王艺杰[1]（2021）在《莽草酸对猪卵母细胞体外成熟及孤雌激活胚胎发育的影响》文中进行了进一步梳理
聂骏宇[2]（2020）在《罗汉果甜甙V对猪卵母细胞及胚胎发育的影响和机制研究》文中指出卵母细胞发育和胚胎生产是动物繁殖领域重要的技术环节。卵母细胞质量决定胚胎命运,并且与后代的健康密切相关。改善卵母细胞和胚胎质量对提高家畜繁殖效率具有重要的理论和实践意义。卵母细胞中大量活性氧积累是影响卵母细胞及胚胎发育的重要原因。罗汉果甜甙V（MV）作为罗汉果的主要药效成分之一,具有丰富的生物学特性,其抗氧化效果显着。为了探究罗汉果甜甙对家畜卵母细胞及胚胎发育的作用,本研究评估了MV对猪卵母细胞体外成熟的影响,初步讨论MV提高卵母细胞体外成熟的分子机制。通过单细胞RNA-seq技术从宏观角度解析MV提高卵母细胞体外成熟的转录本表达调控。此外,本文对MV延缓卵子老化的分子机制进行了初步探究,评估了MV对猪体细胞核移植胚胎以及孤雌激活胚胎发育的影响。结果如下:1.MV对猪卵母细胞体外成熟的影响为了优化MV浓度,将不同浓度的MV（1,5,10,20和40μM）添加至成熟液中,不添加MV组作为对照。卵丘卵母细胞经过40-44h成熟后,浓度为5,10,20和40μM的MV显着提高卵母细胞的第一极体排出率,由于20和40μM之间没有显着差异,因此选择20μM MV进行后续的试验。MV添加后,卵母细胞的孤雌激活胚胎分裂率和囊胚率显着升高,但是对体细胞核移植胚胎的发育没有显着影响。此外,MV显着促进卵母细胞皮质颗粒形成,提高线粒体相关基因PGC-1α和TFAM的转录水平,提高线粒体含量,增强线粒体活性和功能。MV还促进卵母细胞抗氧化基因SOD,CAT和PRDX2的转录水平,降低胞质ROS含量。通过添加SIRT1的特异性抑制剂EX-527发现,MV通过激活SIRT1,调节活性氧和线粒体,促进卵母细胞体外成熟。荧光素酶报告系统的结果表明MV可以提高SIRT1启动子活性。2.利用单细胞RNA-seq技术分析MV提高猪卵母细胞成熟的转录组变化成熟液中添加（处理组）或不添加MV（对照组）,卵母细胞成熟40-44 h后,收集排有第一极体的卵母细胞,每组三个重复。提取卵母细胞的RNA,利用Illumina Hiseq测序平台进行c DNA文库构建。将获得的数据进行质量控制,搜库,差异表达基因分析,基因本体论富集分析,KEGG分析,结果验证等。总共检测到10631个共表达基因,差异表达基因440个,其中上调差异表达基因216个,下调差异表达基因224个。基因本体论分析结果显示应激应答差异表达基因上调30个,下调31个;DNA损伤修复基因上调9个,下调5个。此外,KEGG分析显示MV与卵母细胞的WNT信号,丙酮酸盐代谢以及脂肪酸合成密切相关。基于KEGG分析的结果进行荧光染色和TG酶反应试验,结果表明MV可以提高体外成熟卵母细胞的脂滴合成和甘油三酯的含量。实时荧光定量PCR验证结果（SOD,PRDX2以及TFAM）与单细胞RNA-seq的结果一致,表明转录组测序的结果可靠。3.MV对卵子老化的影响及分子机制体外成熟44 h后的卵母细胞作为新鲜组,添加MV（25,50和100μM）或不添加MV（老化组）的PZM-3培养液继续培养24 h。施加一个微弱的电刺激（0.6 k V/cm,2 DC,10μs）,培养8 h后检查激活率（分裂和碎片）。相对于新鲜组来说,老化组的激活率显着上升,加入50和100μM的MV显着降低老化卵子激活率,后续试验选择50μM MV。当卵子老化24 h后,制作孤雌激活胚胎,结果显示老化卵子的囊胚率从31.1%下降到2.4%,而添加MV的老化卵子的囊胚率上升到14.3%。除此之外,MV还维持老化卵子纺锤体和染色体形态,减少凋亡形成,促进线粒体活性和功能,提高SIRT1的转录水平并降低ROS水平。当EX-527抑制SIRT1表达时,MV对老化卵子的抗氧化作用,纺锤体和染色体的改善作用都消失了,表明MV通过激活SIRT1,降低ROS水平,延缓卵子老化。4.MV对猪早期胚胎发育的影响构建孤雌激活胚胎和体细胞核移植胚胎,添加20μM的MV到胚胎培养液PZM-3中,观察MV对胚胎分裂,囊胚形成,囊胚细胞数以及细胞活性的影响。对于孤雌激活胚胎来说,MV对分裂率,囊胚率,囊胚细胞数和细胞活性方面没有显着的影响,但MV将囊胚率从36.3%提高至43.8%,并且将囊胚细胞数从43.8提高到50.0,且MV将囊胚细胞Ed U阳性率从27.8%提高至33.1%。MV不影响SCNT胚胎的分裂,但是将囊胚率从9.8%提高至15.0%。在当前的体系中,MV对早期胚胎发育没有显着效果。综上所述,本研究利用猪卵母细胞和胚胎模型说明MV提高猪卵母细胞体外成熟,延缓卵子老化并阐明相关的分子机制,然而对早期胚胎发育没有显着影响。本研究结果为MV促进猪卵母细胞和胚胎发育的深入研究奠定基础。本文将有望为提高哺乳动物繁殖的相关研究提供新的思路。
姚文博[3]（2020）在《根皮苷对猪卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎发育的影响》文中研究说明猪由于与人类的生理相似性而被用作研究器官异种移植和人类疾病的动物模型。IVP胚胎在胚胎发育和生殖技术的研究中起着重要的作用。但是,许多不利的环境因素导致卵母细胞的质量在体外低于体内。主要原因可能是,与体内成熟的卵母细胞相比,IVM卵母细胞易受光,氧胁迫和培养基成份的影响,从而改变了卵母细胞的代谢并导致ROS的产生和降解失衡。猪卵母细胞含有大量脂质,这些脂质对ROS特别敏感。过量的ROS可能会导致脂质过氧化,线粒体功能障碍,DNA断裂和蛋白质的氧化修饰,从而损害卵母细胞的质量和发育能力。根皮苷是许多果树中的天然产物和饮食成分。150多年来,它一直被用作生理学研究的药物和工具。根皮苷的主要药理作用是通过抑制位于小肠近端肾小管和粘膜中的钠-葡萄糖同向转运蛋白来产生肾糖尿和阻断肠道葡萄糖吸收。类黄酮,包括查耳酮,例如根皮苷,是所有植物家族生产的代谢产物。这些多酚化合物具有抗氧化性能,并通过配体清除超氧阴离子,单线态氧,脂质过氧自由基和螯合金属离子。许多研究表明,与17-β雌二醇相比,根皮苷是更有效的脂质过氧化抑制剂。苹果汁和苹果提取物所含的根皮苷占总酚浓度的11%至36%,可抑制低密度脂蛋白的氧化。此外,根皮苷的糖苷可在器官浴中产生独立于内皮的独立的冠状动脉环舒张。本研究通过分别在猪卵母细胞体外成熟和早期胚胎体外培养工程中,向培养基中添加0μM、50μM、100μM、150μM的根皮苷观察其对卵母细胞以及胚胎的抗氧化能力,全能性,细胞凋亡等方面产生的影响。探究根皮苷是否可以作为一种有益的补充成分添加到体外成熟以及胚胎培养的培养基中。实验研究表明,体外成熟过程中添加100μM的根皮苷能有效提高卵母细胞孤雌激活的囊胚率,显着提高细胞内GSH水平,显着降低细胞内ROS水平。而且根皮苷显着上调了氧化应激基因SOD,CAT和GPx的表达,同时上调了线粒体功能相关基因TFAM和PGC-1α的表达。关于凋亡方面根皮苷显着下调了凋亡相关基因CASPES3和BAX的表达,下调了抗凋亡基因BCL2的表达。根皮苷处理卵母细胞后激活的囊胚,其全能性相关基因OCT4,SOX2和NANOG的表达显着上调,凋亡相关基因CASPAS3和BAX的表达显着下调,抗凋亡基因BCL2的表达显着上调。在胚胎培养阶段添加100μM的根皮苷并没有显着提高囊胚率,四细胞时期细胞内GSH和ROS的水平相近。但囊胚细胞凋亡相关基因CASPES3和BAX的相对表达显着降低,抗凋亡基因BCL2相对表达也有显着提高,根皮苷处理组的囊胚细胞凋亡更少,总细胞数更多。总之在体外成熟阶段在培养基中添加100μM的根皮苷可以提高卵母细胞的质量进而获得更多更优质的胚胎。
张丹丹[4]（2020）在《组蛋白去乙酰化酶SIRT6对猪卵母细胞成熟的影响及其机制研究》文中进行了进一步梳理卵母细胞体外成熟（IVM）作为胚胎工程的关键环节,在家畜良种繁育、资源保护及生物学研究中具有重要应用价值。但卵母细胞成熟仍面临效率低、质量差等问题,人们对其机制了解有限。SIRT6是一种NAD+依赖性组蛋白去乙酰化酶,可参与调控小鼠卵母细胞成熟,但关于其在猪卵母细胞成熟中的功能研究尚不清楚。本研究旨在探讨猪卵丘细胞和卵母细胞来源的SIRT6对卵子成熟的影响及其机制,以明确SIRT6对猪卵母细胞成熟的调控作用,为增进对SIRT6生物学功能和猪卵母细胞成熟调控机制的认识提供依据。采用荧光定量PCR和免疫荧光染色技术检测发现:猪卵母细胞成熟期间,卵母细胞和卵丘细胞中均表达SIRT6 m RNA和蛋白。通过SIRT6抑制剂（OSS＿128167,处理组为400μM;对照组为0μM）处理卵丘包裹卵母细胞,与对照组相比发现,处理组的卵丘扩散面积（0.048±0.0073 mm2Vs.0.026±0.0020mm2）、卵母细胞生发泡破裂（GVBD）（24h:94.41±3.41%Vs.23.73±1.55%,28h:100.00±0%Vs.25.01±4.44%,32h:100.00±0%Vs.40.35±6.72%）、第一极体（PB1）排出率（80.60±1.28%Vs.13.95±1.41%）和孤雌激活胚胎的发育效率（卵裂率:85.52±4.41%Vs.43.69±9.97%,囊胚率:28.70±2.07%Vs.0±0%）均显着降低。相反,SIRT6抑制剂处理去除卵丘卵母细胞时,与对照组相比发现,仅能显着降低卵母细胞PB1排出率（80.67±5.60%Vs.31.80±3.39%）。然而,无论是卵丘细胞还是卵母细胞来源的SIRT6受抑制时,都会影响纺锤体和染色体的形成。不仅如此,当抑制卵丘细胞表达的SIRT6时,显着降低卵丘扩散和缝隙连接通道相关基因的表达,及卵母细胞中CDK1磷酸化水平。最后,抑制腺苷酸环化酶活性可以部分恢复SIRT6抑制剂诱导的卵丘包裹卵母细胞GVBD（23.97±7.57%Vs.57.28±12.06%）和PB1排出率（12.77±2.56%Vs.35.99±4.06%）。综上所述,SIRT6参与调节猪卵母细胞成熟;SIRT6在卵丘细胞表达并调控猪卵丘细胞扩散及卵母细胞生发泡破裂,而SIRT6在卵母细胞表达参与调控第一极体排出;无论SIRT6在卵丘细胞还是在卵母细胞表达均参与调控卵子成熟中纺锤体和染色体的形成;SIRT6介导腺苷酸环化酶活性调控猪卵母细胞减数分裂启动和成熟。
赵子墨[5]（2020）在《褪黑素减缓猪卵丘卵母细胞热应激损伤及对胚胎发育的影响》文中认为褪黑素（Melatonin,MT）在抗氧化应激方面具有重要功能,然而有关褪黑素在缓解猪卵母细胞热应激（Heat stress,HS）损伤方面的作用机理仍缺乏深入研究。本研究以三元母猪卵巢为试验对象,采集卵母细胞,研究了褪黑素减缓热应激对体外成熟卵母细胞损伤的作用机制;褪黑素对热应激后的卵丘细胞扩展及基因表达的影响;褪黑素对热应激后孤雌激活胚胎和克隆胚胎发育能力及凋亡基因表达的影响。这对提高卵子利用效率和增加高温季节动物繁殖力等方面具有重要的理论和实践指导意义。试验一研究褪黑素缓解热应激对猪体外成熟卵母细胞损伤的作用机制。试验分为三组:对照组处理为猪卵母细胞在38.5℃的成熟培养液中体外成熟培养42 h;热应激组处理为猪卵母细胞在41.5℃的成熟培养液中热应激4 h,然后转回38.5℃的成熟培养液中继续成熟培养38 h;热应激加褪黑素组处理为猪卵母细胞在41.5℃、含有10-9 M褪黑素的成熟培养液中热应激4 h,然后转回38.5℃的成熟培养液中继续成熟培养38 h。结果显示,褪黑素显着降低ROS水平、卵母细胞线粒体异常分布率,并提高卵母细胞存活率和成熟率（59.6%±3.06%vs.68.3%±1.95%;P<0.05）。通过4 h、18 h、42 h三个时间点对基因及亚细胞结构分析,褪黑素显着提高4h、18h、42h的Bcl-2/Bax mRNA比率;显着降低18 h、42 h的α-tubulin与F-actin形态异常率,显着提高4h和42h卵母细胞活性,显着促进4 h、18 h、42 h三个时间点HSP70的mRNA表达,显着降低18 h、42 h的Nrf2 mRNA表达。综合上述结果,在本研究条件下,褪黑素协同胞内HSP70、Nrf2因子共同抑制HS诱导的猪卵母细胞氧化损伤,同时对细胞骨架进行修复,促进卵母细胞成熟发育。试验二研究褪黑素对热应激后的卵丘细胞扩展及基因表达的影响。在试验一的分组基础上继续试验,在卵母细胞培养42 h后,统计各组的卵丘扩展指数,分离出卵丘细胞后,检测卵丘扩展、凋亡、抗氧化相关基因的表达。结果显示,褪黑素处理后,卵丘扩展指数（1.61±0.024 vs.2.09±0.065;P<0.05）、Ptgs2、Ptx3、Tnfaip6、CAT mRNA表达显着升高,其中CAT的mRNA表达仍显着低于对照组,ER mRNA表达差异不显着,Bcl-2/Bax mRNA的比率升高。综合上述结果,在本研究条件下,褪黑素促进卵丘细胞扩展及相关抗凋亡、抗氧化相关基因表达,抑制促凋亡基因表达途径,降低热应激对猪卵丘细胞的损伤。试验三研究褪黑素对热应激后孤雌激活胚胎和克隆胚胎发育能力及凋亡基因表达的影响。在试验一的分组基础上继续试验,检测各组孤雌激活胚胎与克隆胚胎的发育情况,统计各组卵裂率与囊胚率,并检测其凋亡基因的表达情况。结果显示,褪黑素处理后,孤雌胚胎与克隆胚胎的囊胚总细胞数显着升高,其中孤雌胚胎卵裂率（77.67%±3.18%vs.84.67%±1.33%;P<0.05）、囊胚率（26.59%±1.45%vs.33.42%±1.67%;P<0.05）显着升高,而克隆胚胎卵裂率与囊胚率无显着变化;Bcl-2/Bax mRNA的比率均显着升高。综合上述结果,在本研究条件下,褪黑素促进孤雌胚胎发育,抑制其凋亡,减弱热应激对孤雌胚胎的损伤,但无法增加克隆胚胎卵裂率与囊胚率。本研究结果表明,褪黑素通过降低胞内ROS含量、改善线粒体分布、修复α-tubulin与F-actin,抑制卵母细胞凋亡,促进HSP70基因表达,介导Nrf2信号通路,缓解HS诱导的猪卵母细胞氧化损伤,从而促进卵母细胞与孤雌胚胎发育。且褪黑素通过促进卵丘扩展,抑制卵丘细胞凋亡,提高抗氧化能力来减弱热应激对卵丘细胞带来的损伤。
陈华丽[6]（2020）在《Wnt/PLC/Ca2+通路对猪卵泡颗粒细胞和卵母细胞凋亡及颗粒细胞激素分泌的影响机制》文中研究说明哺乳动物超过99%的卵子在发育过程中都会经历闭锁性退化而不排卵,在促性腺激素的作用下,其中一些可以达到排卵前阶段,为了促进濒危物种以及基因优良畜禽体外培养卵子更好的应用,卵子发生和卵泡发育的机制尚需进一步研究。颗粒细胞分泌的激素和生长因子对卵泡发育起重要作用,同时卵母细胞分泌各种生长因子也可以调节颗粒细胞的增殖和分化。在卵泡液中含有多种不同水平的类固醇激素,比如雌激素、孕酮和雄激素,可以通过作用于颗粒细胞生长以及卵泡液的形成来影响卵巢的卵泡发育。近年来很多的研究表明,Wnt信号可以调节小鼠和人类的性腺发育和性别分化,并且可以调节激素的合成和分泌,对哺乳动物卵泡形成和发育以及卵巢功能的维持具有重要作用,可以参与调控卵泡闭锁等生理过程。Wnt5a和Wnt11属于非经典Wnt蛋白,它们在颗粒细胞中表达并且在整个卵泡发育过程中发挥特异的调控作用。当颗粒细胞Wnt5a失去活性的时候可以导致小鼠卵泡闭锁增加和排卵率降低。然而Wnt非典型通路对猪卵泡发育的作用尚未见系统报道,本文探究Wnt/PLC/Ca2+通路对猪卵泡发育过程中凋亡和激素分泌的影响。本试验通过抽吸法取得直径为2-5mm的卵泡中的卵泡液,并且收集颗粒细胞和卵母细胞,在体外培养液中添加一定剂量的Wnt/Ca2+通路中蛋白抑制剂或激活剂,包括Wnt蛋白抑制剂IWP-2、磷脂酶C（PLC）蛋白抑制剂U73122和激活剂m-3M3FBS以及PKCβ蛋白抑制剂Enzastaurin。通过显微镜观察卵母细胞成熟率;通过CCK8试验分别观察IWP-2、U73122、m-3M3FBS或Enzastaurin对颗粒细胞活力的影响。由荧光Ca2+指示剂Fluo3-AM监测颗粒细胞内钙离子含量,Ca2+指示剂Fura-2AM测定卵母细胞内钙离子含量。采用实时荧光定量（q RT-PCR）法检测通路相关基因以及激素分泌、细胞凋亡调控相关基因转录水平的表达;Annexin V-FITC法检测PLC抑制剂和激活剂对颗粒细胞的凋亡的影响。酶联免疫法（ELISA法）检测猪颗粒细胞雌二醇和孕酮的水平。Western Blot法检测凋亡调控若干蛋白、PLC四个亚基蛋白及三种钙离子敏感蛋白（PKCβ、CAMKⅡα、Caln A）的相对表达量。得到如下主要研究结果:1. 与对照组相比,0.05μM或5μM的IWP-2对猪颗粒细胞活力没有影响,0.1μM、0.5μM和2.5μM的IWP-2增加了猪颗粒细胞活力（P<0.05）。这表明Wnt配体在一定程度上抑制颗粒细胞活力。PLC抑制剂U73122的浓度不超过0.5μM时颗粒细胞的活力没有变化,浓度增加时细胞活力在4 h、24 h和48 h降低（P<0.05）,而PLC激活剂m-3M3FBS的添加使12 h之前的颗粒细胞活力随着浓度的增加呈现先升高再降低的趋势,m-3M3FBS浓度为0.5μM时活力最高（P<0.05）。这表明,PLC蛋白参与猪颗粒细胞的活力,并且一定程度上促进颗粒细胞活力。与对照组相比,0.25μM和2μM的Enzastaurin可以降低猪颗粒细胞的活力（P<0.05）。2.0.1-5μM的Wnt抑制剂IWP-2可以对卵母细胞成熟的抑制作用具有剂量依赖性,并且0.5μM的IWP-2抑制卵裂率（P<0.01）和囊胚率（P<0.01）。0.5μM的PLC抑制剂U73122提高了卵母细胞的成熟率（P<0.05）,降低了卵裂率（P<0.001）和囊胚率（P<0.01）;0.5μM PLC激活剂m-3M3FBS降低了卵母细胞成熟率（P<0.05）,提高了卵裂率（P<0.01）和囊胚率（P<0.01）。这说明Wnt配体在猪卵母细胞的成熟过程中可能具有促进作用,PLC蛋白可以抑制卵母细胞的成熟。3.0.5μM的IWP-2可以下调颗粒细胞（P<0.01）和卵母细胞（P<0.05）中的Ca2+的浓度。0.5μM的IWP-2处理猪颗粒细胞24 h降低了PLCB1（P<0.001）、PLCG1（P<0.01）和PLCZ1（P<0.001）的m RNA丰度;IWP-2处理猪卵母细胞44 h降低了PLCB1（P<0.001）、PLCD3（P<0.001）、PLCG1（P<0.001）和PLCZ1（P<0.001）基因的表达,同时降低了PLCD3（P<0.05）蛋白的表达。抑制剂U73122和激活剂m-3M3FBS对PLCB1 m RNA的最佳作用时间是4 h,最佳处理浓度是0.5μM。0.5μM U73122处理猪颗粒细胞4 h降低了PLCB1（P<0.05）、PLCD3（P<0.05）与PLCZ1（P<0.05）的m RNA表达,同时降低了PLCB1（p=0.001）和PLCG1（P<0.05）的相对蛋白丰度以及钙离子的浓度（P<0.001）。0.5μM的m-3M3FBS处理颗粒细胞4 h显着增加了PLCB1（P<0.05）、PLCD3（P<0.05）与PLCZ1（P<0.05）的m RNA表达,并升高了钙离子浓度（P<0.01）。与对照组相比,0.5μM的U73122处理猪卵母细胞44h后,PLCB1（P<0.001）、PLCD3（P<0.01）和PLCZ1（P<0.05）的m RNA丰度下降,钙离子浓度变化不大;用0.5μM m-3M3FBS处理猪卵母细胞44小时后,PLCB1（P<0.01）、PLCD3（P<0.001）、PLCG1（P<0.05）和PLCZ1（P<0.05）的m RNA丰度增加,PLCB1蛋白的丰度明显增加（P<0.05）,钙离子浓度增加（P<0.05）。IWP-2与U73122共同作用降低了颗粒细胞（P<0.001）和卵母细胞（P<0.05）中的钙离子水平,而IWP-2与m-3M3FBS共同作用则对颗粒细胞和卵母细胞的钙离子水平没有影响。结果表明,Wnt配体与PLC蛋白可以协同调节卵泡内钙离子水平的变化,能够增加胞质中Ca2+的增加。4. 在颗粒细胞中,抑制剂U73122降低了钙离子敏感蛋白PKCβ（P<0.05）、CAMKIIα（P<0.05）和Caln A（P<0.01）的表达丰度,激活剂m-3M3FBS升高了CAMKIIα蛋白（P<0.001）的表达量。在卵母细胞中,PLC蛋白对PKCβ和CAMKIIα蛋白具有正调控功能（P<0.05）,但是不影响Caln A的表达。在颗粒细胞中,抑制剂U73122可以下调CDC42（P<0.01）、NFATc1（P<0.01）和NFκB（P<0.01）的m RNA表达水平,同时对CTNNB有少许上调作用（P>0.05）;激活剂m-3M3FBS可以上调CDC42（P<0.05）、NFATc1（P<0.01）和NFκB（P<0.05）的m RNA表达水平,同时降低CTNNB（P<0.05）的表达。在卵母细胞中,PLC对下游基因具有上调作用,但是并不影响CTNNB的m RNA表达水平（P>0.05）。结果表明,PLC蛋白可以激活猪颗粒细胞和卵母细胞的钙离子敏感蛋白和下游基因,并且在颗粒细胞中可以抑制CTNNB的表达。5.0.5μM的IWP-2上调了调控猪颗粒细胞凋亡的BAK（P<0.001）、BAX（P<0.01）、CASP8（P<0.05）和TP53（P<0.05）基因的m RNA水平,同时Bak、Bax和Cleaved caspase-3蛋白的表达增加（P<0.05）。0.5μM的IWP-2处理猪卵母细胞44 h之后,BAX（P<0.01）、CASP3（P<0.05）和TP53（P<0.01）基因的表达显着升高,同时抗凋亡基因BCL6（P<0.05）基因的表达降低;Bax（P<0.01）和Cleaved caspase3（P<0.05）蛋白的表达显着增加,Bcl-6（P<0.01）蛋白的表达降低。PLC活性变化可以抑制颗粒细胞的凋亡调控基因,并且在不同的时间对凋亡率的影响有所不同。0.5μM的PLC抑制剂U73122可以上调BAK（P<0.01）、BAX（P<0.05）和CASP3（P<0.01）的m RNA表达水平。0.5μM的U73122作用颗粒细胞4 h时早期凋亡率（P<0.05）和晚期凋亡率（P<0.05）达到最高。PLC激活剂m-3M3FBS可以上调抗凋亡基因BCL2（P<0.01）的m RNA水平,并且下调BAX（P<0.05）和CASP3（P<0.05）的m RNA表达;并降低Bax蛋白的表达,增加Bcl-2蛋白的表达。0.5μM的m-3M3FBS作用颗粒细胞4 h时早期凋亡率最高（P<0.05）,作用8 h时晚期凋亡率达到最高（P<0.05）。用0.5μM U73122培养猪卵母细胞44小时,与对照组相比,、、CASP3（P=0.001）、和的相对m RNA丰度增加,而的相对m RNA水平降低;、Cleaved和蛋白的表达上调。使用0.5μM m-3M3FBS培养猪卵母细胞44 h,与对照组相比,、、CASP3（p）、和TP53（p=0.001）的相对m RNA丰度降低,而BCL6的相对m RNA水平而升高（图4-6 D）;Bcl-6的蛋白表达丰度增加（P<0.05）,且P53的蛋白表达丰度降低。0.5μM的IWP-2与0.5μM的U73122于体外共同处理猪的颗粒细胞,与对照组相比,上调了BAK（P<0.01）、BAX（P<0.001）、CASP3（P<0.01）、CASP8（P<0.001）和TP53（P<0.05）的m RNA表达量,下调了BCL2（P<0.05）的m RNA表达水平。在猪颗粒细胞培养液中同时添加0.5μM的IWP-2和0.5μM的m-3M3FBS,与对照组相比,BAK（P<0.001）和CASP8（P<0.001）的m RNA表达水平降低。与对照组相比,2μM的Enzastaurin增加了BAK（P<0.001）、BAX（P<0.001）和CASP3（P<0.01）基因的表达,同时降低了BCL2（P<0.001）基因的表达;0.5μM的U73122和2μM的Enzastaurin共同作用增加了BAK（P<0.001）和BAX（P<0.05）基因的表达,同时降低了BCL2（P<0.01）基因的表达。2μM的Enzastaurin增加了Bax蛋白（P<0.05）的表达,降低了Bcl-2蛋白（P<0.01）的表达;0.5μM的U73122和2μM的Enzastaurin共同作用降低了Bcl-2蛋白（P<0.001）的表达。结果表明,Wnt/Ca2+通路中Wnt配体和PLC蛋白可以协同抑制猪颗粒细胞和卵母细胞的凋亡过程。0.5μM的U73122和2μM的Enzastaurin可以协同促进猪颗粒细胞的凋亡。6.0.5μM IWP-2可以促进猪颗粒细胞中雌二醇相关基因CYP17A1（P<0.01）、CYP19A1（P<0.01）、ER1（P<0.001）和ER2（P<0.01）的表达上调。0.5μM PLC抑制剂U73122可以上调猪颗粒细胞CYP11A1基因（P<0.05）,0.5μM PLC激活剂m-3M3FBS对激素调控的作用很小。0.5μM U73122处理颗粒细胞2 h、8 h、12 h、24 h、48 h后雌二醇分泌下降（P<0.05）,0.5μM m-3M3FBS处理猪颗粒细胞2h后雌二醇分泌下降（P<0.05）。0.5μM U73122处理猪颗粒细胞4 h增加了孕酮的分泌（P<0.05）,0.5μM m-3M3FBS处理猪颗粒细胞2 h和8 h后孕酮水平增加（P<0.05）。0.5μM的U73122处理猪颗粒细胞后,除了8 h（P>0.05）之外,各时间点雌二醇与孕酮的比例均下降（P<0.05）。使用0.5μM m-3M3FBS处理猪颗粒细胞2 h降低了雌二醇与孕酮的比例（P<0.05）。IWP-2和U73122共同作用提高了参与调节E2和P4的基因的m RNA表达水平,IWP-2与m-3M3FBS共同作用降低了CYP11A1的m RNA表达水平（P<0.01）,提高了CYP17A1（P<0.05）、CYP19A1（P<0.01）和ER1（P<0.05）的表达水平。与对照组相比,2μM Enzastaurin以及0.5μM U73122和2μM Enzastaurin共同作用均增加了猪颗粒细胞中CYP11A1基因（P<0.01）的表达和降低了CYP19A1（P<0.001）基因的表达。0.5μM U73122和2μM Enzastaurin共同作用比2μM Enzastaurin单独作用更明显地降低了猪颗粒细胞中CYP17A1基因的表达。研究表明,Wnt/Ca2+通路中Wnt配体和PLC蛋白可以共同调控猪颗粒细胞和卵母细胞的雌二醇（E2）和孕酮（P4）的激素水平。0.5μM的U73122和2μM的Enzastaurin可以协同调控三种激素相关基因CYP11A1、CYP17A1和CYP19A1。综上所述,Wnt/Ca2+信号通路中Wnt蛋白和PLC蛋白可发挥协同作用在猪的卵泡发育过程中具有抑制细胞凋亡和调节激素分泌的功能;Wnt/Ca2+信号关键蛋白PLC可以调控钙离子敏感蛋白和下游基因的表达。
张彩玉[7]（2019）在《调控组蛋白H3K4、K9三甲基化对猪卵母细胞体外成熟影响的初步研究》文中进行了进一步梳理哺乳动物卵母细胞的成熟包含染色质凝聚和分离等一系列复杂的生理事件,这些生理事件可能与组蛋白的甲基化修饰密切相关。组蛋白H3第4位赖氨酸三甲基化（Histone H3K4 trimethylation,H3K4me3）与转录激活相关,组蛋白 H3第9位赖氨酸三甲基化（Histone H3K9 trimethylation,H3K9me3）抑制基因表达,两种甲基化修饰的表达均受组蛋白甲基转移酶和去甲基转移酶的调控。毛壳素可特异性抑制组蛋白甲基转移酶SUV39H1/2和G9A基因的表达,降低H3K9me3水平。CPI-455是组蛋白去甲基转移酶KDM5A和KDM5B的特异性抑制剂,可提高细胞中H3K4me3的表达。本研究采用毛壳素和CPI-455处理猪卵母细胞,分析相关基因表达的变化,了解组蛋白三甲基化修饰的改变对猪卵母细胞体外成熟和早期胚胎发育的影响,研究结果为深入了解组蛋白甲基化修饰在猪卵母细胞体外成熟的作用奠定基础。1、调控H3K9me3表达对猪卵母细胞体外成熟和早期胚胎发育的影响。猪卵母细胞体外成熟0-22 h添加不同浓度毛壳素处理,结果显示,与未处理组相比,2 nM毛壳素处理显着提高了猪卵母细胞体外成熟率、4-细胞率和囊胚率（81.5%VS 72.62%,74.43%VS 68.69%,40.43%VS 27.48%,P<0.05）。在不同时间段采用毛壳素处理时发现,22-44 h和0-44 h分别添加毛壳素时,各组之间卵裂率、4-细胞率、囊胚率及囊胚细胞总数均无显着差异（P>0.05）。与未处理组相比,0-44h添加5nM毛壳素处理的成熟率显着提高（87.39%VS 71.95%,P<0.05）。免疫荧光结果表明,H3K9me3在GV期卵母细胞中有表达,在培养22 h以后的卵母细胞中无表达。与未处理组相比,0-22 h添加2 nM毛壳素处理可显着降低囊胚中H3K9me3的表达（P<0.5）。qRT-PCR结果表明,与未处理组相比,0-22h添加2nM毛壳素处理的卵母细胞中SUV39H1/2和G9A表达整体降低,囊胚中Nanog、Oct4、CDX2表达显着提高（P<0.05）,囊胚细胞总数无差异（P>0.05）。2、调控H3K4me3表达对猪卵母细胞体外成熟和早期胚胎发育的影响。猪卵母细胞体外成熟0-22 h添加不同浓度CPI-455处理,结果表明,与未处理组相比,5 μM处理显着提高了猪卵母细胞体外成熟率和囊胚率（88.82%VS 78.20%,41.84%VS 28.4%,P<0.05）。猪卵母细胞体外成熟不同时间段添加CPI-455处理时发现,与未处理组和1 μM处理组相比,在体外成熟22-44 h添加5μM 处理的2-细胞率显着降低（84.94%,86.34%VS 74.15%,P<0.05）;体外成熟0-44h添加CPI-455时发现,各组之间的第一极体排出率、2-细胞率、4-细胞率、囊胚率和囊胚细胞总数均无显着差异（P>0.05）。免疫荧光结果显示,与未处理组相比,0-22 h添加5 μM处理显着了提高囊胚中H3K4me3的表达（P<0.05）。qRT-PCR结果发现,与未处理组相比,0-22 h添加5 μM处理降低了卵母细胞中KDM5A和KDM5B的表达（P<0.05）,显着提高了囊胚中Nanog、Oct4、CDX2等多能性基因的表达（P<0.05）,囊胚细胞总数无差异（P>0.05）。体外成熟0-22h同时添加毛壳素和CPI-455处理对卵母细胞体外成熟率和早期胚胎发育率无显着影响（P>0.05）。以上结果表明,适宜浓度的毛壳素、CPI-455处理可通过降低猪卵母细胞中SUV39H1/2和G9A、KDM5A和KDM5B基因的表达,上调囊胚中多能性基因的表达,进而提高猪卵母细胞体外成熟率和早期胚胎发育率。
殷超[8]（2019）在《热应激对猪卵母细胞和卵丘细胞互作的影响及其生理机制》文中研究表明卵母细胞在雌性哺乳动物的繁殖活动中扮演了重要角色,其质量的优劣直接关系到卵子受精、胚胎发育、妊娠建立与维持甚至仔畜出生后的生长与健康。细胞的核质成熟对于卵母细胞的质量发育至关重要,该过程依赖于卵母细胞与其外周的卵丘细胞（Cumulus cells）形成卵丘-卵母细胞复合体（Cumulus-oocyte complexes,COCs）后,在跨透明带突起（Transzonal projections,TZPs）和间隙连接（Gap junctions,GJs）等转运通道的基础上,通过细胞间的物质信息互作完成。热应激是动物养殖过程中难以避免的一类环境应激源,可引起卵母细胞从第一次减数分裂中期（Metaphase Ⅰ）、末期（Telophase Ⅰ）到第二次减数分裂中期（Metaphase Ⅱ）过程的发育异常,导致猪、牛、鼠等动物繁殖能力严重下降。然而,迄今针对热应激诱导卵母细胞质量损伤的机制分析仍然建立在卵母细胞和卵丘细胞单方面的功能研究上,而较少有人关注热应激对卵母细胞与卵丘细胞之间交流互作的影响,相关生理机制亦不清楚。因此,本研究采用卵巢热应激和COCs热应激两个试验模型,首先验证了热应激对卵母细胞质量产生的影响;其次,在同一模型下比较分析了卵母细胞和卵丘细胞的特异性热应激反应,并通过细胞分离培养和热应激的方式反向求证该特异性反应与细胞间交流互作的相关性;再次,从基因和蛋白表达水平检测了热应激对卵丘-卵母细胞间TZPs通讯结构的影响,并在此基础上有针对性地筛选合适的生理调节剂,用来缓解热应激对卵母细胞质量造成的损伤。1不同热应激模型对猪卵母细胞质量的影响从南京栖霞区屠宰场采集135～170日龄,体重70～120 kg的杜×长×大三元杂交（杜洛克×长白×大白）青年母猪的卵巢,于3h内运回实验室。卵巢热应激试验:卵巢洗净后随机分为对照组和热应激组,分别置于38.5℃和41.5℃水浴锅内进行卵巢热应激,随后收集卵巢内直径为3～6 mm卵泡中的卵泡液,于体视显微镜下拣出COCs,继续在38.5℃条件下进行体外成熟培养（In vitro maturation,IVM）;培养结束后,用1 mg/mL透明质酸酶（Hyaluronidase,Hya）消化COCs获得卵母细胞,进行后续试验分析。结果显示:与对照组相比,1 h、2 h和4 h卵巢热应激均显着降低了（P<0.05）卵母细胞的存活率和第一极体排出率;卵巢热应激1h并继续培养24 h后,卵丘细胞扩展率和卵母细胞中线粒体簇状分布比例均显着下降（P<0.05）;同时,卵巢热应激还使IVM 44 h后85%以上卵母细胞的发育停滞于GV至MI期,而对照组85%以上的卵母细胞则进入TⅠ至MⅡ时期发育阶段。COCs热应激试验:卵巢清洗后直接转入无菌室中38.5℃C的水浴锅内,抽取卵泡液并分离COCs继续进行体外成熟培养,并于IVM 0～24 h给予41.5℃热应激处理;处理后一部分COCs用Hya消化得到卵母细胞,用于荧光染色和显微成像,另一部分继续在38.5℃条件下培养至44 h,经孤雌激活后用来进一步检测卵母细胞的发育潜力。试验结果显示:COCs热应激24 h显着降低了卵母细胞的质量,表现为卵丘细胞扩展率、卵母细胞存活率、第一极体排出率和线粒体近核分布比例的显着下降（P<0.05）;同时,COCs热应激还显着抑制了孤雌激活后卵母细胞的早期胚胎发育能力,2-细胞分裂率、4-细胞分裂率和囊胚率均显着下降（P<0.05）。以上结果表明,不论是卵巢热应激还是COCs热应激模型,均能够显着阻滞卵母细胞的成熟和发育,从而导致卵母细胞质量及其早期胚胎发育能力的下降。2猪卵母细胞和卵丘细胞的不同热应激反应采用卵巢热应激和COCs热应激模型,于体外培养24 h后分离得到卵母细胞和卵丘细胞,用于分析两者的特异性热应激反应。卵巢热应激试验显示:卵母细胞和卵丘细胞中线粒体DNA（Mitochondrial DNA,mtDNA）编码基因和热休克蛋白（Heat shock proteins,HSPs）相关基因的表达水平以及ATP的含量均显着下降,线粒体活性氧（Mitochondrial reactive oxygen species,mROS）含量显着升高（P<0.05）;COCs 热应激试验显示:卵母细胞和卵丘细胞对热应激的反应不相同。与对照组比较,卵母细胞中HSPs相关基因和mtDNA编码基因的mRNA表达丰度以及ATP的含量均显着降低,而在卵丘细胞中显着升高;卵母细胞中mROS生成显着增加,同时伴随两类细胞中caspase 3活性的显着升高（P<0.05）。为了进一步验证热应激对卵母细胞和卵丘细胞交流互作的影响,采集卵巢并拣取COCs后,直接分离得到卵母细胞和卵丘细胞,分别在体外进行24 h成熟培养和热应激。结果显示:单独培养和热应激的卵母细胞和卵丘细胞中HSPs基因表达水平、ATP含量和caspase 3活性的变化均与COCs热应激试验结果相一致;然而,不同的是,分离培养和热应激模型下仅卵丘细胞中mROS的生成量显着增加（P<0.01）,而卵母细胞中mROS的含量不变。以上结果提示:卵母细胞和卵丘细胞对于热应激的不同反应很可能与细胞间交流互作受到干扰有关。3热应激对猪卵丘-卵母细胞间TZPs通讯结构的影响同样,采用卵巢热应激和COCs热应激模型,于体外进行24 h成熟培养和热应激后,分别收集卵母细胞和卵丘细胞,检测单体actin的基因和蛋白表达以及TZPs通讯结构的变化。卵巢热应激试验显示:伴随卵母细胞的发育,对照组和热应激组TZPs结构的数量及其组成蛋白微丝肌动蛋白（Filamentous actin,F-actin）的荧光强度均逐渐下降,与对照组相比,热应激显着降低IVM 24 hTZPs结构的数量和F-actin的荧光强度（P<0.05）;在单体actin表达方面,对照组卵母细胞β-actin和γ-actin的基因表达水平随着卵母细胞的发育先升高后下降,蛋白表达水平逐渐降低,与对照组相比,热应激显着下调IVM 24 h和IVM 44 h β-actin和γ-actin的蛋白表达量（P<0.05）;与之相反,对照组卵丘细胞中β-actin和γ-actin的基因和蛋白表达水平随IVM时间的延长逐渐升高,与对照组相比,热应激显着下调β-actin和γ-actin在IVM 24 h和44 h的基因表达水平以及IVM 24 h的蛋白表达量（P<0.05）;免疫荧光共定位结果显示,F-actin与β-actin、γ-actin的共定位比例分别约为25%和75%,说明F-actin结构主要由单体的γ-actin蛋白组成;TZPs与GJs结构的荧光共定位结果显示,热应激条件下卵母细胞中GJs标志蛋白Connexin45的荧光强度显着增加,而F-actin以及TZPs与GJs共定位区域的荧光强度均显着下降（P<0.05）;COCs热应激试验表明:伴随卵母细胞的发育,对照组TZPs结构的数量和F-actin的荧光强度均逐渐下降,与对照组相比,热应激亦显着降低IVM 24 h TZPs结构的数量和F-actin的荧光强度（P<0.05）;卵母细胞中β-actin和γ-actin的基因和蛋白表达均随IVM时间的延长逐渐下降,而卵丘细胞中则随卵母细胞的发育逐渐升高,与对照组相比,热应激显着下调IVM 24 h卵母细胞和卵丘细胞中β-actin和γ-actin的蛋白表达量（P<0.05）。以上结果说明,TZPs结构主要由γ-actin蛋白构成,热应激可通过降低卵丘细胞中γ-actin的蛋白表达水平影响F-actin和TZPs结构的形成与稳定。4热应激降低卵母细胞质量的缓解措施针对上述结果中ATP、mROS及单体actin表达的变化,本试验中,在COCs体外成熟的前24 h给予41.5℃热应激和N-乙酰半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine,NAC）、ATP、甜菜碱（N,N,N-trimethylglycine,Betaine）的联合处理,通过检测卵母细胞存活率和第一极体排出率筛选有效的生理调节剂用于缓解热应激,并初步探明其缓解机制。结果表明:热应激显着降低了 IVM 44 h卵母细胞的存活率和第一极体排出率（P<0.05）,添加NAC和甜菜碱对热应激条件下卵母细胞的存活率和第一极体排出率没有明显缓解作用;然而,添加200 nM ATP能够显着改善热应激引起的卵母细胞存活率下降和TZPs结构损伤（P<0.05）,对第一极体排出率亦表现出缓解趋势（P=0.075）。与此同时,热应激组卵丘细胞中HSP27的mRNA和蛋白表达水平显着上调,β-actin和γ-actin的蛋白表达水平显着下调（P<0.05）,添加ATP对HSP27 mRNA和β-actin、γ-actin的蛋白表达水平均没有明显影响,但显着缓解了热应激导致的HSP27蛋白高丰度表达现象（P<0.05）。综上所述,热应激主要通过诱导卵丘细胞中γ-actin蛋白表达下调和HSP27蛋白表达上调,从而影响F-actin的形成和稳定;添加适宜浓度的ATP可通过抑制卵丘细胞中HSP27蛋白的高丰度表达缓解热应激对F-actin及TZPs结构造成的损伤,进而改善热应激诱导的卵母细胞质量下降。
刘帅[9]（2015）在《猪卵胞质注射及单精子胞质内注射介导的转基因方法研究》文中提出卵胞质注射转基因（CI-MGT）具有操作简单、胚胎损伤小和胚胎体外停留时间短等优点,结合体内受精胚胎和高效基因编辑技术,最近被广泛应用于转基因动物生产中。单精子胞质内注射转基因（ICSI-MGT）适于大片段外源基因转移,并能有效解决猪体外受精胚胎多精子受精等问题,特别适用于转基因猪的生产。广西地处高温高湿的亚热带地区,为优化此种环境下猪胚胎和转基因技术体系,本研究在优化猪卵母细胞体外成熟、激活及胚胎培养条件的基础上,系统探讨了体外受精及孤雌激活胚胎CI-MGT和ICSI-MGT的相关影响因素,并对CI-MGT体外受精胚胎及ICSI-MGT胚胎生产转基因猪可行性进行了研究。研究结果如下：1.探讨了成熟液和胚胎培养液组分对猪卵母细胞成熟及胚胎发育效果的影响。结果显示,成熟基础液为TCM-199核成熟率和胚胎发育效率显着高于NCSU-37和PZM-3（P<0.05）。以TCM-199为成熟基础液,不加额外能量底物（PMt）的核成熟率和孤雌囊胚发育率分别为74.1土2.4%和29.3+1.3%,显着高于添加0.91 mmol/L丙酮酸钠+3.05 mmol/L葡萄糖（PMtsg）或0.91 mmol/L丙酮酸钠+3.05 mmol/L葡萄糖+0.1mg/mL谷氨酰胺（PMtsgg, P<0.05）。在成熟液中添加10 IU/mL eCG+15 IU/mL hCG组的核成熟率和胚胎发育效率显着高于添加0.5μg/mL FSH+0.5μg/mLLH或0.5μg/mL FSH+10 UI/mL hCG。成熟液中添加50 ng/mL EGF+10 ng/mL IGF-I组囊胚率显着高于添加10 ng/mL EGF和不添加组（P<0.05）。对猪卵母细胞体外成熟过程中核相变化研究显示,成熟培养38 h的核成熟率为57%（105/184）,40 h为43%（82/189）,42 h为48%（75/155）,44 h为59%（208/354）,46 h为70%（59/84）,48 h为62%（51/82）,50 h为74%（154/207）。在以PZM-3为基础液的胚胎培养液中添加0.277 mmol/L肌醇（PZMi）,其囊胚率显着高于添加0.34 mmol/L柠檬酸钠（PZMc）或0.34 mmol/L柠檬酸钠+0.277 mmol/L肌醇（PZMci, P<0.05）;添加0.5 mg/mL透明质酸组的囊胚率显着高于未添加组（P<0.05）；添加3 mg/mL BSA-FAF组的囊胚率显着高于添加BSA-V组（41.4士4.1%vs 36.7±3.8%,P<0.05）。培养液中BSA浓度增加至5 mg/mL或在培养96 h后加入10%FBS的囊胚率和囊胚孵化率均有所增加,但差异不显着。添加50 ng/mL IGF-I的囊胚率和囊胚细胞数高于未添加组,但差异不显着。2.探讨了激活方法对猪卵母细胞孤雌胚胎发育效果的影响。结果显示,卵母细胞经5 μmol/L离子霉素（Ion）激活5 min后,再分别在含2 mmol/L6-二甲基氨基嘌呤（6-DMAP）,5μg/mL细胞松弛素B （CB）+10放线菌酮（CHX）,5μg/mL CB+2 mmol/L 6-DMAP,5μg/mL CB+10μg/mL CHX+2 mmol/L 6-DMAP培养4 h的囊胚率显着高于在10μg/mL CHX培养4 h的囊胚率（29.7±1.1%、29.8±1.2%、30.4±1.6%和30.2±2.7%vs 15.8土1.5%,P<0.05）,但四组间囊胚率、ICM细胞数、TE细胞数及ICM/TE均无显着差异。当电脉电压为1.25KV/cm时3次电脉冲电激活的囊胚发育率显着高于2次电脉冲（P<0.05）,当电脉冲为3次时电场强度为0.80和1.00KV/cm的胚胎碎裂率显着低于1.20 KV/cm,且1.00 KV/cm组的囊胚率显着高于0.80和1.20 KV/cm组（P<0.05）。卵母细胞电激活后分别用5μg/mL CB+10 μg/mL CHX,5μg/mL CB+2 mmol/L 6-DMAP培养处理4 h的囊胚率（55.4±1.2%和50.4±2.9%）显着高于用2 mmol/L 6-DMAP （37.9±2.4%）,5 μg/mL CB+10 μg/mL CHX+2 mmol/L 6-DMAP （36.9±3.1%）培养处理4 h的囊胚发育率,亦显着高于单纯电激活处理（40.7±1.7%）和Ion激活后用2 mmol/L 6-DMAP （30.6±0.8%）培养处理4 h的囊胚发育率(P<0.05。电激活后,用5μg/mLCB培养处理4 h的囊胚率显着高于用5μg/mLCB培养处理4 h（54.0±4.1%vs 37.9±2.4%,P<0.05）,与7.5μg/mLCB组差异不显着,但7.5μg/mLCB组的ICM细胞数和ICM/TE均显着高于5 μg/mLCB组（P<0.05）。对胚胎核型进行分析结果表明,电激活后用7.5μg/mL CB+10 μg/mL CHX培养处理4 h的囊胚细胞二倍体率显着高于单纯电激活处理组（84.6% vs 40.0%,P<0.05）。3.研究了猪卵胞质内注射转基因的影响因素。孤雌激活卵胞质注射（PA-CI）的研究结果显示,注射外源RNA、外源RNA+1-4 U/μL RNA酶抑制剂对孤雌激活卵的囊胚率、ICM细胞数、TE细胞数及ICM/TE均无显着影响,表明可同时注射外源RNA和RNA酶抑制剂。注射100 ng/μL EGFP-N1 DNA的孤雌囊胚阳性率显着高于50 ng/μL和空注组,但囊胚率显着低于其余两组（33.9士1.1%vs 46.4±2.1%和50.5±1.9%,P<0.05）；注射100 ng/μL Talen-BMP15 RNA的囊胚率与50 ng/μL注射组和空注组差异不显着,表明注射DNA对胚胎毒性大于注射RNA。孤雌激活后5-18 h注射的囊胚率均显着低于注射后立刻激活或激活后立刻注射的囊胚率（P<0.05）。注射EGFP-N1线性化DNA的囊胚阳性率显着高于环状DNA（15.8±1.4%vs11.7±1.0%,P<0.05）,但两者胚胎发育率差异不显着,并且外源RNA注射组的囊胚率普遍高于注射DNA载体。当采用体外受精卵进行胞质内注射时（IVF-CI）,精卵孵育后5-18 h注射线性化EGFP-N1载体的囊胚率和囊胚细胞数差异均不显着,但5-6、8-9和11-12 h注射组胚胎阳性率显着高于14-15和17-18 h（12.6±0.6%,11.8土0.5%和13.6±0.6%vs 8.7±0.8%和6.5±1.0%,P<0.05）,表明外源DNA在猪雌雄原核形成期（约13 h）前注射的外源基因整合效率较高。注射40和50 ng/μL EGFP-N1 DNA组囊胚率显着高于100 ng/μL,与10、20、30ng/μL和空注组差异不显着,同时40、50和100 ng/pL组阳性率显着高于其余各组（P<0.05）。IVF卵注射GDF8 Cas9 mRNA/sgRNA的囊胚率显着低于PA卵（13.7±0.8%vs 52.6+3.1%,P<0.05）,但注射IVF卵的胚胎基因突变效率显着高于注射PA卵（25.0% vs3.8%,P<0.05）,表明Cas9/sgRNA系统可以通过注射猪IVF卵对猪的基因组进行编辑。4.系统研究了猪单精子胞质内注射转基因的影响因素。结果显示,10和20 ng/μL EGFP-N1 DNA与精子共孵育的囊胚率显着高于50和100 ng/μL（33.8±2.4%和31.0±0.9% vs 24.4±2.7和16.1±0.8%,P<0.05）,但20ng/μL孵育组胚胎阳性率显着高于10ng/μL（30.5±1.5%vs 16.3±1.5,P<0.05）。精子与外源基因孵育5、30和60 min囊胚率显着高于孵育24 h,但30和60 min组阳性率和囊胚阳性率显着高于5 min（P<0.05）。采用不同冷冻液（DPBS、 BTS和mNIM）冷冻精子对ICSI-MGT胚胎发育率无显着影响,但精子孵育液DPBS+EDTA （10 mmol/L EDTA）的囊胚率显着高于DPBS（27.8±0.7%vs 22.2±1.6%, P<0.05）, mNIM （10 mmol/L EDTA+123.0 mmol/L KCl）组的囊胚率显着高于DPBS+EDTA组（33.2±1.3%vs 27.8±0.7%,P<0.05）,表明孵育液中的EDTA和K+对注射后的胚胎发育有影响。精子超声+冻融处理和NaOH处理的囊胚率显着高于鲜精、A23187、超声、冻融和三次冻融处理组,超声+冻融和NaOH处理组的胚胎外源基因阳性率亦显着高于鲜精和A23187处理组。此外,卵母细胞激活后注射超声+冻融和NaOH处理精子的囊胚率显着高于激活前注射组（35.7±2.4%vs 30.2+0.6%；34.5±0.3% vs28.5±0.9%,P<0.05）,表明精子破膜与激活影响ICSI-MGT胚胎的发育。卵母细胞激活后0-30 min注射的囊胚率显着低于60-90 min注射组,但阳性率和囊胚阳性率均显着高于60-90 min注射组。对ICSI后不同时间合子内的GSH含量分析显示,激活后0-30 min注射组的6 h合子GSH含量显着低于60-90 min注射组和孤雌激活组（3.22±0.06 vs 5.02±0.09和4.73±0.14,P<0.05）,而60-90 min注射组的6 h和12 h合子GSH含量与孤雌组均无显着差异。进一步原核分析发现,0-30 min注射组的雌雄双原核形成率显着高于60-90 min（56.9±3.7% vs 36.3±2.0%,P<0.05）,且0-30min注射组精子解聚率显着高于60-90min,表明延长激活以后的注射时间会造成更高的孤雌胚胎产生。采用不同外源基因载体（EGFP-N1、Anti-FMDV. PRL-EGFP和IFN-EGFP）的ICSI-MGT囊胚率差异不显着,但显着影响胚胎阳性率,其中EGFP-N1线性化载体阳性率显着高于环状载体（35.9±0.2%vs20.9±0.9%,P<0.05）,而Anti-FMDV RNAi载体阳性率和囊胚阳性率均显着低于其它载体（P<0.05）。将Cas-GDF8、Anti-FMDV和EGFP-N1的ICSI-MGT胚胎移植入6头自然发情受体内,4头未见返情,其中7557号受体流产获得3头胎猪,7645号受体妊娠到期得到4头仔猪,对仔猪耳朵皮肤EGFP和Neo双基因进行PCR鉴定均显示阳性,表明应用优化的ICSI-MGT技术可以获得转基因猪后代。
鲍建昌[10]（2011）在《核成熟抑制剂对猪卵母细胞体外成熟和发育能力的影响》文中研究说明通过对比不同猪卵母细胞体外成熟培养液和添加不同的小分子化合物,研究猪卵母细胞体外成熟情况,优化猪卵母细胞体外成熟培养体系。论文主要从以下2个方面进行了研究:1、猪卵母细胞体外成熟培养体系的优化人用卵母细胞体外成熟培养液ART-1600和常用的猪卵母细胞体外成熟培养液mM199、NCSU-23对猪卵母细胞体外成熟的影响进行了比较,并对比了成熟卵母细胞孤雌激活后发育能力的变化;通过添加10%PFF和不同浓度的BSA来优化猪卵母细胞体外培养体系;还比较了三种猪体外胚胎培养液（PZM-3、NCSU-23和G1/G2）对孤雌胚胎体外发育的影响。研究结果发现:（1）猪卵母细胞体外成熟时,ART-1600组卵母细胞的成熟率显着高于mM199和NCSU-23两种培养液（P<0.05,81.6 %±4.9 % vs 71.7 %±3.2 %、69.6 %±3.9 %）;ART-1600组成熟的卵母细胞,经孤雌激活后的囊胚率显着高于mM199和NCSU-23组（P<0.05,22.6 %±3.8 %vs 18.7 %±1.2 %、17.7 %±1.9 %）;（2）添加10% PFF组与对照组相比成熟率无显着差异（P>0.05）,但能显着提高孤雌激活后胚胎的卵裂率（P<0.05）;（3）在成熟培养液中分别添加0、1.5、3、6和12mg/mL BSA,发现3 mg/mL BSA虽不能提高卵母细胞的成熟率（P>0.05）,但能显着提高孤雌激活后胚胎的卵裂率（P<0.05）,而对囊胚率无显着影响（P>0.05）。还发现≥6 mg/mL BSA时卵母细胞的成熟率显着降低（P<0.01）,并且有大量卵母细胞退化死亡;（4）微滴并覆盖矿物油培养卵母细胞与四孔板培养相比,成熟率无显着差异（P>0.05）,但前者成熟的卵母细胞胞质并无收缩;（5）孤雌胚胎体外培养时,PZM-3组的胚胎卵裂率和囊胚率均好于NCSU23组和G1/G2组,且差异显着（P<0.01,77.0 %±3.9 % vs 63.9 %±4.2 %、63.6 %±8.3 %,19.0 %±0.3 % vs 13.2 %±1.1 %、10.9 %±1.2 %）。结果表明ART-1600作为猪卵母细胞体外成熟培养液好于mM199和NCSU-23,在成熟培养液中添加10% PFF和3 mg/mL BSA能够提高卵母细胞激活后的发育能力,PZM-3作为猪孤雌胚胎体外培养液好于NCSU-23和G1/G2。2、丁内酯-I对卵母细胞成熟及胚胎发育能力的影响对cdc2激酶抑制剂丁内酯-I（butyrolactone I, BL-I）对猪卵母细胞体外成熟的抑制情况,以及抑制后卵母细胞发育能力进行了研究。结果表明,分别用0、10、20、40和80μmol/L BL-I处理猪卵母细胞44h后,对卵母细胞成熟的抑制程度与BL-I浓度的升高成正比。用20、40和80μmol/L处理时,处于GV期的卵母细胞分别为25%、47%和67%,与对照组（5%）相比差异极显着（P<0.01）;而到达MⅡ期的卵母细胞分别为38%、9%和0,与对照组（67%）相比差异极显着（P<0.01）,说明BL-I对卵母细胞成熟有明显抑制作用。将20、40和80μmol/Lol/L处理的卵母细胞,再在正常培养液中培养44h后,到达MⅡ期的卵母细胞为57%、41%和5%,与抑制44h时相比均有显着提高,表明BL-I对卵母细胞成熟的抑制作用是可逆的。20μmol/L BL-I抑制培养20h再正常培养24h（20h+24h处理组）后卵母细胞的成熟率显着低于对照组（正常培养44h）（P<0.05, 65.6 % vs 70.1%）。并对20h+24h处理组成熟的卵母细胞进行孤雌激活,其卵裂率、囊胚率和囊胚总细胞数与对照组均无显着差异;对20h+24h处理组成熟的卵母细胞进行核移植（NT）,获得重构胚的卵裂率、囊胚率和囊胚总细胞数均优于对照组,但仅卵裂率有显着差异（P<0.05, 68.9 % vs 62.4%）;表明经BL-I处理能够提高猪卵母细胞孤雌和NT胚胎发育能力。
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 罗汉果的生理功能及研究进展 |
| 1.1.1 罗汉果及其甜甙的发现和应用 |
| 1.1.2 罗汉果甜甙的代谢途径 |
| 1.1.3 罗汉果甜甙的生物功能和分子机制 |
| 1.1.4 甜味剂对动物繁殖的影响 |
| 1.2 哺乳动物卵母细胞体外成熟的研究进展 |
| 1.2.1 卵母细胞核成熟和胞质成熟 |
| 1.2.2 卵母细胞体外成熟与培养环境的关系 |
| 1.2.3 卵母细胞体外成熟与能量物质的关系 |
| 1.2.4 卵母细胞体外成熟与线粒体的关系 |
| 1.2.5 卵母细胞体外成熟与活性氧(ROS)的关系 |
| 1.2.6 单细胞RNA-seq技术评价卵母细胞质量的研究 |
| 1.3 排卵后卵子老化的研究进展 |
| 1.3.1 排卵后卵子老化的发生及危害 |
| 1.3.2 加速卵子老化的因素 |
| 1.3.3 排卵后卵子老化的分子变化 |
| 1.3.4 改善卵子老化的方法及调控机制 |
| 1.4 哺乳动物植入前早期胚胎发育的研究进展 |
| 1.4.1 哺乳动物早期胚胎发生 |
| 1.4.2 影响早期胚胎发育的因素 |
| 1.4.3 孤雌激活胚胎的研究 |
| 1.4.4 体细胞核移植胚胎发育的研究 |
| 1.5 选题依据及研究内容 |
| 第二章 MV对猪卵母细胞体外成熟的影响及机制研究 |
| 前言 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 试验的主要试剂 |
| 2.1.2 试验的主要仪器设备 |
| 2.1.3 试验的主要耗材 |
| 2.1.4 试验用卵巢 |
| 2.1.5 主要溶液配制 |
| 2.1.6 引物合成 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 卵丘卵母细胞复合体(COCs)的收集和体外成熟 |
| 2.2.2 MV浓度的选择 |
| 2.2.3 孤雌激活和体细胞核移植胚胎构建 |
| 2.2.4 皮质颗粒(CGs)检测 |
| 2.2.5 葡萄糖摄取的检测 |
| 2.2.6 线粒体含量的检查 |
| 2.2.7 线粒体膜电位的检查 |
| 2.2.8 ATP的检查 |
| 2.2.9 线粒体DNA(mt DNA)拷贝数的检查 |
| 2.2.10 活性氧(ROS)检测 |
| 2.2.11 基因表达检测 |
| 2.2.12 蛋白水平检测 |
| 2.2.13 SIRT1荧光素酶报告载体构建和检测 |
| 2.2.14 数据统计和分析 |
| 2.3 试验结果 |
| 2.3.1 不同浓度MV对猪卵母细胞体外成熟的影响 |
| 2.3.2 成熟液中添加MV对后续胚胎发育的影响 |
| 2.3.3 MV对卵母细胞体外成熟过程中皮质颗粒的影响 |
| 2.3.4 MV对卵母细胞体外成熟过程中糖摄取的影响 |
| 2.3.5 MV对卵母细胞体外成熟过程中线粒体功能的影响 |
| 2.3.6 MV对卵母细胞体外成熟过程中ROS的影响 |
| 2.3.7 MV激活SIRT1 从而提高体外成熟卵母细胞质量 |
| 2.3.8 MV促进SIRT1 启动子活性 |
| 2.4 分析和讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 单细胞RNA-seq分析MV提高猪卵母细胞体外成熟的转录组变化 |
| 前言 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 试验的主要试剂 |
| 3.1.2 试验的主要仪器设备 |
| 3.1.3 试验的主要耗材 |
| 3.1.4 主要分析工具 |
| 3.1.5 试验用卵巢 |
| 3.1.6 主要溶液配制 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 卵丘卵母细胞复合体(COCs)的收集和体外成熟 |
| 3.2.2 卵母细胞分离和收集 |
| 3.2.3 单细胞RNA-seq文库构建 |
| 3.2.4 文库质检及测序 |
| 3.2.5 数据分析的主要流程 |
| 3.2.6 GO分析和KEGG通路富集 |
| 3.2.7 实时荧光定量PCR验证 |
| 3.2.8 脂滴(LDs)及甘油三酯(TGs)检测 |
| 3.3 试验结果 |
| 3.3.1 可检测的基因总数 |
| 3.3.2 RNA-seq相关性的分析 |
| 3.3.3 碱基分布 |
| 3.3.4 总映射读取在基因组中的分布 |
| 3.3.5 差异表达基因(DEGs) |
| 3.3.6 FPKM分布及DEGs的聚类分析 |
| 3.3.7 GO功能富集分析结果 |
| 3.3.8 KEGG信号通路分析 |
| 3.3.9 MV对脂滴的影响 |
| 3.3.10 实时荧光定量PCR验证 |
| 3.4 分析和讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 MV对老化卵子的影响及机制研究 |
| 前言 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 主要试剂 |
| 4.1.2 主要仪器设备 |
| 4.1.3 主要试验耗材 |
| 4.1.4 试验用卵巢 |
| 4.1.5 主要溶液配制 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 卵丘卵母细胞复合体(COCs)的收集和体外成熟 |
| 4.2.2 卵子老化 |
| 4.2.3 MV浓度的优化 |
| 4.2.4 孤雌激活胚胎培养 |
| 4.2.5 活性氧(ROS)检测 |
| 4.2.6 纺锤体和染色体形态检测 |
| 4.2.7 卵母细胞线粒体含量的检查 |
| 4.2.8 卵母细胞线粒体膜电位的检查 |
| 4.2.9 卵母细胞ATP的检查 |
| 4.2.10 细胞凋亡检测 |
| 4.2.11 基因表达检测 |
| 4.2.12 蛋白质水平检测 |
| 4.2.13 数据统计和分析 |
| 4.3 试验结果 |
| 4.3.1 MV对猪老化卵子的保护作用 |
| 4.3.2 MV对猪体外老化卵子ROS水平的影响 |
| 4.3.3 MV对猪体外老化卵子纺锤体和染色体形态的影响 |
| 4.3.4 MV对猪老化卵子线粒体含量和ATP的影响 |
| 4.3.5 MV对猪老化卵子线粒体膜电位的影响 |
| 4.3.6 MV对猪老化卵子早期凋亡的影响 |
| 4.3.7 MV通过上调SIRT1 的表达延缓猪卵子老化 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 MV对猪孤雌激活和体细胞核移植胚胎的影响 |
| 前言 |
| 5.1 试验材料 |
| 5.1.1 主要试剂 |
| 5.1.2 主要仪器设备 |
| 5.1.3 主要试验耗材 |
| 5.1.4 试验用卵巢 |
| 5.1.5 主要溶液配制 |
| 5.2 试验方法 |
| 5.2.1 卵丘卵母细胞复合体(COCs)的收集和体外成熟 |
| 5.2.2 MV浓度的选择和添加 |
| 5.2.3 孤雌激活胚胎制备 |
| 5.2.4 供体细胞的准备 |
| 5.2.5 体细胞核移植胚胎的制备 |
| 5.2.6 囊胚细胞数检查 |
| 5.2.7 囊胚细胞EdU染色 |
| 5.2.8 数据统计和分析 |
| 5.3 试验结果 |
| 5.3.1 MV对孤雌激活胚胎卵裂和囊胚形成的影响 |
| 5.3.2 MV对孤雌激活胚胎囊胚细胞数的影响 |
| 5.3.3 MV对孤雌激活胚胎囊胚细胞活性的影响 |
| 5.3.4 MV对体细胞核移植胚胎卵裂和囊胚形成的影响 |
| 5.4 分析和讨论 |
| 5.5 小结 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 附录 英文缩写-中文名称对照 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文目录 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 文献综述 |
| 第1章 卵子发生 |
| 1.1 卵原细胞增殖 |
| 1.2 卵母细胞的生长发育 |
| 1.3 卵母细胞的成熟 |
| 第2章 猪卵母细胞体外成熟 |
| 2.1 体外成熟培养基 |
| 2.2 影响体外成熟培养的其他因素 |
| 第3章 根皮苷研究进展 |
| 3.1 根皮苷和细胞葡萄糖转运 |
| 3.2 根皮苷的药理学 |
| 3.3 根皮苷毒理学 |
| 3.4 根皮苷与肾糖尿 |
| 3.5 根皮苷的未来用途 |
| 实验研究 |
| 第1章 根皮苷对猪卵母细胞体外成熟的影响 |
| 1.1 材料与试剂 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 根皮苷对猪卵母细胞成熟率及孤雌发育的影响 |
| 1.3.2 根皮苷对氧化应激基因,线粒体功能基因和卵母细胞质量相关基因表达的影响 |
| 1.3.3 根皮苷对 IVM 期间细胞内 ROS 和 GSH 水平的影响 |
| 1.3.4 根皮苷对囊胚细胞凋亡的影响 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第2章 根皮苷对猪早期胚胎体外培养的影响 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 3 结论 |
| 参考文献 |
| 导师介绍 |
| 作者介绍及攻读硕士期间发表论文 |
| 致谢 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| abstract |
| 缩写与符号清单 |
| 文献综述 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 生物材料 |
| 2.1.2 主要仪器和试验耗材 |
| 2.1.3 试剂耗材 |
| 2.1.4 主要试剂配制 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 卵母细胞体外成熟 |
| 2.2.2 孤雌激活 |
| 2.2.3 总RNA的提取 |
| 2.2.4 总RNA的反转录 |
| 2.2.5 实时荧光定量PCR |
| 2.2.6 间接免疫荧光染色 |
| 2.2.7 荧光定量分析 |
| 2.2.8 蛋白质免疫印迹(Western blotting,WB) |
| 2.3 试验设计 |
| 2.4 数据统计分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 猪卵母细胞成熟期间卵丘细胞和卵母细胞中SIRT6的表达 |
| 3.2 SIRT6抑制剂处理对猪卵母细胞成熟及早期胚胎发育的影响 |
| 3.3 SIRT6抑制剂处理对猪卵母细胞组蛋白乙酰化水平的影响 |
| 3.4 不同来源SIRT6对猪卵母细胞减数分裂重新启动和成熟的影响 |
| 3.5 SIRT6抑制剂处理对猪卵母细胞成熟期间纺锤体和染色体形态的影响 |
| 3.6 SIRT6抑制剂处理对卵丘细胞和卵母细胞中基因表达及酶活性的影响 |
| 3.7 腺苷酸环化酶抑制剂处理对SIRT6抑制剂诱导的猪卵母细胞成熟损伤挽救的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简介 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 猪卵母细胞 |
| 1.1.1 猪卵母细胞体外成熟 |
| 1.1.2 猪卵母细胞细胞骨架 |
| 1.2 热应激 |
| 1.2.1 热应激综述 |
| 1.2.2 热休克蛋白 |
| 1.3 褪黑素 |
| 1.3.1 褪黑素的生物合成与代谢 |
| 1.3.2 褪黑素的生物学功能 |
| 1.3.3 褪黑素在繁殖性能上的研究 |
| 1.4 猪卵丘细胞与卵母细胞的连接方式 |
| 1.5 研究的目的与意义 |
| 1.6 技术路线 |
| 第2章 褪黑素缓解猪卵母细胞热应激损伤的机理研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 试验材料 |
| 2.2.2 试验仪器及耗材 |
| 2.2.3 主要试剂及溶液的配制 |
| 2.2.4 试验方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 褪黑素对热应激后猪卵母细胞成熟的影响 |
| 2.3.2 褪黑素对热应激后猪卵母细胞内ROS水平的影响 |
| 2.3.3 褪黑素对热应激后猪卵母细胞线粒体分布的影响 |
| 2.3.4 褪黑素对热应激后猪卵母细胞活性的影响 |
| 2.3.5 褪黑素对热应激后猪卵母细胞4h、18h、42hα-tubulin的影响 |
| 2.3.6 褪黑素对热应激后猪卵母细胞4h、18h、42h F-actin的影响 |
| 2.3.7 褪黑素对热应激后猪卵母细胞皮质颗粒的影响 |
| 2.3.8 褪黑素对热应激后猪卵母细胞相关基因表达的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 褪黑素对热应激后猪卵母细胞成熟的影响 |
| 2.4.2 褪黑素对热应激后猪卵母细胞内ROS水平的影响 |
| 2.4.3 褪黑素对热应激后猪卵母细胞线粒体分布的影响 |
| 2.4.4 褪黑素对热应激后猪卵母细胞活性的影响 |
| 2.4.5 褪黑素对热应激后猪卵母细胞4h、18h、42hα-tubulin的影响 |
| 2.4.6 褪黑素对热应激后猪卵母细胞4h、18h、42h F-actin的影响 |
| 2.4.7 褪黑素对热应激后猪卵母细胞皮质颗粒的影响 |
| 2.4.8 褪黑素对热应激后猪卵母细胞相关基因表达的影响 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 褪黑素对热应激后的卵丘细胞的影响 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 试验材料 |
| 3.2.2 主要仪器设备与耗材 |
| 3.2.3 主要试剂及溶液的配制 |
| 3.2.4 试验方法 |
| 3.2.5 数据统计分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 褪黑素对热应激后卵丘细胞扩展的影响 |
| 3.3.2 褪黑素对热应激后卵丘细胞扩展相关基因表达的影响 |
| 3.3.3 褪黑素对热应激后卵丘细胞CAT基因表达的影响 |
| 3.3.4 褪黑素对热应激后卵丘细胞雌激素受体基因表达的影响 |
| 3.3.5 褪黑素对热应激后卵丘细胞凋亡基因表达的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 褪黑素对热应激后卵丘细胞扩展的影响 |
| 3.4.2 褪黑素对热应激后卵丘细胞扩展相关基因表达的影响 |
| 3.4.3 褪黑素对热应激后卵丘细胞CAT基因表达的影响 |
| 3.4.4 褪黑素对热应激后卵丘细胞雌激素受体基因表达的影响 |
| 3.4.5 褪黑素对热应激后卵丘细胞凋亡基因表达的影响 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 褪黑素对热应激后胚胎发育的影响 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 试验材料 |
| 4.2.2 主要仪器设备与耗材 |
| 4.2.3 主要试剂及溶液的配制 |
| 4.2.4 试验方法 |
| 4.2.5 数据统计分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 褪黑素对热应激后孤雌胚胎发育的影响 |
| 4.3.2 褪黑素对热应激后孤雌胚胎囊胚总细胞数的影响 |
| 4.3.3 褪黑素对热应激后孤雌胚胎囊胚凋亡相关基因表达的影响 |
| 4.3.4 褪黑素对热应激后克隆胚胎发育的影响 |
| 4.3.5 褪黑素对热应激后克隆胚胎囊胚总细胞数的影响 |
| 4.3.6 褪黑素对热应激后克隆胚胎凋亡相关基因表达的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 褪黑素对热应激后孤雌胚胎发育的影响 |
| 4.4.2 褪黑素对热应激后孤雌胚胎囊胚总细胞数的影响 |
| 4.4.3 褪黑素对热应激后孤雌胚胎囊胚凋亡相关基因表达的影响 |
| 4.4.4 褪黑素对热应激后克隆胚胎发育的影响 |
| 4.4.5 褪黑素对热应激后克隆胚胎囊胚总细胞数的影响 |
| 4.4.6 褪黑素对热应激后克隆胚胎凋亡相关基因表达的影响 |
| 4.5 小结 |
| 全文结论 |
| 创新点 |
| 下一步计划 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文和参加科研情况 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 附录 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 颗粒细胞和卵母细胞在哺乳动物卵泡闭锁和激素分泌中的作用 |
| 1.1.1 哺乳动物卵巢的基本结构和功能 |
| 1.1.2 卵泡发育的基本过程 |
| 1.1.3 卵泡发育的调控途径 |
| 1.1.4 颗粒细胞在卵泡发育中的作用 |
| 1.1.5 卵母细胞的发育以及在卵泡发育中的作用 |
| 1.1.6 颗粒细胞与卵母细胞的互作 |
| 1.2 Wnt-Ca~(2+)信号通路对卵泡发育的影响 |
| 1.2.1 Wnt通路概述以及Wnt-Ca~(2+)通路的组成 |
| 1.2.2 Wnt-Ca~(2+)通路在哺乳动物生理病理活动中的调节作用 |
| 1.2.3 Wnt-Ca~(2+)与Wnt典型通路的互作 |
| 1.2.4 Wnt-Ca~(2+)与其它信号通路的关系 |
| 1.3 研究目的和意义 |
| 第二章 Wnt/PLC/Ca~(2+)信号变化对猪颗粒细胞活力和卵母细胞成熟的调控 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 试验材料 |
| 2.2.1 主要试剂 |
| 2.2.2 主要试验仪器 |
| 2.2.3 试验动物来源 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.3.1 猪卵巢的采集 |
| 2.3.2 猪颗粒细胞和卵母细胞的培养 |
| 2.3.3 猪颗粒细胞的鉴定 |
| 2.3.4 CCK8法测定颗粒细胞活力 |
| 2.3.5 卵母细胞成熟的判定 |
| 2.3.6 孤雌激活和早期胚胎培养 |
| 2.3.7 早期胚胎发育的评定 |
| 2.3.8 统计学数据分析 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 猪颗粒细胞的鉴定 |
| 2.4.2 不同浓度IWP-2对猪颗粒细胞活力的影响 |
| 2.4.3 不同浓度抑制剂U73122对颗粒细胞活力的影响 |
| 2.4.4 不同浓度激活剂m-3M3FBS对颗粒细胞活力的影响 |
| 2.4.5 不同浓度IWP-2对猪卵母细胞第一极体排出率的影响 |
| 2.4.6 不同浓度抑制剂U73122 或激活剂m-3M3FBS对卵母细胞成熟的影响. |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 IWP-2对Wnt/PLC/Ca~(2+)通路的抑制、对凋亡的促进及其对颗粒细胞激素的调控 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 试验材料 |
| 3.2.1 主要试剂 |
| 3.2.2 主要试验仪器 |
| 3.3 试验方法 |
| 3.3.1 猪卵巢的采集以及猪颗粒细胞和卵母细胞的培养 |
| 3.3.2 猪颗粒细胞和卵母细胞钙离子浓度的测定 |
| 3.3.3 猪颗粒细胞RNA提取和反转录 |
| 3.3.4 实时荧光定量PCR检测凋亡相关基因和激素调控基因的表达水平 |
| 3.3.5 Western Blot法检测凋亡相关蛋白和PLC四种亚基蛋白表达水平 |
| 3.3.6 统计学数据分析 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 IWP-2对猪颗粒细胞和卵母细胞中Ca~(2+)浓度的影响 |
| 3.4.2 IWP-2对猪颗粒细胞和卵母细胞凋亡的影响 |
| 3.4.3 IWP-2对颗粒细胞雌二醇和孕酮调控基因的影响 |
| 3.4.4 IWP-2 对猪颗粒细胞和卵母细胞PLC四种亚基基因和蛋白表达的影响. |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 PLC蛋白对猪卵泡发育过程中细胞凋亡、激素分泌和Wnt/Ca~(2+)信号通路的影响 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 试验材料 |
| 4.2.1 主要试剂 |
| 4.2.2 主要试验仪器 |
| 4.3 试验方法 |
| 4.3.1 猪卵巢的采集以及颗粒细胞和卵母细胞的培养 |
| 4.3.2 颗粒细胞和卵母细胞的总RNA提取和反转录 |
| 4.3.3 实时荧光定量PCR检测凋亡、激素和Wnt/Ca~(2+)通路若干基因的表达 |
| 4.3.4 Western Blot法检测凋亡和Wnt/Ca~(2+)通路相关蛋白的表达 |
| 4.3.5 Annexin V-FITC法检测猪颗粒细胞凋亡 |
| 4.3.6 酶联免疫法(ELISA法)测定猪雌二醇和孕酮的含量 |
| 4.3.7 猪颗粒细胞和卵母细胞钙离子浓度测定 |
| 4.3.8 统计学数据分析 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 PLC蛋白对猪颗粒细胞和卵母细胞凋亡的调控 |
| 4.4.2 PLC蛋白对猪颗粒细胞雌二醇和孕酮分泌的调控 |
| 4.4.3 PLC蛋白对猪颗粒细胞和卵母细胞Wnt/Ca~(2+)信号中PLC四个亚基、Ca~(2+)浓度、三个钙离子敏感蛋白和若干下游基因的调控 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第五章 IWP-2与U73122或m-3M3FBS互作对猪卵泡Ca~(2+)的调节以及对颗粒细胞凋亡和激素的调节作用 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 试验材料 |
| 5.2.1 主要试剂 |
| 5.2.2 主要试验仪器 |
| 5.3 试验方法 |
| 5.3.1 猪卵巢的采集以及颗粒细胞和卵母细胞的培养 |
| 5.3.2 猪颗粒细胞和卵母细胞钙离子浓度检测 |
| 5.3.3 颗粒细胞总RNA提取和反转录 |
| 5.3.4 实时荧光定量PCR检测颗粒细胞凋亡和激素调控基因相对表达 |
| 5.3.5 统计学数据分析 |
| 5.4 结果与分析 |
| 5.4.1 IWP-2与U73122或m-3M3FBS相互作用对猪颗粒细胞和卵母细胞Ca~(2+)浓度的影响 |
| 5.4.2 IWP-2与U73122或m-3M3FBS相互作用对颗粒细胞凋亡调控基因的影响 |
| 5.4.3 IWP-2与U73122或m-3M3FBS相互作用对颗粒细胞激素调控基因的影响 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 小结 |
| 第六章 Enzastaurin或 Enzastaurin与 U73122 互作对猪颗粒细胞激素和凋亡的调节作用 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 试验材料 |
| 6.2.1 主要试剂 |
| 6.2.2 主要试验仪器 |
| 6.3 试验方法 |
| 6.3.1 猪卵巢的采集以及颗粒细胞的培养 |
| 6.3.2 猪颗粒细胞总RNA提取和反转录 |
| 6.3.3 实时荧光定量PCR检测猪颗粒细胞凋亡和激素调控基因相对表达 |
| 6.3.4 Western Blot法检测猪颗粒细胞PKC蛋白表达的影响 |
| 6.4 结果与分析 |
| 6.4.1 Enzastaurin对猪颗粒细胞活力的影响 |
| 6.4.2 Enzastaurin以及Enzastaurin与 U73122 互作对猪颗粒细胞凋亡相关基因和蛋白表达的影响 |
| 6.4.3 Enzastaurin以及Enzastaurin与 U73122 互作对猪颗粒细胞雌二醇和孕酮激素相关基因表达的影响 |
| 6.4.4 Enzastaurin以及Enzastaurin与 U73122 互作对PKCβ蛋白表达的影响 |
| 6.5 讨论 |
| 6.6 小结 |
| 第七章 结论与创新点 |
| 7.1 结论 |
| 7.2 创新点 |
| 下一步研究工作 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文对照表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 卵母细胞体外成熟的研究进展 |
| 1.1 卵母细胞的成熟过程 |
| 1.2 卵母细胞体外成熟的影响因素 |
| 2 表观遗传修饰对卵母细胞成熟的影响 |
| 2.1 表观遗传修饰概述 |
| 2.2 组蛋白修饰对卵母细胞成熟的影响 |
| 研究目的与意义 |
| 第二章 调控H3K9me3对猪卵母细胞体外成熟和早期胚胎发育的影响 |
| 前言 |
| 1 试验材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.3 实验设计 |
| 1.4 结果统计与分析 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 毛壳素处理对猪卵母细胞体外成熟和早期胚胎发育的影响 |
| 2.2 毛壳素处理不同时间对猪卵母细胞体外成熟和早期胚胎发育的影响 |
| 2.3 毛壳素处理对猪卵母细胞和早期胚胎中组蛋白H3K9me3表达的影响 |
| 2.4 毛壳素处理对猪卵母细胞和早期胚胎中重要基因表达的影响 |
| 3 讨论与分析 |
| 小结 |
| 第三章 调控H3K4me3对猪卵母细胞体外成熟和早期胚胎发育的影响 |
| 前言 |
| 1 试验材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.3 实验设计 |
| 1.4 统计与分析 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 CPI-455处理对猪卵母细胞体外成熟及早期胚胎发育的影响 |
| 2.2 不同时间段采用CPI-455处理对猪卵母细胞体外成熟和早期胚胎发育的影响 |
| 2.3 CPI-455处理对猪卵母细胞和早期胚胎中组蛋白H3K4me3表达的影响 |
| 2.4 CPI-455处理对猪卵母细胞和早期胚胎中重要基因表达的影响 |
| 2.5 毛壳素和CPI-455联合处理对卵母细胞体外成熟和早期胚胎发育的影响 |
| 3 讨论与分析 |
| 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 硕士期间发表论文情况 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语 |
| 引言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 猪卵母细胞的成熟及其调控研究进展 |
| 1 卵母细胞成熟的生物学过程 |
| 2 卵母细胞成熟的影响因素 |
| 3 卵母细胞成熟的分子调控 |
| 4 热应激对猪卵母细胞成熟的影响及其机制 |
| 第二章 卵母细胞与卵丘细胞的互作研究进展 |
| 1 卵丘细胞在卵母细胞生长发育中的作用 |
| 2 卵母细胞对卵丘细胞的调节 |
| 3 卵丘-卵母细胞互作的结构基础 |
| 4 热应激对猪卵丘-卵母细胞互作的影响及其机制 |
| 第三章 TZPs和F-actin结构的形成及其调控研究进展 |
| 1 TZPS结构的形成和调节 |
| 2 F-actin结构的形成和调节 |
| 3 热应激对F-actin形成的影响及其机制 |
| 第二篇 试验研究 |
| 第四章 不同热应激模型对猪卵母细胞质量的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 第五章 热应激对猪卵母细胞和卵丘细胞互作的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 第六章 热应激对猪卵丘-卵母细胞间通讯结构的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 第七章 热应激降低猪卵母细胞质量的缓解措施 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 总体讨论 |
| 全文结论 |
| 本文创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间发表论文情况 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 卵母细胞成熟、激活与胚胎培养 |
| 1.1 卵母细胞成熟 |
| 1.2 卵母细胞激活 |
| 1.3 早期胚胎发育 |
| 2 卵胞质注射转基因 |
| 2.1 卵胞质注射研究进展 |
| 2.2 卵胞质注射转基因机理 |
| 2.3 卵胞质注射影响因素 |
| 3 单精子胞质内注射转基因 |
| 3.1 精子载体法 |
| 3.2 单精子胞质内注射 |
| 4 本论文的研究意义 |
| 第二章 猪卵母细胞体外成熟与胚胎培养影响因素研究 |
| 摘要 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料与试剂 |
| 1.2 仪器与设备 |
| 1.3 试剂配制 |
| 1.4 试验方法 |
| 1.5 试验设计 |
| 1.6 数据统计分析 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 猪卵母细胞体外成熟影响因素研究 |
| 2.2 猪胚胎培养影响因素研究 |
| 3 分析与讨论 |
| 3.1 猪卵母细胞体外成熟影响因素研究 |
| 3.2 猪胚胎培养影响因素研究 |
| 4 结论 |
| 第三章 猪卵母细胞孤雌激活方法研究 |
| 摘要 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料与试剂 |
| 1.2 仪器与设备 |
| 1.3 试剂配制 |
| 1.4 试验方法 |
| 1.5 试验设计 |
| 1.6 数据统计分析 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 猪卵母细胞化学激活方法的初步研究 |
| 2.2 猪卵母细胞电激活方法的初步研究 |
| 2.3 猪卵母细胞电激活联合化学激活方法的初步研究 |
| 3 分析与讨论 |
| 3.1 猪卵母细胞化学激活方法的初步研究 |
| 3.2 猪卵母细胞电激活方法的初步研究 |
| 3.3 猪卵母细胞电激活联合化学激活方法的初步研究 |
| 4 结论 |
| 第四章 猪卵胞质注射转基因影响因素研究 |
| 摘要 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料与试剂 |
| 1.2 仪器与设备 |
| 1.3 试剂配制 |
| 1.4 试验方法 |
| 1.5 试验设计 |
| 1.6 数据统计分析 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 孤雌激活和IVF方法的完善 |
| 2.2 孤雌卵胞质注射转基因方法的初步研究 |
| 2.3 受精卵胞质注射转基因方法的初步研究 |
| 3 分析与讨论 |
| 3.1 孤雌激活和IVF方法的完善 |
| 3.2 孤雌卵胞质注射转基因方法的初步研究 |
| 3.3 受精卵胞质注射转基因方法的初步研究 |
| 4 结论 |
| 第五章 猪单精子胞质内注射转基因影响因素研究 |
| 摘要 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料与试剂 |
| 1.2 仪器与设备 |
| 1.3 试剂配制 |
| 1.4 试验方法 |
| 1.5 试验设计 |
| 1.6 数据统计分析 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 不同激活方法对猪ICSI胚胎发育的影响 |
| 2.2 不同外源基因浓度对猪ICSI胚胎发育能力及转基因效率的影响 |
| 2.3 精子与外源基因孵育时间对猪ICSI胚胎发育能力及转基因效率的影响 |
| 2.4 不同精子冷冻液和孵育液对猪ICSI胚胎发育能力及转基因效率的影响 |
| 2.5 不同精子处理方法和激活方法对猪ICSI胚胎发育能力及转基因效率的影响 |
| 2.6 激活后精子注射时间对猪ICSI胚胎发育能力及转基因效率的影响 |
| 2.7 激活后精子注射时间对不同发育时间合子内谷胱甘肽含量的影响 |
| 2.8 激活后精子注射时间对猪ICSI胚胎原核形成的影响 |
| 2.9 不同外源基因载体对ICSI胚胎发育能力及转基因效率的影响 |
| 2.10 单精子卵胞质注射胚胎的体内发育 |
| 3 分析与讨论 |
| 3.1 不同激活方法对猪ICSI胚胎发育的影响 |
| 3.2 不同外源基因浓度对猪ICSI胚胎发育能力及转基因效率的影响 |
| 3.3 精子与外源基因孵育时间对猪ICSI胚胎发育能力及转基因效率的影响 |
| 3.4 不同精子冷冻液和孵育液对猪ICSI胚胎发育能力及转基因效率的影响 |
| 3.5 精子处理和激活对猪ICSI胚胎发育能力及转基因效率的影响 |
| 3.6 激活后精子注射时间对猪ICSI胚胎发育能力及转基因效率的影响 |
| 3.7 不同外源基因载体对ICSI胚胎发育能力及转基因效率的影响 |
| 3.8 单精子卵胞质注射胚胎的体内发育 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 文献综述 |
| 第一章 猪卵母细胞体外成熟的研究 |
| 1.1 猪卵母细胞体外成熟 |
| 1.2 猪卵母细胞体外成熟机制 |
| 1.2.1 卵母细胞的发生及其减数分裂的恢复 |
| 1.2.2 卵母细胞成熟过程中的调控机制 |
| 1.3 影响猪卵母细胞体外成熟的因素 |
| 1.3.1 猪的品种、年龄及健康状态 |
| 1.3.2 卵巢的离体时间及保存温度 |
| 1.3.3 卵巢质量及卵泡的大小 |
| 1.3.4 卵丘细胞与卵母细胞IVM 的关系 |
| 1.3.5 卵母细胞的采集方法 |
| 1.3.6 猪卵母细胞IVM 的基础培养液 |
| 1.3.7 猪卵母细胞体外成熟液中的添加物 |
| 1.3.8 卵母细胞体外成熟的培养环境 |
| 1.3.9 卵母细胞体外成熟的培养时间 |
| 1.4 猪卵母细胞体外成熟存在的问题 |
| 1.5 提高猪卵母细胞体外成熟效率的意义 |
| 第二章 猪卵母细胞核成熟抑制剂的研究 |
| 2.1 卵母细胞体外成熟常用的抑制剂种类 |
| 2.2 卵母细胞核成熟抑制剂的作用机理 |
| 2.2.1 蛋白合成抑制剂 |
| 2.2.2 cAMP 相关抑制剂 |
| 2.2.3 蛋白激酶磷酸化抑制剂 |
| 2.2.4 生理性抑制剂 |
| 2.3 抑制剂对卵母细胞成熟的影响 |
| 2.3.1 抑制剂对卵母细胞减数分裂恢复的影响 |
| 2.3.2 抑制剂对卵丘细胞扩散的影响 |
| 2.4 添加抑制剂的意义 |
| 2.5 抑制剂使用存在的问题 |
| 试验研究 |
| 第三章 猪卵母细胞体外成熟培养体系的优化 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 试验设计 |
| 3.2.1 不同培养基对猪卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎发育的影响 |
| 3.2.2 PFF 对猪卵母细胞体外成熟及胚胎发育的影响 |
| 3.2.3 BSA 浓度对猪卵母细胞体外成熟及胚胎发育的影响 |
| 3.2.4 不同培养方法对猪卵母细胞体外成熟的影响 |
| 3.2.5 不同胚胎培养液对孤雌胚胎发育的影响 |
| 3.2.6 数据处理 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 不同培养基对猪卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎发育的影响 |
| 3.3.2 PFF 对猪卵母细胞体外成熟及胚胎发育的影响 |
| 3.3.3 BSA 浓度对猪卵母细胞体外成熟及胚胎发育的影响 |
| 3.3.4 不同培养方法对猪卵母细胞体外成熟的影响 |
| 3.3.5 不同胚胎培养液对孤雌胚胎发育的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 丁内酯-I 对卵母细胞成熟及胚胎发育能力的影响 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 试验设计 |
| 4.2.1 BL-I 浓度对卵母细胞核成熟的抑制作用 |
| 4.2.2 不同浓度的BL-I 抑制后卵母细胞核成熟的恢复情况 |
| 4.2.3 20μmol/L 处理BL-I~+/20h+BL-I~-/24h 对卵母细胞成熟的影响 |
| 4.2.4 经20h+24h 处理后成熟卵母细胞孤雌激活发育能力 |
| 4.2.5 经20h+24h 处理后成熟卵母细胞NT 胚胎的发育能力 |
| 4.2.6 数据处理 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 BL-I 浓度对卵母细胞核成熟的抑制作用 |
| 4.3.2 不同浓度的BL-I 抑制后卵母细胞核成熟的恢复情况 |
| 4.3.3 20μmol/L 处理BL-I~+/20h+BL-I~-/24h 对卵母细胞成熟的影响 |
| 4.3.4 经20h~++24h~-处理后成熟卵母细胞孤雌激活发育能力 |
| 4.3.5 经20h~++24h~-处理后成熟卵母细胞NT 胚胎的发育能力 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
