吴境宇[1]（2021）在《蛋白质组学与转录组学联合分析揭示膜联蛋白ANXA1在小细胞肺癌中的功能》文中研究指明肺癌对人类危害巨大,具有高发病率和高致死率的特点。根据细胞类型特征,世界卫生组织将其分为非小细胞肺癌和小细胞肺癌。与非小细胞肺癌相比,小细胞肺癌的侵袭性高,治疗难度大,且难以早期发现。目前的研究中由于肺癌细胞基因突变类型不同,小细胞肺癌与非小细胞肺癌需要采取不同的治疗策略。因此清楚准确的区分两种肺癌类型,尽早确诊小细胞肺癌,并及时进行针对性治疗对于患者治愈率的提高十分重要。本课题以两种肺癌亚型（非小细胞肺癌和小细胞肺癌）的细胞系作为研究对象,对非小细胞和小细胞肺癌进行蛋白质组学和转录组学数据分析筛选区分两种肺癌亚型的特有基因,通过相关性分析筛选小细胞肺癌特异性基因的靶向药物,并使用分子生物学方法验证其在小细胞肺癌中的生物学功能。通过蛋白质组学分析在对非小细胞肺癌（A549、H1975）和小细胞肺癌细胞系（H446、H69）中共鉴定到3970个蛋白;定量分析发现小细胞肺癌和非小细胞肺癌中有147个差异蛋白;结合在线转录组学数据库分析发现小细胞肺癌中14个基因,与蛋白质组学具有相同差异趋势且相关性良好。进一步针对两种肺癌亚型病人临床样本进行转录组学分析（利用已发表组学数据）,结果显示TUBA1A、DPYSL5、ANXA1基因在小细胞肺癌临床样本中显着变化,而在非小细胞肺癌中无显着性变化。同时使用生存分析发现,仅ANXA1在小细胞肺癌中有显着生存意义,而在非小细胞肺癌中无意义。通过相关性分析后发现,与ANXA1表达正相关的基因都与细胞凋亡相关,与ANXA1表达负相关的基因均与细胞周期调控密切相关。这表明ANXA1在小细胞肺癌中可能参与细胞凋亡或细胞周期过程。此外,使用小细胞肺癌的miRNA数据探索差异和靶向ANXA1的miRNA,发现mi R-196a在小细胞肺癌中过表达并靶向于ANXA1。之后,本研究利用分子生物学方法将ANXA1在4种肺癌细胞系中过表达,并使用相关性分析筛选合适的联合药物。结果显示obatoclax为小细胞肺癌中潜在的靶向治疗药物。实验证明ANXA1可降低Bcl2在小细胞肺癌中的表达量,促进小细胞肺癌的死亡,另外结合使用药物obatoclax后,可进一步降低Bcl2的表达量,促进小细胞肺癌死亡。这些结果表明过表达ANXA1联合obatoclax药物可能进一步促进小细胞肺癌死亡。综上所述,本课题利用蛋白质组学,并结合生物信息学的方法筛选区分小细胞肺癌与非小细胞肺癌的特异性基因,并通过分子生物学方法对关键差异蛋白ANXA1进行验证,发现ANXA1能对小细胞肺癌的凋亡过程进行调控,同时联合使用obatoclax后效果更佳。这些系统的分析将为小细胞肺癌的诊断及治疗提供了新思路。
李小丰[2]（2021）在《PRM1在非小细胞肺癌中的表达及生物学作用研究》文中研究指明背景:目前,肺恶性肿瘤仍是威胁人类健康的最大敌人之一,中国癌症发病和死亡统计显示,2015年我国肺癌的新发病例数为78.7万,死亡人数为63.1万,均列癌症首位。根据临床和病理特点的不同,肺癌分为小细胞肺癌（占13%）和非小细胞肺癌（占87%）,其5年总生存率仅为18.2%。传统的治疗方法包括手术、化疗、放疗等,但对于晚期肺癌患者均疗效不佳。近年来,随着分子靶向治疗的兴起,非小细胞肺癌的无进展生存期和总生存期都得到了显着改善。具有敏感基因突变的肺癌患者,分子靶向治疗是最有效的治疗方式之一,而对于没有敏感突变或在靶向治疗过程中发生靶基因耐药突变的患者而言,发现新的肿瘤生物学标志物和新的治疗靶点显得尤为重要。鱼精蛋白-1（PRM1）是肿瘤-睾丸抗原（CTA）的一种,CTA在正常情况下只在睾丸组织中表达,而其它组织不表达或极低表达,但当机体出现肿瘤时则可以在某些肿瘤组织中高表达,肿瘤-睾丸抗原也因此得名。既往对于PRM1的研究主要集中在男性生殖领域。近年来,随着CTA在肿瘤领域研究的深入,关于PRM1在恶性肿瘤中的作用也逐渐被重视,研究发现PRM1是结肠癌相关的肿瘤-睾丸抗原基因,利用RT-PCR技术分析PRM1在结肠癌和癌旁组织的表达水平,发现肠癌组织中PRM1-m RNA水平明显高于癌旁和正常组织。也有研究发现PRM1在慢性淋巴细胞白血病患者中高表达,PRM1也被认为是慢性淋巴性白血病的CTA基因。另有研究表明,PRM1在恶性肿瘤中的异常表达,可能与肿瘤的生长侵袭相关。在动物实验中,给裸鼠皮下注射PRM1蛋白可明显提高小鼠肠道肿瘤的发生率。目前为止,尚无关于PRM1在非小细胞肺癌中表达情况的报道,课题组的前期工作已证实,与正常组织比较,PRM1在非小细胞肺癌组织中的表达明显升高。同时,PRM1对非小细胞肺癌细胞具有促进增殖作用。本研究中,我们检测了PRM1在非小细胞肺癌肿瘤组织和外周血中的表达情况,分析了PRM1蛋白水平与临床特征的相关性;并评估了PRM1在非小细胞肺癌中的诊断价值;通过过表达和敲低PRM1基因观察其对细胞增殖、凋亡及周期的影响;建立非小细胞肺癌裸鼠转移瘤模型,检测转移瘤裸鼠外周血PRM1蛋白的表达水平,观察外源性PRM1重组蛋白和PRM1抗体对裸鼠转移瘤生长的影响。旨在评估PRM1作为新的生物学标志物对非小细胞肺癌的诊断价值,研究PRM1对非小细胞肺癌细胞的促增殖作用,并对其机制作初步探讨。方法:1、收集110例非小细胞肺癌肿瘤组织、配对正常组织、术前血清和健康者血清标本,应用RT-PCR法、免疫组织化学染色法和ELISA法检测其中PRM1基因和蛋白水平,应用卡方检验统计分析患者肿瘤组织和外周血中PRM1蛋白水平与临床特点的相关性。2、评估PRM1的诊断价值,应用SPSS软件统计分析外周血中PRM1蛋白水平对非小细胞肺癌及其亚组肺腺癌、肺鳞癌的诊断价值,并与临床常用的肿瘤标志物CEA、SCC和CYFRA21-1进行比较,评估PRM1诊断价值的优劣性。3、观察细胞内PRM1表达水平对细胞增殖的影响,通过质粒构建技术及si RNA转染技术,过表达和敲低A549、NCI-H460细胞的PRM1基因,应用RTPCR和ELISA法检测细胞PRM1基因和蛋白表达水平,应用CCK8法和Ed U法检测细胞增殖情况,应用流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡情况。4、观察外源性PRM1重组蛋白和抗体对细胞增殖的影响,将人源重组PRM1蛋白和PRM1抗体加入到A549、NCI-H460细胞培养液中,应用CCK8法和Ed U法检测细胞增殖情况。5、观察细胞在不同营养状态下PRM1的表达情况,将A549、NCI-H460细胞培养于含不同浓度血清的培养液中,应用RT-PCR法和ELISA法检测细胞的PRM1基因及蛋白水平。6、观察外源性PRM1重组蛋白和抗体对动物转移瘤生长的影响,制备裸鼠转移瘤模型,将非小细胞肺癌细胞A549皮下注射到裸鼠背部偏右侧,肿瘤形成后,（1）应用ELISA法检测转移瘤裸鼠和健康裸鼠外周血PRM1蛋白水平,并分析其差异性;（2）分别经尾静脉注射人源重组PRM1蛋白、PRM1抗体及两者混合剂,每3日测量并计算肿瘤体积,绘制肿瘤生长曲线。（3）第33天于麻醉下处死裸鼠,取出肿瘤组织,测量重量并计算肿瘤体积,分析外源性PRM1重组蛋白和PRM1抗体对裸鼠转移瘤生长的影响。结果:1、非小细胞肺癌肿瘤组织中PRM1的m RNA和蛋白水平较配对正常组织明显升高。统计分析显示:随着肿瘤组织中PRM1蛋白水平的增加,肿瘤T分期越晚,淋巴结转移阳性率越高,而与病理类型、年龄、性别、脉管及神经浸润无相关性;2、非小细胞肺癌患者外周血中PRM1蛋白水平较健康者显着升高。统计分析显示,淋巴结转移阳性和临床分期较晚的患者外周血中的PRM1蛋白水平更高,而与病理类型、年龄、性别、脉管及神经浸润不相关。3、PPM1对于非小细胞具有较高的诊断价值。SPSS软件统计分析显示:（1）外周血中PRM1蛋白水平在非小细胞肺癌及其亚组肺腺癌、肺鳞癌中均具有较高的诊断价值。（2）在肺腺癌中,PRM1的诊断价值高于CEA;在肺鳞癌中,PRM1的诊断价值明显强于SCC且与CYFRA21-1相当;（3）含有PRM1的肿瘤标志物组合的诊断价值明显高于传统组合;（4）在早期的肺腺癌中,PRM1的诊断价值高于CEA;在早期肺鳞癌中,PRM1诊断价值高于SCC且不劣于CYFRA21-1。提示PRM1具有较高的非小细胞肺癌诊断价值。4、非小细胞肺癌细胞株A549和NCI-H460的PRM1 m RNA水平较人正常肺上皮细胞株BEAS-2B明显升高;同样,A549、NCI-H460细胞内和培养液中的PRM1蛋白水平较BEAS-2B细胞均显着升高。5、成功构建PRM1过表达和敲低的A549、NCI-H460细胞株模型,与对照组比较,过表达PRM1促进A549和NCI-H460细胞的增殖,而敲低PRM1则抑制细胞的增殖。6、外源性PRM1重组蛋白能够促进非小细胞肺癌A549和NCI-H460细胞的增殖,而PRM1抗体则抑制细胞增殖。7、不同营养状态下PRM1的表达存在差异。实验结果显示,随着细胞培养液中血清浓度的降低,A549和NCI-H460细胞PRM1表达水平显着增加。8、细胞周期检测结果提示,过表达PRM1使细胞周期中G0/G1期比例降低,S期细胞比例增加,肿瘤细胞增殖活跃;而敲低PRM1则使细胞周期发生G0-G1期阻滞,S期细胞比例降低,肿瘤细胞增殖受抑;细胞凋亡结果显示,敲低PRM1对A549和NCI-H460细胞的凋亡水平无显着影响。9、动物实验结果:（1）与健康对照组比较,转移瘤裸鼠外周血中PRM1蛋白水平明显升高,也证实了动物实验和体外细胞实验结果与人体组织实验结果一致。（2）外源性PRM1重组蛋白具有促进裸鼠转移瘤生长的作用,而PRM1抗体则抑制转移瘤生长。实验结果提示,与对照组比较,经尾静脉给予外源性PRM1重组蛋白的裸鼠肿瘤生长速度快,肿瘤体积大,而给予PRM1抗体的裸鼠肿瘤生长速度较慢,且肿瘤体积较小。结论:1、PRM1在非小细胞肺癌肿瘤组织和外周血中的特异性高表达,及其对非小细胞肺癌特别是早期患者的诊断价值,使其具备了成为非小细胞肺癌血清学肿瘤标志物的潜质。2、过表达和敲低PRM1基因双向验证了其对非小细胞肺癌细胞株A549和NCI-H460的促增殖作用,这种作用与增加细胞周期中S期细胞比例相关,而非抑制细胞的凋亡。3、细胞内外PRM1蛋白水平的增加均可促进细胞的增殖,提示PRM1促增殖作用可能存在多条途径,为进一步研究PRM1的作用机制提供线索。4、营养供应差时细胞PRM1的表达水平反而增加,这种负反馈调节作用在一定程度上解释非小细胞肺癌在血供不良的情况下仍快速生长的原因。5、外源性PRM1重组蛋白和抗体对裸鼠转移瘤生长的影响,进一步在生物体内验证了PRM1促进肿瘤生长的作用,同时,PRM1抗体的抑瘤作用也为其成为肿瘤治疗靶点提供直接的理论支持。
郭盛虎[3]（2021）在《LncRNA TUG1通过调节miR-221/PTEN轴提高非小细胞肺癌化疗敏感性的研究》文中研究说明第一部分 化疗敏感组和化疗抵抗组NSCLC肿瘤组织lncRNA TUG1表达情况和临床病理特征目的:研究lncRNA TUG1在非小细胞肺癌化疗敏感组和化疗抵抗组肿瘤组织中的表达情况以及lncRNA TUG1与非小细胞肺癌临床病理特征及预后的相关性方法:采用qRT-PCR法对非小细胞肺癌化疗敏感组（n=43）和化疗抵抗组（n=65）肿瘤组织中lncRNA TUG1表达水平进行检测,Kaplan-Meier法用于绘制生存曲线,log Rank法用于分析化疗敏感组和化疗抵抗组患者生存差异。结果:1.lncRNA TUG1在非小细胞肺癌化疗敏感组和化疗抵抗组肿瘤组织中的表达情况qRT-PCR检测结果显示非小细胞肺癌化疗抵抗组lncRNA TUG1表达水平较化疗敏感组显着降低（P<0.01）。2.非小细胞肺癌化疗敏感组和化疗抵抗组患者临床病理学指标与lncRNA TUG1表达水平的相关性及生存分析非小细胞肺癌lncRNA TUG1的表达水平在化疗抵抗组与既往吸烟史（P=0.014）、组织分化等级（P<0.001）以及淋巴结转移（P=0.003）显着相关。化疗敏感组较化疗抵抗组具有更长的生存时间。小结:非小细胞肺癌化疗抵抗组较化疗敏感组lncRNA TUG1表达水平显着下调,且与不良预后相关,提示其可能参与非小细胞肺癌化疗抵抗的发生。第二部分 lncRNA TUG1对非小细胞肺癌细胞生物学特性及化疗敏感性影响的研究目的:评估lncRNA TUG1对非小细胞肺癌化疗敏感性及增殖、迁移、浸润、凋亡及自噬生物学特性的影响。方法:1.细胞培养、转染及检测人非小细胞肺癌细胞系SPC-A1采用高糖培养基培养,NCI-H1650、NCI-H520、NCI-H1299采用RPMI 1640培养,人正常肺上皮细胞系16HBE采用含10%FBS的高糖培养基（含100U/m L青霉素和100mg/L链霉素）培养。采用药物浓度递增培养法诱导非小细胞肺癌耐药细胞。脂质体转染法将si-TUG1转染至SPC-A1和NCI-H520细胞构建lncRNA TUG1敲低细胞系,将pc DNA-TUG1转染至SPC-A1/DDP和NCI-H520/DDP细胞构建lncRNA TUG1过表达细胞系。qRT-PCR用于检测转染效率。2.MTT实验检测SPC-A1、NCI-H520细胞lncRNA TUG1敲低和SPC-A1/DDP、NCI-H520/DDP细胞lncRNA TUG1过表达对非小细胞肺癌化疗敏感性的影响。3.集落形成实验检测SPC-A1、NCI-H520细胞lncRNA TUG1敲低和SPC-A1/DDP、NCI-H520/DDP细胞lncRNA TUG1过表达对非小细胞肺癌细胞增殖能力的影响。4.划痕实验和Transwell实验检测SPC-A1、NCI-H520细胞lncRNA TUG1敲低和SPC-A1/DDP、NCI-H520/DDP细胞lncRNA TUG1过表达对非小细胞肺癌细胞迁移和浸润能力的影响。5.流式细胞术检测SPC-A1、NCI-H520细胞lncRNA TUG1敲低和SPC-A1/DDP、NCI-H520/DDP细胞lncRNA TUG1过表达对非小细胞肺癌细胞周期分布和细胞凋亡的影响。6.GFP-LC3融合蛋白标记法、MDC染色法和Western blot检测SPC-A1、NCI-H520细胞lncRNA TUG1敲低和SPC-A1/DDP、NCI-H520/DDP细胞lncRNA TUG1过表达对非小细胞肺癌细胞自噬能力的影响。7.裸鼠皮下移植瘤模型的构建裸鼠皮下注射过表达lncRNA TUG1的SPC-A1/DDP或NCI-H520/DDP构建移植瘤模型。8.Western blot实验检测lncRNA TUG1过表达对非小细胞肺癌异种移植瘤细胞凋亡能力的影响。9.TUNEL实验检测lncRNA TUG1过表达对非小细胞肺癌异种移植瘤细胞自噬能力的影响。结果:1.lncRNA TUG1敲低和过表达效率的验证本研究中SPC-A1和NCI-H520细胞用于构建lncRNA TUG1敲低表达模型,SPC-A1/DDP和NCI-H520/DDP细胞用于构建lncRNA TUG1过表达模型。qRT-PCR检测结果提示敲除及过表达成功,P<0.01。2.体外细胞实验结果显示lncRNA TUG1能够抑制非小细胞肺癌细胞增殖、迁移和浸润,促进细胞凋亡、自噬和衰老,且能够提高DDP治疗敏感性。3.体内实验结果显示lncRNA TUG1过表达抑制非小细胞肺癌异种移植瘤生长,促进其细胞凋亡和自噬。小结:lncRNA TUG1能够抑制非小细胞肺癌细胞增殖、迁移及浸润能力,促进非小细胞肺癌细胞凋亡和自噬,提高DDP治疗敏感性。第三部分 lncRNA TUG1通过miR-221/PTEN轴调节非小细胞肺癌化疗敏感性的机制研究目的:研究lncRNA TUG1影响非小细胞肺癌化疗敏感性的内在机制。方法:1.双荧光素酶报告实验检测lncRNA TUG1与miR-221、miR-221与PTEN之间是否存在相互作用。2.qRT-PCR检测非小细胞肺癌化疗敏感组和化疗抵抗组miR-221和PTEN表达情况;检测lncRNA TUG1敲除或过表达对miR-221表达的影响,lncRNA TUG1或miR-221敲除或过表达对PTEN表达的影响。3.集落形成实验、划痕实验、Transwell实验、流式细胞术和Western blot检测SPC-A1和NCI-H520细胞转染si-NC、si-TUG1、si-TUG1+miR-NC和si-TUG1+miR-221,SPC-A1/DDP和NCI-H520/DDP细胞转染pc DNA-NC、pc DNA-TUG1、pc DNA-NC+NC inhibitor和pc DNA-TUG1+miR-221inhibitor对非小细胞肺癌细胞增殖、迁移、浸润、凋亡和自噬能力的影响。4.集落形成实验、划痕实验、Transwell实验、流式细胞术和Western blot检测SPC-A1和NCI-H520细胞转染sh-RNA、sh-PTEN、sh-RNA+pc DNA-TUG1和sh-PTEN+pc DNA-TUG1,SPC-A1/DDP和NCI-H520/DDP细胞转染pc DNA-NC、pc DNA-PTEN、pc DNA-NC+si-TUG1和pc DNAPTEN+si-TUG1对非小细胞肺癌细胞增殖、迁移、浸润、凋亡和自噬能力的影响。结果:1.miR-221在非小细胞肺癌肿瘤组织中高表达,PTEN在非小细胞肿瘤组织中低表达。双荧光素酶报告实验证实lncRNA TUG1与miR-221、miR-221与PTEN之间存在直接作用。非小细胞肺癌中,lncRNA TUG1与miR-221表达负相关,miR-221与PTEN表达负相关;lncRNA TUG1与PTEN表达正相关。2.miR-221过表达进一步加强lncRNA TUG1下调促进非小细胞肺癌细胞增殖、迁移和浸润,抑制细胞凋亡、自噬和衰老的能力;miR-221下调进一步提高lncRNA TUG1过表达抑制非小细胞肺癌细胞增殖、迁移和浸润,促进细胞凋亡、自噬和衰老的能力。3.lncRNA TUG1过表达能够部分逆转PTEN下调促进非小细胞肺癌细胞增殖、迁移和浸润,抑制细胞凋亡、自噬和衰老的能力;lncRNA TUG1下调能够部分克服PTEN过表达抑制非小细胞肺癌细胞增殖、迁移和浸润,促进细胞凋亡、自噬和衰老的能力。小结:lncRNA TUG1通过miR-221调节PTEN表达提高非小细胞肺癌化疗敏感性。
范弘[4]（2021）在《半乳糖凝集素-1在非小细胞肺癌患者血清中的表达和临床意义》文中研究指明目的:检测非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）患者血清中半乳糖凝集素-1（galectin-1,Gal-1）的表达水平,分析其与NSCLC患者临床资料的相关性,分析Gal-1在NSCLC疾病诊断中的敏感度与特异性,评估其在临床中的辅助诊断价值,探讨Gal-1与肿瘤的发生、发展、转移的关系,为NSCLC治疗提供临床参考资料。方法:采取前瞻性研究方法,研究对象为2020年7月至2020年11月在甘肃省人民医院住院,经手术切除、纤维支气管镜、经皮肺穿刺活检术等病理学检查初次确诊为NSCLC患者,按纳入排除标准收集60例为实验组,同时收集同期在本院体检中心健康体检人群30例为对照组。分别留取两组受试者的血清样品,采用酶联免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）法测定血清中Gal-1的表达水平,分析两组间差异,进而分析Gal-1与NSCLC患者临床资料、EGFR突变状态、常见肿瘤标志物的相关性,再绘制受试者工作特征（receiver operating characteristic,ROC）曲线探讨Gal-1预测NSCLC的价值。结果:1.Gal-1在NSCLC患者血清中的表达水平明显高于健康正常人（P<0.05）;Gal-1在NSCLC中的表达水平与腺癌、临床分期Ⅲ-Ⅳ期、肿瘤最大直径>5cm、有淋巴结转移、有远处转移明显相关（P<0.05）,但与性别、年龄、吸烟史无关（P>0.05）;2.在41例肺腺癌中,Gal-1的表达水平与临床分期Ⅲ-Ⅳ期、肿瘤最大直径>5cm、有淋巴结转移、有远处转移明显相关（P<0.05）;与性别、年龄、吸烟史无关（P>0.05）;腺癌组中有16例患者接受了EGFR基因突变检测,无突变11例,突变5例,分析显示Gal-1的表达水平与肺腺癌患者EGFR基因突变无关（P>0.05）;3.在19例肺鳞癌中,Gal-1的表达水平与临床分期Ⅲ-Ⅳ期、有淋巴结转移、有远处转移明显相关（P<0.05）,与年龄、吸烟史、肿瘤最大直径无关（P>0.05）;4.Gal-1与常见NSCLC血清肿瘤标志物鳞状上皮细胞癌相关抗原（SCC）、血清癌胚抗原（CEA）和细胞角蛋白19片段抗原（CYFRA21-1）无明显相关性（r<0.3;P>0.05）;5.绘制ROC曲线,曲线下面积为0.949,95%可信区间为0.909-0.990,最大约登指数为0.767,其截断值为28.61ng/ml时,Gal-1诊断NSCLC的敏感度为90.0%,特异性为86.7%。结论:1.Gal-1在NSCLC中高表达,血清Gal-1水平与NSCLC的病理类型、临床分期、淋巴结转移、远处转移明显相关,与性别、年龄、吸烟史、EGFR基因突变、肿瘤标志物无关,可为NSCLC的辅助诊断提供新的参考指标。2.ROC曲线分析中曲线下面积为0.949,95%可信区间为0.909-0.990,血清Gal-1对于NSCLC的诊断具有较好的敏感性和特异性。
李姗姗[5]（2021）在《长链非编码RNA CAR10通过调节miR-892a/GJB2途径促进非小细胞肺癌细胞转移及侵袭的机制研究》文中认为目的肺癌已成为全世界范围内发病人数最多且死亡率很高的癌症种类。小细胞肺癌（SCLC）和非小细胞肺癌（NSCLC）是肺癌的两种主要的病理分型,其中NSCLC占肺癌总数的大多数。目前有确切证据表明,大多数肿瘤患者死于肿瘤的转移和复发,侵袭性生长和转移潜能是肿瘤高死亡率的根本原因,因此阐明NSCLC的关键侵袭转移机制,有针对性的研究NSCLC的早期诊断标志物和治疗靶标、明确其调控机制,具有重要的意义。长链非编码RNAs（lnc RNAs）的长度大于200个核苷酸,在功能上不具有编码蛋白质的能力。许多研究表明lnc RNAs参与了包括NSCLC在内的多种肿瘤的侵袭转移过程。本研究旨在明确lnc RNA染色体相关RNA 10（chromosome associated RNA 10,CAR10）通过调控GJB2来促进非小细胞肺癌的侵袭转移作用及其具体作用机制。方法1.长链非编码RNA CAR10在非小细胞肺癌中的表达及其临床意义（1）采用生物信息学分析CAR10在Gene Expression Omnibus（GEO）数据库中非小细胞肺癌相关数据集GSE19188、GSE30219和GSE118370中的表达。（2）收集50例非小细胞肺癌患者的癌及癌旁组织标本,采用皮尔森卡方检验（Pearson Chi-Square test）及Fisher精确检验分析不同CAR10表达水平与NSCLC临床特征的相关性。（3）应用RT-qPCR的方法检测CAR10在人支气管上皮细胞16HBE及NSCLC细胞系A549、H1299和H1975中的表达。2.长链非编码RNA CAR10调控GJB2促进非小细胞肺癌A549和H1299迁移及侵袭能力的实验研究（1）设计并构建特异性CAR10小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）,采用细胞转染的方式构建不同CAR10表达水平的非小细胞肺癌细胞系,并用RTq PCR的方法进行验证;采用Transwell实验检测不同CAR10表达水平细胞的迁移及侵袭能力的影响。（2）分析GEO数据库中的非小细胞肺癌相关数据集GSE19188、GSE30219和GSE118370差异表达的基因;通过Kaplan-Meier分析筛选差异表达的基因与NSCLC患者预后的相关性;免疫组织化学法检测不同分级非小细胞肺癌组织中GJB2的表达水平;应用RT-qPCR的方法检测GJB2在人支气管上皮细胞16HBE及非小细胞肺癌细胞系A549、H1299、SPCA1和H1975中的差异表达。（3）根据GSE19188、GSE30219和GSE118370数据集中CAR10和GJB2表达的read值,Spearman相关分析CAR10和GJB2表达的相关性;采用Westernblot法检测不同CAR10表达水平对非小细胞肺癌细胞系A549和H1299细胞中GJB2蛋白的表达水平的影响;用Transwell实验检测不同CAR10水平对非小细胞肺癌细胞系A549和H1299细胞的迁移及侵袭能力的影响。（4）在A549和H1299细胞中共转染CAR10过表达质粒（oeCAR10）及特异性GJB2小干扰RNA（siGJB2）,同步转染空白对照（oeCTR及siSCR）,采用Transwell实验检测改变GJB2表达水平对CAR10介导的非小细胞肺癌细胞系A549和H1299细胞的迁移及侵袭能力的影响。3.长链非编码RNA CAR10作为ceRNA调控GJB2促进A549和H1299迁移及侵袭的机制研究（1）通过在线预测网站（RegRNA 2.0,miRWalk,miRDB和Targetscan）预测可以和GJB2或者CAR10相互作用的miRNAs,选取这4个数据库中miRNAs的交集,共筛选出5种可能和CAR10及GJB2相互作用的miRNAs;分析非小细胞肺癌相关数据集GSE19945中miR-892a的表达情况;采用RT-qPCR的方法检测50例非小细胞肺癌患者的癌和癌旁组织中miR-892a的表达水平;Spearman相关分析miR-892a和GJB2表达的相关性。（2）在A549和H1299细胞中转染miR-892a的模拟物和抑制物,用RT-qPCR的方法检测构建的细胞模型中miR-892a的表达水平;采用Western-blot的方法,检测不同miR-892a表达水平的非小细胞肺癌细胞A549及H1299中GJB2蛋白的表达水平。（3）在A549细胞中共转染miR-892a的模拟物（miR-892a mimic）及GJB2过表达质粒（oe GJB2）,同步转染空白对照（NC mimic及oeCTR）,用Transwell实验检测改变GJB2表达水平对miR-892a介导的非小细胞肺癌细胞系A549细胞的迁移及侵袭能力的影响;相反地,在H1299细胞中共转染miR-892a的抑制物（miR-892a inhibitor）及特异性GJB2小干扰RNA（siGJB2）同步转染空白对照（NC inhibitor及siSCR）,用Transwell实验检测改变GJB2表达水平对miR-892a介导的非小细胞肺癌细胞系H1299细胞的迁移及侵袭能力的影响;采用Tagertscan软件在线预测miR-892a和GJB2的结合靶点,构建含有miR-892a结合位点的野生型报告质粒（GJB2-luc-WT）和含有miR-892a突变结合位点的突变型报告质粒（GJB2-luc-MUT）,将GJB2-luc-WT与miR-892a mimic及GJB2-luc-MUT与miR-892a mimic分别共转染至非小细胞肺癌细胞A549及H1299中,检测荧光素酶的活性。（4）在A549和H1299细胞中共转染CAR10过表达质粒（oeCAR10）及miR-892a模拟物（miR-892a mimics）,同步转染空白对照（oeCTR及NC mimic）,采用Western-blot的方法,检测改变miR-892a和CAR10表达水平对非小细胞肺癌细胞A549及H1299中GJB2蛋白的表达水平的影响;采用在线分析软件预测CAR10与miR-892a的结合靶点,构建含有miR-892a结合位点的野生型报告质粒（CAR10-luc-WT）和含有miR-892a突变结合位点的突变型报告质粒（CAR10-lucMUT）,将CAR10-luc-WT与miR-892a mimic及CAR10-luc-MUT与miR-892a mimic分别共转染至非小细胞肺癌细胞A549及H1299中,检测荧光素酶的活性。（5）在A549及H1299细胞中分别或共转染CAR10过表达质粒（oeCAR10）、GJB2小干扰RNA（siGJB2）、miR-892a抑制物（miR-892a inhibitor）和含有miR-892a突变位点的CAR10过表达质粒（oeCAR10-MUT）,同步转染空白对照（oeCTR）,将细胞分为oeCTR组、oeCAR10组、oeCAR10-MUT组、oeCAR10+siGJB2组及oeCAR10+siGJB2+miR-892a inhibitor组,采用Western-blot的方法,检测改变miR-892a、CAR10和GJB2表达水平对非小细胞肺癌细胞A549及H1299中GJB2蛋白的表达水平的影响;在相同分组的情况下,用Transwell实验检测改变miR-892a、CAR10和GJB2表达水平对非小细胞肺癌细胞A549及H1299细胞的迁移及侵袭能力的影响。结果1.长链非编码RNA CAR10在非小细胞肺癌中的表达及其临床意义（1）生物信息学分析显示:CAR10在Gene Expression Omnibus（GEO）数据库中非小细胞肺癌相关数据集GSE19188、GSE30219和GSE118370中癌组织的表达高于其在癌旁或正常肺组织的表达。（2）皮尔森卡方检验（Pearson Chi-Square test）及Fisher精确检验分析50例非小细胞肺癌患者的癌及癌旁组织标本显示:更高表达的CAR10与更高的病理分级（P=0.000）与更频繁的淋巴结转移（P=0.018）有关;单因素方差分析（One-way ANOVA）不同淋巴结分期患者的CAR10的表达量表明:非小细胞肺癌患者的淋巴结分期越高,患者CAR10的表达量越高;Kaplan-Meier分析发现:CAR10的高表达与患者更短的生存时间有关（P=0.014）。（3）RT-qPCR检测发现:CAR10在非小细胞肺癌细胞系（A549、H1299和H1975）中的表达明显高于其在人支气管上皮细胞16HBE的表达（P<0.001）。2.长链非编码RNA CAR10调控GJB2促进非小细胞肺癌A549和H1299迁移及侵袭能力的实验研究（1）RT-qPCR检测三种CAR10小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）在非小细胞肺癌细胞系A549、H1299中的转染效率显示:转染si CAR10-2的细胞中CAR10的表达量最低（P<0.01）;RT-qPCR检测转染si CAR10-2和CAR10过表达的质粒（oeCAR10）的非小细胞肺癌细胞系A549、H1299中CAR10的表达水平显示:细胞中CAR10的表达水平分别降低和增高（P<0.01;P<0.0001）;Transwell实验显示:下调CAR10的表达削弱了非小细胞肺癌细胞系A549、H1299细胞的迁移及侵袭能力,增加CAR10的表达促进了非小细胞肺癌细胞系A549、H1299细胞的迁移及侵袭能力（P<0.01）。（2）筛选了8个在三个数据集中都存在的差异表达的基因,分别是:COL11AL、MMP12、SPP1、KRT6A、MMP1、GJB2、SCG5和HS6ST2;明确这8个基因在GSE19188、GSE30219和GSE118370中的差异表达的倍数及Kaplan-Meier生存分析筛选差异表达的基因与NSCLC患者预后的相关性后,筛选出GJB2;免疫组织化学的方法明确了随着非小细胞肺癌患者临床分级的增加,GJB2的表达量增多（p<0.0001）;RT-qPCR的方法明确GJB2在非小细胞肺癌细胞系A549、H1299、SPCA1和H1975中的表达明显高于其在人支气管上皮细胞16HBE的表达（p<0.001）。（3）皮尔森相关分析明确了在非小细胞肺癌相关数据集GSE19188、GSE30219和GSE118370中CAR10与GJB2的表达呈正相关;Western-blot结果显示:在非小细胞肺癌细胞系A549、H1299中下调或者上调CAR10的表达可以降低或增加GJB2蛋白的表达（P<0.01）;Transwell实验表明:在非小细胞肺癌细胞系A549、H1299中,过表达CAR10后,细胞的迁移及侵袭能力增强,在过表达CAR10的同时沉默GJB2的表达,可降低过表达CAR10对细胞迁移及侵袭能力的促进作用（P<0.001）。（4）在A549和H1299细胞中共转染CAR10过表达质粒（oeCAR10）及特异性GJB2小干扰RNA（siGJB2）,同步转染空白对照（oeCTR及siSCR）,采用Transwell实验检测改变GJB2表达水平对CAR10介导的非小细胞肺癌细胞系A549和H1299细胞的迁移及侵袭能力的影响。3.长链非编码RNA CAR10作为ceRNA调控GJB2促进A549和H1299迁移及侵袭的机制研究（1）在线预测网站预测了5种可以和GJB2或者CAR10相互作用的miRNAs;分析非小细胞肺癌相关数据集GSE19945表明:miR-892a在癌组织中的表达明显低于其在正常肺组织中的表达;RT-qPCR的方法明确:miR-892a在50例非小细胞肺癌患者的癌组织中的表达明显低于其在癌旁组织中的表达;Spearman相关分析明确miR-892a和GJB2的表达呈负相关。（2）RT-qPCR明确:在非小细胞肺癌细胞系A549和H1299中转染miR-892a的模拟物（miR-892a mimics）和抑制物（miR-892a inhibitor）,细胞中的miR-892a的表达水平增高和降低（P<0.01;P<0.0001）;Western-blot的方法检测:在非小细胞肺癌细胞系A549和H1299中,上调或者下调miR-892a的表达可以降低或增加GJB2蛋白的表达（P<0.01）。（3）Transwell实验结果显示:在非小细胞肺癌细胞系A549中转染miR-892a模拟物后,细胞的迁移及侵袭能力减低,而转染miR-892a模拟物同时转染GJB2过表达质粒,过表达GJB2可以逆转过表达miR-892a对A549细胞迁移及侵袭能力的抑制作用（P<0.001）;在H1299细胞中转染miR-892a抑制物后,细胞的迁移及侵袭能力增强,而转染miR-892a抑制物同时转染GJB2小干扰RNA,下调GJB2可以逆转沉默miR-892a对A549细胞迁移及侵袭能力的促进作用（P<0.001）;双荧光素酶实验表明:在非小细胞肺癌细胞系A549、H1299中,过表达的miR-892a能够显着降低GJB2野生型质粒连接的荧光素酶的活性,而对GJB2突变型质粒连接的荧光素酶的活性却无显着影响（P<0.01）。（4）Western-blot结果显示:在非小细胞肺癌细胞系A549、H1299中转染CAR10过表达质粒后,细胞中GJB2蛋白的表达水平增高,转染CAR10过表达质粒同时转染miR-892a模拟物后,GJB2的表达比oeCAR10组的表达降低（P<0.01）;双荧光素酶实验表明:在非小细胞肺癌细胞系A549、H1299中,过表达的miR-892a能够显着降低CAR10野生型质粒连接的荧光素酶的活性,而对CAR10突变型质粒连接的荧光素酶的活性却无显着影响（P<0.01）。（5）Western-blot结果显示:在非小细胞肺癌细胞系A549、H1299中转染CAR10过表达质粒后,细胞中GJB2蛋白的表达水平增高,在转染含有miR-892a突变位点的CAR10过表达质粒（oeCAR10-MUT）后GJB2蛋白的表达水平降低;在转染siGJB2后,GJB2蛋白的表达水平降低较转染oeCAR10组的降低;在同步转染siGJB2和miR-892a抑制物后,细胞的GJB2蛋白的表达水平升高（P<0.01）;Transwell实验验证:在非小细胞肺癌A549、H1299中转染CAR10过表达质粒后,细胞的迁移侵袭能力增强;在转染含有miR-892a突变位点的CAR10过表达质粒（oeCAR10-MUT）后细胞的迁移侵袭能力减弱;在转染siGJB2后,细胞的迁移侵袭能力较转染oeCAR10组的减弱;在同步转染siGJB2和miR-892a抑制物后,细胞的迁移及侵袭能力增强（P<0.01）。结论1.CAR10在非小细胞肺癌的组织及细胞中均高表达且与患者的临床特点有关。2.高表达CAR10的非小细胞肺癌细胞系A549、H1299的迁移及侵袭能力增强;GJB2在非小细胞肺癌组织及细胞系中的表达均增高且与患者的不良预后有关;GJB2参与CAR10介导的非小细胞肺癌的迁移及侵袭作用。3.MiR-892a在非小细胞肺癌组织中低表达且与GJB2的表达呈负相关;CAR10促进GJB2诱导的侵袭转移是通过粘附miR-892a实现的。
韩秋月[6]（2021）在《SYT7对非小细胞肺癌生物学行为的影响及其机制研究》文中研究指明目的:肺癌,是当今世界最常见的恶性肿瘤。而非小细胞肺癌（Non-small Cell Lung Cancer,NSCLC）是肺癌最主要的病理类型,约占全部肺癌的80-85%。仅2018年,全世界新发肺癌就高达2,093,876例、死亡1,761,007例。尽管近年来不断改进综合治疗的方法,但患者5年总生存率仍低于20%。因此,积极寻找新的标志物和治疗靶标对于肺癌的诊断和治疗都是至关重要的。突触结合蛋白7（Synaptotagmin 7,SYT7）,最早被发现其构成了斑马鱼神经肌肉接头处神经递质释放的异步钙传感器,在整个中枢神经系统中高度表达。目前已被证实它是最主要的囊泡钙传感器之一,参与了内分泌细胞和溶酶体融合的致密核囊泡胞吐过程,并且发现其具有调节神经递质释放、胰岛素分泌等功能,与细胞的迁移及多种疾病的发展相关。然而近些年来,SYT7在肿瘤研究中特别是非小细胞肺癌中的作用仍不清楚。因此,本研究以临床样本为依托,通过生物信息学、分子生物学实验,尝试探索SYT7在非小细胞肺癌中的诊断价值和预后作用,明确SYT7对非小细胞肺癌生物学行为的影响,并进一步探讨其潜在的作用机制。为SYT7作为非小细胞肺癌患者的诊断、预后标志物和药物靶点提供理论基础。方法:1、选择来自The Cancer Genome Atlas（TCGA）和Gene Expression Omnibus（GEO）公共数据库基因表达谱,分析研究非小细胞肺癌癌与癌旁SYT7mRNA表达的差异。2、搜集17个非小细胞肺癌的GEO基因表达谱,通过meta分析,量化其表达的差异水平。3、对选取的在线数据集SYT7 mRNA的表达水平进行分析,并绘制ROC和s ROC曲线证明SYT7表达水平对于非小细胞肺癌的诊断价值。4、通过Kaplan-Meier网站分析联合的数据集中SYT7高、低表达组间患者的总生存期差异。5、在153例非小细胞肺癌患者的癌组织和50例癌旁组织中通过免疫组化方法检测SYT7的蛋白表达水平,判断SYT7蛋白在癌和癌旁表达的差异。6、收集153例非小细胞肺癌患者的临床病理参数和其中具有完整随访的97例预后信息,分析SYT7与患者临床表型和预后间的相关性。运用Cox单因素分析和Cox多因素比例风险模型分析97例完整随访信息的非小细胞肺癌患者数据,判断SYT7是否为患者预后的独立预测因子。7、通过使用siRNA和过表达质粒,分别建立敲减SYT7的A549细胞系和过表达SYT7的H1299细胞系。8、通过qRT-PCR和Western Blot实验验证SYT7敲减及过表达效率。9、在非小细胞肺癌细胞系中通过MTT法和集落形成实验,检测SYT7对细胞增殖的影响。10、在非小细胞肺癌细胞系中通过伤口愈合实验和Transwell实验,检测SYT7对细胞迁移的影响。11、在TCGA-LUNG数据集中利用R语言数据库软件计算SYT7的相关性基因,然后通过Gene ontology（GO）和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）分析,研究SYT7所涉及到生物学过程、分子功能和信号通路。12、利用Western Blot法检测敲减和过表达SYT7后分子通路的变化。13、SPSS 20.0软件行统计学分析:每组实验重复3次。T检验比较组间差异。P<0.05为差异具有统计学意义。结果:1、在GSE8569,GSE18842,GSE19188,GSE19804,GSE21933,GSE27262,GSE31210,GSE32863,GSE43458,GSE74706,GSE75037,GSE103512,GSE118370和TCGA-LUNG数据集中,SYT7 mRNA在非小细胞肺癌组织中的表达水平显着高于癌旁正常肺组织。2、在TCGA-LUAD和TCGA-LUSC数据集中,SYT7 mRNA在Ⅰ-Ⅳ期表达水平明显高于癌旁组织。3、17个GEO数据集的meta分析提示,SYT7mRNA在非小细胞肺癌组织表达高于癌旁正常组织。4、TCGA-LUNG的ROC曲线和17个GEO数据集s ROC曲线提示,SYT7 mRNA的表达对于非小细胞肺癌具有诊断价值。5、KM-plotter网站分析的多个数据集,发现SYT7高表达患者的总生存时间均显着短于低表达者。6、针对153例患者的免疫组化分析显示,SYT7在非小细胞肺癌组织中的表达水平显着高于癌旁组织。7、根据非小细胞肺癌组织中SYT7蛋白水平,将患者分为SYT7高表达组和SYT7低表达组,在患者临床样本资料中分析提示,SYT7的表达与分化程度和p T分期相关。8、患者预后资料分析提示,SYT7高表达患者的总生存均显着短于SYT7低表达患者。Cox比例风险模型证实SYT7为患者预后的独立危险因素。9、非小细胞肺癌细胞系中验证SYT7表达高低,qRT-PCR和Western Blot结果显示,SYT7在A549细胞中表达最高,在H1299细胞中表达最低。10、利用siRNA转染,建立敲减SYT7的A549细胞。使用SYT7过表达质粒,建立高表达SYT7的H1299细胞。Western Blot和qRT-PCR均显示敲减及过表达SYT7的效率良好。11、与A549-NC细胞相比,A549-Si SYT7细胞的增殖能力和迁移能力减弱。12、与H1299-Vector细胞相比,H1299-SYT7细胞的增殖和迁移能力增强。13、流式细胞仪检测发现,敲降或过表达SYT7后不能影响非小细胞肺癌的凋亡和细胞周期。14、在TCGA-LUNG中寻找SYT7共表达基因,GO分析表明SYT7可正向调节MAPK级联反应,KEGG富集分析提示SYT7可能通过调节细胞粘附、NF-kappa B信号通路和c AMP信号通路影响NSCLC。15、蛋白印记分析显示,敲减SYT7后Erk1/2和p38的磷酸化水平下降,但并不改变Erk1/2和p38的表达。而过表达SYT7后Erk1/2和p38的磷酸化水平上调,但并不影响Erk1/2和p38的表达。结论:1、SYT7高表达于非小细胞肺癌组织,其表达对于非小细胞肺癌具有诊断价值。2、SYT7与非小细胞肺癌的不良预后相关。3、SYT7促进非小细胞肺癌的增殖和迁移。4、SYT7对于非小细胞肺癌的凋亡和细胞周期无明显影响。5、在非小细胞肺癌中,SYT7可通过影响Erk1/2和p38参与调控MAPK通路。
肖旭阳[7]（2021）在《Rac3调控非小细胞肺癌细胞自噬、凋亡的分子机制及功能研究》文中认为背景:肺癌是目前全球最为常见的恶性肿瘤,在中国每年肺癌新发病例达73.33万人,占癌症新发病例总数的17.08%,死亡病例达61.02万人,占癌症死亡病例总数的21.68%。目前肺癌的治疗整体情况仍不理想,各项研究仍有待于开展。Rac家族小GTP酶3（Rac family small GTPase 3,Rac3）蛋白是一种分子量为21k D的小G蛋白,属于Rho家族中Rac家族成员,该家族被认为是细胞骨架的重要调节剂,在肿瘤及神经发育中起到重要作用。Rac3在正常神经元组织中表达较高,此外在多种肿瘤细胞,如胶质瘤、乳腺癌、肺腺癌及前列腺癌中高表达,但是,Rac3在肺癌发生发展中作用机制仍不明确。前期利用Rac3基因编辑的细胞进行RNA测序技术检测发现,Rac3可能调控黑色素瘤抗原A6（Melanoma antigen A6,MAGEA6,也被称作MAGE3B,MAGE6）。MAGEA6是黑色素瘤抗原家族的成员,该家族成员在真核生物中保守,在肿瘤中常被异常激活。MAGEA6通过抑制AMPKα调节m TORC1,调节自噬,促进肿瘤生存。Rac3是否调控MAGEA6,并且是否与肺癌发生发展有关,尚未报道,有待进一步验证。自噬是一种高度保守的生物学进程,在肿瘤中往往起到双刃剑的作用:一方面自噬可以增加肿瘤抵抗恶劣环境的能力,另外一方面自噬也可以直接导致肿瘤细胞死亡。鉴于MAGEA6对自噬相关的AMPK/mTOR通路有调控作用,暗示Rac3可能会调控自噬。但是,Rac3在非小细胞肺癌中影响自噬、凋亡的机制如何,目前国内外相关的研究较少,需要更全面和更具体的探索。研究方法:1.通过TCGA数据挖掘的方式,比较癌与正常组织中Rac3的表达,分析不同临床特征与肿瘤中Rac3表达的相关性,通过绘制Kaplan-Meier曲线及COX回归分析研究Rac3表达与总体生存之间的关系。2.在线设计sg RNA序列,构建CRISPR/cas9基因敲除质粒,敲除A549细胞中Rac3基因并构建稳定敲除细胞株。通过Rac3过表达慢病毒感染A549细胞构建稳定过表达细胞株。3.对Rac3敲除及过表达的细胞株进行RNA测序并寻找差异基因,通过差异基因韦恩图分析得到Rac3敲除及过表达后直接影响的基因,并通过实时荧光定量PCR法对这些基因进行低通量验证。4.采用EBSS饥饿法诱导自噬,利用Western Blot检测自噬相关蛋白LC3、SQSTM-1/p62,以及利用LC3双荧光慢病毒感染方法检测自噬水平。5.诱导自噬后,采用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡比例,JC-1荧光探针法检测线粒体膜电位,Western Blot检测caspase3活化,共同验证细胞凋亡的发生。6.通过Western Blot法检测差异基因MAGEA6及AMPKα的变化,并检测与自噬相关的ERK1/2通路、AKT通路和m TOR通路蛋白的变化。7.对Rac3敲除的细胞株转染MAGEA6过表达质粒逆转MAGEA6表达,Western Blot法检测LC3、活化的caspase3、AMPKα和磷酸化AMPKα,考察过表达MAGEA6能否逆转Rac3敲除引起的自噬、凋亡及通路变化。8.制备组织芯片,通过免疫组化染色,在组织水平检测Rac3、MAGEA6和另一个Rac3调控的、在A549细胞中低丰度的基因GABRA3的表达,并进一步分析该三个基因表达与临床特征及肿瘤预后间的关系。9.组织芯片通过免疫组化方式检测AMPKα和活化的caspase3,通过与Rac3、MAGEA6、GABRA3进行相关性分析,在组织水平验证Rac3通过MAGEA6影响AMPKα通路,以及GABRA3是否与AMPKα通路及活化的caspase3存在相关性。结果:1.对1145例TCGA病例进行数据挖掘,Rac3在肺癌中表达高于癌旁组织,在肺鳞癌中的表达较腺癌组织高,差异具备统计学意义。2.Rac3表达与年龄、性别、吸烟史、肿瘤在肺叶分布及T2分期之间的相关性具备统计学意义,p<0.05;与中央型肺癌、R0切除及肿瘤分期之间的相关性不具备统计学意义。3.Kaplan-Meier曲线提示非小细胞肺癌中Rac3高表达预后不良,p<0.05,具备统计学意义;在进一步的病理亚型分析中发现在鳞状细胞癌中Rac3高表达提示预后不良,p<0.05,有显着性,但是在腺癌中Rac3对生存的影响不显着,p>0.05。4.单因素的COX分析提示提示T、N、M分期及临床病理分期、肿瘤所在肺叶、肿瘤是否完全切除和Rac3的高、低表达这些因素都是影响肿瘤预后的危险因素。多因素的COX分析提示Rac3的高、低表达是影响预后的独立危险因素。5.GSEA富集分析得到Rac3上调通路25个,其中前5的包括RNA聚合、DNA复制、剪接体、细胞周期、基础转录因子等信号通路,下调通路1个,为醛固酮调节钠的重吸收通路。6.在线设计2条sg RNA,通过CRISPR/cas9技术成功构建了Rac3敲除的细胞株KO1和KO2,丢失碱基个数分别为2个和35个,Western Blot检测两细胞株Rac3均不表达。7.以log2fold Change≤-2及log2fold Change≥2作为阈值筛选,RNA-Seq结果提示敲除组与对照组相比差异表达基因88个,其中表达上调基因10个,表达下调基因78个。另外,过表达组与对照组相比差异基因160个,其中表达上调基因61个,表达下调基因99个。维恩图提示差异基因中有4个存在交集,分别为:ADAMTS2、CSRNP3、GABRA3和MAGEA6。实时荧光定量PCR进行低通量验证,证实4个基因均在Rac3被敲除时下调,而Rac3过表达时上调,差异具备统计学意义。8.与野生型A549细胞相比,在EBSS诱导自噬时,Rac3敲除的细胞株LC3-II/LC3-I比值上升、SQSTM-1/p62的水平下降,Rac3过表达细胞株的LC3-II/LC3-I比值下降,差异具备统计学意义。LC3双荧光慢病毒感染后诱导自噬,与野生型相比Rac3敲除后荧光聚集点的数量明显增多,而Rac3过表达组荧光聚集点数量降低。提示Rac3过表达抑制自噬,Rac3被敲除时促进自噬。9.Annexin V-FITC/PI流式细胞术检测提示,经诱导自噬后凋亡比例上升,对比野生型A549细胞,Rac3敲除细胞中凋亡比例更高,而Rac3过表达细胞中凋亡比例较低。JC-1荧光探针法检测线粒体膜电位反映凋亡情况,诱导自噬后凋亡显着上升,对比野生型A549细胞,Rac3敲除细胞中JC-1绿色荧光更强,而Rac3过表达细胞中则JC-1绿色荧光较弱。诱导自噬后Western Blot法检测活化的caspase3水平,与野生型A549细胞相比,Rac3敲除细胞中活化的caspase3表达更高,Rac3过表达细胞中活化的caspase3表达较低。提示Rac3敲除促进自噬诱导的凋亡,Rac3过表达抑制自噬诱导的凋亡。10.Western Blot法检测MAGEA6和自噬相关的通路蛋白发现,与野生型细胞相比Rac3敲除细胞中MAGEA6较低,AMPKα和磷酸化AMPKα水平较高,磷酸化m TOR水平较低;而Rac3过表达细胞中MAGEA6较高,AMPKα和磷酸化AMPKα表达较低,磷酸化m TOR水平较高。提示Rac3通过上调MAGEA6的表达降低AMPKα及磷酸化水平,激活m TOR通路,进而可能抑制自噬及凋亡。11.对Rac3敲除细胞株转染MAGEA6过表达质粒,Western Blot检测提示在过表达MAGEA6后,因敲除Rac3引起的LC3-II升高、caspase3的活化和AMPKα磷酸化的升高都得到逆转。12.制备芯片,经过免疫组化染色检测Rac3、MAGEA6和GABRA3在非小细胞肺癌中的表达并分析临床特征。Rac3和MAGEA6均在肿瘤中高表达,Rac3在鳞癌、大于3厘米的肿瘤、临床分期为Ⅱ-Ⅲ期、Ki67阳性的患者中表达增高,p<0.05。MAGEA6在Ⅱ-Ⅲ期患者中高表达,p<0.05。GABRA3表达在各组间均无差异。13.构建的组织芯片通过免疫组化染色检测AMPKα和活化的caspase3表达,并与Rac3、MAGEA6、AMPKα等进行相关性分析,提示在组织水平上Rac3表达与MAGEA6呈显着相关,MAGEA6表达与AMPKα呈显着相关,从组织学水平证明Rac3通过MAGEA6调控AMPKα通路。GABRA3与AMPKα及活化的caspase3不存在相关性。结论:1.Rac3在非小细胞肺癌中高表达,在正常肺组织低表达,且Rac3高表达是非小细胞肺癌预后不良的独立的生存危险因素。2.转录组学分析结果显示,在Rac3敲除后存在88个差异表达基因,其中上调10个,下调78个;Rac3过表达后存在160个差异表达基因,其中上调61个,下调99个。其中Rac3敲除及过表达都存在的差异基因有4个,分别是ADAMTS2、CSRNP3、GABRA3和MAGEA6。3.Rac3在非小细胞肺癌A549细胞系中抑制自噬,并抑制自噬诱导的凋亡。4.Rac3抑制自噬是通过上调MAGEA6实现的,上调MAGEA6导致AMPKα磷酸化降低,m TOR通路激活,进而抑制自噬及其引起的凋亡。5.组织水平上Rac3、MAGEA6都在癌组织中高表达,且以上两个基因高表达都为不良预后的危险因素。6.组织水平上Rac3与MAGEA6、GABRA3之间存在相关性,MAGEA6与AMPKα之间存在相关性,提示Rac3可能通过MAGEA6调控AMPKα通路,进而影响自噬和凋亡。
李雪[8]（2021）在《PHLDB3、P53、Bax、Bcl-2在非小细胞肺癌中的表达及临床意义》文中研究说明目的:非小细胞肺癌（NSCLC）是肺癌最常见的类型,其发病率高,预后不良,且发生发展机制错综复杂。本研究主要通过检测非小细胞肺癌组织中pleckstrin同源样结构域家族B成员3（PHLDB3）、抑癌基因P53、凋亡促进因子Bax、凋亡抑制因子Bcl-2蛋白的表达,分析其相互关系及表达意义,以探究PHLDB3在非小细胞肺癌中的作用及可能的作用机制,拟为进一步探究PHLDB3在非小细胞肺癌中的具体调控机制奠定组织学基础、为非小细胞肺癌患者治疗的靶点选择提供参考依据。方法:选取108例非小细胞肺癌病例,收集其手术切除的非小细胞肺癌组织蜡块108例,并收集部分癌组织5cm以外的正常肺组织蜡块45例作为对照。用免疫组织化学技术检测PHLDB3、P53、Bax、Bcl-2蛋白在非小细胞肺癌组织及邻近正常肺组织（对照组）中的表达情况,分析各蛋白表达与患者临床病理特征之间的关系,分析各蛋白表达之间的相互关系及各蛋白表达对非小细胞肺癌患者预后的影响。结果:1.PHLDB3、P53、Bax、Bcl-2蛋白在非小细胞肺癌组织中的表达情况:PHLDB3在非小细胞肺癌组织中的阳性率为69.4%,在对照组中的阳性率为26.7%;P53在非小细胞肺癌组织中的阳性率为36.1%,在对照组中的阳性率为0.0%;Bax在非小细胞肺癌组织中的阳性率为38.9%,在对照组中的阳性率为80.0%;Bcl-2在非小细胞肺癌组织中的阳性率为82.4%,在对照组中的阳性率为26.7%。与对照组相比,在非小细胞肺癌组织中,PHLDB3表达更高,P53表达更高,Bax表达更低,Bcl-2表达更高（P<0.05）。2.非小细胞肺癌组织中,PHLDB3、P53、Bax、Bcl-2蛋白表达与患者临床病理特征之间的关系:PHLDB3表达与非小细胞肺癌患者的年龄、性别、肿瘤最大径、分化程度、TNM分期及淋巴结转移有关:年龄>60岁、男性、肿瘤最大径>3cm、分化程度为中/低分化、TNM分期为Ⅲ和Ⅳ期或伴淋巴结转移者,PHLDB3阳性率更高;P53表达与非小细胞肺癌患者的肿瘤最大径、吸烟史、分化程度及TNM分期有关:肿瘤最大径>3cm、有吸烟史、分化程度为中/低分化或TNM分期为Ⅲ和Ⅳ期者,P53阳性率更高;Bax表达与非小细胞肺癌患者的分化程度及淋巴结转移有关:分化程度为高分化或未见淋巴结转移者,Bax阳性率更高;Bcl-2表达与非小细胞肺癌患者的TNM分期及淋巴结转移有关:TNM分期为Ⅲ和Ⅳ期或伴淋巴结转移者,Bcl-2阳性率更高（P<0.05）。3.在非小细胞肺癌组织中,PHLDB3、P53、Bax、Bcl-2蛋白表达之间的相互关系:PHLDB3的表达与P53的表达呈正相关关系（r=0.258,P=0.007）、与Bax的表达呈负相关关系（r=-0.477,P<0.001）、与Bcl-2的表达呈正相关关系（r=0.650,P<0.001）;P53的表达与Bcl-2的表达呈正相关关系（r=0.339,P<0.001）;Bax的表达与Bcl-2的表达呈负相关关系（r=-0.509,P<0.001）。Bax在P53（+）PHLDB3（+）组及P53（-）PHLDB3（+）组的表达均显着低于其在P53（-）PHLDB3（-）组的表达（P<0.05）,而其在P53（+）PHLDB3（+）组的表达与其在P53（-）PHLDB3（+）组的表达差异无统计学意义（P>0.05）。Bcl-2在P53（+）PHLDB3（+）组及P53（-）PHLDB3（+）组的表达均显着高于其在P53（-）PHLDB3（-）组的表达（P<0.05）,而其在P53（+）PHLDB3（+）组的表达与其在P53（-）PHLDB3（+）组的表达差异无统计学意义（P>0.05）。4.PHLDB3、P53、Bax、Bcl-2蛋白表达与非小细胞肺癌患者预后的关系:在非小细胞肺癌中,PHLDB3阳性患者的总生存时间较PHLDB3阴性患者的生存时间短;P53阳性患者的总生存时间较P53阴性患者的生存时间短;Bcl-2阳性患者的总生存时间较Bcl-2阴性患者的生存时间短（P<0.05）。PHLDB3、P53、Bcl-2均是影响患者预后的因素。P53（+）PHLDB3（+）组及P53（-）PHLDB3（+）组患者的总生存时间均显着低于P53（-）PHLDB3（-）组患者的总生存时间（P<0.05）,而P53（+）PHLDB3（+）组患者的总生存时间与P53（-）PHLDB3（+）组患者的总生存时间相比差异无统计学意义（P>0.05）。5.单因素及多因素分析:PHLDB3和TNM分期是影响非小细胞肺癌患者预后的独立因素（P<0.05）。结论:1.PHLDB3、P53、Bax、Bcl-2可能参与非小细胞肺癌的发生发展;PHLDB3阳性提示非小细胞肺癌患者预后不良,PHLDB3可能是影响非小细胞肺癌患者预后的独立因素。2.在非小细胞肺癌组织中,PHLDB3表达与Bax表达成负相关、而与Bcl-2表达成正相关;P53表达与Bcl-2表达成正相关;PHLDB3、P53可能参与细胞的凋亡过程,从而影响非小细胞肺癌的发生发展。3.PHLDB3在非小细胞肺癌组织中的表达与P53有关,P53的突变可能导致PHLDB3的表达增加,P53可能是PHLDB3的上游调节因子之一。
胡峰[9]（2020）在《非小细胞肺癌中TIGIT在CD8+T细胞的表达及作用机制研究》文中提出在肿瘤微环境中肿瘤抗原的持续刺激下,CD8+T细胞会进入机能缺陷或衰竭状态,从而不能有效地阻止癌症的进展。肿瘤细胞表面上调的抑制性配体PD-L1与CD8+T细胞上PD-1的相互作用是介导T细胞衰竭的机制之一;阻断PD-1/PD-L1通路的药物在癌症患者中效果显着。然而,在大部分癌症类型中,只有小部分患者（20～30%）对anti-PD-1/PD-L1免疫治疗产生应答,非应答者一般经历体内T细胞功能短暂激活后疾病继续进展,这可能是因为阻断PD-1通路难以逆转表观遗传修饰上稳定的衰竭型T细胞的命运,提示还有其它机制与PD-1通路协同地调节T细胞衰竭。由于免疫检查点分子可以协同地介导免疫抑制和促进T细胞衰竭,所以需要找出与PD-1通路协同调节T细胞衰竭的免疫检查点分子并尝试通过联合用药（同时阻断不同的通路）来进一步增强效应细胞杀伤癌细胞的活性以改善肿瘤免疫治疗的疗效。TIGIT（具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体）,是对T细胞功能起负调控作用的免疫检查点分子之一,它过表达于多种癌症中,因此我们认为它可能是一个肿瘤免疫治疗的潜在靶点。在本课题研究中,我们研究了TIGIT在非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）患者循环血和肿瘤微环境中CD8+T细胞的表达,及其对抗肿瘤免疫应答的调控。并进一步探究了anti-TIGIT+anti-PD-1联合用药对于肿瘤治疗的改善作用,以期为非小细胞肺癌的临床治疗提供一些借鉴性的理论依据。我们发现,NSCLC患者外周血中CD8+T细胞上的TIGIT以及TIGIT和PD-1的共表达水平均高于健康对照。在NSCLC患者的肿瘤中,TIGIT和PD-1均高表达于CD8+T细胞表面。这些结果表明,在NSCLC患者的肿瘤微环境中,TIGIT和PD-1信号通路可能共同通过调节CD8+T细胞来调控T细胞介导的抗肿瘤免疫。进一步研究证实,TIGIT缺陷（基因敲除或anti-TIGIT抗体治疗）可抑制小鼠肺肿瘤的进展。然后,我们利用LLC小鼠模型来研究TIGIT分子产生免疫抑制的机制:TIGIT随着CD8+T细胞向肿瘤浸润或扩增而上调,在第12天达到最高点后下降,并与PD-1共表达;通过对比野生型小鼠和TIGIT基因敲除小鼠的表型,我们发现TIGIT缺陷可显着提高肿瘤浸润的CD8+T细胞的数量和效应功能,并抑制T细胞衰竭的进程。在LLC小鼠肿瘤模型中,anti-TIGIT和anti-PD-1联合治疗相比于单药治疗可更显着地抑制肿瘤生长。我们对比分析发现,anti-TIGIT+anti-PD-1治疗的小鼠中肿瘤抗原特异性CD8+TIL浸润水平增加且具有更强的细胞因子分泌水平,同时显着下调肿瘤微环境中Treg细胞的功能表型。第一部分TIGIT在非小细胞肺癌患者中的表达目的:探究TIGIT在非小细胞肺癌患者外周血和肿瘤微环境中的表达情况,为后续研究奠定基础。方法:采用流式细胞分析术检测NSCLC患者外周血和肿瘤微环境中CD8+T细胞表面免疫检查点分子TIGIT的表达,并进一步明确PD-1在TIGIT+CD8+T细胞上的水平。利用免疫荧光染色确定TIGIT在NSCLC患者中表达的细胞类型。结果:NSCLC患者外周血中CD8+T细胞上的TIGIT以及TIGIT和PD-1的共表达水平均高于健康对照。患者肿瘤组织中,TIGIT高表达于CD8+T细胞表面,并且PD-1高表达于TIGIT+CD8+T细胞。结论:在NSCLC患者体内TIGIT和PD-1在CD8+T细胞上共同高表达,预示着TIGIT和PD-1信号通路可能共同调节CD8+T细胞介导的抗肿瘤免疫。第二部分TIGIT抑制肺肿瘤免疫反应的机制研究目的:旨在探究TIGIT对肺肿瘤进展的影响,以及TIGIT通过调控CD8+T细胞功能进而影响肿瘤免疫的机制。方法:在TIGIT敲除小鼠和野生型小鼠上分别建立LLC皮下移植肺肿瘤模型,确定TIGIT在小鼠抗肿瘤免疫中的作用。采用流式分析术和免疫荧光染色确定TIGIT分子在肿瘤微环境中表达的细胞类型。同时在LLC小鼠模型中确定PD-1+TIGITCD8+T细胞的作用,以及TIGIT对CD8+T细胞功能的影响。结果:TIGIT缺失或阻断TIGIT对小鼠肺肿瘤生长具有抑制作用。进一步的流式分析表明PD-1+TIGIT-CD8+T细胞是肿瘤微环境中主要的活化细胞毒性淋巴细胞群。阻断TIGIT信号通路可以增强CD8+T细胞的活性。结论:TIGIT可能促进活化的CD8+T细胞向衰竭型T细胞转变,从而抑制肿瘤内CD8+T细胞的增殖和效应功能,使它们不能有效地清除机体内的肿瘤细胞,造成肿瘤进展。第三部分anti-TIGIT与anti-PD-1联合治疗的抑癌效果目的:探讨anti-TIGIT与anti-PD-1联合治疗对肺肿瘤的治疗效果,为肿瘤的抗体药物治疗提供新的思路。方法:在小鼠上建立LLC皮下移植肿瘤模型,然后分别用对照抗体,anti-PD-1,anti-TIGIT和anti-PD-1+anti-TIGIT治疗小鼠,观察肿瘤生长情况。采用流式细胞分析术检测LLC肿瘤模型中肿瘤微环境中浸润的CD8+T和调节性T细胞比例,并进一步探讨不同治疗组CD8+T细胞的功能差异和调节性T细胞的表型改变。结果:anti-TIGIT或anti-PD-1的单一用药可以显着抑制小鼠肺肿瘤生长,而anti-TIGIT和anti-PD-1联合治疗的作用较单一治疗更加明显。并且,anti-TIGIT与anti-PD-1联合治疗可以有效促进肿瘤组织中CD8+T细胞浸润,并且增加CD8+T细胞IFN-γ的分泌。另外,anti-TIGIT与anti-PD-1联合治疗可以降低调节性T细胞表面TIGIT的表达。结论:在LLC小鼠肿瘤模型中,anti-TIGIT和anti-PD-1联合治疗相比于单药治疗可更显着地抑制肿瘤生长。anti-TIGIT和anti-PD-1联合治疗可进一步提高CD8+T细胞的肿瘤浸润和效应功能,并且潜在抑制调节性T细胞的功能。因此,在临床应用中,anti-TIGIT和anti-PD-1联合用药有望进一步改善目前anti-PD-1免疫治疗的疗效。
程丽芳[10]（2020）在《GBP1通过PGK1激活EMT通路进而促进非小细胞肺癌厄洛替尼耐药的功能和机制研究》文中进行了进一步梳理研究背景肺癌是我国发病率最高的恶性肿瘤,虽然治疗方法多样,但其死亡率仍然居高不下。非小细胞肺癌是肺癌的主要病理类型。厄洛替尼是一种表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（epithelial growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor,EGFR-TKI）,它作为一个晚期EGFR驱动基因阳性非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）患者一线治疗的首选药物,其使用明显提升此类患者的临床结局。但经历约10月的中位无进展生存期（progression-free survival,PFS）后,EGFR-TKI耐药不可避免成为临床常见的难题之一。至今,已提出MET扩增、ERBB2扩增、K-RAS突变或PTEN缺失等多种机制参与EGFR-TKI耐药,但仍有一些机制不明。因此,进一步探讨厄洛替尼耐药是需要解决的重要问题。本研究通过Gene expression omnibus（GEO）数据库预测了鸟苷酸结合蛋白1（guanylate binding proteinl,GBP1）可能是一个与厄洛替尼耐药相关的癌基因。通过单因素和多因素回归分析确认GBP1与NSCLC患者预后差相关。接着我们通过逐级增加厄洛替尼浓度增加而建立厄洛替尼耐药株,并使用这些细胞分析沉默或过表达GBP1和厄洛替尼耐药的关系,从而确认GBP1参与厄洛替尼耐药。为了探索GBP1在厄洛替尼耐药中具体作用机制,我们进行免疫共沉淀实验和免疫荧光共定位实验分析GBP1和磷酸甘油激酶1（phosphoglycerol kinase 1,PGK1）是否存在互作关系。最后,我们探索PGK1参与厄洛替尼耐药的下游信号通路,通过回复和免疫组化（IHC）实验证实GBP1通过PGK1激活上皮间质转化（epithelial mesenchymal transition,EMT）通路进而促进非小细胞肺癌厄洛替尼耐药。研究目的1,体内、体外实验探讨GBP1是否参与非小细胞肺癌厄洛替尼耐药。2,探讨GBP1参与调控非小细胞肺癌厄洛替尼耐药的分子机制。3,探讨GBP1表达与非小细胞肺癌患者生存、临床特征的关系。研究方法第一部分体外研究1 GBP1参与厄洛替尼耐药的实验1.1细胞毒性实验（CCK-8）比较EGFR-TKI耐药细胞和敏感细胞的半数抑菌浓度（IC50）。1.2荧光定量PCR实验（qRT-PCR）比较EGFR-TKI耐药细胞和敏感细胞GBP1基因的mRNA水平。1.3 Mann-Whitney检测GBP1的mRNA水平与厄洛替尼耐药的相关性。1.4 T790M位点突变检测试剂盒检测耐药细胞是否存在T790M位点突变。1.5利用单因素和多因素Cox回归分析非小细胞肺癌总生存时间和临床特征的关系。2体外研究表明GBP1参与厄洛替尼耐药的实验2.1 CCK-8实验比较沉默或过表达GBP1与对照组间的IC50值。2.2蛋白质免疫印迹实验（WB）比较沉默或过表达GBP1与对照组间GBP1的蛋白表达2.3 qRT-PCR实验比较沉默或过表达GBP1与对照组间GBP1的mRNA水平。2.4 免疫荧光试验探讨与 PC9ER-NC+erlotinib 组比较,PC9ER-shGBP1+erlotinib组GBP1、PCNA荧光值变化。2.5 CCK-8实验分析不同浓度厄洛替尼作用下,PC9ER-shGBP1+erlotinib组与PC9ER--NC+erlotinib 组间的 IC50值。2.6流式凋亡实验比较沉默或过表达GBP1与对照组间的晚期凋亡细胞占比。2.7WB实验检测与对照组比较,沉默或过表达GBP1组凋亡标志物Bax、Bcl-2和cleaved PARP1蛋白表达变化。2.8流式细胞周期实验比较沉默或过表达GBP1与对照组间的G1期占比。2.9 WB实验检测与对照组比较,沉默或过表达GBP1组细胞周期标志物P21、Cyclin D1、CDK4和CDK6蛋白表达变化。第二部分体内研究1体内研究过表达GBP1实验1.1 裸鼠成瘤实验比较 PC9ER-NC+erlotinib 组和 PC9ER-shGBP1+erlotinib 组间的移植瘤大小、重量。1.2 裸鼠成瘤实验比较 PC9-NC+PBS 组、PC9-NC+erlotinib 组、PC9-GBP1+PBS组、PC9-GBP1+erlotinib组的移植瘤大小、重量。1.3 IHC实验检测小鼠肿块GBP 1、PCNA以及凋亡蛋白的表达。2体内研究过表达GBP1组GBP1的WB和qRT-PCR实验2.1 qRT-PCR 实验检测小鼠肿块 PC9-NC+erlotinib 组与 PC9-GBP1+erlotinib 组间GBP1的mRNA水平。2.2 WB 实验检测小鼠肿块 PC9-NC+erlotinib 组与 PC9-GBP1+erlotinib 组间 GBP 1蛋白表达变化。2.3 IHC实验检测小鼠肿块PC9-NC+erlotinib组与 PC9-GBP1+erlotinib组间 P21、Cyclin D1蛋白的蛋白表达变化。第三部分 机制探讨1 GBP1和PGK1互作的实验1.1 质谱分析预测GBP1可能互作的蛋白。1.2 免疫共沉淀实验分析GBP1和PGK1的互作关系。1.3 免疫荧光实验检测GBP1和PGK1共定位关系。1.4 WB实验分析GBP1和PGK1的蛋白调控关系。2 GBP1通过PGK1诱导的EMT通路参与厄洛替尼耐药的实验2.1 WB实验检测与对照组比较,耐药细胞沉默GBP1组、耐药细胞沉默GBP1同时过表达GBP1组EMT相关蛋白的表达变化。2.2 CCK-8实验检测耐药细胞沉默PGK1组与对照组间的IC50值。2.3 qRT-PCR实验检测耐药细胞与敏感细胞间E-cadherin的mRNA水平。2.4 CCK-8实验检测耐药细胞沉默E-cadherin组与对照组间的IC50值。2.5 WB实验分析PGK1和Twist的关系。2.6 IHC 实验分析了小鼠肿块 PC9-NC+erlotinib 组与 PC9-GBP1+erlotinib 组间的EMT相关蛋白的表达变化。第四部分 临床意义非小细胞肺癌中高表达GBP1与预后、临床数据的关系分析1 Kaplan-Meier生存分析GBP1和PGK1表达水平与总生存时间的关系。2 cBioportal数据库分析GBP1的mRNA水平与PGK1的mRNA水平的相关性。3 Oncomine数据分析非小细胞肺癌GBP1表达与临床数据的相关性。研究结果第一部分GBP1在非小细胞肺癌厄洛替尼耐药细胞中的表达及意义1 GBP1参与厄洛替尼耐药1.1与敏感细胞株相比,厄洛替尼在耐药细胞株PC9ER、PC9ER1、PC9ER2、HCC827ER、NCIH1650、NCIH1975 的 IC50值升高。1.2 与敏感细胞株相比,PC9ER、PC9ER1、PC9ER2、HCC827ER、NCIH1650、NCIH1975中GBP1的mRNA水平升高。1.3 Mann-Whitney检验发现高表达的GBP1与厄洛替尼耐药性增强相关。1.4 PC9ER 及 HCC827ER 中未发现 T790M 突变。1.5单因素分析与多因素分析结果表明,与总生存时间相关的因素是治疗后肿瘤情况、GBP1表达水平。2体外研究表明GBP1调控厄洛替尼耐药2.1与对照组相比,耐药细胞沉默GBP1组GBP1蛋白表达减低。2.2与对照组相比,耐药细胞沉默GBP1组GBP1的mRNA水平减低。2.3与对照组相比,耐药细胞沉默GBP1组的IC50值减低。2.4 与 PC9ER-NC+erlotinib 组比较,GBP1、PCNA 在 PC9ER-shGBP1+erlotinib组有弱的荧光值。2.5在相同浓度的厄洛替尼作用下,与PC9ER-NC+erlotinib组比较,PC9ER-shGBP 1+erlotinib组的细胞存活率减低。2.6与对照组比较,耐药细胞沉默GBP1组的晚期凋亡细胞占比增高。2.7与对照组比较,耐药细胞沉默GBP1时Bcl-2和PCNA的蛋白表达减低,Bax和cleaved PARP1的蛋白表达增高。2.8与对照组比较,耐药细胞沉默GBP1组的G1期占比增高。2.9与对照组比较,耐药细胞沉默GBP1组的P21蛋白表达增高,Cycilin D1、CDK4和CDK6的蛋白表达减低。以上结果表明GBP1在厄洛替尼耐药细胞高表达,且提升的GBP1通过促进凋亡,增加细胞G1期比例调控厄洛替尼耐药。第二部分体内研究表明GBP1参与厄洛替尼耐药1过表达GBP1促进厄洛替尼耐药性1.1 与 PC9ER-NC+erlotinib 组比较,PC9ER-shGBP1+erlotinib 组的裸鼠移植瘤体积及重量均减少。1.2与PC9-NC+erlotinib组比较,PC9-GBP1+erlotinib组的裸鼠移植瘤体积及重量均减少。1.3 与 PC9-NC+erlotinib 组比较,PC9-GBP1+erlotinib 组的 GBP1、PCNA 和 Bcl-2蛋白表达升高,而cleaved PARP1蛋白表达减低。2过表达GBP1减少细胞周期G1期占比2.1 裸鼠肿块中与 PC9-NC+erlotinib 组比较,PC9-GBP1+erlotinib 组 GBP1 的mRNA水平升高。2.2 裸鼠肿块中与 PC9-NC+erlotinib 组比较,PC9-GBP1+erlotinib 组 GBP1 蛋白表达升高。2.3 裸鼠肿块中与 PC9-NC+erlotinib 组比较,PC9-GBP1+erlotinib 组 P21 蛋白表达减低,Cyclin D1蛋白表达增高。以上结果表明在体内研究中,过表达GBP1增加厄洛替尼耐药性,减少细胞G1期比例。第三部分GBP1和PGK1互作促进厄洛替尼耐药1 GBP1和PGK1之间存在互作1.1质谱分析预测GBP1可能互作的蛋白有MYL9、ANXA2、ALDOA、PGK1等。1.2免疫共沉淀实验（CoIP）确认GBP1和PGK1的互作关系。1.3免疫荧光实验确认GBP1和PGK1的共定位关系。1.4 GBP1在蛋白水平调控PGK1蛋白表达。2 GBP1通过PGK1诱导的EMT通路参与厄洛替尼耐药2.1耐药细胞沉默GBP1同时过表达GBP1,能回复耐药细胞沉默GBP1对EMT相关蛋白的影响。2.2耐药细胞沉默PGK1组与对照组比较,IC50值减低。2.3耐药细胞与敏感细胞相比,E-cadherin的mRNA水平减低。2.4耐药细胞沉默E-cadherin组与对照组比较,IC50值增高。2.5 PGK1促进Twist蛋白表达。2.6 裸鼠肿块中与 PC9-NC+erlotinib 组比较,PC9-GBP1+erlotinib 组 PGK1、N-cadherin和Vimentin蛋白表达增高,而E-cadherin蛋白表达减低。以上结果表明GBP1通过PGK1激活的EMT通路调控厄洛替尼耐药。第四部分GBP1表达与患者预后、病理分级的关系非小细胞肺癌中高表达GBP1与差的预后、高的肿瘤分级相关1高表达GBP1、PGK1的患者总生存时间和首次进展时间缩短。2 GBP1的mRNA水平与PGK1的mRNA水平呈正相关。3非小细胞肺癌患者的病理分级与GBP1表达呈显着正相关。以上结果表明GBP1的高表达提示非小细胞肺癌患者差的预后、高的病理分级。研究结论本研究发现在非小细胞肺癌厄洛替尼耐药细胞株中,GBP1无论蛋白表达还是mRNA水平均明显提高。而且GBP1水平提高使厄洛替尼敏感细胞在体内及体外获得对厄洛替尼的耐药性。同时上调的GBP1能减少凋亡相关蛋白的表达,并诱导细胞G1期向S期转换。GBP1和PGK1互作且通过EMT信号通路参与厄洛替尼耐药调控。利用癌症基因组图谱（TCGA）数据库发现高表达GBP1提示总生存时间和首次进展时间缩短。总之,我们利用细胞株、动物模型和临床样本证明GBP1表达变化调控厄洛替尼耐药,提示在非小细胞肺癌厄洛替尼耐药中靶向GBP1可能是一个潜在的治疗干预靶点。
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 肺癌的概述 |
| 1.1.1 肺癌简介 |
| 1.1.2 小细胞肺癌与非小细胞肺癌的区别 |
| 1.2 肺癌多组学研究进展 |
| 1.2.1 肺癌蛋白质组研究 |
| 1.2.2 肺癌转录组研究 |
| 1.3 膜联蛋白A1的作用 |
| 1.3.1 膜联蛋白A1与细胞增殖 |
| 1.3.2 膜联蛋白A1与细胞凋亡 |
| 1.3.3 膜联蛋白A1与细胞转移 |
| 1.4 研究目的、内容与意义 |
| 第二章 非小细胞肺癌和小细胞肺癌细胞系蛋白质组学与转录组学联合分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与仪器 |
| 2.2.1 实验试剂与耗材 |
| 2.2.2 主要仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞培养 |
| 2.3.2 蛋白质提取和胰蛋白酶消化 |
| 2.3.3 LC-MS/MS分析 |
| 2.3.4 数据库搜索和label-free定量 |
| 2.3.5 转录组芯片数据和差异分析 |
| 2.3.6 差异基因的确定和层次聚类分析 |
| 2.3.7 GO与KEGG通路分析 |
| 2.3.8 蛋白质网络互作建立和关键蛋白质分析 |
| 2.3.9 MCODE和Reactome富集选择核心蛋白 |
| 2.3.10 皮尔逊线性回归的相关分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 肺癌细胞中蛋白质的鉴定 |
| 2.4.2 非小细胞肺癌和小细胞肺癌细胞中蛋白质的表达差异 |
| 2.4.3 差异表达蛋白质的GO分析与KEGG通路分析 |
| 2.4.4 蛋白质相互作用网络分析与核心蛋白选择 |
| 2.4.5 结合蛋白质组学和转录组学方法测定关键蛋白 |
| 2.4.6 Reactome富集分析 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 非小细胞肺癌与小细胞肺癌临床样本转录组学分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 转录组数据、临床信息下载和差异分析 |
| 3.2.2 差异基因的确定、层次聚类分析、主成分分析与生存分析 |
| 3.2.3 GO分析 |
| 3.2.4 蛋白质网络互作建立和关键蛋白质分析 |
| 3.2.5 皮尔逊线性回归的相关分析 |
| 3.2.6 小细胞肺癌miRNA数据下载与处理 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 肺癌病人转录组表达差异分析 |
| 3.3.2 肺癌病人转录组生存分析 |
| 3.3.3 小细胞肺癌ANXA1相关蛋白的相互作用与关键蛋白的GO分析 |
| 3.3.4 小细胞肺癌miRNA结果 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 ANXA1在小细胞肺癌中的功能研究及药物筛选 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验试剂与仪器 |
| 4.2.1 实验试剂与耗材 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 细胞培养 |
| 4.3.2 肺癌细胞系中ANXA1敲低验证 |
| 4.3.3 过表达质粒载体设计及构建 |
| 4.3.4 过表达细胞系的建立 |
| 4.3.5 ANXA1相关药物筛选 |
| 4.3.6 药物浓度筛选 |
| 4.3.7 Western Blot实验方法 |
| 4.3.8 台盼蓝染色计数细胞死亡 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 肺癌细胞中ANXA1的敲除 |
| 4.4.2 肺癌细胞系中ANXA1过表达质粒载体构建 |
| 4.4.3 构建ANXA1过表达肺癌细胞株 |
| 4.4.4 ANXA1表达相关药物的筛选及药物敏感性检测 |
| 4.4.5 obatoclax对于过表达ANXA1肺癌细胞的影响 |
| 4.5 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录一 |
| 附录二 |
| 攻读硕士学位期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 肺癌的研究进展 |
| 1.1.1 肺癌的分类 |
| 1.1.2 非小细胞肺癌的诊断 |
| 1.1.3 非小细胞肺癌的治疗 |
| 1.2 肿瘤-睾丸抗原(CTA)的研究进展 |
| 1.2.1 CTA分类及特征 |
| 1.2.2 CTA表达调控 |
| 1.2.3 CTA作用和功能 |
| 1.2.4 配子发生与恶性生殖 |
| 1.2.5 CTA在恶性肿瘤中的诊断价值 |
| 1.2.6 肿瘤疫苗和免疫治疗 |
| 1.3 人鱼精蛋白1(PRM1) |
| 1.3.1 PRM1 的作用 |
| 1.3.2 PRM1 与恶性肿瘤 |
| 第2章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验设备和试剂 |
| 2.1.1 实验设备 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验细胞和动物 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 临床样本的收集 |
| 2.2.2 RT-PCTR法检测样本mRNA水平 |
| 2.2.3 免疫组织化学染色(IHC) |
| 2.2.4 酶联免疫吸附实验(ELISA) |
| 2.2.5 细胞株复苏与培养 |
| 2.2.6 非小细胞肺癌细胞株活力检测 |
| 2.2.7 非小细胞肺癌细胞在不同血清浓度下孵育 |
| 2.2.8 质粒转染和RNA干扰 |
| 2.2.9 人源重组PRM1 蛋白孵育实验 |
| 2.2.10 CCK8 法检测细胞增殖 |
| 2.2.11 EdU法检测细胞增殖实验 |
| 2.2.12 动物实验 |
| 2.3 统计学方法 |
| 第3章 结果 |
| 3.1 PRM1 在非小细胞肺癌肿瘤组织和外周血中的表达 |
| 3.1.1 非小细胞肺癌肿瘤组织与配对正常组织PRM1-mRNA水平的差异 |
| 3.1.2 非小细胞肺癌肿瘤组织中PRM1 蛋白水平及临床相关性 |
| 3.1.3 非小细胞肺癌患者外周血中PRM1 蛋白水平及与临床特征的相关性 |
| 3.2 PRM1 诊断价值的评估 |
| 3.2.1 外周血PRM1 蛋白水平对非小细胞肺癌的诊断价值 |
| 3.2.2 PRM1 在肺腺癌中诊断价值的评估 |
| 3.2.3 PRM1 在肺鳞癌中诊断价值的评估 |
| 3.2.4 PRM1 在组合标志物中诊断价值的评估 |
| 3.2.5 PRM1 对不同分期的非小细胞肺癌的诊断价值评估 |
| 3.2.6 PRM1 在Ⅰ-Ⅱ期肺鳞癌和肺腺癌中的诊断价值 |
| 3.3 PRM1 在非小细胞肺癌中生物学作用的研究-细胞学实验 |
| 3.3.1 PRM1 在非小细胞肺癌细胞株中的表达 |
| 3.3.2 PRM1 基因过表达和敲低对非小细胞肺癌细胞株增殖的影响 |
| 3.3.3 外源性PRM1 重组蛋白和PRM1 抗体对非小细胞肺癌细胞增殖的影响 |
| 3.3.4 细胞营养状态对PRM1 表达水平的影响 |
| 3.3.5 PRM1对A549、NCI-H460 细胞的细胞周期和凋亡的影响 |
| 3.4 PRM1 在非小细胞肺癌中生物学作用研究-动物学实验 |
| 3.4.1 构建A549 细胞裸鼠转移瘤模型 |
| 3.4.2 非小细胞肺癌细胞A549 转移瘤裸鼠血清中PRM1 表达水平 |
| 3.4.3 外源性PRM1 重组蛋白和PRM1 抗体对肿瘤生长曲线的影响 |
| 3.4.4 外源性PRM1 重组蛋白和PRM1 抗体对肿瘤体积和重量的影响 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 化疗敏感组和化疗抵抗组NSCLC肿瘤组织lncRNA TUG1表达情况和临床病理特征 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 lncRNA TUG1对非小细胞肺癌细胞生物学特性及化疗敏感性影响的研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 lncRNA TUG1通过miR-221/PTEN轴调节非小细胞肺癌化疗敏感性的机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 TUG1:肿瘤发生发展中的重要lncRNA |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词 |
| 前言 |
| 实验研究 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结语 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 半乳糖凝集素-1 在肺癌中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在校期间研究成果 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词? |
| 第一部分:长链非编码RNA CAR10 在非小细胞肺癌的表达及其临床意义 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分:长链非编码RNA CAR10调控GJB2促进非小细胞肺癌A549和H1299迁移及侵袭能力的实验研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分:长链非编码RNA CAR10作为ceRNA调控GJB2促进A549和H1299迁移及侵袭的机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 本研究创新性自我评价? |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述 环状RNA在非小细胞肺癌中作用的研究进展 |
| 参考文献 |
| 在学期间科研成绩 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分:SYT7在非小细胞肺癌组织中的表达水平及其预后价值 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂和设备 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 在线数据集的下载及预处理 |
| 2.2.2 在线数据集的表达和生存分析 |
| 2.2.3 GEO数据集的meta分析 |
| 2.2.4 在线数据集ROC曲线及sROC曲线分析 |
| 2.2.5 临床病例的入选与排除 |
| 2.2.6 免疫组化染色 |
| 2.2.7 免疫组化评估 |
| 2.2.8 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 生物信息学分析发现SYT7mRNA升高预后不良 |
| 3.1.1 SYT7mRNA在人类泛癌组织中表达的水平 |
| 3.1.2 SYT7mRNA在非小细胞肺癌中表达上调 |
| 3.1.3 基于GEO数据集SYT7表达水平的meta分析 |
| 3.1.4 公共数据集中SYT7表达水平对于非小细胞肺癌的诊断价值 |
| 3.1.5 SYT7在非小细胞肺癌中高表达生存时间短 |
| 3.2 非小细胞肺癌患者中SYT7蛋白表达水平是独立的不良预后因素 |
| 3.2.1 免疫组化检测非小细胞肺癌患者的SYT7表达水平升高 |
| 3.2.2 非小细胞肺癌患者的SYT7表达水平与临床参数之间的关系 |
| 3.2.3 高SYT7蛋白表达预示着非小细胞肺癌患者的预后不良 |
| 3.2.4 SYT7是非小细胞肺癌的独立预后不良因素 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分:SYT7在体外实验中对非小细胞肺癌增殖迁移的影响及其机制的研究 |
| 6 前言 |
| 7 材料与方法 |
| 7.1 主要试剂和设备 |
| 7.1.1 主要试剂 |
| 7.1.2 主要设备 |
| 7.2 实验方法 |
| 7.2.1 细胞培养 |
| 7.2.2 细胞计数 |
| 7.2.3 细胞转染 |
| 7.2.4 实时定量PCR |
| 7.2.5 蛋白质免疫印迹实验 |
| 7.2.6 伤口愈合实验 |
| 7.2.7 MTT细胞活力实验 |
| 7.2.8 集落形成实验 |
| 7.2.9 Transwell法检测细胞迁移 |
| 7.2.10 流式细胞术 |
| 7.2.11 GO和 KEGG分析 |
| 7.2.12 统计学分析 |
| 8 结果 |
| 8.1 非小细胞肺癌细胞系中SYT7的蛋白和mRNA表达水平 |
| 8.2 敲减或过表达SYT7细胞株的建立 |
| 8.3 SYT7促进非小细胞肺癌细胞增殖 |
| 8.3.1 MTT实验发现SYT7促进非小细胞肺癌细胞增殖 |
| 8.3.2 SYT7可增加非小细胞肺癌的集落形成能力 |
| 8.4 SYT7促进非小细胞肺癌细胞的迁移 |
| 8.4.1 伤口愈合实验发现SYT7可以促进细胞的迁移 |
| 8.4.2 Transwell实验发现SYT7可以促进细胞的迁移 |
| 8.5 SYT7不影响非小细胞肺癌细胞的凋亡 |
| 8.6 SYT7不影响非小细胞肺癌的细胞周期 |
| 8.7 SYT7通过Erk1/2和p38MAPK通路促进非小细胞肺癌增殖迁移 |
| 8.7.1 通过生物信息学寻找SYT7共表达基因 |
| 8.7.2 GO和 KEGG富集分析 |
| 8.7.3 Western blot结果证实SYT7参与Erk1/2和p38 MAPK通路 |
| 9 讨论 |
| 10 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 突触结合蛋白7研究现状 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分：基于TCGA数据库分析Rac3在非小细胞肺癌中的表达特征及预后影响 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 基于TCGA的临床数据挖掘 |
| 2.1.1 主要数据 |
| 2.1.2 主要软件算法 |
| 2.1.3 TCGA中非小细胞肺癌数据子集的挖掘 |
| 2.1.4 Rac3在肺癌和癌旁组织中的表达 |
| 2.1.5 Rac3表达与肿瘤临床特征的相关性分析 |
| 2.1.6 Rac3不同表达的肿瘤患者生存分析 |
| 2.1.7 单因素及多因素的COX生存分析 |
| 2.1.8 GSEA富集分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 Rac3在肺癌组织中高表达 |
| 3.2 Rac3与肿瘤临床特征的相关性分析 |
| 3.3 Rac3表达影响非小细胞肺癌预后 |
| 3.4 多因素COX分析提示Rac3高表达是影响预后的独立危险因素 |
| 3.5 GSEA富集分析 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分:非小细胞肺癌A549细胞系中Rac3的转录组学分析 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 细胞系、主要试剂、主要仪器 |
| 2.1.1 非小细胞肺癌A549细胞系 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 细胞培养 |
| 2.2.1 细胞复苏 |
| 2.2.2 细胞培养 |
| 2.2.3 细胞传代 |
| 2.3 通过CRISPR/cas9基因编辑技术敲除A549细胞的Rac3基因 |
| 2.3.1 在线设计Rac3敲除的sg RNA |
| 2.3.2 CRISPR/cas9敲除质粒的构建 |
| 2.3.3 细胞转染 |
| 2.3.4 单克隆细胞株的筛选 |
| 2.3.5 PCR扩增及T7E1酶切实验验证基因编辑 |
| 2.4 Rac3过表达慢病毒感染非小细胞肺癌A549细胞 |
| 2.5 免疫印迹法检测(Western Blot) |
| 2.5.1 总蛋白提取及定量 |
| 2.5.2 SDS-PAGE及转膜 |
| 2.5.3 抗体孵育及化学发光 |
| 2.6 转录组学分析 |
| 2.6.1 总RNA的提取和文库构建 |
| 2.6.2 RNA测序和数据分析 |
| 2.6.3 生物通路和基因富集分析 |
| 2.7 实时荧光定量PCR |
| 2.7.1 柱式法提取总RNA |
| 2.7.2 反转录反应 |
| 2.7.3 Real-Time PCR |
| 2.8 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 肺癌细胞株A549细胞中Rac3敲除及过表达 |
| 3.2 Rac3敲除及过表达后的转录组学分析 |
| 3.3 差异基因实时定量PCR法进行低通量验证 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分:Rac3通过MAGEA6抑制非小细胞肺癌的自噬及凋亡 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 临床标本及临床信息收集 |
| 2.2 主要试剂与仪器 |
| 2.2.1 主要试剂 |
| 2.2.2 主要仪器 |
| 2.3 LC3 双荧光慢病毒感染Rac3敲除及过表达细胞株 |
| 2.4 EBSS饥饿诱导自噬 |
| 2.5 免疫印迹法检测(Western Blot) |
| 2.5.1 总蛋白提取及定量 |
| 2.5.2 SDS-PAGE及转膜 |
| 2.5.3 抗体孵育及化学发光 |
| 2.6 流式细胞术 |
| 2.7 线粒体膜电位检测凋亡 |
| 2.8 MAGEA6过表达质粒转染 |
| 2.9 组织芯片蜡块的制作 |
| 2.10 免疫组织化学检测 |
| 2.11 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 Rac3抑制非小细胞肺癌A549细胞的自噬 |
| 3.2 Rac3促进自噬诱导的非小细胞肺癌A549细胞凋亡 |
| 3.3 Rac3通过MAGEA6 调节AMPKα通路 |
| 3.4 Rac3敲除后回补MAGEA6表达逆转凋亡和自噬 |
| 3.5 Rac3、MAGEA6、GABRA3 在肺癌及癌旁组织中的表达情况 |
| 3.6 Rac3、MAGEA6和GABRA3 基因在非小细胞肺癌中的表达与患者临床特征间的相关性 |
| 3.7 Rac3、MAGEA6、GABRA3 基因表达与非小细胞肺癌预后的相关性 |
| 3.8 Rac3、MAGEA6、GABRA3与AMPKα、活化的caspase3在组织水平表达的相关性分析 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 对本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 Rac3在肿瘤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 英汉缩略词对照表 |
| PHLD与肿瘤 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表论文情况 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 TIGIT在非小细胞肺癌患者CD8+T 细胞上的表达 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 四、小结 |
| 第二部分 TIGIT抑制肺肿瘤免疫反应的机制研究 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 四、小结 |
| 第三部分 anti-TIGIT与 anti-PD-1 联合治疗的抑癌效果 |
| 一、材料方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 四、小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述一 TIGIT在肿瘤中的作用及研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 非小细胞肺癌治疗的策略和展望 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表论文及参加科研工作情况 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 GBP1在非小细胞肺癌厄洛替尼耐药细胞中的表达及意义 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.4 结论与讨论 |
| 1.5 本章小结 |
| 第二章 体内研究表明GBP1参与厄洛替尼耐药 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 结论与讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 GBP1和PGK1互作促进厄洛替尼耐药 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 结论与讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 临床研究表明高表达GBP1患者预后差 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 资料与方法 |
| 4.3 研究结果 |
| 4.4 结论与讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 全文总结 |
| 参考文献 |
| 中英文缩略词 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
