刘春洁[1]（2020）在《绵羊卵泡颗粒细胞中POSTN基因的表达调控及功能研究》文中指出调控卵巢卵泡发育是提高动物繁殖效率的主要途径之一。哺乳动物卵泡发育过程中,99.9%以上的卵泡会发生闭锁退化并消失,早期的一些报道指出,卵泡闭锁与卵泡颗粒细胞（Granulosa cell,GCs）凋亡密切相关,但GCs凋亡调控机制仍不完全清楚。本课题组前期采用FSH超排处理成年母羊,获得不同直径卵泡液和GCs,基于RNA-seq高通量测序和iTRAQ定量蛋白组学联合分析发现,随着卵泡直径的增加,卵泡液和GCs中POSTN表达量逐渐升高。因此提出假设:卵泡发育过程中,FSH与POSTN可能存在一定的相关性,但其具体调节机制尚不清楚。本论文以绵羊卵泡及GCs为研究对象,系统地探究POSTN在卵泡发育过程中表达规律及FSH-POSTN存在的表达调控机制,主要试验结果如下:1.绵羊POSTN基因cDNA的克隆及表达分析。绵羊中克隆出1557 bp长的POSTN cDNA序列,可编码由518个氨基酸组成的蛋白,克隆的绵羊POSTN与牦牛和奶牛同源性较近。POSTN基因在绵羊心、肝、脾、肺、肾、肌肉、子宫和卵巢组织中均有表达,其中卵巢组织中表达量较高,而且随着卵泡直径增加,POSTN表达量逐渐升高,且在卵泡中的GCs中呈高表达。免疫荧光染色发现POSTN在GCs的细胞核和细胞质中都有分布。试验进一步利用RAI法检测不同直径卵泡液和GCs中激素与POSTN含量变化,结果显示,POSTN在不同直径卵泡液和GCs中的变化与FSH存在显着正相关性,表明POSTN可能参与调节卵泡发育进程,而这一过程可能受FSH影响。2.FSH对绵羊卵泡GCs中POSTN的表达具有调节作用。采用10 ng/mL FSH对体外培养GCs处理24 h,能显着增加GCs中POSTN表达,并加速细胞增殖进程,减少其凋亡,还有效促进GCs增殖相关基因PCNA、Ccnd-2和抗凋亡相关基因Bcl-2表达。另外,敲减GCs中POSTN基因,能显着降低FSH条件下引起的POSTN表达上调,并抑制GCs增殖、分化过程,增加其凋亡,同时下调GCs增殖分化基因PCNA、Ccnd-2与抗凋亡基因Bcl-2的转录,上调凋亡相关基因Bim、FasL和Caspase-3的表达。3.FSH通过PI3K-AKT-FOXO1信号通路调控POSTN表达。检测FSH涉及的多条信号通路,发现绵羊卵泡GCs中FSH主要通过激活PI3K、AKT和FOXO1信号通路影响POSTN表达,进而抑制GCs凋亡。进一步分析PI3K、AKT和FOXO1三者关系,结果显示FSH处理能同时激活这三种激酶活性;阻断PI3K或AKT后,FSH对FOXO1激活作用被阻断;而阻断FOXO1后,PI3K和AKT活性不受影响。PI3K抑制剂能同时阻断FSH对AKT和FOXO1的诱导,而AKT抑制剂能阻断FOXO1活性但不能阻断PI3K活性。另外还发现阻断AKT后,POSTN的表达量显着降低,即使加入10 ng/mL FSH在24 h内也无法恢复上调POSTN的转录,未能完全挽救GCs凋亡过程。4.FSH通过调节转录因子SRF调控POSTN表达。分析POSTN转录调控区,发现POSTN上游-1至-387 bp区域内包含1个SRF和1个JunD结合位点,进一步对结合位点定点突变分析,发现位于-222至-210的SRF结合位点突变明显降低了POSTN转录活性;同时还发现10 ng/mL FSH处理GCs 24 h后,能促进SRF表达,实现POSTN转录增强,该结果与ChIP分析结果相一致。因此推测,适量FSH一定时间内可能通过调节转录因子SRF调控POSTN表达,表明SRF可能是FSH调节POSTN表达以促进GCs生长的核心因子。综上所述,本论文主要围绕POSTN在绵羊卵泡GCs凋亡及卵泡闭锁中的作用及其分子调控机制进行了研究,建立了 FSH、POSTN,GCs凋亡和卵泡存活之间的联系,发现了 FSH-PI3K-AKT-FOXO1信号轴与GCs中POSTN表达的调控机制。本论文结果有助于进一步阐明卵泡存活/闭锁的分子机制,也为提高家畜繁殖效率提供新的理论基础。
康新乐[2]（2020）在《蜕皮激素通过G蛋白偶联受体调控昆虫变态发育和易化扩散进入细胞的研究》文中指出研究背景、存在的科学问题及研究意义昆虫的生长发育由多种激素共同调控,包括20-羟基蜕皮酮（20E）、保幼激素（JH）和胰岛素,20E与JH和胰岛素相互作用调控昆虫生长发育和蜕皮变态。昆虫变态期间体内发生着剧烈的变化,如幼虫中肠的凋亡、成虫中肠的形成、脂肪体的解体和重构、成虫盘的生长和脑结构的重塑等,20E在其中起着非常重要的作用。通常,蜕皮激素通过结合蜕皮激素的核受体（EcR）来发挥作用,起始20E早晚期基因的表达,启动变态程序,即20E基因组信号途径。近年来,越来越多的研究证明在经典的20E基因组信号途径之外,存在20E非基因组途径,即20E通过激活细胞膜上的受体引发胞内钙离子和cAMP水平的快速变化,进而引起一系列蛋白质的翻译后修饰,调控基因转录和变态发育。G蛋白偶联受体（GPCR）是一类七次跨膜的蛋白家族,在传递各种信号中起到重要的作用,是各种药物的作用靶标。研究发现GPCR作为固醇类激素的受体,在20E调控昆虫的变态发育中发挥作用。果蝇多巴胺蜕皮激素受体DmDopEcR可以结合20E类似物,被认为是20E的膜受体,但DopEcR在20E信号途径中的功能并不清楚,并且棉铃虫中还报道了另外两个传递20E信号的GPCR,但没有检测到它们结合20E。前期研究还发现20E进入细胞的量是受到控制的,但机制和生物学效应并不清楚。这些研究打破了 20E是通过自由扩散进入细胞与核受体结合启动相关基因转录的经典理论,其尚待阐明的科学问题对于确立类固醇激素的细胞膜受体及其信号途径的新理论具有重要的支撑意义。本论文用重大农业害虫棉铃虫（Helicoverpa armigera）为模型,研究DopEcR在20E信号途径中的功能并证明GPCR可以结合20E,GPCR控制20E进入细胞的机制和生物学效应,丰富和完善20E非基因组信号途径及调控昆虫变态发育的分子机制。研究结果完全变态昆虫在末龄幼虫的最后阶段停止取食,然后发生变态。但是,幼虫停止取食的机制尚不清楚。使用农业害虫棉铃虫作为模型,揭示了 20E与多巴胺受体（DopEcR）（一种G蛋白偶联受体）结合,以停止幼虫取食并促进化蛹。DopEcR在各种组织中均有表达,并在20E调节下的蜕皮变态过程中表达水平升高。幼虫取食阶段的20E滴度较低,而游走阶段的20E滴度较高。相比之下,多巴胺（DA）滴度在幼虫取食阶段较高,而在游走阶段较低。使用多巴胺受体抑制剂flupentixol阻断多巴胺受体或20E注射均可以减少幼虫的食物消耗和体重。敲降DopEcR可以抑制幼虫的取食、生长和化蛹。20E通过DopEcR促进细胞凋亡,DA通过DopEcR诱导细胞增殖。20E通过抑制DA诱导的细胞增殖和AKT的磷酸化来对抗DA功能。20E通过DopEcR诱导基因表达,并使细胞内钙离子和cAMP水平快速增加。20E诱导DopEcR与Gαs和Gαq相互作用。20E通过DopEcR诱导20E信号途径关键蛋白磷酸化和EcRB1-USP1转录复合物与蜕皮激素响应元件EcRE的结合。DopEcR可以在细胞膜或从细胞膜分离后结合20E。DopEcR结合20E位点的突变降低了 20E结合水平和相关的细胞快速反应。研究结果表明20E通过与DA竞争结合DopEcR,抑制幼虫进食并促进化蛹。在棉铃虫中阐明了一种GPCR（命名为GPCR-3）通过触发G蛋白介导的信号级联并形成四聚体促进20E进入细胞传递类固醇激素20E信号。通过虫体RNA干扰从棉铃虫转录组数据库中筛选出GPCR-3参与20E信号途径。虫体干扰GPCR-3导致延迟化蛹或形成嵌合蛹,抑制幼虫中肠和脂肪体的降解,并抑制20E诱导的基因表达。20E诱导GPCR-3与Gαq和Gαs相互作用,并使细胞内钙离子、cAMP和蛋白磷酸化迅速增加。GPCR-3定位于细胞质膜中,20E诱导下被GPCR激酶2（GRK2）磷酸化后内化降解脱敏20E信号,β-arrestin-1和网格蛋白介导GPCR-3的内化。GPCR-3可在细胞膜中和分离后在体外结合20E。20E与GPCR-3的结合诱导GPCR-3的同源二聚体形成同源四聚体,GPCR-3的同源四聚体促进20E进入细胞并传递20E信号。GPCR-3同源四聚体作为20E细胞膜受体并促进20E扩散进入细胞,控制不同组织中20E的滴度,进而调节变态发育中不同组织的发育命运—调亡或增殖生长。结论及科学意义1.本论文研究了 DopEcR在昆虫取食和化蛹中的双重功能,DA通过DopEcR促进幼虫的进食和生长,20E与DA竞争结合DopEcR,并通过DopEcR作为细胞膜受体之一来传递20E信号,从而促进昆虫变态,揭示了类固醇激素与多巴胺系统的互作,阐明了 20E抑制鳞翅目昆虫取食并促进变态发育的分子机制,为类固醇激素信号途径及其与神经系统互作提供了新的理论,为害虫控制提供了新的生长调节剂的研制靶点。2.证明了 ErGPCR-2可以结合20E,支持了前面的研究结论—ErGPCR-2是20E的细胞膜受体。3.证明了 GPCR-3是20E的细胞膜受体,20E结合并诱导GPCR-3形成同源四聚体传导20E信号,并作为转运蛋白易化20E扩散进入细胞。首次发现GPCR可以通过形成同源四聚体促进20E的细胞导入。
杨峰[3]（2020）在《内蒙古绒山羊毛囊细胞作用机制的研究》文中研究表明作为绒肉兼用型山羊,内蒙古绒山羊所产羊绒因其羊绒纤维（Cashmere）轻柔、纤细、柔软、保暖性好、光泽鲜亮等特点而被誉为“软黄金”和“纤维宝石”,在绒毛产业中具有重要的经济价值。内蒙古绒山羊羊绒生长具有明显的周期性变化,分为:休止期、生长期、退行期。目前已有大量的研究表明羊绒的产量和质量受次级毛囊调控,而毛囊内部具有多种类型的毛囊干细胞,其中起主要作用的为毛乳头细胞、毛芽细胞和隆凸区细胞,这些干细胞在不同时期分化或者凋亡,并相互作用、相互联系、相互影响从而推动绒山羊次级毛囊的周期演变。因此,阐明这些干细胞的作用机制有助于对毛囊及绒毛周期更深一步的理解,为提高绒毛的经济效益奠定基础。本研究基于已有的绒山羊研究结果,利用成年内蒙古绒山羊（阿尔巴斯型）个体,获取并分离皮肤毛囊细胞,通过单细胞转录组测序、组织形态学、蛋白质组学以及多色免疫荧光等分别在个体组织、细胞、转录本及蛋白质水平对内蒙古绒山羊不同时期的表达特点进行深入研究,最终获得以下主要结论:1.通过tSNE聚类分析从内蒙古绒山羊皮肤毛囊中鉴定出18个细胞簇,7种细胞类型和13个细胞状态,并描述了不同状态下细胞的关键基因和基因表达谱。其中内皮细胞、黑素细胞、毛芽细胞以及毛母质细胞只有一个细胞状态,真皮细胞有两个中间状态细胞,毛乳头细胞有四个中间状态细胞及隆凸区细胞有七个中间状态细胞,包括内外根鞘细胞。这些细胞在毛囊中相互作用,共同促进了毛囊的再生、萎缩及绒毛的生长脱落,进而推动了绒毛周期的演变。并且在拟时间分化轨迹上细胞分化先后顺序为:真皮细胞、内皮细胞、黑素细胞、毛乳头细胞、毛芽细胞、隆凸区细胞和毛母质细胞。2.通过分群标记发现了主要细胞类型新的标记基因,其中具有代表性的为:Col1a1和Lum高度表达的上皮细胞簇,Pecam1和Aqp1高度表达的内皮细胞簇,Plp1和Sox6高度表达的黑素细胞簇,Lef1和Msx1高度表达的毛乳头细胞簇,Fcgbp和P-cad高度表达的毛芽细胞簇,Sox9和Krt15高度表达的隆凸区细胞簇,Lrat和Gata3高度表达的毛母质细胞簇,Fcer1g和Laptm5高度表达的免疫细胞簇。3.结合光照长度、组织形态学和scRNA基因表达模式聚类结果发现,在生长期当光照时间达到一定阈值,黑素细胞高表达lmcd1,Fabp7,Iga6,Zfp36,Id4,Ramp1,Cryab和Hspe1,受体络氨酸激酶信号通路被激活,进而Gpc1,Gsk3b,Igfbp5,Irs1,Itgav,Stmn1,Nck1,Pak2,Pik3cb,Porr2d,Porr2h,Itsn1,Tiam1,Nrp2,Actr3,Wasf2,Stam2,Cnksr1,Nckap1,Cyfip1和Ptpn18基因表达量升高进一步激活WNT,MAPK等信号通路（细胞命运1）,即随着日光长度的增加,黑素细胞中的基因表达达到阈值进而启动毛囊周期,在退行期和休止期黑素细胞的表达同样起到引导作用,在细胞命运2中随着日光强度的减少,黑色素的表达下降到另一个阈值,毛囊周期进入退行期。当日光长度进一步减少时,黑素细胞表达降低到最低水平,毛囊周期进入休止期。由此本研究推测黑素细胞或是体内绒毛周期转变的诱导因素。4.真皮细胞具有两个中间状态细胞,一是富集到PID-AP1/IL67/ATF2/Fox途径,凋亡信号传导途径的调节,细胞分化的负调节,节律性进程等信号途径,其高表达基因有Col1a1,Cd34,Fgf7,Jund和Tmem59并且表达呈下降趋势,揭示了其在休止期毛囊凋亡的重要作用,另一个则富集到受体酪氨酸激酶信号传导,Wnt信号传导途径,MAPK信号传导途径,BMP信号传导途径及间充质细胞分化,脂肪细胞分化,成骨细胞分化等功能,高表达并且表达呈上升趋势的基因有Ddx5,Rpl7,Zfp36l1,Eif4a2,Id1,Igf2。并且多色免疫荧光结果显示真皮细胞在成熟的毛囊中主要位于毛乳头和毛干的上部,而在新新生毛囊中,它们被标记在整个毛囊中所有位置,进一步揭示了真皮细胞在毛囊周期转化中的重要功能。5.通过构建毛乳头细胞谱系分化轨迹,揭示了决定毛乳头细胞命运的关键基因,信号和功能。结果表明,毛乳头细胞在不同周期分化为四个中间细胞状态:中间细胞10在羊绒的生长和维持中显示出重要的功能高表达基因有Sfn,Krt10,Krt14,Tgm3,Krtap3-1,Cnfn,Ivl等;中间细胞1作用于细胞凋亡和羊绒脱落,主要富集了 foxo信号通路,p53信号通路等;中间细胞0启动了新的毛囊周期,维持毛囊迁移并促进羊绒的产生,主要信号通路有wnt信号通路,notch信号通路,mapk信号通路等;其中中间细胞15被认为是DP祖细胞。此外,在中间细胞1的基因表达谱中发现了占比高达84%的假基因,经过分析发现多为核糖体相关假基因,并且其在凋亡过程中起到了重要作用,这一结论促进了假基因的竞争性内源RNA（ceRNA）学说。6.在细胞命运1中,毛芽细胞接受黑素细胞传递的MAPK信号通路和DP细胞传递的Notch信号通路激活刺猬信号“on”状态,然后启动Smad基因家族,TGF-β基因家族,并进一步激活Wnt信号通路,Notch信号通路和MAPK信号通路。并且高表达了 Hmgn1,Cap1,Nop58,Rab25,Hspe1,Srsf10,Tfg,Stag1,Sp3 和Mtx2基因,从表达模式上看,毛芽细胞更像是作为信号的启动器和放大器,启动毛囊的周期,并将信号级联放大传递给隆凸区的细胞,进一步促进毛囊发育和羊绒的生长。并且在实现其功能后很快进入凋亡程序,在细胞命运2中富集到了细胞凋亡过程,细胞死亡的调节,程序性细胞死亡的调节。7.隆凸区细胞更像是高阈值反应细胞,在生长期前期基因表达并没有发生显着的变化,当毛芽细胞基因表达上升并激活相关信号通路并级联放大传递给隆凸区细胞后,在隆凸区细胞中产生了 CTGF/Hcs24-肌动蛋白（β/γ）复合物,CD98-LAT2-ITGB1 复合物,ITGA6-ITGB1-CD151 复合物,ITGA6-ITGB1-CYR61复合物,ETS2-FOS-JUN复合物和FZD5-LGR5-LRP6复合物并高表达了 Achy,Atf4,Cdk4,Egr 1/2/3,Hspa5,Id 1/3/4,Jun,Mdk,Nfil3,Ntrk2,Ptn,Robo2,Slit3,Tgfb3,Klf10,Bhlhe40,Adamts1,Cbx3和Crtc1基因,进而实现了细胞分化,发育,形态变化,增殖和毛囊结构形成。在细胞命运2中,隆凸区细胞信号通路主要富集在β-catenin破坏复合物的分解,β-catenin独立的WNT信号传导,BMP信号的负调控途径和外在凋亡信号传导途径,干细胞之间的细胞间通讯,细胞分化,揭示了隆凸区细胞向根鞘细胞分化的分支,被提取到的相关基因有:Krt19,Abhd12,Ier5,Lypd3,Dsc1,Jag1。Mgp,Npdc1,Gypc,Rnd1,Sbsn 和 Ube2s。8.关于毛母质细胞起源问题有两个方向,其一是基质细胞起源的假说（毛囊预定假说）,认为毛母质细胞由休止期后期的毛芽细胞在凋亡过程中遗留的未凋亡的细胞分支分化而来,另一个认为毛母质细胞是由生长期前期的隆凸区细胞接收到毛芽细胞信号后分化而来,在毛母质细胞的基因表达谱和信号通路富集中,虽然PID ECADHERIN NASCENT AJ途径被富集到,而P-cad是毛芽细胞的标记基因,但更多被富集到的信号通路和复合物与隆凸区细胞的更相似,所以尽管证据不够充分,但本研究的结果依旧推动了毛母质细胞由隆凸区细胞分化而来的假说。9.通过拟时间分化轨迹,细胞富集的信号通路及其基因表达谱,结合多色免疫荧光结果,本研究总结了不同细胞在不同时期信号传递的先后顺序:黑素细胞在光照长度达到一定阈值后启动毛囊周期信号,这标志着毛囊周期的启动,随后将信号传递给真皮细胞和毛乳头细胞,毛乳头细胞结合黑素细胞将信号传递到毛芽细胞,毛芽细胞启动并级联放大信号后传递给隆凸区细胞,之后隆凸区细胞分化为根鞘细胞和毛母质细胞,在休止期前期,随着根鞘细胞和毛母质细胞的凋亡过程,隆凸区细胞也随之凋亡,但凋亡过程不是完全的,其中一个分支分化为毛芽细胞并在下个毛囊周期实现其功能。10.通过蛋白质组学,本研究共检测到1903个蛋白质,其中在休止期检测到1377个蛋白,在生长期检测到687个蛋白,在退行期检测到1344个蛋白。通过可视化蛋白质之间的关系,发现仅在休止期表达的有366个蛋白质,这些蛋白质主要与毛囊细胞凋亡过程相关。仅在生长期表达的蛋白有363个蛋白质,主要与毛囊发育过程相关,只在退行期表达的蛋白有280个,在从休止期到生长期的演变过程中,富集了 20 种高价值蛋白质,包括 DLDH,EF2,KPYM,GRP75,MDHC,TNNT3,FHL等,主要参与了周期启动过程;而从生长期到退行期,富集了 63种蛋白质,包括H4,QCR,CAZA,CH60,CAZA2,MIME,FLNC等,与绒毛生长及维持相关。而从退行期到休止期,共有750个共有蛋白,揭示了退行期和休止期毛囊及绒毛具有同一性变化趋势。11.标记基因在细胞中的表达相对稳定,通过对休止期、生长期、退行期不同干细胞的标记基因进行western blot试验验证不同细胞在各时期的细胞数量的变化情况,结果显示毛乳头细胞、真皮细胞、隆凸区细胞从休止期到生长期演变过程中细胞数量持续增加,揭示了该过程毛囊发育的情况而从生长期到退行期没有这些细胞数量没有显着增加,表明毛囊结构发育完善,并且该结果验证了毛乳头细胞的数量决定了毛发的类型这一结论,而wnt1Ob和β-catenin的表达量在三个时期呈现显着增长趋势,揭示了其不仅在毛囊发育过程中起到关键作用,而且在绒毛的生长和后期维持绒毛贴附表皮中也起到至关重要作用。
杨丽娜[4]（2019）在《磷酸二酯酶MoPdeH与其相关蛋白在稻瘟病菌cAMP信号途径和致病中的调控机制研究》文中提出水稻作为全球主要的粮食作物,深受水稻病害的危害,导致大规模的减产。稻瘟病是水稻生产上最具破坏性的病害之一,可引起大幅度减产,严重时减产40%-50%,甚至颗粒无收。由于该病害田间菌株变异较快,常导致抗病品种种植几年后就失去抗性。近年来,水稻和稻瘟病菌全基因组序列的公布及分子生物学的不断发展,加速了稻瘟病菌致病分子调控机制的研究,研究结果为新型杀菌剂的研制提供了候选靶标,也为稻瘟病的防治提供了新策略。真核生物中,cAMP信号途径调控信号转换、传递及其形态建成。稻瘟病菌中cAMP信号途径及其组分在其生长、有性生殖、无性繁殖、附着胞形成、细胞壁完整性以及侵染寄主等方面具有重要作用。胞内cAMP主要由腺苷酸环化酶MoMac1催化的生物合成和磷酸二酯酶MoPdeH/L催化的水解维持平衡。本实验室前期研究发现,高亲和性的MoPdeH在水解cAMP的过程中发挥重要作用,参与调控分生孢子的形态建成、附着胞的形成、表面信号的识别、细胞壁完整性以及侵染寄主等多个生物学过程,而低亲和性的MoPdeL水解cAMP的能力较弱,且仅参与分生孢子的形态建成过程,对稻瘟病菌的致病力没有明显的贡献。本文主要研究了稻瘟病菌胞内cAMP水解酶MoPdeH与其相关蛋白在病菌cAMP信号途径和致病中的调控机制,主要研究结果如下:为了解析MoPdeH在致病中的调控机制,本文对稻瘟病菌MoPdeH和MoPdeL的磷酸二酯酶的结构域进行缺失、替换分析,发现磷酸二酯酶功能域HD以及酶活位点EAL对MoPdeH的酶活及生物学功能至关重要,它们通过影响MoPdeH的酶活进而参与调控该病菌的多重生物学过程;MoPdeL的L1结构域具有较高的酶活力,与侵染密切相关,而L2功能域酶活力较低。此外,研究还发现胞内cAMP水平负调控Mps1-MAPK信号通路,正调控Pmkl-MAPK信号通路。为了进一步解析MoPdeH在稻瘟病菌致病中的作用分子机制,以MoPdeH为诱饵采用酵母双杂交技术筛选稻瘟病菌cDNA文库,得到嘌呤代谢通路中的限速酶肌苷-5’-单磷酸脱氢酶Molmd4。本实验室前期研究中已获得了 MoIMD4的缺失突变体,且发现MoIMD4的缺失阻断了胞内嘌呤代谢的从头合成,影响了稻瘟病菌的生长、产孢及致病力。在此研究基础上,本研究进一步解析MoPdeH与MoImd4互作的分子机制与生物学功能,发现MoImd4与MoPdeH相互促进酶活。对预测的MoImd4的功能位点进行失活突变,发现这些位点均可作为Molmd4的酶活位点,但作用机制却存在差异,S345、C347位点仅参与到嘌呤代谢的从头合成过程,而T268、R269、D380、G382、G403、Y428、R458和Y459位点不仅影响到嘌呤代谢的从头合成,还影响MoImd4与MoPdeH之间的互作强度,进而影响MoPdeH磷酸二酯酶酶活力。这些结果表明,MoImd4与MoPdeH将嘌呤代谢的从头合成与胞内cAMP信号途径连接起来,共同调控稻瘟病菌生长发育及致病力。本研究还发现,抑制剂麦考酚酸MPA可特异性地靶标到MoImd4上,而对寄主同源蛋白IMPDH损伤较小,预示着未来可将MPA作为防治稻瘟病的先导化合物开发药剂。以MoPdeH为诱饵进行体内Co-IP与质谱分析,结果获得潜在的与MoPdeH互作的蛋白,包括很多线粒体蛋白。为了解析MoPdeH及其所在的cAMP信号途径与线粒体蛋白之间的关系,本文研究了稻瘟病菌线粒体外膜转位酶MoTom70和线粒体磷酸载体蛋白MoPic的生物学功能,发现MoTom70和MoPic参与调控稻瘟病菌的生长发育及致病过程,MoTom70将MoPic瞬时地从胞质输入到线粒体,Mo TOM70的缺失导致线粒体持续分裂,且这种状态一经损坏无法逆转,MoTom70和MoPic均参与到胞内cAMP信号通路的调控过程。提示,线粒体蛋白的输入可能与MoPdeH介导的胞内cAMP信号通路之间存在一定的联系,且共同调控稻瘟病菌的生长发育及致病过程。综上所述,本研究解析了稻瘟病菌磷酸二酯酶MoPdeH与其相关蛋白的作用分子机制,阐明了它们在稻瘟病菌生长发育及致病中的分子调控机制,为深入揭示该病菌致病机理提供了理论依据,为稻瘟病的防治提供潜在药剂靶标。
谢天[5]（2019）在《G蛋白信号调控基因在罗伯茨绿僵菌生长发育、抗逆和致病过程中的功能分析》文中进行了进一步梳理罗伯茨绿僵菌（Metarhizium roberstii）是一种重要的昆虫病原真菌,广泛应用于农林害虫的防治。然而,作为一种新型的生物农药,绿僵菌的应用有明显缺陷,如侵染宿主时的效果慢、周期长,在野外环境中防治效果不稳定,这些都严重阻碍了绿僵菌在农业生产中的大规模应用。因此了解绿僵菌生长发育及致病过程中所涉及的分子机制,从基因层面提高绿僵菌的杀虫毒力、增强其抗逆境能力,是绿僵菌高效防治农林病虫害的一个关键途径。G蛋白信号调控因子（RGS）是一种GTPase激活蛋白,通过增强Gα亚基GTPase活性,促进和Gα结合的GTP的分解,进而负调控G蛋白信号转导。本论文主要对G蛋白信号途径中的不同的G蛋白信号调控因子在罗伯茨绿僵菌生长发育、抗逆和致病过程中的功能差异分析进行了系统研究,结果如下:1.G蛋白信号调控因子RGS是G蛋白信号途径中的负调控因子。本文从罗伯茨绿僵菌全基因序列中鉴定到7个分别与稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）G蛋白信号调控因子MoRGS同源的MrRGS。比对发现罗伯茨绿僵菌中MrRGS1-7蛋白与稻瘟病菌中MoRgs1-8（除MoRgs5）蛋白的氨基酸非常同源,分别达59%、43%、78%、52%、45%、45%和46%,并且这7对蛋白在特定的位置都含有相同的功能域和跨膜结构。2.不同的Mrrgs在罗伯茨绿僵菌不同生长发育阶段的转录水平有明显差异,进一步进行生物学功能分析发现这些不同的MrRGS蛋白在其生长发育中具有不同的功能。如:缺失Mrrgs1、Mrrgs2和Mrrgs6对罗伯茨绿僵菌的生长速度影响较大,同时这3个基因的缺失也影响了菌株的产孢能力,而Mrrgs3、Mrrgs4、Mrrgs5和Mrrgs7这4个基因的缺失对绿僵菌的生长速率与产孢影响不大。进一步检测绿僵菌中参与调控细胞生长或者孢子产生的基因在ΔMrrgs中的表达情况,结果显示ΔMrrgs1突变株中,wetA、StuA等产孢相关的关键基因表达量显着下降,其他的产孢相关基因flbA、flbB flbC、flbD、brlA、vosA的表达量也明显下降:存ΔMrrgs2突变株中,AbaA、wetA等产孢关键基因表达量也显着下降,flbA、brlA的表达量也都下降明显;在ΔMrrgs6突变株中产孢相关的关键基因AbaA表达量显着下降,flbB、flbD、brlA的表达量也明显下降。表明MrRGS是罗伯茨绿僵菌中调节生长发育的重要因子,参与该病菌的营养生长和产生分生孢子等生理过程。3.不同的G蛋白信号调控因子不同程度上调控罗伯茨绿僵菌的致病性。生物测定表明缺失Mrrgs3、Mrrgs4和Mrrgs7对毒力影响最大,而缺失Mrrgs2对其影响不大。在注射实验中ΔMrrgs4和ΔMrrgs6的毒力分别下降17.7%和28.4%,而缺失Mrrgs1、Mrrgs3、Mrrgs4、Mrrgs5和Mrrgs7的绿僵菌在浸渍实验的毒力分别下降29.9%、33.5%、53.4%、29.3%和32.4%。为探索其影响毒力的机理,我们分别从菌丝疏水性,附着胞的形成、菌丝的cAMP含量三个方面加以系统研究。其结果如下:（1）通过在野生型和各突变体菌株的菌落上进行疏水性测定实验。发现,ΔMrrgs3、ΔMrrgs、5菌丝的疏水性明显下降。同时检测2个与疏水性相关基因在ΔMrrgs突变株中的表达情况,结果表明,与野生菌株相比,除了 ΔMrrgs2和ΔMrrgs6,另外5个突变株中的MHP1和MPG1的表达量都下降了。表明Mrrgs3和Mrrgs5的突变直接影响了罗伯茨绿僵菌的疏水性。（2）罗伯茨绿僵菌缺失Mrrgs的突变体在疏水培养皿和蝉翅上的附着胞形成率除了 ΔMrrgs2和ΔMrrgs6,其他5个突变体都明显下降,其中,ΔMrrgs1、ΔMrrgs3、ΔMrrgs5和ΔMrrgs7下降最为显着。（3）通过HPLC液相色谱的方法测定胞内cAMP的水平。发现与野生型相比,5个ΔMrrgs中cAMP的含量有不同程度的下降,其中有ΔMrrgs1、ΔMrrgs3、ΔMrrgs和ΔMr4rgs5这4个突变株的cAMP含量下降最显着。ΔMrrgs7中cAMP含量反而上升。上述结果表明,RGS蛋白参与调控该罗伯茨绿僵菌的胞内cAMP水平。4.罗伯茨绿僵菌中不同的Mrrgs对化学试剂、热、和紫外胁迫也具有不同的功能。化学试剂胁迫实验表明不同Mrrgs对罗伯茨绿僵菌的细胞壁完整性、抗氧化和抗渗透压能力影响有明显的差异,如:ΔMrrgs2、ΔMrrgs3、ΔMrrgs5、ΔMrrgs6和ΔMrrgs7在含有H202培养基上的生长抑制率比野生型菌株分别降低76.8%、59.0%、24.2%、31.2%和86.4%。ΔMrrgs2、ΔMrrgs3和ΔMrrgs6在含有NaCl的培养基上生长抑制率比野生型菌株分别降低了 65.6%、60.9%和84.7%。而NaCl对ΔMrrgs7生长抑制率的比野生型绿僵菌相比升高了 177.8%。在热胁迫和紫外胁迫条件下孢子萌发实验发现,经42℃1h处理后,ΔMrrgs7孢子的相对萌发率显着性降低,达27.3%。在能量为60J的紫外灯下照射12 s,ΔMrrgs5孢子的相对萌发率下降明显,达37.0%。综上所述,不同的G蛋白信号调控因子在罗伯茨绿僵菌生长发育和致病过程中有不同的功能。其中,Mrrgs1、Mrrgs2和Mrrgs6对罗伯茨绿僵菌的生长速度和产孢能力起正调控作用,进一步从转录水平分析,发现这3个G蛋白信号调控因子是通过调节产孢相关基因的表达来最终影响产孢能力。另外,在对致病性的研究中发现,Mrrgs1、Mrrgs3、Mrrgs4、Mrrgs5和Mrrgs7通过调节罗伯茨绿僵菌的疏水性来影响其附着胞的形成,从而影响毒力。
张瑾瑾[6]（2019）在《稻曲病菌RasGTP酶激活蛋白UvGap1介导的Ras信号途径中相关基因功能分析》文中研究指明稻曲病是水稻穗部的真菌病害,该病害已成为水稻的主要病害之一,严重威胁水稻安全生产。本实验室前期利用农杆菌介导的遗传转化方法（ATMT）构建了稻曲病菌的T-DNA插入突变体库,从该库中筛选到一株丧失产孢能力且致病性减弱的菌株B2510。经鉴定该突变体菌株中T-DNA以双拷贝形式插入,其中一个插入位点是Uv8b1386（编码RasGTP酶激活蛋白UvGap1）的启动子区域。在前期研究基础上,本研究主要针对UvGap1介导的RAS信号途径（稻曲病菌有两个RAS蛋白,UvRas1和UvRas2）及下游的cAMP（环磷酸腺苷）途径的相关基因蛋白激酶A（UvCpka）和腺苷酸环化酶相关蛋白（UvCap1）以及MAPK（mitogen-activated protein kinase）信号途径的骨架蛋白UvSte50展开功能研究,主要研究结果如下:1、初步分析稻曲病菌RasGTP酶激活蛋白UvGap1的功能。采用CRISPR-Cas9系统对稻曲病菌目标基因进行敲除,利用PEG（聚乙二醇）介导的原生质体转化方法,将UvGAP1、UvRAS1和UvRAS2的CRISPR-gRNA载体和同源重组载体共同转化到稻曲病菌野生型菌株P1中,经过筛选后,得到UvGAP1的基因敲除突变体,但未得到UvRAS1和UvRAS2的基因敲除突变体。通过分析基因UvGAP1、UvRAS1和UvRAS2在稻曲病菌侵染阶段的表达水平发现,UvGAP1和UvRAS1在接种3天后表达量最高,UvRAS2在接种2天后表达量最高。分析ΔUvgap1相关表型发现,UvGAP1对稻曲病菌生长和分生孢子产生无显着调控作用,但基因缺失突变体完全丧失致病能力,说明该基因是稻曲病菌致病过程的必需因子。回补UvGAP1至突变体中则恢复其致病能力。2、初步分析稻曲病菌蛋白激酶A Uvcpka和腺苷酸环化酶相关蛋白Uvcap1的功能。利用CRISPR-Cas9方法对UvCPKA和UvCAP1进行敲除,获得相应的基因缺失突变体。对突变体的表型研究发现,ΔUvcpka在菌丝生长方面与野生型菌株无显着差异,但接种水稻穗部后只形成极少数的稻曲球,提示UvCPKA在稻曲病菌致病过程是必需的;△Uvcap1相较于野生型菌株,菌丝生长减慢,分生孢子产量减少,接种水稻穗部后仍可正常形成稻曲球,说明UvCAP1主要参与调控稻曲病菌菌丝生长和分生孢子产生过程。3、初步分析稻曲病菌中MAPK途径骨架蛋白Uvste50的功能。同样利用CRISPR-Cas9技术获得USTE50的基因敲除突变体。表型分析发现ΔUvste50在菌丝生长和分生孢子产生方面与野生型菌株没有显着差异,但田间接种实验显示ΔUvste50完全丧失致病能力。酵母双杂交实验发现UvGap1、UvRas1和UvRas2之间存在两两相互作用,同时UvSte50、UvRas2和UvCap1之间也存在两两相互作用;UvRas1与UvCap1之间也存在相互作用。上述结果表明UvGap1介导的Ras信号通路与下游cAMP和MAPK途径的致病相关蛋白关系密切,共同调控稻曲病菌生长发育和致病过程。本研究对于揭示稻曲病菌致病过程中的信号转导途径有重要价值,也为科学合理地制定稻曲病的防治方案提供了理论依据。
袁雪梅[7]（2019）在《灰葡萄孢BcPDR1基因调控致病力的分子机制》文中认为本实验室前期获得了灰葡萄孢致病基因BcPDR1,明确了该基因正调控病菌的生长、发育和致病力。为明确BcPDR1调控病菌致病力的分子机制,本研究利用PCR和Western blot技术,检测BcPDR1的编码功能;利用Pull down和酵母双杂交技术,对BcPDR1蛋白的互作蛋白进行了筛选与鉴定;利用数字基因表达谱、qRT-PCR技术以及酶活检测试剂盒,对受BcPDR1影响的过氧化物酶家族基因和胞壁降解酶基因进行了筛选与鉴定;利用qRT-PCR及双基因突变技术,明确了BcPDR1与病菌cAMP和MAPK信号途径的关系。主要研究结果如下:1.灰葡萄孢BcPDR1基因的编码功能研究。利用BcPDR1基因的特异性引物,对灰葡萄孢野生型菌株的cDNA和基因组DNA进行PCR扩增,结果均获得了单一条带,初步确定了BcPDR1的转录功能;利用Western blot技术,用GST Tag antibody、GFP Tag antibody、BcPDR1 antibody分别对体外诱导表达的BcPDR1-GST蛋白、回复突变体CE的总蛋白以及野生型菌株BC22和回复突变体CE的总蛋白进行检测。结果所有检测样本均获得了单一的阳性条带,与目的蛋白大小一致,表明BcPDR1具有蛋白的编码功能。2.灰葡萄孢BcPDR1互作蛋白的筛选与鉴定。利用Pull down技术,初步筛选获得了216个BcPDR1蛋白的候选互作蛋白;进一步利用生物信息学分析,筛选出12个候选互作蛋白PPDK、MDAR1、MDAR2、IMD1、PDC2、NADP-ME2、EDA9、SHM2、AIP12、U88A1、2AB2B和RAD2C。利用酵母双杂交技术,对候选互作蛋白进行鉴定。结果发现,与阴性对照相比,转化AD-BcPDR1+BD-IMD1、AD-BcPDR1+BD-SHM2和AD-BcPDR1+BD-AIP12以及BD-BcPDR1+AD-IMD1、BD-BcPDR1+AD-SHM2、BD-BcPDR1+AD-AIP12的酵母细胞在二缺（-Leu/-Trp）、三缺（-Leu/-Trp/-His）和四缺（-Leu/-Trp/-His/-Ade）培养基上均可以正常生长,表明BcPDR1与IMD1、SHM2和AIP12在酵母细胞中直接互作,而共转化了BcPDR1与其他候选互作蛋白组合的酵母细胞在二缺（-Leu/-Trp）上生长状态良好,而在三缺（-Leu/-Trp/-His）和四缺（-Leu/-Trp/-His/-Ade）培养基上均不能正常生长,表明它们不能在酵母细胞中直接互作。3.灰葡萄孢BcPDR1差异表达基因的筛选与鉴定。利用数字基因表达谱技术,筛选出933个受BcPDR1影响的差异表达基因,对差异表达基因的GO富集分析发现,差异表达基因主要集中在biological process的growth（GO:0040007）、signaling（GO:0023052）,molecular function的transporter（GO:0005215）、nucleic acid binding transcription factor（GO:0001071）、enzyme regulator（GO:0030234）、translation regulator（GO:0045182）等方面。利用表达谱数据,对差异表达的14个胞壁降解酶和29个过氧化物酶基因的表达水平进行分析,发现胞壁降解酶基因Bcpg5、Bcpgx1、Bcpg4、Bcams1、Bcmnl1在野生型BC22和回复突变体CE中的表达水平明显高于突变体BCt89和ΔBcPDR1,而基因Bcpme5、Bcpg3、Bcpme1、Bcpg6、Bcpg1在突变体BCt89和ΔBcPDR1中的表达水平明显高于野生型BC22和回复突变体CE;过氧化物酶基因BccatA、Bcprd8、Bccat3、BcppoA90、Bcprd7、Bcprd11、Bcprx3、Bccat4、Bcprd2、Bcprd5、Bcprx7在野生型BC22和回复突变体CE中的表达水平明显高于突变体BCt89和ΔBcPDR1,而基因Bcprx9、Bcprd1、Bcprd4、Bcprx8、Bcprd9、Bcccp2、Bcprd10在突变体BCt89和ΔBcPDR1中的表达水平明显高于野生型BC22和回复突变体CE。利用Real-time PCR技术,对14个胞壁降解酶基因的表达水平进行分析。结果发现,胞壁降解酶基因Bcpg5、BccutA、Bcpgx1、Bcams1、Bcmnl1、BccutB在野生型BC22和回复突变体CE中的表达水平明显高于突变体BCt89和ΔBcPDR1,而基因Bcmns1、Bcrot2、Bcpme2、Bcpg1、Bcpg3、Bcpme1、Bcpg6、Bcpg4在突变体BCt89和ΔBcPDR1中的表达水平明显高于野生型BC22和回复突变体CE。利用酶活检测试剂盒,检测灰葡萄孢野生型BC22和BcPDR1三个突变体中胞内胞壁降解酶的酶活性。结果发现,野生型BC22和回复突变体CE中多聚半乳糖醛酸酶（PMG）、果胶酶（PG）、纤维素酶（CX）、多聚半乳糖醛酸反式消除酶（PGTE）、果胶甲基反式消除酶（PMTE）的酶活性均显着高于突变体BCt89和ΔBcPDR1。表明BcPDR1正调控胞内胞壁降解酶的活性。利用Real-time PCR技术,对29个过氧化物酶基因的表达水平进行分析。结果发现,过氧化物酶基因Bcprx4、Bccat5、Bcgpx3、Bcprd3、Bcprx9、Bcprd1、Bcprx1、Bcccp1、Bcprd4、Bcprx8、Bcprd9、BcnoxA、Bcprd6、Bcccp2、Bccat2、Bccat6、BcppoA80、Bcprd10在突变体BCt89和ΔBcPDR1中的表达水平明显高于野生型BC22和回复突变体CE,而基因BccatA、Bcprd8、BcppoA90、Bcprd7、Bcprd11、Bccat4、Bcprd2、Bcprx7在野生型BC22和回复突变体CE中的表达水平明显高于突变体BCt89和ΔBcPDR1,与数字表达谱的分析结果基本一致。4.灰葡萄孢BcPDR1与cAMP、MAPK信号途径之间的关系研究。利用cAMP、MAPK信号途径抑制剂SQ22536、U0126,分析灰葡萄孢野生型BC22、突变体BCt89、ΔBcPDR1和CE对信号途径抑制剂的敏感性,发现突变体BCt89和ΔBcPDR1对抑制剂SQ22536和U0126均不敏感,受抑制的程度均明显低于野生型BC22和回复突变体CE。利用HPLC方法,检测BcPDR1基因突变体中cAMP的含量,发现突变体BCt89和ΔBcPDR1中cAMP含量均明显高于野生型BC22和回复突变体CE。利用Real-time PCR技术,检测BcPDR1突变体中cAMP和MAPK信号途径关键基因的表达水平,发现突变体BCt89和ΔBcPDR1中cAMP信号途径关键基因bcg1、bcg2、bcg3、BAC、BcpkaR、Bcpka1、Bcpka2和MAPK信号途径关键基因Btp1、BOS1、BcCDC4、BcRAC、bmp1、bmp3、BcSaK1、BAP1的表达水平均明显高于野生型BC22和回复突变体CE,而MAPK信号途径关键基因BcATF1的表达水平明显低于野生型BC22和回复突变体CE。表明灰葡萄孢BcPDR1负调控cAMP、MAPK信号途径关键基因bcg1、bcg2、bcg3、BAC、BcpkaR、Bcpka1、Bcpka2、Btp1、BOS1、BcCDC4、BcRAC、bmp1、bmp3、BcSaK1、BAP1的表达,正调控MAPK信号途径关键基因BcATF1的表达。利用Real-time PCR技术,检测cAMP和MAPK信号途径关键基因的RNAi突变体中BcPDR1基因的表达水平,发现cAMP信号途径关键基因pka1、pka2、pkaR、bcg2、bcg3的RNAi突变体中BcPDR1基因表达水平明显低于野生型,MAPK信号途径关键基因bmp1和bmp3的RNAi突变体中BcPDR1基因表达水平明显低于野生型。表明灰葡萄孢cAMP信号途径关键基因pka1、pka2、pkaR、bcg2、bcg3正调控BcPDR1基因的表达,MAPK信号途径关键基因bmp1和bmp3正调控BcPDR1基因的表达。利用双基因突变技术,获得了BcPDR1与cAMP途径关键基因Bcpka1、Bcpka2、BcpkaR、bcg2、bcg3和MAPK途径关键基因bmp1、bmp3的双基因突变体。对双基因突变体的表型和致病力进行分析,发现ΔBcPDR1/Bcpka1-OE、ΔBcPDR1/Bcpka2-OE、ΔBcPDR1/BcpkaR-OE、ΔBcPDR1/bcg2、ΔBcPDR1/bcg3、ΔBcPDR1/bmp1-OE、ΔBcPDR1/bmp3-OE的表型和致病力与突变体ΔBcPDR1相比均有不同程度的恢复。表明BcPDR1参与病菌的cAMP和MAPK信号途径。
马妮[8]（2019）在《寡孢节丛孢中亲和性cAMP磷酸二酯酶功能的初步研究》文中研究说明磷酸二酯酶（Phosphodiesterases,PDEs）在细胞信号转导过程中发挥重要作用,其能够水解胞内第二信使cAMP（环磷酸腺苷）,从而终止cAMP所参与的信号转导途径的功能。目前,在大多数真菌中报道的磷酸二酯酶家族包含了高亲和性磷酸二酯酶（pde2/pdeH）和低亲和性磷酸二酯酶（pdel/pdeL）,它们在真菌的营养菌丝生长和致病性发育过程中发挥了重要的调控作用。捕食线虫真菌的代表菌株-寡孢节丛孢（Arthrobotrys oligospora）在饥饿条件下产生三维菌网（three-dimensional networks）作为捕食器官捕捉线虫为自身生长获取营养,但是捕食器官形成的信号调控机制还不清楚。本论文以寡孢节丛孢中与构巢曲霉等丝状真菌同源的高亲和性磷酸二酯酶（AoPdeH,AOL s00083g160）和低亲和性磷酸二酯酶（AoPdeL,AOL s00097g378）为研究对象,对磷酸二酯酶编码基因进行敲除,探究磷酸二酯酶在寡孢节丛孢营养菌丝生长和致病性发育过程中所发挥的功能。主要实验结果:1.磷酸二酯酶的功能结构域和聚类分析对寡孢节丛孢两种磷酸二酯酶的功能结构域分析表明,AoPdeH含有以下的保守结构域和位点:3’5’-环核苷酸磷酸二酯酶超家族结构域（IPR036971）、磷酸二酯酶结构域（IPR003607）、3’5’-环核苷酸磷酸二酯酶催化结构域（IPR002073）和3’5’-环核苷酸磷酸二酯酶保守位点（IPR023174）;AoPdeL也含有多个保守结构域,包括是富含亮氨酸的重复结构域超家族（IPR032675）、核糖核酸酶Z/羟基酰基谷胱甘肽水解酶样（IPR036866）和cAMP磷酸二酯酶结构域（IPR000396）。聚类分析表明,AoPdeH和AoPdeL分别聚类于2个不同进化分支上,由此可以初步推断这两个蛋白在真菌中可能发挥着不同的作用。2.磷酸二酯酶敲除突变株的营养菌丝生长、抗逆性和致病性分析利用同源重组技术对两种磷酸二酯酶编码基因进行敲除,成功获得两种磷酸二酯酶基因的敲除突变株,对突变株的菌丝形态、生长速率、抗逆境胁迫能力、杀线虫能力、胞外蛋白酶活性以及三维菌网形态和数量进行了统计比较。结果发现AoPdeH基因的缺失造成其突变株生长速率显着减慢、气生菌丝出现缺陷、菌丝横膈膜增多且发生膨大变形、对环境压力敏感性增强,除此之外,ΔAoPdeH突变株失去形成成熟三维菌网的能力,杀线虫能力显着降低但并没有完全丧失杀线虫能力,对其发酵液进行蛋白酶活性分析,发现突变株胞外蛋白酶活性没有明显变化。然而,ΔAoPdeL突变株的生长速率、抗逆境胁迫能力与寡孢节丛孢野生型菌株相比没有显着差异,杀线虫能力和产生三维菌网数量有所下降,菌丝形态有膨大变形现象。以上实验结果表明AoPdeH参与了寡孢节从孢的菌丝生长、抗逆性和致病性发育相关的生物学过程的调控。3.磷酸二酯酶参与产孢过程的调控产孢量比较发现,ΔAoPdeH突变株分生孢子产量仅为野生型菌株孢子产量的2～6%,ΔAoPde 突变株的分生孢子产量与野生型菌株相比无显着差异。光学显微镜观察发现,两种磷酸二酯酶基因突变株孢子形态皆发生变形,变得狭长无横膈膜,除此之外ΔAoPdeH突变株分生孢子梗的数量明显少于野生型菌株,且孢子梗上几乎没有孢子着生,ΔAoPdeL突变株分生孢子梗数量及孢子着生方式与寡孢节丛孢野生型菌株相比无明显差异。为进一步探讨磷酸二酯酶对产孢的调控作用,选取13个产孢调控基因在产孢初期（3 days）、产孢中期（5 days）和孢子成熟期（7 days）进行荧光定量PCR分析,结果表明,ΔAoPdeH突变株13个产孢调控基因中FlbA、Acr1、FluG、VelB、NsdD、FlbC、PkaC1、Plp1、AbaA、LreA和LreB的转录水平皆下调,而在分生孢子产量与野生型菌株没有明显差异的ΔAoPdeL突变株中,13个产孢调控基因的转录水平与野生型菌株相比无明显变化。以上实验结果表明AoPdeH参与了寡孢节丛孢的产孢过程的调控。4.磷酸二酯酶参与寡孢节丛孢菌丝内cAMP水平调控通过酶联免疫法测定突变株营养菌丝生长和致病性发育过程中不同时间点的菌丝内cAMP含量,结果表明,在所选取的所有时间点ΔAoPdeH敲除株和ΔAoPdeL敲除株菌丝内cAMP含量均高于寡孢节丛孢野生型菌株。为进一步分析磷酸二酯酶对cAMP水平的调控机制,选取16个磷酸二酯酶上下游的关键基因以及参与调节cAMP含量的相关基因进行荧光定量PCR（RT-PCR）分析,其中cAMP受体样蛋白和cAMP反应原件结合蛋白、腺苷酸环化酶表达量发生了明显变化（在菌丝生长发育期间显着上调,致病性发育期间显着下调）,说明磷酸二酯酶可能通过调控上述基因的表达水平从而参与寡孢节丛孢cAMP含量的调节。本文的创新点:1.首次在寡孢节丛孢中成功敲除了磷酸二酯酶家族的蛋白编码基因,发现AoPdeH参与寡孢节从孢营养菌丝生长、无性产孢、抗逆境胁迫压力、捕食器官形成和菌丝内cAMP含量调节等重要生物学过程的调控。2.通过RT-PCR比较了AoPdeH、AoPdeL、分生孢子发育调控以及cAMP合成等相关基因在ΔAoPdeH突变株、ΔAoPdeL突变株和野生型菌株中不同时间点的转录水平变化,推测磷酸二酯酶参与寡孢节丛孢中分生孢子的发育以及cAMP合成等相关基因的表达调控。
陈超[9]（2018）在《基于miRNA和比较蛋白质组学联合研究参志苓（开心散方）治疗抑郁症的分子调控机制》文中提出背景:抑郁症发生机制复杂,其分子水平的发病机理尚不明确,一线治疗药物应答率有限。中药多途径、多靶点的协同作用特点,对于提高抗抑郁治疗效率和抑郁药新靶点的选择具有重要的引导和推动作用。开心散是唐宋以来中医传统益气养心、安神定志的代表方和基本方,课题组前期已在经典抑郁动物和细胞模型进行了深入的药效物质基础和作用机制的研究,但尚未在临床水平发现和验证其成药制剂参志茶的效应机制和有效靶点。目的:参志苓是经典抗抑郁古方开心散的中药成药制剂,本研究旨在临床水平采用系统生物学方法筛选参与抑郁病理生理进程的分子标记物和参志苓的作用靶点,以期基于临床疗效阐明参志苓抗抑郁的分子作用机制和相关生物学途径。方法:采集“参志苓片随机、双盲双模拟、阳性药平行对照治疗轻/中度抑郁症的有效性和安全性临床试验”受试者的外周血样本,选取抑郁症首发未用药和参志茶治疗8周显效患者的血清样本,并匹配健康对照,通过生物信息学分析筛选出在血清中差异表达的miRNAs,并遴选与抑郁和参志苓抗抑郁作用相关的目标miRNAs进行RT-PCR验证,从而在转录后调控水平寻找潜在的分子治疗靶标。基于miRNA表达谱中发现新的分子靶标miR-1281,在体外培养的SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞系中,建立皮质酮损伤体外模拟抑郁模型并予以不同浓度开心散处理,以考察miR-1281及其预测的靶基因在神经细胞中的表达情况及开心散的干预作用;通过双萤光素酶报告基因的方法分别检测miR-1281对野生型/突变型ADCY1和DVL1的降解能力,验证miR-1281对ADCY1和DVL1的靶向调控作用;构建miR-1281过表达的慢病毒表达载体,并予以不同浓度开心散处理,采用CCK8法、流式细胞术、PCR等方法,研究miR-1281表达水平的变化对神经细胞增殖、凋亡等细胞表型以及靶基因的影响;采用western blot检测miR-1281过表达对cAMP/PKA/ERK/CREB和Wnt/β-catenin信号转导通路靶蛋白的影响。采用蛋白质组学非标记定量（Lable-free）技术结合LC-MS/MS的方法,检测健康对照组、抑郁症首发未用药组和参志苓治疗8周显效患者的血清样本,通过生物信息学分析筛选出在血清中差异表达的蛋白,然后遴选与抑郁和参志茶抗抑郁作用相关的关键差异靶蛋白进western blot验证,并解析相关的生物学途径。基于蛋白组学结果的提示,采用比浊法原理对参志茶体外抗血小板聚集活性（THR、ADP、AA、COLL为诱导剂）进行评价,采用竞争性酶联免疫吸附法测定参志茶对凝血酶诱导的血小板cAMP含量和5-HT的影响,以及健康对照、抑郁症、参志苓服用8周显效患者血清样本中BDNF和5-HT的含量,采用荧光分光光度法测定参志苓对静息状态和凝血酶诱导的血小板Ca2+离子含量的影响,采用western blot分别测定参志茶对凝血酶诱导的血小板BDNF蛋白表达水平的影响,并在临床水平测定HC、DP、SZL三组血清样本中凝血酶原的表达情况,采用血凝仪检测参志苓给药前后患者血浆样本的凝血五项变化。结果:通过高通量基因芯片筛选的方法,筛选出在临床外周血清样本中差异表达的miRNAs,在抑郁患者中共鉴定出112个差异具有显着性的miRNAs,其中23个上调,89个下调;与抑郁患者给药前相比,在参志苓给药8周后共鉴定出46个个差异具有显着性的miRNAs。两者取交集,共有45个miRNAs表达差异显着,其中17个上调,28个下调,既可能是抑郁症发病的生物标记物,又可能是参志茶抗抑郁的作用靶标。然后使用实时荧光定量PCR扩大血清样本验证了交集中10个差异表达的候选目标miRNAs,有6个miRNA（miR-1281、miR-365a-3p、miR-2861、miR-16-5p、miR-1202、miR-451a）的表达与芯片检测结果一致,其中miR-1281在抑郁患者中高表达,表达水平约为正常对照的4倍,而在参志茶给药后下调,组间差异显着,且microRNA-gene-pathway-net分析显示miR-1281网络赋值较高,预测其能调控的靶基因多为与抑郁相关的经典信号通路上的关键节点,提示miR-1281的调控异常可能与抑郁发病和参志茶抗抑郁作用相关。进一步细胞功能学实验显示,皮质酮诱导损伤的SH-SY5Y细胞中miR-1281表达水平升高,而其预测的靶基因ADCY1和DVL1表达水平降低,开心散干预后呈剂量相关性同时反向减低/升高。转染突变型ADCY1和DVL1质粒组的HEK293细胞内ADCY1和DVL1的水平明显高于野生型质粒组,说明野生型ADCY1和DVL1可与miR-1281特异性结合并被降解,ADCY1和DVL1可能是miR-1281的靶基因。转染miR-1281慢病毒后SH-SY5Y细胞存活率降低并凋亡明显,开心散干预后存活率显着增加,并明显抑制细胞早期凋亡。同时在miR-1281过表达的SH-SY5Y细胞系中,ADCY1mRNA和DVL1mRNA表达水平下调,由ADCY1介导的cAMP信号通路上的PKA、pERK1/2、CREB、p-CREB、BDNF蛋白水平明显降低,开心散干预后蛋白水平呈剂量相关性显着性增高,而由DVL1介导的Wnt信号通路上的GSK-3β蛋白表达水平增高,pGSK-3β和β-catenin蛋白表达水平降低,开心散干预后表达水平也发生反向变化。通过Lable-free联合LC-MS/MS总共鉴定出878种蛋白质,与健康对照相比,抑郁患者组有31种蛋白质呈显着性差异表达（>1.5或<0.67倍,p<0.05）,其中又有12种蛋白质在参志苓给药8周后表现出反转表达趋势,组间差异具有显着性。这12种蛋白质的细胞定位集中在富含血小板α颗粒,通路富集于血小板脱颗粒、血小板胞质Ca2+升高、补体和凝血级联、血小板活化等,随后我们通过western blot进一步验证了 VWF、SERPINA1、APOC3、A2M表达水平的动态变化与蛋白谱一致。基于蛋白质组学的研究结果提示,我们进一步考察了不同浓度的开心散对THR、ADP、AA、COLL诱导的人血小板聚集抑制作用,发现与空白对照组相比,KXS可呈剂量依赖性的显着抑制THR和ADP引起的血小板聚集,对COLL诱导的血小板聚集仅在KXS高浓度时体现出微弱的抑制作用,而对AA诱导的血小板聚集基本没有抑制作用。在使用Fura-2荧光标记示踪观察KXS对凝血酶激活的血小板胞浆游离钙动员的影响时发现,150μg/mL的KXS提取物不论在有无外钙存在的条件下,均能够使凝血酶诱导血小板胞浆内Ca2+水平显着降低。通过KXS对血小板聚集过程中核苷酸系统、内含释放物影响的研究也证实,不同浓度KXS体外孵育可显着增加血小板cAMP水平,抑制凝血酶诱导的血小板活化所致BDNF的释放,降低血小板5-HT的含量。同时,其成药制剂SZL可在临床水平增加抑郁患者血清BDNF水平,降低血清凝血酶原和5-HT水平,但对凝血酶原时间、活化部分凝血活酶时间、凝血酶时间、国际标准化比值比无影响。结论:基于RCT临床研究的外周血样本开展了经典古方开心散成药（参志茶片）的转录后调控和蛋白质组学研究,筛选并验证了与抑郁发生和参志茶抗抑郁作用相关的差异miRNAs和靶蛋白,发现了 miR-1281是在外周临床样本中被鉴定出来的一种新的可能与抑郁和参志茶抗抑郁作用相关的微小RNA,同时蛋白组学研究显示参志茶抗抑郁的生物学途径与血小板活化、脂质代谢、凝血级联和免疫应答有关,并对VWF、SERPINA1、APOC3等与心血管相关的蛋白表达有明显的影响,提示其参与了对抑郁患者心血管功能的调节作用。基于临床水平miRNA表达谱的发现,通过体外研究阐明了过表达miR-1281对神经细胞具有损伤作用,开心散可能通过下调miR-1281水平同时靶向ADCY1和DVL1,从而激活cAMP/PKA/ERK/CREB和Wnt/β-catenin信号转导通路来发挥神经细胞保护作用;基于临床水平蛋白质组学的发现,初步探讨了开心散发挥抗抑郁作用的另一种可能机制一抑制凝血酶诱导的血小板活化,并通过体外研究初步阐明了开心散是通过抑制血小板内钙释放、外钙内流和降低cAMP水平发挥抑制活化作用,并能够影响血小板BDNF的分泌和生成、降低血小板5-HT含量,与前期蛋白组学研究结果相吻合,这可解释开心散通过影响血小板功能发挥抗抑郁的生物学效应。提示开心散在调控抑郁症相关分子网络的同时,对抑郁导致心血管疾病的共病机制之一血小板活化也显示出调控效应,并在临床水平未见相关出血风险,可能成为治疗双心疾病的潜在优选药物。
尹梓屹[10]（2018）在《MAPK蛋白激酶介导的细胞壁完整性通路协调cAMP途径与细胞自噬调控稻瘟病菌发育及致病力的机制研究》文中认为水稻是我国主要的粮食作物,其种植面积约占全国耕地面积的1/4,年产量约占全国粮食总产量的一半。然而,水稻病害一直严重影响着水稻的生产,同时还影响稻米的品质和商品价值。稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）引起的水稻稻瘟病（rice blast）是水稻上一种毁灭性的真菌病害,也是威胁世界粮食安全的主要病害,每年造成的粮食损失能够养活超过六千万人口。目前对于稻瘟病的防治主要采用选育抗病丰产优质良种为中心,科学栽培措施和化学保护为辅的综合治理措施。但是,由于稻瘟病菌在大田中易发生变异,抗病品种在种植3～5年后就降低或彻底丧失抗性,且化学防治所使用的药剂较为单一,主要为三环唑类药物。因此,进一步探索稻瘟病菌致病的分子机制有助于开发新的杀菌剂靶标,以更好的控制稻瘟病的危害。本论文主要对稻瘟病菌胞内信号传导途径的相关蛋白在稻瘟病菌生长发育以及致病过程中的功能和各信号通路之间的协调互作进行系统研究。细胞壁是丝状真菌抵御外界胁迫的第一道屏障,也参与细胞与外界的信号传导和物质交换,对维持细胞形态具有重要作用。前期工作中发现在稻瘟病菌中,一个高亲和性的磷酸二酯酶MoPdeH不仅参与胞内cAMP信号通路的调控,还能调节细胞壁完整性（Cell Wall Integrity,CWI）及致病力,但是对于其调控CWI的具体机制并不清楚。本文通过蛋白质免疫共沉淀的方法,筛选到一个与MoPdeH相互作用的蛋白激酶MoMck1,它是控制稻瘟病菌细胞壁完整性通路的丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）途径中的一个关键蛋白。过表达MoMCK1可以部分的抑制AMopdeH突变体在菌丝自溶以及致病力方面的缺陷,说明MoPdeH可以通过CWI相关的MAPK途径调控细胞壁完整性。进一步发现,CWI通路的三个关键蛋白MoMck1,MoMkk1以及MoMps1都可以通过调控MoPDEH的表达量反馈调节胞内的cAMP水平。同时,通过对MoMkk1蛋白功能的研究,进一步完善了细胞壁完整性相关的MAPK通路:发现MoMkk1参与调控稻瘟病菌的气生菌丝形态建成、无性繁殖以及致病力。另外,MoMkk1还介导了细胞壁完整性通路与渗透压胁迫通路（HOG1-MAPK）、未折叠蛋白反应（UPR）途径间的交又对话。以上结果表明,MoPdeH作用在MoMck1-MoMkk1-MoMps1这条细胞壁完整性通路的上游,并且将稻瘟病菌中的cAMP通路、细胞壁完整性通路、渗透压胁迫通路以及未折叠蛋白反应途径联系起来,共同完成对外界环境胁迫的应答。细胞壁的形成很大程度依赖于在内质网中加工并向菌丝顶端运输的细胞壁组分蛋白,同时稻瘟病菌侵染水稻早期也需合成并分泌大量的效应蛋白干扰寄主的免疫反应,促进病菌的侵染。上述蛋白质大量合成时,常因蛋白质错误折叠而滞留在内质网中造成胁迫,病菌需激活下游的未折叠蛋白反应适应此胁迫。本文研究发现,内质网压力胁迫（DTT）可以激活CWI和细胞自噬,并且使MoAtg1激酶复合体结合到MoMkk1上,代替MoMck1激活MoMkk1-MoMps1磷酸化。实验发现,缺失CWI组分会影响细胞自噬进程;同时,过表达MoAtg1复合体组分可以完全互补缺失MoMCK1造成的缺陷,说明CWI与细胞自噬存在交叉对话关系。另外,过表达MoAtg1复合体的组分可以一定程度上增强稻瘟病菌在中抗水稻品种K23上的致病力,暗示着CWI与细胞自噬过程协同作用在稻瘟病菌侵染过程中具有重要作用。这些结果揭示了 CWI与细胞自噬过程存在交叉对话,阐明了在内质网胁迫下,病菌协调细胞自噬与CWI途径维持其正常生长发育和致病力的分子机制。RGS蛋白是生物体内cAMP途径的重要负调控因子,可以加速G蛋白α亚基自身的GTP水解酶活性,促使Gα亚基重新与Gβγ二聚体重新聚合成异三聚体,从而关闭cAMP途径。实验室前期研究结果表明,稻瘟病菌（M.oryzae）中含有8个RGS以及RGS-like蛋白（MoRgs1～8）,它们共同或单独的调控病菌的生长、分化及致病力。在这些RGS蛋白中,MoRgs7十分独特,除了具有保守的RGS功能域外,在N端还存在一个7次跨膜结构;MoRgs7在病菌附着胞形成的初期定位于芽管中高度动态的囊泡状结构（晚期内含体）中,并随着附着胞的成熟而逐渐被降解,这暗示着MoRgs7在激活信号通路过程中可能存在着作用。另外,通过co-IP方法鉴定到一个MoRgs7的互作蛋白MoMip11（Magnaporthe oryzae Mip11）,它是Gib2/RACK1/Asc1的同源蛋白。除了 MoRgs7外,MoMip11还选择性的与cAMP通路中多个调节因子相互作用,包括Gα亚基MoMagA,磷酸二酯酶MoPdeH。进一步的研究发现,MoMip11可以帮助激活MoMagA,并抑制MoPdeH的酶活性,同时可以干扰MoRgs7与激活态Gα的互作,从而综合的正调控胞内的cAMP水平。研究还发现MoMip1 1对于病菌响应多种外界环境胁迫都至关重要。总的来说,这部分我们发现了支架蛋白MoMip11与RGS蛋白互作并调控胞内的cAMP通路、胁迫应答以及致病力的一种新机制,凸显了多方面的调节网络在稻瘟病菌的生长、发育及致病过程中所发挥的重要作用。综上所述,稻瘟病菌中MAPK介导的细胞壁完整性通路通过协调cAMP通路、未折叠蛋白反应途径以及细胞自噬过程,共同调控稻瘟病菌的生长分化以及致病力。
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
| 摘要 |
| abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 FSH调节卵泡发育 |
| 1.1.1 FSH调节卵泡发育功能 |
| 1.1.2 FSH协同信号轴调节卵泡颗粒细胞功能 |
| 1.2 AKT信号通路相关生物学调控机制研究 |
| 1.2.1 PI3K-AKT信号通路的激活及通信过程 |
| 1.2.2 PI3K-AKT信号通路的生物学作用 |
| 1.3 PI3K-AKT信号通路调控卵泡发育机制研究 |
| 1.4 FOXO1转录因子的功能研究进展 |
| 1.4.1 FOXO1在细胞中的生物学调控功能 |
| 1.4.2 FOXO1在卵泡中的细胞生物学调控功能 |
| 1.5 POSTN生物功能研究 |
| 1.6 本研究的目的和意义 |
| 2 实验一 绵羊POSTN基因的克隆及表达分析 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 试验样品 |
| 2.1.2 主要试剂与药品 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 不同直径卵泡及黄体分离 |
| 2.2.2 不同直径卵泡中MGCs,TCs,COC和Oocyte的收集 |
| 2.2.3 RNA提取和反转录 |
| 2.2.4 POSTN基因cDNA克隆 |
| 2.2.5 胶回收及转化 |
| 2.2.6 POSTN基因cDNA生物信息学分析 |
| 2.2.7 qRT-PCR方法检测POSTN在绵羊不同组织中的表达 |
| 2.2.8 免疫组化检测绵羊卵巢中POSTN的表达 |
| 2.2.9 Western Blot法检测POSTN蛋白表达 |
| 2.2.10 免疫荧光检测GCs中POSTN的表达 |
| 2.2.11 不同直径腔卵泡液中POSTN和生殖激素浓度检测 |
| 2.2.12 统计分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 绵羊组织及卵泡GCs总RNA提取 |
| 2.3.2 POSTN cDNA序列的克隆及生物信息学分析 |
| 2.3.3 POSTN基因在绵羊不同组织中表达分析 |
| 2.3.4 POSTN在不同直径卵泡及卵泡细胞中的表达分析 |
| 2.3.5 POSTN在GCs的定位及表达 |
| 2.3.6 不同直径卵泡中POSTN和FSH、LH和17β-E_2含量水平 |
| 2.3.7 POSTN与FSH、LH和17β-E_2在不同直径卵泡中相关性分析 |
| 2.3.8 POSTN mRNA与FSHR、LHR和ER表达相关性分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 3 实验二 FSH对绵羊卵泡GCs中POSTN的表达具有调节作用 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 试验样品 |
| 3.1.2 主要试验试剂 |
| 3.1.3 主要仪器设备 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 卵泡GCs收集 |
| 3.2.2 绵羊GCs凋亡检测 |
| 3.2.3 FSH对体外培养的GCs的活性影响 |
| 3.2.4 FSH对体外培养的GCs细胞周期检测 |
| 3.2.5 POSTN siRNA化学合成 |
| 3.2.6 绵羊卵泡中GCs原代培养 |
| 3.2.7 POSTN siRNA细胞转染 |
| 3.2.8 转染POSTN-siRNA后GCs活性检测 |
| 3.2.9 转染POSTN-siRNA后GCs周期检测 |
| 3.2.10 转染POSTN-siRNA后GCs凋亡检测 |
| 3.2.11 GCs复苏及培养 |
| 3.2.12 GCs RNA提取和逆转录 |
| 3.2.13 qRT-PCR检测GCs中POSTN-siRNA转染效率 |
| 3.2.14 qPCR检测GCs中基因表达 |
| 3.2.15 Western Blot法检测蛋白表达 |
| 3.2.16 数据分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 不同浓度FSH对体外培养的GCs生长的影响 |
| 3.3.2 不同浓度FSH对体外培养的GCs凋亡影响 |
| 3.3.3 不同浓度FSH对体外培养的GCs周期影响 |
| 3.3.4 FSH对GCs中POSTN不同时期表达影响 |
| 3.3.5 FSH上调GCs中PCNA,Ccnd-2,Bcl-2和POSTN表达 |
| 3.3.6 POSTN-siRNA干扰效率检测 |
| 3.3.7 转染POSTN-siRNA对GCs活性的影响 |
| 3.3.8 转染POSTN-siRNA对GCs凋亡的影响 |
| 3.3.9 敲减POSTN可增加GCs凋亡 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 4 实验三 FSH通过AKT-FOXO1信号通路激活转录因子SRF调控POSTN表达 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 试验样品 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器设备 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 绵羊卵泡中GCs分离和原代培养 |
| 4.2.2 GCs复苏及培养 |
| 4.2.3 蛋白激酶活性测定 |
| 4.2.4 GCs RNA提取和逆转录 |
| 4.2.5 绵羊POSTN启动子克隆及生物信息学分析 |
| 4.2.6 绵羊POSTN启动子5'缺失片段克隆及载体构建 |
| 4.2.7 目段片段与载体连接 |
| 4.2.8 GCs转染及相对荧光素酶活性分析 |
| 4.2.9 POSTN启动子转录因子结合位点突变分析 |
| 4.2.10 染色质免疫沉淀(ChIP) |
| 4.2.11 PCR扩增 |
| 4.2.12 统计学分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 FSH诱导的细胞信号通路对POSTN表达的影响 |
| 4.3.2 GCs中AKT和FOXO1磷酸化激活POSTN表达 |
| 4.3.3 FSH通过AKT/FOXO1信号通路调控GCs中POSTN表达 |
| 4.3.4 POSTN启动子克隆及分析 |
| 4.3.5 POSTN启动子不同大小片段的克隆及载体构建 |
| 4.3.6 POSTN启动子活性分析 |
| 4.3.7 POSTN启动子活性区转录因子结合位点突变分析 |
| 4.3.8 ChIP鉴定转录因子结合 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 5 全文总体结论、创新点 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 创新点 |
| 6 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一章 前言 |
| 1 激素调控昆虫变态发育 |
| 2 20E作用的分子机制 |
| 2.1 蜕皮激素及其对蜕皮变态的调控 |
| 2.2 20E基因组信号途径 |
| 2.3 20E非基因组信号途径 |
| 2.4 20E的运输方式 |
| 3 存在的科学问题,研究方案和意义 |
| 第二章 蜕皮激素竞争结合多巴胺/蜕皮激素受体抑制鳞翅目昆虫取食并促进化蛹的研究 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 在20E调节下,DopEcR在大脑中高表达 |
| 3.2 20E抑制幼虫取食,DA参与幼虫取食 |
| 3.3 干扰DopEcR可以减少幼虫进食并延迟化蛹 |
| 3.4 20E拮抗多巴胺功能 |
| 3.5 DopEcR参与20E信号途径 |
| 3.6 DopEcR与Gαq和Gαs相互作用以调节蛋白质的磷酸化 |
| 3.7 DopEcR结合20E的结构模拟 |
| 3.8 DopEcR结合20E |
| 4 讨论 |
| 4.1 20E与DopEcR结合导致幼虫停止进食并传导化蛹信号 |
| 4.2 GPCR结合20E |
| 4.3 20E上调DopEcR表达 |
| 4.4 多个GPCR传输20E信号 |
| 5 结论 |
| 第三章 蜕皮激素诱导G蛋白偶联受体3形成同源四聚体传递信号并通过该受体易化扩散进入细胞 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 GPCR-3参与20E信号途径 |
| 3.2 GPCR-3变态过程中表达上调 |
| 3.3 GPCR-3干扰抑制20E诱导的化蛹、组织重塑和基因表达 |
| 3.4 GPCR-3参与了20E诱导的快速细胞反应和蛋白质磷酸化 |
| 3.5 20E诱导GPCR-3的磷酸化和内化 |
| 3.6 GPCR-3结合20E |
| 3.7 GPCR-3以同源二聚体存在,并通过20E诱导为同源四聚体 |
| 3.8 GPCR-3促进20E进入细胞 |
| 4 讨论 |
| 4.1 20E通过GPCR-3传输信号和终止信号 |
| 4.2 多个GPCR结合20E的细胞膜受体 |
| 4.3 20E促进GPCR-3形成同源四聚体易化20E进入细胞 |
| 4.4 GPCR-3四聚体增加组织中20E滴度进而促进细胞凋亡 |
| 5 结论 |
| 第四章 论文创新点总结及意义 |
| 4.1 论文创新点总结及意义 |
| 4.2 后期工作展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间发表论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 1 引言 |
| 1.1 绒山羊概况 |
| 1.2 皮肤毛囊结构及细胞类型研究进展 |
| 1.3 单细胞转录组学概述 |
| 1.4 蛋白质组学概况 |
| 1.5 本研究的目的、意义及主要研究内容 |
| 1.6 技术路线图 |
| 2 研究一 单细胞转录组学揭示绒毛周期转换的调控机制 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 试验主要仪器与试剂 |
| 2.1.3 试验方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 毛囊细胞的分离 |
| 2.2.2 毛囊周期中的单细胞测序和细胞异质性的表征 |
| 2.2.3 揭示不同毛囊周期中细胞命运决定和中间状态细胞 |
| 2.2.4 毛囊周期的分支分析 |
| 2.2.5 基于伪时间排序分析揭示所有细胞簇的细胞命运 |
| 2.2.6 细胞命运1细胞分化和基因表达促进毛囊周期从休止期到生长期过渡 |
| 2.2.7 细胞命运2细胞动力学和基因表达促进毛囊周期从生长期向退行期演变 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 3 研究二 单细胞转录组学揭示绒山羊毛囊真皮乳头细胞的中间状态和功能 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 试验主要仪器与试剂 |
| 3.1.3 试验方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 毛乳头细胞群体鉴定 |
| 3.2.2 DP细胞簇分离及命运决定 |
| 3.2.3 分支点4分析-休止期凋亡细胞命运 |
| 3.2.4 DP细胞命运的转变-休止期的结束和生长期的启动 |
| 3.2.5 DP细胞命运3--毛囊周期的启动 |
| 3.2.6 DP细胞的最终命运-毛囊结构发育完成,旧发脱落和新发生长 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 4 研究三 蛋白质组学揭示毛囊周期中蛋白表达变化规律 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试验材料 |
| 4.1.2 试验主要仪器与试剂 |
| 4.1.3 试验方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 液相色谱质谱联用数据采集 |
| 4.2.2 不同毛囊周期的主成分分析及蛋白鉴定 |
| 4.2.3 蛋白功能探究及分类 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 5 研究四毛囊周期中毛囊细胞的位置、数量变化及细胞迁移的规律研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 试验材料 |
| 5.1.2 试验主要仪器与试剂 |
| 5.1.3 试验方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 休止期毛囊细胞的鉴定与定位 |
| 5.2.2 生长期前期毛囊结构及细胞动态变化分析 |
| 5.2.3 生长期毛囊细胞的动态变化及位置的迁移分析 |
| 5.2.4 退行期毛囊细胞的动态变化及位置的迁移分析 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 6 研究五 毛囊细胞表达在蛋白水平及细胞水平的验证 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 试验材料 |
| 6.1.2 试验主要仪器与试剂 |
| 6.1.3 试验方法 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 Western blot揭示细胞数量及基因表达量的变化 |
| 6.2.2 质粒构建结果 |
| 6.2.3 毛囊细胞培养与鉴定 |
| 6.2.4 毛囊细胞转染 |
| 6.2.5 荧光定量检测 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 小结 |
| 7 全文主要结论、创新点及下一步研究展望 |
| 7.1 全文主要结论 |
| 7.2 创新点 |
| 7.3 下一步研究展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 上篇 文献综述 |
| 第一章 环腺苷酸cAMP信号途径的研究进展 |
| 1 PDEs的定位决定cAMP的定位模式 |
| 2 线粒体cAMP的研究进展 |
| 2.1 线粒体外膜cAMP的研究进展 |
| 2.2 线粒体基质中cAMP的研究进展 |
| 3 稻瘟病菌中cAMP信号途径的研究进展 |
| 3.1 稻瘟病菌概述 |
| 3.2 稻瘟病菌中cAMP信号途径研究进展 |
| 4 磷酸二酯酶PDEs在真菌中的研究进展 |
| 4.1 磷酸二酯酶在酵母中的研究进展 |
| 4.2 磷酸二酯酶在稻瘟病菌中的研究进展 |
| 4.3 磷酸二酯酶在黑粉菌中的研究进展 |
| 5 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 第二章 真菌中嘌呤代谢通路的研究进展 |
| 1 嘌呤及其在细胞中的功能 |
| 2 嘌呤是氮的来源 |
| 3 嘌呤的补充途径 |
| 4 嘌呤的合成 |
| 5 病原真菌中嘌呤代谢的研究进展 |
| 5.1 白色念珠菌中嘌呤代谢研究进展 |
| 5.2 隐球酵母中嘌呤代谢的研究进展 |
| 5.3 曲霉中嘌呤代谢的研究进展 |
| 5.4 稻瘟病菌中嘌呤代谢的研究进展 |
| 6 嘌呤代谢可作为抗真菌剂药剂靶标 |
| 7 总结 |
| 参考文献 |
| 下篇 研究内容 |
| 第一章 稻瘟病菌磷酸二酯酶MoPdeH和MoPdeL结构域功能解析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试菌株和培养条件 |
| 1.2 结构域缺失、HD结构域、嵌合基因原核表达载体构建 |
| 1.3 稻瘟病菌RNA的提取、cDNA的合成与实时定量PCR |
| 1.4 胞内cAMP含量测定 |
| 1.4.1 样品处理 |
| 1.4.2 上机检测 |
| 1.5 菌丝自溶与表面疏水性测定 |
| 1.6 产孢量测定、附着胞形成及膨压测定 |
| 1.7 致病力测定和活性氧检测 |
| 1.7.1 水稻叶片喷雾接种 |
| 1.7.2 水稻叶鞘注射接种 |
| 1.7.3 病斑分级统计分析 |
| 1.7.4 病斑生物量测定 |
| 1.7.5 活性氧检测 |
| 1.8 胞外磷酸二酯酶PDEase酶活测定 |
| 1.9 蛋白同源建模 |
| 1.10 腺苷酸环化酶抑制试验 |
| 1.11 MpsⅠ磷酸化检测试验 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 △MopdeH中过表达MoPdeL部分回补胞内cAMP水平及亲水界面附着胞形成率 |
| 2.2 结构域预测和载体构建 |
| 2.3 结构域缺失菌株及嵌合菌株均没有回补△MopdeH突变体胞内cAMP水平 |
| 2.4 MoPdeH的HD结构域及EAL位点对维持细胞壁完整性及表面疏水性至关重要 |
| 2.5 结构域缺失和嵌合菌株均没有回补△MopdeH突变体产孢量与孢子形态缺陷 |
| 2.6 MoPdeH~(△HD+L1L2)、MoPdeH~(△HD+L1)和MoPdeH~(△HD+L2)部分回补△MopdeH突变体亲水界面附着胞形成率 |
| 2.7 MoPdeH~(△HD-L1)部分回补△MopdeH突变体的致病力 |
| 2.8 结构域缺失菌株及嵌合菌株清除寄主活性氧的能力受到抑制 |
| 2.9 结构域缺失菌株与嵌合菌株胞内Mps1磷酸化水平下降 |
| 2.10 MoPdeH的HD结构域可回补突变体AMopdeH的表型缺陷 |
| 2.11 HD结构域和EAL位点对MoPdeH的酶活至关重要 |
| 2.12 抑制△MopdeH中腺苷酸环化酶的酶活,可回补突变体在亲水界面上附着胞的形成 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 肌苷-5’-单磷酸脱氢酶MoImd4调控MoPdeH介导的cAMP信号途径和胞内嘌呤代谢通路控制稻瘟病菌的生长发育及致病力 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试菌株与培养条件 |
| 1.2 MPA结合位点点突变菌株营养生长测定 |
| 1.3 GST pull-down试验 |
| 1.4 MoImd4体外酶活,Km值(米氏常数)和Kii值(抑制剂常数)的测定 |
| 1.5 胞内XMP, GTP和cAMP含量测定 |
| 1.6 MoImd4与其点突变蛋白及功能域缺失蛋白对MoPdeH酶活影响的测定 |
| 1.7 蛋白同源建模 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 MoPdeH与Molmd4互作 |
| 2.2 MoImd4是黄嘌呤单磷酸盐(XMP)合成必需的 |
| 2.3 XMP合成受损抑制稻瘟病菌生长与致病力 |
| 2.4 失活MPA结合位点降低MoImd4的酶活 |
| 2.5 Molmd4在嘌呤代谢的从头合成中必不可少 |
| 2.6 外源添加XMP抑制点突变S345AC347A菌株的生长与致病力缺陷 |
| 2.7 MoImd4促进磷酸二酯酶MoPdeH的酶活 |
| 2.8 MoImd4的T268、R269、D380、G382、G403、Y428、#R458和Y459氨基酸位点对促进MoPdeH磷酸二酯酶的酶活有重要作用 |
| 2.9 MPA处理不影响MoImd4与MoPdeH之间的互作强度 |
| 2.10 MoPdeH促进肌苷-5,-单磷酸脱氢酶MoImd4的酶活 |
| 2.11 MPA作为杀菌剂先导化物控制稻瘟病菌 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 线粒体相关蛋白MoTom70与MoPic在稻瘟病菌生长发育及致病过程中的功能研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试菌株及培养条件 |
| 1.2 体内Co-IP试验 |
| 1.3 系统发育树的构建 |
| 1.4 MoTOM70和MoPIC缺失突变体的获得 |
| 1.4.1 MoTOM70和MoPIC敲除载体的构建 |
| 1.4.2 MoTOM70和MoPIC敲除突变体的筛选及验证 |
| 1.4.3 MoTOM70和MoPIC敲除突变体互补菌株的获得 |
| 1.5 稻瘟病菌RNA的提取、cDNA的合成与实时定量PCR |
| 1.6 敲除突变体营养菌丝生长测定 |
| 1.7 突变体产孢量测定 |
| 1.8 敲除突变体致病力测定 |
| 1.8.1 水稻喷雾试验 |
| 1.8.2 水稻叶鞘注射试验 |
| 1.8.3 病斑分级统计试验 |
| 1.8.4 病斑生物量测定 |
| 1.9 突变体膨压测定 |
| 1.10 MoTom70和MoPic亚细胞定位观察 |
| 1.10.1 MoTom70和MoPic荧光表达菌株的获得 |
| 1.10.2 线粒体与荧光菌株的共定位观察 |
| 1.11 突变体中线粒体形态观察 |
| 1.12 线粒体形态及数量分析 |
| 1.12.1 营养菌丝内线粒体形态及数量分析 |
| 1.12.2 侵染菌丝内线粒体形态及数量分析 |
| 1.13 线粒体内膜膜势测定 |
| 1.14 突变体渗透压胁迫下菌丝生长速率测定 |
| 1.15 cAMP含量测定 |
| 1.16 表面疏水性试验 |
| 1.17 蛋白同源建模 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 MoPdeH潜在互作蛋白MoPic的获得 |
| 2.2 MoPic识别受体MoTom70的鉴定 |
| 2.3 MoTOM70和MoPIC在稻瘟病菌中各阶段转录水平分析 |
| 2.4 MoTom70和MoPic参与调控稻瘟病菌的营养生长和无性繁殖过程 |
| 2.5 MoTom70和MoPic正调控稻瘟病菌的致病力 |
| 2.6 MoTom70和MoPic定位在稻瘟病菌的线粒体上 |
| 2.7 MoTOM70的缺失影响了线粒体的分裂与融合 |
| 2.8 线粒体形态的平衡影响稻瘟病菌的致病力 |
| 2.9 MoTom70是线粒体的分裂与融合是必需的 |
| 2.10 MoTom70瞬时地将MoPic输入到线粒体 |
| 2.11 MoPIC的缺失改变了稻瘟病菌线粒体内膜膜势 |
| 2.12 MoTom70参与调控稻瘟病菌Osml信号途径 |
| 2.14 MoTom70和MoPic参与调控稻瘟病菌cAMP信号途径 |
| 2.15 MoPic参与调控稻瘟病菌表面疏水性 |
| 2.16 MoPic参与调控黑色素的生物合成 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 创新点 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间发表的研究论文 |
| 致谢 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要缩略词和符号表 |
| 第一章 文献综述 |
| 引言 |
| 1.1 丝状真菌营养生长和繁殖研究进展 |
| 1.1.1 丝状真菌营养生长 |
| 1.1.2 丝状真菌繁殖 |
| 1.1.3 丝状真菌营养生长的分子机理 |
| 1.1.4 丝状真菌繁殖的分子机理 |
| 1.2 丝状真菌对昆虫致病研究概述 |
| 1.2.1 昆虫病原真菌致病机制 |
| 1.2.2 昆虫病原真菌致病相关因子研究进展 |
| 1.3 真菌中G蛋白信号调控因子RGS的研究进展 |
| 1.3.1 酵母中G蛋白信号转导途径 |
| 1.3.2 稻瘟菌中G蛋白信号转导途径 |
| 1.3.3 其他真菌中G蛋白信号转导途径 |
| 第二章 引言 |
| 2.1 研究目的和意义 |
| 2.2 主要研究内容 |
| 第三章 罗伯茨绿僵菌中G蛋白信号调控因子生物信息学分析 |
| 3.1 材料及其来源 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验仪器 |
| 3.1.3 实验试剂 |
| 3.1.4 主要培养基配方 |
| 3.1.5 主要试剂溶液配方 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 菌株和培养条件 |
| 3.2.2 MrRGS系统进化树构建 |
| 3.2.3 MrRGS氨基酸序列保守功能域、信号肽及跨膜结构的预测 |
| 3.3 实验结果与分析 |
| 3.3.1 MrRGS1生物信息学分析结果 |
| 3.3.2 MrRGS2生物信息学分析结果 |
| 3.3.3 MrRGS3生物信息学分析结果 |
| 3.3.4 MrRGS4生物信息学分析结果 |
| 3.3.5 MrRGS5生物信息学分析结果 |
| 3.3.6 MrRGS6生物信息学分析结果 |
| 3.3.7 MrRGS7生物信息学分析结果 |
| 3.4 结论与讨论 |
| 第四章 不同G蛋白信号调控因子在罗伯茨绿僵菌生长发育中的功能 |
| 4.1 材料及其来源 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验仪器 |
| 4.1.3 实验试剂 |
| 4.1.4 主要培养基配方 |
| 4.1.5 主要试剂溶液配方 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 菌株和培养条件 |
| 4.2.2 Mrrgs在罗伯茨绿僵菌不同生长发育阶段表达分析 |
| 4.2.3 罗伯茨绿僵菌Mrrgs的敲除 |
| 4.2.4 菌落形态观察、营养生长和产孢量的测定 |
| 4.2.5 敲除突变株中产孢相关基因表达量的测定 |
| 4.3 实验结果与分析 |
| 4.3.1 Mrrgs在绿僵菌不同生长发育阶段的表达水平 |
| 4.3.2 Mrrgs突变体的获得 |
| 4.3.3 Mrrgs1、Mrrgs2和Mrrgs6调控营养生长和分生孢子产生 |
| 4.4 结论与讨论 |
| 第五章 不同G蛋白信号调控因子对杀虫毒力的影响及其杀虫机制的初步研究 |
| 5.1 材料及其来源 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 实验仪器 |
| 5.1.3 实验试剂 |
| 5.1.4 主要培养基 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 菌株和培养条件 |
| 5.2.2 不同敲除突变株毒力测试 |
| 5.2.3 附着胞形成率测定 |
| 5.2.4 对绿僵菌表面疏水性测定 |
| 5.2.5 用HPLC法测定绿僵菌中cAMP的含量 |
| 5.3 实验结果与分析 |
| 5.3.1 Mrrgs调控罗伯茨绿僵菌致病性 |
| 5.3.2 Mrrgs1、Mrrgs3、Mrrgs5和Mrrgs7参与调控附着胞的分化 |
| 5.3.3 Mrrgs3和Mrrgs5调控罗伯茨绿僵菌气生菌丝的疏水性 |
| 5.3.4 Mrrgs调控胞内的cAMP水平 |
| 5.4 结论与讨论 |
| 第六章 不同G蛋白信号调控因子在罗伯茨绿僵菌抗逆境中的作用 |
| 6.1 材料及其来源 |
| 6.1.1 实验材料 |
| 6.1.2 实验仪器 |
| 6.1.3 实验试剂 |
| 6.1.4 主要培养基 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 菌株和培养条件 |
| 6.2.2 对化学药品耐受能力的测定 |
| 6.2.3 对紫外和热胁迫耐受力的测定 |
| 6.3 实验结果与分析 |
| 6.3.1 Mrrgs参与调控细胞壁完整性、抗氧化和抗渗透压能力 |
| 6.3.2 Mrrgs5参与调控紫外逆境耐受性、Mrrgs7参与调控热耐受性 |
| 6.4 结论与讨论 |
| 第七章 结论与展望 |
| 7.1 结论与讨论 |
| 7.1.1 罗伯茨绿僵菌G蛋白信号调控因子MrRGS生物信息学分析 |
| 7.1.2 G蛋白信号调控因子在罗伯茨绿僵菌生长发育过程中的作用 |
| 7.1.3 G蛋白信号调控因子对罗伯茨绿僵菌致病性的调控作用 |
| 7.1.4 G蛋白信号调控因子在罗伯茨绿僵菌抗逆性中的作用 |
| 7.2 展望 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简介 |
| 参与科研项目 |
| 发表论文 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1 水稻稻曲病研究概况 |
| 1.1 稻曲病病害症状及危害 |
| 1.2 稻曲病菌侵染循环 |
| 1.3 稻曲病菌毒素 |
| 1.4 稻曲病菌的孢子种类 |
| 1.5 稻曲病的防治策略 |
| 2 RasGAP蛋白介导的Ras信号通路相关研究 |
| 2.1 小G蛋白结构及功能 |
| 2.2 Ras信号通路 |
| 2.3 cAMP信号通路 |
| 2.4 Ras/cAMP/MAPK信号通路 |
| 3 稻曲病菌遗传转化方法相关研究 |
| 3.1 根癌农杆菌介导的遗传转化技术 |
| 3.2 PEG介导的原生质体转化方法 |
| 3.3 CRISPR-Cas9技术在稻曲病菌中的应用 |
| 4 本研究的依据及意义 |
| 第二章 稻曲病菌Ras GTP酶激活蛋白UvGap1的功能研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 敲除载体的构建 |
| 1.3 CRISPR-gRNA载体的构建: |
| 1.4 PEG介导的原生质体转化 |
| 1.5 基因敲除验证 |
| 1.6 基因互补 |
| 1.7 稻曲病菌中UvGAP1、UvRAS1和UvRAS2基因的表达分析 |
| 1.8 基因敲除突变体生物学表型分析 |
| 1.9 荧光定位分析 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 UvGAP1、UvRAS1和UvRAS2基因敲除结果 |
| 2.2 UvGAP1基因互补验证结果 |
| 2.3 UvGAP1、UvRAS1和UvRAS2基因在稻曲病菌侵染阶段表达分析 |
| 2.4 ΔUvgap1生物学表型分析 |
| 2.5 UvGap1和UvRas2在稻曲病菌中的定位分析 |
| 3 讨论 |
| 第三章 稻曲病菌中蛋白激酶A UvCpka和腺苷酸环化酶相关蛋白UvCap1的功能研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 敲除载体的构建 |
| 1.3 CRISPR-gRNA载体的构建 |
| 1.4 PEG介导的原生质体转化 |
| 1.5 基因敲除验证 |
| 1.6 基因互补 |
| 1.7 稻曲病菌中UvCPKA和UvCAP1基因的表达分析 |
| 1.8 基因敲除突变体生物学功能分析 |
| 1.9 荧光定位分析 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 UvCPKA和UvCAP1基因敲除结果 |
| 2.2 UvCPKA和UvCAP1基因互补验证结果 |
| 2.3 稻曲病菌中UvCPKA和UvCAP1基因的在侵染阶段表达分析 |
| 2.4 ΔUvcpka和ΔUvcap1生物学表型分析 |
| 2.5 UvCpka和UvCap1在稻曲病菌中的定位 |
| 3 讨论 |
| 第四章 稻曲病菌中MAPK途径骨架蛋白UvSte50的功能研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 敲除载体的构建 |
| 1.3 CRISPR-gRNA载体的构建 |
| 1.4 PEG介导的原生质体转化 |
| 1.5 基因敲除验证 |
| 1.6 基因互补 |
| 1.7 基因敲除突变体生物学表型分析 |
| 1.8 荧光定位分析 |
| 1.9 酵母双杂交互作分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 UvSTE50敲除验证结果 |
| 2.2 UvSTE50的互补结果 |
| 2.3 ΔUvste50生物学表型分析 |
| 2.4 ΔUvste50致病性分析 |
| 2.5 UvSte50在稻曲病菌中的定位 |
| 2.6 稻曲病菌中UvGap1、UvRas1、UvRas2、UvSte50和UvCap1互作情况分析 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| abstract |
| 缩写词表 |
| 1 引言 |
| 1.1 灰葡萄孢及其危害 |
| 1.2 灰葡萄孢的致病机制研究进展 |
| 1.2.1 致病相关胞外酶是病菌成功侵入寄主的先决条件 |
| 1.2.2 致病毒素和草酸是病菌侵染过程的重要因素 |
| 1.2.3 致病相关过氧化物酶参与调控病菌的致病力 |
| 1.2.4 信号途径关键基因在致病过程发挥重要调控作用 |
| 1.3 本研究的目的与意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 试剂、缓冲液及反应底物溶液 |
| 2.1.3 培养基 |
| 2.1.4 主要仪器和设备 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 灰葡萄孢的致病力及BcPDR1 基因的表达分析 |
| 2.2.2 灰葡萄孢BcPDR1 基因编码功能分析 |
| 2.2.3 灰葡萄孢Bc PDR1 蛋白候选互作蛋白的筛选与鉴定 |
| 2.2.4 灰葡萄孢BcPDR1 差异表达基因的筛选和鉴定 |
| 2.2.5 灰葡萄孢BcPDR1 基因与cAMP、MAPK信号途径的关系 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 灰葡萄孢致病力及Bc PDR1 基因的表达分析 |
| 3.1.1 不同灰葡萄孢野生型菌株的致病力检测 |
| 3.1.2 不同灰葡萄孢野生型菌株中Bc PDR1 基因的表达分析 |
| 3.2 灰葡萄孢Bc PDR1 基因的编码功能分析 |
| 3.3 灰葡萄孢Bc PDR1 蛋白候选互作蛋白的筛选与鉴定 |
| 3.3.1 灰葡萄孢Bc PDR1 蛋白候选互作蛋白的筛选 |
| 3.3.2 灰葡萄孢Bc PDR1 蛋白候选互作蛋白的酵母双杂交鉴定 |
| 3.4 灰葡萄孢Bc PDR1 差异表达基因的筛选与鉴定 |
| 3.4.1 差异基因的功能富集分析 |
| 3.4.2 胞壁降解酶和过氧化物酶基因的筛选与鉴定 |
| 3.5 灰葡萄孢Bc PDR1 基因与cAMP、MAPK途径的关系 |
| 3.5.1 BcPDR1 突变体对cAMP、MAPK途径抑制剂的敏感性检测 |
| 3.5.2 BcPDR1 突变体中cAMP的含量检测 |
| 3.5.3 BcPDR1 突变对cAMP和 MAPK途径关键基因表达的影响 |
| 3.5.4 cAMP途径关键基因突变对Bc PDR1 表达的影响 |
| 3.5.5 MAPK途径关键基因突变对Bc PDR1 表达的影响 |
| 3.5.6 BcPDR1 与途径关键基因的双基因突变体的表型及致病力分析 |
| 3.5.7 BcPDR1 在双基因突变体中的表达分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 灰葡萄孢Bc PDR1 基因的功能 |
| 4.2 灰葡萄孢Bc PDR1 蛋白候选互作蛋白的筛选与鉴定 |
| 4.3 灰葡萄孢Bc PDR1 差异表达基因的筛选与鉴定 |
| 4.4 灰葡萄孢Bc PDR1 基因与病菌信号途径的关系 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在读期间发表学术论文 |
| 作者简历 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 食线虫真菌和磷酸二酯酶的研究进展 |
| 1 食线虫真菌研究概况 |
| 2 捕食线虫真菌研究进展 |
| 3 cAMP信号级联研究进展 |
| 4 磷酸二酯酶家族功能研究进展 |
| 5 本论文选题的依据和研究意义 |
| 第二章 磷酸二酯酶的功能结构域预测和聚类分析 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 磷酸二酯酶氨基酸序列来源 |
| 2.2 磷酸二酯酶功能结构域分析 |
| 2.3 寡孢节丛孢磷酸二酯酶系统发育分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 磷酸二酯酶的氨基酸序列和系统发育分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 寡孢节从孢两种磷酸二酯酶氨基酸序列和结构域的分析 |
| 4.2 寡孢节从孢磷酸二酯酶同源性比较分析 |
| 第三章 磷酸二酯酶编码基因的敲除及转化子验证 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料及仪器 |
| 2.1 实验菌株和载体 |
| 2.2 主要溶液及培养基 |
| 2.3 实验试剂药品 |
| 2.4 实验中使用的主要仪器及设备 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 敲除载体构建方法 |
| 3.2 敲除引物设计 |
| 3.3 寡孢节丛孢基因组DNA提取 |
| 3.4 质粒pRS426和pSCN44的提取 |
| 3.5 pRS426质粒的双酶切 |
| 3.6 目的片段扩增 |
| 3.7 制备酵母感受态和电转化 |
| 3.8 提取酵母转化子的质粒 |
| 3.9 筛选阳性酵母转化子 |
| 3.10 扩增并回收敲除载体全长片段 |
| 3.11 制备寡孢节从孢的原生质体 |
| 3.12 寡孢节从孢原生质体的化转与再生 |
| 3.13 寡孢节从孢原生质体转化子基因组提取 |
| 3.14 敲除转化子的验证 |
| 4 实验结果 |
| 4.1 寡孢节从孢两种磷酸二酯酶基因上下游片段和潮霉素片段的扩增 |
| 4.2 酵母转化子 |
| 4.3 酵母转化子质粒PCR验证 |
| 4.4 PCR验证原生质体转化子 |
| 4.5 Southern blot验证原生质体转化子 |
| 5 讨论 |
| 5.1 构建敲除载体的关键点 |
| 5.2 寡孢节丛孢原生质体的制备及转化改进之处 |
| 5.3 敲除转化子PCR验证 |
| 5.4 敲除转化子的Southern blot验证 |
| 6 本章小结 |
| 第四章 磷酸二酯酶基因敲除株与寡孢节从孢野生型菌株的表型特征比较和分析 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料及仪器 |
| 2.1 实验菌株 |
| 2.2 主要培养基 |
| 2.3 主要药品 |
| 2.4 主要仪器设备 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 生长速率的比较 |
| 3.2 菌丝形态比较 |
| 3.3 抗逆性测试 |
| 3.4 分生孢子的比较 |
| 3.5 捕器形成和杀线虫活性分析 |
| 3.6 磷酸二酯酶基因突变株发酵液活性化合物分析 |
| 4 实验结果 |
| 4.1 磷酸二酯酶基因敲除菌株的生长速率和菌落形态的比较 |
| 4.2 磷酸二酯酶突变菌株与野生型菌株的菌丝形态比较 |
| 4.3 磷酸二酯酶基因突变菌株的抗逆性测试 |
| 4.4 磷酸二酯酶对无性产孢的影响 |
| 4.5 磷酸二酯酶基因突变株致病性分析 |
| 4.6 磷酸二酯酶基因突变株发酵液活性化合物比较 |
| 5 讨论 |
| 5.1 营养菌丝生长和菌丝形态的比较 |
| 5.2 抗逆性测试 |
| 5.3 无性产孢的数量和形态比较 |
| 5.4 致病性和胞外蛋白酶活性分析 |
| 6 小结 |
| 第五章 磷酸二酯酶基因敲除株和寡孢节丛孢野生型菌株菌丝内cAMP含量分析 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料及仪器 |
| 2.1 实验菌株 |
| 2.2 所用培养基 |
| 2.3 所用试剂盒 |
| 2.4 设备及仪器 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 组织样品的收集与处理 |
| 3.2 需要准备的试剂 |
| 3.3 实验步骤 |
| 4 实验结果 |
| 4.1 cAMP含量测定标准曲线 |
| 4.2 磷酸二酯酶突变菌株的cAMP含量测定结果 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 第六章 磷酸二酯酶编码基因敲除菌株表型相关基因的转录水平分析 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料及仪器 |
| 2.1 实验菌株 |
| 2.2 所用培养基 |
| 2.3 主要药品及试剂盒 |
| 2.4 主要仪器及设备 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 提取野生型菌株及磷酸二酯酶基因敲除株的总RNA |
| 3.2 逆转录获取cDNA |
| 3.3 相关基因选取及引物设计 |
| 3.4 Real-Time PCR |
| 4 实验结果 |
| 4.1 两种磷酸二酯酶在寡孢节丛孢中的表达量分析 |
| 4.2 两种磷酸二酯酶在突变株中的表达量分析 |
| 4.3 磷酸二酯酶基因敲除株产孢相关基因表达量分析 |
| 4.4 磷酸二酯酶基因敲除株cAMP含量调节基因表达量分析 |
| 5 讨论 |
| 5.1 寡孢节丛孢生长周期内磷酸二酯酶基因的表达量分析 |
| 5.2 磷酸二酯酶在突变株中的表达量分析 |
| 5.3 产孢相关基因的表达量分析 |
| 5.4 cAMP相关基因表达量分析 |
| 6 小结 |
| 全文小结及存在的问题 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录Ⅰ 同源臂序列及潮霉素引物 |
| 附录Ⅱ 论文RT-PCR引物序列 |
| 附录Ⅲ 论文中使用的质粒图谱 |
| 附录Ⅳ 研究生期间所获成果 |
| 致谢 |
| 英文缩略语表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 参志苓对抑郁症患者血清microRNAs表达谱的影响研究 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 miR-1281作为参志苓抗抑郁作用靶点的细胞生物学功能研究 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分 基于非标记定量蛋白质组学研究参志芩对抑郁症患者血清蛋白表达谱的干预作用 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第四部分 参志苓通过抑制凝血酶诱导的血小板活化参与抑郁病理生理过程 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表文章和成果情况 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语汇总 |
| 上篇 文献综述 |
| 第一章 稻瘟病菌致病相关基因的研究进展 |
| 1 稻瘟病菌的生活史及侵染循环 |
| 2 稻瘟病菌侵染的第一阶段:寄主表面识别与附着胞形成 |
| 2.1 稻瘟病菌与寄主植物的接触与识别 |
| 2.2 通过环腺苷酸(Cyclic AMP,cAMP)和MAPK信号途径将环境信号转导到胞内 |
| 2.3 附着胞形成过程中的细胞周期调控 |
| 3 稻瘟病菌侵染的第二阶段:侵染菌丝在寄主植物叶片内的扩展 |
| 3.1 侵染菌丝的生长 |
| 3.2 效应分子的定位:细胞质效应分子VS质外体效应分子 |
| 3.3 稻瘟病菌活体营养阶段的分泌机制 |
| 3.4 模拟激素调节植物的新陈代谢 |
| 4 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 第二章 细胞自噬及其核心调控组分的研究进展 |
| 1 PAS的鉴定 |
| 2 自噬起始复合体 |
| 3 磷脂酰肌醇激酶{phosphatidylinositol (PtdIns) 3-kinase complex}复合体 |
| 4 两个类泛素化偶联系统 |
| 4.1 Atg8偶联系统 |
| 4.2 Atg12偶联系统 |
| 5 细胞自噬在稻瘟病菌中的研究进展 |
| 5.1 氮素营养及TOR途径 |
| 5.2 Atg1激酶复合体 |
| 5.3 类泛素化系统 |
| 5.4 Atg9循环系统 |
| 5.5 PtdIns3K复合体Ⅰ |
| 5.6 SNAREs和HOPs |
| 6 展望 |
| 参考文献 |
| 下篇 研究内容 |
| 第一章 细胞壁完整性通路蛋白激酶MoMkk1在稻瘟病菌生长发育过程中的功能分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试菌株和培养条件 |
| 1.2 MoPdeH互作蛋白的鉴定 |
| 1.3 酵母双杂交 |
| 1.4 GST-pull down |
| 1.5 双分子荧光互补(BiFC) |
| 1.6 蛋白磷酸化检测实验 |
| 1.7 MoMKK1的敲除与互补 |
| 1.8 MoMKK1突变体生长速率及产孢能力测定 |
| 1.9 MoMKK1敲除突变体侵染及致病力测定 |
| 1.10 DNA、RNA的提取和cDNA的合成 |
| 1.11 胞内cAMP含量测定和液相色谱(HPLC,high-performance liquidchromatography)分析 |
| 1.12 CFW (Calcofluor white)染色 |
| 1.13 几丁质含量测定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 MoPdeH与蛋白激酶MoMck1相互作用 |
| 2.2 MoPdeH调控MoMCK1的表达量控制侵染和致病力 |
| 2.3 细胞壁完整性通路(CWI pathway)调节胞内的cAMP水平 |
| 2.4 MoMkk1是细胞壁完整性相关的MAPK通路的重要组分 |
| 2.5 MoMkk1调控稻瘟病菌气生菌丝的形态建成和无性繁殖 |
| 2.6 MoMkk1调控稻瘟病菌的侵染及致病力 |
| 2.7 MoMkk1调控稻瘟病菌的细胞壁完整性 |
| 2.8 MoMkk1参与病菌对渗透压胁迫的应答 |
| 2.9 细胞壁完整性通路(Mps1-MAPK)与渗透压胁迫通路(Hog1-MAPK)存在交叉对话关系 |
| 2.10 内质网胁迫可以激活细胞壁完整性通路 |
| 2.11 细胞壁完整性缺失影响未折叠蛋白反应途径(UPR)的应答 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 蛋白激酶MoMck1介导的细胞壁完整性通路协调内质网胁迫、细胞自噬调控稻瘟病菌发育和致病力 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试菌株和培养条件 |
| 1.2 MoMkk1互作蛋白的鉴定 |
| 1.3 稻瘟病菌DNA、RNA的提取和cDNA的合成 |
| 1.4 致病性及侵染能力测定 |
| 1.5 酵母双杂交 |
| 1.6 GST-pull down |
| 1.7 双分子荧光互补(BiFC) |
| 1.8 蛋白磷酸化检测实验 |
| 1.9 生长速率及产孢能力测定 |
| 1.10 细胞自噬水平检测 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 细胞壁完整性通路(CWI pathway)中间组分MoMkk1互作蛋白的鉴定 |
| 2.2 内质网压力(DTT)可以激活稻瘟病菌的细胞自噬 |
| 2.3 CWI通路参与调控细胞自噬过程 |
| 2.4 CWI通路互作的细胞自噬相关(autophagy-related,ATG)蛋白筛选 |
| 2.5 Atg1激酶复合体与MoMkk1相互作用 |
| 2.6 过表达MoAtg1激酶复合体的组分(除MoAtg13外)可以完全回补ΔMomck1突变体的缺陷 |
| 2.7 过表达MoAtg1复合体组分可以增强稻瘟病菌野生型Guy11在K23水稻上的致病力 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 MoRgs7互作蛋白MoMip11作为支架蛋白调控稻瘟病菌的cAMP途径及致病力 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试菌株及培养条件 |
| 1.2 DNA、RNA的提取和cDNA的合成 |
| 1.3 基因敲除及回补实验 |
| 1.4 MoRgs7-RFP和MoMagA-RFP在附着胞形成阶段的定位观察 |
| 1.5 致病性及侵染能力测定 |
| 1.6 附着胞形成及膨压测定 |
| 1.7 胞内cAMP测定 |
| 1.8 MoPdeH磷酸二酯酶活性的体外测定 |
| 1.9 酵母双杂交及GST-pull down |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 MoRgs7在附着胞形成初期高量表达并且定位在晚期内含体中 |
| 2.3 MoRgs7与RACK1同源蛋白MoMip11相互作用 |
| 2.4 MoMip11调控稻瘟病菌的生长、无性繁殖与有性生殖 |
| 2.5 MoMip11调控稻瘟病菌的侵染和致病力 |
| 2.6 MoMip11调控稻瘟病菌附着胞膨压的形成 |
| 2.7 MoMip11调控胞内的cAMP水平 |
| 2.8 MoMip11与Gα互作但与激活态的α MoMagA~(G187S)并不互作 |
| 2.9 MoMip11促进MoMagA的激活 |
| 2.10 MoMip11干扰MoRgs7-MoMagA~(G187S)之间的互作 |
| 2.11 MoMip11与MoPdeH相互作用并抑制其磷酸二酯酶的活性 |
| 2.12 MoMip11可以部分回补G蛋白α亚基(Gα)在附着胞形成方面的功能 |
| 2.13 MoMip11参与调控稻瘟病菌对环境胁迫的应答 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结及创新点 |
| 附录1 组蛋白乙酰转移酶MoHatl核质穿梭调控稻瘟病菌细胞自噬和致病力的机制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试菌株和培养条件 |
| 1.2 稻瘟病菌DNA、RNA的提取和cDNA的合成 |
| 1.3 致病性及侵染能力测定 |
| 1.4 附着胞形成及膨压测定 |
| 1.5 附着胞形成阶段糖原和脂质染色 |
| 1.6 稻瘟病菌总蛋白提取与GFP蛋白纯化 |
| 1.7 Phos-tag实验检测MoHat1磷酸化 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 MoHat1与分子伴侣MoSsb1相互作用 |
| 2.2 MoSsb1帮助MoHat1从细胞核转移到细胞质中 |
| 2.3 MoHat1磷酸化水平会影响其定位 |
| 2.4 MoHat1的磷酸化干扰MoHat1-MoSsb1之间的互作 |
| 2.5 MoHat1被糖原合成激酶MoGsk1磷酸化 |
| 2.6 MoHat1的磷酸化对病菌的细胞自噬十分重要 |
| 2.7 MoHat1的磷酸化是稻瘟病菌的功能性附着胞形成和致病力必需的 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 附录2 |
| 附表1 |
| 附表2 |
| 附表3 |
| 读博士学位期间发表的研究论文 |
| 致谢 |
