欧阳波[1]（2021）在《冰片配伍黄芪甲苷和三七总皂苷对脑缺血/再灌注损伤后神经血管单元保护作用的研究》文中指出目的:研究冰片配伍黄芪甲苷（Astragaloside Ⅳ,AST Ⅳ）和三七总皂苷（Panax notoginseng saponins,PNS）对大鼠脑缺血/再灌注损伤（Cerebral ischemia reperfusion injury,CIRI）后脑组织损伤、神经血管单元主要组分（神经元、星形胶质细胞和微血管）的结构、主要组分特异蛋白--胶质纤维酸性蛋白（Glialfibrillary acidic protein,GFAP）、神经元特异性核蛋白（Neuron specific nuclear,Neu N）、层黏连蛋白（Laminin,LN）、内皮屏障抗原蛋白（Endothelial barrier antigen,EBA）及相关功能蛋白--αII-血影蛋白（αII-Spectrin,αII-SP）、水通道蛋白4（Aquaporin 4,AQP-4）、基质金属蛋白酶9（Matrix metalloproteinase-9,MMP-9）、血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）表达的影响,探讨其通过Notch信号通路对神经血管单元的保护机制。方法:成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠随机分为假手术组（Sham Operation Group,SOG）、模型组（Model Group,MG）、冰片组（Borneol Group,BG）、AST Ⅳ组（AST Ⅳ Group,AG）、PNS组（PNS Group,PG）、AST Ⅳ+PNS组（AST Ⅳ+PNS Group,APG）、冰片+AST Ⅳ+PNS低剂量组（Borneol+AST Ⅳ+PNS Low-dose Group,LDG）、冰片+AST Ⅳ+PNS高剂量组（Borneol+AST Ⅳ+PNS High-dose Group,HDG）、依达拉奉组（Edaravone Group,EG）。EG腹腔注射给药,其他组灌胃给药,2次/d。采用线栓法阻断右侧大脑中动脉（Middle cerebral artery,MCA）,建立大鼠CIRI模型。缺血2h,再灌注后22h,行神经功能缺损评分,TTC染色测定脑梗死体积,HE染色观察大脑缺血皮质区病理形态;免疫组化法检测大脑缺血皮质区GFAP、Neu N、LN、EBA的表达;免疫荧光三标法检测大脑缺血皮质区GFAP、神经丝蛋白200（neurofilament-200,NF-200）、LN的蛋白表达;Westrn blot检测大脑缺血皮质区αII SP、AQP-4、MMP-9、VEGF、Notch1、Notch胞内域（Intracellular domain of Notch,NICD）、Hes1、Delta-like ligand 4（DLL4）蛋白的表达。结果:缺血2h,再灌注22h后,MG出现神经功能缺损、右侧局灶性脑梗死、神经细胞损伤。各药物组神经功能缺损评分、脑梗死体积和神经细胞损伤率显着降低（P<0.05、0.01）,且冰片+AST Ⅳ+PNS的效应强于各药物单用及AST Ⅳ+PNS（P<0.05、0.01）。缺血2h,再灌注22h后,免疫组化结果显示,MG的Neu N、LN、EBA阳性细胞显着减少（P<0.01）,GFAP阳性细胞显着增加（P<0.01）;冰片、PNS、AST Ⅳ、AST Ⅳ+PNS与冰片+AST Ⅳ+PNS能显着增强Neu N、LN、EBA蛋白表达（P<0.05、0.01）,显着降低GFAP蛋白表达（P<0.05、0.01）,且冰片+AST Ⅳ+PNS的作用强于各药物单用及AST Ⅳ+PNS（P<0.05、0.01）。免疫荧光三标结果显示,MG的NF-200、LN阳性细胞显着减少（P<0.01）,GFAP阳性细胞显着增加（P<0.01）;冰片、AST Ⅳ、PNS、AST Ⅳ+PNS与冰片+AST Ⅳ+PNS能显着降低GFAP蛋白表达（P<0.05、0.01）,且冰片+AST Ⅳ+PNS的作用强于各药物单用及AST Ⅳ+PNS（P<0.05、0.01）。冰片、AST Ⅳ+PNS与冰片+AST Ⅳ+PNS能显着增强LN蛋白表达（P<0.05、0.01）,且冰片+AST Ⅳ+PNS的作用强于各药物单用及AST Ⅳ+PNS（P<0.05、0.01）。冰片+AST Ⅳ+PNS能显着增强NF-200蛋白表达（P<0.01）,且冰片+AST Ⅳ+PNS的作用强于AST Ⅳ+PNS（P<0.05）。Westrn blot结果显示,MG大鼠缺血皮质区AQP-4、MMP-9蛋白表达显着增加（P<0.05）,αII SP蛋白表达水平显着降低（P<0.05）,而VEGF、NICD、Notch1、Hes1、DLL4蛋白表达无显着变化（P>0.05）,冰片+AST Ⅳ+PNS能显着上调αII SP、VEGF、NICD、Notch1、Hes1、DLL4蛋白的表达（P<0.01）,且冰片+AST Ⅳ+PNS的效应强于各药物单用及AST Ⅳ+PNS（P<0.05、0.01）。冰片+AST Ⅳ+PNS能显着下调AQP-4、MMP-9蛋白的表达（P<0.01）,且冰片+AST Ⅳ+PNS的效应强于各药物单用及AST Ⅳ+PNS（P<0.05、0.01）。结论:1.冰片配伍AST Ⅳ和PNS对大鼠CIRI后具有脑保护作用,能改善神经功能缺损、降低神经细胞损伤率、减少脑梗死体积,且冰片+AST Ⅳ+PNS的作用强于各药物单用及AST Ⅳ+PNS。2.冰片配伍AST Ⅳ和PNS对大鼠CIRI后神经血管单元具有保护作用,可减轻神经元和微血管基底膜损伤、抑制星形胶质细胞过度活化、减轻脑水肿,且冰片+AST Ⅳ+PNS的作用强于各药物单用及AST Ⅳ+PNS。维持神经血管单元结构完整性,且冰片+AST Ⅳ+PNS的作用强于AST Ⅳ+PNS。3.冰片配伍AST Ⅳ和PNS对大鼠CIRI后的脑保护作用机制可能与激活Notch信号通路,上调NICD、Notch1、Hes1、VEGF、DLL4表达,从而发挥对缺血脑组织的保护作用有关。
王文龙[2]（2020）在《基于上皮间质转化探讨复方苦参注射液防治放射性肺损伤的机制》文中研究表明目的:放射性肺损伤是胸部肿瘤放疗最常见的并发症,既往关于其发生机制的研究主要集中在氧自由基及炎性细胞因子的产生和效应,而放射性肺损伤后发生上皮间质转化（EMT）的现象及其机理并未引起足够的重视。近期有多项研究表明,复方苦参注射液对上皮间质转化有一定的抑制作用。本项目拟通过建立小鼠放射性肺损伤疾病模型,以不同浓度复方苦参注射液进行干预,而后评估小鼠肺损伤程度,测定EMT相关的表型标记物、细胞因子等变化,以及EMT相关信使mRNA转录水平变化及由此导致TGF-β1/Smads、Wnt/β-catenin信号通路交互变化。本项目拟通过观察复方苦参注射液对放射性肺损伤小鼠上皮间质转化效应途径的影响,有望阐明复方苦参注射液通过抑制上皮间质转化而防治放射性肺损伤的机理,为临床推广使用复方苦参注射液防治放射性肺损伤提供实验依据。方法:1.理论部分:通过回顾性分析了中医学对放射性肺损伤的认识,探究了热毒络瘀相关理论的源流及其典型代表中成药复方苦参注射液。2.实验部分:C57bl/6小鼠194只,雄性,依据随机数字表法分为10组:空白对照组（Control group,Control）、模型组（Model group,Model）、复方苦参注射液低剂量组（Compound kushen injection-Low dose group,CKI-L）、复方苦参注射液中剂量组（Compound kushen injection-Middle dose group,CKI-M）、复方苦参注射液高剂量组（Compound kushen injection-High dose group,CKI-H）、信号通路激动剂1组（SB431542,SB）、信号通路抑制剂2组（XAV-939,XAV）、复方苦参注射液+信号通路抑制剂1组（CKI+SB）、复方苦参注射液+信号通路抑制剂2组（CKI+XAV）、地塞米松注射液组（Dexamethason,DXM）。使用美国XStrahl小动物精准放疗辐照研究平台（SARRP）,实施单次20 Gy双侧肺野照射成功建立C57bl/6小鼠放射性肺损伤模型。照射后观察小鼠的一般情况,分别于照射后第2、4、6、8、10、12周6个时间点处死小鼠,采集血清和取出肺组织。取第4、8周C57bl/6小鼠肺组织,小鼠及肺组织称重,计算肺系数,采用苏木精伊红染色法（HE）和Masson染色,分别通过光学显微镜和电子显微镜观察各组C57bl/6小鼠肺组织病理学形态改变;采用免疫组织化学染色法（IHC）检测C57bl/6小鼠在第4周、第8周的肺组织中E-cadherin、Vimentin蛋白表达情况;采用酶联免疫吸附实验（ELISA）法检测C57bl/6小鼠在第第4周、第8周采集血浆中肿瘤坏死因子α（TNF-α）和转化生长因子β1（TGF-β1）含量;采用实时定量PCR法（RT-qPCR）检测各组小鼠第4周、第8周肺组织中TGF-β1mRNA、Smad3 mRNA、GSK-3βmRNA、β-catenin mRNA的表达水平;采用免疫印迹法（Western-blot）分别检测各组小鼠在第4周、第8周肺组织内TGF-β1、Smad3、GSK-3β、β-catenin通道蛋白表达水平。结果:1.实验一结果复方苦参注射液可增加放射性肺损伤小鼠肺系数,减轻小鼠放射性肺损伤病理损害程度,并可改善小鼠一般情况,包括毛色、脱毛、食量、活动及体重等。2.实验二结果2.1 HE染色结果:Control组:小鼠肺组织肺泡壁较薄,肺泡结构清晰,毛细血管完整,无充血及水肿,无炎症细胞浸润,各时间点均未见明显病理改变;Model组:照射后前2周以渗出性病变为主,肺泡腔可见少量炎症细胞浸润,出现急性肺间质水肿、充血,第4周可见肺组织间质明显水肿及支气管周围炎性细胞浸润,肺泡结构破坏,部分肺泡萎缩,第6周炎性细胞浸润减少,小鼠肺组织间质水肿渐渐消退,肺泡隔渐增宽,肺泡腔有所缩小,出现成纤维细胞,胶原增生,第8周小鼠炎性细胞减退,肺组织间质水肿进一步消退,肺泡间隔增宽,肺泡结构破坏,出现部分肺泡塌陷伴有不张,还可见少许梭形成纤维细胞,第12周小鼠肺泡扩张加重,胶原增生明显,气体交换空间显着减少,肺泡塌陷更明显、并纤维化;CKI-L组、CKI-M组及CKI-H组:第2周渗出性病变较轻,肺间质水肿、充血及炎性细胞浸润程度等均较Model明显减轻;第4周,可见少许炎性细胞浸润,肺组织间质轻度水肿;第8周可见炎性渗出,肺泡壁毛细血管轻度充血,肺间质轻度水肿,肺泡部分塌陷,肺泡壁略有增厚,但是上述表现均较Model组明显减轻;第12周可见少许成纤维细胞,肺泡壁轻度增厚,部分肺纤维化,但均明显较Model组显着减轻;DXM组各时间点与CKI-H组无明显差别;SB组和XAV组各时间点处于CKI-M组及CKI-H组之间,但未见明显差别;CKI+SB组和CKI+XAV组第2周、第4周渗出性病变较轻微,肺间质水肿、充血及炎性细胞浸润程度等均较单药干预组明显减轻;第8周可见少许炎性渗出,肺泡壁毛细血管轻度充血,肺间质轻度水肿,肺泡部分塌陷,肺泡壁略有增厚,但是上述表现均较单药干预组明显减轻;第12周可见少许成纤维细胞,肺泡壁轻度增厚,部分肺纤维化,但均明显较单药干预组显着减轻。2.2 Masson染色结果:胶原纤维呈蓝色,肌纤维呈红色,细胞核呈现蓝黑色。Control组:胶原纤维较少,肌纤维多,细胞核多;Model组:随着造模时间的延长,胶原纤维逐渐增多,可见大量胶原纤维;与Model组比较,复方苦参注射液各浓度组的胶原纤维染色受到较为明显的抑制;SB组、XAV-939组胶原纤维染色也受到较为明显的抑制,胶原纤维量较模型组明显减少,与CKI-M组和CKI-H组相仿;SB组、XAV组,各时间点胶原纤维量较Model组明显减少,与单药干预组相比,胶原纤维染色受到更为明显的抑制。放射性肺炎和放射性肺纤维化常常同时发生,随着时间进一步延长,放射性肺炎逐步减轻和放射性肺纤维化程度渐渐加重,本研究4周内以放射性肺炎为主,4周到8周出现放射性肺炎渐减轻和放射性肺纤维化程度渐加重,12周以放射性肺纤维化为主,经过复方苦参注射液及信号通路抑制剂单药或联合干预后,放射性肺炎及放射性肺纤维化程度受到明显的抑制,CKI-M组和CKI-H组干预效果优于CKI-L组,与信号通路抑制剂组相当,逊于CKI+SB组、CKI+XAV组。2.3透射电镜结果:Control组:细胞核大,呈现椭圆形,未见胶原纤维,结构完整,肺泡腔相对干净,肺泡间隔未增宽增厚,肺泡上皮细胞表面绒毛球形,高尔基体数量较多,偶见巨噬细胞和红细胞;Model组:细胞核固缩,变小,可见大量胶原纤维,可见条索样改变,肺泡上皮细胞线粒体肿胀明显,其内部活性物质增多较多,胞浆减少,空泡较为严重,巨细细胞增多,伴有纤维细胞产生;复方苦参注射液各浓度组:各时间点细胞核大小介于Control组和Model组之间,胶原纤维数目中等,肺泡上皮细胞线粒体肿胀较轻,处于慢性炎症修复阶段。SB组及XAV组:各时间点细胞核大小介于Control组和Model组之间,胶原纤维数目与CKI-H组及CKI-H组相当。CKI+SB组、CKI+XAV组两联合用药组:各时间点细胞核大小介于Control组和Model组之间,胶原纤维数目较单药干预组明显减少,肺泡上皮细胞线粒体肿胀也较单药干预组明显减轻,处于慢性炎症修复阶段。3.实验三结果3.1各组小鼠肺组织中E-cadheren蛋白表达情况:E-cadheren蛋白主要表达定位于细胞膜、细胞浆液和细胞连接等。免疫组化结果显示:E-cadheren蛋白在肺组织细胞浆和胞膜上表现为棕黄色或棕褐色或淡黄色颗粒。Control组小鼠肺组织中的E-cadheren表达率较高;Model小鼠肺组织中的E-cadheren表达率很低;复方苦参注射液各剂量组C57bl/6小鼠肺组织各时间点的E-cadheren表达率介于Control组和Model组之间,E-cadheren表达率处于中等;SB组及XAV组小鼠肺组织各时间点的E-cadheren表达率也同样介于Control组和Model组之间,E-cadheren表达率与CKI-M组及CKI-H组相当;CKI+SB组、CKI+XAV组两联合用药组小鼠肺组织各时间点的E-cadheren表达率虽然介于Control组和Model组之间,但E-cadheren表达率较单药干预组明显增加,更接近于Control组。3.2各组小鼠肺组织中Vimentin蛋白表达情况:Vimentin蛋白主要表达在定位于细胞浆,常附在细胞核、内质网及线粒体的旁边或末端。免疫组化结果显示:Vimentin蛋白在肺组织细胞浆上表现为棕黄色或棕褐色或淡黄色颗粒。Control小鼠肺组织中的Vimentin表达率很低;Model组小鼠肺组织中的Vimentin表达率较高;复方苦参注射液各剂量组小鼠肺组织各时间点的Vimentin表达率介于Control组和Model组之间,Vimentin表达率处于中等;SB组及XAV组小鼠肺组织各时间点的Vimentin表达率也同样介于Control组和Model组之间,Vimentin表达率与CKI-M组、CKI-H相当;CKI+SB组、CKI+XAV组小鼠肺组织各时间点的Vimentin表达率虽然介于Control组和Model组之间,但Vimentin表达率较单药干预组明显减少。4.实验四结果与Control组比较,Model组小鼠血清TGF-β1、TNF-α含量在第4、8周均显着性升高（P<0.01）;与Model组比较,除CKI-L组第8周外,CKI-M组、CKI-H组及其他用药干预组小鼠血清TGF-β1、TNF-α含量在第4、8周均显着性降低（P<0.05,P<0.01）;与CKI-M组比较,CKI+SB组小鼠血清TGF-β1、TNF-α含量在第8周均显着性降低（P<0.05,P<0.01）,CKI+SB组、CKI+XAV组小鼠血清TNF-α含量在第4周均显着性降低（P<0.05）,CKI-L组小鼠血清TGF-β1、TNF-α含量在第4周显着性升高（P<0.05）,其余各用药干预组小鼠血清TGF-β1、TNF-α含量在第4、8周均未见显着性差异（P>0.05）;与CKI-H组比较,CKI-L组小鼠血清TGF-β1、TNF-α含量在第4周均显着性升高（P<0.05,P<0.01）,CKI-L组小鼠血清TGF-β1含量在第8周均显着性升高（P<0.05,P<0.01）,CKI+SB组小鼠血清TGF-β1含量在第4周显着性降低（P<0.05,P<0.01）,CKI+SB组小鼠血清TNF-α含量在第8周显着性降低（P<0.05）,其余各用药干预组小鼠血清TGF-β1含量在第4、8周均未见显着性差异（△P>0.05）;与DXM组比较,CKI-L组小鼠血清TGF-β1、TNF-α含量在第4周均显着性升高（P<0.05,P<0.01）,CKI-L组小鼠血清TGF-β1含量在第8周均显着性升高（P<0.05,P<0.01）,CKI+SB组小鼠血清TGF-β1含量在第4周显着性降低（P<0.05）,其余各用药干预组小鼠血清TGF-β1含量在第4、8周均未见显着性差异（P>0.05）。5.实验五结果5.1 Real time RT-PCR实验结果:与Control组比较,Model组第4周、第8周的TGF-β1、Smad3、β-catenin、GSK-3βm RNA表达水平明显升高（P<0.01）;与Model组比较,CKI-L组、CKI-M组、CKI-H组、DXM组、CKI+SB组、CKI+XAV组第4周、第8周的TGF-β1、Smad3、β-catenin、GSK-3βm RNA表达水平均有不同程度降低（P<0.01,P<0.05）;与CKI-H组比较,DXM组、SB组、XAV组第4周、第8周的TGF-β1、Smad3、β-catenin、GSK-3βm RNA表达水平变化改变不明显（P>0.05）,CKI-L组、CKI-M组第8周的TGF-β1、Smad3、β-catenin、GSK-3βm RNA表达水平变化改变不明显（P>0.05）,而CKI+SB组、CKI+XAV组第4周、第8周的TGF-β1、Smad3、β-catenin、GSK-3βm RNA表达水平改变明显,差异具有统计学意义（P<0.05,P<0.01）;而CKI-L组、CKI-M组第4周、第8周的TGF-β1、Smad3、β-catenin、GSK-3βm RNA表达水平改变明显,差异具有统计学意义（P<0.05,P<0.01）;与DXM组比较,CKI-H组、SB组、XAV组第4周、第8周的TGF-β1、Smad3、β-catenin、GSK-3βm RNA表达水平变化不明显（P>0.05）,CKI+SB组、CKI+XAV组第4周、第8周的TGF-β1、Smad3、β-catenin、GSK-3βm RNA表达水平改变明显,差异具有统计学意义（P<0.05,P<0.01）,而CKI-L组、CKI-M组第四周TGF-β1、Smad3、β-catenin、GSK-3βm RNA表达水平变化不明显（P>0.05）。5.2 Western t bolt实验结果:与Control组比较,Model组第4周、第8周的TGF-β1、Smad3、β-catenin、GSK-3β蛋白表达水平明显升高（P<0.01）;与Model组比较,CKI-H组、DXM组、CKI+SB组、CKI+XAV组第4周、第8周的TGF-β1、Smad3、β-catenin、GSK-3β蛋白表达水平均有不同程度降低（P<0.01,P<0.05）,而CKI-L组和CKI-M组TGF-β1、Smad3、β-catenin、GSK-3β蛋白表达水平变化改变不明显（P>0.05）;与CKI-H组比较,CKI-L组、CKI-M组、DXM组、SB组、XAV组第4周、第8周的TGF-β1、Smad3、β-catenin、GSK-3β蛋白表达水平变化改变不明显（P>0.05）,而CKI+SB组、CKI+XAV组第4周、第8周的TGF-β1、Smad3、β-catenin、GSK-3β蛋白表达水平改变明显,差异具有统计学意义（P<0.05,P<0.01）;与DXM组比较,CKI-L组、CKI-M组、CKI-H组、SB组、XAV组第4周、第8周的TGF-β1、Smad3、β-catenin、GSK-3β蛋白表达水平变化不明显（P>0.05）,CKI+SB组、CKI+XAV组第4周、第8周的TGF-β1、Smad3、β-catenin、GSK-3β蛋白表达水平改变明显,差异具有统计学意义（P<0.05,P<0.01）。5.3免疫荧光实验结果:TGF-β1蛋白主要表达在细胞间质。Smad3蛋白主要表达在定位于细胞核及细胞浆。GSK-3β蛋白主要表达在定位于细胞核、细胞浆及细胞膜。β-catenin蛋白主要表达在定位于细胞核、细胞浆及细胞膜。TGF-β1蛋白免疫荧光结果显示:TGF-β1、Smad3、β-catenin、GSK-3β蛋白在肺组织细胞间质为深浅不同的红色颗粒。Control组C57bl/6小鼠肺组织中的TGF-β1、Smad3、β-catenin、GSK-3β表达率很低;Model组C57bl/6小鼠肺组织中的TGF-β1、Smad3、β-catenin、GSK-3β表达率较高;复方苦参注射液各剂量组C57bl/6小鼠肺组织各时间点的TGF-β1表达率介于Control组和Model组之间,TGF-β1、Smad3、β-catenin、GSK-3β表达率处于中等;信号通路抑制剂SB431542组及XAV-939组C57bl/6小鼠肺组织各时间点的TGF-β1、Smad3、β-catenin、GSK-3β表达率也同样介于Control组和Model组之间,TGF-β1、Smad3、β-catenin、GSK-3β表达率与CKI-M组和CKI-H组相当;复方苦参注射液+SB431542组、复方苦参注射液+XAV-939组两联合用药组C57bl/6小鼠肺组织各时间点的TGF-β1、Smad3、β-catenin、GSK-3β表达率虽然介于Control组和Model组之间,但TGF-β1表达率较单药干预组明显减少。结论:放射性肺损伤发病机制复杂,近年来放射性肺损伤后发生的上皮间质转化备受关注。为此,我们基于上皮间质转化及中医热毒络瘀理论,选择中成药复方苦参注射液来干预小鼠放射性肺损伤,并取得了较好的放射防护作用,其可能机制如下:1.复方苦参注射液可以通过降低血清中EMT相关的TNF-α和TGF-β1的水平,从而减轻C57bl/6小鼠放射性肺损伤;2.复方苦参注射液可以降低TGF-β/Smads和Wnt/β-catenin信号通路EMT相关基因的表达;3.复方苦参注射液还可通过降低TGF-β/Smads和Wnt/β-catenin信号通路EMT相关通道蛋白的表达来达到防治放射性肺损伤的目的。
李琦玮[3]（2020）在《益气活血解毒中药对三阴性乳腺癌的干预作用及机制探讨》文中指出研究背景:乳腺癌居于全球女性癌症死亡原因的首位。三阴性乳腺癌（TNBC）是乳腺癌的一种亚型,其分子表型呈雌激素受体（ER）阴性、孕激素受体（PR）阴性以及人类表皮生长因子受体2（HER2）阴性,约占全部乳腺癌的10-20%。TNBC由于缺乏有效的治疗靶点,往往预后不佳。乙酰肝素酶（HPSE）是哺乳动物体内唯一一种用于切割硫酸乙酰肝素（HS）侧链的β-D-葡萄糖内切糖苷酶,通过切割HS侧链过程重塑细胞外基质（ECM）结构,释放具有生物活性的小分子物质,如生长因子、细胞因子等,协助肿瘤的侵袭与转移,促进肿瘤血管生成,有助于肿瘤的发展。HPSE在多种肿瘤组织中高表达,与肿瘤的恶性进展呈正相关。有研究发现,乙酰肝素酶具有调控细胞基础自噬过程的作用。自噬是一种进化保守的细胞通过溶酶体进行物质降解代谢的过程,一般认为,自噬在肿瘤的发生、发展过程中具有双刃剑的效果。在肿瘤产生之前,自噬可以清除损伤的细胞器或异常合成的蛋白质,减轻炎症反应,避免DNA损伤,预防肿瘤的发生;当体内出现肿瘤细胞时,自噬可以激活免疫细胞的抗原呈递功能,激活T细胞,增强免疫应答功能清除肿瘤细胞。然而肿瘤发生之后,肿瘤细胞可利用自噬作为其必要的生存机制,通过自噬过程为肿瘤细胞的生存和发展提供营养物质和能量支持,以此应对外周环境压力,获得增殖或转移的机会。由于TNBC目前仍然缺乏有效的治疗靶点,且易对治疗产生抵抗,寻找有效的辅助治疗手段提高TNBC的疗效十分重要。研究者对于包括传统中医药在内的补充替代治疗日益关注。千百年来,中药被广泛用于包括癌症在内的各种疾病的治疗。中药结合常规现代治疗有助于提高肿瘤疗效,减轻治疗毒副作用,改善肿瘤患者的生存质量。郁仁存教授、王笑民教授根据多年临证经验总结“益气活血解毒法”,并据此治则创立相关方剂,在临床上治疗各类恶性肿瘤取得了良好的疗效。基于益气活血解毒法,我们选择四种中药单体联合应用并评价其疗效。这些单体包括黄芪甲苷（提取自黄芪,代表“益气”）,龙葵碱（提取自植物龙葵,代表“解毒”）,莲心碱（提取自莲子,代表“解毒”）,川芎嗪（提取自川芎,代表“活血化瘀”）。我们将这四种单体组合简称“SANT”,并对其在肿瘤体内外模型中进行研究。研究目的:评价益气活血解毒中药单体组合SANT对MDA-MB-231 Hpa/Mock肿瘤的影响并分析相关机制。研究方法:在本研究中,我们首先利用数据库进行肝素酶表达与乳腺癌患者生存的相关性分析。利用MTS、trans-well和划痕实验评价SANT对肿瘤细胞增殖、迁移的影响。共聚焦实验用于观察SANT处理后231-Hpa细胞中GFP-RFP-LC3蛋白的变化。免疫印迹实验用于检测相关蛋白标志物表达。动物实验用于评价SANT在体内的疗效与安全性。最后我们采用人类自噬相关PCR微阵列和血管生成蛋白微阵列用于相关机制探索。研究结果:1.HPSE在多种癌症类型中高表达,乳腺癌中HPSE mRNA表达水平超过正常乳腺组织2倍以上。HPSE高表达的乳腺癌患者无复发生存期（P=1.7e-12）与总生存期（P=0.00016）都显着短于HPSE低表达的乳腺癌患者。TNBC患者的HPSE转录效率高于非三阴性乳腺癌患者。2.肿瘤细胞231-Hpa具有显着上调的肝素酶水平,231-Hpa细胞内LC3B-I/-Ⅱ转化率也显着高于231-Mock细胞（P=0.0003）。在乳腺癌原位移植瘤模型中,免疫荧光显示231-Hpa移植瘤HPSE表达显着升高;231-Hpa组肿瘤负荷（0.608g 与 0.437g,每组≥6 只,P=0.0242）,肺重（0.167g 与 0.148g,每组≥6只,P=0.0164）均显着高于对照组。231-Hpa组Ki-67染色与CD31染色均显着高于 231-Mock 组。3.体外实验:经过24小时处理,龙葵碱在0-64μM浓度范围将231-Mock细胞生存率降低近50%,231-Hpa细胞生存率降低约60%;经过48小时处理,龙葵碱对于231-Mock细胞抑制率为68.93%,对231-Hpa细胞抑制率为81.06%。甲基莲心碱（NEF）处理细胞24-48h后也达到60-80%的抑制率。黄芪甲苷和川芎嗪对肿瘤细胞增殖影响不明显。在Trans-well实验中,与对照组相比,SANT对231-Hpa细胞迁移的抑制率达79%,对231-Mock细胞迁移抑制率达72%。划痕实验也取得类似的结果,经过24小时SANT处理,231-Hpa细胞的划痕愈合面积下降了 51.5%,231-Mock细胞的划痕愈合面积下降了 40.6%。SANT在免疫印迹实验中可轻度降低活性形式HPSE的表达,对惰性形式HPSE的影响不明显。SANT和PI-88（肝素酶抑制剂）在体外均可轻微降低肝素酶活性带的表达。在荧光共聚焦观察实验中,转入GFP-RFP-LC3B标记的231-Hpa细胞经过SANT药物处理12h后,可以观察到大量LC3蛋白与溶酶体融合形成的黄色斑点,表示自噬过程的发生。Western实验可见,SANT处理细胞不同时间后引起了 LC3B-Ⅱ表达的升高,SANT与自噬抑制剂CQ联用可使LC3B-Ⅱ表达进一步升高,表明自噬流量的发生。4.体内实验中,SANT与PI-88均可以显着抑制肿瘤的生长（SANT与对照组,360.59 与 598.32mm3,P=0.0381;PI-88 与对照组,3 64.93 与 598.32mm3,P=0.0344）。SANT、PI-88组肿瘤重量较对照组也明显下降（SANT与对照组,0.29与 0.54g,P=0.0046;PI-88 与对照组,0.37 与 0.54g,P=0.0262）。肿瘤组织的免疫组化染色中,与对照组相比,SANT显着降低了 Ki-67表达（17.76±3.41%与7.52±2.02%,P<0.0001）,效果优于PI-88组。SANT明显抑制了微血管（MVD）（57%,P<0.0001）与血管生成拟态（VM）（33%,P=0.0019）的形成,但 PI-88抑制血管生成的效果更佳。安全性评价中,SANT在体内对小鼠的生化指标无明显影响。5.机制探索:对肿瘤组织进行人类自噬相关基因PCR微阵列检验结果显示,SANT处理显着上调了部分自噬过程相关基因,包括ATG10,ATG16L1,ATG16L2,ATG4B,ATG4D,ATG9A等,而PI-88处理组显着下调了一些自噬相关基因如AMBRA1,ATG16L1,ATG4D,BAD,BCL2L1等。肿瘤血管生成相关蛋白微阵列研究结果显示,SANT治疗组中HB-EGF,thrombospondin-2,amphiregulin,leptin,IGFBP-9,EGF,coagulation factor Ⅲ,MMP-9（前体及活性形式）表达上升,serpin E1,platelet factor 4表达下降。结论:肝素酶（HPSE）高表达常见于侵袭性乳腺癌患者中,与不良预后相关。HPSE促进肿瘤增殖,引起小鼠体内肺转移增多,在体外提高了肿瘤细胞自噬水平。体外研究中,SANT抑制肿瘤细胞的增殖与迁移,并增强肿瘤细胞的自噬水平。体内实验中,SANT在小鼠体内抑制肿瘤生长与血管生成过程。SANT对自噬相关基因或血管生成相关蛋白表达具有调控作用,可能与其肿瘤抑制作用相关。SANT是一种具有前景的用于三阴性乳腺癌辅助治疗的药物,这种药物组合研究拓展了天然化合物的应用思路。
张济周[4]（2020）在《基于活血化瘀法探讨三七粉抗肺癌的机制研究》文中认为目的:本项目在临床疗效的基础上通过理论研究、细胞实验、动物实验,探讨三七对肺癌的干预作用及其抗肿瘤的可能机制,为临床使用中药饮片三七治疗肺癌提供理论基础。方法:1.理论研究:通过查阅大量的参考文献,了解肺癌的发病机理、三七的药用机制、血瘀与肺癌发病的关系及肿瘤治疗基因学研究进展。2.临床研究（回顾性分析）:通过临床资料回顾性分析,得出三七在治疗肺癌上可能起作用;结合临床数据收集统计结果,进一步从细胞水平及动物水平两个层面进行研究认证。3.细胞实验:1)筛选最佳目的基因CTSB干扰组;2)三七含药血清低、中、高剂量进行干预实验,并于目的基因CTSB干扰组进行对比,从细胞水平研究三七粉对肺腺癌细胞系的作用及其对Cathepsin B的作用关系及机制。4.动物实验:用A549肺腺癌细胞进行皮下成瘤,分为5组,正常对照组、荷瘤模型组、三七低剂量干预组、三七中剂量干预组、三七高剂量干预组,用三七粉低、中、高剂量进行瘤体干预实验,与正常肺组织及肿瘤肺组织进行对比,从动物水平研究三七粉对CTSB基因表达的调控作用及抑制肺癌生长的机制。结果:1.理论研究:查阅大量的参考文献后,结果分析:1)中医认为血瘀与肺癌发病存在一定的相关性;2)活血化瘀药治疗肿瘤存在一定的争议:“争对血瘀的病因治疗肿瘤”和“活血化瘀促进肿瘤的扩散”;3)肿瘤治疗基因学研究发现cathepsin B在肿瘤组织中高表达,可能与肿瘤发病相关,并确定其对应基因为CTSB。2.临床研究（回顾性分析）:对2组肺癌患者进行临床观察,发现使用三七粉治疗后可不同程度降低观察期患者体内CEA、NSE和CYFRA21的含量、纤维蛋白原、活化部分凝血酶原时间及凝血酶原时间水平,并且可降低患者血清中D-二聚体的水平,其中,CYFRA21、D-二聚体、纤维蛋白原三项指标改善比较明显,CT结果无进展,患者体内肿瘤情况稳定,生活质量改善。3.细胞实验:1)转染后针对cathepsin B的小干扰RNA能够有效抑制A549细胞中cathepsin B的表达,通过荧光定量PCR和western blot检测,发现细胞中cathepsin B的mRNA和蛋白表达水平均显着下降,并筛选出CTSB最佳干扰组;2)三七含药血清低、中、高剂量干预实验:三七含药血清处理后肺癌A549细胞的细胞增殖能力下降、凋亡能力上升,且细胞的增殖能力与凋亡能力改变具有剂量依赖性。荧光定量PCR检测三七含药血清能够下调A549细胞中CTSB mRNA表达,以高剂量组更为明显。4.动物实验:1)荷瘤模型组与正常对照组相比,cathepsin B的mRNA和蛋白表达水平呈高表达状态;2)三七干预组与荷瘤模型组相比瘤子生长速度明显减慢,且具有剂量依耐性,不同组间瘤子体积差异有显着性（P<0.05）;三七干预后不同组瘤体的CTSB mRNA的表达量及CTSB蛋白的表达水平均有不同程度的下降,且具有剂量依赖性;三七干预后能够不同程度影响小鼠血清中肿瘤标志物（CEA、NSE和CYFRA21）的水平、降低荷瘤小鼠血清中D-二聚体的含量,可不同程度延长小鼠总生存期,且高剂量组更为明显。结论:通过理论研究、临床回顾性分析及体内外实验证实三七能够作用于CTSB基因、下调肺癌细胞cathepsin B（CTSB）mRNA及蛋白表达、降低D-二聚体、改变血液粘度等方式抑制肺癌生长,实现抗肿瘤作用,为临床三七（粉）运用于肺癌的治疗提供了一定的实验基础。
梁克山[5]（2019）在《P38MAPK抑制剂、雌二醇和TPX2对痴呆鼠模型海马神经细胞损害的保护作用及认知功能的影响》文中进行了进一步梳理引言痴呆是以认知功能进行性减退为特征的综合征,是一种渐进的、退化的脑部疾病,导致认知和情感功能的丧失,最常见于记忆,而其他功能如语言、行为以及最显着的执行功能也常常受损。据估计,全世界约有2400万人患有痴呆症,到2040年,这一数字将增加3至4倍。大约60%是阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）,10%～20%为血管性痴呆（vascular dementia,VaD）,分别占痴呆的第一、二位,其发病机制尚未完全明了。AD特征性病理改变为颞叶海马出现β淀粉样蛋白沉积形成的细胞外老年斑和tau蛋白过度磷酸化形成的神经细胞内神经原纤维缠结,VaD是由于缺血、出血、低灌注、栓塞、小血管病等血管因素及事件致认知领域损害。在影像学方面,AD是以海马、颞、顶叶皮质萎缩为主的弥漫性萎缩,VaD表现为认知相关区（额叶、颞叶、海马、顶叶、角回、丘脑等）的血管事件（梗死、出血、脑白质病变、腔隙性梗死）。除家族史和一些躯体疾病外,导致痴呆的危险因素主要有:年龄、性别、较低教育、经济水平等。两者在临床表现上各有特点。但在临床实际工作中常难以鉴别。有证据表明,相当部分的AD具有脑血管方面的病理改变,这可能是老龄化的表现之一,也有可能是AD与VaD混合状态的表现之一。同样地,VaD患者脑组织病理检查可以发现诸如老年斑之类AD改变,这可能是混合性痴呆的结果,与正常的老年化进程有关。这就导致人们对这两种疾病的关系和鉴别产生了浓厚的兴趣,这些问题的研究有助于对痴呆发生的病理机制有更加深人的了解,对临床干预策略的制定有很大的推动作用。海马是神经系统中与人类的学习与记忆关系密切的重要功能区,大脑的海马体不但是老年痴呆最早最重要的病变区域,而且也是血管性痴呆的重要受损部位,以往的研究表明,海马神经元凋亡在AD和VaD的发病中均起着重要的作用,并且对缺血低灌注损伤具有明显的易感性。阿尔茨海默氏病（阿尔茨海默病）是一种进行性神经退行性疾病,最终导致神经元不可逆性损伤以及各种智力缺陷,包括认知和记忆。AD已成为重要的公共卫生问题,其症状主要包括躯体、认知、情绪功能的障碍,以及长期的认知和感觉功能退化,这些均明显影响患者的生活质量。当前已有大量有关AD发生和发展方面的研究,并已取得显着成绩,但是这些研究仍然无法提供有效的疾病诊断和治疗技术。这种紧迫的需求激发了神经科学界及医疗行业对AD治疗方法发展的兴趣。根据经典的淀粉样蛋白假说,相对于其他各种淀粉衍生物,Aβ1-42在AD的发病中起着重要的作用。Aβ1-42是由淀粉样前体蛋白（APP）裂解产生的β-分泌酶和γ-分泌酶。Aβ蛋白过量导致淀粉样斑块的形成和各种神经功能障碍包括炎性级联反应的激活启动,tau蛋白磷酸化的推广,氧化应激的增加,细胞内的信号转导通路的管制,突触可塑性的损伤及诱导神经元的凋亡和细胞死亡。越来越多的证据表明,雌二醇可能既促进又会损害记忆相关的过程,因此,雌激素在AD病理过程中所扮演的确切的角色仍然是难以捉摸的。目前,通过向脑内立体定向注射Aβ1-42建立AD小鼠模型。切除小鼠双侧卵巢来观察17β-雌二醇（E2）对AD不同阶段的治疗（早期和晚期）的影响,国内外少见报道,对这一课题的进一步研究无疑具有重要意义。充分证据表明,妇女绝经后循环系统中雌激素水平会突然下降,造成氧化应激风险加大和神经退行过程加快,尤其是那些AD的高危人群。另一方面,实验研究表明,雌性动物（OVX）切除卵巢后的雌激素治疗可改善其学习和记忆过程,提高其在旋臂迷宫和对象识别中的认知能力。在临床情况下,绝经后5年内保持较高雌二醇水平的女性与保持稳定低雌二醇水平的女性相比,前者表现出更优的行为能力。此外,具有较高内源性雌激素水平的绝经后妇女在斯特鲁普任务和空间工作记忆,延迟回忆和数字排序测试方面的能力更为出色。同样,正在服用激素替代疗法的妇女在非空间工作记忆和空间工作记忆任务有更好的反应。然而,也有报道指出雌激素对绝经后妇女认知能力的负面影响。旨在了解这些差异的研究结果表明,若提前应用雌二醇,暴露于Aβ蛋白的神经元所受损伤会显着减少,而若同时或于暴露Aβ蛋白5天后应用雌二醇,神经元则无法获得雌二醇所带来的保护,甚至所受损伤会转而加剧。总之,在阿尔茨海默病的病理过程中雌激素起着微妙又重要的作用,可在不同阶段施加积极或消极的影响。因此,本实验通过研究AD不同病理阶段的17β-雌二醇（E2）治疗（早期和晚期）,全面了解E2在AD病理过程中的角色和评估E2作为预防药物的意义。海马是神经系统中与人类的学习与记忆关系密切的重要功能区,大脑的海马体不但是老年痴呆最先最重要的病变区域,而且也是血管性痴呆的重要受损部位,以往的研究表明,海马神经元凋亡在AD和VaD的发病中均起着重要的作用,但SB202190和SB203580对海马神经元凋亡因子表达和学习记忆能力的影响却少有报道,特别是SB202190和SB203580对海马神经元凋亡和Bcl-2、Caspase-3表达影响的研究国内外未见有报道。为了探讨海马神经元凋亡在AD和VaD中的致病机制以及对认知功能的影响,历时6年课题组做了以下3项课题:1.应用雌二醇对AD痴呆小鼠模型海马神经细胞元凋亡的保护作用机制和认知功能影响进行了研究,本研究利用切除双侧卵巢的小鼠,经侧脑室内注射Aβ1-42的方法建立阿尔茨海默病（AD）模型,并给予雌二醇（E2）治疗,研究Aβ1-42诱导的海马神经毒性及分子机制,评价E2拮抗Aβ1-42诱导的海马神经毒性的效果和分子机制。2.应用p38MAPK抑制剂对VaD痴呆大鼠模型海马神经细胞凋亡的保护作用机制和认知功能影响进行了研究,在这项研究中,我们研究了 SB203580、SB202190对血管性痴呆大鼠海马细胞凋亡和学习记忆能力的影响。观察了 p38 MAPK抑制剂对脑细胞凋亡的保护作用,并借助海马依赖性水迷宫试验检测了大鼠的空间参考学习和记忆能力。3.应用TPX2研究对阿尔茨海默病模型大鼠神经细胞凋亡的保护作用机制。借助海马依赖性水迷宫试验检测了大鼠的空间参考学习和记忆能力。TUNEL染色检测脑组织细胞凋亡,H E染色观察各组脑组织细胞,Western blot检测ERK和p38 MAPK的表达,采用RT-PCR方法检测MAPK、ERK和p21中mRNA的表达水平。观察了 TPX2对经β1-42处理脑组织的细胞凋亡有保护作用,进一步通过抑制MAPK、ERK和p38蛋白的表达而探讨了其作用机理。总之,课题组通过以上3项研究,旨在进一步阐明p38MAPK抑制剂和雌二醇对痴呆鼠模型海马神经元凋亡的保护作用机制以及对痴呆模型认知功能的影响。第一部分 雌二醇治疗对小鼠阿尔茨海默病模型海马神经元发生及认知功能障碍的早期保护作用目的:本研究利用切除双侧卵巢的小鼠,经侧脑室内注射Aβ1-442的方法建立阿尔茨海默病（AD）模型,并给予雌二醇（E2）治疗。检测Aβ1-42诱导的神经毒性及分子机制;评价E2拮抗Aβ1-42诱导的神经毒性的效果和分子机制。方法:1.双侧卵巢切除术:所有小鼠双侧卵巢切除并立即皮下植入药物,可以持续释放药物60天,内含有E2 0.18毫克。2.动物模型的制备:AD模型组小鼠Aβ1-42（4μg/mouse）,缓慢注射（0.5μl/min）;安慰剂组小鼠注射等量生理盐水（4μg/mouse）。3.BrdU注射:BrdU连续3次腹腔注射,间隔6小时,给药剂量为50mg/kg。4.雌二醇治疗:（1）早期E2治疗:注射BrdU后第7天双侧海马注射Aβ1-42,后给予7天雌二醇皮下注射,3 μg/day。（2）后期E2治疗:注射BrdU后第7天双侧海马注射Aβ1-42,7天后再给予7天雌二醇皮下注射,3 μ g/day。5.Morris水迷宫实验:计算每组小鼠平均游泳速度、延迟时间。在实验的第8天,撤去隐蔽的水面下平台,观察并记录小鼠的游泳速度及登台潜伏期。6.免疫染色:采用NeuN和BrdU免疫染色检测海马神经的生成。7.ELISA检测:检测促黄体生成激素（LH）、促卵泡激素（FSH）、雌激素（Estrogen）、孕酮（Progesterone）血清水平。8.RT-PCR:从大脑样本中取出海马组织,在冰上用剪刀将其剪碎。总mRNA采用Trizol试剂提取和RNA反转录与PrimeScriptTMRT试剂盒。9.Western blotting检测信号通路蛋白的表达:从大脑样本中取出海马组织,在冰上用剪刀将其剪碎。蛋白样品的提取采用放射免疫沉淀试验（RIPA）缓冲液。10.cAMP浓度测定:海马组织,在冰上用剪刀将其剪碎。组织颗粒在裂解缓冲液中裂解10分钟,在4℃、14000 rpm离心10分钟,收集上清液并用LANCETM cAMP 384试剂盒测定环磷酸腺苷（cAMP）浓度。11.透射电子显微镜:腹腔麻醉后小鼠,经心脏用2.5%戊二醛灌注并取出海马组织,海马组织继续用2.5%戊二醛固定过夜,在4℃,四氧化锇固定2小时后制作超薄切片（60 nm）,用丙酮脱水和醋酸铀染色。结果:1.小鼠海马注射Aβ1-42后,进行Morris水迷宫测试评,估认知功能,特别是空间学习和记忆能力（图1A）。在培训第1-2天,接受Aβ1-42注射的“老年”鼠在发现可见平台的游泳速度或时间延迟上与对照组相比没有差异,这表明空间学习能力不是在Aβ1-42注射后立即受到影响（P>0.05,n=10;见图1A）。相反,改为隐藏平台培训的第3-7天,Aβ1-42小鼠比对照组小鼠时间延迟更长,这些差异在5-7天显着,这表明记忆功能是在Aβ1-42注射后5天开始明显受损（P<0.01,n=10;见图 1A）。从迷宫中去掉平台后,观察小鼠在每个象限停留的时间比例（图1B）。Aβ1-42小鼠在象限虚拟平台的位置所花费的时间百分比明显减少。在本研究中,通过NeuN和BrdU染色标记海马神经元（图1C）,染色结果显示Aβ1-42模型组小鼠BrdU注射后21到28天,NeuN、BrdU 阳性细胞数量均显着减少（P<0.01,n=10;图1D）。这些结果表明,小鼠海马神经元在接受Aβ1-42注射后发生严重损害。2.为评估E2对AD小鼠病理过程中早期阶段的影响,在造模后立即给予E2治疗（图2C）。与单纯对照组相比,接受E2治疗的对照组海马神经元再生无明显变化,而Aβ1-42小鼠接受E2治疗与未接受E2治疗比较,NeuN和BrdU 阳性细胞显着增加（P<0.01,n=3;图2D）。此外,给予E2治疗后,AD小鼠找到隐藏平台的潜伏期显着降低（P<0.01,n=10;图2A）,在撤出平台的象限所停留的时间比例明显升高（P<0.01,n=10;图2B）。这些研究结果表明,在Aβ1-42小鼠AD病理过程的早期阶段,雌激素治疗增加海马元神经再生并促进认知功能的恢复。3.为评估E2对AD小鼠病理过程中后期阶段的影响,在造模后第7天开始给予E2治疗（图2C）。无论是对照组还是模型组,E2治疗均没有改善海马神经元再生,NeuN和BrdU阳性细胞没有明显变化（P>0.05,n=3;见图3D）。此外,给予E2治疗,并没有降低AD小鼠找到隐藏平台的潜伏期（P>0.05,n=10;见图3A）。在撤出平台的象限停留时间比例没有明显升高（P>0.05,n=10;见图3B）。4.通过测定LH、FSH、雌激素和孕激素的血清水平,确认E2的效果。在E2治疗前FSH,LH,雌激素或孕激素水平没有显着差异（P>0.05,n=6;图4A-D）,但在E2治疗后LH、FSH、雌激素水平显着增加,而孕酮水平明显下降（P<0.01,n=6;图 4A-D）。在早期给与雌二醇的Aβ1-42小鼠,TrkB、BDNF的mRNA及蛋白水平显着上调,而P75NTR表达水平减少（P<0.01,n=3;图4E,F）。这些结果表明,E2诱导的神经发生,至少部分通过BDNF/TrkB通路。对这一途径的下游因子进行了检测（图4E,F）和结果与以前的研究结果相一致,STAT3/CREB/ERK信号通路的激活明显增加（P<0.01,n=3;图4E,F）。本研究还对cAMP水平进行评估,以确认BDNF/TrkB下游信号通路的活化（图4D）。5.与后期E2治疗及未给予E2治疗比较,在早期给与雌二醇的A β 1-42小鼠,NO和ROS的水平明显降低（P<0.01,n=3;图5A）。相应的细胞死亡相关的Cytochrome-c/Bax/Bcl-2/acspase-3 信号通路因子活化下调（P<0.01,n=3;图5B-C）。这些结果表明,E2降低AD病理过程早期阶段海马区的细胞的氧化应激及死亡通路相关因子的活化,促进认知功能的恢复。6.与后期E2治疗及未给予E2治疗比较,在早期给与雌二醇的Aβ1-42小鼠,胶质细胞增生显着降低（P<0.01,n=3:图6A,B）。E2介导的炎症反应,上调抗炎信号通路的因子活化（CD206,FIZZ1,1、TGFβ）并下调促炎信号通路因子的活化（IL-1β,TNF 和 IL-6。P<0.01,n=3;图 6C-E）。7.在本研究中,使用透射电镜观察海马突触的超微结构。与后期E2治疗及未给与E2治疗比较,发现在早期给与雌二醇的Aβ1-42小鼠,突触的数量显着增加（P<0.01,n=3;图7A）。为了进一步探讨E2对不同类型突触的作用,采用Western blot对海马NMDA受体和AMPAR受体水平进行分析。NMDA受体（GluN1和GluN2）水平没有明显影响,而AMPAR受体水平（GluA1 GluA2）明显增加（P<0.01,n=3;图7B,C）。此外,还有重要的突触后蛋白Hevin和SPARC表达明显增加（P<0.01,n=3;图7B,C）,这两种蛋白在突触的生成及功能方面起着重要作用。结论:1.Aβ1-42小鼠认知功能减退与海马区神经元发生有关。小鼠海马神经元在接受Aβ1-42注射后发生严重损害,海马神经元损害在认知功能障碍方面起到重要作用。2.AD早期阶段E2可增加海马神经元再生并促进认知功能的恢复,而后期阶段E2治疗对的海马神经元再生及认知功能无改善。3.AD早期阶段E2治疗上调Aβ1-42小鼠海马神经元再生相关信号通路。4.AD早期阶段E2治疗可减少氧化应激、下调细胞死亡相关的信号通路活性。5.AD早期阶段E2治疗抑制Aβ1-42小鼠海马小胶质细胞过度增生。6.AD早期阶段E2治疗可增加海马神经元突触受体数量。第二部分 P38MAPK抑制剂对血管性痴呆大鼠海马细胞凋亡的保护作用及学习记忆能力的影响目的:本研究利用应用双侧颈总动脉结扎法（2-VO法）制作血管性痴呆（VaD）大鼠模型,经侧脑室内注射SB202190和SB203580的方法对VaD大鼠学习记忆能力进行研究,观察p38MAPK抑制剂对VaD大鼠海马依赖的Morris水迷宫的认知功能所起的作用,并通过研究海马神经元凋亡、海马区P38MAPK磷酸化变化及Bcl-2和Caspase-3表达,研究SB202190和SB203580对血管性痴呆大鼠海马区的神经保护机制,探讨海马神经元凋亡在血管性痴呆的发病机制中所起的作用。方法:利用应用双侧颈总动脉结扎法（2-VO法）制作血管性痴呆（VaD）大鼠模型,随机分为SB202190治疗组、SB203580治疗组、对照组和假手术组。假手术组只分离出双侧颈总动脉并不对其结扎,作为两血管法VaD模型的正常对比。治疗组采用侧脑室注射给药方式分别给予P38MAPK抑制剂SB202190、SB203580,对照组和假手术组采用侧脑室注射给药方式给予等量二甲基亚矾（DMSO）,注射药物2周后用Morris水迷宫法测试各组大鼠的学习记忆能力的变化。注射药物后应用TUNEL法检测海马区神经元凋亡,应用蛋白印迹（Western blot）法检测大鼠海马区P38MAPK磷酸化变化,免疫荧光法和激光共聚焦显微镜观察大鼠海马区Bcl-2和Caspase-3表达,以探讨SB202190和SB203580对血管性痴呆大鼠海马区的神经保护机制。结果:1.本研究对平台逃避潜伏期、空间学习、大鼠的SB203580或SB202190治疗效果均进行了研究。结果表明,SB203580和SB202190治疗组平台逃避潜伏期与假手术组和对照组相比明显缩短（**P<0.01）,说明大鼠的空间学习能力得以提高。2.给予SB203580和SB202190治疗5天后我们还观察到海马磷酸化激活P38 MAPK表达水平在各治疗组间差异显着（**P<0.01,SB203580治疗组或SB202190组治疗VS假手术组和对照组）。结果显示,SB203580或SB202190治疗后p38MAPK的表达显着降低。SB203580和SB202190治疗组间无显着差异。3.SB203580和SB202190有助于海马神经元抵抗慢性缺血诱导的细胞凋亡。为了探索SB203580和SB202190是否对血管性痴呆大鼠体外海马细胞凋亡和学习记忆能力有效,本实验用HT22细胞测试SB203580和SB202190的治疗效果。与对照组相比,用SB203580或SB202190治疗后实验组海马神经元凋亡减少。实验也证实了在体内SB203580、SB202190对海马细胞凋亡和血管性痴呆大鼠学习记忆能力是有疗效的。侧脑室注射SB203580和SB202190治疗五天后,处死大鼠,与对照组、SB203580和SB202190组相比,假手术组TUNEL阳性细胞数（脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导缺口末端标记,绿色荧光）显着下降（**P<0.01）。然而,SB203580和SB202190组与对照组相比,前者TUNEL阳性细胞数目显着降低;而且SB203580组与SB202190组相比,前者TUNEL 阳性细胞较少。总之,SB203580和SB202190有助于海马神经元抵抗慢性缺血诱导的细胞凋亡。4.本实验研究了 SB203580和SB202190对VaD大鼠海马区施加的抗凋亡能力。脑室注射五天后,处死大鼠获取VaD大鼠海马标本。SB203580或SB202190培养48小时后,进行实验计算实验组凋亡细胞的数量（n=3）。P38MAKA培养后,HT22细胞出现皱缩,碎裂成膜结合凋亡小体,很快被邻近细胞吞噬。P38MAKA能够减少HT22细胞的凋亡。而SB203580或SB202190治疗组凋亡的HT22细胞数量均显着低于对照组。5.在VaD大鼠模型的海马标本上进行了 P38 MAKA和凋亡相关基因之间的关系研究。我们对P38MAKA诱导细胞凋亡相关的mRNA的表达水平进行了分析。与假手术组和对照组相比,细胞凋亡抑制基因BAX和Bcl-2在VaD大鼠海马经SB203580 或 SB202190 治疗后表达增加。caspase-8、caspase-3 和 caspase-9 的表达在SB202190或SB203580治疗组比对照组均显着降低。但SB202190治疗组细胞凋亡抑制基因Bax和Bcl-2的表达比SB203580组略高,这表明SB202190可通过抑制P38 MAKA的活性而减少细胞凋亡,依赖线粒体的凋亡途径可以由慢性缺血激活。6.大鼠经SB203580和SB202190治疗存活时间延长 实验组其余VaD大鼠模型继续存活以观察治疗的远期疗效。假手术组和对照组大鼠在第30天处死。相反,约30%SB202190组和60%SB203580组的动物最后需要处死（**P<0.01）。这说明与SB203580相比,SB202190治疗可进一步延长大鼠的存活时间。其中,相对于SB203580,SB202190较好的治疗效果体现在VaD大鼠显着的生存优势（**P<0.05）结论1.P38MAPK抑制剂SB202190和SB203580,能提高或改善VaD大鼠的学习记忆能力。2.本研究给予VaD大鼠P38MAPK抑制剂治疗后p38MAPK的表达显着降低,有效减少海马神经元细胞凋亡,促进记忆障碍重建,且耐受性良好。3.SB203580和SB202190通过抑制P38 MAKA的活性而减少细胞凋亡,有助于海马神经元抵抗慢性缺血诱导的细胞凋亡,依赖线粒体的凋亡途径可以由慢性缺血激活。4.大鼠经SB203580和SB202190治疗存活时间延长,与SB203580相比,SB202190治疗可进一步延长大鼠的存活时间。第三部分 TPX2对阿尔茨海默病模型大鼠神经细胞凋亡的保护作用机制的研究目的:研究TPX2对阿尔茨海默病模型大鼠神经细胞凋亡的保护作用机制。方法:将90只大鼠随机分为药物组、对照组和空白组,每组30只。在药物治疗组和空白组大鼠用1 0%水合氯醛麻醉（0.5ml/100g剂量）,在大鼠双侧海马区域的准确位置注入Aβ1-425ul（浓度1μg/ul）建立模型。将配置的TPX2抑制剂制成溶液。模型建立后,各组大鼠分别给予不同的治疗方法;药物组大鼠将TPX2-siRNA溶液连接10μl微量注射器给予侧脑室注射10μl,对照组大鼠给予侧脑室注射等量1%DMSO溶液。空白组为正常健康组,本组大鼠未作任何手术或药物治疗。大鼠脑组织分为两个部分,一部分是固定、脱水、石蜡包埋、制成约5um厚度的切片。TUNEL染色检测脑组织细胞凋亡,HE染色观察各组脑组织细胞,Western blot检测ERK、MAPK和p38的表达水平,采用RT-PCR方法检测MAPK、ERK和p38中mRNA的表达水平。结果:一周后,TUNEL染色显示在药物组脑组织细胞凋亡率明显高于对照组和空白组,差异具有统计学意义（P<0.05）;使用TPX2抑制剂后,药物组TPX2的mRNA表达水平显着低于对照组,差异具有统计学意义（P<0.05）,分别检测MAPK和p38蛋白的mRNA表达水平,药物组MAPK水平显着高于对照组及空白组,差异具有统计学意义（P<0.05）;Western blot灰度值比较中发现,MAPK和p38的表达水平无显着差异,其差异不具有统计学意义（P>0.05）。然而,在药物组中,MAPK、p38表达水平明显高于对照组,空白组MAPK灰度值则明显下降,其差异具有统计学意义（P<0.05）。结论:因此,TPX2通过抑制MAPK、ERK和p38蛋白的表达抑制经Aβ1-42处理的脑组织细胞发生凋亡,对其有保护作用。
吴琼[6]（2019）在《定痫汤加减联合丙戊酸钠治疗缺血性卒中后癫痫痰瘀阻络型及对hs-CRP影响的临床研究》文中指出目的:观察定痫汤加减联合丙戊酸钠治疗缺血性卒中后癫痫痰瘀阻络型的临床疗效和安全性,以及对血清hs-CRP（hypersensitive C-reative protein,hs-CRP）影响。方法:采用随机对照的临床研究方案,选取广西中医药大学第一附属医院脑病一区,2018年03月至2019年03月符合纳入标准的门诊及住院缺血性卒中后癫痫痰瘀阻络型患者共67例。予随机数字表法分为治疗组33例和对照组34例。对照组予丙戊酸钠抗癫痫治疗,治疗组予定痫汤加减联合丙戊酸钠抗癫痫治疗。所有入组患者治疗前后观察及记录发作频次、发作时间、中医证候积分、癫痫患者生活质量量表评分、美国国立卫生研究院卒中量表、血清hs-CRP、脑电图及安全指标和不良反应,评定临床疗效性和安全性。结果:治疗2个月后,治疗组发作控制有效率93%优于对照组83%（P<0.05）;治疗组中医证候积分、癫痫患者生活质量量表评分、美国国立卫生研究院卒中量表评分改善均优于对照组（P<0.05）;治疗组患者血清hs-CRP下降明显高于对照组（P<0.05）;两组不良反应发生无明显差别（P>0.05）。结论:定痫汤加减联合丙戊酸钠治疗缺血性卒中后癫痫痰瘀阻络型临床疗效显着,安全可靠,促进神经功能恢复,改善癫痫患者生活质量,降低缺血性卒中后癫痫患者血清hs-CRP水平。
刘结民[7]（2019）在《热敏灸对缺氧缺血性脑病新生小鼠脑组织细胞凋亡的影响》文中指出目的:研究热敏灸大椎穴治疗新生儿小鼠缺氧缺血性脑病（NHIE）疗效并探讨其作用机制。方法:SPF级健康ICR小鼠（重约3～5g）按随机对照原则分成假手术组、缺氧缺血模型组、艾灸治疗组;艾灸治疗组依据小鼠尾温变化再次分为非热敏灸组（尾温未上升）和热敏灸组（尾温升高）。缺氧缺血模型组、艾灸治疗组按照Rice-Vannucci和Levine的方法制备NHIE模型;以生长发育的体重、神经行为学测试（翻正反射、悬崖躲避试验、趋地反射试验、抓力试验）、形态学观察、TTC、TUNEL、caspase-9为检测指标。结果:纳入统计的四组新生小鼠体重统计学上无差异（P>0.05）,在术后三天,与缺氧缺血模型组比较,非热敏灸组和热敏灸组的小鼠体重增长较快,统计学上有差异（P<0.05）。与缺氧缺血模型组比较,非热敏灸组和热敏灸组小鼠的翻正反射时间、悬崖躲避试验时间、趋地反射试验时间明显缩短,而抓力试验时间延长,统计学上有差异（P<0.05）。非热敏灸组和热敏灸组梗死面积较缺氧缺血模型组均减少（P<0.05）,且热敏灸组梗死面积明显减少（P<0.05）。缺氧缺血模型组小鼠左侧脑组织表面出现大面积苍白、液化现象,且脑组织萎缩,大面积梗死;与缺氧缺血模型组比较,非热敏灸组梗死面积较小,热敏灸组梗死面积最小。缺氧缺血模型组左侧脑组织细胞排列顺序杂乱无章,细胞大量丢失,缝隙变大;与缺氧缺血模型组比较,非热敏灸组仅少量细胞脱落,热敏灸组细胞脱落数量最少。非热敏灸组和热敏灸组表达的TUNEL阳性细胞总数较缺氧缺血模型组减少（P<0.05）;热敏灸组较非热敏灸组表达的TUNEL阳性细胞总数减少（P<0.05）。非热敏灸组和热敏灸组表达的caspase-9阳性细胞总数较缺氧缺血模型组减少（P<0.05）;热敏灸组较非热敏灸组表达的caspase-9阳性细胞总数减少（P<0.05）。结论:热敏灸大椎穴可以增加缺氧缺血性脑病新生小鼠的体重,提高其运动功能,减少脑梗死面积,抑制细胞脱落,其机理也许与降低脑组织中caspase-9的阳性表达和细胞凋亡的数量有关。
韩雪[8]（2019）在《基于TLR4/MAPKs/NF-κB信号通路和钙通道的6-姜酚心肌保护作用及机制研究》文中研究指明氧化应激、免疫炎症反应、细胞凋亡和钙离子超载等是导致心肌损伤的重要生物学事件。心肌缺血损伤时,Toll样受体4/核因子кB（TLR4/NF-кB）信号通路激活,氧自由基和细胞炎性因子大量释放,丝裂原活化蛋白激酶族（MAPKs）信号被激活,使转录因子和细胞蛋白磷酸化,加剧炎症反应,诱发细胞凋亡,引起细胞坏死。因此,TLR4/MAPKs/NF-кB信号通路与心肌损伤密切相关。钙超载参与心肌损伤的发病机制,可能与引起心律失常、细胞过度挛缩、线粒体Ca2+积累有关。外源性Ca2+主要通过L-型钙通道进入细胞,L-型钙通道阻滞剂能够通过抑制钙通道来保护心肌缺血损伤。因此,可以削弱L-型Ca2+电流(ICa-L)的药物有望用于心肌保护。生姜中有效成分6-姜酚（6-Gingerol,6-Gin）具有抗炎、降血压、抗动脉粥样硬化等药理活性,在心血管疾病中发挥重要作用,但是6-Gin心肌保护作用分子机制尚未可知。本研究通过动物实验和细胞实验,基于TLR4/MAPKs/NF-кB信号通路和钙通道对6-Gin心肌保护作用机制进行初步探讨。第一部分6-Gin对心肌纤维化小鼠的保护作用及机制研究目的:基于TLR4/MAPKs/NF-кB信号通路探讨6-Gin对心肌纤维化（MF）小鼠的保护作用及机制。方法:50只小鼠随机分为空白对照组（Con）、异丙肾上腺素模型组（ISO）、6-Gin低剂量组（L-6-Gin）、6-Gin高剂量组（H-6-Gin）、普萘洛尔组（Pro）5组,每组10只。Con组小鼠灌胃、同时皮下注射生理盐水,ISO组小鼠灌胃生理盐水,同时皮下注射ISO（10 mg/kg/d）。L-6-Gin组和H-6-Gin组灌服6-Gin（10,20 mg/kg/d）,同时皮下注射ISO（10 mg/kg/d）,Pro组腹腔注射Pro（40 mg/kg/d）,同时皮下注射ISO（10 mg/kg/d）,连续14天。比色法、免疫组化方法、TUNEL染色和Western blot等方法观察6-Gin对ISO致心肌纤维化小鼠氧化应激、炎性反应、细胞凋亡及TLR4/MAPKs/NF-кB信号通路的影响。结果:1.6-Gin能显着降低ISO诱导的MF小鼠心率和J点的抬高。2.6-Gin能显着降低ISO诱导的MF小鼠心脏重量指数（CWI）和左心室重量指数（LVWI）。3.6-Gin能显着降低ISO诱导的MF小鼠血清肌酸激酶（CK）和乳酸脱氢酶（LDH）水平。4.HE染色和天狼星红染色结果显示6-Gin能改善MF小鼠心肌纤维化程度。5.6-Gin能显着升高MF小鼠心肌组织超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽（GSH）活性,降低丙二醛（MDA）含量和钙离子含量。6.免疫组化结果显示,6-Gin能降低MF小鼠肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）、c-fos和c-jun的表达。7.TUNEL结果显示,6-Gin能降低MF小鼠凋亡细胞数量;Western blot结果显示6-Gin能降低MF小鼠心肌组织Bax和Caspase-3表达,升高Bcl-2表达,抑制细胞凋亡。8.Western blot结果显示,6-Gin能降低MF小鼠TLR4、p38分裂原活化蛋白激酶（p38）、p-p38、细胞外调节蛋白激酶（ERK1/2）、p-ERK1/2、c-Jun氨基端激酶（JNK）、p-JNK、NF-kB蛋白表达。第二部分6-Gin对H9c2心肌细胞缺氧损伤的保护作用及机制研究目的:基于p38/NF-кB信号通路探讨6-Gin对氯化钴（CoCl2）致H9c2心肌细胞缺氧损伤的保护作用及机制。方法:H9c2心肌细胞分为4组:1)Con组;2)CoCl2组:400μmol/L（μM）的CoCl2处理;3)L-6-Gin组:20μM的6-Gin孵育12小时+400μM的CoCl2孵育22小时;4)H-6-Gin组:40μM的6-Gin孵育12小时+400μM的CoCl2孵育22小时。利用比色法、Elisa法、流式细胞技术和Western blot等方法观察6-Gin对CoCl2致H9c2心肌细胞缺氧损伤的保护作用及对p38/NF-кB信号通路的影响。结果:1.CoCl2对H9c2心肌细胞存活率影响的实验表明,200,300,400,500和600μM的CoCl2分别处理H9c2心肌细胞22小时,存活率明显降低,400μM的CoCl2处理细胞存活率下降50%左右,因此选择400μM的CoCl2作为低氧损伤浓度。2.6-Gin对H9c2心肌细胞存活率影响的实验表明,10,20,30,40,50和60μM的6-Gin分别处理H9c2心肌细胞12小时,对细胞存活率没有影响,参考相关文献选择20和40μM的6-Gin作为干预浓度。3.6-Gin能显着降低细胞上清液中CK和LDH释放量。4.6-Gin能显着降低细胞活性氧（ROS）的生成,降低细胞内钙含量和MDA含量,升高SOD、CAT和GSH水平。5.Elisa检测结果显示,6-Gin能显着降低细胞TNF-α和IL-6的含量。6.流式细胞仪检测结果显示,6-Gin能显着降低细胞凋亡率。7.Western blot结果显示,6-Gin能显着降低p38和NF-kB的蛋白表达,升高Nrf2、HIF-1a和HO-1蛋白表达。第三部分6-Gin对大鼠心肌细胞L-型钙通道、收缩力及钙瞬变的影响目的:通过观察6-Gin对大鼠心肌细胞ICa-L、收缩力和钙瞬变的影响,探讨其心肌保护作用分子机制。方法:利用全细胞膜片钳技术、心肌细胞收缩及离子浓度同步测量系统观察6-Gin对大鼠心肌细胞ICa-L、收缩力和钙瞬变的影响。结果:1.300μM的6-Gin可以显着地抑制正常心肌细胞和缺血心肌细胞的ICa-L,抑制率分别为58.17±1.04%和55.22±1.34%,且在给予细胞外液后,钙电流可部分恢复到给药前水平。2.6-Gin以浓度依赖性方式抑制ICa-L,3,10,30,100和300μM的6-Gin的抑制率分别为8.71±0.60%,16.2±0.80%,32.67±0.76%,54.33±1.89%和58.17±1.04%。3.3,30和300μM的6-Gin可在激活电位和峰电位保持不变的情况下显着上移I-V关系曲线。4.6-Gin对ICa-L的稳态激活和失活无显着性作用。5.300μM的6-Gin能够显着抑制心肌细胞收缩幅度,抑制率为48.87±5.44%,钙瞬变的峰值下降42.5±9.79%。6.300μM的6-Gin能显着抑制心肌细胞收缩达峰时间的50%（Tp50）及恢复基线水平时间的50%（Tr50）,降低细胞收缩和舒张的最大速率（±dL/dt）。结论:1.6-Gin对ISO致心肌纤维化小鼠的保护作用机制与抑制TLR4/MAPKs/NF-kB信号通路,抑制氧化应激、炎症反应和细胞凋亡有关。2.6-Gin对CoCl2致H9c2心肌细胞缺氧损伤的保护作用机制与抑制p38/NF-kB通路,激活Nrf2通路,升高HIF-1a和HO-1表达,进而抑制氧化应激、炎性因子释放和细胞凋亡有关。3.6-Gin能显着抑制心肌细胞ICa-L,减少钙离子内流,从而抑制心肌细胞[Ca2+]i和收缩力,这可能是其心肌保护的分子机制之一。
李琳[9]（2015）在《川芎嗪预处理促进骨髓间充质干细胞向损伤区迁移提高脑缺血的治疗作用》文中指出目的 观察川芎嗪（Ligustrazine）预处理促进骨髓间充质干细胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs）向损伤区迁移提高脑缺血的治疗作用,并探讨其可能作用机制。方法①采用全骨髓贴壁法体外培养大鼠骨髓间充质干细胞,传至第3代,流式细胞仪检测BMSCs阳性抗原（CD29和CD90）及阴性抗原（CD34和CD45）鉴定BMSCs纯度,不同终浓度BrdU（5 μmol/L、10 μmol/L和20 μmol/L）标记BMSCs24 h、48h和72 h,检测BrdU标记率。②采用线栓法诱导大鼠右侧大脑中动脉阻塞模型,缺血90min,缺血24 h后除假手术组外,随机分为模型组,MCAO+未预处理BMSCs组（BMSCs组）,MCAO+50 μM川芎嗪预处理BMSCs组（50μM川芎嗪组）,MCAO+100μM川芎嗪预处理BMSCs组（100 μM川芎嗪组）,50 μM川芎嗪预处理BMSCs+CXCR4拮抗剂AMD3100组（AMD3100）,每组各12只,模型组和假手术组,经尾静脉缓慢注射1 mLPBS,其它各组经尾静脉缓慢注射1mL细胞悬液（1×106mmL）。③在缺血后第1、7、14和28d采用改良神经损伤严重程度评分、粘胶揭除试验和角试验进行神经功能评价。④缺血后第28 d,采用免疫荧光法检测缺血周边区BMSCs数量,采用甲苯胺蓝染色检测脑缺血梗死体积。⑤缺血后第14 d,采用免疫荧光法检测缺血周边区BMSCs数量、基质细胞衍生因子-1（SDF-1）、血管性血友病因子（vWF）、血管内皮生长因子（VEGF）和脑源性神经营养因子（BDNF）的表达。结果①采用全骨髓贴壁法,可得到生长良好,形态均一性的BMSCs,第3代BMSCs的表型鉴定CD29、CD90、CD34和CD45阳性表达率分别为99.0%、99.3%、0.2%和4.1%,符合BMSCs的特点,说明是分离培养纯度较高的BMSCs。②在缺血后第7 d、14 d和28 d,川芎嗪预处理（50 μM和100 μM）组显着改善大鼠脑缺血后神经症状（P<0.01或<0.05）,减少大鼠黏胶揭除时间（P<0.01或P<0.05）,大鼠右转次数显着减少（P<0.01或P<0.05）。③缺血后第28 d,与模型组和BMSCs组比较,川芎嗪预处理（50 μM和100 μM）组大鼠脑缺血的梗死体积显着性减少（P<0.01或P<0.05）。④缺血后第14 d,与模型组、BMSCs组和AMD3100组比较,川芎嗪预处理（50μM和100μM）组缺血周边区的BrdU、SDF-1、vWF、VEGF和BDNF免疫阳性细胞明显增加（P<0.01）。结论 川芎嗪（50 μM和100 μM）预处理BMSCs治疗脑缺血的疗效优于BMSCs,川芎嗪预处理促进BMSCs向脑缺血损伤区迁移,促进神经功能恢复,缩小脑梗死体积,机制可能与促进脑缺血周边区血管生成及上调脑缺血周边区的SDF-1、VEGF和BDNF的表达有关。
林锦璇[10]（2014）在《川芎嗪衍生物药理活性及其机制研究》文中进行了进一步梳理本课题由国家自然基金项目（81173519）及北京中医药大学创新团队项目（2011-CXTD-15）资助。受启发于中药的配伍和化药的拼合,本课题组前期基于川穹——丹参、川芎——当归经典药对中的活性成分,设计、合成了川芎嗪系列衍生物108个。经过9种细胞模型系统筛选发现川芎嗪化合物17和化合物4、13、26分别具有神经保护和抗肿瘤先导化合物的研究价值。本论文深入开展上述先导化合物药理活性及其作用机制研究,结合前期工作基础研究内容分为两部分。第一部分川芎嗪衍生物17对分化后神经细胞拟缺血损伤模型的影响川芎嗪衍生物17,结构新颖,是从60种川芎嗪衍生物中初步筛选出来的,具有较强的神经细胞保护活性先导化合物。本课题通过NGF诱导PC12细胞分化,建立体外拟缺血损伤神经细胞模型,进一步探讨该药对神经元作用及其机制。一、化合物17对神经细胞拟缺血损伤模型的影响及其作用机制研究目的:观察化合物17对体外培养PC12细胞在NGF诱导、拟缺血损伤等条件下生长的影响并观察化合物17对损伤神经细胞NF-κB/p65、COX-2的表达情况,探讨化合物17对神经细胞保护作用及作用机理。方法:1.化合物17对神经细胞活性的影响:未分化PC12细胞的生长条件为85%RPMI1640+5%胎牛血清+10%马血清+双抗（100μg·mL-1链霉素和100 青霉素）;分化后培养基改为90%RPMI1640+10%胎牛血清+双抗（100μg·mL-1链霉素和100 U·mL-1青霉素）;在37℃恒温、5%C02及饱和湿度培养箱中生长。通过NGF对PC12细胞诱导分化并用CoC12作用于细胞12h后建立拟缺血损伤模型,采用MTT法测定化合物17对神经细胞活性的影响。2.化合物17对拟缺血损伤神经细胞凋亡的影响:利用流式细胞仪技术观察不同给药浓度的化合物17对分化后拟缺血损伤PC12细胞凋亡率的变化,探讨化合物17是否通过影响神经细胞凋亡率,从而促进神经细胞增殖,减轻神经细胞损伤程度。3.化合物17对诱导分化拟缺血损伤PC12细胞形态学的影响及其作用机制研究:采用HE染色法,观察不同作用浓度化合物17对分化后拟缺血损伤PC12细胞形态学的变化;采用ICC染色法,分析NF-κB/p65、COX-2的表达。结果:1.熟练掌握了该课题组建立的PC12细胞培养体系,实验结果稳定;并验证PC12细胞分化后拟缺血损伤模型作为神经保护药物筛选模型的可行性;以50ng·mL-1NGF,作用24h诱导PC12细胞分化建立神经细胞模型;以200μmol·L-1氯化结,作用12h为分化后PC12细胞拟缺血损伤造模条件。2.化合物17可使拟缺血损伤神经细胞活性增强,并呈现一定的量效关系,3.75μmol.L-1、7.5μmol·L-1、15μmol·L-1、30μmol·L-1、60μmol·L-1各浓度组的OD值明显高于模型组及川芎嗪组;浓度为60μmol.L-1时OD值明显高于NGF组。3.化合物17可抑制分化拟缺血损伤PC12的凋亡;不同作用浓度化合物17组可显着抑制神经细胞凋亡,提高细胞存活率;15μmol·L-1、30μmol·L-1、60μmol·L-1各浓度组的细胞存活率值明显高于NGF组及模型组。4.化合物17对拟缺血损伤神经细胞形态学的影响HE染色结果:（1）NGF组:与模型组比较,可见细胞体积显着增大,胞核也增大,胞浆较饱满,几乎每个胞体均长出多个突起,长短不一,突起末端呈现楔状的生长锥,相互交错形成网状;（2）模型组:细胞两极突起减少或消失;细胞折光性差,核固缩,核碎裂,核溶解,胞浆少,包膜破裂,细胞坏死;（3）化合物17组:与NGF组相比较,可发现细胞突起数目增多,突起长度增长,特别是高剂量组变化明显。ICC染色结果:（1）NF-KB/p65:化合物17可增加缺氧时NF-κB/p65的表达;（2）COX-2:化合物17可减少缺氧时COX-2的表达。结论:化合物17对拟缺血损伤神经细胞具有保护作用;化合物17具有NGF激动剂活性;其作用机理可能为:化合物17可能通过增加NF-κB/p65的激活,并减少下游因子COX-2的表达,减轻PC12细胞拟缺血后的炎症反应,抑制损伤神经细胞凋亡,对神经细胞起到保护作用。二、结语综上所述,化合物17具有明显的NGF激动剂活性,并能够显着减轻分化后PC12细胞缺血缺氧引起的损伤,随着化合物17浓度的增加对拟缺血损伤的神经细胞保护作用显着增强。其作用机制可能为:抑制神经细胞凋亡,减少下游因子COX-2的表达,进而抑制神经细胞拟缺血损伤后的炎症反应,产生神经保护作用。第二部分川芎嗪衍生物4、13、26的抗肿瘤活性及机制研究基于中医经典药对抗癌活性成分,以拼合原理为指导,设计、合成高效、低毒的抗癌先导化合物,是发现新型抗肿瘤药物的思路之一。川芎嗪具有扩张血管、抑制血小板聚集、抗凝、改善微循环、抗氧化和钙拮抗、抗内皮素和保护血管内皮等作用。川芎嗪衍生物4、13、26是由北京中医药大学中药学院从48种川芎嗪衍生物中初步筛选出来的,具有较强抗肿瘤活性。前期关于这3种化合物的急性毒性试验,未出现毒性反应或较轻,提示这些化合物安全性较高。本文利用MTT比色法完成化合物4、13、26在HepG2、MCF-7、Hela和HT-29等在4种癌细胞模型上的抗肿瘤活性多浓度梯度筛选,并计算出IC50,与阳性药顺铂进行比较。利用AnnexinV-PI凋亡检测试剂盒与流式细胞仪检测先导化合物4、13、26诱导HepG2细胞凋亡的作用;并检测化合物26对HepG2细胞周期分布的影响;采用H22荷瘤小鼠模型检测化合物26对肿瘤生长的抑制作用,为抗肿瘤先导化合物的发现研究提供实验依据。1.抗肿瘤先导化合物的筛选及其IC50值测定为了考察本课题组在研的先导化合物,重点是川芎嗪衍生物的抗肿瘤活性,确定了4种肿瘤细胞的MTT筛选条件,对活性较好的化合物进一步抗肿瘤活性筛选,并计算其IC50值,结果显示川芎嗪衍生物4、13和26的抗肿瘤效果显着,它们抑制肿瘤细胞增殖的作用呈现剂量依赖性,且IC50值与顺铂相当。2.化合物4、13及26诱导HepG2细胞凋亡的检测为了研究化合物4、13和26是否通过诱导凋亡的方式抑制肿瘤细胞增殖,我们利用流式细胞仪对这些化合物作用于HepG2细胞后的凋亡率变化进行了检测,结果显示化合物4、13、26均可浓度依赖性地诱导细胞凋亡,且以早期凋亡为主。3.化合物26影响HepG2细胞周期分布的检测多数抗肿瘤化合物可以诱导细胞凋亡同时具有细胞周期依赖性,因此我们采用流式细胞仪检测了化合物26对HepG2细胞周期分布的影响。结果显示化合物26可使细胞周期的各时相细胞百分数发生显着改变,主要表现为三个不同浓度均使GO/GI期与G2/M期细胞数增加,S期细胞数减少,结果提示化合物26可使细胞停滞在GO/GI期与G2/M期,阻止S期细胞向G2/M期移行,最终诱导细胞凋亡,而且可能以S期为主。4.化合物26对H22荷瘤小鼠模型的抗肿瘤作用化合物26对肿瘤细胞表现出显着的抗肿瘤作用,其作用机制可能与促进肿瘤细胞的凋亡、干扰肿瘤细胞的分裂周期有关。为了探讨其体内抗肿瘤作用,设计了 H22荷瘤小鼠的体内实验。结果表明,化合物26可以显着抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长,给药浓度为30mg/kg（腹腔注射）时抑瘤率达到了 60%以上,并呈现出较低的毒副作用。
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文索引 |
| 前言 |
| 第一部分 冰片配伍AST Ⅳ和 PNS对脑缺血/再灌注损伤大鼠行为学及病理形态学的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物及分组 |
| 1.2 受试药物、剂量确定及药物配制 |
| 1.3 试剂及仪器 |
| 1.4 实验方法 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 MCAO模型的评价 |
| 2.2 Bederson神经功能评分比较 |
| 2.3 Garcia JH神经功能评分比较 |
| 2.4 脑梗死体积的比较 |
| 2.5 脑组织病理形态的比较 |
| 3 讨论 |
| 3.1 实验模型及动物的选择 |
| 3.2 中医对缺血性脑卒中的认识及中药治疗 |
| 4 小结 |
| 第二部分 冰片配伍AST Ⅳ和 PNS对脑缺血/再灌注损伤大鼠神经血管单元特异性结构蛋白及其结构完整性的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物及分组 |
| 1.2 受试药物、剂量及浓度 |
| 1.3 实验器材、耗材、试剂及仪器 |
| 1.4 实验方法 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 冰片配伍AST Ⅳ和 PNS对 CIRI后脑缺血皮质区NeuN表达的影响 |
| 2.2 冰片配伍AST Ⅳ和 PNS对 CIRI后脑缺血皮质区Laminin表达的影响 |
| 2.3 冰片配伍AST Ⅳ和 PNS对 CIRI后脑缺血皮质区GFAP表达的影响 |
| 2.4 冰片配伍AST Ⅳ和 PNS对 CIRI后 脑缺血皮质区EBA表 达的影响 |
| 2.5 冰片配伍AST Ⅳ和 PNS对 CIRI后脑缺血皮质区NVU的主要组分结构关系的影响 |
| 3 讨论 |
| 3.1 指标选择依据 |
| 3.2 冰片配伍AST Ⅳ和 PNS对 CIRI后脑缺血皮质区Neu N、 EBA和Laminin及 GFAP表达的影响 |
| 3.3 冰片配伍AST Ⅳ和 PNS对 CIRI后脑缺血皮质区NVU主要组分的结构关系的影响 |
| 4 小结 |
| 第三部分 冰片配伍AST Ⅳ和 PNS对脑缺血/再灌注损伤大鼠神经血管单元主要组分相关功能蛋白的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物及分组 |
| 1.2 受试药物、剂量及浓度 |
| 1.3 实验器材、耗材、试剂及仪器 |
| 1.4 实验方法 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 冰片配伍AST Ⅳ和 PNS对 CIRI后脑缺血皮质区αII-Spectrin表达的影响 |
| 2.2 冰片配伍AST Ⅳ和 PNS对 CIRI后脑缺血皮质区AQP-4表达的影响 |
| 2.3 冰片配伍AST Ⅳ和 PNS对 CIRI后脑缺血皮质区VEGF表达的影响 |
| 2.4 冰片配伍AST Ⅳ和 PNS对 CIRI后脑缺血皮质区MMP-9 表达的影响 |
| 3 讨论 |
| 3.1 指标选择依据 |
| 3.2 冰片配伍AST Ⅳ和 PNS对 CIRI后脑缺血皮质区αII-Spectrin、AQP-4、MMP-9及VEGF表达的影响 |
| 4 小结 |
| 第四部分 冰片配伍AST Ⅳ和 PNS对脑缺血/再灌注损伤大鼠损伤局部Notch信号通路的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物及分组 |
| 1.2 受试药物、剂量及浓度 |
| 1.3 实验器材、耗材、试剂及仪器 |
| 1.4 实验方法 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 冰片配伍AST Ⅳ和 PNS对 CIRI后脑缺血皮质区Notch1表达的影响 |
| 2.2 冰片配伍AST Ⅳ和 PNS对 CIRI后脑缺血皮质区NICD表达的影响 |
| 2.3 冰片配伍AST Ⅳ和 PNS对 CIRI后脑缺血皮质区Hes1 表达的影响 |
| 2.4 冰片配伍AST Ⅳ和 PNS对 CIRI后脑缺血皮质区DLL4 表达的影响 |
| 3 讨论 |
| 3.1 指标选择依据 |
| 3.2 冰片配伍AST Ⅳ和 PNS对 CIRI后脑缺血皮质区Notchl、NICD、Hesl及 DLL4 表达的影响 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录A 个人简历 |
| 文献综述 |
| 文献综述一 基于神经血管单元的缺血性脑卒中相关信号通路研究进展 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 黄芪、三七及冰片抗脑缺血的研究进展 |
| 参考文献 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 放射性肺损伤的中医理论探讨 |
| 1 中医学对放射性肺损伤病名的认识 |
| 2 中医学对放射性肺损伤病因的认识 |
| 3 中医学对放射性肺损伤病机的认识 |
| 4 中医学对放射性肺损伤病理特点的认识 |
| 5 放射性肺损伤治疗原则浅析 |
| 6 放射性肺损伤中医治法浅析 |
| 7 选方分析 |
| 8 参考文献 |
| 第二部分 现代医学对放射性肺损伤的认识 |
| 1 放射性肺炎 |
| 2 放射性肺纤维化 |
| 3 放射性肺损伤西医治疗 |
| 4 EMT |
| 5 EMT的发病因素 |
| 6 与EMT相关的转录因子 |
| 7 调节EMT的部分信号通路 |
| 8 复方苦参注射液对EMT中 TGF-β/Smads和 Wnt/β-catenin信号通路的协同作用 |
| 9 选方分析 |
| 10 参考文献 |
| 第三部分 实验部分 |
| 实验一 放射性肺损伤小鼠模型的建立及评价 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 5 讨论 |
| 6 参考文献 |
| 实验二 复方苦参注射液对小鼠放射性肺损伤肺组织病理形态学的影响 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 5 讨论 |
| 6 参考文献 |
| 实验三 复方苦参注射液对放射性肺损伤小鼠肺组织EMT相关的表型标记物E-cadheren、Vimentin表达的影响 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 5 讨论 |
| 6 参考文献 |
| 实验四 复方苦参注射液对小鼠放射性肺损伤血清中TNF-α和TGF-β1 表达的影响 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 5 讨论 |
| 6 参考文献 |
| 实验五 复方苦参注射液对放射性肺损伤小鼠肺组织TGF-β/Smads和Wnt/β-catenin信号通路的影响 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 5 讨论 |
| 6 参考文献 |
| 结语 |
| 附录 |
| 综述一 |
| 参考文献 |
| 综述二 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间参与课题和发表论文情况 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 文献综述 |
| 文献综述一 天然药物调控自噬治疗肿瘤及基于益气活血解毒理论的应用 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 自噬影响肿瘤发生与转移的研究进展 |
| 参考文献 |
| 文献综述三 肝素酶与血管生成相关研究进展 |
| 参考文献 |
| 文献综述四 三阴性乳腺癌肿瘤异质性与治疗研究进展 |
| 辨文献 |
| 第二部分 乙酰肝素酶对MDA-MB-231乳腺癌肿瘤生长、自噬、血管生成的干预作用 |
| 实验一 乙酰肝素酶对乳腺癌患者生存情况的影响分析 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 实验二 乙酰肝素酶对MDA-MB-231细胞自噬水平的影响 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 实验三 MDA-MB-231乳腺癌乳垫原位移植瘤模型建立以及乙酰肝素酶表达水平对体内肿瘤生长及血管生成的干预作用 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 第三部分 益气活血解毒中药对HPSE高表达乳腺癌体内外的干预作用及自噬及血管生成方面的机制研究 |
| 实验一 SANT对乳腺癌细胞生长的影响 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 实验二 SANT对乳腺癌细胞迁移的影响 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 实验三 SANT对乳腺癌细胞肝素酶表达及自噬的影响 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 实验四 SANT对小鼠肿瘤生长的抑制作用及安全性评价 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 实验五 SANT对肿瘤血管生成的干预作用及机制分析 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 实验六 SANT对肿瘤组织自噬相关基因表达的影响及分析 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语 |
| 前言 |
| 第一部分 理论研究 |
| 1. 对“血瘀理论”及“活血化瘀法”的认识 |
| 1.1 “瘀”是体内一种状态(高凝状态) |
| 1.2 “致瘀”是一个致病过程(血栓形成) |
| 1.3 “瘀血”是病理结果(血栓栓塞) |
| 1.4 “瘀”与D-二聚体的相关研究 |
| 1.5 活血化瘀法的中医溯源 |
| 1.6 活血化瘀药治疗肿瘤的争议与思考 |
| 2. 中医学对肺癌的认识及治疗 |
| 2.1 肺癌的中医病名认识 |
| 2.2 肺癌的中医病因认识 |
| 2.3 肺癌的中医主要病机认识 |
| 3. 肺癌的中医治疗 |
| 3.1 药物治疗 |
| 3.2 食物治疗 |
| 3.3 康复治疗 |
| 3.4 中医特色适宜技术治疗 |
| 4. 现代医学对肺癌的认识及治疗 |
| 4.1 肺癌的定义及临床分型 |
| 4.2 肺癌的分期 |
| 4.3 现代医学对肺癌的病因认识 |
| 5. 肺癌的西医治疗 |
| 5.1 手术 |
| 5.2 放射治疗 |
| 5.3 化学治疗 |
| 5.4 靶向治疗 |
| 5.5 免疫治疗 |
| 6. 三七的研究进展 |
| 6.1 三七的中医研究概述 |
| 6.2 三七的现代药理学研究进展 |
| 6.3 三七的前期基础研究 |
| 7. 立项依据及意义 |
| 7.1 肺癌的流行病学概况及治疗现状 |
| 7.2 血瘀与肺癌发病的相关性 |
| 7.3 组织蛋白酶B(Cathepsin B,CTSB)与肿瘤的相关性 |
| 7.4 立项思路与科学假说 |
| 8. 小结 |
| 第二部分 回顾性临床研究 |
| 1. 目的 |
| 2. 临床资料与方法 |
| 2.1 一般资料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 观察指标 |
| 2.4 统计学分析 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 不足之处 |
| 6. 典型病例举例1例 |
| 7. 结论 |
| 第三部分 实验研究 |
| 1. 细胞实验 |
| 1.1 实验材料与方法 |
| 1.2 实验结果 |
| 2. 动物实验 |
| 2.1 实验材料与方法 |
| 2.2 实验结果 |
| 3. 讨论 |
| 3.1 肺癌研究中“中医药治疗”介入的必要性 |
| 3.2 实验中三七剂量组设定及其效量关系探讨 |
| 3.3 三七粉与三七含药血清药效成分探讨 |
| 3.4 三七在肺癌及肿瘤治疗中的药用机制探讨 |
| 3.5 CSTB在肺癌及肿瘤治疗中的研究价值 |
| 3.6 活血化瘀法在肺癌及肿瘤治疗中应用的思考 |
| 4. 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1: 综述 |
| 参考文献 |
| 附录2: 临床研究伦理批件 |
| 附录3: 三七质检报告 |
| 附录4: 体力状态评分表 |
| 附录5: 压力指数评分表 |
| 攻读博士学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 中文部分 |
| 第一部分 雌二醇治疗对小鼠阿尔茨海默病模型海马神经元发生及认知功能障碍的早期保护作用 |
| 前言 |
| 资料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第二部分 P38MAPK抑制剂对血管性痴呆大鼠海马细胞凋亡的保护作用及学习记忆能力的影响 |
| 前言 |
| 资料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第三部分 TPX2对阿尔茨海默病模型大鼠神经细胞凋亡的保护作用机制的研究 |
| 前言 |
| 资料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 英文部分 |
| Chronic estradiol administration during the early stage ofAlzheimer's disease pathology rescues adult hippocampalneurogenesis and ameliorates cognitive deficits in Ap"2 mice |
| Introduction |
| Materials and Methods |
| Results |
| Discussion |
| Summary |
| Reference |
| Figure legends |
| The Effect of P38MAPK Inhibitors on Hippocampus Apoptosisand Learning Memory Ability in Vascular Dementia Rat |
| 1. Introduction |
| 2. Materials and Methods |
| 3. Results |
| 4. Discussion |
| Conflict of Interests |
| Authors, Contribution |
| Reference |
| Figure legend |
| Protective Effects and Mechanism Researches of TPX2 onNeurocytes Apoptosis of Rats with Alzheimer's Disease Model |
| Introduction |
| Materials and methods |
| Results |
| Discussion |
| References |
| 中文摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一部分 文献研究 |
| 1 中医对缺血性卒中后癫痫认识 |
| 1.1 中医对中风的认识 |
| 1.2 中医对痫病的认识 |
| 1.3 中医对中风与痫病关系的认识 |
| 1.4 古代医家对于痰瘀致痫的认识 |
| 2 西医对缺血性卒中后癫痫的认识 |
| 2.1 流行病学研究 |
| 2.2 缺血性卒中后癫痫危险因素 |
| 2.3 缺血性卒中后癫痫发作类型 |
| 2.4 缺血性卒中后癫痫脑电图表现 |
| 2.5 缺血性卒中后癫痫发作机制 |
| 2.6 缺血性卒中后癫痫的治疗 |
| 3 血清hs-CRP与缺血性卒中后癫痫的关系 |
| 3.1 对血清hs-CRP的认识 |
| 3.2 血清hs-CRP对缺血性卒中的影响 |
| 3.3 血清hs-CRP对癫痫的影响 |
| 3.4 血清hs-CRP对缺血性卒中后癫痫的影响 |
| 第二部分 临床研究 |
| 1 一般资料 |
| 1.1 病例来源 |
| 1.2 诊断标准 |
| 1.3 病例纳入 |
| 2 研究方法 |
| 2.1 分组方法 |
| 2.2 入组病人病史采集 |
| 2.3 研究指标 |
| 2.4 纳入病人基础疾病治疗 |
| 2.5 纳入病人抗癫痫治疗 |
| 2.6 不良反应 |
| 2.7 疗效评定 |
| 3 统计学方法 |
| 4 结果 |
| 4.1 一般资料 |
| 4.2 临床疗效 |
| 5 讨论 |
| 5.1 导师对“痰瘀生风”理论治疗缺血性卒中后癫痫的认识 |
| 5.2 组方分析 |
| 5.3 现代药理研究 |
| 5.4 对缺血性卒中后癫痫患者血清hs-CRP影响的探讨 |
| 5.5 定痫汤加减联合丙戊酸钠治疗缺血性卒中后癫痫疗效分析 |
| 5.6 不足和展望 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 略缩词表 |
| 综述 定痫丸治疗癫痫的研究新进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历及攻读学位期间获得的科研成果 |
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 引言 |
| 第一部分 文献研究 |
| 1 西医对NHIE的研究 |
| 2 中医对NHIE的研究 |
| 第二部分 实验研究 |
| 1 实验材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方案 |
| 1.3 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 热敏灸对HI模型小鼠尾温的影响 |
| 2.2 热敏灸对HI模型小鼠体重的影响 |
| 2.3 热敏灸对HI模型小鼠行为学测试结果的影响 |
| 2.4 热敏灸对HI模型小鼠脑梗死面积的影响 |
| 2.5 热敏灸对HI模型小鼠脑组织形态观察 |
| 2.6 热敏灸对HI模型小鼠脑组织TUNEL阳性细胞数的影响 |
| 2.7 热敏灸对HI模型小鼠脑组织caspase-9 阳性细胞数的影响 |
| 3 小结 |
| 讨论 |
| 1 实验动物的选择 |
| 2 HI模型的选择 |
| 2.1 气管夹闭术 |
| 2.2 延迟剖宫产术 |
| 2.3 动脉结扎法 |
| 3 热敏灸的概述 |
| 4 针灸大椎穴与脑病的探讨 |
| 5 腧穴热敏化的探讨 |
| 6 热敏灸治疗HI模型疗效的探讨 |
| 6.1 热敏灸对HI模型小鼠生理发育和行为学测试的探讨 |
| 6.2 热敏灸对HI模型的探讨 |
| 6.3 热敏灸对HI模型脑组织形态学的探讨 |
| 7 热敏灸治疗HI模型作用机制的探讨 |
| 7.1 热敏灸对HI模型小鼠脑组织TUNEL阳性细胞数的探讨 |
| 7.2 热敏灸对HI模型小鼠脑组织caspase-9阳性细胞数的探讨 |
| 结论 |
| 1 文献研究 |
| 2 实验研究 |
| 本研究创新与不足之处 |
| 创新之处 |
| 不足之处 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简介 |
| 答辩委员会名单 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 6-姜酚对心肌纤维化小鼠的保护作用及机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 6-姜酚对H9c2心肌细胞缺氧损伤的保护作用及机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 6-姜酚对大鼠心肌细胞L-型钙通道、收缩力及钙瞬变的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述一 生姜活性成分及药理作用研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 抗心肌缺血中药有效成分研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 川芎嗪预处理BMSCs移植提高脑缺血的治疗作用 |
| 一、实验材料与方法 |
| (一) 实验动物 |
| (二) 实验试剂 |
| (三) 实验仪器 |
| (四) 实验方法 |
| 1. 骨髓间充质干细胞分离培养 |
| 2. 骨髓间充质干细胞表面标记物鉴定 |
| 3. 骨髓间充质干细胞预处理 |
| 4. 大鼠局灶性脑缺血模型制备 |
| 5. 动物分组及BMSCs移植 |
| 6. 行为学评价 |
| 7. 梗死体积检测 |
| 8. 统计学分析 |
| 二、结果 |
| (一) 骨髓间充质干细胞的形态学观察 |
| (二) BMSCs表面标记物鉴定 |
| (三) 川芎嗪预处理BMSCs对脑缺血大鼠mNSS评分的影响 |
| (四) 川芎嗪预处理BMSCs对脑缺血大鼠粘胶揭除试验评分的影响 |
| (五) 川芎嗪预处理BMSCs对脑缺血大鼠角试验的影响 |
| (六) 川芎嗪预处理BMSCs对脑缺血大鼠脑梗死体积的影响 |
| 三、分析与讨论 |
| (一) 骨髓间充质干细胞的分离与鉴定 |
| 1. 骨髓间充质干细胞的分离、培养 |
| 2. 骨髓间充质干细胞的的鉴定 |
| 3. 骨髓间充质干细胞预处理 |
| (二) 川芎嗪预处理BMSCs移植改善脑缺血大鼠的神经功能 |
| 1. 川芎嗪预处理BMSCs移植改善了大鼠的行为学功能 |
| 2. 川芎嗪预处理BMSCs移植减少大鼠的梗死体积 |
| 四、小结 |
| 第二部分 川芎嗪预处理促进BMSCs向脑缺血损伤区迁移 |
| 一、实验材料与方法 |
| (一) 实验动物 |
| (二) 实验试剂 |
| (三) 实验仪器 |
| (四) 实验方法 |
| 1. BrdU标记骨髓间充质干细胞 |
| 2. BMSCs预处理 |
| 3. 大鼠局灶性脑缺血模型制备 |
| 4. 动物分组及BMSCs移植 |
| 5. BMSCs向脑缺血损伤区归巢的检测 |
| 6. SDF-1免疫荧光检测 |
| 7. BrdU和SDF-1免疫阳性细胞计数 |
| 8. 统计学分析 |
| 二、结果 |
| (一) BrdU标记骨髓间充质干细胞的阳性标记率 |
| (二) 川芎嗪预处理对BMSCs向脑缺血损伤周边区迁移的影响 |
| (三) 川芎嗪预处理BMSCs对大鼠缺血周边区SDF-1表达的影响 |
| 三、分析与讨论 |
| (一) BMSCs体外BrdU标记的最佳时间和浓度的筛选 |
| (二) 川芎嗪预处理促进BMSCs向脑缺血损伤区迁移 |
| 1. 川芎嗪预处理促进BMSCs归巢 |
| 2. 川芎嗪预处理BMSCs促进大鼠脑缺血后SDF-1的表达 |
| 四、小结 |
| 第三部分 川芎嗪预处理BMSCs移植治疗脑缺血的机制研究 |
| 一、实验材料与方法 |
| (一) 实验动物 |
| (二) 实验试剂 |
| (三) 实验仪器 |
| (四) 实验方法 |
| 1. BMSCs预处理 |
| 2. 大鼠局灶性脑缺血模型制备 |
| 3. 动物分组及BMSCs移植 |
| 4. 脑缺血损伤周边区血管生成检测 |
| 5. VEGF和BDNF免疫荧光检测 |
| 6. vWF、VEGF和BDNF免疫阳性细胞计数 |
| 7. 统计学分析 |
| 二、结果 |
| (一) 川芎嗪预处理BMSCs对脑缺血大鼠血管生成的影响 |
| (二) 川芎嗪预处理BMSCs对大鼠缺血周边区VEGF表达的影响 |
| (三) 川芎嗪预处理BMSCs对大鼠缺血周边区BDNF表达的影响 |
| 三、分析与讨论 |
| (一) 川芎嗪预处理BMSCs移植提高脑缺血治疗作用的机制探讨 |
| 1. 川芎嗪预处理BMSCs促进大鼠脑缺血后的血管生成 |
| 2. 川芎嗪预处理BMSCs促进大鼠脑缺血后的神经营养因子分泌 |
| 四、小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 致谢 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词 |
| 上篇 文献综述 |
| 综述一 缺血性脑中风的发病机制及其中医药治疗研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 川芎嗪治疗肿瘤研究进展 |
| 参考文献 |
| 下篇 实验研究 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 实验流程框架示意图 |
| 第一部分 川芎嗪衍生物17对分化后神经细胞拟缺血损伤模型的影响 |
| 实验一、分化后PC12细胞拟缺血损伤模型的建立及化合物17对细胞增殖的影响 |
| 实验材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验二 川芎嗪衍生物17对分化后拟缺血损伤PC12细胞凋亡的影响 |
| 实验材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 实验三 川芎嗪衍生物17对分化后拟缺血损伤PC12细胞的形态学影响及其机理探讨 |
| 一、化合物17促神经分化活性的研究 |
| 实验材料与方法 |
| 结果 |
| 二、化合物17抗缺血性脑中风作用机理的探讨 |
| 实验材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 川芎嗪衍生物4、13、26对肿瘤细胞活性的影响及机制研究 |
| 实验一 肿瘤细胞的培养及川芎嗪衍生物4、13、26对肿瘤细胞增殖活性的影响 |
| 实验材料与方法 |
| MTT实验结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验二 川芎嗪衍生物4、13、26对HEPG2细胞周期及凋亡的影响 |
| 一、化合物4、13、26对HepG2细胞作用浓度与时间的筛选 |
| 实验材料与方法 |
| 结果 |
| 二、川芎嗪衍生物4、13、26对HepG2细胞周期及凋亡影响的检测 |
| 实验材料与方法 |
| 凋亡检测实验结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验三 川芎嗪衍生物26对H22荷瘤小鼠的抗肿瘤作用 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
