
| 1.3.1 物理修复 |
| 1.3.2 化学修复 |
| 1.3.3 生物修复 |
| 1.4 多氯联苯的微生物降解途径 |
| 1.4.1 厌氧降解途径 |
| 1.4.2 好氧降解途径 |
| 1.4.3 联苯双加氧酶 |
| 1.5 Burkholderia xenovorans LB400 及其BphAE活性催化位点分析 |
| 1.5.1 Burkholderia xenovorans LB400 |
| 1.5.2 BphAE_(LB400)及其突变体分析 |
| 1.6 联苯双加氧酶类型及反应机理 |
| 1.7 突变方法及突变位点的确定 |
| 1.8 总结 |
| 1.9 研究目的和意义 |
| 1.10 研究内容和技术路线 |
| 第2章 联苯双加氧酶突变体的构建与表达 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 菌株、质粒和试剂 |
| 2.2.2 培养基与缓冲液 |
| 2.2.3 主要实验仪器 |
| 2.2.4 数据库及分析软件 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 联苯双加氧酶活性位点氨基酸分析 |
| 2.3.2 BphAE_(LB400)突变体构建 |
| 2.3.3 BphAEs表达 |
| 2.4 实验结果与讨论 |
| 2.4.1 BphAE_(LB400)活性位点氨基酸分析 |
| 2.4.2 BphAE_(LB400)突变基因的扩增 |
| 2.4.3 BphAE_(LB400)与突变蛋白关键位点氨基酸 |
| 2.4.4 BphAE_(LB400)及其突变蛋白的SDS-PAGE分析 |
| 2.5 本章小结 |
| 第3章 BphAEs对于联苯和PCBs的动力学参数测定 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与方法 |
| 3.2.1 菌株、质粒和试剂 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果与讨论 |
| 3.3.1 BphAEs对联苯的动力学参数测定 |
| 3.3.2 BphAEs对低氯代联苯的动力学参数测定 |
| 3.3.3 BphAEs对高氯代联苯的动力学参数测定 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 BphAEs对典型二氯联苯代谢产物的鉴定及区域专一性分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与方法 |
| 4.2.1 菌株、质粒和试剂 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.3 实验结果与讨论 |
| 4.3.1 BphAEs对2,2’-CB的区域专一性分析 |
| 4.3.2 BphAEs对2,5-CB的区域专一性分析 |
| 4.3.3 BphAEs对2,6-CB的区域专一性分析 |
| 4.3.4 代谢产物特性及后续代谢研究 |
| 4.4 本章小结 |
| 第5章 BphAEs对不同类型PCBs的降解 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料与方法 |
| 5.2.1 菌株、质粒和试剂 |
| 5.2.2 实验方法 |
| 5.3 实验结果与讨论 |
| 5.3.1 BphAEs对三氯和四氯联苯的降解 |
| 5.3.2 BphAEs对高氯联苯的降解 |
| 5.4 本章小结 |
| 第6章 BphAEs的结构分析 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 实验材料 |
| 6.2.1 实验模拟及对接所用模板及配体 |
| 6.2.2 数据库及分析软件 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 BphAE_(LB400)突变蛋白的三级结构模拟 |
| 6.3.2 BphAEs的催化活性空腔体积分析 |
| 6.3.3 BphAEs与配体的对接 |
| 6.4 实验结果与讨论 |
| 6.4.1 BphAEs的三级结构模拟 |
| 6.4.2 关键位点氨基酸残基对催化活性空腔的影响 |
| 6.4.3 BphAEs与配体结合方式及空间构象分析 |
| 6.5 本章小结 |
| 第7章 结论与展望 |
| 7.1 总结与讨论 |
| 7.2 创新点 |
| 7.3 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
| 附录 |
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 前言 |
| 1.1 研究目的和意义 |
| 1.2 我国土壤重金属镉污染的来源、现状及土壤环境质量标准 |
| 1.2.1 土壤重金属镉污染的来源 |
| 1.2.2 土壤重金属镉污染的形态和特点 |
| 1.2.3 土壤重金属镉污染事件 |
| 1.2.4 我国土壤环境质量标准的历史演变 |
| 1.3 镉胁迫对植物生长发育及主要代谢过程的影响 |
| 1.3.1 对种子萌发及淀粉酶活性的影响 |
| 1.3.2 对根系及幼苗生长发育的影响 |
| 1.3.3 对光合作用及叶绿素荧光特性的影响 |
| 1.3.4 对活性氧代谢的影响 |
| 1.3.5 对矿质养分代谢的影响 |
| 1.3.6 对根系分泌物的影响 |
| 1.4 玉米对镉的吸收、运输转运及镉在器官的分布规律 |
| 1.4.1 玉米对镉的吸收规律 |
| 1.4.2 玉米对镉的转运规律 |
| 1.4.3 镉在玉米各器官的积累分布规律 |
| 1.5 玉米对镉胁迫的耐受机制 |
| 1.5.1 玉米的避镉机制 |
| 1.5.2 玉米的耐镉机制 |
| 1.6 农田土壤重金属镉污染修复措施 |
| 1.7 氯化血红素(Hemin)的介绍及其生理功能 |
| 1.7.1 氯化血红素(Hemin) |
| 1.7.2 氯化血红素(Hemin)的生理功能 |
| 1.8 氯化血红素(Hemin)缓解植物逆境胁迫的生理生态作用机制 |
| 1.8.1 氯化血红素(Hemin)能够诱导血红素加氧酶(HO)的表达 |
| 1.8.2 氯化血红素(Hemin)能够通过利用一氧化碳(CO)、胆绿素(BV/BR)和亚铁离子(Fe~(2+))代谢产物发挥作用 |
| 1.9 氯化血红素-β-环糊精包合物利用进展 |
| 1.10 研究内容 |
| 1.11 技术路线 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料培养及处理 |
| 2.1.1 室内Hoagland水培幼苗下的镉胁迫及Hemin处理试验 |
| 2.1.2 盆栽模拟大田镉胁迫下的Hemin拌种促发试验 |
| 2.1.3 盆栽模拟大田镉胁迫下的不同浓度Hemin喷施效果试验 |
| 2.2 测定项目与方法 |
| 2.2.1 镉胁迫下玉米生长、水势状态及根系特征参数 |
| 2.2.2 镉含量测定及其分布、镉转运系数及地上部富集系数 |
| 2.2.3 叶片光合参数及关键酶指标 |
| 2.2.4 蔗糖代谢关键酶指标 |
| 2.2.5 活性氧代谢及抗氧化系统相关指标的测定 |
| 2.2.6 渗透调节物质含量的测定 |
| 2.2.7 氮代谢相关指标的测定 |
| 2.2.8 内源植物激素含量及次生代谢产物测定 |
| 2.2.9 多胺代谢相关物质含量及酶的测定 |
| 2.2.10 镉胁迫下Hemin促进种子萌发试验测定参数 |
| 2.2.11 盆栽模拟大田镉胁迫下的Hemin喷施效果试验测定参数 |
| 2.3 数据分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 外源Hemin对镉胁迫下玉米幼苗生长表型及根系参数的影响 |
| 3.1.1 Hemin对镉胁迫下幼苗干重、根冠比和叶面积的影响 |
| 3.1.2 Hemin对镉胁迫下叶片相对含水量(RWC)、水势(Ψw)和根系水力导度(Lp)的影响 |
| 3.1.3 Hemin对镉胁迫下根系参数,根系活力和根系耐性指数的影响 |
| 3.2 外源Hemin对镉胁迫下玉米幼苗镉含量、分布及其转运影响 |
| 3.2.1 Hemin对镉胁迫下玉米根系和地上部的镉含量、镉转运系数以及地上部富集系数的影响 |
| 3.2.2 Hemin对镉胁迫下玉米幼苗非蛋白硫醇含量(NPT)和植物螯合素含量(PCs)的影响 |
| 3.2.3 Hemin对镉胁迫下玉米叶片和根部亚细胞组分中镉分布的影响 |
| 3.2.4 Hemin对镉胁迫下玉米叶片和根系HMA3基因表达水平的影响 |
| 3.3 外源Hemin对镉胁迫下叶片光合参数、叶片超微结构及关键酶指标的影响 |
| 3.3.1 Hemin对镉胁迫下叶片光合色素含量及其比值的影响 |
| 3.3.2 Hemin对镉胁迫下叶片超微结构叶肉细胞、叶绿体和颗粒类囊体的影响 |
| 3.3.3 Hemin对镉胁迫下叶黄素循环组分(A,V,Z)分析的影响 |
| 3.3.4 Hemin对镉胁迫下叶片气体交换(P_n,g_s,T_r,WUE,L_s,C_i)参数的影响 |
| 3.3.5 Hemin对镉胁迫下叶绿素荧光(F_m,F_v/F_m,ΦPSII,ETR,qP,NPQ)参数的影响 |
| 3.3.6 Hemin对镉胁迫下叶片光合作用关键酶(RUBPCase,PEPCase)活性的影响 |
| 3.4 外源Hemin对镉胁迫下叶片蔗糖代谢关键酶指标的影响 |
| 3.4.1 Hemin对镉胁迫下叶片蔗糖合成酶(SS)及蔗糖磷酸合成酶(SPS)的影响 |
| 3.4.2 Hemin对镉胁迫下叶片可溶性酸性转化酶(SAInv)和碱性/中性转化酶(A/N-Inv)的影响 |
| 3.5 外源Hemin对镉胁迫下活性氧代谢及抗氧化系统的影响 |
| 3.5.1 Hemin对镉胁迫下玉米幼苗叶片组织中膜脂过氧化物TBARS含量的影响 |
| 3.5.2 Hemin对镉胁迫下玉米幼苗叶片活性氧代谢(O_2·~-生成速率和H_2O_2含量)的影响 |
| 3.5.3 Hemin对镉胁迫下玉米幼苗叶片膜脂过氧化产物丙二醛(MDA)和电解质泄漏率(EL)的影响 |
| 3.5.4 镉胁迫下Hemin处理后MDA含量与干物质积累及镉含量的相关分析 |
| 3.5.5 Hemin对镉胁迫下玉米幼苗叶片抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性的影响 |
| 3.5.6 Hemin对镉胁迫下AsA-GSH循环酶活性及非酶抗氧化剂的影响 |
| 3.6 外源Hemin对镉胁迫下渗透调节物质含量的影响 |
| 3.7 外源Hemin对镉胁迫下氮代谢相关指标的影响 |
| 3.7.1 Hemin对镉胁迫下玉米幼苗伤流液中NO_3~-含量的影响 |
| 3.7.2 Hemin对镉胁迫下玉米幼苗叶片NO_3~-和NH_4~+含量的影响 |
| 3.7.3 Hemin对镉胁迫下氮代谢相关酶(NR,GS,GOGAT,GDH)活性的影响 |
| 3.7.4 Hemin对镉胁迫下谷氨酸-草酰乙酸转氨酶(GOT)和谷氨酸-丙酮酸转氨酶(GPT)活性的影响 |
| 3.8 外源Hemin对镉胁迫下幼苗内源激素含量及其平衡的影响 |
| 3.8.1 Hemin对镉胁迫下叶片内源激素含量及其平衡的影响 |
| 3.8.2 Hemin对镉胁迫下根系内源激素含量及其平衡的影响 |
| 3.8.3 Hemin对镉胁迫下叶片SA和MeJA含量的影响 |
| 3.9 外源Hemin对镉胁迫下叶片和根系次生代谢产物(丁布和总酚)含量及苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的影响 |
| 3.10 外源Hemin对镉胁迫下叶片多胺代谢生理的影响 |
| 3.10.1 Hemin对镉胁迫下玉米幼苗叶片内源多胺含量的影响 |
| 3.10.2 Hemin对镉胁迫下玉米幼苗多胺合成酶(ADC、ODC、SAMDC)和多胺氧化酶(DAO、PAO)活性的影响 |
| 3.11 外源Hemin对模拟大田镉胁迫下种子萌发影响 |
| 3.11.1 Hemin对模拟大田镉胁迫下种子发芽率、发芽势、活力指数、贮藏物质转运率、胚芽鞘及胚根长的影响 |
| 3.11.2 Hemin对模拟大田镉胁迫下种子萌发期间α-淀粉酶和β-淀粉酶活性的影响 |
| 3.12 外源Hemin对模拟大田镉胁迫下玉米生长发育及产量的影响 |
| 3.12.1 不同浓度Hemin对模拟大田镉胁迫下玉米干物质积累分配特性的影响 |
| 3.12.2 不同浓度Hemin对模拟大田镉胁迫下玉米根系特征参数、根系活力和伤流量的影响 |
| 3.12.3 Hemin对模拟大田镉胁迫下玉米根系伤流中矿质元素及氨基酸含量的影响 |
| 3.12.4 不同浓度Hemin对模拟大田镉胁迫下玉米SPAD值、叶片净光合速率和叶面积的影响 |
| 3.12.5 不同浓度Hemin对模拟大田镉胁迫下玉米叶片衰老特性的影响 |
| 3.12.6 不同浓度Hemin对模拟大田镉胁迫下玉米籽粒灌浆特性的影响 |
| 3.12.7 不同浓度Hemin对模拟大田镉胁迫下玉米籽粒淀粉含量的影响 |
| 3.12.8 不同浓度Hemin对模拟大田镉胁迫下玉米籽粒淀粉合成关键酶(AGPcase,SSS,GBSS,SBE)活性的影响 |
| 3.12.9 不同浓度Hemin对模拟大田镉胁迫下玉米籽粒淀粉合成关键酶基因表达的影响 |
| 3.12.10 不同浓度Hemin对模拟大田镉胁迫下玉米产量及资源利用效率的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 外源Hemin促进了镉胁迫下玉米幼苗干物质积累能力,增强了植株水分利用能力,调控了形态建成 |
| 4.2 外源Hemin调控了镉胁迫下玉米幼苗镉含量、分布及其转运,提高了幼苗耐镉胁迫能力 |
| 4.3 外源Hemin维持了镉胁迫下玉米叶片细胞超微结构稳定性,改善了光合及叶绿素荧光参数,并且光合酶活性得到显着提高 |
| 4.4 外源Hemin介导了镉胁迫下玉米叶片蔗糖代谢酶活性增加 |
| 4.5 外源Hemin提升了镉胁迫下玉米叶片活性氧代谢能力及抗氧化系统的平衡 |
| 4.6 外源Hemin促进了镉胁迫下玉米叶片渗透调节物质的平衡 |
| 4.7 外源Hemin介导了镉胁迫下根系伤流及叶片中氮代谢营养元素及关键酶活性的提升 |
| 4.8 外源Hemin诱导了镉胁迫下内源激素含量变化及其比例的平衡 |
| 4.9 外源Hemin激发了镉胁迫下叶片和根系次生代谢产物含量的提升,以及苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的增加 |
| 4.10 外源Hemin改变了镉胁迫下叶片多胺PA含量及其酶代谢生理,增强了玉米耐镉胁迫能力 |
| 4.11 外源Hemin促进了模拟大田镉胁迫下种子萌发,为逆境下玉米高产奠定群体基础 |
| 4.12 外源Hemin促进了模拟大田镉胁迫下玉米叶片和根系的生长发育,产量与光热水资源利用效率协同提高,为玉米抗逆生产提供试验依据和技术途径 |
| 4.12.1 外源Hemin增强模拟大田镉胁迫下玉米叶片光合作用、延缓了叶片衰老,改善了干物质积累与分配 |
| 4.12.2 外源Hemin优化了模拟大田镉胁迫下玉米根系生长特性,提升根系活力和伤流量,优化了根系伤流中矿质元素及氨基酸含量 |
| 4.12.3 外源Hemin改善了模拟大田镉胁迫下玉米籽粒灌浆淀粉特性、促进了淀粉合成关键酶活性及基因的表达 |
| 4.12.4 外源Hemin增加了模拟大田镉胁迫下玉米产量,提升了植株对于光热水资源利用效率,实现镉胁迫下产量与效率的协同提升 |
| 5 结论 |
| 6 主要创新点 |
| 7 下一步研究方向 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
| 中英文缩写对照表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 木质纤维素生物质 |
| 1.1.1 木质纤维素生物质的基本结构 |
| 1.1.2 果胶在木质纤维素中的作用 |
| 1.1.3 木质纤维素生物质能源生产的瓶颈 |
| 1.2 木质纤维素降解酶 |
| 1.2.1 纤维素水解酶 |
| 1.2.2 裂解性多糖单加氧酶 |
| 1.2.3 纤维二糖脱氢酶 |
| 1.2.4 半纤维素酶 |
| 1.2.5 果胶酶 |
| 1.2.6 木质素降解酶——漆酶 |
| 1.3 宏基因组学技术在挖掘木质纤维素降解酶中的应用 |
| 1.3.1 宏基因组学 |
| 1.3.2 木质纤维素降解酶的宏基因组挖掘 |
| 1.4 统合生物加工生产纤维二糖酸 |
| 1.4.1 纤维二糖酸 |
| 1.4.2 Neurospora crassa工程菌 |
| 1.4.3 LPMO、CDH、漆酶、GMC氧化还原酶、木质素与纤维素之间的关系 |
| 1.5 本文研究意义及主要研究内容 |
| 1.5.1 研究意义 |
| 1.5.2 研究内容及技术路线图 |
| 第二章 木质纤维素降解堆肥生境的构建及宏基因组学分析 |
| 2.1 试验材料与设备 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 主要试剂及耗材 |
| 2.1.3 主要仪器与设备 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 苹果渣生物质降解微生物在堆肥环境中的富集 |
| 2.2.2 堆肥的物理化学性质分析 |
| 2.2.3 16S rDNA基因高通量测序和物种系统分类 |
| 2.2.4 宏基因组测序,de novo序列组装和开放阅读框预测 |
| 2.2.5 序列提交 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 堆肥进程中理化性质的变化 |
| 2.3.2 堆肥进程中微生物群落结构的变化 |
| 2.3.3 APACMC宏基因组中的微生物多样性分析 |
| 2.3.4 APACMC宏基因组中预测基因的功能基因分类 |
| 2.3.5 APACMC宏基因组中碳水化合物活性酶的多样性、丰度和微生物来源 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 纤维素降解酶、半纤维素降解酶和木质素降解酶的宏基因组学挖掘 |
| 3.1 试验材料与设备 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 主要试剂及耗材 |
| 3.1.3 主要仪器与设备 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 木质纤维素生物质降解微生物在堆肥生境中的富集效果的评判 |
| 3.2.2 纤维素酶活和半纤维素酶活的测定 |
| 3.2.3 木质纤维素降解酶基因的注释 |
| 3.2.4 木质素降解基因的准确注释 |
| 3.2.5 特定的纤维素、半纤维素和木质素降解基因:注释及系统发育树分析 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 富集的微生物纤维素降解能力的初级评判 |
| 3.3.2 纤维素酶活和半纤维素酶活的测定 |
| 3.3.3 APACMC宏基因组中木质纤维素降解微生物组成分析 |
| 3.3.4 APACMC宏基因组中木质纤维素降解代谢潜能分析 |
| 3.3.5 木质纤维素降解酶的挖掘 |
| 3.3.6 木质纤维素降解微生物的挖掘 |
| 3.3.7 需重点关注的木质纤维素降解酶及微生物 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 宏基因组学挖掘果胶降解菌、果胶酶及嗜热果胶酶的分离、纯化和表征 |
| 4.1 试验材料与设备 |
| 4.1.1 试验材料 |
| 4.1.2 主要试剂及耗材 |
| 4.1.3 主要仪器设备 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 果胶降解微生物在堆肥生境中的富集效果的评判 |
| 4.2.2 特定果胶酶降解基因:基因注释和系统发育分析 |
| 4.2.3 果胶酶活的测定 |
| 4.2.4 嗜热果胶降解微生物的筛选分离 |
| 4.2.5 嗜热果胶降解微生物的鉴定 |
| 4.2.6 编码果胶酶基因序列的克隆、验证及测序 |
| 4.2.7 编码果胶酶的氨基酸序列比对、生物信息学分析及其三维结构模拟 |
| 4.2.8 果胶酶的分离纯化 |
| 4.2.9 温度、pH、金属离子和化学试剂对酶的影响 |
| 4.2.10 底物特异性和酶促动力学参数的测定 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 富集微生物的果胶降解能力的初级评判 |
| 4.3.2 参与果胶降解的特定COG功能分类分析 |
| 4.3.3 果胶降解酶的挖掘 |
| 4.3.4 果胶降解微生物的挖掘 |
| 4.3.5 嗜热果胶降解微生物的分离 |
| 4.3.6 嗜热细菌来源的果胶降解酶的基因克隆与测序 |
| 4.3.7 果胶酸裂解酶的纯化及分子量的确定 |
| 4.3.8 果胶酸裂解酶BsPel-Z10 的酶学特性 |
| 4.3.9 金属离子和化学试剂对BsPel-Z10 酶活的影响 |
| 4.3.10 BsPel-Z10 的底物特异性和酶动力学参数测定 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 五个宏基因组来源的新颖木质纤维素降解酶的异源表达及分析 |
| 5.1 试验材料与设备 |
| 5.1.1 试验载体与菌株 |
| 5.1.2 工具酶和试剂盒 |
| 5.1.3 主要试剂及培养基 |
| 5.1.4 主要仪器及设备 |
| 5.2 试验方法 |
| 5.2.1 新颖木质纤维素降解酶基因的验证及筛选 |
| 5.2.2 新颖木质纤维素降解酶基因的分析及合成 |
| 5.2.3 重组质粒的构建及验证 |
| 5.2.4 基因工程菌E.coli BL21 的构建及鉴定 |
| 5.2.5 重组工程菌诱导表达获得重组酶 |
| 5.2.6 重组酶的分离纯化 |
| 5.2.7 重组酶的蛋白电泳SDS-PAGE检测 |
| 5.2.8 LPMO与铜离子的结合 |
| 5.2.9 重组酶的酶活测定 |
| 5.2.10 重组酶蛋白含量测定 |
| 5.2.11 重组酶系统发育分析、蛋白结构的同源建模与分析 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 LPMO10-297291的序列分析 |
| 5.3.2 CE15-3258的序列分析 |
| 5.3.3 Lac-4805的序列分析 |
| 5.3.4 GH43-5749的序列分析 |
| 5.3.5 PL11-18811的序列分析 |
| 5.3.6 重组质粒、基因工程菌的构建及验证 |
| 5.3.7 重组酶的诱导表达、纯化及酶活测定 |
| 5.3.8 重组酶的同源建模及结构和催化活性位点分析 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 漆酶、纤维二糖脱氢酶和木质素在纤维二糖酸生产中的协同作用 |
| 6.1 试验材料与设备 |
| 6.1.1 试验菌株 |
| 6.1.2 主要试剂、耗材及培养基 |
| 6.1.3 主要仪器及设备 |
| 6.2 试验材料及方法 |
| 6.2.1 N.crassa F5ΔΔΔ和 HL10 种子的制备 |
| 6.2.2 N.crassa F5ΔΔΔ和 HL10 体内发酵试验 |
| 6.2.3 纤维二糖脱氢酶的制备及纯化 |
| 6.2.4 漆酶的制备及纯化 |
| 6.2.5 纤维二糖脱氢酶和漆酶酶活及浓度的测定 |
| 6.2.6 小麦秸秆原料的制备 |
| 6.2.7 酶解木质素的制备 |
| 6.2.8 CDH-漆酶无细胞体系将纤维二糖转化为纤维二糖酸的体外试验 |
| 6.2.9 纤维二糖酸标品的制备及标定 |
| 6.2.10 纤维二糖、纤维二糖酸、葡萄糖和葡萄糖酸浓度的测定 |
| 6.2.11 木质素对CDH和漆酶酶活的影响 |
| 6.2.12 木质纤维素组分测定 |
| 6.2.13 停流光谱仪监测CDH与漆酶之间的电子传递 |
| 6.2.14 电子顺磁共振光谱技术测定木质素自由基的形成及消耗 |
| 6.2.15 数据处理 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 CDH、漆酶酶活及纤维二糖酸标品浓度 |
| 6.3.2 外源添加氧化还原介体对N.crassa HL10 高产纤维二糖酸的必要性 |
| 6.3.3 N.crassa HL10 直接从Avicel和小麦秸秆中生产纤维二糖酸的比较 |
| 6.3.4 木质素对N.crassa HL10将Avicel转化为纤维二糖酸的影响 |
| 6.3.5 木质素对CDH-漆酶无细胞体系将纤维二糖转化为纤维二糖酸的影响 |
| 6.3.6 木质素对CDH和漆酶酶活的影响 |
| 6.3.7 CDH-木质素-漆酶体系的潜在机制 |
| 6.3.8 EPR监测木质素自由基产生及消耗 |
| 6.3.9 停流光谱仪监测CDH与漆酶之间的电子传递 |
| 6.4 小结 |
| 第七章 工程菌N.crassa直接从小麦秸秆中统合生产纤维二糖酸 |
| 7.1 试验材料与设备 |
| 7.1.1 试验菌株 |
| 7.1.2 主要试剂、耗材及培养基 |
| 7.1.3 主要仪器设备 |
| 7.2 试验方法 |
| 7.2.1 小麦秸秆的三种预处理 |
| 7.2.2 三种从预处理小麦秸秆木质素的制备 |
| 7.2.3 木质纤维素组分测定及木质素的测定 |
| 7.2.4 CDH和漆酶的制备、纯化及酶活测定 |
| 7.2.5 N.crassa HL10 种子的制备 |
| 7.2.6 不同预处理小麦秸秆的N.crassa HL10 发酵 |
| 7.2.7 三种木质素对N.crassa HL10 生产纤维二糖酸的影响 |
| 7.2.8 三种木质素对CDH-漆酶无细胞体系生产纤维二糖酸的影响 |
| 7.2.9 纤维二糖和纤维二糖酸的检测 |
| 7.2.10 木质素和酚类物质含量测定 |
| 7.2.11 三种预处理小麦秸秆及其相应木质素的傅里叶红外光谱 |
| 7.2.12 三种预处理小麦秸秆的X射线衍射分析 |
| 7.2.13 凝胶渗透色谱对三种木质素分子量的测定 |
| 7.2.14 香草醛、丁香醛和阿魏酸对CDH-漆酶无细胞体系产纤维二糖酸的影响 |
| 7.2.15 数据处理 |
| 7.3 结果与讨论 |
| 7.3.1 不同预处理对小麦秸秆中各组分的影响 |
| 7.3.2 三种预处理小麦秸秆统合生物加工生产纤维二糖酸能力比较 |
| 7.3.3 三种木质素对N.crassa HL10以Avicel为底物生产纤维二糖酸的影响 |
| 7.3.4 三种木质素对CDH-漆酶无细胞体系生产纤维二糖酸的影响 |
| 7.3.5 三种预处理小麦秸秆及其制备的相应木质素的FTIR分析 |
| 7.3.6 三种预处理小麦秸秆的XRD特性 |
| 7.3.7 三种木质素的分子大小及分布比较 |
| 7.3.8 香草醛、丁香醛和阿魏酸在CDH-漆酶无细胞体系生产中纤维二糖酸的作用 |
| 7.3.9 N.crassa HL10 从碱预处理小麦秸秆中统合生产纤维二糖酸工艺的初步构建 |
| 7.4 小结 |
| 第八章 结论、创新点与展望 |
| 8.1 结论 |
| 8.2 创新点 |
| 8.3 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 木质素来源及结构 |
| 1.2 木质素的应用前景 |
| 1.3 木质素的微生物降解 |
| 1.3.1 木质素降解微生物种类 |
| 1.3.2 木质素降解酶系 |
| 1.4 白蚁及其肠道共生菌降解木质纤维素 |
| 1.4.1 白蚁解聚木质素机制研究进展 |
| 1.4.2 白蚁肠道共生细菌降解木质素研究进展 |
| 1.5 细菌降解木质素及模型化合物代谢途径研究 |
| 1.6 本课题研究意义、内容及技术路线 |
| 1.6.1 研究内容 |
| 1.6.2 技术路线 |
| 第二章 高等白蚁肠道可培养木质素降解细菌多样性研究 |
| 2.1 实验材料与仪器 |
| 2.1.1 白蚁来源 |
| 2.1.2 培养基与试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 木质素降解菌筛选 |
| 2.2.2 细菌的16S rRNA基因序列及系统进化树分析 |
| 2.2.3 木质素模型化合物降解菌复筛 |
| 2.2.4 染料脱色检测细菌胞外分泌酶 |
| 2.2.5 细菌生长pH范围测定 |
| 2.3 实验结果与讨论 |
| 2.3.1 白蚁肠道木质素降解细菌分离纯化 |
| 2.3.2 木质素降解菌16S rRNA基因的分子鉴定 |
| 2.3.3 木质素降解细菌复筛 |
| 2.3.4 细菌对不同种类染料脱色能力评价 |
| 2.3.5 木质素降解菌序列比对与系统发育树 |
| 2.3.6 菌株MP-4和MP-132 生长pH范围 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 R.ornithinolytica MP-132和P.anthropi MP-4 降解碱木质素过程特征研究 |
| 3.1 实验材料与仪器 |
| 3.1.1 材料与试剂 |
| 3.1.2 实验仪器及设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 细菌培养条件 |
| 3.2.2 细菌生长及木质素降解率测定 |
| 3.2.3 木质素降解相关酶活力测定 |
| 3.2.4 场发射扫描电子显微镜分析(FE-SEM) |
| 3.2.5 傅里叶变换红外色谱分析(FTIR) |
| 3.2.6 热重分析(TGA) |
| 3.2.7 热裂解-气相色谱质谱联用分析(Py-GC/MS) |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 细菌生长与碱木质素降解 |
| 3.3.2 碱木质降解相关酶活力 |
| 3.3.3 细菌降解碱木质素后微观结构分析 |
| 3.3.4 傅里叶红外光谱(FTIR)分析 |
| 3.3.5 热重分析(TGA) |
| 3.3.6 Py-GC/MS检测木质素热裂解产物 |
| 3.3.7 初步推断细菌降解碱木质素的机制 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 R.ornithinolytica MP-132降解不同类型木质素特性分析 |
| 4.1 实验材料与仪器 |
| 4.1.1 材料与试剂 |
| 4.1.2 实验仪器及设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 玉米秸秆中磨木木质素提取 |
| 4.2.2 普鲁士法测定木质素浓度 |
| 4.2.3 细菌培养条件 |
| 4.2.4 细菌不同培养条件对碱木质素降解率的影响 |
| 4.2.5 场发射扫描电子显微镜分析(FE-SEM) |
| 4.2.6 傅里叶变换红外色谱分析(FTIR) |
| 4.2.7 热重分析(TGA) |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 细菌降解木质素的培养条件 |
| 4.3.2 SEM分析木质素微观结构 |
| 4.3.3 木质素的FTIR分析 |
| 4.3.4 TGA分析木质素热稳定性 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 解析R.ornithinolytica MP-132 降解松木过程中木质素化学结构变化 |
| 5.1 实验材料与仪器 |
| 5.1.1 材料与试剂 |
| 5.1.2 实验仪器及设备 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 细菌培养条件 |
| 5.2.2 松木中磨木木质素的提取 |
| 5.2.3 还原糖浓度测定 |
| 5.2.4 木质纤维素相关酶活力测定 |
| 5.2.5 松木的纤维素、半纤维素和木质素测定 |
| 5.2.6 X-射线衍射(XRD)分析 |
| 5.2.7 场发射扫描电子显微镜分析(FE-SEM) |
| 5.2.8 傅里叶变换红外色谱分析(FTIR) |
| 5.2.9 热重分析(TGA) |
| 5.2.10 热裂解-气相色谱质谱联用分析(Py-GC/MS) |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 R.ornithinolyticaMP-132 降解松木屑过程中还原糖浓度及组分含量变化分析 |
| 5.3.2 R.ornithinolytica MP-132 降解松木过程中相关酶活力分析 |
| 5.3.3 扫描电子显微镜(SEM)分析松木微观结构 |
| 5.3.4 X-射线衍射(XRD)分析松木结晶度 |
| 5.3.5 松木及其磨木木质素红外光谱(FTIR)分析 |
| 5.3.6 TGA分析磨木木质素热稳定性 |
| 5.3.7 Py-GC/MS分析磨木木质素热解产物 |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 基于转录组解析R.ornithinolytica MP-132 降解木质素分子机制 |
| 6.1 实验材料与仪器 |
| 6.1.1 材料与试剂 |
| 6.1.2 实验仪器及设备 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 细菌培养条件 |
| 6.2.3 细菌总RNA提取及质量检测 |
| 6.2.4 构建文库及上机测序 |
| 6.2.5 生物信息学分析 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 细菌总RNA质量检测结果 |
| 6.3.2 样品测序数据统计及参考基因比对分析 |
| 6.3.3 差异表达基因分析 |
| 6.3.4 差异表达基因的GO分析 |
| 6.3.5 差异表达基因的KEGG代谢通路分析 |
| 6.3.6 R.ornithinolytica MP-132 降解木质素相关基因分析 |
| 6.3.7 R.ornithinolytica MP-132 降解木质素相关代谢途径分析 |
| 6.4 本章小结 |
| 第七章 结论与展望 |
| 7.1 结论 |
| 7.2 本研究的创新点 |
| 7.3 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 博士期间发表论文及其他科研成果 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 鸭坦布苏病毒病概述 |
| 1.1.1 鸭坦布苏病毒概述 |
| 1.1.2 鸭坦布苏病毒在细胞内的复制 |
| 1.1.3 鸭坦布苏病毒病的流行病学 |
| 1.1.4 鸭坦布苏病毒潜在的公共卫生威胁 |
| 1.1.5 防治措施 |
| 1.2 血红素加氧酶-1(HO-1)与病原感染的相互作用 |
| 1.2.1 HO-1 生物学特性 |
| 1.2.2 病原感染对HO-1 表达的影响 |
| 1.2.3 HO-1 抗病毒感染的研究 |
| 1.3 本研究的目的和意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 毒株来源 |
| 2.1.2 主要仪器和试剂 |
| 2.1.2.1 主要仪器 |
| 2.1.2.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要试剂的配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 DTMUV感染DEF细胞后HO-1 表达的测定 |
| 2.2.1.1 DEF细胞的制备及传代培养 |
| 2.2.1.2 DTMUV的增殖与保存 |
| 2.2.1.3 DEF细胞接毒、样品采集 |
| 2.2.1.4 DEF细胞中HO-1及DTMUV mRNA表达情况的检测 |
| 2.2.2 诱导HO-1 的表达对DTMUV复制水平影响的测定 |
| 2.2.2.1 HO-1 过表达载体的构建 |
| 2.2.2.2 过表达质粒过表达效果的验证 |
| 2.2.2.3 诱导HO-1 过表达对DTMUV复制水平的测定 |
| 2.2.2.4 不同浓度的CoPP对细胞活性影响的测定 |
| 2.2.2.5 不同浓度CoPP对细胞HO-1及DTMUV基因表达水平的测定 |
| 2.2.2.6 HO-1 过表达对DTMUV复制水平影响的测定 |
| 2.2.3 siRNA抑制细胞HO-1 的表达后病毒复制水平的测定 |
| 2.2.4 HO-1 作用机制的研究 |
| 2.2.4.1 HO-1 过表达在DTMUV感染不同阶段影响的测定 |
| 2.2.4.2 HO-1 催化产物对DTMUV感染影响的测定 |
| 2.3 统计分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 原代DEF细胞的制备与病毒的感染 |
| 3.2 DTMUV感染DEF细胞不同时间点HO-1 基因表达量变化 |
| 3.3 上调HO-1 表达对DTMUV复制的影响 |
| 3.3.1 HO-1 过表达对DTMUV复制的影响 |
| 3.3.1.1 HO-1 过表达载体的构建 |
| 3.3.1.2 HO-1 过表达对DTMUV复制的影响 |
| 3.3.2 CoPP处理诱导HO-1 上调对DTMUV复制的影响 |
| 3.3.2.1 不同浓度CoPP对 DEF细胞活性的影响 |
| 3.3.2.2 不同浓度CoPP对 DTMUV复制的影响 |
| 3.3.2.3 DTMUV感染DEF后不同阶段病毒基因及HO-1 基因的表达水平 |
| 3.4 siRNA抑制细胞HO-1 的表达对病毒复制的影响 |
| 3.4.1 siRNA对细胞HO-1 表达干扰的效果 |
| 3.4.2 HO-1 表达下调对病毒复制的影响 |
| 3.5 HO-1 抑制DTMUV复制的机制 |
| 3.5.1 DTMUV不同感染阶段过表达细胞HO-1 对病毒复制的影响 |
| 3.5.1.1 DTMUV感染前对细胞HO-1 过表达 |
| 3.5.1.2 DTMUV感染后对细胞HO-1 过表达 |
| 3.5.2 HO-1 三种代谢产物对病毒复制抑制作用的检测 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 硕士期间发表的论文 |
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 引言 |
| 第一节 石油等化石燃料生物脱硫的研究背景及进展 |
| 1.1.1 石油中存在的硫元素 |
| 1.1.2 脱硫技术研究进展 |
| 1.1.3 模式化合物脱硫途径的研究进展 |
| 1.1.3.1 DBT的降解途径 |
| 1.1.3.2 BT的降解途径 |
| 1.1.4 当前生物脱硫研究的不足及研究趋势 |
| 第二节 细菌中硫酸盐和有机硫化合物的转运蛋白 |
| 第三节 原核转录组测序及其应用 |
| 1.3.1 转录组测序平台 |
| 1.3.2 转录组测序的应用 |
| 1.3.2.1 转录组测序在功能基因组学中的应用 |
| 1.3.2.2 转录组测序在代谢途径相关方面的应用 |
| 1.3.2.3 转录组测序对新基因的挖掘 |
| 1.3.3 原核转录组分析流程 |
| 第四节 烷基磺酸盐单加氧酶的研究进展 |
| 1.4.1 烷基磺酸盐的研究背景 |
| 1.4.2 烷基磺酸盐单加氧酶的研究现状 |
| 第五节 嗜热酶的研究进展 |
| 1.5.1 嗜热酶的特征 |
| 1.5.1.1 嗜热酶的来源及特点 |
| 1.5.1.2 嗜热酶的应用 |
| 第六节 研究意义与内容 |
| 1.6.1 研究意义 |
| 1.6.2 研究内容 |
| 1.6.3 创新点 |
| 第二章 材料与方法 |
| 第一节 实验材料 |
| 2.1.1 菌株与质粒 |
| 2.1.1.1 菌株 |
| 2.1.1.2 质粒 |
| 2.1.2 菌株培养条件及培养基配方 |
| 2.1.2.1 菌株培养条件 |
| 2.1.2.2 培养基配方 |
| 2.1.3 引物 |
| 2.1.4 仪器设备 |
| 2.1.5 主要酶与试剂 |
| 2.1.6 分析软件 |
| 第二节 实验方法 |
| 2.2.1 转录组测序与分析 |
| 2.2.2 克隆构建 |
| 2.2.3 蛋白表达和纯化 |
| 2.2.3.1 蛋白的小量表达 |
| 2.2.3.2 蛋白的大量纯化 |
| 2.2.4 脱硫相关基因(ssuD_1/ssuE1和ssuD_2/ssuE2)的表征 |
| 2.2.5 比较分析 |
| 第三章 结果与分析 |
| 第一节 脱硫细菌G.thermoglucosidasius W-2 对重油的降解 |
| 3.1.1 G.thermoglucosidasius W-2 对重油的降解 |
| 第二节 G.thermoglucosidasius W-2在DBT和 BT诱导下转录组响应 |
| 3.2.1 转录组测序和组装 |
| 3.2.2 功能注释分析 |
| 3.2.3 功能富集分析 |
| 3.2.4 功能途径的鉴定 |
| 3.2.5 硫代谢途径中功能基因和转运蛋白基因的差异表达分析 |
| 第三节 有机硫脱除系统的蛋白表达纯化及表征 |
| 3.3.1 烷基磺酸盐降解相关基因的表达 |
| 3.3.2 SsuD_1/SsuE1和SsuD_2/SsuE2 的表征 |
| 3.3.3 SsuD_1和SsuD_2的结构模拟 |
| 3.3.4 SsuD_1和SsuD_2的系统发生关系 |
| 第四节 菌株W-2对有机硫化合物的降解 |
| 第四章 讨论 |
| 第一节 DBT、BT等含硫有机化合物存在的危害 |
| 第二节 生物脱硫的优势和模式化合物脱除途径 |
| 第三节 转录组测序及脱硫途径分析 |
| 第四节 有机硫脱除相关转运蛋白分析 |
| 第五节 SsuD_1/SsuE1和SsuD_2/SsuE2 的适用性 |
| 第六节 生物脱硫的可行性改造 |
| 第七节 G.thermoglucosidasius W-2 有机硫脱除能力的分析 |
| 第五章 结论与展望 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 中英文缩写一览表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 真菌活性天然产物的研究意义 |
| 1.2 真菌萜类天然产物概述 |
| 1.2.1 真菌萜类天然产物及其分类 |
| 1.2.2 真菌倍半萜类天然产物的结构多样性 |
| 1.2.3 真菌倍半萜类天然产物的活性多样性 |
| 1.2.4 真菌萜类天然产物的生源途径研究 |
| 1.2.5 真菌倍半萜类天然产物的生物合成研究 |
| 1.3 窗烷结构天然产物的研究进展 |
| 1.3.1 窗烷结构天然产物的发现 |
| 1.3.2 窗烷结构天然产物的化学合成研究 |
| 1.4 Penifulvins研究概述 |
| 1.4.1 Penifulvins的发现及其生物活性 |
| 1.4.2 Penifulvins的化学合成研究 |
| 1.4.3 Penifulvin A假想生物合成途径的推测 |
| 1.5 研究目的及意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株 |
| 2.1.2 质粒 |
| 2.1.3 引物 |
| 2.1.4 本课题所用到的主要培养基及其配置方法 |
| 2.1.5 本课题所用到的主要试剂及其配制方法 |
| 2.1.6 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 菌种保藏 |
| 2.2.2 灰黄青霉菌及构巢曲霉菌的培养 |
| 2.2.3 灰黄青霉菌及构巢曲霉菌原生质体的制备及转化 |
| 2.2.4 灰黄青霉菌基因组DNA的提取 |
| 2.2.5 灰黄青霉菌总RNA的提取及RT-PCR反应 |
| 2.2.6 目的DNA片段PCR |
| 2.2.7 DNA片段的回收 |
| 2.2.8 重组质粒的构建 |
| 2.2.9 大肠杆菌感受态细胞的制备 |
| 2.2.10 大肠杆菌感受态细胞的转化 |
| 2.2.11 大肠杆菌质粒DNA的提取 |
| 2.2.12 大肠杆菌质粒DNA的少量快速提取及检测 |
| 2.2.13 酵母感受态细胞的制备及转化 |
| 2.2.14 酵母质粒的提取 |
| 2.2.15 大肠及酵母阳性转化子的PCR鉴定 |
| 2.2.16 大肠杆菌重组蛋白的表达及纯化 |
| 2.2.17 镍柱的再生及保存 |
| 2.2.18 SDS-PAGE凝胶电泳 |
| 2.2.19 样品的分析方法 |
| 2.2.20 化合物分离及结构鉴定方法 |
| 2.2.21 生物信息学的分析方法 |
| 第三章 Penifulvin A产生菌株灰黄青霉菌的发酵验证 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 Penifulvin A产生菌株P.griseofulvum NRRL35584 的发酵检测 |
| 3.2.2 Penifulvin A的发酵及分离 |
| 3.2.3 Penifulvin A的结构确定 |
| 3.3 小结与讨论 |
| 第四章 Penifulvin A生物合成基因簇的确定及其生物信息学分析 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 P.griseofulvum NRRL35584 基因组中萜类次级代谢产物基因簇的分析 |
| 4.2.2 Penifulvin A生物合成基因簇的预测 |
| 4.2.3 P.griseofulvum中 peni基因簇的基因功能分析及转录检测 |
| 4.2.4 Penifulvin A生物合成基因簇的确定 |
| 4.2.5 Penifulvin A生物合成途径的重新推导 |
| 4.3 小结与讨论 |
| 第五章 peni基因簇中倍半萜环化酶PeniA的功能研究 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 PeniA的生物信息学分析 |
| 5.2.2 基因peniA的敲除及其突变株代谢产物分析 |
| 5.2.3 基因peniA在酵母中异源表达及其产物(209)分析 |
| 5.2.4 化合物209 的分离及结构鉴定 |
| 5.2.5 化合物209 化学喂养ΔpeniA突变株 |
| 5.2.6 PeniA蛋白体外酶催化功能验证 |
| 5.2.7 PeniA蛋白的底物宽泛性研究 |
| 5.2.8 PeniA催化FPP环化机制推导 |
| 5.3 小结与讨论 |
| 第六章 peni基因簇中P450 单氧化酶PeniB的功能研究 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 PeniB的生物信息学分析 |
| 6.2.2 基因peniB的敲除及其突变株发酵检测 |
| 6.2.3 基因peniB在构巢曲霉中异源表达及其产物(203/210/211)的分析 |
| 6.2.4 PeniB催化产物203/210/211 的分离及结构鉴定 |
| 6.2.5 化合物203/210/211 化学喂养ΔpeniA突变株 |
| 6.2.6 PeniB酵母微粒体蛋白复合物的体外酶催化功能验证 |
| 6.2.7 PeniB催化机理的研究 |
| 6.3 小结与讨论 |
| 第七章 peni基因簇中Baeyer-Villiger单加氧酶PeniC的功能研究 |
| 7.1 前言 |
| 7.2 结果与分析 |
| 7.2.1 PeniC的生物信息学分析 |
| 7.2.2 基因peniC的敲除及其突变株发酵检测 |
| 7.2.3 基因peniC在构巢曲霉中异源表达及其催化功能研究 |
| 7.2.4 PeniC蛋白在大肠杆菌中的表达 |
| 7.2.5 化合物211 化学喂养ΔpeniB及 ΔpeniC突变株 |
| 7.2.6 基因peniD/peniE/peniF的敲除及各突变株发酵检测 |
| 7.3 小结与讨论 |
| 第八章 总结与展望 |
| 8.1 本研究工作总结 |
| 8.2 主要创新点 |
| 8.3 进一步工作展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 在校期间发表文章和参加科研情况 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 木质素的组成及生物降解 |
| 1.2.1 木质素的组成 |
| 1.2.2 木质素的生物降解 |
| 1.3 木材白腐菌 |
| 1.3.1 白腐菌的生物学背景 |
| 1.3.2 白腐菌应用与研究现状 |
| 1.3.3 偏肿革裥菌(Lenzites gibbosa)及其研究现状 |
| 1.4 白腐菌降解木质素酶系统 |
| 1.4.1 漆酶及其降解机制 |
| 1.4.2 LiPs及其降解机制 |
| 1.4.3 MnPs及其降解机制 |
| 1.4.4 其他木质素降解酶 |
| 1.5 高通量测序及生物信息学 |
| 1.5.1 转录组学 |
| 1.5.2 加权基因共表达网络分析 |
| 1.6 研究的目的与意义 |
| 2 偏肿革裥菌在不同木质纤维基质下木质素降解酶的活性规律 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 供试菌种 |
| 2.1.2 供试木质纤维基质 |
| 2.1.3 主要试剂与仪器 |
| 2.1.4 培养基 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 培养方法 |
| 2.2.2 MnP酶活测定方法 |
| 2.2.3 漆酶活性测定方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 三种木质纤维基质对MnP活性的影响 |
| 2.3.2 三种木质纤维基质对漆酶活性的影响 |
| 2.4 小结与讨论 |
| 3 木质和非木质条件下偏肿革裥菌转录组构建与分析 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 供试菌株及木屑 |
| 3.1.2 主要试剂与仪器 |
| 3.1.3 培养基 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 菌丝培养及处理 |
| 3.2.2 偏肿革裥菌总RNA提取及其质量鉴定 |
| 3.2.3 文库构建及上机测序 |
| 3.2.4 生物信息学分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 总RNA提取与质量检测 |
| 3.3.2 原始测序数据及其质量控制 |
| 3.3.3 转录组数据与参考基因组序列比对 |
| 3.3.4 转录组文库质量评估 |
| 3.3.5 SNP/InDel分析 |
| 3.3.6 可变剪接事件预测 |
| 3.3.7 基因结构优化分析 |
| 3.3.8 新基因分析 |
| 3.3.9 基因表达量分析 |
| 3.3.10 差异表达分析 |
| 3.3.11 差异表达基因功能注释和富集分析 |
| 3.4 小结与讨论 |
| 4 基因共表达网络和模块构建及核心基因筛选 |
| 4.1 数据来源 |
| 4.2 分析方法 |
| 4.2.1 检测离群样本及基因 |
| 4.2.2 WGCNA方法构建共表达网络 |
| 4.2.3 WGCNA模块的检测和识别 |
| 4.2.4 基因表达量与外部性状关联分析 |
| 4.2.5 目标模块中枢纽基因筛选 |
| 4.2.6 枢纽基因的富集分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 数据稳定性检测及关键参数确定 |
| 4.3.2 WGCNA网络构建和基因共表达模块聚类 |
| 4.3.3 WGCNA网络模块的关联度 |
| 4.3.4 与酶活数据联合分析与识别关键模块 |
| 4.3.5 hub genes的筛选 |
| 4.4 小结与讨论 |
| 5 偏肿革裥菌降解木质素关键基因表达特性分析 |
| 5.1 试验材料 |
| 5.1.1 供试菌种 |
| 5.1.2 供试木质纤维基质 |
| 5.1.3 主要试剂与仪器 |
| 5.1.4 培养基 |
| 5.2 试验方法 |
| 5.2.1 培养方法 |
| 5.2.2 总RNA提取及检测 |
| 5.2.3 反转录合成第一链cDNA |
| 5.2.4 引物设计 |
| 5.2.5 荧光定量PCR检测 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 总RNA检测 |
| 5.3.2 qPCR扩增效率及引物特异性检测 |
| 5.3.3 木屑处理对11个木质素降解酶基因表达的影响 |
| 5.3.4 秸秆和稻草处理对11个木质素降解酶基因表达的影响 |
| 5.4 小结与讨论 |
| 6 偏肿革裥菌降解木质素关键基因的克隆与分析 |
| 6.1 试验材料 |
| 6.1.1 供试菌种 |
| 6.1.2 主要试剂与仪器 |
| 6.2 试验方法 |
| 6.2.1 菌丝获取 |
| 6.2.2 总RNA提取 |
| 6.2.3 第一链cDNA合成 |
| 6.2.4 目的基因CDS克隆 |
| 6.2.5 PCR产物胶回收 |
| 6.2.6 PCR产物连接、转化 |
| 6.2.7 菌落PCR鉴定 |
| 6.2.8 克隆基因的生物信息学分析 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 RNA质量检测 |
| 6.3.2 基因mnp10s(VP), laccase D, cyp450的CDS克隆结果 |
| 6.3.3 mnp10s(VP)、laccase D、cyp450-up1基因分析 |
| 6.4 小结与讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 研究背景及意义 |
| 1.2 人工金属酶构建的要求 |
| 1.3 利用单克隆抗体设计新型人工金属酶 |
| 1.3.1 具有类过氧化氢酶活性的抗体-卟啉复合物 |
| 1.3.2 各种抗体-铁-卟啉复合物的过氧化氢酶活性的比较 |
| 1.3.3 具有单加氧酶活性的血红素抗体酶 |
| 1.3.4 改进血红素抗体酶 |
| 1.4 将合成的金属卟啉引入到蛋白质中设计新的人工金属酶 |
| 1.4.1 血清白蛋白 |
| 1.4.2 肌红蛋白 |
| 1.4.3 木聚糖酶A |
| 1.5 人工酶的发展现状总结 |
| 1.6 选题依据及主要内容 |
| 第二章 Hemin-GroEL人工酶的制备、表征及性能研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料与仪器 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.3 实验内容 |
| 2.3.1 GroEL蛋白的表达、纯化及表征 |
| 2.3.2 Hemin-GroEL人工酶的构建 |
| 2.3.3 Hemin-GroEL人工酶催化实验 |
| 2.4 实验结果与讨论 |
| 2.4.1 Hemin-GroEL人工酶的构建及表征 |
| 2.4.2 Hemin-GroEL人工酶催化Orange II氧化 |
| 2.4.3 Hemin-GroEL人工酶氧化活性的机理研究 |
| 2.4.4 Hemin-GroEL人工酶的稳定性研究 |
| 2.5 本章总结 |
| 第三章 Hemin-GroEL人工酶在比色实验中的研究及应用 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料与仪器 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.3 实验内容 |
| 3.3.1 Hemin-GroEL人工酶的制备 |
| 3.3.2 Hemin-GroEL人工酶在比色实验中的动力学分析 |
| 3.3.3 Hemin-GroEL人工酶检测H_2O_2和葡萄糖 |
| 3.3.4 儿茶酚的显色实验 |
| 3.4 实验结果与讨论 |
| 3.4.1 比色法的原理 |
| 3.4.2 Hemin-GroEL人工酶催化TMB/OPD氧化 |
| 3.4.3 Hemin:GroEL比例的优化 |
| 3.4.4 Hemin-GroEL人工酶在比色检测中的动力学分析 |
| 3.4.5 Hemin-GroEL人工酶催化比色反应检测H2O2 和葡萄糖 |
| 3.4.6 Hemin-GroEL人工酶比色检测儿茶酚(Catechol) |
| 3.5 本章总结 |
| 第四章 Hemin-GroEL人工酶在荧光实验中的研究与应用 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料与仪器 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.3 实验内容 |
| 4.3.1 Hemin-GroEL人工酶在荧光反应中的动力学分析 |
| 4.3.2 Hemin-GroEL人工酶的荧光法检测H_2O_2、葡萄糖和葡萄糖氧化酶 |
| 4.4 实验结果与讨论 |
| 4.4.1 Hemin-GroEL人工酶催化HVA的二聚化反应 |
| 4.4.2 Hemin-GroEL人工酶在荧光反应中的动力学分析 |
| 4.4.3 阿魏酸对Hemin-GroEL人工酶的抑制作用 |
| 4.4.4 Hemin-GroEL人工酶催化荧光反应检测H_2O_2、葡萄糖和葡萄糖氧化酶 |
| 4.5 本章总结 |
| 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间取得的学术成果 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 我国蛋鸡产业发展现状 |
| 1.2 绿壳蛋鸡品种概述 |
| 1.2.1 长顺绿壳蛋鸡的现状 |
| 1.2.2 其它绿壳蛋鸡品种 |
| 1.3 绿壳蛋研究进展 |
| 1.3.0 绿壳蛋蛋品质 |
| 1.3.1 绿壳蛋的色素组成 |
| 1.3.2 胆绿素的生物合成途径 |
| 1.3.3 绿色蛋壳形成原因 |
| 1.3.4 蛋壳颜色的影响因素 |
| 1.4 血红素加氧酶和胆绿素还原酶简介 |
| 1.4.1 血红素加氧酶简介 |
| 1.4.2 胆绿素还原酶简介 |
| 1.5 研究的目的与意义 |
| 第二章 利用EAV-HP片段选育长顺绿壳蛋鸡 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 试验动物 |
| 2.1.2 试验营养 |
| 2.1.3 引物设计和PCR条件 |
| 2.1.4 数据分析 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 体型外貌 |
| 2.2.2 0世代绿壳蛋鸡的选育 |
| 2.2.3 1世代公母鸡的选育及绿壳率 |
| 2.3 讨论与展望 |
| 小结 |
| 第三章 长顺绿壳蛋鸡生长曲线和产蛋曲线模型拟合 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试验动物 |
| 3.1.2 饲料营养 |
| 3.1.3 指标测定 |
| 3.1.4 生长曲线和产蛋曲线数学模型 |
| 3.1.5 数据分析 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 生长曲线拟合效果分析 |
| 3.2.2 三种模型与实际生长曲线比较 |
| 3.2.3 产蛋曲线拟合效果分析 |
| 3.2.4 三种模型与实际产蛋曲线比较 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 最优生长曲线拟合模型 |
| 3.3.2 最优产蛋曲线拟合模型 |
| 3.3.3 生产管理与性能预测分析 |
| 小结 |
| 第四章 不同蛋壳颜色蛋品质比较 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试验动物 |
| 4.1.2 饲料营养 |
| 4.1.3 指标测定 |
| 4.1.4 胆绿素与原卟啉标准曲线的制备 |
| 4.1.5 蛋壳颜色的测定 |
| 4.1.6 数据统计 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 不同蛋色蛋品质比较 |
| 4.2.2 原卟啉和胆绿素标准曲线的绘制 |
| 4.2.3 不同蛋色色差值与色素浓度比较 |
| 4.2.4 长顺绿壳蛋蛋品质各指标的相关性 |
| 4.2.5 色差值与色素浓度的相关性 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 不同蛋色蛋品质比较与相关性分析 |
| 4.3.2 不同蛋色色差值与色素浓度比较及相关性分析 |
| 小结 |
| 第五章 不同蛋色HO-1基因和BLVRA基因的表达研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 试验动物 |
| 5.1.2 饲料营养 |
| 5.1.3 引物的设计和合成 |
| 5.1.4 RNA的提取 |
| 5.1.5 总RNA的检测 |
| 5.1.6 cDNA的合成 |
| 5.1.7 荧光定量PCR |
| 5.1.8 数据统计 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 RNA提取结果 |
| 5.2.2 cDNA质量检测 |
| 5.2.3 荧光定量引物的特异性 |
| 5.2.4 不同绿壳组HO-1基因和BLVA基因表达情况比较 |
| 5.3 讨论 |
| 5.3.1 HO-1基因表达分析 |
| 5.3.2 BLVRA基因基因表达分析 |
| 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的成果 |
| 致谢 |
