王雨潇,李靖欣,刘沛,朱凤才[1]（2021）在《禽流感病毒研究进展及抗H7N9型病毒疫苗与抗体研究》文中研究指明禽流感病毒（avian influenza virus,AIV）是一种可引起急性呼吸道传染病的人畜共患病毒。自2013年我国出现了全球首例人感染H7N9型AIV病例以来,人们对该病毒产生了担忧与恐慌。AIV在全球广泛传播,人感染不同型别AIV事件也持续发生,造成了巨大的经济损失。目前尚无针对该病的特异性治疗措施与药物,疫苗成为最有可能预防控制病毒传播的手段。现有针对H7N9型AIV的兽用与人用疫苗种类繁多,其中,4类人用H7N9型AIV疫苗已经率先进入了临床试验阶段,主要包括了病毒样颗粒疫苗、减毒活疫苗、灭活疫苗及DNA疫苗,并显示出了良好的安全性和免疫原性。因为暂无上市的人用AIV疫苗,所以其真实效力不得而知。此外,现有的流感疫苗在人群中虽然具有良好的安全性和免疫原性,但对H7N9型AIV并无交叉抗体反应。本文回顾AIV的病原学、流行病学、职业暴露人群调查与防控策略、H7N9型AIV疫苗及H7N9型AIV全人源单克隆抗体研究进展,讨论尚存的问题和挑战以及未来的发展方向,为加深对疾病的了解以及控制AIV在全球的蔓延提供防控策略与方针。
丁海川[2]（2021）在《禽伤寒沙门氏菌自然弱毒活疫苗候选株SG01交叉保护效力及免疫持续期试验评估》文中进行了进一步梳理沙门氏菌病是由沙门氏菌属细菌引起的各种动物和人类疾病的总称,它不仅给畜禽养殖业带来重大损失,而且具有重大公共卫生意义。禽沙门氏菌病包括禽伤寒、鸡白痢和禽副伤寒等。禽副伤寒沙门氏菌感染家禽,很少引起全身性疾病,但此类沙门氏菌常会引起人类的食源性疾病。鸡白痢沙门氏菌和禽伤寒沙门氏菌是危害养鸡业发展的重要病原菌,该类病原菌可通过水平及垂直传播,主要感染3周龄以内的雏鸡,对青年鸡和成年鸡也会造成不良影响,如下痢、产蛋率下降等。尽管禽伤寒和鸡白痢在一些欧美国家已基本根除,但是发展中国家仍然有严重的发病率和死亡率,造成巨大的经济损失。过去常采用抗生素治疗可导致家禽产生多药耐药细菌,且这些多重耐药的病原体可以通过食物链传染给人类。接种疫苗是预防沙门氏菌感染最有效的方法之一。本研究在作者实验室前期分离到的一株禽伤寒沙门氏菌自然弱毒株SG01的基础上（命名为SG01,专利号:ZL201811491200.6）,探索了SG01株针对禽伤寒沙门氏菌和鸡白痢沙门氏菌的交叉保护及SG01的免疫持续期,作为一种弱毒疫苗候选株在实验室试验的结果可行性,这是实验室首次分离鉴定的一株禽伤寒沙门氏菌自然弱毒株,旨在为开发一种天然弱毒的禽伤寒活疫苗奠定基础。1.禽伤寒沙门氏菌自然弱毒疫苗候选株SG01交叉保护效力评估基于实验室前期分离到一株禽伤寒沙门氏菌自然弱毒分离株SG01的安全性等试验结果,我们认为SG01株菌具有作为禽伤寒沙门氏菌弱毒活疫苗候选株的潜力。为满足临床应用的需求,本研究探索了适合SG01株生长的培养基,发现SG01疫苗候选株在SOC培养基中培养速度显着高于普通LB和含2.5%新生牛血清LB培养基。探究禽伤寒沙门氏菌SG01株作为弱毒活疫苗候选株对本型禽伤寒沙门氏菌及同属D群沙门氏菌的鸡白痢沙门氏菌感染的交叉保护效力。本研究挑选50只5日龄雏鸡,并分成5组:免疫组1、禽伤寒沙门氏菌攻毒组1、免疫组2、鸡白痢沙门氏菌攻毒组2和健康对照组,每组10只鸡。免疫组1和免疫组2均通过口服免疫途径方式接种5×109CFU的SG01疫苗候选株,免疫后连续观察临床症状14天并在免疫后第7天和14天称重所有鸡只。免疫后第15天,通过腹腔注射途径,以禽伤寒沙门氏菌U20株（1×1010CFU）对免疫组1和禽伤寒沙门氏菌攻毒组1进行攻毒;以鸡白痢沙门氏菌SP03株（1×1010CFU）对免疫组2和鸡白痢沙门氏菌攻毒组2进行攻毒。攻毒后连续观察14天,并于第15天进行剖检。利用基于临床症状和病理变化的评分系统对攻毒后观察的临床症状（精神沉郁和腹泻症状）以及剖检后的病理变化（心脏、肝脏和脾脏病理变化）进行评分,并通过实验室建立的发病判定标准以确定发病率。结果显示,口服免疫5×109CFU的SG01候选株对鸡群日增重无显着影响,并且不引起鸡群产生精神沉郁和腹泻临床症状。禽伤寒沙门氏菌和鸡白痢沙门氏菌分别攻毒不同组鸡群后,免疫组与攻毒组的鸡群相比,临床症状以及剖检后的病理变化平均评分均显着较低。以禽伤寒沙门氏菌U20株（1×1010CFU）对免疫1组、禽伤寒沙门氏菌攻毒组1进行攻毒,鸡群的发病率分别为30%（3/10）、100%（10/10）;以鸡白痢沙门氏菌SP03株（1×1010CFU）对免疫2组、鸡白痢沙门氏菌攻毒组2进行攻毒,鸡群的发病率分别为50%（5/10）、100%（10/10）。针对禽伤寒沙门氏菌和鸡白痢沙门氏菌的交叉免疫保护试验结果表明,口服免疫禽伤寒沙门氏菌SG01株可在一定程度上预防禽伤寒沙门氏菌及鸡白痢沙门氏菌的人工高剂量感染,期待在家禽生产上起到有效的交叉保护作用。2.禽伤寒沙门氏菌自然弱毒疫苗候选株SG01的免疫持续期效力及抗体检测为了探究禽伤寒沙门氏菌SG01株抗体与其保护效率的关系及免疫之后抗体持续的时间,本试验进行了一次口服免疫SG01株后的抗体监测水平,并评估了免疫后血清抗体水平与攻毒保护效力的对应关系。本研究将160只5日龄SPF鸡分为三部分:免疫组（60只）、攻毒组（50只）、健康对照组（50只）。免疫组分为6组（每组10只）,均于5日龄通过口服免疫方式接种5×109CFU的SG01疫苗候选株。其中5组免疫组鸡群分别在免疫后1、2、3、7和10周,以腹腔注射的方式,攻毒禽伤寒沙门氏菌U20株,攻毒剂量为每只鸡1×1010CFU,攻毒后连续观察14天,并于攻毒后第15天进行剖检,确定发病率。另设1组鸡群不进行攻毒试验,在免疫后1～10周内每周进行采血测定血清抗体凝集效价,血清抗体凝集效价检测利用实验室研发的S9-peg凝集抗原（专利号:ZL202010400163.4）。攻毒保护试验结果显示,免疫后第1周攻毒,免疫组发病率60%（6/10）,攻毒组发病率100%（10/10）;免疫后第2周攻毒,免疫组发病率30%（3/10）,攻毒组发病率100%（10/10）;免疫后第3周攻毒,免疫组发病率10%（1/10）,攻毒组发病率90%（9/10）;免疫后7周攻毒,免疫组发病率0%（0/10）,攻毒组发病率80%（8/10）;免疫后第10周攻毒,免疫组发病率0%（0/10）,攻毒组发病率60%（6/10）。此外,10只仅免疫SG01候选株但不进行攻毒试验的鸡血清抗体凝集效价检测结果显示,免疫后第1周和第2周中未有鸡只检测出抗D群沙门氏菌凝集抗体效价,免疫后第3周有3只鸡（3/10）测出1:1凝集效价滴度,并在免疫后第4周就全部到达1:8凝集效价滴度之后持续升高,于第7周到达峰值为8只鸡（8/10）凝集效价滴度为1:16和2只鸡（2/10）凝集效价滴度为1:8。在第10周有7只鸡（7/10）仍保持1:8的凝集效价滴度,而仅有1只鸡（1/10）未检测出凝集效价滴度。上述结果说明,口服免疫SG01株后第3周即可用S9-peg凝集抗原检测到抗体,且免疫后第3周进行攻毒试验,攻毒保护率为80%,表明鸡只能检测出凝集抗体阳性,鸡群即可有效抵抗禽伤寒沙门氏菌的感染。此外,口服免疫SG01候选株后能提供超过8周的免疫持续期。
凌蒙蒙[3]（2021）在《H9N2与H3N2亚型禽流感二价嵌合病毒样颗粒的构建及免疫效果评价》文中研究指明本研究以鼠白血病病毒的gag蛋白替换禽流感病毒的M1蛋白,利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统制备了一种将H9N2亚型禽流感病毒的HA和NA蛋白,以及H3N2亚型禽流感病毒的HA蛋白共同嵌合到gag蛋白上,以此构建二价嵌合禽流感病毒样颗粒,旨在获得同时诱导H9N2和H3N2亚型禽流感病毒特异性免疫的疫苗。具体构建过程为:首先构建p Fast Bac1-H9、p Fast Bac1-H3和p Fast Bac1-Mgag N2三种重组穿梭质粒,然后将其分别转化至E.coli DH10Bac感受态细胞,通过蓝白斑筛选获得三种重组杆粒,即r Bacmid-H9、r Bacmid-H3和r Bacmid-Mgag N2。然后,将三种重组杆粒分别感染Sf9贴壁细胞,96h后收取P1代杆状病毒,盲传3代后获得P4代杆状病毒,即r BV-H9、r BV-H3和r BV-Bgag N2。测定P4代杆状病毒滴度后,将三种杆状病毒以MOI=3的感染剂量共感染Sf9悬浮细胞。96 h后将收取的细胞上清经20%-30%-60%蔗糖密度梯度离心纯化。血凝结果显示,该病毒样颗粒的血凝效价为28;western blot鉴定结果表明,其能够正确表达目的蛋白;在透射电镜下,所获得的病毒样颗粒粒子直径约为180 nm,表面嵌有纤突。由此表明,四种蛋白成功组装成了二价嵌合病毒样颗粒（bivalent chimeric virus-like particles,bc VLPs）。为了验证所制备的bc VLPs的免疫效果,对免疫鸡只进行了HI抗体效价测定和脾淋巴细胞增殖能力检测。HI抗体效价测定结果表明,免疫后三周内各剂量bc VLPs免疫组和疫苗免疫组的HI抗体效价呈上升趋势,即使免疫后第35天,各剂量bc VLPs免疫组和疫苗免疫组的HI抗体效价仍高于2log2,并且高剂量bc VLPs免疫组与疫苗免疫组对比显示,高剂量bc VLPs免疫组各时间点的HI与疫苗免疫组无显着差异（p>0.05）。由此表明bc VLPs具有较强的免疫原性,免疫后能诱导机体产生良好的体液免疫。脾淋巴细胞增殖能力检测结果表明,各剂量bc VLPs免疫组和疫苗免疫组的SI随着时间延长而增长,到免疫后第3周达到高峰,并且高剂量bc VLPs免疫组与疫苗免疫组对比显示,高剂量bc VLPs免疫组各时间点的SI与疫苗免疫组无显着差异（p>0.05）。由此表明bc VLPs能诱导机体产生良好的细胞免疫。为了评价本研究制备的二价嵌合病毒样颗粒bc VLPs的保护效力,于免疫三周后用H9N2和H3N2亚型AIV进行滴鼻攻毒。体外排毒和体内载毒检测结果表明,高剂量和中剂量bc VLPs免疫组攻毒后,病毒的体外排毒时间和体内载毒时间短于疫苗免疫攻毒组,而低剂量bc VLPs免疫攻毒组的体外排毒时间和体内载毒时间短于疫苗免疫攻毒组或与疫苗免疫攻毒组的时间相当。此外,IHC方法检测抗原试验结果表明,免疫攻毒后第7天,低剂量免疫攻毒组和疫苗免疫攻毒组鸡只的肺脏和气管已检测不到病毒,而攻毒对照组鸡只的肺脏和气管中仍能检测到病毒。由此表明,bc VLPs免疫攻毒组体外排毒时间更短、体内病毒载量更低,因此bc VLPs疫苗能够更好地阻止病毒复制,有效地保护鸡只免受病毒的攻击。总之,本研究制备的bc VLPs能够诱导鸡只产生良好的体液免疫和细胞免疫应答,可以有效保护鸡只免受同源病毒的攻击,为新型二价AIV疫苗的研制提供了新的疫苗制备策略。
丁海川,戴鹏,李亚杰,朱国强[4]（2021）在《禽沙门菌疫苗的研究进展》文中研究表明沙门菌（Salmonella）是重要的人畜共患病病原,能引起人类和动物的胃肠道疾病。污染沙门菌的家禽产品是人类感染沙门菌的主要来源之一。家禽的沙门菌疫苗接种是近年来用于降低家禽感染沙门菌概率及种群净化的重要策略,有助于降低人类感染沙门菌的风险。文章综述了多种沙门菌疫苗的优势、存在问题以及应用情况,为禽沙门菌疫苗的开发应用提供科学参考。
项瑞[5]（2021）在《鸡新城疫、禽流感、传染性法氏囊病毒重组蛋白的免疫保护效果研究》文中研究表明新城疫、禽流感以及鸡传染性法氏囊病是具有高度传染性的疾病,对多种家禽和野生鸟类均有不同程度的影响,对商品鸡和散养鸡农户都造成了巨大的损失。使用疫苗是控制这些疾病的最主要方法。目前临床上主要使用新流法灭活疫苗进行免疫防控,根据临床调查发生,疫苗免疫,存在免疫效率低,需反复接种等问题。本实验利用实验室已制备鉴定的新城疫重组蛋白（HN、NP、M、F）;禽流感重组蛋白（HA、NA、M1）。同时构建传染性法氏囊VP2蛋白的表达载体p RSFduet1-sumo-VP2（BC6/85）并在大肠杆菌系统中表达,为验证重组蛋白的免疫保护效果,首先分别使用新城疫、禽流感和VP2重组蛋白进行预实验,验证其免疫原性。根据试验结果再制备三联抗原液,检测鸡群免疫后的血清抗体水平。在免疫后第四周,使用新城疫SZ株、传染性法氏囊BC6/85株分别攻毒两组鸡群,本论文的主要研究结果如下。1.传染性法氏囊VP2蛋白的表达及检验将扩增的VP2基因克隆至p RSFduet1-sumo载体,获得p RSFduet1-sumo-VP2重组质粒。经过测序鉴定后,将重组质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导表达VP2蛋白。并利用亲和层析镍柱纯化VP2蛋白,最后切割sumo标签。将重组蛋白产物经SDS-PAGE分析,获得目的蛋白条带。经Western-blotting进一步鉴定,VP2蛋白与IBDV阳性血清具有较好的反应性。经双向琼脂扩散实验测得VP2蛋白的AGP效价为1:64。经血凝试验测得NDV重组蛋白的血凝效价为26,AIV重组蛋白产生的血凝效价为29。2.重组蛋白的免疫原性实验先将表达的VP2蛋白与本实验室保存的新城疫、禽流感重组蛋白分别与白油佐剂进行乳化制备抗原液,分别免疫30日龄SPF鸡。再将三种蛋白共同乳化制备抗原液,共同免疫鸡群。在免疫后第14天、21天、28天进行采血分离血清,利用血凝抑制实验和双向琼脂扩散实验测定抗体效价。结果表明:免疫新城疫重组蛋白的鸡群HI效价为3.4log2;免疫禽流感重组蛋白的鸡群HI效价为7.9log2;VP2蛋白免疫组在第4周抗体达到高峰,最高AGP效价为1:128。免疫4周后,100%的鸡群获得有效免疫。三联抗原液免疫实验中,80%的鸡群产生对新城疫的抗体;90%鸡群产生对禽流感的抗体;100%的鸡群产生对传染性法氏囊的抗体。3.新城疫及传染性法氏囊的攻毒实验三联重组蛋白免疫鸡群后28天分别皮下注射新城疫SZ株20μL(含105.0EID50);传染性法氏囊BC6/85株0.2 m L（病毒含量大于100BID-法氏囊感染剂量）进行攻毒实验。结果表明:NDV重组蛋白保护率为90%,IBDV VP2保护率为70%。小结:本研究成功表达了传染性法氏囊VP2蛋白,同时制备了新城疫（基因Ⅶ型）、禽流感（H9亚型）、传染性法氏囊（BC6/85株）三联抗原液,动物试验表明其具有良好免疫保护效果,为后续新流法基因工程亚单位疫苗的研发提供了材料和数据支撑。
张晓欢[6]（2020）在《FAdV-4 pcDNA3.1-Fiber2-IL2重组质粒的构建及其免疫效果的初步评价》文中研究表明禽腺病毒（Fowl Adenovirus）是禽类病毒中最常见的其中一种,其中由血清4型禽腺病毒（Fowl Adenovirus serotype 4,FAdV-4）感染所引起的禽心包积液-肝炎综合征（Hydropericardium-Hepatitis Syndrome,HHS）主要以肝脏发黄肿胀,心包内积聚大量黄色透明状积液为主要特征,对我国的禽类养殖业造成严重的危害,经济损失严重。该病首发于1987年巴基斯坦的安卡拉地区,因此该病又叫禽安卡拉病。禽安卡拉病于2015年在我国呈大面积的爆发并开始流行,对3-6周龄的雏鸡容易造成感染,死淘率最高可达80%。开发安全有效的药物和疫苗来预防该病是非常迫切的,Fiber2蛋白是FAdV-4的主要结构蛋白之一,被认为是一种保护性免疫原,能够诱导产生中和抗体。DNA疫苗通常需要佐剂来提高递呈效率。本试验以Fiber2基因为研究对象,并加入鸡细胞因子IL-2作为基因佐剂,构建pc DNA3.1-Fiber2重组质粒,pc DNA3.1-IL2重组质粒,pc DN A3.1-Fiber2IL2重组质粒。将重组质粒分组对雏鸡进行免疫,探究它的免疫效果,为研制安全有效的安卡拉病疫苗提供初步的理论依据。结果如下:1.以本实验室新分离的新宾株肝组织DNA和鸡脾组织c DNA为模板,根据Gen Bank上FAdV-4 Fiber2基因、鸡IL-2基因序列设计引物,将Fiber2基因、IL-2基因以及Fiber2-IL2融合基因进行PCR扩增,扩增后将纯化的目的基因插入到克隆载体中,最后连接到pc DNA3.1真核表达载体里构建成重组质粒。对重组质粒进行PCR验证、HindⅢ和XbaⅠ双酶切鉴定、测序验证,显示pc DNA3.1-Fiber2重组质粒,pc DNA3.1-IL2重组质粒,pc DNA3.1-Fiber2IL2重组质粒构建成功。2.将上述已构建好的重组质粒对35只健康SPF雏鸡于14日龄进行分组免疫。通过ELISA方法检测免疫前、后SPF雏鸡血清中FAdV-4抗体水平、以及白细胞介素6（IL-6）和干扰素γ（IFN-γ）含量,进而对构建的重组质粒进行免疫效果的初步评价。试验结果显示,重组质粒分组免疫雏鸡后,均能够诱导机体产生FAdV-4抗体,刺激机体内IFN-γ、IL-6含量升高。细胞因子IL-2作为基因佐剂能提高pc DNA3.1-Fiber2重组质粒免疫效果。在FAdV-4抗体水平方面比较,pc DNA3.1-Fiber2重组质粒和pc DNA3.1-IL2重组质粒混合免疫与pc DNA3.1-Fiber2IL2重组融合质粒的免疫效果相比差异不显着。从提高机体内细胞因子含量以及免疫剂量与成本控制方面相比,pc DNA3.1-Fiber2IL2融合重组质粒要优于pc DNA3.1-Fibe-r2与pc DNA3.1-IL2混合免疫重组质粒。综上,以FAdV-4 Fiber2为目的基因构建的重组质粒可以诱导机体产生FAdV-4抗体,并刺激机体内IFN-γ、IL-6含量升高。细胞因子IL-2作为基因佐剂可以显着增强Fiber2基因重组质粒免疫效果。
陈晓涵[7]（2020）在《重组禽流感病毒（H5+H7）三价灭活疫苗研究及应用》文中研究说明高致病性H5和H7亚型禽流感的暴发不仅给养禽业造成重大损失,也给人类的生命健康构成严重威胁,而疫苗免疫是预防禽流感的主动措施、关键环节和最后防线。因此,为了防止H5和H7亚型禽流感在中国的肆虐,重组禽流感病毒（H5+H7）二价灭活疫苗（H5N1 Re-8株+H7N9H7-Re1株）于2017年在养殖场中广泛应用。但是,2017年底以来的全国禽流感流行病学调查结果显示,我国H5亚型禽流感病毒以2.3.2.1和2.3.4.4分支为主,并且2.3.4.4d分支和2.3.2.1d分支病毒已成为当前威胁我国养禽业的主要流行株。进一步的抗原性分析和攻毒试验结果表明,Re-8株疫苗株与2018年分离到的2.3.4.4d和2.3.2.1d分支代表病毒株均存在较大抗原性差异,并且在临床上所使用的二价灭活疫苗不能对当时流行的H5亚型高致病性禽流感病毒提供完全保护作用,因此需要将H5N1 Re-8株疫苗种毒进行更新。此外,H7N9 H7-Re1株与分离到的部分H7N9病毒的抗原性差异较大,并且这种差异还在不断增加,因此将H7N9 H7-Re1株疫苗种毒一并进行更新。本研究将构建的H5亚型Re-11株、Re-12株和H7亚型H7-Re2株重组禽流感病毒进行系统鉴定（种毒病毒含量、HA和NA基因的序列分析、对鸡胚和雏鸡毒力、特异性、免疫原性以及纯净性）。此外,我们将3株病毒在鸡胚中传至13代,测定所有代次病毒的鸡胚半数致死量和HA效价。结果表明,H5亚型Re-11株、Re-12株和H7亚型H7-Re2株重组病毒生物安全度高、特异性强、免疫原性好、适合在鸡胚中稳定增殖,病毒液纯净,均符合作为禽流感灭活疫苗种毒要求。随后,我们用Re-11、Re-12和H7-Re2株疫苗种毒制备成重组禽流感病毒（H5+H7）三价灭活疫苗（H5N1 Re-11株+H5N1 Re-12株+H7N9 H7-Re2株）,对其安全性和免疫效果等进行实验室研究。结果表明,三价灭活疫苗对SPF鸡、SPF鸭和商品鹅均安全,免疫后无不良反应;3批灭活苗免疫家禽后21d,SPF鸡、SPF鸭和商品鹅的HI抗体效价平均值分别可达到7.7log2、7.7log2和4.2log2以上。三价灭活疫苗免疫鸡用亲本毒株和流行毒株攻击,无发病死亡及排毒现象。当SPF鸡的HI抗体效价达到3log2时,可获得抗死亡保护;达到4log2时,可获得完全保护;SPF鸭H5亚型Re-11株、Re-12株HI抗体≥2log2时可对H5亚型效检毒株攻击提供完全保护,H7亚型H7-Re2株HI抗体≥3log2时,对异源H7N2亚型毒株攻击提供完全保护。最后,进行了临床上蛋种鸡、白羽肉种鸡、北京油鸡、固始鸡、商品白羽肉鸡和种鸭免疫三价灭活疫苗的抗体检测,以评价该疫苗的临床应用效果。结果表明,该疫苗安全性良好,免疫后的家禽均无明显不良反应;该三价灭活疫苗可以诱导蛋种鸡、白羽肉种鸡、北京油鸡、固始鸡和种鸭产生良好的抗体;免疫后的商品白羽肉鸡,在出栏检测时具有较高的抗体效价;疫苗免疫家禽后,可有效预防当前我国流行的H5和H7亚型禽流感病毒引起的禽流感。本研究表明重组禽流感病毒（H5+H7）三价灭活疫苗（H5N1 Re-11株+H5N1 Re-12株+H7N9H7-Re2株）对SPF鸡和水禽均具有良好的安全性和免疫保护效果。并且该三价疫苗已于2019年在全国广泛应用,为控制高致病性禽流感发挥了重要作用。
李如梦[8]（2020）在《基于重组杆状病毒昆虫细胞悬浮培养系统的H7N9 VLP新型疫苗的研究》文中研究指明2013年,H7N9亚型禽流感首次在中国长三角地区出现,迄今已在我国人群中形成了五波流行高峰。截至2020年3月1日,实验室确诊人感染H7N9禽流感病毒共有1568例病例,其中616人死亡,病死率约为40%。另外,根据世界动物卫生组织（World Orgnization For Animal Health,OIE）的报告,截至2018年3月,在中国家禽中已报告11起高致病性H7N9亚型禽流感暴发,导致将近100万只家禽被扑杀。因此,H7N9亚型禽流感是对公共卫生和家禽养殖的重大威胁。接种疫苗是预防流感病毒感染的最有效手段。传统灭活疫苗依赖于鸡胚进行生产,具有诸如疫病暴发期间鸡胚供应不足、产生大量的废物引起环境污染、内源病毒污染等缺点。此外,灭活疫苗只能诱导抗体免疫,而不能诱导细胞免疫。因此,需要利用新的技术研发一种安全高效的H7N9禽流感疫苗,以满足现代化家禽养殖业疫病防控的需求。病毒样颗粒（Virus-like particle,VLP）是由携带病毒抗原的结构蛋白自行组装的非传染性颗粒,可模拟病毒粒子的天然结构,能激活细胞免疫反应和体液免疫反应,诱导的免疫保护更为全面。另外,利用杆状病毒表达系统在昆虫悬浮细胞中能够大规模生产流感VLP疫苗,而且它由于不依赖鸡胚生产,保证了禽流感大流行时疫苗的充足供应,且具有成本低、对环境友好、生产周期短、安全性高等优势。本研究利用杆状病毒-昆虫细胞悬浮培养平台,采用两种策略构建了表达H7N9禽流感病毒的血凝素（Hemagglutinin,HA）、神经氨酸酶（Neuraminidase,NA）和基质蛋白（Matrix,M1）的VLP候选疫苗株。两种策略产生的候选VLP疫苗的抗原产量较高、免疫原性好、保护效力强,与商品化H7N9灭活疫苗的表现相当,为H7N9禽流感的防控提供了新的选择。1.基于单独表达HA、NA、M1基因的重组杆状病毒组装H7N9 VLP疫苗的研究本研究选取了一株 H7N9 亚型高致病性禽流感病毒A/Chicken/Guangdong/GD1 5/2016（GD15）作为目的基因的供体。分别将 GD15 的 HA、NA、M1基因克隆在pVL1393载体上,通过与线性化的苜蓿银纹夜蛾多核型多角体病毒（AcMNPV）基因组DNA共转染产生了三个重组杆状病毒（rBac-HA-GD15、rBac-NA-GD15、rBac-M1-GD15）。利用IFA方法能检测到外源蛋白的表达。将三个重组杆状病毒以MOI为1:1:1的比例共感染Sf9细胞。通过透射电镜可观察到直径80-120 nm、内部无遗传物质且与流感病毒结构相似的颗粒形成,即为H7N9 VLP（命名为VLP-1）。将VLP经超滤管浓缩后再经30-60%蔗糖密度梯度超速离心进行纯化,其血凝（HA）效价达到11 log2。分别收获超滤浓缩的VLP与超速离心纯化的VLP制备疫苗,同时以单独表达HA蛋白的重组杆状病毒rBac-HA-GD15制备的灭活疫苗为对照。疫苗经肌肉注射方式接种4周龄的SPF鸡,免疫后第3周各疫苗都能诱导产生抗体应答,平均血凝抑制（Hemagglutination inhibition,HI）抗体滴度在6 log2以上;与对照组相比,各疫苗免疫鸡的血清中均能检测到中和抗体,纯化VLP-1组平均滴度能达到260;各疫苗组IgY抗体滴度均在2560以上,这些结果显示了 VLP-1疫苗具有较强的免疫原性。其中15 μg免疫剂量比7.5 μg免疫剂量能诱导更高的HI抗体水平。免疫3周后,用GD15毒株以106.0 EID50的剂量通过滴鼻点眼的方式攻毒。未免疫组在攻毒后出现严重的临床症状,且5天内全部死亡。所有疫苗免疫鸡在攻毒后14天内均未出现症状且未发生死亡,说明H7N9 VLP-1疫苗可提供100%的临床保护。攻毒后第3、5、7、9天采集喉头及泄殖腔棉拭子进行病毒分离。结果显示,疫苗免疫后最高仅有30%的鸡能检测到排毒,且排毒量较低,其中纯化VLP-1组仅在攻毒后第3天能检测到排毒。组织病理学实验显示,VLP-1疫苗以15 μg剂量免疫时,H7N9病毒感染造成的肺脏病变明显较轻。以上结果说明,通过单独表达HA、NA和M1蛋白的重组杆状病毒共感染Sf9细胞可成功组装H7N9 VLP,且VLP-1疫苗能够诱导产生较强的抗体反应,能够提供针对H7N9病毒攻击完全的临床保护且显着抑制排毒。2.基于串联表达HA、NA、M1基因的重组杆状病毒组装H7N9 VLP疫苗的研究本研究将H7N9 GD15毒株的HA、NA和M1基因串联并克隆至穿梭载体中（pVL1393-NA-M1-HA）。将重组穿梭质粒与线性化的AcMNPV基因组DNA共转染Sf9细胞进行VLP的组装。利用IFA方法鉴定了 HA、NA与M1蛋白的表达,并用透射电镜观察到直径约为100 nm的流感病毒样颗粒,说明重组杆状病毒拯救成功且能够组装成H7N9VLP（命名为VLP-2）。重组杆状病毒接种Sf9细胞制备VLP,用超滤结合超速离心方法浓缩VLP,浓缩后VLP的HA效价显着提高（6 log2至11 1og2）。用两种构建策略制备的VLP疫苗（VLP-1与VLP-2）与商品化重组禽流感病毒H5+H7三价灭活疫苗进行动物的免疫与攻毒实验。VLP疫苗以15μg剂量肌肉注射4周龄的SPF鸡,第3周平均HI抗体滴度在6 log2以上,商品疫苗和VLP-1疫苗诱导的最高HI抗体均能达到10 log2以上。疫苗免疫血清与2013-2018年H7N9野毒株均具有良好的交叉反应性。各疫苗均能诱导中和抗体反应,但是VLP疫苗诱导的中和抗体比商品疫苗诱导的抗体略低。各疫苗均能诱导很高的IgY抗体水平（2560-5120）,且VLP疫苗与灭活疫苗之间无显着差异。其中,VLP-2与VLP-1都以15 μg剂量免疫时,VLP-1疫苗诱导的抗体水平更高。免疫后第3周用高致病性H7N9禽流感病毒GD15株以106.0 EID50的剂量进行攻毒。临床观察14天内,各疫苗免疫组均未出现明显的临床症状且未发生死亡,说明VLP疫苗与商品疫苗均能提供100%的临床保护。攻毒后第3、5、7、9天采集喉头及泄殖腔棉拭子进行排毒检测,结果显示50%的商品疫苗免疫鸡能检测到排毒,两个VLP疫苗免疫鸡的排毒率分别为30%与40%,与商品化疫苗相比无显着差异。VLP疫苗与商品疫苗免疫鸡的脏器中均未检测到病毒,说明它们均能有效抑制病毒复制。以上结果说明,基于HA、NA、M1基因串联表达策略组装的H7N9 VLP疫苗能够在SPF鸡中诱导较强的抗体免疫应答,且能够提供针对H7N9病毒攻击完全的临床保护并显着抑制排毒及病毒在体内的复制,其免疫原性与保护效力与杆状病毒共感染组装的VLP-1疫苗及商品疫苗相当。
何婉婷[9]（2019）在《优化型H5亚型禽流感DNA疫苗与禽用免疫增强剂的初步研制》文中研究指明禽流感是由禽流感病毒引起的一种可感染家禽及野生鸟类的传染病。2017年7月至2018年8月,中国、意大利、南非等亚、欧、非国家及地区暴发了H5亚型禽流感疫情,严重冲击家禽业。DNA疫苗是一种新型基因工程疫苗,有研究发现,禽流感病毒HA基因制成的禽流感DNA疫苗对禽类具有良好的保护效果。由于DNA疫苗具有免疫原性低等问题,急需开发新型免疫增强剂来增强DNA疫苗的保护效果。本研究根据鸡的密码子偏嗜性对H5亚型禽流感病毒A/Goose/Guangdong/P45/2016（H5N6）的HA基因进行优化,并将优化后的HA基因命名为opti-HA。将opti-HA克隆到载体p CAGGS-K中得到重组质粒,并将该重组质粒命名为p CAGGSK-opti-HA,将测序正确的阳性质粒转染到293T细胞中表达。Western blot结果显示,重组质粒p CAGGSK-opti-HA能高效表达HA蛋白,且表达的目的蛋白大小约为64 k Da,这说明重组质粒p CAGGSK-opti-HA能在293T细胞中成功表达。为研究鸡STING、鸡IL-7、鸡IL-8、鸡IL-15、鸭STING、鸭IL-8的重组质粒作为免疫增强剂是否能增强DNA疫苗的免疫效果,根据鸡的密码子偏嗜性分别对鸡STING基因、鸡IL-7基因、鸡IL-8基因、鸡IL-15基因进行优化,并将优化后的基因分别命名为opti-CKSTING、opti-CHIL7、opti-CHIL8、opti-CHIL15;根据鸭的密码子偏嗜性分别对鸭STING基因、鸭IL-8基因进行优化,并将优化后的基因分别命名为opti-DKSTING、opti-DKIL8。将上述优化后的基因带上HIS或HA标签后分别克隆到载体p CAGGS-K后得到重组质粒,并将这些重组质粒分别命名为p CAGGSK-opti-CKSTING-HIS、p CAGGSK-opti-CHIL7-HA、p CAGGSK-opti-CHIL8-HA、p CAGGSK-opti-CHIL15-HA、p CAGGSK-opti-DKSTING-HIS、p CAGGSK-opti-DKIL8-HA。将测序正确的阳性质粒转染到293T细胞中表达。Western blot结果显示,各重组质粒均能在293T细胞中表达出大小正确的目的蛋白。为评估重组质粒p CAGGSK-opti-HA制备的DNA疫苗的免疫效果,以及重组质粒p CAGGSK-opti-CKSTING-HIS、p CAGGSK-opti-CHIL8-HA作为免疫增强剂的效果,将60只2周龄的鸡平均分为4组,分别为PBS组、p CAGGSK-opti-HA组、p CAGGSK-opti-CKSTING-HIS+p CAGGSK-opti-HA共同免疫组、p CAGGSK-opti-CHIL8-HA+p CAGGSK-opti-HA共同免疫组,采用腿肌多点注射的免疫方式,在第一次免疫两周后进行第二次免疫。通过微量血凝抑制试验显示:PBS对照组的血清抗体水平都为0;p CAGGSK-opti-HA组第一次免疫2周时与第二次免疫2周时的血清抗体水平分别约为0.42log2、4.21log2;p CAGGSK-opti-CKSTING-HIS+p CAGGSK-opti-HA共同免疫组第一次免疫2周时与第二次免疫2周时的血清抗体水平分别约为1.29log2、5.08log2;p CAGGSK-opti-CHIL8-HA+p CAGGSK-opti-HA共同免疫组第一次免疫2周时与第二次免疫2周时的血清抗体水平分别约为1.41log2、4.50log2。因此,p CAGGSK-opti-HA组、p CAGGSK-opti-CKSTING-HIS+p CAGGSK-opti-HA共同免疫组、p CAGGSK-opti-CHIL8-HA+p CAGGSK-opti-HA共同免疫组的血清抗体水平在免疫期间均呈现上升趋势。在整个免疫监测期内,p CAGGSK-opti-CKSTING-HIS+p CAGGSK-opti-HA共同免疫组与p CAGGSK-opti-CHIL8-HA+p CAGGSK-opti-HA共同免疫组的血清抗体水平都比p CAGGSK-opti-HA组略高因此,p CAGGSK-opti-HA组、p CAGGSK-opti-CKSTING-HIS+p CAGGSK-opti-HA共同免疫组、p CAGGSK-opti-CHIL8-HA+p CAGGSK-opti-HA共同免疫组均能诱导鸡体内产生良好的抗体,重组质粒p CAGGSK-opti-CKSTING-HIS、p CAGGSK-opti-CHIL8-HA均能提高DNA疫苗在动物体内产生的抗体水平。在第二次免疫2周后,用100μL 106EID50禽流感病毒p45（2.3.4.4分支）对全部实验鸡进行攻毒,PBS对照组的鸡在攻毒后3天内全部死亡,其余各实验组的鸡均存活且无明显的临床症状。p CAGGSK-opti-HA组有2只鸡出现排毒;p CAGGSK-opti-CKSTING-HIS+p CAGGSK-opti-HA共同免疫组有1只鸡出现排毒;p CAGGSK-opti-CHIL8-HA+p CAGGSK-opti-HA共同免疫组有2只鸡出现排毒。因此,重组质粒p CAGGSK-opti-HA作为DNA疫苗对H5亚型禽流感病毒（2.3.4.4分支）的攻击能够提供良好的保护效果,且该DNA疫苗与重组质粒p CAGGSK-opti-CKSTING-HIS共同免疫时对鸡群的保护效果最好,但无论是单独使用DNA疫苗还是DNA疫苗与免疫增强剂一同免疫,均有一些鸡出现排毒。
任培森[10]（2018）在《大肠杆菌DH5α规模化生产禽流感DNA疫苗的工艺及免疫应用研究》文中研究表明禽流感是由A型流感病毒引起的急性传染病,主要侵害禽类的呼吸和神经系统。在我国主要存在LPAI和HPAI两种类型的禽流感病毒,禽流感病毒毒株的不同亚型同时存在也是普遍现象。HPAI占我国禽流感发生次数的90%以上,在东中西部很多地区均有爆发且发病率、死亡率均比较高,致死率高达70%以上,对我国养殖业造成了非常大的经济损失。目前该病主要靠灭活疫苗接种来预防控制,在我国对HPAI农业部采取强制免疫。由于禽流感病毒基因突变率很高,尤其主要保护性抗原的HA基因突变非常频繁,使得H5亚型高致病性禽流感病毒出现了很多不同的病毒株,但是疫苗毒株相对滞后,同时灭活疫苗存在免疫剂量大、免疫副反应强、干扰流行病学检测等诸多缺点。禽流感DNA疫苗在激活体液免疫的同时也能诱发细胞免疫,而且免疫副反应小,不涉及病毒扩散等优点,其有望成为灭活疫苗的替代产品,国外已经有禽流感的商品化核酸疫苗,禽流感H5亚型DH5α-pCAGGoptiHA5 DNA疫苗新兽药核发已通过。重组菌的小规模培养和质粒小量提取技术,在实验室已经是非常成熟的技术,但是要规模化应用于兽用疫苗生产有较大困难,获得规模化高效表达和高效率提纯是当前主要瓶颈,DNA疫苗生产工艺优化是当前迫切需要。本研究摸索了在100L发酵罐中培养基筛选并建立了种子库,优化了DH5α-pCAGGoptiHA5规模化培养的参数条件,并进一步对放大至1000L发酵罐中禽流感DNA生产工艺进行了更为详细的参数研究。此外,对生产的DNA疫苗进行了免疫研究,探索DNA疫苗联合应用的可能性,为其它产品工艺和产品应用提供有效参考。结合统计学方法、响应面法、最陡爬坡法对DH5α-pCAGGoptiHA5培养工艺的各因素优化研究,筛选出培养基优化配方:胰蛋白胨（10g/L）,蔗糖（17.5g/L）,酵母粉（7.5g/L）,硫酸铵（7.5g/L）,NaCl（10g/L）,利用100L反应器发酵培养,最终质粒浓度为115.25mg/L,产量提高88.52%。菌株经连续传15代后,通过菌培养特性和质粒遗传稳定性筛选,得到适应性良好的菌株15株,成功建立了菌种库,该菌株质粒非常稳定,且纯净性较好。通过规模化生产后,该菌种的质粒稳定性也非常好。通过对生产过程中主要影响因素进行优化实验,利用1000L发酵罐,成功进行了规模化放大生产。结果显示在接种量8%、溶氧30%的补料发酵,37.0℃转42.0℃温度诱导5h,质粒产量高达359.2mg/L,产量提高108.9%,具有可重复性,为规模化生产提供有效数据。利用改进的裂解提取法,采用自主研发的裂解仪、絮状物去除仪、切向流过滤组合工艺,使裂解效率提高15倍,质粒回收效率提高了18.74%,质粒纯度良好。利用质粒制备的禽流感DNA疫苗进行了免疫实验,20μg质粒免后5周抗体即可达到7.3log2;200μg质粒大剂量进行免疫后观察14天,鸡只状态良好,无不良反应;30μg质粒剂量进行免疫两次,连续监测6个月,抗体效价平均为5.4log2。通过禽流感DNA疫苗和转移因子联合免疫研究摸索,结果表明二者联合免疫能提高禽流感抗体水平1.2个滴度,为禽流感DNA疫苗的临床推广应用提供参考。
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第1章 禽沙门氏菌疫苗的研究进展 |
| 1.1 禽沙门氏菌的危害及流行情况 |
| 1.2. 沙门氏菌疫苗获得性免疫机制 |
| 1.3. 禽伤寒和鸡白痢沙门氏菌防控及疫苗应用的价值 |
| 1.4. 沙门氏菌疫苗的应用 |
| 1.4.1 灭活疫苗 |
| 1.4.2 亚单位疫苗 |
| 1.4.3 减毒活疫苗 |
| 1.4.4 DNA疫苗 |
| 1.5 本课题研究的目的及意义 |
| 参考文献 |
| 第2章 禽伤寒沙门氏菌自然弱毒疫苗候选株SG01交叉保护效力评估 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株和质粒及感受态细胞 |
| 1.1.2 培养基及主要试剂 |
| 1.1.3 主要仪器 |
| 1.1.4 实验动物 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 SG01株鉴定及培养基筛选 |
| 1.2.2 动物试验方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 SG01疫苗候选株鉴定及培养基筛选 |
| 1.3.2 禽伤寒沙门氏菌SG01株免疫后对的影响 |
| 1.3.3 免疫SG01株对禽伤寒沙门氏菌U20株攻毒后的保护效力评估 |
| 1.3.4 免疫SG01株对鸡白痢沙门氏菌SP03株攻毒后的保护效力评估 |
| 1.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第3章 禽伤寒沙门氏菌自然弱毒疫苗候选株SG01的免疫持续期评估 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株 |
| 1.1.2 培养基及主要试剂 |
| 1.1.3 主要仪器 |
| 1.1.4 实验动物 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 活菌数测定 |
| 1.2.2 试验分组及方法 |
| 1.2.3 平板凝集抗体检测方法 |
| 1.2.4 攻毒试验对增重的影响 |
| 1.2.5 临床症状观察 |
| 1.2.6 大体剖检结果 |
| 1.2.7 病理切片制作 |
| 1.2.8 数据分析 |
| 1.2.9 发病判定标准 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 禽伤寒沙门氏菌U20株攻毒后死亡率及平均增重的结果 |
| 1.3.2 临床症状结果 |
| 1.3.3 大体剖检结果 |
| 1.3.4 病理切片结果 |
| 1.3.5 发病率判定结果 |
| 1.3.6 未攻毒组鸡群1到10周抗体水平及抗体动态学结果 |
| 1.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 H9N2 和H3N2 亚型禽流感流行情况概述 |
| 1.1 H9N2 亚型禽流感流行情况 |
| 1.2 H3N2 亚型禽流感流行情况 |
| 第二章 流感疫苗研究进展 |
| 2.1 灭活疫苗 |
| 2.2 减毒活疫苗 |
| 2.3 亚单位疫苗 |
| 2.4 重组活载体疫苗 |
| 2.5 DNA疫苗 |
| 2.6 通用疫苗 |
| 2.7 病毒样颗粒疫苗 |
| 2.8 本研究的目的意义 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 H9N2 与H3N2 亚型禽流感二价嵌合病毒样颗粒的构建 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 H9N2 与H3N2 亚型禽流感二价嵌合病毒样颗粒的免疫效果评价 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介及在学期间所取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 1 沙门菌疫苗获得性免疫机制 |
| 2 沙门菌疫苗在家禽中的应用 |
| 2.1 灭活疫苗 |
| 2.2 亚单位疫苗 |
| 2.3 减毒活疫苗 |
| 2.4 DNA疫苗 |
| 2.5 基于沙门菌为载体的疫苗 |
| 3 展望 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 鸡新城疫及其疫苗研究进展 |
| 1.1.1 新城疫概述 |
| 1.1.2 新城疫在我国的流行现状 |
| 1.1.3 新城疫疫苗研究进展 |
| 1.1.3.1 传统疫苗 |
| 1.1.3.2 载体疫苗 |
| 1.1.3.3 利用Toll样受体配体作为佐剂的疫苗 |
| 1.1.3.4 病毒样颗粒疫苗 |
| 1.1.4 新城疫防控措施 |
| 1.2 禽流感及其疫苗研究进展 |
| 1.2.1 禽流感概述 |
| 1.2.2 H9 亚型禽流感在我国流行现状 |
| 1.2.3 H9 亚型禽流感疫苗研究进展 |
| 1.2.4 禽流感防控措施 |
| 1.3 鸡传染性法氏囊病及其疫苗研究进展 |
| 1.3.1 鸡传染性法氏囊病概述 |
| 1.3.2 传染性法氏囊病流行现状 |
| 1.3.3 传染性法氏囊病毒蛋白结构和功能相关研究 |
| 1.3.4 鸡传染性法氏囊病疫苗研究进展 |
| 1.3.5 鸡传染性法氏囊病防控措施 |
| 1.4 本研究目的及意义 |
| 第二章 传染性法氏囊VP2 蛋白的制备及检验 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 毒株 |
| 2.1.2 主要试剂及配制 |
| 2.1.2.1 主要试剂 |
| 2.1.2.2 主要溶液的配制 |
| 2.1.2.3 主要仪器 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 传染性法氏囊VP2 蛋白的制备 |
| 2.2.2 传染性法氏囊VP2 蛋白的纯化 |
| 2.2.3 VP2 蛋白的SDS-PAGE分析 |
| 2.2.4 重组蛋白的Western Blot分析 |
| 2.2.5 传染性法氏囊VP2 蛋白的滴度测定 |
| 2.3 试验结果 |
| 2.3.1 VP2 片段的PCR扩增结果 |
| 2.3.2 VP2 片段PCR扩增产物回收结果 |
| 2.3.3 克隆质粒的菌液PCR鉴定结果 |
| 2.3.4 VP2 蛋白的SDS-PAGE分析结果 |
| 2.3.5 VP2 蛋白的Western Blot鉴定结果 |
| 2.3.6 VP2 蛋白滴度测定结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 免疫保护效果研究 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 新城疫及禽流感重组蛋白的滴度测定 |
| 3.2.2 抗原液的制备及检验 |
| 3.2.2.1 单抗原液的制备 |
| 3.2.2.2 三联抗原液的制备 |
| 3.2.2.3 抗原液的检验 |
| 3.2.3 单个抗原的免疫保护效果研究 |
| 3.2.3.1 新城疫及禽流感的抗体检测 |
| 3.2.3.2 传染性法氏囊的抗体检测 |
| 3.2.4 三联抗原液的免疫保护效果研究 |
| 3.2.4.1 新城疫及禽流感的抗体检测 |
| 3.2.4.3 传染性法氏囊抗体检测 |
| 3.3 试验结果 |
| 3.3.1 新城疫、禽流感重组蛋白血凝效价测定结果 |
| 3.3.2 单个抗原的免疫保护效果研究结果 |
| 3.3.2.1 新城疫及禽流感的抗体检测结果 |
| 3.3.2.2 新城疫的攻毒试验结果 |
| 3.3.2.3 传染性法氏囊的抗体检测与攻毒试验结果 |
| 3.3.3 多抗原液的免疫保护效果研究结果 |
| 3.3.3.1 新城疫及禽流感的抗体检测结果 |
| 3.3.3.2 新城疫的攻毒试验结果 |
| 3.3.3.3 传染性法氏囊的抗体检测与攻毒试验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 禽腺病毒 |
| 1.1.1 禽腺病毒分类 |
| 1.1.2 禽腺病毒形态结构 |
| 1.1.3 禽腺病毒结构蛋白 |
| 1.1.4 禽腺病毒流行病学 |
| 1.1.5 禽腺病毒诊断方法 |
| 1.1.6 禽腺病毒疫苗研究进展 |
| 1.2 免疫佐剂研究进展 |
| 1.3 本试验研究目的与意义 |
| 第二章 FAdV-4 pc DNA3.1-Fiber2-IL2 重组质粒的构建 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 病毒来源 |
| 2.1.2 试验动物及取材 |
| 2.1.3 主要使用仪器及厂家 |
| 2.1.4 主要试验仪器及主要试剂 |
| 2.1.5 试验中使用的其他耗材与相关试剂 |
| 2.1.6 主要溶液配制 |
| 2.1.7 试验中使用其他耗材与相关试剂 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 引物设计与合成 |
| 2.2.2 Fiber2 基因、IL-2 基因、Fiber2-IL2 基因PCR扩增 |
| 2.2.3 Fiber2基因克隆及鉴定 |
| 2.2.4 菌液质粒提取及PCR扩增 |
| 2.2.5 Fiber2克隆质粒酶切鉴定以及纯化 |
| 2.2.6 Fiber2基因重组质粒的构建及鉴定 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 Fiber2、IL-2、Fiber2-IL2的PCR扩增结果 |
| 2.3.2 Fiber2、IL-2、Fiber2-IL2 克隆质粒双酶切鉴定结果 |
| 2.3.3 pc DNA3.1-Fiber2IL2 重组质粒PCR鉴定结果 |
| 2.3.4 FAdV-4 pc DNA3.1-Fiber2、pc DNA3.1-IL2、pc DNA3.1-Fiber2IL2 重组质粒酶切鉴定 |
| 2.3.5 测序结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 禽腺病毒Fiber2蛋白 |
| 2.4.2佐剂IL-2 |
| 2.4.3 融合基因 |
| 2.4.4 表达系统 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 Fiber-2基因重组质粒免疫雏鸡后免疫效果初步评价 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 主要仪器及厂家 |
| 3.1.2 主要试剂及厂家 |
| 3.1.3 试验动物 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 主要溶液配制 |
| 3.2.2 质粒大量制备 |
| 3.2.3 雏鸡免疫试验 |
| 3.3 试验结果与分析 |
| 3.3.1 SPF雏鸡血清中FAdV-4 抗体水平结果与分析 |
| 3.3.2 SPF雏鸡血清中IFN-γ含量结果与分析 |
| 3.3.3 SPF雏鸡血清中IL-6含量结果与分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 禽腺病毒疫苗 |
| 3.4.2 重组质粒间的比较 |
| 3.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录一 pcDNA3.1-Fiber2 重组质粒测序结果 |
| 附录二 pcDNA3.1-IL2 重组质粒测序结果 |
| 附录三 pcDNA3.1-Fiber2IL2 重组质粒测序结果 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 禽流感病毒概述 |
| 1.2 H7亚型禽流感的流行 |
| 1.3 H5亚型禽流感的流行 |
| 1.4 高致病禽流感疫苗的研究进展 |
| 1.4.1 全病毒灭活疫苗 |
| 1.4.2 重组病毒活载体疫苗 |
| 1.4.3 DNA疫苗 |
| 1.4.4 通用流感疫苗 |
| 1.5 本研究的目的和意义 |
| 第二章 重组禽流感病毒H5N1 亚型Re-11 株、Re-12 株和H7N9 亚型H7-Re2 株生物特性研究 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 毒种 |
| 2.1.2 病毒株 |
| 2.1.3 试验动物 |
| 2.1.4 血清 |
| 2.1.5 主要试剂和仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 种毒的系统鉴定 |
| 2.2.2 种毒的传代及病毒含量的测定 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 种毒的系统鉴定 |
| 2.3.2 种毒的传代及病毒含量的测定结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 重组禽流感病毒(H5+H7)三价灭活疫苗的实验室研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 制苗用种毒 |
| 3.1.2 攻毒用病毒株 |
| 3.1.3 试验动物 |
| 3.1.4 检测用HI抗原 |
| 3.1.5 主要试剂和仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 抗原配比及有效成分相容性研究 |
| 3.2.2 3批三价疫苗物理性状检验 |
| 3.2.3 3批三价疫苗安全性试验 |
| 3.2.4 3批三价疫苗免疫效力试验 |
| 3.2.5 三价疫苗对流行毒株的免疫效力试验 |
| 3.2.6 HI抗体与攻毒保护关系研究 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 抗原配比及有效成分相容性研究 |
| 3.3.2 成品物理性状的检验 |
| 3.3.3 3批三价疫苗安全性试验 |
| 3.3.4 3批三价疫苗免疫效力试验 |
| 3.3.5 三价疫苗对流行毒株的免疫效力试验 |
| 3.3.6 HI抗体与攻毒保护关系研究 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 重组禽流感病毒(H5+H7)三价灭活疫苗的临床应用评估 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 疫苗 |
| 4.1.2 抗原及标准阳性血清 |
| 4.1.3 试验动物 |
| 4.1.4 主要试剂和仪器 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 蛋种鸡安全性和免疫效果评估 |
| 4.2.2 白羽肉种鸡安全性和免疫效果评估 |
| 4.2.3 北京油鸡安全性和免疫效果评估 |
| 4.2.4 固始鸡安全性和免疫效果评估 |
| 4.2.5 商品白羽肉鸡安全性和免疫效果评估 |
| 4.2.6 种鸭安全性和免疫效果评估 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 安全性评估结果 |
| 4.3.2 蛋种鸡免疫效果评估 |
| 4.3.3 白羽肉种鸡免疫效果评估 |
| 4.3.4 北京油鸡免疫效果评估 |
| 4.3.5 固始鸡免疫效果评估 |
| 4.3.6 商品白羽鸡免疫效果评估 |
| 4.3.7 种鸭免疫效果评估 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
| 摘要 Abstract 符号说明 第一章 文献综述 |
| 引言 |
| 1 H7N9流感病毒的流行现状 |
| 1.1 流行现状 |
| 1.2 基本结构 |
| 2 流感疫苗的研究进展 |
| 2.1 流感病毒疫苗的研究现状 |
| 2.2 通用型流感病毒疫苗的研究 |
| 3 病毒样颗粒疫苗的研究进展 |
| 3.1 流感VLP疫苗的制备 |
| 3.2 VLP表达系统 |
| 3.3 流感病毒样颗粒疫苗的研究进展及前景 |
| 参考文献 第二章 基于单独表达HA、NA、M1基因的重组杆状病毒组装H7N9 VLP疫苗的研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 细胞、质粒、菌株和毒株 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 鸡胚和实验动物 |
| 1.5 主要分子生物学软件 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 重组穿梭质粒的构建 |
| 2.2 重组杆状病毒的拯救 |
| 2.3 重组杆状病毒的鉴定 |
| 2.4 重组杆状病毒的空斑纯化 |
| 2.5 重组病毒的扩增 |
| 2.6 VLP的收获 |
| 2.7 疫苗的制备 |
| 2.8 攻毒用病毒的准备 |
| 2.9 疫苗免疫实验 |
| 2.10 攻毒保护实验 |
| 2.11 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 重组穿梭质粒的构建 |
| 3.2 重组杆状病毒的鉴定 |
| 3.3 重组杆状病毒滴度的测定 |
| 3.4 VLP形态的透射电镜观察 |
| 3.5 H7N9 VLP的HA滴度测定 |
| 3.6 H7N9 VLP疫苗诱导的抗体应答测定 |
| 3.7 攻毒保护实验 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 第三章 基于串联表达HA、NA、M1基因的重组杆状病毒组装H7N9 VLP疫苗的研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 毒株、细胞、质粒和菌株 |
| 1.2 主要试剂与仪器 |
| 1.3 鸡胚和实验动物 |
| 1.4 主要分子生物学软件 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 重组穿梭质粒的构建 |
| 2.2 重组杆状病毒的拯救 |
| 2.3 重组杆状病毒的鉴定 |
| 2.4 重组杆状病毒的空斑纯化 |
| 2.5 重组病毒的扩增 |
| 2.6 VLP的收获 |
| 2.7 VLP疫苗的制备 |
| 2.8 疫苗免疫实验 |
| 2.9 攻毒保护实验 |
| 2.10 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 重组穿梭质粒的构建 |
| 3.2 重组杆状病毒的鉴定 |
| 3.3 VLP形态的透射电镜观察 |
| 3.4 H7N9 VLP的滴度测定 |
| 3.5 H7N9 VLP疫苗诱导的抗体应答测定 |
| 3.6 攻毒保护实验 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 全文总结 致谢 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词或符号表 |
| 1 前言 |
| 1.1 我国H5亚型禽流感的流行情况 |
| 1.2 禽流感的公共卫生意义 |
| 1.3 禽流感疫苗的研究进展 |
| 1.3.1 我国禽流感疫苗使用现状 |
| 1.4 DNA疫苗 |
| 1.4.1 DNA疫苗的优点与不足 |
| 1.4.2 改善DNA疫苗的方法 |
| 1.4.2.1 基于脂质体、纳米颗粒的递送系统 |
| 1.4.2.2 传统佐剂 |
| 1.4.2.3 分子佐剂 |
| 1.4.2.4 DNA质粒设计及免疫程序的改进 |
| 1.5 密码子优化策略 |
| 1.5.1 GC含量的调整 |
| 1.5.2 m RNA二级结构 |
| 1.5.3 密码子偏好性 |
| 1.5.4 其他因素 |
| 1.6 本研究的目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病毒、载体 |
| 2.1.2 基因的优化及质粒的构建 |
| 2.1.3 实验动物及鸡胚 |
| 2.1.4 实验主要试剂及工具酶 |
| 2.1.5 实验主要试剂盒 |
| 2.1.6 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 基因的优化及获取 |
| 2.2.1.1 opti-HA(p45)基因的优化及获取 |
| 2.2.1.2 鸡STING基因的优化及获取 |
| 2.2.1.3 鸭STING基因的优化及获取 |
| 2.2.1.4 鸡IL-7 基因的优化及获取 |
| 2.2.1.5 鸡IL-8 基因的优化及获取 |
| 2.2.1.6 鸭IL-8 基因的优化及获取 |
| 2.2.1.7 鸡IL-15 基因的优化及获取 |
| 2.2.2 重组质粒的构建 |
| 2.2.3 重组质粒在体外的表达鉴定 |
| 2.2.3.1 细胞转染 |
| 2.2.3.2 蛋白样品的收集及Western blot检测重组质粒在体外的表达 |
| 2.2.4 质粒大提与SPF鸡免疫 |
| 2.2.4.1 质粒大提 |
| 2.2.4.2 SPF鸡的免疫 |
| 2.2.4.3 攻毒试验 |
| 2.2.4.4 HI抗体的检测 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 密码子优化结果 |
| 3.1.1 p45禽流感病毒HA基因优化结果 |
| 3.1.2 鸡STING基因优化结果 |
| 3.1.3 鸭STING基因优化结果 |
| 3.1.4 鸡IL-7 基因优化结果 |
| 3.1.5 鸡IL-8 基因优化结果 |
| 3.1.6 鸭IL-8 基因优化结果 |
| 3.1.7 鸡IL-15 基因优化结果 |
| 3.2 重组质粒的构建和鉴定 |
| 3.2.1 重组质粒pCAGGSK-opti-HA的构建与鉴定 |
| 3.2.2 重组质粒pCAGGSK-opti-CKSTING-HIS的构建与鉴定 |
| 3.2.3 重组质粒pCAGGSK-opti-DKSTING-HIS的构建与鉴定 |
| 3.2.4 重组质粒pCAGGSK-opti-CHIL7-HA的构建与鉴定 |
| 3.2.5 重组质粒pCAGGSK-opti-CHIL8-HA的构建与鉴定 |
| 3.2.6 重组质粒pCAGGSK-opti-DKIL8-HA的构建与鉴定 |
| 3.2.7 重组质粒pCAGGSK-opti-CHIL15-HA的构建与鉴定 |
| 3.3 重组质粒体外表达结果 |
| 3.3.1 重组质粒pCAGGSK-opti-HA Western blot检测结果 |
| 3.3.2 重组质粒pCAGGSK-opti-CKSTING-HIS Western blot检测结果 |
| 3.3.3 重组质粒pCAGGSK-opti-DKSTING-HIS Western blot检测结果 |
| 3.3.4 重组质粒pCAGGSK-opti-CHIL7-HA Western blot检测结果 |
| 3.3.5 重组质粒pCAGGSK-opti-CHIL8-HA Western blot检测结果 |
| 3.3.6 重组质粒pCAGGSK-opti-CHIL15-HA Western blot检测结果 |
| 3.3.7 重组质粒pCAGGSK-opti-DKIL8-HA Western blot检测结果 |
| 3.4 抗体水平检测结果 |
| 3.5 攻毒试验结果 |
| 4 全文讨论与结论 |
| 4.1 讨论 |
| 4.2 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 硕士研究生期间所获科研成果 |
| 中文摘要 abstract 缩略语中英文对照表 第一篇 文献综述 |
| 第1章 禽流感分子流行病学 |
| 1.1 禽流感分子生物学特征 |
| 1.2 禽流感的宿主及传染源 |
| 1.3 禽流感的传播途径及致病机理 |
| 1.4 禽流感的流行情况 |
| 1.5 禽流感的临床症状及病理变化 |
| 1.6 禽流感的诊断 |
| 1.7 禽流感的防治措施 |
| 第2章 国内外禽流感疫苗的研究进展 |
| 2.1 常规禽流感疫苗的研究进展 |
| 2.2 AIV基因工程疫苗的研究进展 |
| 2.3 禽流感DNA疫苗研究进展 |
| 第3章 大肠杆菌工程菌生产质粒DNA的工艺研究进展 |
| 3.1 影响基因工程菌高密度发酵的因素 |
| 3.2 影响质粒DNA产量的因素 |
| 3.3 E.coli质粒DNA提纯工艺研究 第二篇 研究内容 |
| 第1章 重组大肠杆菌DH5α-pCAGGoptiHA5培养基优化与种子库建立 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第2章 禽流感DNA疫苗规模化培养工艺研究 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 规模化禽流感DNA疫苗提纯工艺与DNA质粒免疫研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 禽流感DNA疫苗和转移因子联合免疫效果研究 |
| 4.1 材料 |
| 4.2 方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 结论 参考文献 导师简介 作者简介 致谢 |
