再灌注心肌损伤的表现和机制

一、再灌注心肌损伤的表现及机制(英文)（论文文献综述）

张雯雯^[1]（2021）在《益气搜风中药对心肌缺血再灌注损伤大鼠内皮功能影响与机制的研究》文中认为目的:缺血再灌注损伤可见于心、脑、肺、肾等人体多个重要器官,探究其病理机制,最大程度降低损伤,提高临床疗效越来越成为医学界的研究热点。缺血心肌再灌注（MIRI）后无复流、慢复流致使心律失常甚至再梗死等并发症严重影响血运重建治疗的临床预后,其机制涉及冠脉微循环病变。西医治疗方案尚缺乏安全有效防治冠脉微循环障碍的药物,特别是血运重建后期治疗方面,中医药能够发挥未病先防、既病防变的特色优势,临床疗效明显,较西药治疗费用更低。目前国内关于中药单体及复方防治MIRI的研究虽有一定进展,但缺乏对多靶点作用机制的深入探究。宫丽鸿教授以“风扰心络为病”理论为基础,提出益气搜风、养血解痉、通络止痛之治法,总结自身多年临床经验结合前人古方,形成益气搜风中药组方黄芪复方,寓意补养心络亏虚之气血、搜剔内扰之毒风,以助心脉气血调和、脉道息风通络,改善心肌细胞因缺血缺氧形成的组织结构与功能损伤。此法以补为通,寓通于补,通补兼施,相辅相成,补气而不留邪,剔邪而不伤正,针对本虚标实的病理特点,可谓标本兼治。本研究通过冠脉结扎法复制建立心肌缺血再灌注损伤大鼠模型,以模型大鼠为研究对象,观察益气搜风中药黄芪复方对实验大鼠内皮功能影响与炎症反应、细胞凋亡相关因子蛋白与基因的表达,从对血管内皮功能的保护作用角度,探讨益气搜风中药对缺血再灌注损伤中微循环障碍的影响,并进一步揭示其产生作用可能相关的机制途径,丰富风扰心络为病之理论内涵,并为临床推广应用提供实验依据。材料与方法:1.心肌缺血再灌注损伤模型建立与益气搜风中药对模型大鼠内皮功能影响:将120只（240±20）g SD大鼠随机分为假手术组、模型组、培哚普利组、益气搜风中药黄芪复方低中高剂量组,共6组,每组20只。根据成人（按体重60kg计算）常用剂量与实验动物用药剂量换算公式,折算出大鼠剂量,每组给予不同预处理。假手术组、模型组大鼠均予生理盐水10 mL·kg-1灌胃;益气搜风中药低、中、高剂量组分别予含黄芪复方1.8g·kg-1、3.6 g·kg-1、7.2 g·kg-1药液灌胃;培哚普利组予以含有培哚普利浓度为0.4mg·kg-1溶液灌胃。上述操作各组日1次,持续7d。第7d灌胃完毕1h采用冠脉结扎法建立心肌缺血再灌注模型;其中假手术组术中不结扎冠脉,余操作同其它各组;分别记录结扎30 min时与再灌注120 min时大鼠ECG情况;选取Ⅱ导联为实验中主要观察目标,以ST段变化作为心肌缺血标志;以ST段显着抬高判定结扎成功,以抬高的ST段回落幅度达1/2判定再灌注造模成功。造模成功后进行取材,取材前夜（即第6d）大鼠禁食不禁水。取腹主动脉取血,静置后离心,上清液-20℃保存,用于后续实验;采血后即刻处死大鼠,无菌条件下取出心脏,经灭菌生理盐水清洗以10%甲醛固定,-20℃冻存用于后续实验。采用ELISA法检测各组血清中TXA2、PGI2、s TM、s EPCR的含量,比较各组TXA2/PGI2比值。2.益气搜风中药对心肌缺血再灌注损伤模型大鼠血管内皮炎症因子的影响:取已采集的各组大鼠血清,采用ELISA法检测各组血清中IL-8、IL-6、TNF-α含量。3.益气搜风中药对心肌缺血再灌注损伤模型大鼠血管内皮细胞凋亡的影响:取已采集的各组大鼠心脏组织,电子天平称取左心室心尖部位100mg,高通量组织研磨仪研磨组织,研磨好的心肌组织置于预先配制好的500ul裂解液,以12000 rpm速度离心10 min后取上清液,经处理后采用Western Blot法测定各组Akt、P-Akt、Bax、Bcl-2蛋白表达水平,采用蛋白质定量（BCA）法测定蛋白浓度,采用ECL化学发光检测法检测,实验结果通过成像系统显示;采用RT-PCR法测定Aktm RNA、eNOS m RNA、Baxm RNA、Bcl-2 m RNA表达水平,采用引物设计软件Primer Premier 5.0设计引物,采用2-ΔΔct法对各样品中基因的表达差异进行相对定量分析。统计学处理均采用SPSS 26.0统计软件进行数据分析,Graphpad Prism 9.0.0版统计软件绘制数据分析图,计量资料以（?）表示,组间比较采用单因素方差分析,两两比较方差齐采用LSD检验。P<0.05表示存在统计学差异,P<0.01表示差异显着,P>0.05为差异不具有统计学意义。结果:1.心肌缺血再灌注损伤模型建立与益气搜风中药对模型大鼠内皮功能影响:1.1复制大鼠心肌缺血再灌注损伤模型:模型建立过程中各组大鼠存活情况:麻醉操作后,死亡1只大鼠;气管插管与术中行结扎、再灌注等操作时,因呼吸停止、大出血和室颤共造成37只大鼠死亡,其中假手术组5只、其他造模组32只。各组存活大鼠数量满足后续实验需求。造模情况:经心电图监测观察结扎时与再灌注后大鼠Ⅱ导联心电变化,筛除未符合ST段改变标准大鼠8只,成功造模总数59只,各组造模成功大鼠数量满足指标检测需求。1.2各组大鼠血清TXA2、PGI2水平及TXA2/PGI2比值:相较假手术组,模型组TXA2水平显着升高,PGI2水平显着降低,TXA2/PGI2明显升高（P<0.01）;相较模型组,培哚普利组和益气搜风中药黄芪复方各剂量组TXA2含量均显着降低,PGI2含量显着升高,TXA2/PGI2显着下降（P<0.01）;相较于培哚普利组,益气搜风中药中剂量组TXA2、PGI2含量与TXA2/PGI2均无明显差异（P>0.05）。1.3各组大鼠血清s TM、s EPCR水平:相较于假手术组,模型组s TM、s EPCR含量显着升高（P<0.01）;相较于模型组,培哚普利组和益气搜风中药各剂量组s TM、s EPCR含量均显着降低（P<0.01）;相较于培哚普利组,中药各剂量组s TM、s EPCR含量升高（P<0.05）。2.益气搜风中药对心肌缺血再灌注损伤模型大鼠血管内皮炎症因子的影响:2.1各组大鼠血清IL-6、IL-8水平:相较假手术组,模型组IL-6、IL-8含量显着升高（P<0.01）;相较模型组,培哚普利组和中药各剂量组IL-6、IL-8含量均显着降低（P<0.01）;相较于培哚普利组,中药中剂量组IL-6、IL-8含量无明显差异（P>0.05）。2.2各组大鼠血清TNF-a水平:相较假手术组,模型组TNF-a含量显着升高（P<0.01）;相较于模型组,培哚普利组和中药各剂量组TNF-a含量均显着降低（P<0.01）;相较于培哚普利组,中剂量组TNF-a含量无明显差异（P>0.05）。3.益气搜风中药对心肌缺血再灌注损伤模型大鼠血管内皮细胞凋亡的影响:3.1各组大鼠Akt、eNOS m RNA的表达:相较假手术组,模型组Akt m RNA、eNOS m RNA表达显着降低（P<0.01）;相较模型组,培哚普利组与益气搜风中药各剂量组Akt mRNA、eNOS m RNA表达均增加（P<0.05）;相较于培哚普利组,益气搜风中药中剂量组Akt mRNA、eNOS mRNA表达无明显差异（P>0.05）。3.2各组大鼠Akt、P-Akt蛋白表达与P-Akt/Akt 比值:相较假手术组,模型组Akt、P-Akt蛋白表达显着降低（P<0.01）;相较模型组,培哚普利组、益气搜风中药各剂量组Akt、P-Akt蛋白表达显着增加（P<0.01）;相较于培哚普利组,益气搜风中药中剂量组Akt蛋白表达、P-Akt/Akt 比值无明显差异（P>0.05）,高剂量组P-Akt蛋白表达无明显差异（P>0.05）。3.3各组大鼠Bcl-2、Bax mRNA的表达:相较假手术组,模型组Bcl-2 mRNA、Bax mRNA表达均升高（P<0.05）;相较模型组,培哚普利组与益气搜风中药各组Bcl-2mRNA表达均升高,Bax mRNA表达降低（P<0.05）;与培哚普利组相比,益气搜风中药中剂量组Bcl-2 mRNA、Bax mRNA表达无明显差异（P>0.05）。3.4各组大鼠Bcl-2、Bax蛋白表达与Bcl-2/Bax比值:相较假手术组,模型组Bcl-2、Bax蛋白表达均显着升高,Bcl-2/Bax比值显着降低（P<0.01）;相较模型组,培哚普利组、益气搜风中药中剂量组Bcl-2蛋白表达与Bcl-2/Bax比值均显着升高,Bax蛋白表达显着降低（P<0.01）;相较于培哚普利组,益气搜风中药中剂量组Bcl-2蛋白表达无明显差异（P>0.05）。结论:1.益气搜风中药黄芪复方能够调控血管内皮功能损伤因子的表达,提示益气搜风中药复方对MIRI大鼠血管内皮功能可能具有保护作用。2.益气搜风中药复方能够下调大鼠IL-8、IL-6、TNF-α等炎症因子的表达,提示益气搜风中药复方对MIRI大鼠心肌的保护作用可能与抑制炎性反应有关。3.益气搜风中药复方能够上调PI3K/Akt信号通路中关键靶蛋白Akt及其下游eNOS mRNA表达水平;干预Akt及P-Akt蛋白表达水平,调控P-Akt/Akt平衡;同时调控凋亡因子Bcl-2、Bax基因与蛋白的表达。提示益气搜风中药复方改善MIRI血管内皮功能的机制可能与激活PI3K/Akt信号通路活性从而调控细胞凋亡有关。

张刘洋^[2]（2020）在《心肌缺血再灌注损伤过程中的类二十烷酸代谢组学研究》文中研究表明研究目的急性心肌梗死（Acute myocardial infarction,AMI）是冠心病分属中最为严重的类型,该病被认知为危害人类健康的头号杀手之一。对于ST段抬高心肌梗死（STsegment elevation myocardial infarction,STEMI）需紧急恢复血流供应,挽救缺血心肌。经皮冠状动脉介入治疗（Percutaneous coronary intervention,PCI）是针对STEMI患者的首选策略,能改善急性STEMI患者的远期生存率。然而,目前仍存在诸多与PCI相关的临床问题需要被解决,其中心肌缺血再灌注损伤（Myocardial ischemiareperfusion injury,MIRI）是最重要的临床问题之一。类二十烷酸代谢产物是由花生四烯酸等多不饱和脂肪酸在环氧酶、脂氧酶和细胞色素P450三大代谢通路的作用下生成的几百种活性脂质分子的总称。这类代谢产物中的很多分子与心血管疾病中涉及到的生物学过程有关,在诸如炎症、血栓形成、动脉粥样硬化、心肌肥厚、心律失常、心力衰竭等过程中发挥危害或保护性作用。然而,目前大部分类二十烷酸代谢产物在心肌缺血再灌注损伤过程中发挥的作用与分子机制尚不清楚,对于PCI手术前后病人的类二十烷酸的整体代谢模式改变情况也尚未阐明。本工作的目的是利用类二十烷酸代谢组学在小鼠心肌缺血再灌注损伤模型与STEMI患者血浆样本中阐述心肌缺血再灌注过程中类二十烷酸代谢谱的整体变化规律;发现与心肌缺血再灌注损伤相关的关键代谢产物;并在细胞模型中研究关键代谢产物的功能与机制。研究方法利用小鼠经冠脉结扎/再通手术建立的心肌缺血再灌注损伤模型,超声心动、Evans blue-TTC双染色检测验证动物模型成功建立;收取STEMI患者PCI手术前后7个时间点（手术前30分钟、手术后6小时、手术后12小时、手术后24小时、手术后72小时、出院前1天、出院后28天）的血浆样本,并充分记录患者的临床信息（包括人口学特征、生命特征、既往疾病史、院前用药、心脏超声、心梗面积、CKMB、c Tn I等心脏损伤标志物水平等）。利用基于液相色谱-三重四极杆质谱联用技术的靶向代谢组学方法分析小鼠MIRI模型心脏组织及STEMI患者血浆的类二十烷酸代谢谱（包括环氧酶、脂氧酶、细胞色素P450氧化酶通路下的84种代谢产物）。通过由Mann-Whitney U检验、ANOVA方差分析、偏最小二乘判别分析等统计学方法所组成的筛选原则,筛选与心肌缺血再灌注损伤相关的关键代谢产物。建立缺氧复氧过程诱导大鼠乳鼠原代心肌细胞I/R模型（缺氧12小时,常氧条件6小时）,在此模型中研究关键代谢产物对心肌细胞凋亡的影响。研究结果在小鼠心脏组织中共检测到类二十烷酸代谢产物68种。偏最小二乘-判别分析显示小鼠经冠脉结扎/再通手术建立的IR模型与对照组相比,类二十烷酸代谢谱发生明显的改变,其中15-羟基二十碳四烯酸（15-HETE,I/R组升高）对代谢组的整体差异贡献最大;经Mann-Whitney U检验筛选到7种具有显着性变化的代谢产物,其中16-羟基二十碳四烯酸（16-HETE）在I/R组降低至低于检测限),12-羟基二十碳四烯酸（12-HETE）在I/R组升高约2.08倍（p=0.011）,15-HETE在I/R组升高约2.11倍（p=0.014）,18-羟基二十碳四烯酸（18-HETE）降低约70%（p=0.001）,血栓烷素B2（TXB2）升高约1.46倍（p=0.048）。对20位STEMI患者在7个时间点收集到的共计140个血浆样本进行类二十烷酸代谢组学分析,共检测到类二十烷酸代谢产物68种。偏最小二乘-判别分析显示STEMI患者接受PCI手术前后类二十烷酸代谢谱发生明显变化,其中6-k-前列腺素F1α（6-k-PGF1α）对代谢组的整体差异贡献最大;通过对代谢产物时程曲线的聚类分析发现,不同代谢产物的时程曲线展现出不同的变化特征;其中缺血再灌注早期阶段（6小时）造成16-HETE水平的升高（ANOVA p=0.006）;中期阶段（1272小时）造成二羟基二十碳三烯酸（DHET）类代谢产物的升高（ANOVA p<0.05）以及TXB2、脂氧素A4（LXA4）的降低（ANOVA p=0.005）;后期阶段（72小时之后）造成6-kPGF1α（ANOVA p=2.71E-08）和白三烯B4（LTB4）（ANOVA p=0.0004）的升高;此外前列腺素D2和E2（PGD2、PGE2）在整个过程中持续性降低。研究结论经Mann–Whitney U检验和PLS-DA多元统计所得数据的综合考量,结合类二十烷酸代谢产物的已知功能,我们认为包括12-HETE、15-HETE、16-HETE、18-HETE、TXB2在内的5种花生四烯酸代谢产物在小鼠的心肌缺血再灌注损伤过程中具有重要的病理生理学意义;经过对ANOVA分析、Mann-Whitney U检验、以及PLA-DA多元统计所得数据的综合考量,并结合类二十烷酸代谢产物的已知功能,我们认为包括6-k-PGF1α、TXB2、PGD2、PGE2、LXA4、LTB4、16-HETE、20-HETE、5,6-DHET在内的9种类二十烷酸代谢产物在STMEI患者的缺血再灌注损伤过程中具有重要的病理生理学意义。对小鼠心肌缺血再灌注损伤模型与STEMI患者关键类二十烷酸代谢产物的比较显示:TXB2和16-HETE可能在动物模型与STEMI患者中均发挥重要作用。本研究利用代谢组学系统性地研究类二十烷酸代谢谱在心肌缺血再灌注损伤中的整体变化规律,全面理解心肌缺血再灌注损伤过程中类二十烷酸系统的整体特点,完整勾勒出多种类二十烷酸分子之间在心肌缺血再灌注损伤过程中水平变化的总体脉络,针对类二十烷酸在心肌缺血再灌注损伤过程中的改变提出了对类二十烷酸具有针对性的干预策略。

肖燕^[3]（2020）在《基于mTORC1-ULK1-FUNDC1通路的电针预处理减轻MIRI的线粒体自噬机制研究》文中提出目的:1、比较不同电流强度电针预处理（EAP）对心肌缺血再灌注损伤（MIRI）的影响,并明确其效应差异,探索EAP抗MIRI的相对适宜电流强度。2、探索mTORC1在EAP抗MIRI保护效应中与线粒体自噬的相关性。3、探索EAP调控MIRI大鼠线粒体自噬的mTORC1-ULK1-FUNDC1信号机制。方法:1、将120只SPF级成年雄性SD大鼠随机分为8组:模型组（I/R组）、模型+非电针对照组（I/R+SEA组）、模型+0.2mA电流强度电针预处理4d组（I/R+0.2mA组）、模型+1mA电流强度电针预处理4d组（I/R+1mA组）、模型+2mA电流强度电针预处理4d组（I/R+2mA组）、模型+4mA电流强度电针预处理4d组（I/R+4mA组）、模型+6mA电流强度电针预处理4d组（I/R+6mA组）、模型+8mA电流强度电针预处理4d组（I/R+8mA组）,每组各15只。各电针预处理组分别于MIRI手术前4天（d）干预,选择大鼠双侧“内关”穴（PC6）进行电针（2/100Hz）,20min/次,1次/d。I/R+SEA组每天进行与其他组相同方式、时间的异氟烷吸入麻醉但不电针。各组均于第5d结扎心脏冠状动脉左前降支（LAD）30min,再灌注4h,建立心肌缺血再灌注损伤模型,期间进行心电图（ECG）监测。每天监测大鼠体重变化,再灌注4h后,统计室性心律失常评分（VAS）情况,并对各组大鼠生存情况进行生存曲线分析;采用Evans blue-TTC双染法染色切片,计算心肌梗死面积比（Infarct size,IS%）、风险面积比（Risk size）;利用酶联免疫吸附法（ELISA）检测血清肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、乳酸脱氢酶（LDH）、肌钙蛋白T（cTnT）的浓度。2、在探索了电针预处理抗MIRI的相对适宜电流强度基础上,进行实验二和实验三。实验二将140只SPF级成年雄性SD大鼠,随机分为5组,分别为:假手术组（S组）,除不结扎LAD,余与模型组操作相同;假手术+电针预处理组（S+EA组）,除不结扎LAD,余与模型+电针预处理组操作相同;模型组（I/R组）,同“方法1”中的造模方法;模型+非电针预处理组（I/R+SEA组）,在大鼠两侧PC6皮肤表面贴上与电针同样大小的自制的竹制签子20min/次/d,连续4d,第5天造模;模型+电针预处理组（I/R+EA组）,每天电针1次（2mA,2/100Hz,20min）,连续4d,第5天造模。每组各28只。实验三将196只SPF级成年雄性SD大鼠,随机分为7组,分别为:I/R组,同上;I/R+EA组,同上;空白对照组（B组）,未做干预处理;模型+阴性对照预处理组（I/R+C组）,腹腔注射与抑制剂组等量的助溶剂,1次/d,连续4d,并于第5天造模;模型+阴性对照+电针预处理组（I/R+C+EA组）,每天电针1次、腹腔注射与抑制剂组等量的助溶剂1次,连续4d,第5天造模;模型+mTORC1抑制剂（雷帕霉素,Rapamycin）预处理组（I/R+R组）,腹腔注射雷帕霉素,每天1次,3.0mg/kg,连续3d,并于最后1次注射24h后造模;模型+mTORC1抑制剂+电针预处理组（I/R+R+EA组）,每天电针1次,连续4d;电针第2天,同时开始给予腹腔注射雷帕霉素,每天1次,连续3d,于最后1次注射24h后造模。每组各28只。每天监测大鼠体重变化,并在实验结束后对各组大鼠生存情况进行生存曲线分析;采用ECG检测心脏ST段变化,并对缺血期的前20min和再灌注期的前20min及220-240min进行VAS统计;Evans blue-TTC双染色法观察心肌梗塞面积情况,计算IS%与Risk size;ELISA法测定血清心肌酶谱CK-MB、LDH、cTnT的水平;采用末端脱氧核苷酰转移酶介导的DUTP缺口末端标记法（TUNEL）检测心肌细胞凋亡,评价心肌细胞存活情况,全面充分评价心脏功能情况。在充分明确EAP对MIRI保护效应的基础上,采用透射电镜观察自噬囊泡（即自噬小体）水平;免疫荧光染色法检测线粒体、溶酶体及两者结合情况,评价EAP抗MIRI效应与线粒体自噬的相关性。采用蛋白免疫印迹（WB）、免疫组化法（IHC）分别检测心肌组织线粒体中LC3-I（mito-LC3-I）与LC3-Ⅱ（mito-LC3-Ⅱ）、心肌中mTORC1、ATG13、ULK1、p-ULK1、FUNDC1、p-FUNDC1等物质的分布和表达水平;采用大鼠能量（ATP）ELISA试剂盒检测左心室心肌组织中线粒体的ATP产生情况,整体分析EAP通过mTORC1-ULK1-FUNDC1信号通路调控线粒体自噬从而减轻MIRI的可能潜在机制。结果一:不同电流强度EAP对MIRI的效应差异1、不同电流强度EAP对各组大鼠体重及MIRI术后生存曲线的影响各组大鼠体重变化表明,EAP电流强度为0.2mA、1mA与2mA时,EAP的大鼠体重呈正常增长趋势,而电流强度为4mA、6mA、8mA时大鼠体重随着EAP电流强度的增大,体重出现不增反减的趋势;对生存曲线的分析结果显示,与I/R组比,EAP各组的存活率均升高,但0.2mA、1mA与2mA时的大鼠术后存活率高于4mA、6mA与8mA组。2、不同电流强度EAP抗MIRI的效应研究大鼠VAS、心脏Evans blue-TTC双染色及血清心肌酶谱结果表明,与I/R组比,不同电流强度EAP均可有效降低MIRI。VAS结果显示,EAP（仅I/R+2mA组）可有效降低室性心律失常评分VAS（P<0.05）。Evans blue-TTC染色结果显示,与I/R组比,EAP（I/R+0.2mA 组、I/R+1mA 组、I/R+2mA 组、I/R+4mA 组、I/R+6mA 组、I/R+8mA 组）可明显降低 IS%、Risk size（P<0.05）,其中 I/R+2mA 组的 IS%、Risk size 值最小（P<0.05）;而与 I/R+2mA 组相比,I/R+4mA 组、I/R+6mA 组、I/R+8mA 组的 IS%增加（P<0.05）,其中 I/R+6mA 组、I/R+8mA 组 IS%显着增加（P<0.01）。与 I/R+2mA 组相比,I/R+SEA 组、I/R+0.2mA 组、I/R+1mA 组、I/R+6mA 组、I/R+8mA 组心肌 Risk size 均增加（P<0.05）。血清心肌酶谱结果表明,与I/R组比,不同电流强度EAP均可有效降低血清CK（P<0.05）、CK-MB（P<0.05）、LDH（P<0.05）、cTnT（P<0.05）的水平。其中 I/R+2mA 组的心肌酶谱水平均最低,效应最佳。结果二:EAP调控MIRI大鼠线粒体自噬的效应研究1、EAP对各组大鼠体重及MIRI术后生存曲线的影响各组大鼠体重及术后生存曲线的结果表明,与I/R组比,EAP可促进大鼠体重稳步增长,并有效提高大鼠MIRI术后存活率。2、对 VAS、IS%及 Risk size 的影响结果显示,与I/R组比,EAP可有效降低VAS（P<0.05）、降低IS%（P<0.05）及Risk size（P<0.05）。3、EAP减少MIRI诱导的心肌损伤标志物和细胞凋亡结果显示,与I/R组比,I/R+EA组可降低血清CK-MB（P<0.05）、LDH（P<0.05）、cTnT（P<0.05）的水平,减少心肌细胞凋亡（P<0.05）,从而减轻MIRI,对心脏起到保护作用。4、EAP减弱MIRI诱导的线粒体自噬与S组相比,I/R和I/R+SEA组的自噬囊泡明显增加（P<0.01）。与I/R组相比,EAP（I/R+EA组）显着减少了再灌注240min后心肌组织自噬囊泡的数量（P<0.05）,即EAP可抑制线粒体与溶酶体的结合。5、EAP 调节 mTORC1、ULK1 和 FUNDC1 的表达采用WB、IHC检测心肌组织中的mTORC1、ULK1、FUNDC1蛋白表达,结果初步显示,EAP可促进mTORC1蛋白的表达,抑制线粒体自噬相关蛋白ULK1、FUNDC1的表达水平。结果三:EAP调控MIRI大鼠线粒体自噬的mTORC1-ULK1-FUNDC1信号机制研究1、雷帕霉素阻断了 EAP的心脏保护作用各组大鼠体重及术后生存曲线的结果表明,在应用雷帕霉素抑制mTORC1蛋白后,消除了 EAP促进MIRI大鼠体重稳步增长,并有效提高大鼠MIRI术后存活率这一保护作用。在应用雷帕霉素抑制mTORC1蛋白后,消除了 EAP对MIRI的保护效应:与I/R组比,I/R+R+EA组的VAS升高（P<0.05）、IS%（P<0.05）及Risk size（P<0.05）也升高、血清CK-MB（P<0.05）、LDH（P<0.05）、cTnT（P<0.05）的水平均升高,心肌细胞凋亡率也增加（P<0.05）。2、雷帕霉素减弱EAP抑制的线粒体自噬结果显示,在应用雷帕霉素抑制mTORC1蛋白后,消除了 EAP对MIRI线粒体自噬的抑制效应:I/R+R+EA组的自噬囊泡水平（P<0.05）升高,线粒体与溶酶体的结合（P<0.05）增加,表明线粒体自噬的水平增加,从而使MIRI加重。3、EAP通过mTORC1-ULK1-FUNDC1途径抑制线粒体自噬WB、IHC检测mTORC1-ULK1-FUNDC1信号通路中的相关蛋白:心肌组织mTORC1、ATG13、p-ULK1、ULK1、p-FUNDC1、FUNDC1 及心肌线粒体中 mito-LC3Ⅰ、mito-LC3Ⅱ,结果显示,EAP可促进mTORC1蛋白的表达,抑制线粒体自噬相关蛋白ATG13、p-ULK1、ULK1、p-FUNDC1、FUNDC1、mito-LC3Ⅱ/Ⅰ 的表达水平（全部,P<0.05）,但在应用雷帕霉素抑制mTORC1蛋白后,EAP的这些调节作用则受到抑制（P<0.05）。对ATP（三磷酸腺苷）检测水平的结果显示,心肌缺血再灌注损伤后FUNDC1蛋白诱导的线粒体自噬会通过过度消除线粒体而增加心肌细胞凋亡（P<0.05）,线粒体数量的绝对不足而导致ATP产生障碍。但在PC6上进行EAP可逆转这种情况:EAP可促进线粒体内ATP的产生（P<0.05）,防治MIRI。而应用雷帕霉素后,EAP的这一促进作用则受到抑制。结论:1、不同电流强度EAP“内关”穴4天均可有效抗MIRI,其中2mA电流强度的EAP保护效应最好。2、EAP“内关”穴减轻MIRI大鼠的心肌保护效应可能与其促进心肌组织mTORC1蛋白的表达,同时下调ULK1、FUNDC1蛋白的表达,从而抑制线粒体自噬的发生有关。说明mTORC1在EAP抗MIRI中可能起关键性的作用。3、雷帕霉素抑制mTORC1后消除了 EAP“内关”穴对MIRI大鼠的心肌保护效应,说明EAP对MIRI的心肌保护效应可能是通过mTORC1-ULK1-FUNDC1这一信号通路调控线粒体自噬,进而增加线粒体来源的ATP,改善MIRI后的能量供应来实现的。

邢小卫^[4]（2020）在《miR-26a-5p通过调控PTEN/PI3K/AKT信号通路对心肌缺血再灌注损伤的作用研究》文中研究表明研究背景心血管疾病是世界上无论是发展中国家还是发达国家中最常见的死亡原因之一,而这其中急性ST段抬高型心肌梗死（ST-segment elevation myocardial infarction,STEMI）首当其冲成为最为凶险、致死致残率最高的一类。虽然我国心血管疾病的预防和救治工作有了很大的改善,但急性心肌梗死的发病率及死亡率仍然在不断上升。再灌注治疗是STEMI患者最有效的治疗措施,可以向缺血区域提供及时有效的能量,从而减少梗死范围、维持心脏收缩功能。但是越来越多的基础和临床研究表明,缺血心肌在恢复血液再次灌注后会导致额外的心肌损伤,如心肌顿抑、心律失常、无复流、心肌坏死等的发生,这种现象称之为心肌缺血/再灌注损伤（myocardialischemia/reperfusion injury,MIRI）,MIRI 已成为影响再灌注治疗效果和STEMI患者预后的主要因素。既往研究MIRI的机制包括氧自由基学说、钙超载学说、心肌能量代谢障碍学说、细胞凋亡学说等;治疗策略包括非药物干预的方法如缺血预适应、缺血后适应和远程缺血预适应,药物干预方法包括腺苷、心房钠肽、环孢素A、极化液、胰高血糖素样肽-1等。虽然许多细胞实验、动物实验证实上述治疗措施有效,但转化成临床试验的结局确是令人失望的。单一的心脏保护策略对改善缺血再灌注损伤效果不佳,联合多种保护策略或者协同多靶点治疗却很有希望治疗缺血再灌注损伤,因此我们非常有必要进一步深入研究MIRI的分子机制,为我们探索新的诊断、治疗靶点提供依据。越来越多的证据表明缺血再灌注损伤的一种重要病理生理机制是细胞凋亡,细胞调亡是一个需要能量的过程,虽然冉灌注过程给缺血心肌提供赖以生存的氧气和能量,但同时也为细胞凋亡提供了能量。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase家族）在凋亡的执行阶段起主要作用,凋亡是多种Caspase共同完成的,Caspase-3被认为是各种凋亡刺激因子促进凋亡过程中的终末剪切酶,有研究表明Caspsase-3在缺血再灌注导致的心肌细胞凋亡过程中发挥重要作用。微小RNA（miRNA）是近年来发现的内源性非编码单链小分子RNA,通过结合靶mRNA的3’ UTR区从而降解靶mRNA或抑制其翻译,达到调控基因表达的目的。miRNA在各种细胞功能调控中具有重要作用,例如胚胎发育、细胞凋亡、细胞生长和分化以及肿瘤发生等。研究表明在心血管系统方面,miRNA与心肌梗死、心脏肥大、心肌重塑、心力衰竭和心律不齐等各种心脏病的发病机制有密切关系。miRNA具有细胞和组织特异性,有快速释放的动力学特点,在血清当中相对稳定存在,因此循环miRNA有望用于心血管疾病的早期诊断、危险分层、判断预后甚至治疗。目前miRNA研究颇多,一些研究表明miRNA在心肌细胞凋亡中发挥着重要的调控作用,但在心肌缺血再灌注损伤中的研究仍不成熟。miR-26a-5p作为新近发现的一种miRNA,在多种心血管疾病中存在差异表达。如有研究显示经过miR-26a-5p抑制剂转染的冠心病小鼠模型,分离出的内皮细胞生存力明显下降而凋亡率明显升高。另一项研究表明miR-26a-5p的过表达可以减轻冠状动脉微循环栓塞引起的无复流和心肌坏死。鉴于心肌缺血再灌注损伤与心肌细胞凋亡、冠脉微循环栓塞有着密切的关系,我们推测miR-26a-5p可能通过调节细胞凋亡参与心肌缺血再灌注损伤。目前,miR-26a-5p在心肌缺血再灌注损伤中的作用尚未见报道。我们通过心肌细胞缺氧/复氧模型、小鼠缺血再灌注模型分别在体外、体内模拟了心肌缺血再灌注损伤模型。然后,利用生物实验结合生物信息学方法来探索miR-26a-5p在心肌缺血再灌注损伤中的表达和调控作用,并进一步探讨miR-26a-5p影响缺血再灌注损伤可能的通路和机制,从而为更好的解释心肌缺血再灌注损伤的机制和提供可能的治疗策略奠定实验基础。第一章miR-26a-5p在缺氧/复氧心肌细胞中的表达及其调控作用目的关于心肌缺血再灌注损伤的分子机制仍未明确阐明,而关于miR-26a-5p在心肌缺血再灌注损伤当中的作用尚不清楚。第一章研究的目的是明确miR-26a-5p在细胞缺氧/复氧损伤中的表达水平,分析miR-26a-5p的过表达或抑制对缺血再灌注损伤程度的影响。方法1.生物信息学分析:从GEO数据库中搜索与心肌缺血再灌注相关的miRNAs的大数据,比较分析差异表达的miRNA。2.原代心肌细胞的分离和培养:取2日龄的C57BL/6乳鼠,消毒后开胸取心脏,分离出左心室后剪碎并胰酶消化,应用差速贴壁离心方法纯化心肌细胞,加入DMEM培养基,在37℃培养箱中培养。3.细胞转染:miR-26a-5p模拟物、miR-26a-5p抑制剂及相应对照物利用Lipofectamine█ RNAiMAX Reagent转染至原代心肌细胞中。4.建立心肌细胞缺氧/复氧模型:心肌细胞培养液置换为不含血清、不含糖的DMEM培养基,放置在37℃含5%C02、95%N2的低氧培养箱中缺氧培养4小时,之后置换上含糖、FBS的DMEM培养基并放置在37℃含95%空气和5%C02的培养箱中继续培养心肌细胞2小时,自此,缺氧/复氧（H/R）模型成功建立。5.细胞实验分组5.1实验一分组:1.对照组（Control group）;2.缺氧/复氧组（H/R group）。5.2 实验二分组:1.miRNA control+H/R 组;2.miR-26a-5p mimic+H/R组;3.inhibitor control+H/R 组;4.miR-26a-5p inhibitor+H/R 组。6.MTT法检测心肌细胞活力:各组心肌细胞培养孔中加入MTT、二甲基亚砜后测定心肌细胞存活率。7.流式细胞学技术测定细胞实验中心肌细胞凋亡率。8.实时萤光定量PCR检测各组心肌细胞中miR-26a-5p含量。9.Western Blot实验检测促凋亡蛋白cleaved caspase-3的表达。结果1.GEO网站为https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/,识别出心肌缺血再灌注相关的miRNAs生物芯片数据,与正常组织对比,做差异分析。发现miR-26a-5p在心肌缺血再灌注组织中表达下调,差异明显（P=0.0004）。2.流式细胞学技术来检测H/R心肌细胞的凋亡率是12.65%,对照组心肌细胞凋亡率为0.71%,差异明显。Western Blot技术检测结果显示H/R心肌细胞中凋亡蛋白cleaved caspase-3的表达量明显高于对照组（P=0.0003）。3.qRT-PCR检测结果显示H/R心肌细胞中miR-26a-5p的含量明显低于对照组（P=0.0003）。4.转染miR-26a-5pmimic后心肌细胞中miR-26a-5p的水平明显升高;而转染 miR-26a-5pinhibitor 后心肌细胞中 miR-26a-5p 含量明显降低（P<0.0001）。MTT检测结果显示与对照组相比,过表达miR-26a-5p显着增加了心肌细胞在缺氧/复氧后的细胞活力;miR-26a-5p表达受抑制后显着降低心肌细胞在缺氧/复氧后的细胞活力（P<0.01）。5.流式细胞学技术检测结果显示:过表达miR-26a-5p组H/R心肌细胞凋亡率显着低于对照组,miR-26a-5p mimic组的细胞凋亡率为7.54%,mimic control组的细胞凋亡率为20.86%,差异明显;受抑制miR-26a-5p组H/R心肌细胞凋亡率显着高于对照组,miR-26a-5p inhibitor组的细胞凋亡率为35.89%,inhibitor control组的细胞凋亡率为23.25%,差异明显。Western Blot结果显示:过表达miR-26a-5p组H/R心肌细胞中cleaved caspase-3的含量显着低于对照组;受抑制miR-26a-5p组H/R心肌细胞中cleaved caspase-3的含量显着高于对照组（P<0.001）。结论及意义1.与正常对照组相比,miR-26a-5p在缺氧/复氧细胞中的表达明显下降;心肌细胞凋亡率明显升高。2.在缺氧/复氧心肌细胞模型中,miR-26a-5p的过表达可以通过降低心肌细胞凋亡率来减轻心肌缺血再灌注损伤;而miR-26a-5p低表达可以通过增加心肌细胞凋亡来加重心肌缺血再灌注损伤。3.我们的研究结果可能有助于发现心肌缺血再灌注损伤中发生、进展的新机制,有助于开发心肌缺血再灌注损伤新的早期诊断生物标志物或新的治疗手段。第二章miR-26a-5p调控PTEN/PI3K/AKT通路改善心肌缺血再灌注损伤目的miRNA是一类内源性非编码的单链小分子RNA,它通过结合靶基因mRNA的3’非翻译区,降解靶基因或抑制其翻译。miRNA具有功能多样性的特点,研究miRNA的靶基因功能较为复杂,近些年随着TargetScan、miRBase等大型miRNA分析数据库的发展,方便了科学家进行miRNA靶基因预测。我们在第一章的研究结果表明,miR-26a-5p在心肌缺血再灌注细胞中表达下调,且过表达miR-26a-5p可以减轻心肌缺血再灌注损伤,但具体机制尚不明确。本章目的是对miR-26a-5p的靶基因进行预测,研究miR-26a-5p调控心肌缺血再灌注损伤可能的通路机制并进一步验证。方法1.生物信息学分析:利用Targetscan数据库对miR-26a-5p的靶基因进行预测（http://www.targetscan.org/vert72）。2.利用双萤光素酶报告基因检测验证miR-26a-5p与PTEN的3’UTR是否存在互补结合关系。我们构建PTEN野生型和突变型的双萤光报告载体pMIR-REPORTTM-PTEN-WT和pMIR-REPORTTM-PTEN-Mut,分别与 miR-26a-5p 模拟物（miR-26a-5pmimcs）以及阴性对照共同转染心肌细胞,观察各组萤光素酶活性的变化,从而验证PTEN是否是miR-26a-5p的靶基因。3.细胞培养、转染miRNA以及模拟缺氧/复氧模型（H/R）:同第一章。4.细胞实验分组:4.1实验一分组:萤光素酶报告基因检测1.转染 pMIR-REPORTTM-PTEN-WT+miR-26a-5p mimics 组。2.转染 pMIR-REPORTTM-PTEN-WT+miRNA control 组。3.转染 pMIR-REPORTTM-PTEN-Mut+miR-26a-5p mimics 组。4.转染 pMIR-REPORTTM-PTEN-Mut+miRNA control 组4.2实验二分组:1.对照组（Control group）;2.缺氧/复氧组（H/R group）。4.3 实验三分组:1.miRNA control+H/R 组;2.miR-26a-5p mimic+H/R组;3.inhibitor control+H/R 组;4.miR-26a-5p inhibitor+H/R 组。5.qRT-PCR技术检测PTEN基因含量;Western Blot技术检测PTEN/PI3K/AKT蛋白表达量,方法类同第一章。结果1.Targetscan 预测 PTEN 是 miR-26a-5p 的靶基因。2.双萤光素酶报告实验显示与对照组相比,转染了野生型PTEN-3’UTR和miR-26a-5pmimics的萤光素酶活性显着降低（P=0.0003）;而共转染突变型PTEN-3’ UTR和miR-26a-5p mimics组与对照组相比萤光素酶活性无显着性差异（P>0.9999）。结果表明miR-26a-5p可直接与PTEN的3’ UTR作用。3.qRT-PCR检测H/R心肌细胞中PTEN基因含量,结果显示H/R组PTEN基因含量明显高于正常对照组（P=0.0038）。Western Blot检测H/R心肌细胞中PTEN蛋白表达含量,结果显示H/R组PTEN蛋白表达含量明显高于对照组（P=0.0001）。4.通过心肌细胞转染,分别构建过表达miR-26a-5p组、敲低miR-26a-5p组以及相应对照组,Western Blot检测显示过表达miR-26a-5p显着下调了 PTEN的蛋白表达水平,同时显着提高了 PI3K和AKT的表达水平;相反的,敲低miR-26a-5p显着上调了 PTEN的蛋白表达水平,同时显着降低了 PI3K和AKT的表达水平（P<0.001）。结论及意义1.在心肌缺血再灌注过程中,PTEN是miR-26a-5p的靶基因。2.过表达miR-26a-5p可以通过与PTEN的3’UTR结合而负性调控PTEN蛋白表达,PTEN受抑制后反向激活PI3K/AKT通路,达到抗心肌细胞凋亡目的,从而改善心肌缺血再灌注损伤。3.通过研究miR-26a-5p具体调控机制有助于我们更深入的理解缺血再灌注损伤的机制,有助于开发心肌缺血再灌注损伤新的药物或非药物治疗手段。第三章miR-26a-5p在缺血再灌注小鼠心肌组织中的表达及其调控机制目的在之前的研究中,我们通过体外实验建立心肌细胞缺氧/复氧（H/R）模型,发现H/R组心肌细胞凋亡率增高,miR-26a-5p在H/R组心肌细胞中表达下降,过表达miR-26a-5p减轻了心肌细胞缺血再灌注损伤。同时发现PTEN是miR-26a-5p的靶基因,miR-26a-5p通过PTEN/PI3K/AKT通路改善心肌缺血再灌注损伤。在这一章中,在小鼠体内心脏实验中,我们进一步验证miR-26a-5p对心肌缺血再灌注损伤是否会有相同的影响。方法1.缺血再灌注损伤小鼠模型的建立:C57BL/6小鼠麻醉后取仰卧位,气管插管后连接动物呼吸机,小鼠四肢通过电极连接到心电图仪。碘伏消毒胸前区后,第三和第四肋间行开胸手术。在左冠状动脉前降支距离左心耳下缘1-2mm处对冠状动脉左前降支进行结扎,发现明显的ST段抬高时表示结扎成功,阻断血流后30分钟,缝合线被释放,冠状动脉重新恢复血流,小鼠心肌缺血再灌注模型建立成功。在假手术组中,缝线只穿过小鼠的心脏,不进行结扎。2.小鼠心肌转染:构建腺相关病毒AAV9-miRNA载体,8周龄C57BL/6小鼠随机分组后,通过尾静脉注射AAV9-miRNA-26a-5p或AAV9-control构建转染模型。3.动物实验分组3.1实验一分组:1.假手术组（Shamgroup）;2.缺血再灌注损伤组（I/R group）。3.2 实验二分组:1.miRNA control+I/R 组;2.miR-26a-5pmimic+I/R组;3.inhibitor control+I/R 组;4.miR-26a-5p inhibitor+I/R 组。4.TTC-Evans blue双染法检测各组小鼠心肌梗死面积。5.流式细胞学技术测定动物实验中各组小鼠心肌细胞凋亡率。6.实时萤光定量PCR检测各组小鼠心肌组织中miR-26a-5p、PTEN含量。7.Western Blot 实验检测 cleaved caspase-3、PTEN、PI3K、AKT 的表达。结果1.Evans blue/TTC染色观察I/R组小鼠的心肌梗死面积大于对照组（P=0.0058）。流式细胞学技术显示I/R组小鼠心肌组织中心肌细胞凋亡率明显高于对照组,I/R组小鼠心肌细胞的凋亡率是40.24%,对照组心肌细胞凋亡率为8.83%,差异明显。Wesetern Blot检测显示I/R组小鼠心肌cleaved caspase-3蛋白含量明显高于对照组（P=0.0015）。2.qRT-PCR方法检测结果显示I/R组小鼠心肌细胞中miR-26a-5p的表达量显着低于正常对照组（P<0.0001）。3.qRT-PCR的方法检测各组转染小鼠心肌中miR-26a-5p的表达,结果显示转染miR-26a-5p mimic小鼠心肌中miR-26a-5p的水平明显升高;而转染miR-26a-5p inhibitor 小鼠心肌中 miR-26a-5p 含量明显降低（P<0.01）。Evans blue/TTC染色观察发现过表达miR-26a-5p显着减少了小鼠心肌I/R后梗死面积,受抑制miR-26a-5p组小鼠心肌I/R后梗死面积显着大于对照组（P<0.05）。4.qRT-PCR检测发现I/R组小鼠心肌PTEN基因含量明显高于正常对照组（P=0.0080）。Western Blot检测结果显示I/R组心肌组织中PTEN蛋白表达含量明显高于对照组（P<0.0001）。5.Western Blot检测显示在小鼠I/R损伤模型中,与对照组相比,过表达miR-26a-5p显着下调了 PTEN的蛋白表达水平,同时显着提高了 PI3K和AKT的蛋白表达水平;相反的,抑制miR-26a-5p组显着上调了 PTEN的蛋白表达水平,同时显着降低了 PI3K和AKT的蛋白表达水平,组间差异具有统计学意义（P<0.001）。结论及意义1.与正常对照相比,缺血再灌注小鼠模型中,心肌细胞凋亡和cleaved caspase-3表达量升高,缺血再灌注组织中miR-26a-5p的表达明显下降;miR-26a-5p的过表达减轻了心肌缺血再灌注损伤;而miR-26a-5p低表达可以增加心肌凋亡来加重心肌缺血再灌注损伤。2.体内实验进一步验证了缺血再灌注组织中PTEN基因及蛋白表达量明显升高,PTEN 是 miR-26a-5p 的靶基因;miR-26a-5p 可以通过 PTEN/PI3K/AKT 通路调控心肌缺血再灌注损伤。3.我们体内实验的研究结果进一步验证miR-26a-5p对心肌缺血再灌注损伤的调控作用和机制,为开发心肌缺血再灌注损伤新的早期诊断生物标志物或新的治疗手段提供实验基础。

刘岩松^[5]（2020）在《基于SIRT1信号通路探讨舒心生脉丹对MI/RI模型大鼠的保护作用和机制》文中研究表明目的:院内制剂舒心生脉丹,是三十多年临床经验总结得出的经验方,在治疗冠心病为代表的心血管疾病方面疗效确切。为进一步探讨其作用机制,本课题通过病理学、分子生物学等分析方法,探索其对心肌细胞的保护机制,探讨其与细胞凋亡相关性,运用实验数据评价舒心生脉丹的疗效,为舒心生脉丹新药研发提供数据支持,为中医治疗心血管疾病的临床药物应用以及疾病治疗提供有价值的理论依据。方法:1.将70只健康SPF级SD雌性大鼠随机分成7组:空白组、假手术组、阳性对照组（复方丹参滴丸）、模型组、舒心生脉丹低剂量组、舒心生脉丹中剂量组、舒心生脉丹高剂量组。2.中药预处理:适应性饲养5天后,分组给药。给药剂量:根据动物与人之间药物等效剂量换算系数表计算,舒心生脉丹中剂量组为健康成年人1日用量,舒心生脉丹高剂量组与舒心生脉丹低剂量组分别为2倍剂量与0.5倍剂量,对照组复方丹参滴丸按照健康成年人1日用量给药。预给药7天,每日给药1次,空白组、假手术组、模型组给予蒸馏水。7天后禁食进行造模,空白组不做处理,假手术组只进行穿线,不予结扎。其余各组行左冠状动脉前降支结扎30min,再灌注120min,制备心肌缺血再灌注损伤大鼠模型。造模成功取心脏组织。3.监测并记录缺血/再灌注过程中心电图、血流动力学的改变,分析舒心生脉丹对MI/RI模型大鼠心功能的影响。4.通过HE染色和透射电镜观察MI/RI大鼠心肌组织及超微结构,分析舒心生脉丹对MI/RI模型大鼠心肌组织及超微结构的干预效果。5.分别采用qRT-PCR法、Western blot法、IHC法检测中药舒心生脉丹对SIRT1信号通路相关因子SIRT1、p53、ac-p53、Bax、Bcl-2、Capase-3、Capase-9的mRNA及蛋白的表达量影响。分析舒心生脉丹对MI/RI大鼠心肌组织SIRT1/p53信号通路上相关因子的调控。结果:1.心电图:各组大鼠在造模成功后心电图均有明显ST段改变,肢体导联出现ST段抬高,并有出现T波倒置改变;再灌注30min后各组大鼠心电图提示ST段不同程度回落改变,提示MI/RI大鼠造模成功。2.血流动力学:与模型组相比,舒心生脉丹各剂量治疗组及阳性对照组大鼠血流动力学指标均有不同程度的改善,舒心生脉丹组改善更为明显。3.HE染色:MI/RI模型组大鼠心肌组织结构欠完整,形态排列紊乱,细胞间质水肿明显,细胞核出现固缩。与模型组相比,中药舒心生脉丹各治疗组结构相对完整,形态排列较规则,层次较清晰,细胞间质水肿程度较模型组减轻,细胞核固缩减少。其中舒心生脉丹高剂量组改善最明显。4.电镜观察:模型组肌纤维排列不整齐,线粒体肿胀,排列呈不规则形态,部分线粒体嵴不完整,出现空泡。中药舒心生脉丹各剂量治疗组及阳性药组线粒体可见轻度肿胀变形,多数结构完整,肌纤维排列大致整齐,程度较模型组减轻。5.qRT-PCR法检测MI/RI大鼠心肌组织中SIRT1、Bcl-2、Bax、Caspase-9的基因表达量:与模型组相比,舒心生脉丹能上调SIRT1、Bcl-2的基因表达量,差异具有统计学意义（P<0.05）,降低Bax、Caspase-9基因表达量,差异具有统计学意义（P<0.05）。Western blot法检测MI/RI大鼠心肌组织中SIRT1、Caspase-9、p53、ac-p53的蛋白表达量:与模型组相比,舒心生脉丹能够上调MI/RI模型大鼠心肌细胞中SIRT1的蛋白表达量,差异具有统计学意义（P<0.05）,下调Caspase-9、p53、ac-p53的蛋白表达量,差异具有统计学意义（P<0.05）。IHC检测提示舒心生脉丹能够上调SIRT1的蛋白表达,降低p53、Caspase-3、Caspase-9的蛋白表达。结论:1.舒心生脉丹对能改善大鼠MI/RI后的心功能和心肌超微结构,对心肌细胞具有保护作用。2.舒心生脉丹能调控MI/RI模型大鼠心肌细胞中SIRT1、p53、ac-p53、Bax、Bcl-2、Capase-3、Capase-9的mRNA及蛋白的表达量,减少细胞凋亡的发生,其保护作用与细胞凋亡机制相关。

彭科^[6]（2020）在《右美托咪定调控HIF-1α信号通路减轻心肌缺血再灌注损伤的分子机制研究》文中提出第一部分 右美托咪定后处理减轻原代乳鼠心肌细胞的缺氧复氧损伤目的:探讨右美托咪定（dexmedetomidine,DEX）后处理对原代乳鼠心肌细胞缺氧复氧（hypoxia/reoxygenation,H/R）过程中心肌细胞损伤的影响。方法:（1）新生乳鼠原代心肌细胞的提取和培养。选取新生48小时内的Sprague Dawley（SD）大鼠提取和原代培养心肌细胞,并运用免疫荧光染色法鉴定心肌细胞的纯度。（2）不同浓度的右美托咪定对正常培养的原代心肌细胞的影响。将原代心肌细胞随机分为5组（每组n=6）:对照组,0.1、1、10、50μM不同浓度的右美托咪定处理24小时组。与对照组相比,观察不同浓度的右美托咪定对正常状态下培养的心肌细胞是否存在细胞毒性。（3）不同缺氧复氧时间对原代心肌细胞活力的影响。将原代心肌细胞随机分为7组（每组n=6）:对照组和6个H/R组。H/R组通过氧糖剥夺（oxygen glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R）建立细胞 H/R 模型,分别于缺氧 3、6、12 小时+复氧3小时（H3R3、H6R3、H12R3组）以及缺氧6小时+复氧6、12、24小时（H6R6、H6R12、H6R24组）的不同缺氧复氧时间点使用cell counting kit-8（CCK-8）试剂盒检测心肌细胞活力,确定本实验条件下细胞缺氧复氧模型的作用时间点。（4）不同浓度右美托咪定后处理对原代心肌细胞H/R损伤后细胞活力和细胞毒性的影响。将原代心肌细胞随机分为5组（每组n=6）:对照组、H/R组,3个右美托咪定处理组。处理组中分别给予0.1、1、10μM不同浓度的右美托咪定后处理（即在复氧开始时加入到细胞培养基）,使用CCK-8和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）试剂盒检测心肌细胞活力和细胞毒性,以确定本实验中最佳的右美托咪定后处理浓度。（5）右美托咪定后处理对原代心肌细胞H/R损伤时细胞凋亡的影响。将原代心肌细胞随机分为3组（每组n=6）:对照组、H/R组、H/R+DEX组。在复氧开始时给予1 μM的右美托咪定后处理,复氧结束后采用Annexin V-FITC/PI双染法和流式细胞技术检测心肌细胞的凋亡率。（6）右美托咪定后处理对原代心肌细胞H/R损伤时缺氧诱导因子-1α（hypoxiainducible factor-1α,HIF-1α）、凋亡相关基因 B 淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2,BCL-2）和BCL2样蛋白X（BCL2-Associated X,BAX）蛋白表达水平影响。将原代心肌细胞随机分为3组（每组n=6）:对照组、H/R组、H/R+DEX组。使用Western Blot检测各组HIF-1α、BCL-2、BAX蛋白水平的表达。（7）右美托咪定后处理对原代心肌细胞H/R损伤时HIF-1α和BAX在细胞内的定位的影响。将原代心肌细胞随机分为3组（每组n=6）:对照组、H/R组、H/R+DEX组。使用双标免疫荧光法检测各组心肌细胞内HIF-1α和BAX蛋白在细胞中的定位情况和表达水平。以上各组数据以均值±标准误表示,使用GraphPad 7软件进行统计学分析处理。结果:（1）乳鼠原代心肌细胞正常培养至72小时,经免疫荧光染色鉴定其心肌细胞纯度达98%,可稳定供以下实验使用。（2）0.1、1、1 0 μM的右美托咪定对于正常培养的心肌细胞活力均无显着影响,而高浓度的右美托咪定（50μM）则使得细胞活力降低至对照组的82.42±2.39%（P<0.01）,说明右美托咪定大于50μM的浓度时会对原代心肌细胞产生一定的细胞毒性。（3）心肌细胞的活力在H3R3、H6R3、H12R3、H6R6、H6R12、H6R24的各个不同时间点和对照组细胞相比均明显下降（P<0.01）,选取缺氧6小时复氧3小时用于后续的细胞实验（此时细胞活力下降至对照组的63.21±1.74%）。（4）与H/R组相比,使用0.1、1、10μM的右美托咪定后处理显着改善H/R损伤后的心肌细胞活力,减少LDH释放量（P<0.01）。其中浓度为1 μM的右美托咪定后处理效果最好,细胞活力与H/R组相比为75.21±2.23%vs.60.00±1.11%（P<0.01）,培养基中 LDH 释放量与 H/R 组相比为 200.8±7.37%vs.267.5 ± 5.57%（P<0.01）。因此,选取1μM的右美托咪定用于后续的细胞实验。（5）流式细胞凋亡率检测结果显示,与对照组相比,缺氧复氧过程显着增高原代心肌细胞的凋亡率至38.60±0.90%（P<0.01）,而使用1 μM右美托咪定后处理可以使H/R损伤后的心肌细胞凋亡率降低至20.94±0.96%（P<0.01）。（6）Western Blot结果显示,H/R组细胞HIF-1α和BAX的蛋白表达水平显着升高（P<0.01）,而BCL-2蛋白表达和BCL-2/BAX的比值显着降低（P<0.01）。右美托咪定后处理显着降低了 HIF-1α和BAX蛋白的表达水平（P<0.01）,并且翻转了 BCL-2蛋白表达（P<0.05）以及BCL-2/BAX的比值（P<0.01）。（7）双标免疫荧光实验结果显示,HIF-1α与BAX蛋白的表达在原代心肌细胞内存在共定位关系。在H/R组中,HIF-1α和BAX的荧光表达强度较对照组显着升高（P<0.01）,右美托咪定后处理显着降低了H/R损伤时HIF-1α和BAX的荧光表达水平（P<0.01）。结论:1 μM右美托咪定后处理可以显着减轻乳鼠原代心肌细胞缺氧复氧损伤,具体表现为改善H/R损伤导致的细胞活力下降、减轻细胞毒性、抑制LDH释放量、以及降低细胞凋亡率。右美托咪定后处理在细胞水平上减轻缺氧复氧损伤的保护作用很可能与其抑制HIF-1α蛋白的表达,调节凋亡相关蛋白的水平,从而抑制H/R损伤导致的心肌细胞凋亡有关。第二部分 右美托咪定后处理通过在转录后水平抑制HIF-1α信号减轻缺氧复氧过程中心肌细胞凋亡的分子机制目的:进一步探讨右美托咪定后处理是否通过调控HIF-1α的转录活性、抑制细胞凋亡、从而减轻缺氧复氧导致的心肌细胞损伤及其分子机制。方法:（1）HIF-1α 脯氨酰羟化酶 2（prolyl hydroxylase-2,PHD2）抑制剂 IOX2 对原代心肌细胞常氧和H/R状态下HIF-Iα和凋亡相关蛋白表达的影响。将原代心肌细胞随机分为4组（每组n=6）:对照组、对照+IOX2组、H/R组、H/R+IOX2组。IOX2是一种特异性的HIF-1α PHD2抑制剂,可通过抑制HIF-1α的降解从而增强其转录活性。IOX2的使用浓度为50μM,在复氧开始时使用右美托咪定前加入到细胞培养基之中。使用Western Blot方法检测HIF-1α、Bcl-2/adenovirus E1B 19kDa相互作用蛋白3（Bcl-2/adenovirus E1B 19kD interacting protein 3,BNIP3）、半胱氨酸蛋白酶-3 剪切体（cleaved caspase-3）蛋白水平的表达。（2）IOX2对右美托咪定后处理的原代心肌细胞H/R损伤时细胞活力的影响。将原代心肌细胞随机分为6组（每组n=6）:对照组、对照+IOX2组、H/R组、H/R+DEX组、H/R+DEX+IOX2组、H/R+DEX+溶剂组。其中溶剂为0.1%的二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide,DMSO）,用于溶解IOX2。使用CCK-8试剂盒检测各组心肌细胞的活力。（3）IOX2对右美托咪定后处理的原代心肌细胞H/R损伤时线粒体膜电位的影响。将原代心肌细胞随机分为5组（每组n=6）:对照组、H/R组、H/R+DEX组、H/R+DEX+IOX2组、H/R+DEX+溶剂组。使用JC-1荧光染色法检测各组心肌细胞线粒体膜电位（ΔΨm）水平。正常线粒体膜中,JC-1以聚合体的形式出现,在荧光显微镜下呈现出红色荧光;而凋亡细胞的线粒体膜电位ΔΨm下降或消失,JC-1以单体的形式出现,在荧光显微镜下呈现出绿色荧光。通过分析不同状态下JC-1红色/绿色荧光的比值可以得到细胞线粒体膜电位的相对数值,线粒体膜电位下降提示线粒体的结构性损伤。（4）IOX2对右美托咪定后处理的原代心肌细胞H/R损伤时HIF-1α和凋亡相关蛋白表达的影响。将原代心肌细胞随机分为4组（每组n=6）:H/R组、H/R+DEX组、H/R+DEX+IOX2 组、H/R+DEX+溶剂组。使用 Western Blot 检测各组细胞 HIF-1α和 BCL-2、BAX、BNIP3、cleaved caspase-3、聚 ADP-核糖聚合酶 1 剪切体（cleaved poly ADP-ribose polymerase 1,cleaved PARP-1）蛋白水平的表达。（5）右美托咪定后处理对原代心肌细胞H/R损伤时HIF-1α及其靶基因BNIP3的mRNA表达水平的影响。将原代心肌细胞随机分为3组（每组n=6）:对照组、H/R组、H/R+DEX 组。使用荧光定量聚合酶链反应（quantitative polymerase chain reaction,qPCR）检测各组细胞内HIF-1α及其靶基因BNIP3的mRNA表达水平。（6）通过质粒转染正常培养的原代心肌细胞以证实HIF-1α对BNIP3启动子的激活情况。合成目的基因 HIF-1α DNA,将其构建到质粒载体 pLenti-GⅢ-CMV-GFP-2A-Puro上:并合成启动子BNIP3 promoter和BNIP3启动子突变体,将其构建到双荧光酶素报告质粒载体 pLenti-miniCMV-RenLuc-PGK-Luc-SV40-GFP-2A-Puro 上。将原代心肌细胞随机分为4组（每组n=6）:BNIP3启动子组、BNIP3启动子+空载质粒组、BNIP3启动子+HIF-1α质粒组、BNIP3启动子突变+HIF-1α质粒组。将质粒转染正常培养的心肌细胞24小时后,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）的表达强度,并使用双荧光素酶报告基因试剂盒检测转录因子HIF-1α对BNIP3启动子的激活情况。（7）IOX2对右美托咪定后处理的原代心肌细胞H/R损伤时BNIP3启动子活性的影响。将原代心肌细胞随机分为6组（每组n=6）:对照组、对照+DEX组、H/R组、H/R+DEX 组、H/R+DEX+IOX2 组、H/R+DEX+溶剂组。将报告基因 BNIP3 promoter质粒分别转染以上细胞24小时之后,按照分组情况对细胞进行H/R、DEX、IOX2的处理。使用双荧光素酶报告基因试剂盒检测BNIP3启动子的活性。以上各组数据以均值±标准误表示,使用GraphPad 7软件进行统计学分析处理。结果:（1）Western Blot结果显示,IOX2使正常培养的原代心肌细胞HIF-1α蛋白表达水平明显着升高为对照组的254.4±22.37%（P<0.01）。在H/R状态下,IOX2仍有进一步升高HIF-1α的趋势,但差异不具有统计学意义（431.1±37.86%vs.353.2±35.61%,P>0.05）。同时,IOX2并不影响BNIP3和cleaved caspase-3在正常培养的细胞和H/R状态下细胞中的表达。该结果说明IOX2可以有效的稳定HIF-1α的表达水平而并不增加细胞凋亡。（2）IOX2对于正常培养的心肌细胞活力没有明显影响。H/R造成细胞活力显着下降至对照组的60.26 ± 2.17%（P<0.01）,使用1 μM的右美托咪定后处理使细胞活力升高为77.72±1.63%（P<0.01）,而IOX2使用后细胞活力又下降为63.10±2.36%（P<0.01）。因此,IOX2逆转了右美托咪定后处理的作用,说明右美托咪定后处理通过调控HIF-1α减轻H/R导致的心肌细胞活力下降。（3）线粒体膜电位JC-1染色结果显示,H/R使原代心肌细胞的线粒体膜电位ΔΨm显着下降,即较高的绿色JC-1单体/红色JC-1聚合体比值。1μM的右美托咪定后处理减轻了线粒体膜电位ΔΨm的下降,使得红色JC-1聚合体增加,绿色JC-1单体减少。然而,IOX2的使用逆转了右美托咪定对线粒体膜电位ΔΨm的效果（P<0.01）。这提示右美托咪定后处理通过调控HIF-1α减轻H/R导致心肌细胞凋亡过程中线粒体结构损伤。（4）Western Blot结果显示,1 μM的右美托咪定后处理使H/R时原代心肌细胞的HIF-1α、BNIP3、cleaved caspase-3、cleaved PARP-1 蛋白表达水平显着减少（P<0.01）,而BCL-2/BAX蛋白表达比值显着增加（P<0.01）,IOX2则逆转了右美托咪定对上述蛋白的效果（P<0.05或P<0.01）。该结果证实右美托咪定后处理通过调控HIF-1α减轻H/R导致心肌细胞凋亡相关蛋白的改变。（5）qPCR结果显示,H/R时HIF-1α和BNIP3的mRNA表达水平显着升高（P<0.01）。1μM的右美托咪定后处理显着降低了 H/R时的BNIP3的激活（P<0.01）,但并没有明显改变HIF-1α的mRNA表达水平。该结果提示右美托咪定后处理在HIF-1α的转录后水平而非mRNA水平抑制了 HIF-1α蛋白对靶基因BNIP3的激活。（6）正常培养的心肌细胞转染BNIP3启动子/启动子突变体、HIF-1α质粒24小时后,双荧光酶素报告基因结果显示BNIP3启动子+HIF-1α质粒组的荧光素酶活性显着升高（P<0.01）,BNIP3启动子突变+HIF-1α DNA质粒组的荧光素酶活性与之相比则显着降低（P<0.01）。该结果说明合成的BNIP3启动子可以被HIF-1α DNA激活,该质粒系统的构建有效。（7）双荧光酶素报告基因结果显示,H/R时荧光素酶活性显着升高、BNIP3启动子被激活（P<0.01）,1 μM的右美托咪定后处理则降低了 H/R引起的高荧光素酶活性（P<0.01）。然而,IOX2的使用逆转了右美托咪定对BNIP3启动子活性的抑制作用（P<0.01）。该结果证实右美托咪定后处理通过调控HIF-1α的转录活性抑制了 H/R导致的BNIP3启动子的激活。结论:特异性HIF-1α脯氨酰羟化酶-2抑制剂IOX2可以稳定HIF-1α蛋白的表达水平,同时对乳鼠原代心肌细胞的活性和细胞凋亡没有不良影响。1 μM的右美托咪定后处理可以改善H/R后原代心肌细胞的活力、恢复线粒体膜电位、减轻线粒体结构损伤、调控凋亡相关蛋白 BCL-2、BAX、BNIP3、cleaved caspase-3、cleaved PARP-1 的表达水平、并在转录后水平抑制了 HIF-1α对靶基因BNIP3的激活。然而,IOX2逆转了上述效果,阻断了右美托咪定后处理对原代心肌细胞缺氧复氧的保护作用。综合本部分机制研究的结果,右美托咪定后处理通过在转录后水平作用于HIF-1α此关键靶点,抑制其对下游靶基因的激活,抑制凋亡级联反应,减少细胞凋亡,从而在细胞水平减轻原代心肌细胞缺氧复氧损伤。第三部分 右美托咪定后处理通过调控HIF-1α信号抑制细胞凋亡减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤目的:阐明右美托咪定后处理对大鼠心肌缺血再灌注（ischemia/reperfusion,I/R）过程中心肌损伤和凋亡相关蛋白表达的影响,并进一步证实右美托咪定后处理通过调控HIF-1α信号通路发挥对大鼠缺血再灌注损伤心肌的保护作用。方法:（1）大鼠心肌缺血再灌注过程中HIF-lα蛋白表达随再灌注时间的变化。取24只健康成年雄性SD大鼠随机分为4组（每组n=6）:假手术组、心肌缺血30分钟再灌注2小时、6小时、和24小时组。使用Western Blot检测再灌注2、6、24小时大鼠左心室组织中HIF-1α的蛋白表达水平,取其表达变化最显着的时刻作为后续实验的观察时间点。（2）右美托咪定后处理和IOX2对心肌缺血再灌注过程中大鼠心率的影响。使用MedLab生物医学信号处理系统监测大鼠心电图的变化。取42只健康成年雄性SD大鼠随机分为7组（每组n=6）:假手术组、假手术+DEX组、I/R组、I/R+IOX2组、I/R+DEX组、I/R+DEX+IOX2组、I/R+DEX+溶剂组。其中溶剂为5%二甲基亚砜（DMSO）+30%聚乙二醇300（PEG300）,用于溶解IOX2。再灌注开始时,经过右颈内静脉泵注右美托咪定负荷剂量6 μg/kg/h持续10分钟,追加维持剂量0.7μg/kg/h持续15分钟。IOX2组中,使用右美托咪定前经大鼠腹腔给予25μg/mg的IOX2。记录基础值、缺血15和30分钟、再灌注15、30、60分钟的心率值,并比较心率随时间变化的曲线下面积以观察心率在此期间整体的变化。（3）右美托咪定后处理和IOX2对大鼠心肌缺血再灌注过程中动脉血气、电解质、酸碱平衡的影响。上述7组大鼠于再灌注6小时经腹主动脉取血,行动脉血pH、动脉血氧分压（partial pressures of oxygen,PaO2）、动脉血二氧化碳分压（partial pressures of carbon dioxide,PaCO2）、动脉氧饱和度（arterial oxygen saturation,SaO2）、血红蛋白（hemoglobin,Hb）、红细胞压积（hematocrit,Hct）、Na+、K+、Ca2+、Cl-、HCO3-、碱剩余（base excess,BE）的分析,以了解各组动物在实验过程中内环境的是否稳定。（4）IOX2对右美托咪定后处理的大鼠心肌缺血再灌注过程中血清心肌肌钙蛋白I（cardiac troponin I,cTnI）的影响。取36只健康成年雄性SD大鼠随机分为6组（每组 n=6）:假手术组、假手术+DEX 组、I/R 组、I/R+DEX 组、I/R+DEX+IOX2组、I/R+DEX+溶剂组。给药方式同第（2）部分。于再灌注6小时取下腔静脉血,使用酶联免疫吸附测定法（Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA）检测血清cTnI的水平,以明确各组大鼠心肌损伤的程度。（5）IOX2对右美托咪定后处理的大鼠心肌缺血再灌注导致的心肌组织凋亡的影响。上述6组大鼠于再灌注6小时取左心室组织,行冰冻切片。并使用原位末端标记法（TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling,TUNEL）标记凋亡细胞断裂基因组 DNA的3’-OH末端,在荧光显微镜下检测各组大鼠心肌绀织的凋亡情况。（6）IOX2对右美托咪定后处理的大鼠心肌缺血再灌注导致的心肌梗死面积的影响。取36只健康成年雄性SD大鼠随机分为6组（每组n=6）:假手术组、I/R组、I/R+IOX2 组、I/R+DEX 组、I/R+DEX+IOX2 组、I/R+DEX+溶剂组。于再灌注 6小时,左心室组织行2%伊文氏蓝/1%氯化二苯四氮唑（Evans blue/2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride,TTC）染色,分析心肌组织缺血危险区（area at risk,AAR）和心肌梗死区（infarct area,IA）的面积,心肌切片后以称重法分别记录其重量,心肌梗死面积最终以IA 区的承量占AAR区的市量的百分比（IA总重量/AAR总重量×100%）来表示。（7）IOX2对右美托咪定后处理的大鼠心肌缺血再灌注过程中HIF-1α和凋亡相关蛋白表达的影响。取36只雄性SD大鼠随机分为6组（每组n=6）:假手术组、I/R组、I/R+IOX2 组、I/R+DEX 组、I/R+DEX+IOX2 组、I/R+DEX+溶剂组。使用 Western Blot检测缺血再灌注、右美托咪定、IOX2干预后各组大鼠心肌组织中HIF-1α和凋亡相关蛋白 BCL-2、BAX、BNIP3、cleaved caspase-3、cleaved PARP-1 的表达水平的变化。（8）心肌缺血再灌注实验过程中各组大鼠死亡率的比较。记录和比较以上所有7部分实验中,在未达到实验终点前由于任何原因引起的的大鼠死亡情况。以上各组数据以均值±标准误表示,使用GraphPad 7软件进行统计学分析处理。结果:（1）Western Blot结果显示,缺血30分钟再灌注2、6、24小时的三组大鼠心肌组织内HIF-1α蛋白表达均较假手术组显着升高（P<0.01）,且再灌注6小时组的表达量显着高于2小时组（P<0.01）和24小时组（P<0.05）。因此,选取缺血30分钟再灌注6小时作为最佳时间点应用于后续大鼠实验。（2）心电图及心率监测结果显示,心肌缺血再灌注过程引起了大鼠心电图的显着变化,即缺血时ST段显着抬高、再灌注时出现快速型心律失常如室性心动过速、甚至室颤。右美托咪定后处理对于ST段变化和心律失常没有显着影响。实验过程中右美托咪定组的大鼠心率有减慢的趋势,但组内和组间比较的差异都不具有统计学意义（P>0.05）,各组的曲线下面积（心率×时间）也相似。（3）血气、电解质、血红蛋白的结果显示,再灌注6小时各组大鼠的动脉血pH、Pa02、PaCO2、SaO2、Hb、Hct、Na+、K+、Ca2+、Cl-、HCO3-、BE 数值都在正常范围。与假手术组相比,经受心肌I/R的大鼠PaCO2、HCO3-、BE的数值偏低,但组间比较差异不具有统计学意义（P>0.05）。因此,实验过程中大鼠的内环境保持稳定。（4）血清cTnI检测结果显示,I/R组大鼠血清cTnI浓度显着升高为9.78±0.42 ng/ml（P<0.01）,右美托咪定后处理则使cTnI降低至5.07±0.33 ng/ml（P<0.01）,但I/R+DEX+IOX2组又升高为8.19±0.43 ng/ml（P<0.01）。右美托咪定后处理显着减少了大鼠心肌I/R导致的cTnI释放,该保护作用被IOX2逆转,提示右美托咪定后处理通过调控HIF-1α减轻I/R导致的大鼠心肌组织损伤。（5）TUNEL凋亡检测结果显示,I/R组大鼠心肌组织凋亡率为36.67±1.97%（P<0.01）,右美托咪定后处理组则降低至15.59±0.80%（P<0.01）,而I/R+DEX+IOX2组又升高为28.74±1.38%（P<0.01）。此结果证明右美托咪定后处理通过调控HIF-1 α减轻I/R导致大鼠心肌组织的凋亡。（6）Evans Blue/TTC双染检测结果显示,除假手术组外的各组大鼠心肌缺血危险区AAR的面积在45%左右,组间具有可比性（P>0.05）。I/R组和I/R+IOX2组大鼠的心肌梗死面积显着升高为39.27±0.72%和41.53±1.50%（P<0.01）,右美托咪定后处理显着降低梗死面积至20.20±2.07%（P<0.01）,而IOX2又使梗死面积增加至33.90±2.06%（P<0.01）。因此,右美托咪定后处理通过调控HIF-1α减轻I/R导致的大鼠心肌梗死面积。（7）Western Blot的结果显示,右美托咪定后处理使I/R时心肌组织的HIF-1α、BNIP3、cleaved caspase-3、cleaved PARP-1 蛋白表达水平显着减少（P<0.01）,BCL-2/BAX蛋白表达比值显着增加（P<0.01）,而IOX2则逆转了右美托咪定对上述蛋白的效果（P<0.05或P<0.01）。该结果证实右美托咪定后处理通过调控HIF-1α蛋白减轻I/R导致大鼠心肌凋亡相关蛋白的改变。（8）整个实验过程中总共有9只大鼠在实验终点前死亡。死亡原因包括失血、严重心律失常（室性心动过速和室颤）、呼吸衰竭。死亡率分别为:假手术组（1/25,即4.0%）、假手术+DEX组（0/6,即0%）、I/R组（2/38,即5.26%）、I/1R+IOX2组（2/20,即 10%）、I/R+DEX 组（1/1 9,即 5.26%）、I/R+DEX+IOX2 组（2/20,即10%）、I/R+DEX+溶剂组（1/19,即5.26%）。各组死亡率的组间比较,差异不具有统计学意义（P>0.05）。结论:右美托咪定后处理可减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤,表现为降低血清cTnl水平、减轻心肌组织凋亡、减少心肌梗死面积、调控凋亡相关蛋白BCL-2、BAX、BNIP3、cleaved caspase-3、cleaved PARP-1 的表达水平。特异性 HIF-1α 脯氨酰羟化酶-2抑制剂IOX2则逆转了右美托咪定后处理的心肌保护作用和以上指标的变化。综合本部分研究结果,右美托咪定后处理通过作用于HIF-1α此关键靶点减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤。

周友^[7]（2020）在《尿石素B对心肌缺血再灌注损伤的保护作用及其机制研究》文中研究表明背景:急性心肌梗死发病率死亡率高,严重威胁人类健康。溶栓或介入等治疗后缺血心肌的血流再灌注自身会引起心肌损伤,导致心脏预后不良。因此采取措施预防心肌缺血再灌注（ischemia reperfusion,IR）损伤对急性心肌梗死的治疗具有重要意义。尿石素B（Urolithin B,UB）是食物中的鞣花酸在肠道的代谢产物,具有抗肿瘤、抗炎症、抗氧化应激、类激素作用等药物活性。近年来的研究表明UB对动脉粥样硬化和糖尿病心肌损伤具有改善作用,但UB是否可以保护心肌缺血再灌注损伤尚不清楚。目的:探究UB对心肌缺血再灌注损伤的作用及其可能的分子机制。方法:（1）雄性Sprague Dawley大鼠结扎冠状动脉左前降支后复灌构建心肌IR模型,腹腔注射不同剂量UB。观察心肌内凋亡相关蛋白Cleaved Caspase 3表达变化,并检测最小有效剂量下药物的血浆浓度。（2）左心室插管记录IR期间血流压力变化;Evans Blue-TTC和HE染色观察心肌梗死面积和结构形态的改变;比色法检测心肌损伤因子CK、LDH、MDA含量和SOD活性;TUNEL及Western blot检测心肌细胞凋亡情况。（3）H9c2心肌细胞缺氧复氧（hypoxia reoxygenation,HR）建立HR细胞模型,并给予UB处理。MTT法检测HR和UB对细胞活性的影响;Western Blot及Annex V/PI双染检测UB对细胞凋亡的影响。（4）Western Blot和GFP-LC3腺病毒单标检测心肌组织及H9c2细胞内自噬水平及其上游通路Akt/mTOR/ULK1的变化。（5）给予Akt抑制剂LY294002后观察细胞自噬激活通路及细胞凋亡的变化。（6）荧光探针及Western Blot分别检测活性氧（ROS）含量及Nrf2-ARE通路激活情况;并检测p62/Keap1/Nrf2信号通路激活情况。（7）使用siRNA干扰Nrf2后,检测细胞内Nrf2下游蛋白表达、ROS含量及细胞凋亡的变化情况。结果:（1）0.7 mg/kg的UB可显着抑制IR心肌Cleaved Caspase 3的表达（P<0.05）,该剂量血药浓度峰值约15.8μM。（2）与IR大鼠相比,UB显着升高左心室舒张末压（LVEDP）,降低左心室收缩压（LVSP）、等容收缩期左室内压上升段最大变化速率（+dp/dt max）、左室内压下降段最大变化速率（-dp/dt max）（P<0.05）;减心肌小梗死面积并改善结构紊乱;降低LDH、CK、MDA的表达并增强SOD的活性（P<0.05）;抑制IR诱发的心肌细胞凋亡（P<0.05）。（3）UB显着抑制HR导致的细胞活性降低和细胞凋亡（P<0.05）。（4）UB显着抑制IR/HR激活的自噬,上调p-Akt（S473）、p-mTOR（S2448）、p-ULK1（S757）、p62的表达,降低LC3Ⅱ/Ⅰ的表达（P<0.05）。（5）LY294002阻断UB的自噬抑制后,UB抑制细胞凋亡的作用消失（P<0.05）。（6）UB减轻IR/HR模型内ROS的含量、促进Nrf2的核转位并上调HO-1、NQO1、GSTP1蛋白的表达（P<0.05）;HR导致与Keap1结合的p62减少,而UB增加二者的结合水平。（7）Nrf2表达被抑制后UB上调抗氧化蛋白表达、降低ROS含量、抑制细胞凋亡的作用被逆转（P<0.05）。结论:（1）UB具有抗心肌缺血再灌注损伤作用。（2）自噬抑制参与调节UB抗心肌缺血再灌注损伤。（3）UB通过p62/Keap1/Nrf2信号通路激活Nrf2发挥抗心肌缺血再灌注损伤作用。

宁小伟^[8]（2020）在《蒙药当贡-3通过PI3K/Akt信号通路干预心肌缺血再灌注损伤大鼠的机制研究》文中提出目的通过复制大鼠心肌缺血再灌注损伤模型,探讨蒙药当贡-3对大鼠缺血再灌注心肌的影响及其对缺血再灌注心肌的保护作用与PI3K/Akt信号通路的关系。方法将SD大鼠随机分为7组,分别为:空白组（A组）,模型组（B组）,假手术组（C组）,当贡-3高剂量组（D组）、中剂量组（E组）、低剂量组（F组）,当贡-3高剂量+PI3K/Akt阻断剂LY294002组（G组）,每组10只,共70只。D、E、F和G组分别给予当贡-3 1.08g/kg、0.54g/kg、0.27g/kg、1.08g/kg的混悬液灌胃,A、B及C组则灌胃等量蒸馏水,每天1次,共21天;灌胃结束后造模,其中G组大鼠于造模前10min尾静脉注射LY294002（0.3mg/kg）。实验结束后取材,Elisa法检测大鼠血清LDH、CK-MB活性;Evans Blue+TTC双染法测定大鼠心肌梗死面积;TUNEL法检测大鼠心肌细胞凋亡指数;HE染色观察心肌组织病理形态学变化;Western blot测定心肌组织PI3K、Akt、Bax、Bcl-2蛋白水平。结果1.大鼠血清LDH、CK-MB含量变化:C组大鼠血清LDH、CK-MB含量与A组比无明显变化（P>0.05）。B组大鼠血清LDH、CK-MB含量显着高于C组（P<0.01）。当贡-3干预后,D、E、F组大鼠血清LDH、CK-MB含量明显低于B组（P<0.01）。D组大鼠血清LDH、CK-MB含量显着低于E、F组（P<0.01）。G组大鼠血清LDH、CKMB含量显着高于D组（P<0.01）。2.大鼠心肌梗死面积、细胞凋亡指数测定:C组大鼠心肌梗死面积、细胞凋亡指数与A组比无明显变化（P>0.05）。B组大鼠心肌梗死面积、细胞凋亡指数显着高于C组（P<0.01）。当贡-3干预后,D、E、F组大鼠心肌梗死面积、细胞凋亡指数明显低于B组（P<0.01）。D组大鼠心肌梗死面积、细胞凋亡指数显着低于E、F组（P<0.01）。G组大鼠心肌梗死面积、细胞凋亡指数明显高于D组（P<0.01）。3.大鼠心肌组织HE染色结果:A、C组大鼠心肌组织无明显病理改变。B组心肌组织出现断层、纹理模糊、心肌纤维形态不规则、间质内大量炎细胞浸润等病理表现。当贡-3干预后,D、E、F组心肌组织病理形态与B组相比具有不同程度的改善,尤以D组改善明显。4.大鼠心肌组织PI3K、Akt、Bcl-2、Bax蛋白表达变化:C组大鼠心肌组织PI3K、Akt、Bcl-2、Bax蛋白表达与A组比无明显变化（P>0.05）。与C组比,B组大鼠心肌组织PI3K、Akt、Bcl-2蛋白表达明显下降,Bax蛋白表达明显升高（P<0.01）。当贡-3干预后,与B组比,D、E、F组PI3K、Akt、Bcl-2蛋白表达明显上升,Bax蛋白表达明显下降（P<0.01）。与E、F组比,D组PI3K、Akt、Bcl-2蛋白表达明显上升,Bax蛋白表达明显下降（P<0.01）。与D组比,G组PI3K、Akt、Bcl-2蛋白表达明显下降,Bax表达显着升高（P<0.01）。结论蒙药当贡-3在心肌缺血再灌注时具有保护心肌的作用,其发生机制可能与抑制心肌细胞凋亡,活化PI3K/Akt信号通路有关。

张亚楠^[9]（2020）在《HIF-1α/BNIP3信号通路诱导的自噬可减轻心肌缺血再灌注损伤》文中提出冠心病被称为人类健康和生命的“第一大杀手”,在全球的发病率和病死率都呈逐年上升的趋势。而治疗冠心病除了传统的药物治疗之外,冠状动脉溶栓、经皮冠状动脉介入和冠状动脉旁路移植术也在治疗中广泛应用,优点是能开通闭塞和狭窄的血管,恢复冠脉血流,但也不可避免的带来血管开通后心肌缺血再灌注损伤,这已经成为目前对冠心病研究的一个热点问题。冠状动脉闭塞会导致心脏缺血,会明显的影响到心肌细胞供血供氧而产生一定的损害。而心肌细胞缺血后恢复供血会导致活性氧簇（ROS）而产生进一步的损害,影响了心肌细胞的功能,即心肌的缺血再灌注（ischemia/reperfusion,I/R）损伤。I/R损伤过程中伴随着许多不良反应,如严重的缺氧、酸中毒、钙超载、能量耗竭和离子动态平衡紊乱等,在这些因素的影响下,心肌受到损伤而最终导致心肌细胞死亡。线粒体可以为心肌细胞的活动提供能量支持,在I/R损伤的作用很重要,线粒体在受损情况下产生的活性氧明显高于正常条件下的,而活性氧对线粒体蛋白质和DNA会产生很强损伤作用,这也导致线粒体被破坏,进而对细胞造成损伤。适度的线粒体自噬可以对一些受损线粒体起到清除作用,降低了这种损害,因而适当调控线粒体自噬可以减轻心肌的缺血再灌注损伤。相关研究发现细胞自噬调节路径有很多种,包括调节线粒体去极化的PINK1（PTEN induced putative kinase 1）/Parkin（Parkinson juvenile disease protein 2）途径,线粒体自噬受体分子FUNDC1（FUN14 domain containing 1）介导的线粒体自噬途径,还有一种途径就是本课题着重研究的BNIP3通路在缺血缺氧下介导的自噬途径。BNIP3（Bcl-2 nineteen-kilodalton interacting protein 3）属于Bcl-2家族蛋白中的BH3-only亚家族成员,主要分布于内质网（ER）,松散的结合在线粒体外膜上,其在细胞内的位置决定细胞死亡方式。BNIP3通过其BH3结构域开放线粒体通透性转换孔（m PTP）从而影响到线粒体功能,在此基础上促使细胞凋亡;实验研究还发现其BH3结构域导致Bcl-2/Beclin-1作用受影响而启动自噬机制,Beclin-1表达增强可以作为自噬水平升高的重要指标。当细胞的营养和氧减少时,BNIP3可以激活线粒体自噬,在不改变线粒体通透性和不依赖于凋亡的前提下,介导线粒体自噬。适度的线粒体自噬可以消除受损的线粒体,维持机体内环境的稳定。缺氧诱导因子-1（HIF-1）是一种异源二聚体,其主要组成包括亚基HIF-lα和HIF-1β。HIF-lα在正常氧条件下稳定性差,受到脯氨酰羟化酶催化而羟基化后,容易结合肿瘤抑制蛋白（VHL）,被识别成泛素化的部位,之后通过泛素-蛋白酶体通路被迅速降解。此降解过程在缺氧条件下受到抑制;HIF-lα转移到细胞核内结合HIF-1β而组合成复合体,所得产物结合低氧反应元件（HRE）,且对超60个靶基因的转录进行介导。既往在肿瘤细胞,肝脏和肾脏细胞缺血再灌注损伤研究发现,线粒体自噬介导的选择性自噬会导致线粒体破坏并释放,而HIF-1α在线粒体自噬过程中起着重要调节作用。许多研究表明由HIF-1α引起的BNIP3和BNIP3L的表达上调在低氧诱发的自噬密切相关。本研究分别以SD大鼠、H9C2心肌细胞和急性心肌梗死患者的外周血为研究对象。分别应用酶联免疫吸附法（ELISA法）、实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-PCR）、蛋白印迹法（Western Blot）、MTS实验、LDH实验和透射电镜等实验方法研究心肌缺血再灌注损伤情况下HIF-1α和BNIP3的表达;然后通过体外实验研究升高或敲低BNIP3后对H9C2心肌细胞氧糖剥夺再灌注损伤情况下的细胞活力和LDH释放、细胞自噬水平的影响,最后通过检测相关通路蛋白的表达情况进一步探讨其影响心肌氧糖剥夺再灌注损伤的途径,阐明了HIF-1α/BNIP3信号通路在心肌氧糖剥夺再灌注损伤的作用,从而为更深刻的认识心肌氧糖剥夺再灌注损伤发生发展的分子机制。第一部分SD大鼠心肌缺血再灌注损伤时HIF-1α和BNIP3的表达目的:验证HIF-1α和BNIP3蛋白水平在SD大鼠心肌细胞缺血再灌注中的表达。方法:1.SD大鼠随机分为4组,每组12只,分别为:假手术（Sham组）、缺血再灌注组（I/R组）、缺血再灌注+DMOG组（I/R+DMOG组）、缺血再灌注+3-MA组（I/R+3-MA组）;2.TTC和HE染色法检测SD大鼠心肌缺血的面积和心肌细胞的损伤水平;3.Western Blot法检测各组心肌组织中HIF-1α、BNIP3、LC3-I、LC3-II、Beclin-1蛋白表达水平;结果:1.SD大鼠各组心肌组织TTC结果显示:DMOG预处理能够显着减轻大鼠I/R损伤的心肌梗死面积,而3-MA预处理组能显着增加心肌梗死面积。2.SD大鼠各组心肌组织HE染色结果显示:DMOG预处理能显着减轻SD大鼠I/R的心肌损伤,而3-MA预处理加重SD大鼠I/R的心肌损伤。3.DMOG预处理可通过上调HIF-1α的水平使BNIP3的表达水平和自噬调节蛋白LC3-I、LC3-II、Beclin-1的表达水平增高,激活心肌细胞的自噬起保护心肌的作用;3-MA预处理通过抑制自噬,使自噬调节蛋白LC3-I、LC3-II、Beclin-1表达降低,加重了心肌损伤。小结:1.HIF-1α和BNIP3蛋白水平在SD大鼠心肌I/R损伤情况下中表达显着增高;HIF-1α的激动剂DMOG能升高HIF-1α的水平,进而升高BNIP3蛋白及自噬调节蛋白LC3-I、LC3-II、Beclin-1的水平。2.升高HIF-1α和BNIP3蛋白水平,会使自噬水平增高,进一步减轻SD大鼠心肌细胞I/R损伤,抑制自噬水平会加重SD大鼠心肌细胞I/R损伤。第二部分HIF-1α对BNIP3调节在H9C2心肌细胞氧糖剥夺再灌注损伤中的作用目的:研究升高和敲低BNIP3对氧糖剥夺再灌注损伤状态下H9C2心肌细胞细胞活力和细胞损伤的影响。方法:1.H9C2细胞氧糖剥夺再灌注（OGD/R）模型的建立,将H9C2细胞随机分为6组,control组、OGD/R（24h/2h）组、OGD/R（24h/2h）+DMOG组、OGD/R（24h/2h）+YC-1组、OGD/R（24h/2h）+Tre组、OGD/R（24h/2h）+BNIP3-si RNA组;2.免疫化学染色及Western Blot法检测各组HIF-1α及BNIP3的表达;3.MTS实验和LDH实验检测升高和转染技术敲低BNIP3对H9C2细胞在氧糖剥夺再灌注损伤中细胞活力和损伤的影响;结果:1.成功构建升高和抑制HIF-1α蛋白表达水平的H9C2细胞氧糖剥夺再灌注损伤模型。2.升高BNIP3蛋白表达水平会使H9C2细胞氧糖剥夺再灌注损伤中LDH释放降低,敲低BNIP3蛋白表达水平会使H9C2细胞氧糖剥夺再灌注损伤中LDH释放升高。3.升高BNIP3蛋白表达水平会提高H9C2细胞在氧糖剥夺再灌注损伤中活力,敲低BNIP3蛋白表达水平会降低H9C2细胞在氧糖剥夺再灌注损伤中活力。小结:1.在H9C2细胞OGD/R损伤中升高HIF-1α水平会使BNIP3蛋白水平同步升高,降低HIF-1α水平会使BNIP3蛋白水平同步降低。2.升高BNIP3蛋白水平会减轻H9C2细胞OGD/R损伤,敲低BNIP3蛋白表达会加重H9C2细胞OGD/R损伤。第三部分BNIP3通过激活线粒体自噬减轻H9C2心肌细胞氧糖剥夺再灌注损伤目的:进一步研究BNIP3在H9C2心肌细胞氧糖剥夺再灌注损伤过程中对心肌细胞自噬的影响。方法:1.H9C2心肌细胞氧糖剥夺再灌注（OGD/R）模型的建立,将H9C2心肌细胞随机分为5组,control组、OGD/R（24h/2h）组、OGD/R+Tre（24h/2h）组、OGD/R（24h/2h）+BNIP3-si RNA组、OGD/R（24h/2h）+3-MA组;2.Western Blot法检测升高和转染技术敲低BNIP3及抑制线粒体自噬,BNIP3和自噬蛋白的表达。3.通过透射电镜观察H9C2心肌细胞在不同干预条件下的自噬水平。结果:1.升高BNIP3蛋白会增加H9C2心肌细胞在OGD/R损伤中自噬水平,敲低BNIP3蛋白会降低H9C2心肌细胞在OGD/R损伤中自噬水平。2.进一步应用透射电镜验证升高BNIP3蛋白会增加H9C2心肌细胞在OGD/R中的自噬,敲低BNIP3蛋白会降低H9C2心肌细胞在OGD/R中的自噬;抑制H9C2心肌细胞自噬会增加H9C2心肌细胞OGD/R损伤,适度的增加H9C2心肌细胞自噬会减轻OGD/R损伤。小结:1.升高BNIP3蛋白的表达水平会提高H9C2心肌细胞氧糖剥夺再灌注损伤中自噬水平,从而减轻H9C2心肌细胞氧糖剥夺再灌注损伤。2.敲低BNIP3蛋白的表达水平会降低H9C2心肌细胞的自噬水平,从而加重H9C2心肌细胞氧糖剥夺再灌注损伤。第四部分急性心肌梗死患者血清HIF-1α的表达目的:验证HIF-1α水平在急性ST段抬高型心肌梗死的患者中表达。方法:1.应用酶联免疫吸附法（ELISA法）检测36例急性ST段抬高型心肌梗死（Acute ST-Segment Elevation Myocardial Infarction,STEMI）的并行经皮冠状动脉介入治疗术（Percutaneous coronary intervention,PCI）术患者、32例急性ST段抬高型心肌梗死行冠脉造影（Coronary arteriography,CAG）术患者、35例无冠心病对照组（NC）的血清HIF-1α表达水平。结果:1.三组受试者的临床资料特征无统计学差异。2.与NC组相比HIF-1α外周血清水平在STEMI+PCI组和STEMI+CAG组血清中表达上调,且STEMI+PCI组的HIF-1α水平升高的更显着。小结:急性ST段抬高型心肌梗死患者,开通冠脉血流恢复后的外周血血清HIF-1α水平会升高。

周桐^[10]（2020）在《双参通脉颗粒对大鼠心肌缺血再灌注后VCAM-1及IL-1β的影响实验研究》文中研究说明目的:本实验通过观察测定双参通脉颗粒干预心肌缺血再灌注造模后的大鼠血清中血管细胞粘附分子VCAM-1及白细胞介素IL-1β的含量变化,然后在光学显微镜下观察大鼠心肌细胞的形态学改变。探讨双参通脉颗粒对缺血再灌注损伤大鼠心肌细胞的作用及可能的作用机制,验证双参通脉颗粒治疗此类心血管疾病的有效作用,并为临床推广此类中医药疗法治疗疾病提供理论依据。材料与方法:制备院内中药制剂双参通脉颗粒。将大鼠随机分为六组:对照组、模型组、西药组、中药低剂量组、中药中剂量组和中药高剂量组,每组十只大鼠。其中西药组予合心爽,中药组予不同剂量的双参通脉颗粒,每日1次进行药物灌胃,其余两组予等量的生理盐水灌胃,连续两周。之后通过结扎左冠状动脉前降支对大鼠进行造模手术,其中对照组只做开胸手术不做结扎手术,从而复制大鼠心肌缺血再灌注损伤的模型。从大鼠腹主动脉采集血清,分别按照VCAM-1及IL-1β的试剂盒要求,采用ELISA法测定各组指标含量,并用HE染色法制作心肌组织切片,在光学显微镜下观察形态学变化。结果:1.VCAM-1:与对照组比较,模型组及各个用药组VCAM-1水平明显提高（P<0.05）;与模型组比较,各个用药组VCAM-1水平明显下降（P<0.05）;与中药低剂量组相比,中药中剂量和高剂量组VCAM-1水平下降（P<0.05）;2.IL-1β:与对照组比较,模型组及各个用药组IL-1β水平明显提高（P<0.05）;与模型组比较,各个用药组IL-1β水平明显降低（P<0.05）;与中药低剂量组相比,中药中剂量和高剂量组IL-1β水平下降（P<0.05）;3.光学显微镜观察到,模型组大鼠细胞核肿胀变圆,心肌间质水肿,组织间隙增宽。中药组大鼠胞核未见明显肿胀,间质水肿减轻,心肌细胞排列较为致密整齐。结论:1.心肌缺血再灌注损伤后的大鼠血清中VCAM-1及IL-1β含量明显升高;2.双参通脉颗粒能够降低大鼠血清中VCAM-1及IL-1β的水平,且在一定范围内与药物剂量成正相关;3.双参通脉颗粒能保护心肌组织及细胞的结构,可能的机制是由于降低了大鼠VCAM-1及IL-1β水平。

二、再灌注心肌损伤的表现及机制(英文)（论文开题报告）

（1）论文研究背景及目的

此处内容要求：

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例：

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

（2）本文研究方法

调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、再灌注心肌损伤的表现及机制(英文)（论文提纲范文）

（1）益气搜风中药对心肌缺血再灌注损伤大鼠内皮功能影响与机制的研究（论文提纲范文）

（2）心肌缺血再灌注损伤过程中的类二十烷酸代谢组学研究（论文提纲范文）

（3）基于mTORC1-ULK1-FUNDC1通路的电针预处理减轻MIRI的线粒体自噬机制研究（论文提纲范文）

（4）miR-26a-5p通过调控PTEN/PI3K/AKT信号通路对心肌缺血再灌注损伤的作用研究（论文提纲范文）

（5）基于SIRT1信号通路探讨舒心生脉丹对MI/RI模型大鼠的保护作用和机制（论文提纲范文）

（6）右美托咪定调控HIF-1α信号通路减轻心肌缺血再灌注损伤的分子机制研究（论文提纲范文）

（7）尿石素B对心肌缺血再灌注损伤的保护作用及其机制研究（论文提纲范文）

（8）蒙药当贡-3通过PI3K/Akt信号通路干预心肌缺血再灌注损伤大鼠的机制研究（论文提纲范文）

（9）HIF-1α/BNIP3信号通路诱导的自噬可减轻心肌缺血再灌注损伤（论文提纲范文）

（10）双参通脉颗粒对大鼠心肌缺血再灌注后VCAM-1及IL-1β的影响实验研究（论文提纲范文）

四、再灌注心肌损伤的表现及机制(英文)（论文参考文献）

• [1]益气搜风中药对心肌缺血再灌注损伤大鼠内皮功能影响与机制的研究[D]. 张雯雯. 辽宁中医药大学, 2021(02)
• [2]心肌缺血再灌注损伤过程中的类二十烷酸代谢组学研究[D]. 张刘洋. 中国人民解放军海军军医大学, 2020(05)
• [3]基于mTORC1-ULK1-FUNDC1通路的电针预处理减轻MIRI的线粒体自噬机制研究[D]. 肖燕. 南京中医药大学, 2020(01)
• [4]miR-26a-5p通过调控PTEN/PI3K/AKT信号通路对心肌缺血再灌注损伤的作用研究[D]. 邢小卫. 山东大学, 2020(08)
• [5]基于SIRT1信号通路探讨舒心生脉丹对MI/RI模型大鼠的保护作用和机制[D]. 刘岩松. 长春中医药大学, 2020(08)
• [6]右美托咪定调控HIF-1α信号通路减轻心肌缺血再灌注损伤的分子机制研究[D]. 彭科. 苏州大学, 2020(06)
• [7]尿石素B对心肌缺血再灌注损伤的保护作用及其机制研究[D]. 周友. 广州医科大学, 2020(01)
• [8]蒙药当贡-3通过PI3K/Akt信号通路干预心肌缺血再灌注损伤大鼠的机制研究[D]. 宁小伟. 内蒙古医科大学, 2020(03)
• [9]HIF-1α/BNIP3信号通路诱导的自噬可减轻心肌缺血再灌注损伤[D]. 张亚楠. 河北医科大学, 2020(01)
• [10]双参通脉颗粒对大鼠心肌缺血再灌注后VCAM-1及IL-1β的影响实验研究[D]. 周桐. 辽宁中医药大学, 2020(02)