古丽玲[1]（2021）在《间充质干细胞旁分泌蛋白在软骨修复中的作用及机制研究》文中指出关节软骨缺损是骨关节临床最常见疾病之一,由于软骨组织内没有血管供应、神经支配和淋巴回流,组织内的软骨细胞的迁移及增殖能力较低,导致软骨自我修复能力很差,各种损伤、炎症和退行性病变均可引起不可逆性软骨损伤。目前临床上多采用以药物缓解疼痛为主的保守治疗,无法实现软骨的再生修复。研究人员在积极尝试通过用外科手术的方式来探寻更好的治疗方式,虽然目前采取的微骨折、自体软骨/软骨细胞移植等技术有一定的效果,但是仍难以实现完美的软骨组织及功能的再生修复。目前,基于干细胞来源广泛,免疫原性低,具备多向分化功能等优势开展的干细胞组织工程已成为软骨再生修复的一种新治疗策略。干细胞在组织修复中所发挥的作用及其机制迅速成为研究热点。随着对干细胞旁分泌因子在组织修复中发挥重要作用的认识,利用间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells,MSCs）旁分泌体进行无细胞治疗来替代传统细胞疗法受到越来越多研究者的关注。为了探究MSCs的旁分泌体在治疗骨性关节炎所致软骨缺损中发挥的作用及机制,本文首先比较了体外培养MSCs所获条件培养基（Conditioned medium,CM）中所含MSCs旁分泌体不同组成成分:可溶性蛋白（Soluble Proteins,SPs）、外泌体（Exosomes,Exos）和微泡（Micro-vehicles,MVs）对保护炎症刺激下软骨细胞表型及促进软骨修复的作用差异。接着研究了脂肪间充质干细胞（Adipose Tissue-derived Stem Cells,ADSCs）及骨髓间充质干细胞（Bone Marrow Derived Stem Cells,BMSCs）在2D/3D培养条件下所得CM维持软骨细胞表型能力的差异,通过蛋白质组学技术及生物信息学分析找到了ADSCs来源SPs中发挥软骨保护作用的可能蛋白为网钙结合蛋白-2（Reticulocalbin-2,RCN2）。最后通过构建RCN2低表达和过表达细胞系初步阐明了RCN2在调控软骨细胞表型中发挥作用的可能机制。主要研究结果如下:1.体外培养大鼠软骨细胞在促炎因子IL-1β存在的情况下,培养基中添加大鼠BMSCs来源的CM成分SPs能更好的恢复软骨细胞表型,而添加CM中另两种主要成分Exos和MVs效果不明显。提示BMSCs的旁分泌体中,可能发挥保护软骨细胞免受炎症环境影响维持其正常形态及表型作用的,不是Exos和MVs而是SPs。在大鼠OA模型中关节腔注射Exos、MVs和SPs,通过对样本的组织学评价也证实了SPs能够促进大鼠软骨基质形成。2.将ADSCs和BMSCs培养于不同2D/3D条件以制备CM,经PCR和Western blot实验检测发现ADSCs来源的CM更有利于维持软骨表型;ADSCs组间比较发现,3D培养所得的CM维持软骨表型效果优于2D培养所得CM,而3D支架孔径的改变对所得CM维持软骨表型能力的影响不大;通过蛋白组学对各CM中SPs进行差异蛋白比对分析,发现ADSCs各组SPs间3D培养组与2D培养组对比所得差异蛋白数量多于不同孔径3D支架之间对比,说明3D支架孔径的改变对CM中SPs表达差异影响不大;通过蛋白组学对及生物信息学分析,我们从ADSCs来源的SPs中优选了四个最可能影响软骨细胞表型的分子:CAPNS1、LAL、MAT2A和RCN2,对上述四个分子进行sh RNA转染实验检测其对软骨细胞软骨表型的影响,结果显示RCN2基因下调后,MMP-13的表达明显降低,SOX-9的表达增加,但对Col-X和Col-I表达影响较少,提示RCN2相对其他蛋白对软骨细胞软骨表型的影响更大,可能是SPs中的主要功能蛋白。3.通过构建稳定的人/大鼠的软骨细胞低表达和过表达RCN2细胞系,研究RCN2调控软骨细胞软骨表型的机制。结果显示:敲低RCN2后软骨基质降解酶MMP-13和ADAMTS-5的表达量降低,软骨基质标志蛋白Col-II、SOX-9、ACAN升高,过表达RCN2后软骨基质降解酶MMP-13和ADAMTS-5的表达量升高,软骨基质标志蛋白Col-II、SOX-9、ACAN降低,进一步实验发现敲低RCN2后NFAT1、NFAT2的表达水平升高,过表达后相反。提示:RCN2可能通过NFAT信号通路调控软骨基质的形成。综上所述,本文明确了骨髓间充质干细胞分泌体中的SPs相比Exos和MVs能更好的恢复促炎因子IL-1β存在下的软骨细胞形态及软骨表型。脂肪间充质干细胞来源的CM在维持软骨细胞软骨表型方面优于骨髓间充质干细胞,3D支架培养所得CM优于2D培养,3D支架孔径的改变对CM功能影响不大。通过蛋白质组学数据筛选出ADSCs来源SPs中RCN2可能对软骨基质有影响,进一步实验证实RCN2可能是通过NFAT信号通路调控软骨细胞表型。
佘凌宇[2]（2021）在《黄芩组分对FGF1促创面愈合的协同作用机制研究》文中研究表明目的:基于多室电泳筛选技术从黄芩中筛选与FGF1具有促进创面愈合协同作用的活性组分;探究黄芩组分与FGF1的协同作用机制。方法:1.优化多室电泳筛选技术参数并筛选黄芩中与FGF1协同作用的组分:优化多室电泳筛选技术参数（p H、时间、电压）;以FGF1为靶蛋白筛选协同作用的组分;建立LC-MS/MS方法检测组分定性、定量分析。利用Molecular Operating Environment 2019模拟黄芩组分与FGF1进行分子对接,验证筛选的黄芩组分与FGF1的结合方式。2.探究FGF1-黄芩组分协同作用的效果:将FGF1-黄芩组分联合给药后考察NIH3T3细胞增殖、细胞迁移的影响,ELISA试剂盒检测胶原蛋白含量,考察FGF1-黄芩组分分协同作用效果。3.基于PI3K/AKT/mTOR信号通路探究黄芩组分-FGF1协同作用分子机制:提取样品RNA,采用实时荧光定量PCR技术检测PI3K/AKT/mTOR信号通路中PI3K、AKT、mTOR mRNA基因的相对表达量。Western blot法检测PI3K/AKT/mTOR信号通路中PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、mTOR和p-mTOR蛋白的相对表达量。结果:1.多室电泳筛选技术参数:黄芩提取液与FGF1,37℃孵化30 min、10 mM乙酸铵p H 4.0,电泳电压14 V、电泳时间15 min、FGF1迁移率60.58%（RSD=1.825%）。2.基于多室电泳筛选技术从黄芩提取液中筛选出3种成分,并利用LC-MS/MS对3种活性成分定性,分别为:黄芩苷、千层纸素A-7-0-β-D葡萄糖醛酸苷、汉黄芩苷。同时采用MRM模式对3种成分定量,确定其摩尔比例为2:2:1。3.Molecular Operating Environment 2019软件对接后,均与FGF1结合,结合方式为氢键。4.FGF1在2.5 nM时,促细胞增殖作用最佳;FGF1与黄芩组分联合给药能促进细胞增殖,与FGF1给药组对比具有显着性差异（P<0.001）;并能增加胶原蛋白的合成,与FGF1和黄芩组分单独给药均具有显着差异（P<0.001）;还能提升细胞的迁移率,与FGF1和黄芩组分单独给药组均具有显着差异（P<0.001）。5.FGF1与黄芩组分联合给药能激活细胞内PI3K/AKT/mTOR信号通路中PI3K、AKT、mTOR基因和蛋白的相对表达量。结论:采用多室电泳筛选技术从黄芩中筛选出与FGF1协同作用的3种活性成分（黄芩苷、千层纸素A-7-0-β-D葡萄糖醛酸苷、汉黄芩苷）,其摩尔比例为2:2:1。联合给药后,协同促进NIH3T3细胞的增殖及迁移,并增加细胞的胶原蛋白的合成。同时激活PI3K/AKT/mTOR信号通路,调控PI3K、AKT、mTOR基因及蛋白的表达。FGF1与黄芩组分初步协同机制可能与PI3K/AKT/mTOR信号通路的激活有关。
李孟[3]（2021）在《消症散结止痛贴膏的药学及药效学基础研究》文中认为目的:本文以消症散结止痛贴膏为研究对象,探索其有效成分及作用机制。采用UPLC-Q-Exactive静电场轨道阱高分辨质谱联用技术,对消症散结止痛贴膏的化学成分进行全面分析和表征,筛选有效成分;复制相关动物模型,系统评价消症散结止痛贴膏的药效学;体内实验观察消症散结止痛贴膏对裸鼠乳腺癌动物模型的一般状态,异体瘤体体积,抑瘤率影响,检测VEGF,Bcl,Caspase-3基因和蛋白表达,体外实验培养乳腺癌细胞系MCF-7细胞,通过检测观察本制剂体外对目的细胞系的存活率、凋亡率、VEGF,Bcl,Bax,Caspase-3基因及蛋白的改变,阐明消症散结止痛贴膏治疗乳腺癌的机制。方法:1.采用UPLC-Q-Exactive静电场轨道阱高分辨质谱联用技术,对消症散结止痛贴膏的化学成分进行全面分析和表征,进一步筛选出含量占比高、生物活性强的成分,应用UPLC MS/MS对其化学成分进行含量测定。2.选取4-6周雌性BALB/C-nu纯系裸鼠,在小鼠左侧第2个乳房脂肪层内接种MCF-7细胞悬液胞,建立裸鼠乳腺癌荷瘤模型,成模后随机分为模型组（A组）,阳性对照组（氟尿嘧啶溶液）（B组）,消症散结止痛贴膏低剂量组（C组）,消症散结止痛贴膏中剂量组（D组）及消症散结止痛贴膏高剂量组（E组）共五组,每组12只,模型组给予蜂蜡麻油等容积混合物,在小鼠细胞接种处皮肤局部外敷,阳性对照药组给予5-FU(腹腔注射,20mg·kg-1·3d-1),其余三组给予消症散结止痛贴膏低中高剂量局部外敷,其中给药周期除阳性对照组外的四组每日一次,连续给药21天,阳性对照组每周一次,连续给药三周,定期观测小鼠体重,记录一般情况变化,游标卡尺测量肿瘤的长度（a）及宽度（b）,计算肿瘤近似体积（V）V=1/2ab2（单位cm3）;计算各组中抑瘤率;光镜下观察荷瘤组织及肿瘤组织密度;免疫组织化学方法检测荷瘤组织汇总CD34阳性表达,并观察血管新生情况,Real Time PCR及Westernblot方法检测荷瘤组织中VEGF,Bcl-2及Caspase-3基因及蛋白表达。3.药效学研究中,分别以建立雌二醇致大鼠及家兔乳腺增生模型,大鼠琼脂肉芽肿,电、热刺激致痛模型,血瘀型模型等,评价消症散结止痛贴膏抑制乳腺增生,对肉芽肿重量,抗炎镇痛及对血液粘稠度影响等药效学改变。4.体外培养乳腺癌细胞系MCF-7细胞,复苏,传代稳定后,MTT方法检测MCF-7细胞活性,检测消症散结止痛贴膏溶液乳腺癌细胞的存活率、凋亡率,确定消症散结止痛贴膏溶液最佳干预浓度及干预时间,以备后续实验应用。5.将稳定传代乳腺癌细胞系MCF-7细胞分为两组,对照组和实验组,对照组不予干预,实验组给予消症散结止痛贴膏溶液进行干预,应用Real Time PCR方法检测MCF-7细胞中VEGF,Bcl-2及Caspase-3 m RNA表达。6.将稳定的MCF-7细胞分为两组,对照组和实验组,对照组不予干预,实验组给予消症散结止痛贴膏溶液进行干预,Westernblot方法检测VEGF,Bcl,Bax,Caspase-3,cleaved caspase-3蛋白的表达。结果:1.消症散结止痛贴膏具有针对性状、含膏量、黏附力、重量差异、含量测定研究结果表明,自制贴膏为黄棕色半固体制剂;含膏量暂定为每贴不低于24.994g/100 cm2。初黏力为不低于17号钢球;10片消症散结止痛贴膏重量的RSD为1.41%。2.消症散结止痛贴膏中的姜黄、藤黄、莪术、白芷、天葵子薄层鉴别方法学研究,研究结果表明莪术等药材的鉴别方法,重复性好,耐用性强,方法科学可靠。3.在动物体内实验中,空白对照组小鼠肿瘤生长迅速,余治疗组均对肿瘤有抑制作用,其中阳性对照组及消症散结止痛贴膏中、高剂量抑制最强,三组间无明显差异（P>0.05）,而低剂量组则不及其他三组治疗组（P<0.05）;各治疗组中小鼠一般状态较空白组相比,未出现行为和进食,对外界刺激的反应,皮毛光泽情况和精神状态的方面的异常。HE染色后,光镜下观察,模型组组癌细胞排列非常紧密,细胞核完整,大小均一,且无结缔组织,各治疗组中肿瘤细胞均出现不同程度的细胞皱缩,伴不同程度结缔组织,其中高剂量和阳性对照药物组别中结缔组织较其他治疗组比较,表达更多;免疫组化中各组中均有CD34阳性表达,表明荷瘤组织中新生血管,而经治疗后,均可减少肿瘤新生血管生成,其中以中、高剂量和阳性对照药物组血管新生较模型组减少,优于低剂量组（P<0.05）。4.在抗炎镇痛实验结果表明,消症散结止痛贴膏可明显减轻大鼠皮下棉球肉芽肿及皮下琼脂肉芽肿重量,与基质对照组相比,具有统计学意义（P<0.05）,同时,消症散结止痛贴膏可有效减低电刺激及热刺激致小鼠疼痛反应,优于基质对照组（P<0.05）。5.在活血化瘀药效学实验中,消症散结止痛贴膏可有效降低血瘀大鼠（皮下注射肾上腺素+冰水浸泡）全血粘度（包括高切和低切变率）、血浆粘度、还原粘度、血沉、纤维蛋白原含量、体外血栓指数、体外血栓长度及湿重;增加正常小鼠耳部微血管血液流速、管径及固定区域有血细胞流动的毛细血管数目,上述结果与血瘀模型基质组比较,均优于该组（P<0.05）。6.在对乳腺增生药效学实验中,经与乳腺增生模型基质对照组对比,消症散结止痛贴膏高中低三个剂量均可可有效降低雌二醇所致大鼠及家兔乳腺增生（P<0.05）,表现为降低雌二醇所致乳腺增生动物乳房重量、乳头高度、乳房外观病变程度及乳腺组织病理变化程度、降低家兔血清雌二醇水平及乳腺组织病理变化程度（P<0.05）。7.在动物实验基因检测部分,结果表明,模型组中荷瘤组织中VEGF,Bcl-2均显着增高,明显高于其他治疗四组（P<0.05）,Caspase-3则明显低于其余四组Caspase-3;治疗组中比较,阳性对照组中VEGF,Bcl-2和Caspase-3基因表达,与高剂量组中比较无差异经（P>0.05）,而中、低剂量组则表现为VEGF,Bcl-2高于高剂量和阳性对照组（P<0.05）,Caspase-3表达低于次两组（P<0.05）。8.在动物实验基蛋白检测部分,结果与基因表达呈一致性,表现为模型组VEGF,Bcl-2蛋白均显着增高,明显高于其他治疗四组（P<0.05）,Caspase-3蛋白则明显低于其余四组;与阳性对照组对比,高剂量表现为效果相当（P>0.05）,中低剂量则不及阳性对照组（P<0.05）。9.取人乳腺癌MCF-7常规培养,经传代,复苏稳定后,以消症散结止痛贴膏提取物溶液制备后7个浓度,分别在24h和48h干预MCF-7细胞,经MTT法检测,最佳浓度为0.32mg/m L,干预最佳时间为24h。10.光镜下观察细胞生长,对照组:随时间增加,细胞死亡,在48h时,细胞大量死亡。培养初期6h时癌细胞呈典型的腺体样排列,随时间增长,细胞呈锥形,核位于细胞一侧,呈扭曲、折叠、凹陷等畸形改变,粗颗粒状,分布不均;实验组:培养初期6h,与对照组对比,有少量细胞死亡,随时间增加,细胞死亡加速,排列稀疏,核仁多而形态不规则,胞质减少,胞质及核内可见多量弥散的小空泡,在同等时间下,死亡较对照组增多。11.细胞基因学检测部分:消症散结止痛贴膏提取物可有效降低MCF-7细胞中VEGF及Bcl-2 m RNA表达,优于对照组（P<0.05）,而两组间Caspease-3m RNA表达则表现为无差异（P>0.05）。12.细胞蛋白学检测部分:消症散结止痛贴膏提取物可有效降低MCF-7细胞中VEGF及Bcl-2 m RNA表达,优于对照组（P<0.05）,可显着升高Caspase-3,cleaved caspase-3蛋白表达,优于对照组（P<0.05）。结论:1.消症散结止痛贴膏中姜黄的主要活性成分姜黄素,其含量为2.85mg/g。藤黄酸不多于15.15mg/g。2.消症散结止痛贴膏可以显着降低荷瘤裸鼠一般情况,抑瘤率,破坏荷瘤组织癌细胞形态,增加荷瘤中结缔组织,减少荷瘤组织中微血管新生。3.消症散结止痛贴膏具有抑制乳腺增生、活血化瘀、抗慢性炎症镇痛及抗乳腺癌作用。4.消症散结止痛贴膏可显着减少荷瘤裸鼠荷瘤组织中VEGF,Bcl-2中m RNA和蛋白表达,升高Caspase-3 m RNA和蛋白表达,阻断血管生成信号的传导,达到治疗乳腺癌的目的。5.消症散结止痛贴膏提取物可显着可抑制MCF-7细胞中VEGF及Bcl-2的表达,促进Caspase-3,cleaved caspase-3表达,并可能是通过激活Caspase-3,诱导MCF-7细胞凋亡,防治乳腺癌。
李唯[4]（2021）在《A型低聚原花青素的检测、转化研究及应用》文中研究说明低聚原花青素是广泛存在于植物中的聚多酚类化合物,分为A型和B型两种构型:B型原花青素由单体间的碳碳单键连接而成,A型原花青素则通过碳碳单键和醚氧键双重连接,在自然界中较为少见。与B型不同,A型原花青素除具有极强的抗氧化活性、抗炎活性和保护心血管等生理功效外,还具有独特的抑制大肠杆菌等细菌黏附上皮细胞的功能,能够防治尿道感染。食品来源中A型原花青素主要见于蔓越莓及其制品,而蔓越莓仅产于北美、北欧及我国大兴安岭部分地区,产量有限,价格较高。利用莓类浆果中广泛存在的花色苷,通过对加工工艺及参数的精准调控,促使蓝靛果等原料中含有的花色苷在加工过程中转化生成A型原花青素,是一个既具有理论价值又具有良好应用前景的科学问题。本文在模拟体系中利用花色苷和表儿茶素转化形成A型原花青素二聚体,探索反应条件,研究反应机理,评价生理功效,建立优化了转化方法,并将成果应用到蓝靛果加工过程中,为富含花色苷的浆果的高值化利用提供新方法和新思路。主要研究结果如下:（1）制备不同结构的A型原花青素并建立检测方法。鉴于没有商品化的A型花色苷-表儿茶素纯品,以花色苷和表儿茶素为原料,通过亲核加成反应,转化生成五种A型花色苷-表儿茶素二聚体,产物经过Sephadex LH-20凝胶柱和半制备液相分离纯化,制得A型花色苷-表儿茶素二聚体纯品,采用基质辅助激光解析离子化-飞行时间质谱法鉴定其结构和纯度,确定其分别为A型Cy-Ec、Dpd-Ec、Cy-3glc-Ec、Cy-3gal-Ec和Pt-3rut（pC）-5glc-Ec,纯度大于95%。优化建立了超高效液相色谱-串联质谱法,能够在混合体系中同时定性定量检测五种A型原花青素二聚体,在最佳检测条件下,检测限为0.0265–0.0571 mg/L,回收率为85.32%–93.43%,精密度为8.74%–12.67%,该检测方法前处理简单,检测时间短,回收率和精密度均能满足分析要求。在五种常见的市售浆果浓缩汁中,只有蔓越莓浓缩汁中含有A型原花青素二聚体。（2）模拟条件下A型原花青素转化过程中关键因素和控制条件的确定和优化及其反应机理的研究。分别鉴定四种花浆果提取物中花色苷的组成,确定模拟体系的反应原料,建立成分简化的模拟A型原花青素的反应体系;通过对O2、pH值、反应温度、处理时间、原料浓度等多种因素的筛选,运用HPLC-MS手段确证产物中目标组分的存在,优化确定模拟体系中A型原花青素的最优反应条件。结果表明:蓝莓花色苷提取物和表儿茶素反应,生成A型Cy-Ec和Dpd-Ec,由两种脱糖苷产物花青素（矢车菊素和飞燕草素）和表儿茶素直接缩合形成的;蓝靛果提取物、黑果腺肋花楸提取物和黑枸杞提取物与表儿茶素反应,分别检测到A型Cy-3glc-Ec、Cy-3gal-Ec和Pt-3rut（pC）-5glc-Ec,由花色苷和表儿茶素发生直接亲核加成反应后生成。（3）探究高A型原花青素含量的蓝靛果浓缩汁的制备方法。通过优化表儿茶素添加量、pH值、真空度,选择低于模拟体系中的温度并延长浓缩时间,并监测A型原花青素、花色苷、多酚和5-HMF含量以及褐变指数的变化,制备高A型原花青素含量的蓝靛果果汁,最优制备条件为:表儿茶素添加量0.66 g/L,pH 2.8–3.1,真空度200 mbar,加热温度80℃,加热时间100 min。制备工艺实验规模扩大20倍后基本达到实验室工艺的A型原花青素产量。高A型原花青素含量的蓝靛果浓缩汁中的A型花色苷-表儿茶素二聚体为A型Cy-3-glc-Ec,含量为620.85±33.09 mg/L,显着高于市售蓝靛果浓缩汁,与蔓越莓浓缩汁中PAC-A2的含量没有显着性差异,但是总原花青素含量低于市售蔓越莓浓缩汁。高A型原花青素蓝靛浓缩汁中总花色苷、总酚、总黄酮、抗坏血酸含量与铁离子还原能力和氧化自由基吸收能力均高于蔓越莓浓缩汁。（4）评价A型花色苷-表儿茶素二聚体及高A型原花青素含量的蓝靛果浓缩汁体外防治尿道感染的功效。对比反应原料（花色苷和表儿茶素）,A型Cy-3glc-Ec、Cy-3gal-Ec和Pt-3rut（pC）-5glc-Ec能够在不影响大肠杆菌生长和细胞活性的低浓度范围（25、50、100、250和500μmol/L）显着影响大肠杆菌生物膜的形成,破坏成熟的大肠杆菌生物膜,抑制大肠杆菌对膀胱上皮细胞的粘附,与PAC-A2无显着性差异,并且能够降低大肠杆菌表面的疏水性,抑制大肠杆菌刺激下膀胱上皮细胞IL-8的分泌和NF-κB p65的诱导活性。同时,高A型原花青素含量的蓝靛果浓缩汁的防治尿道感染的能力显着高于普通市售蓝靛果浓缩汁,等同于蔓越莓浓缩汁。说明三种A型花色苷-表儿茶素二聚体和高A型原花青素含量的蓝靛果浓缩汁对防治尿道感染显示有较好的潜能。综上所述,本研究结果为A型原花青素的高效转化提供了新思路,为其在食品中的应用提供了理论依据;以蓝靛果果汁为原料开发富含A型原花青素的浓缩汁产品,为果蔬的综合加工和功能食品的开发提供了新的思路。
李金芝[5]（2021）在《鸡传染性贫血病病毒的分离鉴定、核酸定性标准样品的制备及抗体间接ELISA方法的建立与初步应用》文中研究说明鸡传染性贫血病病毒（Chicken infectious anaemia virus,CIAV）是鸡传染性贫血病的病原体。由于缺乏有效监测技术与防控措施,当前CIAV在世界各地的家禽养殖场普遍存在。CIAV感染可引起雏鸡再生障碍性贫血、免疫抑制和全身淋巴萎缩,继发感染,对全球养禽业造成了巨大的经济损失。为建立有效的CIAV检测技术,本研究在开展CIAV分离鉴定的基础上,制备了CIAV核酸定性标准样品,建立了基于多肽技术的检测CIAV抗体的间接ELISA方法,并对临床样品进行了初步应用。研究结果为分析CIAV流行变异和传播趋势提供了依据,为CIAV病毒核酸检测提供了定性标准样品以及为临床监测CIAV感染与免疫提供了自主产权的间接ELISA检测技术。1.鸡传染性贫血病病毒的分离鉴定以及JSP1906株的序列分析本研究对江苏地区养殖场内送检的疑似鸡传染性贫血病病毒（CIAV）感染的6份病料,通过接种MDCC-MSB1细胞传代以及PCR检测进行了病原分离与鉴定。PCR结果表明6份病料以及由MDCC-MSB1细胞扩增传代样品均能扩增出CIAV特异性条带。对其中送检鸽子组织样品中分离到的CIAV病毒CIAV-JSP1906全基因测序发现,CIAV-JSP1906基因组大小为2298 bp。将其与GenBank上26株国内外不同地区的CIAV毒株进行对比发现,CIAV-JSP1906与吉林株（JL14023）的同源性最高,与巴西株（KY02457）和日本株（TR20）的同源性最低。与其他毒株比较,虽然CIAV-JSP1906的VP2和VP3蛋白高度保守,但是其VP1第394位点为谷氨酰胺（Q）,表明CIAV-JSP1906具有高致病性。进一步分析发现CIAV-JSP1906在非编码区150 bp～245 bp之间有4个21 bp的DR序列和12 bp的插入,具有典型的CIAV基因型。CIAV-JSP1906的成功分离鉴定与全基因测序为深入研究CIAV跨物种传播的分子流行情况提供了参考。2.鸡传染性贫血病病毒核酸定性标准样品的制备为获得可用的CIAV核酸定性标准样品,本研究将2019年10月20日从江苏省泰州兴化市送检病料中分离到的一株鸡传染性贫血病病毒CIAV-TZC1910,进行病毒纯粹性鉴定,然后在MDCC-MSB1细胞上大量扩增,CIAV-TZC1910全基因大小为2298 bp。根据《鸡传染性贫血诊断技术》（NY/T 1187-2019）行业标准的推荐,本研究采用实时荧光定量PCR方法,以pcDNA3.1-VP1真核质粒为标准曲线检测CIAV病毒DNA拷贝数,确定CIAV最佳稀释度和最佳灭活条件。最后对灭活后的病毒悬液进行分装保存,进行无支原体和无菌检验后,同时对CIAV核酸定性标准样品TZC1910进行均一性、稳定性以及保存时间等的标定,结果表明所制备的CIAV核酸定性标准样品TZC1910符合标准。CIAV核酸定性标准样品的获得,解决了该病在检测中缺乏核酸定性标准样品的实际问题,规范了CIAV核酸检测技术。3.鸡传染性贫血病抗体间接ELISA方法的建立与初步应用本研究通过软件分析CIAV经典毒株序列CUX-1,选择CIAV-VP1序列中高度保护的抗原性和亲水性较高的3段多肽序列作为包被抗原,同时在制备CIAV阳性鸡血清的基础上,建立了检测CIAV抗体的间接ELISA检测方法。通过反应条件优化确定了ELISA最佳反应条件及检测临界值,并开展了特异性、重复性测定以及与IDEXX的ELISA试剂盒对临床样品进行了比较检测。特异性试验表明该ELISA方法不与所检测的REV、AIV-H5/H9、ILTV、IBV、NDV以及ALV-A/J/K等多抗血清反应,仅与所检测的CIAV阳性多抗血清反应。重复性试验表明该ELISA方法批内重复变异系数以及批间重复变异系数CV值均小于10%。对临床CIAV免疫鸡群样品进行比对,检测结果发现该ELISA方法和IDEXX试剂盒的阳性检出率分别为94%和80.4%,该ELISA方法与IDEXX试剂盒的总符合率73.2%。以上基于多肽的检测CIAV抗体的ELISA方法的建立为CIAV免疫鸡群及感染鸡群提供了一种快速简便的监测CIAV抗体的血清学检测方法。
陈绪龙[6]（2021）在《姜黄素过饱和自纳米乳给药体系的构建及其稳定化与增强吸收机制的研究》文中认为目的:自纳米乳给药系统在分散与消化过程产生的过饱和状态是热力学不稳定体系,沉淀的产生制约了该剂型的开发与利用。本文以水难溶性中药活性成分姜黄素（CUR）为模型,引入亲水性聚合物构建过饱和自纳米乳给药体系,提高药物吸收与生物利用度。通过对自纳米乳乳化过程中纳米乳溶液及其产生的沉淀进行全面表征并结合分子动力学模拟探讨聚合物维持药物过饱和机制,同时从离体肠道吸收、细胞摄取和活体药动学3个水平来阐明过饱和自纳米乳增强吸收的机制。方法:（1）姜黄素自纳米乳（CUR-SNEDDS）的制备及其体外分散评价:通过溶解度试验、油相和表面活性剂的配伍、表面活性剂乳化能力的考察及伪三元相图的绘制,筛选出处方组成,然后基于层次分析（AHP）法结合星点设计-效应面法优化CUR-SNEDDS处方。采用透射电镜、激光纳米粒度仪和秒表仪对CUR-SNEDDS乳化后乳滴形态、粒径与分散性、Zeta电位和乳化时间进行表征,并以人工胃肠液为分散体系,研究CUR-SNEDDS体外分散过饱和稳定性。（2）基于亲水性聚合物抑晶行为构建姜黄素过饱和自纳米乳给药体系:以CUR-SNEDDS为过饱和产生工具,通过体外分散实验,以晶体成核时间和晶体生长速率为指标,优选最佳沉淀抑制剂（PIs）,并以维持CUR过饱和浓度与时间曲线下面积（AUC）为指标优化PIs用量与处方载药量,构建姜黄素过饱和自纳米乳（CUR-SSNEDDS）并进行质量评价。（3）聚合物维持姜黄素过饱和稳定化机制研究:通过体外分散实验,系统评价CUR-SNEDDS及含有5%不同聚合物的CUR-SSNEDDS体外分散过程中溶液电导率、粘度、纳米乳质量稳定性及CUR平衡溶解度的变化,并利用X-射线粉末衍射（XRD）、差示扫描量热仪（DSC）、红外光谱（FT-IR）、拉曼光谱（Raman）及核磁共振氢谱（1H-NMR）对分散过程中沉淀进行表征,同时结合Gromacs2018程序对CUR与聚合物进行分子动力学模拟,初步阐明聚合物维持CUR过饱和机制。（4）姜黄素过饱和自纳米乳体外与体内评价:使用HPLC和激光纳米粒度仪考察CUR-SNEDDS、CUR-SSNEDDS（I和II）在不同p H环境下24 h内CUR稳定性,及其在25℃条件下储存三个月内处方载药量与纳米乳质量稳定性;通过体外溶出与消化实验比较CUR-SNEDDS及CUR-SSNEDDS-I和CUR-SSNEDDS-II体外溶出与消化行为的差异。采用大鼠离体肠道和活体药动学评价CUR-SNEDDS和CUR-SSNEDDS（I和II）肠吸收与生物利用度。（5）姜黄素过饱和自纳米乳吸收机制的研究:以Caco-2细胞为模型,选择不同细胞内吞及细胞内运输抑制剂,分别采用流式细胞仪（定量）和荧光显微镜（定性）研究CUR-SNEDDS、CUR-SSNEDDS-I和CUR-SSNEDDS-II细胞摄取途径。结果:（1）姜黄素自纳米乳（CUR-SNEDDS）处方组成为Capryol 90-Kolliphor RH 40-Transcutol HP（7.93︰66.71︰25.36）,最大载药量65 mg·g-1,呈黄色透明状,纳米乳滴呈圆球形,分布均匀,乳化时间（19.64±0.11）s,平均粒径（15.06±1.12）nm,多分散指数（PDI）（0.18±0.01）,Zeta电位（-7.41±0.52）m V。体外分散实验结果表明,随着载药量的提高,CUR过饱和度显着降低,晶体成核与生长速度加快,形成的纳米乳滴增大、粘连且分布不均。因此CUR-SNEDDS体外分散过饱状态和是热力学不稳定体系。（2）CUR-SNEDDS处方中引入不同聚合物,抑晶行为具有明显的规律性,HPMC和Soluplus在人工胃与肠液中均显着抑制药物晶体的成核与生长、HPMCAS和PVP仅在人工肠液中有抑晶作用,而PEG和HP-β-CD完全没有抑晶作用。同时聚合度亦会影响抑晶作用,HPMC聚合度越大,抑晶能力减弱（HPMC55-6>HPMC4000>HPMC15000）,而HPMCAS聚合度越大,抑晶能力越强（LG<MG≈HG）,最后优选出2%HPMC55-60和5%Soluplus分别作为沉淀抑制剂制备CUR-SSNEDDS-I和CUR-SSNEDDS-II,载药量均为100%。CUR-SSNEDDS-I和CUR-SSNEDDS-II水乳化后乳滴呈球形,粒径分布均匀,与CUR-SNEDDS相比,Zeta点位绝对值分别增大至（-17.87±1.42）m V和（-18.10±1.30）m V,说明纳米乳质量稳定。因此,引入HPMC55-60和Soluplus后,显着抑制晶体的成核与生长,从而维持CUR过饱和状态,提高了体系热力学稳定性。（3）CUR-SNEDDS及含有5%不同聚合物的CUR-SSNEDDS在乳化过程中,随着含水量比例增大,其体系中药物平衡溶解度、溶液粘度均显着下降。但与CUR-SNEDDS相比,HPMC55-60和Soluplus组药物平衡溶解度及其纳米乳质量稳定性均显着提高,同时HPMC55-60显着提高了体系的粘度。不同处方乳化过程中电导率曲线无显着性差异,说明聚合物不影响纳米乳结构转变,但HPMC55-60和Soluplus组乳化过程中产生的沉淀显着减少,且改变了沉淀形态,含有部分无定型形式。沉淀表征与分子动力学模拟结果均表明,CUR分别与HPMC55-60、Soluplus发生了分子间相互作用,形成了氢键且有π-π堆积效应。因此,HPMC55-60和Soluplus通过改变SNEDDS乳化过程中溶液体系的粘度、CUR溶解度及乳滴稳定性等物理特征,并与药物分子间形成氢键和π-π堆积效应,从而抑制CUR分子之间聚集,产生过饱和作用。（4）CUR-SNEDDS、CUR-SSNEDDS（I和II）在碱性生物介质中24 h内CUR不降解,且常温储藏3个月内处方载药量和纳米乳质量稳定。体外溶出过程中,三者均能显着提高了CUR溶出的速度与程度。体外消化过程中,CUR-SSNEDDS-I和CUR-SSNEDDS-II显着抑制了沉淀的形成,CUR在亲水相中比例分别提高了2.63和4.18倍,形成的纳米乳质量稳定性提高,其中Soluplus乳滴形态和粒径稳定且无显着增大。大鼠离体肠吸收结果表明,与CUR-SNEDDS相比,CUR-SSNEDDS-I组CUR在十二指肠、空肠、回肠和结肠段吸收明显增强,Papp分别提高了3.12、1.73、1.29和1.94倍,而CUR-SSNEDDS-II在十二指肠和空肠段吸收明显增大,Papp分别提高了1.67和1.63倍。大鼠活体药动学结果表明,SD大鼠灌胃给药后,与CUR-SNEDDS比较,CUR-SSNEDDS-I和CUR-SSNEDDS-II的Cmax分别提高了2.29和1.60倍,AUC0-t分别提高了3.50和1.92倍。因此,聚合物介导的过饱和体系显着改善了CUR稳定性、体外溶出与消化过饱和状态,从而促进药物吸收,提高生物利用度。（5）CUR-SNEDDS的细胞摄取受时间、浓度、温度及P-gp作用的影响,其主要摄取途径包括网格蛋白、小窝蛋白及动力蛋白介导的内吞、巨胞饮途径,同时依赖细胞内质网和高尔基体之间的传递、高尔基体向细胞膜的传递、微管蛋白途径在细胞内传输。与CUR-SNEDDS相比,CUR-SNEDDS-I和CUR-SSNEDDS-II细胞摄取率显着提高,细胞摄取不受P-糖蛋白调控,但均依赖肌动蛋白介导的微胞吞途径,在细胞内吞后细胞内传输均受溶酶体酸化途径的影响,其中CUR-SSNEDDS-II不依赖微管蛋白传递途径。因此,HPMC55-60和Soluplus构建的过饱和自纳米乳通过抑制P-糖蛋白作用、改变细胞内吞和胞内运输途径,从而提高了CUR的细胞摄取率。结论:基于HPMC55-60和Soluplus构建的CUR-SSNEDDS（I和II）,提高了CUR溶解度、稳定性、体外溶出、分散与消化稳定性,并在乳化过程中与CUR分子发生相互作用,形成氢键和π-π堆积效应、改变体系粘度、增溶、提高纳米乳质量稳定性,从而抑制CUR分子间聚集,维持过饱和状态。同时CUR-SSNEDDS抑制细胞膜上P-糖蛋白、改变细胞内吞与胞内传输途径,提高CUR细胞摄取率。因此,CUR-SSNEDDS通过提高CUR稳定性、过饱和稳定性、抑制P-糖蛋白及改变细胞内吞与胞内输运途径,从而增强药物吸收。
徐小轻[7]（2021）在《食源性干酪乳杆菌NA-2抑菌特性及其胞外多糖功效研究》文中进行了进一步梳理乳酸菌是常见的益生菌,具有抑制病原菌、调节肠道菌群、免疫和抗肿瘤等活性。乳酸菌分泌的胞外多糖也是具有多种功能活性的天然化合物,其功能活性有抗病原菌生物膜、抗氧化和免疫调节等。发酵蔬菜是一种酸性发酵食品,富含丰富的乳酸菌。本论文选择了东北传统的发酵蔬菜（酸菜）作为原材料,筛选出了一株新的产胞外多糖的乳酸杆菌,在评价了该乳酸杆菌的一些生理活性后,提取了该菌的胞外多糖,并对其物化性质、结构特征和生理功能做了一系列研究。产胞外多糖的乳酸菌菌落一般具有“拉丝”和“粘液”两种表型。本研究依据菌落表型特征从酸菜中发现了一株具有“粘液”表型的产胞外多糖乳酸杆菌。经过16S r DNA测序、进化分析和全基因组测序分析,确定该乳酸杆菌为干酪乳杆菌,并命名为干酪乳杆菌NA-2（Lactobacillus casei NA-2）。由体外耐酸耐胆盐评价结果可知,L.casei NA-2在p H为2～4的培养条件下,培养2 h时,存活率可达70%,且培养4 h后存活率仍高于50%,在含有0.03%～0.3%胆盐的培养基中培养2 h后,存活率可达90%,培养4 h时,存活率依然高达70%,具有较好的耐酸耐胆盐特性。将L.casei NA-2与蜡样芽孢杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7和金黄色葡萄球菌共培养24 h,结果表明,在L.casei NA-2生长不受影响的情况下,四种常见食源性病原菌的存活率均低于0.5%,甚至在共培养48 h后已检测不到某些存活的病原菌。通过扫描电子显微镜观察到共培养体系中的出现了L.casei NA-2和病原菌粘附在一起的现象。进一步将L.casei NA-2和四种病原菌等量混合后的菌液与Caco-2细胞共同培养,发现L.casei NA-2可以不同程度地抑制四种病原菌粘附Caco-2细胞,最高抑制率可达50%。本研究通过热水提取和乙醇沉淀的方法提取了附着在L.casei NA-2表面的胞外多糖,用TCA除去蛋白质后,进一步对所得L.casei NA-2胞外多糖进行了初步的结构分析。经红外光谱分析测定,可知该L.casei NA-2胞外多糖样品具有羟基和C-H等多糖的特征吸收峰;通过苯酚硫酸法和考马斯亮蓝法测定L.casei NA-2胞外多糖的总糖和蛋白含量分别为88%和0.28%;经硫酸酸解,TLC和HPLC测定,得出该胞外多糖是由鼠李糖、甘露糖和葡萄糖三种单糖组成的杂多糖,且三种单糖的摩尔比为24.3:1.0:42.9;采用HPLC测定L.casei NA-2胞外多糖分子量,可知其主要是由6.4×105 Da、2.0×105 Da和1.4×104Da三种分子量的多糖组成的混合物。通过荧光显色分析了L.casei NA-2胞外多糖抗生物膜活性,结果表明L.casei NA-2胞外多糖可以不同程度的抑制蜡样芽孢杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7和金黄色葡萄球菌生物膜的形成和分散四种病原菌已形成的生物膜,与L.casei NA-2抑制病原菌生长结果呈正相关。体外抗氧化的实验结果表明,L.casei NA-2胞外多糖具有清除羟基自由基、超氧自由基和DPPH的能力,且对超氧自由基的清除率显着高于抗坏血酸。L.casei NA-2胞外多糖处理RAW264.7巨噬细胞后,发现其至少可以通过调节NF-κB和JNK信号通路,上调细胞中ROS和TNF-α的产量,激活细胞免疫;L.casei NA-2胞外多糖与LPS叠加诱导细胞后,细胞中i NOS表达量降低,NO产量减少,表现出潜在的抗炎功能。
冯攀[8]（2021）在《微腔式芯片数字PCR体系构建及在肺癌基因突变检测中的初步应用》文中认为肺癌基因突变的检测与精准定量在肺癌的诊断及靶向治疗中起重要作用。数字PCR（Digital PCR,dPCR）以其直接绝对定量、高灵敏特异和无需标准曲线及校准品等特点,在背景复杂的样本中鉴定稀有突变及微小丰度差异方面具有无可比拟的优势。目前商业化的dPCR系统存在依赖精密昂贵仪器、检测成本高、芯片工艺复杂等缺点,还未能广泛应用于临床检测。因此,亟需开发一种操作较为简易、费用低廉、结果判定简单的基因突变检测新方法。最近,课题组与重庆大学合作研发了一种低挥发“自分配”的d PCR芯片,该芯片以聚二甲基硅氧烷（Polydimethylsiloxane,PDMS）为材料,具有成本低、制作简单的特点,能很好地完成绝对定量分析的检测目标。但前期研发的芯片仍存在依赖于商用d PCR试剂组分、微腔室数目较少、进样时间较长和油密封不充分等问题。因此,本研究拟构建一个自主经济的PCR扩增体系组分,并结合最近研发的新型十万目六边形微腔芯片（Novel 100,000 Hexagonal Microchamber Chip,NHMC）建立一种用于肺癌基因突变绝对定量的NHMC-dPCR平台,旨在为肺癌患者个性化治疗的用药指导、动态监测和非适用患者的排查提供更加简易、快速、经济的基因突变检测方法。【研究目的】构建可用于基因突变绝对定量分析的简易、经济、快速的微腔式芯片d PCR平台,为临床肿瘤患者基因突变检测提供新方法。【研究方法】1.肺癌EGFR基因突变扩增体系组分的设计和验证（1）根据EGFR G719S野生型和突变型序列设计实时荧光定量核酸扩增检测系统（Real-time Quantitative PCR Detecting System,q PCR）引物,并构建以p UC57为载体的含有目的序列的野生型质粒（p UC57-G719S W）和突变型质粒（p UC57-G719S M）。（2）采用锁核酸（Locked Nucleic Acid,LNA）和MGB双添加的Taq Man探针法根据EGFR G719S野生型和突变型序列筛选并合成相应的探针及引物;根据文献及前期实验基础在构建EGFR G719S突变扩增体系组分中添加适量比例的牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin,BSA）溶液,并分析所构建的野生型和突变型体系在芯片外进行q PCR的特异性、扩增效率、灵敏度及重复性。（3）以p UC57-G719S W和p UC57-G719S M为模板进行q PCR反应,优化其最佳参数,如退火温度、引物及探针的浓度。2.NHMC-d PCR平台的建立及在肺癌基因突变检测中的初步应用（1）结合前期芯片研究基础设计NHMC的图形化PDMS核心结构层的立体结构,并在NHMC的制备过程中添加适量比例的Triton X-100;将优化的EGFR G719S突变扩增体系组分应用于NHMC构建NHMC-d PCR检测平台,并在同等条件下与商用试剂进行比较。（2）根据L858R突变（EGFR突变）、KRAS codon12突变（KRAS密码子突变）和H19突变（长链非编码RNA突变）序列设计并合成相应的q PCR引物,并分别构建以p UC57为载体的含有以上目的序列的突变型质粒,作为待检测的干扰物质。（3）通过检测不同浓度梯度的EGFR G719S突变质粒、白蛋白标准液（血清主要物质）、L858R突变质粒、KRAS codon12突变质粒、H19突变质粒和以上物质的混合物,初步评估NHMC-d PCR平台的线性范围、特异性和抗干扰能力。（4）用NHMC-d PCR、DNA测序和液滴式数字PCR（Droplet Digital PCR,dd PCR）三种方法分别检测6例含有EGFR G719X突变（扩增阻滞突变系统测出）的肺癌组织标本,比较三种方法在临床样本检测中的一致性。【研究结果】1.肺癌EGFR基因突变扩增体系组分的设计和验证（1）根据EGFR G719S野生型和突变型序列设计合成了q PCR引物,并构建了p UC57-G719S W和p UC57-G719S M。（2）采用LNA和MGB双添加的Taq Man探针法设计的EGFR G719S野生型和突变型扩增体系组分特异性高、重复性好。在野生型体系中,p UC57-G719S W的标准曲线扩增效率为97%,而p UC57-G719S M为阴性;在突变型体系中,p UC57-G719S M的标准曲线扩增效率为94.18%,而p UC57-G719S W为阴性;构建的EGFR G719S扩增体系在芯片外进行q PCR的灵敏度为11 copies/μL。（3）EGFR G719S突变扩增体系优化后的最佳参数为:退火温度为56℃,引物及探针的浓度分别为0.9μmol/L和0.5μmol/L。2.NHMC-d PCR平台的建立及在肺癌基因突变检测中的初步应用（1）六棱柱空腔的设计使腔室数量提高至113 137,进样时间减少至5～30 s;除去制作芯片的时间,整个检测过程仅需1.5 h左右。并且进样管道设计的改变解决了由于PDMS真空作用不够导致的油密封不充分的问题。（2）在扩增体系组分中增添合适体积BSA同时在NHMC的配制过程中添加适当比例Triton X-100后,自主构建的EGFR G719S突变扩增体系在NHMC中的应用取得了与商用试剂在NHMC中扩增的同等效果,降低了试剂成本。（3）构建并鉴定了含有目的序列的L858R突变型质粒、KRAS codon12突变型质粒及H19突变质粒。（4）NHMC-d PCR检测EGFR G719S突变的线性范围为3.01×100～3.01×107copies/μL;检测值与期望值的线性方程为Y=0.725X-0.581,线性相关性R2=0.984。NHMC-d PCR检测白蛋白标准液、L858R突变质粒、KRAS codon12突变质粒和H19突变质粒4种干扰物均未发现阳性拷贝,检测G719S突变和其与4种干扰物混合的结果分别为23 194.4 copies和22 095.7 copies。（5）NHMC-d PCR、dd PCR和DNA测序三种方法检测6例临床样本的定性结果符合率为100%,其中2例由NHMC-d PCR定量的结果为1 822.4 copies和451.7 copies,其对应由dd PCR定量的结果为1 581.8 copies和218.3 copies。【结论】本研究建立的NHMC-d PCR平台在EGFR G719S突变检测中具有成本低、检测时间较短、操作简单、特异性好等优点,可用于肺癌基因突变的绝对定量分析。
贾鹏禹[9]（2021）在《植物激素与品质高效检测方法的建立及其在大豆中的应用》文中认为植物激素是作物生长和种子品质形成的重要生命调节物质,种子品质的形成是不同生长历程的最终反馈。调研发现,现行植物激素和品质检测方法很难满足深层次研究需求,大豆植物激素随不同时空、不同胁迫和化学调控的变化规律尚不明确,大豆中重要的品质化合物受化学调控变化研究尚有不足,因此新方法建立及其应用具有重要意义。本研究以提升检测方法为基础,以目标化合物的变化规律为方法应用目标,在生理方面建立了高效经济的植物激素检测方法,在品质方面建立了快速有效的脂肪酸和植物甾醇测定方法,考察了不同测试方法的检测效果;以黑龙江主栽品种合丰50和垦丰16为研究对象对方法进行了应用,揭示了植物激素含量的时空变化、胁迫变化和化学调控变化规律,探讨了烯效唑调控对大豆脂肪酸和植物甾醇品质形成的影响。主要研究结果和结论如下:1.比较了不同检测方法对4种植物激素（ZT、IAA、GA3和ABA）检测的方法学能力。结果表明,超快速液相色谱较高效液相色谱法的分离速度快、灵敏度高,但受检测器灵敏度的限制,样品基体干扰较大;三甲基重氮甲烷衍生结合气质联用具有方法适用性,但仅适用于含羧酸基团的目标化合物;采用液质联用方法灵敏度得到进一步提高,但样品前处理操作步骤较为繁琐,检测效率受样品前处理影响较大;在线固相萃取方法自动化能力强,检测限在0.20 ng/m L～1.01 ng/m L之间,重复性相对标准偏差在2.54%～4.83%之间,但方法有设备依赖性。2.创建了基于超高效液相色谱-质谱联用的高效经济检测方法。采用真空冷冻干燥技术处理样品,超声波辅助溶剂提取目标化合物,改进的Qu ECh ERS方法净化基体,色谱分离采用Phenomenex Kinetex F5色谱柱（50 mm×3.0 mm ID,2.6μm,100?）,以甲酸/水体系梯度洗脱目标组分,质谱检测器采用正负同时扫描MRM模式。该方法4种植物激素在3 min内完成分离,各目标组分在0.1 ng/m L～100 ng/m L浓度范围内呈现良好的线性关系,方法检测限在0.015 ng/m L～0.078 ng/m L之间,相对标准偏差在0.16%～0.25%之间。方法样品前处理简便经济,检测效率高,样品用量少。3.基于气相色谱结合高压转印样品前处理方式建立了大豆中脂肪酸组成的快速测定方法,采用介质阻挡放电氦等离子体结合短柱恒压分离模式以提升方法的灵敏度、分离效果和分析效率。大豆样品中10种脂肪酸组分在30 min完成高分辨率检测,各目标化合物检测限在0.105μg/m L～0.196μg/m L之间,相对标准偏差在1.04%～1.35%之间。方法所需样品量小,化学试剂消耗少,样品前处理简单快速,测定结果重现性好。4.基于气相色谱-质谱联用建立了大豆中植物甾醇含量的快速测定方法,样品中目标物采用异辛烷萃取,氢氧化钾-乙醇-水体系超声波辅助皂化脂肪,萃取物无需硅烷化衍生直接上机分析。大豆样品中4种植物甾醇检测灵敏度在0.098μg/m L～0.206μg/m L之间,相对标准偏差在1.16%～1.97%之间。所建方法样品前处理简单快速,无需衍生化处理,能够精确测定植物甾醇含量。5.采用新方法对大豆植物激素进行了时空变化、胁迫变化和化学调控变化规律考察。结果表明,大豆植物激素在日间发生快速和系统性变化,受光温变化敏感;不同植物激素在不同生长时期呈现其独有的时空特性,含量水平随生理部位和个体存在差异;在受到逆境胁迫后,植物激素的平衡被快速打破,不论是低温还是干旱胁迫,促进型植物激素和抑制型植物激素基本表现为相反的变化趋势,其中促进型植物激素含量普遍降低;在烯效唑对大豆生长的调控中,烯效唑发挥延缓作用的关键植物激素是赤霉素和生长素,其调控机制相当于对植物的一种定向胁迫,通过外源生长素和赤霉素可快速解除烯效唑的药效。6.对初花期喷施烯效唑对大豆脂肪酸和植物甾醇品质影响进行了考察。结果表明,烯效唑对不同品种大豆脂肪酸和植物甾醇组成均产生了显着影响。在脂肪酸组成方面,外源烯效唑降低了大豆多不饱和脂肪酸的含量,烯效唑的调控过程可能参与了脂肪的降解;在植物甾醇含量变化方面,烯效唑的调控显着降低了不同品种大豆中菜油甾醇、豆甾醇和谷甾醇的含量,对不同含油品种的植物甾醇影响略有差异,表现为对高油品种的影响偏弱。烯效唑对品质形成的影响小于品种基因,对大豆生产具有安全性。综合以上结果,本研究通过技术集成创新建立了植物激素、脂肪酸和植物甾醇高效检测方法,利用新方法的技术优势深入揭示了大豆生长发育和化学调控中植物激素与品质变化规律,为大豆栽培研究提供了新的方法策略和规律认知。
魏真妮[10]（2021）在《柯萨奇病毒A组4型小鼠主动免疫保护模型的建立及候选疫苗体内效力评估》文中进行了进一步梳理手足口病（HFMD）是一种在全球流行比较广泛的疾病。主要病原体包括柯萨奇病毒（Coxsackievirus）A组的2、4、5、6、7、9、10、16以及EV-A71,B组的1、2、3、4、5和埃可病毒等。自2012年以来,我国由非EV-A71和非CV-A16的其他肠道病毒感染所引起的HFMD的爆发越来越多。在湖南、广州、北京、福州和山东等省市超过50%,有些地区达到了80%。2017年EV-A71疫苗上市后,重症和死亡病例明显降低,但发病人数并未显着降低。为了降低HFMD的发病率,研发多价HFMD疫苗是非常有必要的。CV-A4病毒自首次分离以来,在全球多个国家和地区均出现了流行。在中国台湾出现了两次CV-A4的大流行;在2012-2013湖北武汉占比13.9%,是HFMD第四大病原体;在2011-2015年福建省,CV-A4在非EV-A71、非CV-A16病原体中占6.8%,排名第三;在2012年宁德地区,CV-A4是最主要病原,占比15.1%;2012年江苏省余愉县,占比例为16%,排名第二。在福建、云南、广州等多地出现了由CV-A4导致的重症。另出现了CV-A4与其他多种血清型之间重组现象,这可能导致更严重的HFMD流行。研发CV-A4单价疫苗或者包含CV-A4在内的多价HFMD疫苗对于HFMD的预防和控制非常重要。此外,建立合适的CV-A4小鼠模型,对于CV-A4的致病机理研究以及候选疫苗体内效力评价极其重要。为了制备CV-A4相关检测性抗体。本研究表达了CV-A4的VP1结构蛋白,然后将CV-A4的VP1和全病毒颗粒分别免疫日本大耳白兔,获得了特异性良好的Rb-α-VP1、Rb-α-virion,为病毒鉴定及抗原的定性定量分析提供了试剂。本研究将CV-A4病毒RD细胞分离株在小鼠鼠脑和RD细胞交替传代,经过多次反复交替传代适应获得致死14日龄小鼠的CV-A4-M14-RP3,该病毒株可通过腹腔、口服和颅内三种途径感染昆明鼠。挑取8个克隆株比较了小鼠的体内毒力,获得了强毒株CV-A4-M14-613131,弱毒株CV-A4-M14-623131。对两个毒株的全基因组序列进行比对发现有8个核苷酸存在差异,其中有4个核苷酸差异导致了氨基酸的差异,可能与病毒毒力有关,分别为VP1-T2778G/D112E、3D-C5973G/I3M、3D-T7175A/W404R和3D-A7181G/K406R。通过细胞工厂培养的方式制备了攻毒库,并测定了LD50。本研究通过高感染复数传代的方式将CV-A4从RD细胞适应至Vero细胞,筛选适合作为疫苗候选株的克隆株。并在体外人工合成CV-A4疫苗候选株的全基因组序列,连接到p BR322质粒,构建CV-A4感染性c DNA克隆,通过T7体外转录试剂盒,获得CV-A4全长RNA,成功转染了Vero细胞,获得了无RD细胞遗传背景的CV-A4疫苗候选株。通过比对CV-A4 RD细胞分离株和Vero适应株的全基因组序列,发现RD细胞分离株和Vero适应株序列存在几处不同,其中同义突变的核苷酸对应位置分别为VP2-C1144T和2C-C4783T;错义突变的核苷酸和氨基酸及位置分别为:VP2-G1361A-A1362G/E137R;VP3-A2417G/I233V;VP1-G2930T/D164Y;VP1-A3354G/H305R;3D-A7322C/M454L,这些位点改变可能与细胞嗜性相关。培养病毒,纯化后得到CV-A4的空心颗粒（EP）以及实心颗粒（FP）。通过TEM、SDS-PAGE和WB对纯化的病毒颗粒的形态、纯度和特异性进行了鉴定,分别以CV-A4 EP、CV-A4 FP、CV-A4 EP+FP（EP=19.23%,FP=80.77%）、CV-A4 VLP为抗原,加入铝佐剂（终浓度为1.05 mg/m L）,制备成候选疫苗。分别以0.5μg、1.5μg、4.5μg剂量,在0和14天免疫小鼠,检测各时期血清中和抗体滴度。结果显示4种抗原均可诱导产生较高水平中和抗体,CV-A4 FP和CV-A4 EP+FP免疫原性结果无显着性差异,均优于CV-A4 EP和CV-A4 VLP。CV-A4 EP、CV-A4 FP和CV-A4 EP+FP的免疫持久性良好,均优于CV-A4 VLP。各种抗原出现明显的剂量效应和剂次效应,1.5μg为较为合适的剂量。本课题还研究了T细胞介导的免疫应答,在小鼠血清中、PBS、佐剂对照组和候选疫苗组之间活细胞中CD4+和CD8+T细胞、细胞因子无显着差异。但抗原对免疫后的肾脏细胞再刺激后,由CD4+和CD8+T细胞分泌的几种细胞因子和趋化因子的水平显着升高,表明CV-A4候选疫苗接种小鼠后,刺激特异性T细胞免疫应答。诱导体液免疫和细胞免疫（触发Th1和Th2免疫反应）,能够活化B细胞,然后分泌抗体,刺激T细胞增殖。并能产生记忆细胞,经再次刺激后,记忆细胞迅速反应,分泌各种炎性因子。最后,评估了CV-A4单价灭活疫苗的体内效力。结果显示CV-A4 FP和CV-A4EP+FP两种疫苗可以有效诱导机体产生高水平的中和抗体,能够完全抵御CV-A4病毒的致死攻击,保护率达到100%。CV-A4 VLP制备的疫苗保护率为60%。免疫组化、组织病理切片和各组织器官病毒载量结果显示CV-A4 FP和CV-A4 EP+FP制备的疫苗对小鼠的保护作用机理,疫苗接种及攻毒后的安全性良好,且保护作用优于CV-A4VLP。本课题成功制备了CV-A4候选疫苗,建立了CV-A4主动免疫保护评价模型,并使用主动免疫保护模型评价了CV-A4候选疫苗的体内效力。结果显示,CV-A4候选疫苗对小鼠有较好的保护作用。本研究为CV-A4单价疫苗或者手足口病多价疫苗的研发建立了方法、奠定了基础,具有重大意义。
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本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略表 |
| 文献综述 |
| 1.前言 |
| 2.软骨组织的类型及结构 |
| 3.现有的软骨修复策略 |
| 4.MSC在软骨修复组织工程中的应用 |
| 5.MSC分泌体检测的研究进展 |
| 6.不同预处理得到CM中分泌体的差异 |
| 7.MSCs分泌体在软骨修复中的机制 |
| 8.总结 |
| 第一章 骨髓间充质干细胞来源的外泌体、微泡和可溶性蛋白在骨关节炎下的软骨保护作用和治疗效果 |
| 1.前言 |
| 2.实验材料与仪器 |
| 2.1 实验细胞 |
| 2.2 实验试剂 |
| 2.3 实验仪器耗材 |
| 3.实验方法 |
| 3.1 SD大鼠骨髓间充质干细胞培养 |
| 3.2 条件培养基收集 |
| 3.3 条件培养基内微泡、外泌体、分泌蛋白的分离、收集 |
| 3.4 MVs及 Exos的表征鉴定 |
| 3.5 SD大鼠软骨细胞提取 |
| 3.6 微泡、外泌体、分泌蛋白处理软骨细胞 |
| 3.7 软骨细胞的免疫荧光检测 |
| 3.8 软骨细胞的Western Blot检测 |
| 3.9 软骨细胞的PCR检测 |
| 3.10 SPs细胞因子检测 |
| 3.11 动物实验 |
| 3.12 数据统计 |
| 4.结果 |
| 4.1 大鼠骨髓间充质干细胞来源CM中 Exos和 MVs的鉴定 |
| 4.2 Exos、MVs和 SPs对软骨细胞形态影响的镜下观察 |
| 4.3 Exos、MVs和 SPs对软骨细胞软骨标志物影响的免疫荧光检测 |
| 4.4 Exos、MVs和 SPs对软骨细胞软骨标志物影响的RT-PCR和 WB检测 |
| 4.5 SPs的细胞因子检测分析 |
| 4.6 Exos、MVs、SPs对大鼠ACLT模型膝关节软骨影响的大体观察 |
| 4.7 Exos、MVs、SPs对大鼠ACLT模型膝关节软骨影响的组织学染色 |
| 4.8 Exos、MVs、SPs对大鼠ACLT模型膝关节软骨影响的免疫组化染色 |
| 5.讨论 |
| 6.小结 |
| 第二章 2D及/不同孔径3D支架培养条件下脂肪间充质干细胞来源分泌蛋白的蛋白质组学研究 |
| 1.前言 |
| 2.实验材料与仪器 |
| 2.1 实验细胞 |
| 2.2 实验试剂 |
| 2.3 实验仪器耗材 |
| 3.实验方法 |
| 3.1 CM对软骨细胞表型的影响 |
| 3.2 CM中SPs的蛋白组学研究 |
| 3.3 差异兴趣蛋白的功能验证 |
| 4.结果 |
| 4.1 BMSCs和 ADSCs在不同2D/3D条件下培养所得CM对软骨细胞表型的影响 |
| 4.2 CM中SPs的蛋白质组学结果 |
| 4.3 差异表达蛋白CAPNS1、LAL、MAT2A和 RCN2 与软骨细胞表型的相关性 |
| 5.讨论 |
| 6.小结 |
| 第三章 RCN2 通过NFAT信号通路抑制软骨基质降解 |
| 1.前言 |
| 2.实验材料与仪器 |
| 2.1 实验试剂 |
| 2.2 实验仪器及耗材 |
| 3.实验方法 |
| 3.1 原代细胞提取 |
| 3.2 敲低和过表达RCN2 细胞系构建 |
| 3.3 数据统计 |
| 4.结果 |
| 4.1 构建稳定的敲低和过表达RCN2 细胞系 |
| 4.2 RCN2 对软骨基质合成代谢的影响 |
| 4.3 RCN2 对软骨细胞NFAT信号通路的影响 |
| 5.讨论 |
| 6.小结 |
| 第四章 全文总结 |
| 1.结论 |
| 2.创新点 |
| 3.展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录A 攻读博士学位期间发表的学术论文与研究成果奖励 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要符号说明 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 酸性成纤维细胞生长因子的研究 |
| 1.1.1 FGF1 概述 |
| 1.1.2 FGF1 结构及特点 |
| 1.1.3 FGF1 主要生物活性 |
| 1.2 中药黄芩主要成分及药理作用研究 |
| 1.2.1 黄芩主要化学成分 |
| 1.2.2 黄芩主要药理作用 |
| 1.3 中药活性成分协同作用研究 |
| 1.3.1 协同作用研究的意义 |
| 1.3.2 中药活性成分研究的意义 |
| 1.3.3 中药活性成分的筛选方法 |
| 1.3.4 多室电泳筛选技术用于中药活性成分筛选 |
| 1.4 PI3K/AKT/MTOR信号通路研究 |
| 1.4.1 PI3K/AKT/mTOR信号通路 |
| 1.4.2 FGF1 激活的PI3K/AKT/mTOR信号通路 |
| 1.5 本课题的研究思路 |
| 1.5.1 建立FGF1多室电泳技术体系,筛选黄芩中与其结合的组分 |
| 1.5.2 细胞试验探究FGF1-黄芩组分协同作用效果评价 |
| 1.5.3 黄芩组分-FGF1 协同作用分子机制探究 |
| 第二章 材料与仪器 |
| 2.1 药材与试剂 |
| 2.2 主要仪器与设备 |
| 2.3 多室电泳筛选技术装置 |
| 第三章 实验方法 |
| 3.1 FGF1 迁移率的优化 |
| 3.1.1 缓冲溶液的选择 |
| 3.1.2 滤膜的选择 |
| 3.1.3 缓冲溶液pH的优化 |
| 3.1.4 施加电泳电压的优化 |
| 3.1.5 电泳时间的优化 |
| 3.2 黄芩提取液成分检测 |
| 3.2.1 黄芩提取液的制备 |
| 3.2.2 高效液相色谱串联质谱条件确立 |
| 3.3 黄芩提取液中与FGF1 结合活性成分的筛选 |
| 3.3.1 结合活性成分的筛选及初步定性 |
| 3.3.2 标准品定性活性成分 |
| 3.3.3 活性成分的验证 |
| 3.3.4 定量分析活性成分 |
| 3.4 分子对接模拟活性成分与FGF1 结合位点 |
| 3.5 黄芩组分与FGF1 协同给药对NIH3T3 细胞增殖作用的影响 |
| 3.5.1 小鼠成纤维NIH3T3 细胞培养 |
| 3.5.2 黄芩组分对NIH3T3 细胞给药浓度筛选 |
| 3.5.3 FGF1对NIH3T3 细胞给药浓度筛选 |
| 3.5.4 活性成分与FGF1 协同给药对NIH3T3 细胞增殖的影响 |
| 3.5.5 不同协同比例对NIH3T3 细胞增殖作用的影响 |
| 3.6 活性成分与FGF1 协同给药对NIH3T3 细胞胶原蛋白合成的影响 |
| 3.6.1 细胞分组 |
| 3.6.2 ELISA法测定细胞中胶原蛋白的表达水平 |
| 3.7 黄芩组分与FGF1 协同给药对NIH3T3 细胞迁移的影响 |
| 3.7.1 细胞分组 |
| 3.7.2 平板划痕实验检测NIH3T3 细胞迁移 |
| 3.8 黄芩组分与FGF1协同给药对PI3K/AKT/mTOR mRNA表达水平的影响 |
| 3.8.1 细胞给药分组 |
| 3.8.2 引物设计 |
| 3.8.3 qRT-PCR法检测PI3K/AKT/mTOR mRNA表达水平 |
| 3.9 活性成分与FGF1协同给药对PI3K/AKT/mTOR蛋白表达水平的影响 |
| 3.9.1 细胞给药分组 |
| 3.9.2 提取总蛋白 |
| 3.9.3 BCA法测定蛋白浓度 |
| 3.9.4 Western blotting检测蛋白表达 |
| 3.10 统计分析 |
| 第四章 结果分析 |
| 4.1 FGF1 迁移率的优化 |
| 4.1.1 电泳时间的优化 |
| 4.1.2 缓冲溶液pH的优化 |
| 4.1.3 电泳电压的选择 |
| 4.2 黄芩提取液成分检测 |
| 4.3 黄芩提取液中与FGF1 结合活性成分的筛选 |
| 4.3.1 结合活性成分的筛选 |
| 4.3.2 结合活性成分的初步定性 |
| 4.3.3 标准品定性活性成分 |
| 4.3.4 六种化合物验证潜在活性成分 |
| 4.3.5 定量分析活性成分 |
| 4.4 分子对接模拟活性成分与FGF1 结合位点 |
| 4.5 活性成分与FGF1 协同给药对NIH3T3 增殖作用的影响 |
| 4.5.1 活性成分对NIH3T3 细胞给药浓度筛选 |
| 4.5.2 FGF1对NIH3T3 细胞给药浓度筛选 |
| 4.5.3 活性成分与FGF1 协同给药对NIH3T3 细胞增殖的影响 |
| 4.5.4 不同协同比例对NIH3T3 细胞增殖作用的影响 |
| 4.6 活性成分与FGF1 协同给药对NIH3T3 细胞胶原蛋白合成的影响 |
| 4.7 活性成分与FGF1 协同给药对NIH3T3 细胞迁移的影响 |
| 4.8 活性成分与FGF1协同给药对PI3K/AKT/mTOR mRNA表达水平的影响 |
| 4.9 活性成分与FGF1协同给药对PI3K/AKT/mTOR蛋白表达水平的影响 |
| 第五章 讨论与结论 |
| 5.1 讨论 |
| 5.1.1 应用多室电泳筛选技术筛选黄芩中与FGF1 结合成分 |
| 5.1.2 协同作用效果评价 |
| 5.1.3 基于PI3K/AKT/mTOR信号通路探究协同作用机制 |
| 5.2 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 乳腺癌病名源流 |
| 2 乳腺癌的研究现状 |
| 2.1 中医学对乳腺癌的认识 |
| 2.2 现代医学对乳腺癌的认识 |
| 3 消症散结止痛贴膏的概述 |
| 3.1 消症散结止痛贴膏的组成 |
| 3.2 消症散结止痛贴膏各药物的成分、药理作用及抗癌的作用机制 |
| 4 中药透皮贴剂的现状 |
| 第二章 消症散结止痛贴膏质量控制及经皮渗透特性研究 |
| 第一节 消症散结止痛贴膏质量控制研究 |
| 1 实验仪器及材料 |
| 1.1 实验仪器 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验试药 |
| 2 消症散结止痛贴膏检查 |
| 2.1 性状 |
| 2.2 含膏量测定 |
| 2.3 初黏力测定 |
| 2.4 赋形性 |
| 2.5 重量差异检查 |
| 3 定性鉴别 |
| 3.1 显微鉴别 |
| 3.2 薄层鉴别 |
| 4 含量测定 |
| 4.1 消症散结止痛贴膏中藤黄酸的限量检查 |
| 4.2 消症散结止痛贴膏中姜黄素的含量测定 |
| 5 讨论 |
| 5.1 显微鉴别 |
| 5.2 薄层鉴别 |
| 5.3 含量测定 |
| 第二节 消症散结止痛贴膏经皮渗透特性研究 |
| 1 实验仪器及材料 |
| 1.1 实验仪器 |
| 1.2 实验材料 |
| 1.3 实验动物 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 透皮吸收分析方法的建立 |
| 2.2 透皮吸收实验 |
| 2.3 透皮吸收累积渗透量测定 |
| 2.4 透皮吸收模型拟合 |
| 3 讨论 |
| 第三章 消症散结止痛贴膏化学成分定性研究 |
| 1 实验仪器与材料 |
| 1.1 实验仪器 |
| 1.2 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 供试品溶液的制备 |
| 2.2 色谱条件 |
| 2.3 质谱条件 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 不同扫描模式对质谱分析结果的影响 |
| 3.2 不同提取溶剂对质谱分析结果的影响 |
| 3.3 消症散结止痛贴膏化学成分分析 |
| 4 讨论 |
| 第四章 消症散结止痛贴膏的药效学研究 |
| 第一节 消症散结止痛贴膏的抗乳腺癌作用 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验仪器 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 实验药物及试剂 |
| 2 方法与结果 |
| 2.1 实验动物造模、分组及干预 |
| 2.2 取材及样品处理 |
| 2.3 HE染色并观察 |
| 2.4 免疫组化法检测CD34 |
| 2.5 Realtime PCR方法检测组织中VEGF,Bcl-2和Caspase-3mRNA表达 |
| 2.6 Westernblot方法检测组织中VEGF,Bcl-2和Caspase-3蛋白表达 |
| 3 统计学处理 |
| 4 实验结果 |
| 4.1 裸鼠的一般状态观察 |
| 4.2 裸鼠肿瘤体积、体重 、瘤重 、抑瘤率 |
| 4.3 各组裸鼠肿瘤光镜下病理学改变 |
| 4.4 药物对肿瘤组织密度的影响 |
| 4.5 各组 裸鼠荷瘤组 织中VEGF,Bcl-2,Caspase-3 mRNA表达 |
| 4.6 各组 裸鼠荷瘤组 织中VEGF,Bcl-2,Caspase-3蛋白表达 |
| 5 讨论 |
| 第二节 消症散结止痛贴膏的活血化瘀作用 |
| 1 实验材料与动物 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验药品 |
| 1.3 实验材料 |
| 2 实验方法及结果 |
| 2.1 对实验性血瘀大鼠血液流变性的影响 |
| 2.2 对正常小鼠耳部微循环的影响 |
| 3 讨论 |
| 第三节 消症散结止痛贴膏的抗炎镇痛作用 |
| 1 实验材料与动物 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验药品 |
| 1.3 实验材料 |
| 2 实验方法和结果 |
| 2.1 对大鼠皮下棉球肉芽肿重量的影响 |
| 2.2 对大鼠皮下琼脂肉芽肿重量的影响 |
| 2.3 对电刺激致小鼠疼痛反应的影响(鼠尾刺激法) |
| 2.4 对热刺激致小鼠疼痛反应的影响(热板法) |
| 3 讨论 |
| 第四节 消症散结止痛贴膏对乳腺增生的影响 |
| 1 实验材料与动物 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验药品 |
| 1.3 实验材料及仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 对雌二醇致大鼠乳腺增生的的影响 |
| 2.2 对雌二醇致家兔乳腺增生的的影响 |
| 3 统计学分析 |
| 4 实验结果 |
| 4.1 对雌二醇致大鼠乳腺增生的的影响 |
| 4.2 对雌二醇致家兔乳腺增生的的影响 |
| 5 讨论 |
| 第五章 消症散结止痛贴膏抑制MCF-7 细胞的作用机制研究 |
| 第一节 对MCF-7细胞VEGFmRNA表达的影响 |
| 1 实验材料与仪器 |
| 1.1 细胞株 |
| 1.2 实验材料与试剂 |
| 1.3 实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 提取物溶液制备 |
| 2.3 对乳腺癌MCF-7 细胞活性的影响 |
| 2.4 细胞分组与干预 |
| 2.5 Real-Time PCR检测MCF-7细胞中VEGF,Bcl-2,Caspase-3mRNA表达 |
| 3 统计学处理 |
| 4 实验结果 |
| 4.1 MTT比色法检测消症散结止痛贴膏提取物对细胞増殖的影响 |
| 4.2 光镜下观察细胞生长 |
| 4.3 对MCF-7细胞中Bcl-2、Caspease-3及VEGF mRNA表达量的影响 |
| 5 讨论 |
| 第二节 蛋白免疫印迹法检测VEGF及凋亡相关蛋白的表达 |
| 1 实验材料与仪器 |
| 1.1 细胞株 |
| 1.2 实验试剂与材料 |
| 1.3 实验仪器 |
| 1.4 试剂的配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 消症散结止痛贴膏提取物溶液制备 |
| 2.3 细胞分组与干预 |
| 2.4 Westerblot方法检测MCF中 VEGF、Bax、Caspase-3和cleaved/caspase-3蛋白表达 |
| 3 统计学分析 |
| 4 实验结果 |
| 4.1 消症散结止痛贴膏提取物对MCF-7细胞VEGF蛋白表达的影响 |
| 4.2 消症散结止痛贴膏提取物对MCF-7细胞Bcl-2/Bax蛋白表达的影响 |
| 4.3 消症散结止痛贴膏提取物对MCF-7细胞Caspase-3/cleavedcaspase-3蛋白表达的影响 |
| 5 讨论 |
| 全文总结 |
| 本文特色与创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
| 个人简历 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩写符号说明 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 原花青素与A型原花青素 |
| 1.1.1 原花青素的结构和来源 |
| 1.1.2 原花青素的分离纯化方法 |
| 1.1.3 原花青素的检测 |
| 1.2 生理功能研究 |
| 1.2.1 原花青素(A/B型)的生理功能 |
| 1.2.2 A型原花青素独特的生理功能 |
| 1.3 A型原花青素转化的方法 |
| 1.3.1 氧化B型原花青素转化为A型原花青素 |
| 1.3.2 花色苷和黄烷醇发生亲核加成反应形成A型原花青素 |
| 1.3.3 微波辅助反应生成A型原花青素类似物 |
| 1.4 浆果及其加工 |
| 1.4.1 浆果 |
| 1.4.2 浆果中的营养成分 |
| 1.4.3 浆果加工现状 |
| 1.5 立题背景及意义 |
| 1.6 研究内容 |
| 第二章 A型原花青素的制备、表征和检测方法的建立 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料和仪器 |
| 2.2.1 材料与试剂 |
| 2.2.2 主要仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 A型原花青素的制备 |
| 2.3.2 A型原花青素二聚体的分离纯化 |
| 2.3.3 硫解实验 |
| 2.3.4 基质辅助激光解析离子化-飞行时间质谱法鉴定A型原花青素的结构 |
| 2.3.5 超高效液相色谱-三重四级杆质谱检测A型原花青素方法的建立 |
| 2.3.6 方法的可靠性分析 |
| 2.3.7 浓缩汁中A型原花青素二聚体的检测 |
| 2.3.8 数据分析 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 A型原花青素的制备与纯化 |
| 2.4.2 A型原花青素的鉴定 |
| 2.4.3 超高效液相色谱-串联质谱法定量检测A型原花青素方法的建立 |
| 2.4.4 方法学验证 |
| 2.4.5 浆果浓缩汁中A型原花青素二聚体的检测 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 模拟条件下A型原花青素转化的关键因素及控制条件的确定和优化 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料和仪器 |
| 3.2.1 材料与试剂 |
| 3.2.2 主要仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 总花色苷含量测定 |
| 3.3.2 花色苷的鉴定 |
| 3.3.3 模拟条件下A型原花青素的制备 |
| 3.3.4 A型原花青素的检测 |
| 3.3.5 优化模拟条件下A型原花青素制备条件 |
| 3.3.6 数据分析 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 浆果提取物中花色苷的分析和检测 |
| 3.4.2 模拟条件下A型原花青素的制备 |
| 3.4.3 体系pH对A型原花青素形成的影响 |
| 3.4.4 氧暴露对A型原花青素形成的影响 |
| 3.4.5 温度对A型原花青素形成的影响 |
| 3.4.6 加热时间对A型原花青素形成的影响 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 高A型原花青素含量的蓝靛果浓缩汁的制备 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与实验仪器 |
| 4.2.1 材料与试剂 |
| 4.2.2 主要仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 可溶性固形物含量的测定 |
| 4.3.2 花色苷的分析和检测 |
| 4.3.3 高A型原花青素含量的蓝靛果浓缩汁的制备工艺优化 |
| 4.3.4 A型花青素-表儿茶素二聚体的分析和检测 |
| 4.3.5 总酚含量测定 |
| 4.3.6 5-羟甲基糠醛(5-HMF)含量测定 |
| 4.3.7 褐变指数测定 |
| 4.3.8 工艺小试放大试验 |
| 4.3.9 总酸的测定 |
| 4.3.10 总糖含量的测定 |
| 4.3.11 总原花青素的测定 |
| 4.3.12 总黄酮含量的测定 |
| 4.3.13 抗坏血酸含量测定 |
| 4.3.14 抗氧化活性的测定 |
| 4.3.15 数据分析 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 蓝靛果果汁中花色苷含量、总酚含量和pH值 |
| 4.4.2 表儿茶素的添加对A型原花青素产量的影响 |
| 4.4.3 pH对A型原花青素产量的影响 |
| 4.4.4 旋蒸真空度对A型原花青素产量的影响 |
| 4.4.5 旋蒸温度和时间对A型原花青素产量的影响 |
| 4.4.6 旋蒸温度和时间对花色苷和总酚含量的影响 |
| 4.4.7 旋蒸温度和时间对蓝靛果浓缩汁褐变的影响 |
| 4.4.8 高A型原花青素含量的蓝靛果浓缩汁制备工艺的放大实验 |
| 4.4.9 三种浆果浓缩汁的理化指标对比 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 A型花色苷-表儿茶素及高A型PAC蓝靛果浓缩汁抑制大肠杆菌黏附及抗炎活性的研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料和仪器 |
| 5.2.1 材料与试剂 |
| 5.2.2 主要仪器 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 细菌培养 |
| 5.3.2 大肠杆菌生长活性的测定 |
| 5.3.3 A型原花青素、花色苷和表儿茶素对大肠杆菌生物膜形成的影响 |
| 5.3.4 A型原花青素、花色苷和表儿茶素对大肠杆菌成熟生物膜的破坏作用 |
| 5.3.5 细胞培养 |
| 5.3.6 细胞毒性检测 |
| 5.3.7 抑制粘附试验 |
| 5.3.8 A型原花青素对大肠杆菌表面疏水性的影响 |
| 5.3.9 A型原花青素对IL-8 含量的影响 |
| 5.3.10 A型原花青素对NF-κB p65 蛋白含量的影响 |
| 5.3.11 考察浓缩汁的体外防治尿道感染作用 |
| 5.3.12 数据分析 |
| 5.4 结果与讨论 |
| 5.4.1 A型原花青素对大肠杆菌生物膜形成和破坏作用 |
| 5.4.2 A型原花青素对大肠杆菌在膀胱上皮细胞上的抗黏附特性 |
| 5.4.3 A型原花青素对大肠杆菌表面疏水性的影响 |
| 5.4.4 A型原花青素对IL-8 含量的影响 |
| 5.4.5 A型原花青素对NF-κB p65 蛋白表达的影响 |
| 5.4.6 浓缩汁的体外防治尿道感染作用 |
| 5.5 本章小结 |
| 主要结论与展望 |
| 论文创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录:作者在攻读博士期间的成果清单 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 研究内容一 鸡传染性贫血病病毒的分离鉴定以及JSP1906株的序列分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 生物材料 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 病毒的分离与鉴定 |
| 2.2 鸽源CIAV的全基因测序 |
| 3 结果 |
| 3.1 疑似CIAV感染病料汇总 |
| 3.2 PCR检测结果 |
| 3.3 细胞病毒分离结果 |
| 3.4 CIAV-JSP1906全基因扩增结果 |
| 3.5 酶切鉴定结果 |
| 3.6 全基因序列分析 |
| 4 讨论 |
| 研究内容二 鸡传染性贫血病病毒核酸定性标准样品的制备 |
| 1 材料 |
| 1.1 生物材料 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 鸡传染性贫血病病毒核酸定性标准样品的制备 |
| 2.2 鸡传染性贫血病病毒核酸定性标准样品的标定 |
| 3 结果 |
| 3.1 鸡传染性贫血病病毒核酸定性标准样品的制备 |
| 3.2 鸡传染性贫血病病毒核酸定性标准样品的标定 |
| 4 讨论 |
| 研究内容三 鸡传染性贫血病抗体间接ELISA方法的建立与初步应用 |
| 1 材料 |
| 1.1 生物材料 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 计算软件分析 |
| 2.2 鸡传染性贫血病病毒阳性血清的制备 |
| 2.3 最佳多肽的筛选与确定 |
| 2.4 间接ELISA条件的优化 |
| 3 鸡传染性贫血病抗体间接ELISA方法的初步应用 |
| 3.1 送检血清样品ELISA检测 |
| 3.2 IDEXX试剂盒检测血清样品 |
| 3.3 两种检测方法比较 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 多肽序列选择结果 |
| 4.2 鸡传染性贫血病病毒阳性血清的制备 |
| 4.3 最佳多肽的确定 |
| 4.4 间接ELISA方法的建立及反应条件的优化 |
| 4.5 特异性试验 |
| 4.6 批间及批内重复性试验 |
| 4.7 送检血清样品检测结果 |
| 5 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| abstract |
| 注释表 |
| 引言 |
| 1 研究背景 |
| 2 研究目的 |
| 3 研究内容 |
| 4 技术路线图 |
| 第一章 姜黄素自纳米乳的制备及其体外分散评价 |
| 1 引言 |
| 2 仪器与材料 |
| 2.1 仪器 |
| 2.2 材料 |
| 2.3 人工胃液与人工肠液的配制 |
| 3 方法 |
| 3.1 姜黄素含量测定方法学 |
| 3.2 平衡溶解度测定 |
| 3.3 油相和表面活性剂的配伍变化 |
| 3.4 表面活性剂的筛选 |
| 3.5 伪三元相图 |
| 3.6 CUR-SNEDSS处方优化 |
| 3.7 CUR-SNEDDS质量评价 |
| 3.8 CUR-SNEDDS的体外分散稳定性评价 |
| 4 结果 |
| 4.1 姜黄素含量测定方法学 |
| 4.2 姜黄素在不同辅料中平衡溶解度 |
| 4.3 油相与表面活性剂配伍 |
| 4.4 表面活性剂的筛选 |
| 4.5 伪三元相图的绘制 |
| 4.6 CUR-SNEDDS处方优化 |
| 4.7 CUR-SNEDDS质量评价 |
| 4.8 CUR-SNEDDS的体外分散评价 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 第二章 基于亲水性聚合物抑晶行为构建姜黄素过饱和自纳米乳给药体系 |
| 1 引言 |
| 2 仪器与材料 |
| 2.1 仪器 |
| 2.2 材料 |
| 3 方法 |
| 3.1 人工胃液与肠液的制备 |
| 3.2 聚合物维持CUR过饱和作用 |
| 3.3 聚合物对晶体成核时间的影响 |
| 3.4 聚合物对晶体生长变化的影响 |
| 3.5 过饱和自纳米乳处方的优化与质量评价 |
| 4 结果 |
| 4.1 聚合物维持CUR过饱和作用 |
| 4.2 成核时间 |
| 4.3 晶体生长 |
| 4.4 CUR-SSNEDDS处方的优化与质量评价 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 第三章 聚合物维持姜黄素过饱和稳定化机制研究 |
| 1 引言 |
| 2 仪器与材料 |
| 2.1 仪器 |
| 2.2 材料 |
| 2.3 软件与程序 |
| 3 方法 |
| 3.1 聚合物对分散过程中纳米乳溶液物理特性的影响 |
| 3.2 姜黄素沉淀存在形式 |
| 3.3 聚合物与姜黄素分子间相互作用研究 |
| 3.4 分子动力学模拟 |
| 4 结果 |
| 4.1 聚合物对分散过程中纳米乳溶液物理特性的表征 |
| 4.2 姜黄素沉淀存在形式 |
| 4.3 聚合物与姜黄素分子间相互作用 |
| 4.4 分子动力学模拟 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 第四章 姜黄素过饱和自纳米乳体外与体内评价 |
| 1 引言 |
| 2 仪器与材料 |
| 2.1 仪器 |
| 2.2 材料 |
| 2.3 实验动物 |
| 3 方法 |
| 3.1 聚合物对SNEDDS稳定性的影响 |
| 3.2 聚合物对SNEDDS体外溶出的影响 |
| 3.3 聚合物对SNDDDS体外消化的影响 |
| 3.4 聚合物对SNEDDS肠吸收的影响 |
| 3.5 聚合物对SNEDDS体内药动学的影响 |
| 4 结果 |
| 4.1 稳定性 |
| 4.2 体外溶出 |
| 4.3 体外消化 |
| 4.4 大鼠离体肠道吸收 |
| 4.5 大鼠体内药代动力学 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 第五章 姜黄素过饱和自纳米乳吸收机制的研究 |
| 1 引言 |
| 2 仪器与材料 |
| 2.1 仪器 |
| 2.2 材料 |
| 3 方法 |
| 3.1 Caco-2 细胞的培养 |
| 3.2 细胞毒性实验 |
| 3.3 Caco-2 细胞摄取 |
| 4 结果 |
| 4.1 细胞毒性实验 |
| 4.2 细胞摄取方法专属性 |
| 4.3 药物浓度、时间及温度对CUR-SNEDDS细胞摄取的影响 |
| 4.4 细胞摄取抑制剂对三种CUR自纳米乳制剂细胞摄取的影响 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 全文总结 |
| 本文创新点 |
| 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 文献综述 姜黄素口服给药的研究进展 |
| 1 肠屏障 |
| 1.1 粘液层 |
| 1.2 上皮细胞 |
| 2 吸收 |
| 3 代谢与排泄 |
| 4 药物动力学参数 |
| 5 药剂学研究 |
| 5.1 早期制剂学法方法 |
| 5.2 现代药剂学方法 |
| 5.3 其他 |
| 6 结语 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 益生菌简介 |
| 1.2 乳酸菌 |
| 1.2.1 乳酸菌定义及分类 |
| 1.2.2 乳酸菌的生物学特性 |
| 1.2.3 益生乳酸菌的功能活性 |
| 1.2.4 益生乳酸菌的应用 |
| 1.3 多糖简介 |
| 1.3.1 微生物多糖 |
| 1.4 乳酸菌胞外多糖研究现状 |
| 1.4.1 产胞外多糖的乳酸菌 |
| 1.4.2 乳酸菌胞外多糖定义及分类 |
| 1.4.3 胞外多糖生物合成途径 |
| 1.4.4 影响胞外多糖产量的因素 |
| 1.4.5 胞外多糖的分离纯化 |
| 1.4.6 胞外多糖的功能特性及应用 |
| 1.5 传统发酵东北酸菜研究进展 |
| 1.5.1 酸菜简介 |
| 1.5.2 东北酸菜的微生态系统及其发酵过程 |
| 1.5.3 东北酸菜中微生物的研究进展 |
| 1.6 本论文的研究目的和意义 |
| 1.7 本论文的研究目标和内容 |
| 1.8 技术路线 |
| 第二章 产胞外多糖乳酸杆菌的筛选和鉴定 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与设备 |
| 2.2.1 实验材料与试剂 |
| 2.2.2 实验设备与仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 样品采集与处理 |
| 2.3.2 样品处理 |
| 2.3.3 乳酸杆菌的分离纯化 |
| 2.3.4 乳酸杆菌的16S rDNA鉴定 |
| 2.3.5 产胞外多糖乳酸杆菌的鉴定和进化分析 |
| 2.3.6 乳酸杆菌全基因组测序分析 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 乳酸杆菌的分离与初步鉴定 |
| 2.4.2 产胞外多糖乳酸杆菌的鉴定 |
| 2.4.3 L.casei NA-2进化分析 |
| 2.4.4 L.casei NA-2全基因组测序分析 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 L.casei NA-2特性及抑菌功效评价 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与设备 |
| 3.2.1 实验材料与试剂 |
| 3.2.2 实验设备与仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 L.casei NA-2耐酸特性评价 |
| 3.3.2 L.casei NA-2耐受高浓度胆盐特性评价 |
| 3.3.3 L.casei NA-2与病原菌共培养 |
| 3.3.4 L.casei NA-2抑制病原菌粘附Caco-2细胞 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 L.casei NA-2耐酸结果 |
| 3.4.2 L.casei NA-2耐受高浓度胆盐结果 |
| 3.4.3 L.casei NA-2与病原菌共培养的实验结果 |
| 3.4.4 L.casei NA-2抑制病原菌粘附Caco-2细胞的实验结果 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 L.casei NA-2胞外多糖提取及检测 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与设备 |
| 4.2.1 实验材料与试剂 |
| 4.2.2 实验设备与仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 L.casei NA-2胞外多糖的提取 |
| 4.3.2 傅立叶转换红外光谱测定L.casei NA-2胞外多糖 |
| 4.3.3 L.casei NA-2胞外多糖中总糖和蛋白质含量测定 |
| 4.3.4 L.casei NA-2胞外多糖中单糖组分的测定 |
| 4.3.5 L.casei NA-2胞外多糖分子量测定 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 L.casei NA-2胞外多糖傅立叶红外光谱检测结果 |
| 4.4.2 L.casei NA-2胞外多糖中总糖和蛋白质含量 |
| 4.4.3 L.casei NA-2胞外多糖中单糖组分及其含量 |
| 4.4.4 L.casei NA-2胞外多糖分子量结果 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 L.casei NA-2胞外多糖抗生物膜和抗氧化活性评价 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料与设备 |
| 5.2.1 实验材料与试剂 |
| 5.2.2 实验设备与仪器 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 荧光显微镜观察L.casei NA-2胞外多糖对病原菌生物膜的影响 |
| 5.3.2 定量检测L.casei NA-2胞外多糖抗生物膜活性 |
| 5.3.3 L.casei NA-2胞外多糖体外抗氧化活性检测 |
| 5.4 结果与讨论 |
| 5.4.1 L.casei NA-2胞外多糖抑制病原菌生物膜形成 |
| 5.4.2 L.casei NA-2胞外多糖分散病原菌生物膜活性测定 |
| 5.4.3 L.casei NA-2胞外多糖体外抗氧化活性 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 L.casei NA-2胞外多糖免疫调节和抗炎活性研究 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 实验材料与设备 |
| 6.2.1 实验材料与试剂 |
| 6.2.2 实验设备与仪器 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 细胞培养 |
| 6.3.2 L.casei NA-2胞外多糖免疫活性测定 |
| 6.3.3 L.casei NA-2胞外多糖对LPS诱导细胞的细胞活性和NO的影响 |
| 6.3.4 蛋白免疫印迹法检测iNOS、NF-κB p65和c-jun的蛋白表达量 |
| 6.4 结果与讨论 |
| 6.4.1 L.casei NA-2胞外多糖对细胞活性、NO、IL-6和TNF-α的影响 |
| 6.4.2 L.casei NA-2胞外多糖对巨噬细胞产生ROS的影响 |
| 6.4.3 L.casei NA-2胞外多糖对LPS诱导处理巨噬细胞的细胞活性和NO的影响 |
| 6.4.4 L.casei NA-2胞外多糖诱导巨噬细胞中iNOS、NF-κB p65和c-jun蛋白的表达结果 |
| 6.5 小结 |
| 第七章 结论与建议 |
| 7.1 结论 |
| 7.2 创新点 |
| 7.3 有待进一步研究和解决的问题 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
| 缩略语表 |
| Abstract |
| 摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 肺癌EGFR基因突变扩增体系组分的设计和验证 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 NHMC-dPCR平台的建立及其在肺癌基因突变检测中的初步应用 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.3 讨论 |
| 全文总结与展望 |
| 参考文献 |
| 文献综述 数字PCR技术在临床检测中的应用进展 |
| 参考文献 |
| 在读期间的研究成果 |
| 致谢 |
| 中英文缩略语对照表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 文献综述 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 植物激素检测方法的研究进展 |
| 1.2.1 早期检测方法 |
| 1.2.2 高效液相色谱法 |
| 1.2.3 气相色谱-质谱联用法 |
| 1.2.4 液相色谱-质谱联用法 |
| 1.2.5 样品前处理方法 |
| 1.3 部分品质检测方法的研究进展 |
| 1.3.1 气相色谱法测定大豆中脂肪酸的含量 |
| 1.3.2 气相色谱-质谱联用法测定大豆中植物甾醇的含量 |
| 1.4 大豆生长发育特点和常见的非生物胁迫 |
| 1.5 生长调节剂烯效唑对植物激素和品质的调控效应 |
| 1.5.1 烯效唑在作物生产中的应用和效果 |
| 1.5.2 烯效唑对植物激素的调控效应 |
| 1.5.3 烯效唑对大豆相关品质的调控效应 |
| 1.6 本研究的目的和意义 |
| 1.7 本研究的内容和技术路线 |
| 1.7.1 本研究的主要内容 |
| 1.7.2 本研究的技术路线 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试剂与材料 |
| 2.2 主要仪器设备 |
| 2.3 供试样品品种及实验基地情况 |
| 2.4 检材培养方法 |
| 2.5 实验设计与方法 |
| 2.5.1 液相色谱测定植物激素的方法 |
| 2.5.2 气相色谱-质谱联用测定植物激素的方法 |
| 2.5.3 超高效液相色谱-质谱联用测定植物激素的方法 |
| 2.5.4 在线固相萃取-液相色谱-质谱联用测定植物激素的方法 |
| 2.5.5 快速样品前处理-液相色谱-质谱联用测定植物激素的方法 |
| 2.5.6 气相色谱测定大豆中脂肪酸的方法 |
| 2.5.7 气相色谱-质谱联用测定大豆中植物甾醇的方法 |
| 2.5.8 不同生长状况下大豆植物激素的测定 |
| 2.5.9 烯效唑调控下大豆脂肪酸含量的测定 |
| 2.5.10 烯效唑调控下大豆中植物甾醇含量的测定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 液相色谱测定植物激素的含量 |
| 3.1.1 方法的系统适应性比较 |
| 3.1.2 不同分离通道对植物激素测定的比较 |
| 3.1.3 超快速液相色谱系统的优化 |
| 3.1.4 检测方法学比较 |
| 3.1.5 检测性能比较 |
| 3.2 气相色谱-质谱联用测定植物激素的含量 |
| 3.2.1 系统适应性 |
| 3.2.2 衍生化方法的选择和优化 |
| 3.2.3 方法学考察 |
| 3.3 超高效液相色谱-质谱联用测定植物激素的含量 |
| 3.3.1 系统适应性 |
| 3.3.2 样品前处理方法和检测系统的优化 |
| 3.3.3 方法学考察 |
| 3.4 在线固相萃取-液相色谱-质谱联用测定植物激素的含量 |
| 3.4.1 系统适应性 |
| 3.4.2 在线SPE柱的选择和分离系统的优化 |
| 3.4.3 在线SPE与检测系统阀切换的优化 |
| 3.4.4 方法学考察 |
| 3.5 快速样品前处理-超高效液相色谱-质谱联用测定植物激素的含量 |
| 3.5.1 系统适应性 |
| 3.5.2 样品前处理方法的优化 |
| 3.5.3 溶剂效应对目标化合物响应的影响 |
| 3.5.4 方法学考察 |
| 3.6 气相色谱测定大豆中脂肪酸的含量 |
| 3.6.1 不同载气输送模式下的系统适应性考察 |
| 3.6.2 不同检测器的灵敏度比较 |
| 3.6.3 快速测定方法的系统优化 |
| 3.6.4 方法学考察 |
| 3.7 气相色谱-质谱联用测定大豆中植物甾醇的含量 |
| 3.7.1 系统适应性 |
| 3.7.2 样品前处理方法的优化 |
| 3.7.3 方法学考察 |
| 3.8 植物激素测试方法的应用及其含量变化 |
| 3.8.1 不同生长时期大豆叶片植物激素的含量变化 |
| 3.8.2 大豆功能叶片中植物激素日间含量变化 |
| 3.8.3 低温胁迫下大豆苗期叶片植物激素含量变化 |
| 3.8.4 干旱胁迫下大豆苗期植物激素含量变化 |
| 3.8.5 烯效唑对大豆苗期植物激素的调控及其恢复 |
| 3.9 脂肪酸测试方法的应用及其含量变化 |
| 3.10 植物甾醇测试方法的应用及含量变化 |
| 4 讨论 |
| 4.1 植物激素检测方法的建立 |
| 4.1.1 植物激素检测方法效能的比较和影响因素 |
| 4.1.2 目标化合物与仪器配置要素的关系 |
| 4.1.3 样品处理方法的选择与优化 |
| 4.1.4 自动化样品前处理方法的选择与优化 |
| 4.1.5 植物激素检测方法的最优化策略 |
| 4.1.6 植物激素检测方法的检测流程 |
| 4.2 大豆品质检测方法的建立 |
| 4.3 不同生理状态下大豆植物激素的变化规律 |
| 4.4 脂肪酸的调控响应变化规律和影响 |
| 4.5 植物甾醇调控响应及变化规律 |
| 4.6 大豆植物激素与品质的内在联系 |
| 5 结论 |
| 6 创新与展望 |
| 6.1 创新点 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
| 武汉生物制品研究所博士学位论文创新点概述 |
| 博士学位论文主要研究成果的发表或获奖情况 |
| 英文缩略词表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 技术路线 |
| 第一章 材料和方法 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 细胞、菌株、质粒、毒株、引物 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 实验试剂 |
| 1.4 实验仪器 |
| 1.5 主要试剂配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 兔抗CV-A4 VP1、VP2、VP3、全病毒多克隆抗体的制备及检测 |
| 2.2 细胞培养 |
| 2.3 病毒传代 |
| 2.4 病毒滴定 |
| 2.5 CV-A4 致死14 日龄昆明鼠攻毒株的获得 |
| 2.6 CV-A4 疫苗候选株的获得和免疫原性研究 |
| 2.7 CV-A4 疫苗候选株免疫原性研究 |
| 2.8 建立CV-A4 主动免疫保护模型 |
| 3 统计分析 |
| 第二章 CV-A4 Rb-α-VP1、VP2、VP3和Rb-α-virion的制备及应用 |
| 1 实验结果 |
| 1.1 p GEX-6p-1 表达载体的构建 |
| 1.2 CV-A4 VP1、CV-A4 VP2、CV-A4 VP3 蛋白的表达与纯化 |
| 1.3 CV-A4 全病毒抗原的纯化制备 |
| 1.4 Western blotting鉴定多克隆抗体 |
| 1.5 IFA鉴定多克隆抗体 |
| 2 小结 |
| 第三章 CV-A4 致死14 日龄小鼠攻毒株的选育 |
| 1 实验结果 |
| 1.1 14 日龄昆明鼠致死模型的建立 |
| 1.2 CV-A4 感染不同日龄昆明鼠的生存曲线 |
| 1.3 CV-A4-M14-RP3 感染14 日龄昆明鼠最优的感染途径选择 |
| 1.4 小鼠品系的选择 |
| 1.5 CV-A4-M14-613131,CV-A4-M14-623131 两克隆株毒力比较 |
| 1.6 CV-A4-M14-613131,CV-A4-M14-623131 全基因组序列分析 |
| 1.7 CV-A4-M14-613131 小鼠攻毒株LD_(50)测定 |
| 2 小结 |
| 第四章 CV-A4 疫苗候选株的选育 |
| 1 实验结果 |
| 1.1 CV-A4 克隆株313422 的获得 |
| 1.2 pBR322-CV-A4-313422 重组质粒构建及线性化 |
| 1.3 疫苗候选株的获得 |
| 1.4 疫苗候选株CV-A4-313422-VP3 的鉴定 |
| 1.5 CV-A4-313422-VP3 全序列测定和分析 |
| 2 小结 |
| 第五章 CV-A4 候选疫苗的制备及免疫原性研究 |
| 1 实验结果 |
| 1.1 CsCl等密度梯度离心法纯化CV-A4 病毒颗粒 |
| 1.2 SDS-PAGE、WB鉴定纯化的CV-A4 病毒颗粒 |
| 1.3 TEM 鉴定 CV-A4 病毒颗粒 |
| 1.4 CV-A4 毒种(stocks)的滴度测定和鉴定 |
| 1.5 CV-A4 候选疫苗的体液免疫应答 |
| 1.6 CV-A4 免疫血清与CV-A4 RD细胞株、EV-A71 的交叉中和反应 |
| 1.7 CV-A4 EP、FP、EP+FP、VLP细胞免疫应答 |
| 2 小结 |
| 第六章 主动免疫-攻毒后的疫苗效力评估 |
| 1 实验结果 |
| 1.1 疫苗保护效力及耐受性 |
| 1.2 病毒载量测定 |
| 1.3 主动免疫保护实验血清中和抗体效价测定 |
| 1.4 组织病理切片分析 |
| 1.5 免疫组化分析 |
| 2 小结 |
| 第七章 总结和讨论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
