吕叶辉,王卓群,陈忆九,陈龙[1]（2020）在《mRNA和ncRNA在死亡时间推断中的研究进展》文中研究说明死亡时间（postmortem interval,PMI）推断一直是法医病理学研究的重点和难点。近年来,国内外学者运用死后体内核糖核酸（ribonucleic acid,RNA）特异性变化规律推断PMI取得了一定研究进展。本文结合文献,综述了运用信使RNA（messenger RNA,mRNA）和非编码RNA（non-coding RNA,ncRNA）进行PMI推断的具体应用方法,并探讨了存在的问题及发展趋势,以期为相关研究和鉴定实践提供技术参考。
常怀成[2]（2020）在《黄瓜果实膨大相关miRNA的鉴定及其功能分析》文中研究指明miRNA是一类重要的调控分子,通过剪切靶mRNA调节基因的表达,进而调控植物生长发育、胁迫应答和新陈代谢等多项生理进程。miRNA调控了果实发育,但其调控黄瓜果实膨大的分子机制仍不清楚。本研究通过构建黄瓜果实膨大small RNA（sRNA）文库和降解组文库,获得了与黄瓜果实膨大相关miRNA及其靶基因。挑选与黄瓜果实膨大差异表达显着的miRNA（CsamiR160d和CsaMIR319b）,对CsamiR160d和CsaMIR319b及其靶基因进行了生物信息学分析,并通过构建超表达载体,初步分析了CsamiR160d和CsaMIR319b在黄瓜植株生长和果实膨大中的功能,为揭示miRNA调控黄瓜果实膨大的分子机制提供理论基础和重要的基因资源。主要研究结果如下:1.构建了三个不同取样时间黄瓜果实膨大相关sRNA文库和降解组文库;sRNA库中共鉴定出分属66个家族的2522个miRNA,其中EXP5 d sRNA文库中58个已知miRNA和47个新miRNA可能在黄瓜果实膨大中发挥重要的调控作用;挑选其中差异表达量较高的11个miRNA通过实时定量PCR进行分析验证,表达结果与sRNA测序结果中的表达趋势基本一致,验证了测序数据的可靠性;降解组测序鉴定了miRNA的靶基因,GO分析发现这些靶基因主要参与了生物学进程、细胞组分和分子功能;KEGG分析表明,这些靶基因主要与环境适应性,信号转导和翻译相关。2.分别对CsamiR160d及其靶基因CsARF17、CsARF18进行生物信息学分析。结果表明,CsamiR160d上游启动子元件与果实生长及成熟相关,靶基因CsARF17、CsARF18家族功能保守,推测黄瓜CsamiR160d通过靶向ARF参与生长素信号途径调控果实膨大;优化黄瓜子叶节遗传转化体系,并将CsamiR160d超表达载体通过遗传转化导入黄瓜,最终获得9株CsamiR160d转基因苗,转化率28.13%;与非转基因黄瓜植株相比,超表达CsamiR160d黄瓜植株整个生长阶段都表现出较强的生长势,表现为株高增高,茎增粗,叶片数增多。说明CsamiR160d的超表达促进了黄瓜植株的生长。3.分别对CsaMIR319b及其靶基因CsDME进行生物信息学分析。结果表明,CsaMIR319b上游启动子元件除了与果实生长及成熟相关外,还可能在调控植物逆境胁迫等方面发挥更多的作用,CsDME家族功能同样保守,推测CsaMIR319b则可能通过调控靶基因CsDME影响黄瓜DNA甲基化,进而影响了黄瓜果实膨大。通过遗传转化将CsaMIR319b超表达载体导入黄瓜,最终获得4株CsaMIR319b转基因苗,转化率40.00%。与非转基因黄瓜植株相比,超表达CsaMIR319b转基因植株及果实生长缓慢,发育不良,转基因种子干瘪不能萌发。说明超表达CsaMIR319b抑制了黄瓜植株的生长和果实初期的膨大。
白倩倩[3]（2019）在《小麦小分子RNA MIR9674a、MIR408和MIR9780分子特征及耐逆功能研究》文中研究指明小麦在生长发育过程中可能会受到多种逆境的影响,其中营养胁迫和高盐胁迫是限制作物生长的主要影响因子。植物MicroRNA参与植物生长发育过程多方面的调控,并且在介导植株抵御逆境中发挥重要的作用。因此,本研究以实验室前期的工作积累为基础,对TaMIR9674a、TaMIR408以及TaMIR9780的分子特征和耐逆功能进行了研究,主要研究结果如下:1.TaMIR9674a和TaMIR9780对高盐胁迫明显应答,其初始序列长度均为89 nt,成熟区序列长度均为20 nt,TaMIR9674a成熟序列位于13 nt至33 nt,TaMIR9780成熟序列位于68 nt至88 nt。2.在高盐胁迫处理下,融合TaMIR9674a正义系烟草植株与野生型相比,植株长势更健壮,鲜重增加,叶面积增大,保护酶活性升高,可溶性糖含量增加,丙二醛含量和电导率下降。反义系植株则表现出与正义系相反的结果。TaMIR9674a正义系烟草植株保护酶相关基因、ABA受体（PYL）相关基因及介导ABA信号转导的SnRK2家族基因表达水平也发生了变化,TaMIR9674a正义表达转基因烟草植株的SOD1、FeSOD、Mn1SOD、POD1.2、POD1.3、POD1.6、POD2.1、CAT1.1、CAT1.2及PYL8、PYL11和SAPK1、SAPK3、SRK2E-9、SRK2A-4基因上调表达,但上述基因在TaMIR9674a反义表达转基因株系中下调表达。上述结果表明,在高盐胁迫下,TaMIR9674a转基因株系通过快速关闭气孔、增加体内渗透调节物质含量以减少水分散失,通过细胞保护酶相关基因的的表达调控增强保护酶系统的清除能力,降低MDA等膜脂过氧化产物积累等,使植株形态得到改善,细胞功能得以维持。3.本研究利用在线分析工具对TaMIR408作用的靶基因进行了预测,结果表明,3个参与生化代谢（TaCP、TaMP和TaBCP）,2个参与信号转导（TaKRP和TaABP）,1个参与微管组织（TaMP）。低磷胁迫下,超表达的转基因株系较野生型相比长势有所改善,植株磷含量和磷积累量增加;在高盐胁迫下,可溶性糖和脯氨酸含量升高。因此,TaMIR408可能通过调控靶基因的转录来介导植株抵御低磷和高盐逆境的能力。4.初步鉴定了TaMIR9780在高盐胁迫下的表型特征,结果显示,在正常培养条件下,转基因株系与野生型在长势和形态特征上无明显差异,但在高盐胁迫下,转基因正义系与野生型相比,植株略大于野生型,而反义系株系的长势明显弱于野生型。有关TaMIR9780的耐逆能力与分子特征还需进一步探究。综上所述,TaMIR9674a、TaMIR408和TaMIR9780均对高盐胁迫明显应答。TaMIR9674a转基因株系,在高盐胁迫下通过快速关闭气孔和增加体内渗透调节物质含量,维持细胞渗透压,同时,增强保护酶系统的清除能力,降低MDA等膜脂过氧化产物的积累等生理生化过程降低细胞膜的损伤。TaMIR408通过调控其作用的靶基因在低磷和高盐胁迫下通过改善植株磷的吸收能力和植株磷累积吸收量保障生长发育过程中磷的供应能力应对低磷胁迫。在高盐逆境下,通过渗透调节物质脯氨酸含量和可溶性糖含量的增加,改善植株的渗透调节能力,在上述两种胁迫下超表达TaMIR408的转基因株系较野生型相比长势得到改善。
刘志鹏[4]（2019）在《小麦小分子RNA TaMIR5062/1139和激酶基因TaMAPKK1/MAPKKK；A特征及功能研究》文中研究说明高盐、干旱和营养元素缺乏等非生物胁迫对植物生长发育有着重要影响。其中,高盐和干旱是诱发高渗胁迫的重要因素,同时也是影响作物产量和品质的常见逆境。缺磷状态下植株的生长和发育受到明显抑制。本研究以小麦小分子RNA TaMIR5062、TaMIR1139和促分裂原活化蛋白激酶TaMAPKK1、TaMAPKKK;A为对象,对上述成员应答高盐、干旱和低磷特征及耐逆功能进行了较系统研究。主要结果如下:TaMIR5062前体序列长158 nt,成熟序列长23 nt。该小分子RNA对高盐和干旱胁迫明显应答。采用DNA重组技术,建立了正、反义表达该小分子RNA的烟草转基因株系,对高盐和干旱处理下转基因株系的植株形态、保护酶活性、失水率、电导率和相关基因表达进行了分析。结果表明,与野生型相比,超表达TaMIR5062的转化株系植株表型和保水率均明显改善,抗氧化酶活性增强。部分CAT、SOD和POD等细胞保护酶相关基因在转化株系中呈上调表达模式。表明TaMIR5062可以通过调节特定保护酶相关基因表达,改善植株抵御高渗胁迫的能力。TaMIR1139前体序列长216 nt,成熟序列长22 nt。该miRNA成员在低磷（P）条件下转录水平上调,且上调的转录本在P水平恢复后下调。该miRNA作用靶基因应答低P胁迫及复磷处理的表达模式与其相反,表明TaMIR1139通过转录后水平对其靶基因进行调节。缺P条件下,与野生型对照相比,超表达该miRNA成员的烟草转化株系植物表型、生物量、和P累积量均具有不同程度的改善。磷酸转运（PT）基因NtPT在超表达TaMIR1139株系中显着上调表达,在增强转化株系抵御低P逆境中发挥重要功能。小麦促分裂原活化蛋白激酶TaMAPKK1和TaMAPKKK;A全长序列分别为1279和1247 bp,编码氨基酸分别为355和251个。表达分析表明,上述激酶基因对高盐和干旱均有应答,其中以对高盐胁迫的应答更为明显。采用DNA重组技术和遗传转化方法,建立了TaMAPKK1和TaMAPKKK;A的正、反义转基因烟草植株株系。结果表明,TaMAPKK1编码蛋白定位在细胞质内,TaMAPKKK;A编码蛋白定位于细胞壁和细胞间隙。综上所述,TaMIR5062通过改善高渗胁迫下的植株生长、保护酶活性和叶片保水能力,在介导植株抵御高渗胁迫中发挥着重要生物学功能;TaMIR1139通过转录后调节磷转运蛋白基因,增强植株抵御低磷逆境的能力;TaMAPKK1和TaMAPKKK;A对高盐和干旱逆境产生应答。TaMAPKK1定位在细胞质,TaMAPKKK;A定位在细胞壁和细胞间隙。
廖沛然[5]（2019）在《干旱胁迫影响三七皂苷合成途径的分子机制研究》文中研究表明植物小RNA（sRNA）是一类长18-24nt的非编码RNA,它们参与调控植物的生长发育、生殖与基因组重组等生物过程,同时,小RNA也在植物响应非生物胁迫、增强植物耐受能力等方面起着非常重要的作用。干旱胁迫是植物最常遇到的环境胁迫,而植物的干旱响应是个复杂的过程。三七是我国人工种植历史悠久并且能规模化种植、经济价值极高的少数药用植物之一。随着全球温室效应的加剧,极端天气频发大背景下,研究干旱胁迫对三七生长及有效成分含量变化及相关机制,不但可以为三七生产提供优质栽培管理的科学依据,还可以拓展药用植物生理及次生代谢产物的研究内容。本文以期通过分析高通量测序数据,在三七中挖掘、验证由小RNA介导的干旱响应皂苷代谢调控通路基因,特别是合成四环三萜类化合物的上游萜类骨架合成的关键基因。为拓展对miRNA在次级代谢通路调控中的相关认识,并挖掘相关miRNA标记,为高品质三七育种奠定基础。本文主要有以下几个方面的研究成果。1、通过对干旱处理的三七叶和根进行转录组测序,采用STAR—Cufflinks对转录组进行数据分析,分别从叶和根中得到3539个和3179个表达量较高的基因,并分别对它们做基因时序性聚类分析,分别得到5个和2个表达趋势不同的基因类别。通过KEGG和GO聚类分析对这7个不同表达模式的基因进行分析,得到了响应干旱胁迫基因及其功能。在次级代谢通路中,重点分析了萜类骨架合成代谢途径和苯丙烷代谢途径,分别得到了叶中15个和根中13个干旱响应基因。而三七叶和根中分别各有149个和67个胁迫相关转录因子,其中有24个家族的成员是植物内源激素响应通路中重要的响应蛋白,以ABA和乙烯响应蛋白成员最多,且表达量随干旱时间增加而升高。可见,ABA和乙烯在三七干旱胁迫响应中具有重要的作用。2、通过对小RNA的高通量测序与数据分析,共找到1584个三七保守的miRNA,预测出保守miRNA前体结构256个,得到非保守miRNA及其前体198个。通过CleaveLand将这些miRNA进行靶基因预测后,共识别出保守miRNA的584个靶基因,非保守miRNA的254个靶基因,将这些靶基因进行SOM表达聚类分析后,将干旱胁迫下表达量发生变化的miRNA靶基因进行KEGG通路和GO功能分析,得到43个响应干旱胁迫且调控转录因子和具有胁迫响应功能的miRNA。将这些miRNA及其靶基因的表达量进行相关性分析后,得到8对具有显着负相关性的miRNA—靶基因。通过KEGG通路分析后,找到4对与萜类合成相关的miRNA—靶基因,它们是MIR156aaai—GGPS、MIR482g—ispF、t15589037—ispH和t49562107—HMGCS。这些miRNA可以作为筛选耐旱或高品质三七的标记。通过对三七基因组分析,识别到一个TAS3基因,既TAS3b（-）,它产生的tasiRNA靶向两个ARF基因。表达量相关性分析显示TAS3b（-）、TAS3bD5（-）和TAS3bD6（-）与ARF的表达量呈负相关性,且随着干旱时间的增加,叶中的TAS3b（-）和TAS3bD5（-）表达量上升,而ARF表达量下降。可见干旱胁迫下三七叶子激活TAS3基因以抑制ARF基因的表达。3、皂苷合成代谢中,萜类骨架合成通路是合成前体的重要过程。首先,通过短期（0-24 h）和长期的干旱处理（0-30 d）三七后,对所有这些基因进行了qRT-PCR实验。短期处理下三七叶和根qRT-PCR的实验结果与本研究预测到的基因表达情况相似,说明本研究预测的基因表达量较为准确。另一方面,采取长期干旱的处理,通过qRT-PCR的方法研究了萜类骨架合成相关基因表达量,发现除了PMK、MVK和CAS外,其余基因表达都成上升趋势。4、本研究将上述预测到的4个被miRNA调控的基因进行RLM-5’RACE实验,得到一个确定靶点的miRNA及其靶基因,既t49562107和HMGCS。得到t49562107和HMGCS的ORF全长序列后,构建t49562107前体—RFP和HMGCS—GFP报告载体质粒,转入到洋葱表皮细胞进行瞬时表达,发现转入两个质粒后洋葱的GFP信号会减弱,说明t49562107有抑制HMGCS的作用。综上所述,本研究首次通过分析干旱胁迫下三七叶和根的转录组、降解组和小RNA测序数据,找到40个响应干旱胁迫并参与调节相关转录因子和胁迫相关蛋白的miRNA,以及4个响应干旱胁迫且调节皂苷骨架合成代谢相关基因的miRNA,并确定了HMGCS基因的miRNA裂解位点。首次为miRNA作用于皂苷萜类骨架合成关键基因提供依据。本研究将为筛选抗旱和高品质三七育种研究奠定一定的基础。
李世鹏[6]（2019）在《黑斑病诱导的三七microRNA鉴定及其功能分析》文中提出植物microRNA（miRNA）是一类长18-24nt的非编码RNA,它们参与调控植物的生长发育,生殖与基因组重组,同时,microRNA也在植物响应生物和非生物胁迫、增强耐受能力过程中起着非常重要的作用。黑斑病是三七生长过程中最容易受到的灾害之一,常因此造成不可估量的经济损失。目前关于黑斑病的研究多集中在致病菌的生理生化特性及综合防治等方面,而从非编码RNA的角度探讨抗性microRNA鲜有报道。本文以期通过分析高通量测序数据,即小RNA测序技术,转录组测序技术,降解组测序技术,联合分析在三七中挖掘、鉴定由microRNA介导响应病害胁迫所参与调控的microRNA,为拓展对microRNA在药用植物抗病调控中的认识,并挖掘相关抗性microRNA标记,有望为高品质三七育种奠定基础。本课题的研究结果如下:1、鉴定了共得到响应黑斑病的277个含有前体序列的microRNA,其中有130个含有前体序列的microRNA已经被报导,81个含有前体序列的microRNA在22个保守microRNA家族中;2、SeqTar程序、CleaveLand程序作对比,预测保守microRNA的靶基因,结果显示SeqTar程序预测结果更为准确,其预测共得到了123个（碱基错配在4以下）在20个保守microRNA家族中的靶基因;3、另外,得到了7对负相关的保守microRNA与其靶基因,相关荧光定量PCR实验得到验证其负相关关系的准确性,这7对保守microRNA的靶基因多为ARF,GRF,CSD等转录因子,参与调控植物抗病性反应。本研究首次利用高通量多组学测序数据（转录组测序,小RNA测序,降解组测序）进行黑斑病胁迫诱导下三七中microRNA的鉴定及其功能分析,并通过昆明理工大学非编码RNA课题组开发的方法进行预测和分析,探讨黑斑病胁迫诱导下,随着时间的变化,三七中microRNA用来响应胁迫的表达变化情况;首次研究病害胁迫下药用植物三七中的抗性microRNA,作为抗性分子标记,有望为筛选抗病性高品质三七育种研究奠定一定的基础。
郑兰杰[7]（2018）在《miR167调控花药开裂与胚乳发育的机理研究》文中提出Micro RNA167（miR167）是植物体内生长素响应因子（ARF）基因的重要表达调控因子之一,参与植物生长发育以及外界胁迫应答。前期研究中我们发现拟南芥miR167通过调控ARF6和ARF8的表达参与花发育调控。在不改变氨基酸编码序列的情况下,我们将ARF6和ARF8中miR167的靶位点进行定点突变（mARF6、mARF8）,发现ARF6和ARF8在mARF6和mARF8突变体花药中表达量增加,突变体花药不开裂。茉莉酸是影响花药开裂的主要因素之一,主要在花丝中合成,能够促进花丝上部区域吸收花药组织水分引起花药脱水干燥以及引发花药表皮层对茉莉酸的感知,从而引起花药开裂。茉莉酸合成依赖ARF6和ARF8在花丝中的表达;arf6 arf8双突变体中茉莉酸合成受阻,导致花丝变短,花药不开裂,对arf6 arf8双突变体外施茉莉酸能引发花药开裂。然而对mARF6和mARF8突变体外施茉莉酸不能引发花药开裂。表明arf6 arf8和mARF6（或mARF8）突变体在调控花药开裂中存在不同调控机制。此外,有研究发现miR167在玉米胚乳发育过程中差异表达,表明miR167可能参与胚乳发育调控;然而,其调控机制并不清楚。因此,本研究分别以拟南芥花药和玉米胚乳为材料,深入探究miR167对花药开裂和胚乳发育的影响与调控机制。主要结果如下:1.本研究首先创制与鉴定了拟南芥miR167靶位点弱突变体和mir167突变体。mARF6和mARF8弱突变株系杂合植株花药开裂延迟,育性降低。miR167家族共有四个成员,即miR167a、miR167b、miR167c和miR167d。为明确miR167不同成员对花药的调控作用,我们将MIR167启动子与GUS基因融合的转基因植株进行GUS基因的时空表达分析。X-Gluc染色结果表明,仅miR167a在花药中表达强烈。利用CRISPR/Cas9系统对拟南芥MIR167a基因进行敲除后,发现mir167a突变体与mARF6和mARF8弱突变株系的表型相似。以上结果表明,在花药中,MIR167a是MIR167基因家族靶向调控转录因子ARF6和ARF8的主要成员;MIR167a调控作用缺失,花药开裂延迟。2.为明确拟南芥miR167调控作用缺失引起的花药表型差异,我们利用组织细胞学方法对miR167缺失突变体进行了表型观察与分析。组织及细胞形态观察显示miR167缺失突变体花药于第11期时开始异常生长,花药细胞异常增大。研究表明,生长素可以直接作用于细胞膜或膜内组分,进而影响细胞的扩大。为探究miR167缺失突变体花药细胞的膨大是否与受生长素应答有关,我们将生长素响应启动子DR5与GUS基因融合的转基因植株分别与mARF6和mARF8突变体植株杂交,观察GUS基因的时空表达。X-Gluc染色结果表明,mARF6和mARF8突变体具有生长素响应增强的表型。同时,植物体内各器官和组织间必须有物质的相互交换,交换速率越快,生长速度也就越快。为探究miR167缺失突变体花药细胞的膨大是否与花药中物质运输有关,我们将韧皮部特异表达基因SUC2启动子与YPET报告基因融合的载体转化拟南芥,并将转基因植株分别与mARF6和mARF8突变体植株杂交,通过观测YPET报告基因在花药韧皮部的特异表达判断在突变体中物质运输是否有差异。共聚焦显微镜结果显示,荧光信号在mARF6和mARF8突变体花药微管结构区域表达时间和分布长度较野生型增加,表明突变体花药内部大量的物质运输可能为花药持续生长提供物质基础。另外,药室内壁木质素的填充也影响花药开裂。间苯三酚木质素染色结果显示,mARF6和mARF8突变体染色区域与野生型无显着差异,表明突变体花药开裂延迟与药室内壁木质素积累无关。以上表明,miR167缺失突变体花药过度膨大表现为花药细胞的膨大,与花药体内生长素响应和物质运输量呈正相关。3.拟南芥ARF6和ARF8是一类转录激活因子,在miR167缺失突变体花药中异位表达,可能引起下游作用基因的上调表达。为鉴定参与调控miR167缺失突变体花药膨大的相关基因,我们采用RNA-Seq以及基因组织特异性表达等方法进行分析。通过对野生型、PRPS5a>MIR167a（MIR167a过表达植株）和mARF8突变体雄蕊进行RNA-Seq,我们鉴定到在mARF8突变体中上调表达且在PRPS5a>MIR167a中下调表达的102个差异基因。GO功能富集分析表明,差异基因主要为茉莉酸响应和细胞壁疏松相关基因,这些上调表达基因参与调控突变体花药细胞的过度生长。为验证这些基因在突变体花药中上调表达,我们我们将候选基因启动子与GUS基因融合的转基因植株分别与mARF6和mARF8突变体植株杂交,观察GUS基因的时空表达。X-Gluc染色结果表明,XTH19和EXPA8在mARF6或mARF8突变体花药中异位表达。以上结果表明,EXPA8和XTH19等基因在mARF6或mARF8突变体花药中上调表达,参与调控花药生长。4.为明确拟南芥miR167调控花药开裂的方式,我们探索了引发miR167缺失突变体花药开裂的条件。对拟南芥miR167缺失突变体花药干燥处理后,花药开裂,花粉释放;高湿条件下野生型花药则延迟开裂。因此,miR167缺失突变体花药延迟开裂可能是由于花药持续生长引起花药水分含量过高造成的。表明miR167能够抑制花药生长,促进花药开裂。为探究miR167调控花药开裂是否与依赖茉莉酸信号转导途径,我们将MIR167a启动子与GUS基因融合的转基因植株分别与茉莉酸途径相关突变体植株杂交,观察GUS基因的时空表达。X-Gluc染色结果表明,GUS基因的表达在茉莉酸途径相关突变体花药中与野生型无差异。qPCR结果显示,miR167在茉莉酸合成突变体中的表达量与野生型无显着差异。以上结果表明,miR167通过限制花药生长,促进花药干燥与开裂,该过程不依赖茉莉酸信号作用通路。5.为探究miR167在玉米胚乳发育过程中重要作用及调控路径,我们分析了miR167表达模式以及鉴定了miR167的靶基因。玉米胚乳小分子RNA文库测序显示miR167在灌浆前后差异表达。MIR167a表达模式表明,MIR167a在玉米胚乳发育过程中呈上调表达趋势。为明确miR167在胚乳中的靶基因,我们通过降解组测序、瞬时表达验证、进化树分析和表达模式分析等,确定ARF9和ARF18为miR167的靶基因。ARF18同样是一类转录激活因子,在胚乳发育过程中可能通过激活下游作用基因的表达参与胚乳发育调控。为探究ARF9和ARF18的下游作用基因,我们通过基因瞬时表达的方法,获得ARF18过表达胚乳。RNA-Seq以及GO功能富集分析显示,121个上调表达基因主要为激素响应、细胞壁疏松和水运输基因。以上表明,miR167通过调控靶基因ARF9和ARF18参与玉米胚乳发育调控。本研究通过组织细胞学与分子生物学技术,探讨了miR167对拟南芥花药开裂的影响与调控机制,为揭示miR167在玉米花药发育中的调控机理奠定基础;同时初步探究了miR167在玉米胚乳发育过程中调控路径,为进一步开展miR167对玉米胚乳发育的影响与调控机理提供理论依据。miR167在花药和胚乳中调控机理的揭示,为今后玉米雄性不育材料的创造及杂种优势育种、高产育种提供理论基础。
朱旗[8]（2018）在《孕早期胚胎停育绒毛组织病理学变化及miRNA在胎盘异常发育中的作用》文中研究说明早期胚胎停育,又称稽留流产（missed abortion,MA）,是指妊娠早期胚胎停止发育、胚胎未见孕囊或心血管搏动等,是一种特殊类型的自然流产。我国MS的临床发病率为13%,且近年来呈现上升趋势,已经成为育龄妇女面临的一个重大健康问题。然而,但MA发生的确切机制至今尚未完全清楚。胎盘是妊娠期保证胎儿正常生长发育的临时性器官,是胎儿与母体进行营养和气体交换的唯一渠道。在胚胎发育过程中胎盘血管的形成和发育程度与妊娠的成功与否关系密切。胎盘发育异常是引起稽留流产的一个重要原因。在稽留流产中胎盘的病理生理变化尚不十分清楚,并且胎盘异常发生的分子机制也有待深入研究。MicroRNA（miRNA）是一种仅有18-25个核苷酸的内源性单链小分子RNA,广泛存在真核生物中,具有高度的保守性、组织特异性和时序性,在细胞增殖、分化和凋亡等多种生理过程中发挥着重要的作用。我们实验室的前期研究显示胎盘miRNAs异常表达参与了妊娠糖尿病的发生,而同样作为妊娠期相关疾病的稽留流产,miRNAs在其胎盘组织异常发育过程中的作用尚不明确。为了观察MA胎盘绒毛组织的病理学变化,采用免疫组化法检测了标记胎盘血管生成和滋养层细胞入侵情况的血管内皮生长因子（VEGF）、反应滋养层细胞分布情况的细胞角蛋白（CK19）和反应蜕膜间充质细胞分布情况的波形蛋白（Vimentin）在MA患者和正常早孕对照绒毛组织中的表达差异;通过Tunel检测法测定了 MS患者和正常对照胎盘绒毛组织的凋亡情况。结果显示,VEGF、CK19及Vimentin在胚胎停育的胎盘绒毛组织及正常对照绒毛组织中均有表达,VEGF的阳性信号主要定位于绒毛滋养细胞（包括细胞滋养细胞和合体滋养细胞）及间质细胞,CK19主要表达于滋养层细胞,Vimentin在间充质细胞及血管内皮细胞中表达丰富。利用H-score评分分析病例组及对照组的VEGF、CK19及Vimentin表达差异发现,病例组VEGF的表达水平显着低于对照组（P<0.001）,其与已经报道的自然流产中VEGF表达水平较低的研究结果相一致。对照组及病例组的CK19和Vimentin表达没有明显差异。在MA患者及正常早孕对照胎盘绒毛中均存在细胞凋亡,病例组的凋亡指数显着高于对照组（P<0.001）。这些结果提示MA发生时胎盘血管形成和绒毛滋养层细胞入侵受阻,滋养层细胞发生凋亡,其可能引起绒毛生长受限、侵袭不足,阻碍孕卵发育,从而发生胚胎停育。为了研究MA患者胎盘异常发育的分子机制,我们首先筛选了在MA患者胎盘组织中差异表达的miRNAs。miRNA探针原位杂交和RT-PCR方法被用来检测miR-98、miR-16、miR-503和miR-125a在MA患者胎盘中的表达。原位杂交结果显示miR-98、miR-16、miR-503和miR-125a在MA患者及正常早孕绒毛组织中的均有广泛表达,主要分布于细胞滋养层细胞、合体滋养层及间质细胞。对miRNAs的阳性信号进行平均光密度统计分析发现,与对照组相比,miR-98、miR-16、miR-503和miR-125a的表达在MA患者绒毛组织中均有显着升高（均P<0.05）。Real-time PCR结果显示miR-98、miR-16和miR-125a在对照组和病例组间的表达差异与其原位杂交结果一致（P<0.05,P<0.01,P<0.001）。这些结果提示miR-98、miR-16和miR-125a表达上调可能是引起胚胎停育的相关因素。我们实验室前期的研究结果显示miR-98和miR-125a在胚胎植入和复发性流产中发挥重要作用,故本研究选择miR-98和miR-125a进行深入研究。为了进一步分析这些miRNAs与MA的关系,我们研究了 miRNAs在滋养层细胞中的作用及机制。Edu、MTT、transwell小室法被用来分析miRNA对人绒毛滋养细胞功能的影响;miRWalk、targetscan数据库被用来预测miRNA的靶基因;双荧光素酶报告基因检测系统和Real-time PCR被用来鉴定及验证miRNA的靶基因;基因补偿实验被用来进一步证实miRNAs与靶基因的作用关系。研究结果显示,过表达miR-98,滋养层细胞HTR8的迁移能力及活性显着降低（P<0.01,P<0.05）,敲低miR-98,HTR8细胞的增殖能力及活性明显提高（P<0.05,P<0.05）,提示miR-98对细胞、增殖及迁移起抑制作用。生物信息学预测显示GDF6和PLEKHA8是miR-98的靶基因。利用双荧光素酶系统验证显示,含GDF6 3’UTR种子序列的重组质粒与miR-98模拟物共转染可以显着降低荧光素酶活性（P<0.01）,与miR-98抑制物共转染可以显着增加荧光素酶活性（P<0.05）,提示miR-98能够与GDF6 3’UTR发生结合。突变预测的miR-98与GDF6 3’UTR识别序列,荧光素酶的活性显着增加（P<0.05）,提示该位点突变可以抑制miR-98与GDF6 3’UTR结合。miR-98过表达,可以降低细胞中GDF6 mRNA表达水平（P<0.001）,敲低miR-98,GDF6表达量显着升高（P<0.05）。这些结果提示GDF6为miR-98靶基因。同样,双荧光素酶实验显示miR-98过表达可以显着抑制PLEKHA8的活性（P<0.05）,敲低可以明显促进PLEKHA8的活性（P<0.05）,突变miR-98识别的PLEKHA8 3’UTR位点,可以显着抑制miR-98与PLEKHA8 3’UTR结合（P<0.001）。qRT-PCR结果显示miR-98过表达可以降低细胞中PLEKHA8 mRNA表达水平（P<0.001）,miR-98低表达可以显着升高PLEKHA8 mRNA表达水平（P<0.05）。这些结果提示PLEKHA8为miR-98靶基因。靶基因RESCUE实验显示,敲低miR-98的同时抑制其靶基因PLEKHA8表达,可以使细胞增殖和迁移能力恢复到正常水平。过表达miR-125a,HTR8细胞的迁移能力及增殖显着降低（P<0.05,P<0.05）,敲低miR-125a,HTR8细胞的增殖能力及活性明显提高（P<0.05,P<0.05）,说明miR-125a对细胞增殖及迁移起抑制作用。过表达miR-125a可以抑制CBX7的表达,提示CBX7可能是miR-125a的靶基因。结论:胚胎停育的患者中,滋养层细胞与间质细胞的分布没有明显变化,而绒毛滋养细胞侵袭能力下降,细胞过度凋亡,说明VEGF低表达和细胞凋亡异常与MA发生相关;miR-98、miR-16和miR-125a的过表达参与了MA的发生;miR-98和miR-125a对细胞增殖及迁移起抑制作用,miR-98通过下调GDF6及PLEKHA8发挥作用,miR-125a通过调节CBX7发挥作用。
陈灿斌[9]（2018）在《火龙果甜菜素生物合成相关miRNAs的筛选和鉴定》文中指出火龙果是近几年发展起来的一种新兴水果,也是唯一富含甜菜素的大面积栽培水果,但火龙果甜菜素生物合成的机理尚不清楚。相对于转录因子参与甜菜素生物合成的调控,植物体内miRNAs抑制靶基因表达提供了一种全新的甜菜素合成调控机理。miRNA主要的功能是在转录后水平对靶基因mRNA剪切或抑制其翻译。miRNA参与调控植物的生长发育及对非生物、生物逆境胁迫响应,对植物色泽也有一定的调控作用。本文基于小RNA文库与转录组文库,筛选与火龙果甜菜素生物合成相关的miRNAs及其靶基因,以期解析火龙果甜菜素生物合成过程中miRNAs的作用机制,为火龙果分子育种工作提供的理论依据。主要研究结果如下:1、以火龙果‘莞华红’果肉发育阶段样品转色前（19 d）、转色后（25 d）和成熟时期（29 d）为材料,通过小RNA测序,得到了Hp19d1、Hp19d2、Hp25d1、Hp25d2、Hp29d1和Hp29d2等6个小RNA文库。数据分析共鉴定出128个保守miRNAs和41个新预测的miRNAs,其中95个保守miRNAs分别属于53个miRNA家族;18个miRNAs为保守miRNA和1个新预测的miRNA（PC-5p-2975303）在19 d（转色前）、25 d（转色后）和29 d（成熟期）三个时期有差异表达,很可能参与了甜菜素的生物合成。2、转录组的3个文库是由‘莞华红’火龙果果肉转色前期（授粉后19 d）、转色后期（授粉后25 d）和成熟时期（授粉后29 d）等三个时期分别构建而成。Hp19d、Hp25d和Hp29d三个文库分别得到了7.46 Gb、9.10 Gb和10.23 Gb的核苷酸序列。经过组装得到了68,505条transcripts（N50=1700 bp）,这些transcripts进一步组装得到平均长度为879bp的genes共39,737个。并通过比对公共数据库对这39,737个genes进行功能注释。分析发现3,988个基因在发育过程中显着差异表达,其中124个基因在三个阶段中均显着差异表达。利用转录组和Target Finder软件对miRNAs进行靶基因预测,预测到9个在19 d（转色前）、25 d（转色后）和29 d（成熟期）三个时期有差异表达的且P值≤0.05的新miRNAs对应有31个靶基因。3、通过荧光定量PCR分析与火龙果甜菜素生物合成相关的候选miRNAs在‘莞华红’和‘莞华白’火龙果果肉转色过程的表达情况,发现12个候选miRNAs在‘莞华红’火龙果果肉转色期（23 d）中高表达,其中ata-miR172b-3p1ss1AC、aly-miR157d-5pL+11ss4AC、cpa-miR159a、PC-3p-42960981、PC-5p-1835491、ssp-miR156L+1R-11ss4AC和PC-3p-5333818等7个火龙果miRNAs在‘莞华红’火龙果果肉不同发育阶段的表达均高于‘莞华白’火龙果。这些结果表明它们很可能在火龙果果肉转色期扮演着调控因子的角色。4、对关键miRNAs及其靶基因在火龙果果肉7个发育时期的表达模式分析,发现关键miRNAs和相应的靶基因随着果实的发育呈相反的表达趋势。如nta-miR6020b的表达量随‘莞华红’火龙果果实发育有所上升,而其靶基因comp234190c0的表达量随果实发育则逐渐下降。但nta-miR6020b与其靶基因comp234190c0的表达模式在‘莞华白’火龙果上呈现上下波动趋势,规律性不明显。nta-miR6020b在‘莞华红’火龙果果肉授粉后23 d和27 d分别表达高峰,在‘莞华白’火龙果发育过程中表达量逐渐升高,但总体均低于‘莞华红’火龙果。这些实验证据表明nta-miR6020b可能参与调控火龙果甜菜素生物合成。5、用5′RACE和烟草瞬时表达体系验证了可能参与调控火龙果甜菜素生物合成关键miRNAs的靶基因。共有4条miRNAs及对应的5条靶基因在5′RACE和烟草瞬时表达体系实验中均被验证是相互作用的,分别是mdm-miR858及其靶基因comp15143c0和comp24362c0、PC-5p-2975303及其靶基因comp23458c0、PC-5p-1927269及其靶基因comp29967c0和PC-5p-2384539及其靶基因comp28219c0。
张子旭[10]（2017）在《水稻干尖线虫miRNA高通量测序分析及内参基因的筛选》文中指出水稻干尖线虫（Aphelenchoides besseyi）是危害水稻的最重要病原线虫之一,分布于世界大多数的水稻种植区,在国内则广泛分布于大陆24省,目前在环渤海稻区发生较为普遍,其不仅危害水稻,还为害草莓、菊花等多种观赏植物和经济作物,造成重大经济损失。目前对于水稻干尖线虫的防治仍以使用杀线剂为主,对环境造成了污染,影响人类的生命健康。随着基因工程技术的快速发展,分子生物学方法成为研究植物线虫防治新方法的重要手段和途径。本研究对水稻干尖线虫致病力不同的N10群体（寄主为水稻）和S24群体（寄主为草莓）进行了miRNA高通量测序和分析,并克隆和筛选了水稻干尖线虫的理想内参基因,研究了这两个群体线虫的miRNA差异表达谱及4个高表达miRNA（miR-1、miR-34、miR-71和let-7-5p）在不同虫态的相对表达情况,对测序结果进行了生物信息学分析;并通过qPCR、原位杂交和miRNA mimics等方法初步研究了水稻干线虫部分miRN A的功能。主要研究成果如下:1、获得了水稻干尖线虫的miRNA测序结果和miRN A表达谱等信息;分别在N10和S24文库中得到了817和733个已知miRNA,其中差异miRNA为413个,254个miRN A在N10文库中上调表达,159个miRNA在S24文库中上调表达。2、qPCR验证了15个差异miRN A在N10和S24群体间的相对表达量的差异趋势与测序结果一致;miR-1、miR-34、miR-71和let-7-5p在两个群体内的不同虫态间存在差异,其中miR-34在卵中相对表达量显着低于其他虫态,并且差异倍数最大。3、miR-34的原位杂交结果表明其主要定位在雌雄虫生殖腺附近,且在雄虫交合刺附近清晰可见,呈点状。4、利用本课题组已有的水稻干尖线虫转录组数据,克隆了4个内参基因片段（actin、GAPDH、UBC和α-tubulin）,并对在三种实验条件下的5个内参基因18S rRNA、actin、GAPDH、UBC和α-tubulin的稳定性进行了评估,得到了比较稳定的内参基因UBC,为水稻干尖线虫基因表达量的准确分析提供了合适的内参基因。5、对水稻干尖线虫的miRNA的靶基因进行GO和KEGG注释和富集分析,差异miRNA的靶基因主要富集在生长发育、细胞分化、催化转运等方面;miR-1、miR-34、miR-71和let-7-5p的miRNA的靶基因主要富集在信号转导通路、绑定连接和酶催化活性等功能方面。6、利用miRNA mimics浸泡线虫的方法检测了导入miRN A mimics对目的miRN A表达量的影响,浸泡24h后处理组的miR-34表达量升至最高,而对照组和清水组则差异不显着,证实了使用miRNA mimics浸泡水稻干尖线虫可以促进内源性miR-34表达量增加。本研究获得了水稻干尖线虫的miRNA文库和表达谱及其基因定量分析所需的合适内参基因,初步了解了部分miRNA可能具有的生物学功能,为进一步探究水稻干尖线虫miRNA在生长发育和致病过程中的作用和功能奠定了基础,对深入探索防治水稻干尖线虫新方法具有重要的意义。
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
| 1 运用m RNA死后变化规律推断PMI |
| 1.1 运用m RNA死后变化规律推断PMI的早期探索（2002—2009年相关研究） |
| 1.2 近10年运用m RNA死后变化规律推断PMI的研究进展（2010—2019年相关研究） |
| 1.2.1 运用反转录技术检测m RNA死后变化规律推断PMI的研究进展 |
| 1.2.2 运用高通量技术检测m RNA死后变化规律推断PMI的研究进展 |
| 2 运用nc RNA死后变化规律推断PMI |
| 2.1 运用管家nc RNA进行PMI推断的相关研究 |
| 2.2 运用调控nc RNA进行PMI推断的相关研究 |
| 3 现有问题及展望 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 黄瓜果实发育研究进展 |
| 1.1.1 植物激素与黄瓜果实发育 |
| 1.1.2 功能基因与黄瓜果实发育 |
| 1.2 miRNA研究进展 |
| 1.2.1 植物miRNA的发现 |
| 1.2.2 植物miRNA的合成及作用机制 |
| 1.2.3 miRNA的研究方法 |
| 1.2.4 植物miRNA的功能 |
| 1.3 miRNA调控果实发育研究进展 |
| 1.4 miR160 及其靶基因研究进展 |
| 1.5 miR319 及其靶基因研究进展 |
| 1.6 本课题研究的目的及意义 |
| 第二章 黄瓜果实膨大相关miRNA及其靶基因的鉴定 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 sRNA文库的构建和测序 |
| 2.1.3 测序数据的分析 |
| 2.1.4 miRNA的差异表达分析 |
| 2.1.5 qRT-PCR分析 |
| 2.1.6 降解组测序 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 miRNA测序结果 |
| 2.2.2 已知miRNA和新miRNA的鉴定 |
| 2.2.3 miRNA的差异表达 |
| 2.2.4 qRT-PCR验证miRNA表达 |
| 2.2.5 靶基因的鉴定 |
| 2.2.6 GO和 KEGG分析 |
| 2.3 结论与讨论 |
| 2.3.1 黄瓜果实膨大sRNA文库的构建和测序分析 |
| 2.3.2 部分高差异表达miRNA的基因网络 |
| 第三章 黄瓜CsamiR160d的生物信息学分析和遗传转化 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 植物材料 |
| 3.1.2 表达载体及菌株 |
| 3.1.3 培养基成分和激素 |
| 3.1.4 CsamiR160d及其靶基因的生物信息学分析 |
| 3.1.5 CsamiR160d超表达载体的遗传转化 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 CsamiR160d的序列 |
| 3.2.2 CsamiR160d上游启动子元件预测 |
| 3.2.3 CsamiR160d靶基因预测 |
| 3.2.4 CsARF17和CsARF18 蛋白性状分析 |
| 3.2.5 CsARF17和CsARF18 蛋白序列分析 |
| 3.2.6 潮霉素筛选浓度的确定 |
| 3.2.7 黄瓜抗性植株的获得及转基因植株的鉴定 |
| 3.2.8 超表达CsamiR160d黄瓜植株生长状况观察 |
| 3.3 结论与讨论 |
| 3.3.1 CsamiR160d及其靶基因CsARF17和CsARF18 的生物信息学分析 |
| 3.3.2 黄瓜CsamiR160d超表达载体的遗传转化 |
| 3.3.3 超表达CsamiR160d对黄瓜植株生长的影响 |
| 第四章 黄瓜CsaMIR319b的生物信息学分析和遗传转化 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 植物材料 |
| 4.1.2 表达载体及菌株 |
| 4.1.3 培养基成分和激素 |
| 4.1.4 CsaMIR319b及其靶基因的生物信息学分析 |
| 4.1.5 CsaMIR319b超表达载体遗传转化黄瓜 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 CsaMIR319b序列 |
| 4.2.2 CsaMIR319b上游启动子元件预测 |
| 4.2.3 CsaMIR319b靶基因预测 |
| 4.2.4 CsDME蛋白性状分析 |
| 4.2.5 CsDME1和CsDME2 蛋白序列分析 |
| 4.2.6 黄瓜抗性植株的获得及转基因植株的鉴定 |
| 4.2.7 超表达CsaMIR319b黄瓜植株及果实的膨大状况观察 |
| 4.2.8 超表达CsaMIR319b黄瓜种子萌发特性 |
| 4.3 结论与讨论 |
| 4.3.1 CsaMIR319b及其靶基因CsDME的生物信息学分析 |
| 4.3.2 超表达CsaMIR319b对黄瓜植株及果实发育的影响 |
| 第五章 全文结论 |
| 5.1 黄瓜果实膨大相关miRNA及其靶基因的鉴定 |
| 5.2 CsamiR160d的生物信息学分析和功能初探 |
| 5.3 CsaMIR319b的生物信息学分析和功能初探 |
| 5.4 本试验的创新点及未来发展展望 |
| 5.4.1 创新点 |
| 5.4.2 未来发展展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 攻读学位期间参加的项目 |
| 摘要 |
| abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 植物miRNA的研究现状 |
| 1.1.1 miRNA的概念与分子特征 |
| 1.1.2 miRNA的研究历史 |
| 1.2 植物miRNA的合成及作用机制 |
| 1.2.1 植物miRNA的生物合成 |
| 1.2.2 植物miRNA的作用机理 |
| 1.2.3 miRNA靶基因的预测及鉴定 |
| 1.3 植物miRNA与逆境胁迫 |
| 1.3.1 miRNA与植物的养分胁迫 |
| 1.3.2 miRNA与其他非生物逆境胁迫 |
| 1.4 本研究的目的意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 植物材料的培养 |
| 2.1.1 小麦材料的培养 |
| 2.1.2 转基因烟草株系的鉴定培养 |
| 2.2 RNA的提取和反转录 |
| 2.3 基因序列的获得 |
| 2.4 基因的表达特征分析 |
| 2.5 融合目的基因的双元表达载体构建 |
| 2.5.1 克隆和测序 |
| 2.5.2 融合目的基因的正、反义双元表达载体构建 |
| 2.6 转基因植株的建立及鉴定 |
| 2.6.1 转基因株系的建立 |
| 2.6.2 转基因植株阳性鉴定 |
| 2.7 转基因植株耐逆功能鉴定 |
| 2.7.1 逆境胁迫下转基因植株的表型鉴定 |
| 2.7.2 逆境胁迫下转基因植株生理指标的测定 |
| 2.7.3 高盐处理下气孔开度测定 |
| 2.7.4 逆境胁迫下转基因植株的表达模式分析 |
| 2.8 转基因植株的转录组分析 |
| 2.9 数据统计分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 TaMIR9674a分子特征及耐逆功能 |
| 3.1.1 TaMIR9674a的分子特征 |
| 3.1.2 TaMIR9674a克隆及测序 |
| 3.1.3 TaMIR9674a在逆境下的表达模式 |
| 3.1.4 TaMIR9674a靶基因预测 |
| 3.1.5 TaMIR9674a正、反义双元表达载体的构建 |
| 3.1.6 TaMIR9674a正、反义表达载体转基因烟草的遗传转化及阳性鉴定 |
| 3.1.7 高盐胁迫下TaMIR9674a转基因株系耐逆功能 |
| 3.1.8 TaMIR9674a转基因烟草植株中PYL和 Sn RK2 基因半定量分析 |
| 3.1.9 TaMIR9674a转基因烟草植株细胞保护酶相关基因的表达特征 |
| 3.1.10 TaMIR9674a转基因烟草植株生理生化指标 |
| 3.1.11 高盐处理下TaMIR9674a转基因植株的气孔关闭特征 |
| 3.1.12 高盐处理下TaMIR9674a转基因植株的转录组分析 |
| 3.2 TaMIR408 的耐逆功能鉴定 |
| 3.2.1 TaMIR408 在小麦和烟草中的保守性 |
| 3.2.2 TaMIR408 作用的靶基因 |
| 3.2.3 miR408 及其靶基因对低磷和高盐胁迫的响应 |
| 3.2.4 TaMIR408 转基因株系抵御低磷和高盐胁迫能力的鉴定 |
| 3.3 TaMIR9780 分子特征和遗传转化 |
| 3.3.1 TaMIR9780 的分子特征 |
| 3.3.2 TaMIR9780 的基因克隆 |
| 3.3.3 逆境下Ta MIR9780 的表达模式 |
| 3.3.4 融合TaMIR9780 正、反义序列的表达载体构建 |
| 3.3.5 TaMIR9780 转基因株系抵御高盐胁迫能力的鉴定 |
| 4 讨论 |
| 4.1 TaMIR9674a介导植株抵御高盐胁迫的分子机制 |
| 4.2 TaMIR408 在介导植株抵御低磷、高盐胁迫中的功能 |
| 4.3 TaMIR9780 应答高盐胁迫的特征及耐逆功能 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简历 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 MIRNA在介导植物抵御逆境中的功能 |
| 1.1.1 MIRNA表达模式 |
| 1.1.2 MIRNA作用机制 |
| 1.1.3 MIRNA在植株抵御逆境中的生物学功能 |
| 1.2 促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)抵御逆境的作用机制 |
| 1.2.1 MAPK分子特征 |
| 1.2.2 MAPKS介导植物应答抵御逆境胁迫的生物学功能 |
| 1.3 本研究的目的及意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料培养 |
| 2.1.1 小麦培养 |
| 2.1.2 转基因材料培养 |
| 2.2 基因克隆与表达 |
| 2.2.1 总RNA提取 |
| 2.2.2 基因克隆 |
| 2.2.3 基因表达 |
| 2.3 表达载体构建与遗传转化 |
| 2.3.1 双元表达载体构建 |
| 2.3.2 亚细胞定位载体构建 |
| 2.3.3 双元表达载体遗传转化 |
| 2.3.4 亚细胞定位表达载体瞬时转化 |
| 2.4 转化烟草株系功能分析 |
| 2.4.1 烟草转化株系的生理指标测定 |
| 2.4.2 亚细胞定位荧光显微镜观察 |
| 3 结果分析 |
| 3.1 TAMIR5062 分子特征及耐逆功能 |
| 3.1.1 分子特征及表达模式 |
| 3.1.2 正、反义双元表达载体的构建 |
| 3.1.3 烟草转化系的建立 |
| 3.1.4 高盐和干旱处理下转化株系的植株生长和形态特征 |
| 3.1.5 高盐和干旱处理下转化系的植株生理生化特性 |
| 3.1.6 高盐和干旱处理下转化株系保护酶编码基因的表达模式 |
| 3.2 TAMIR1139 的分子特征和功能 |
| 3.2.1 TAMIR1139 具有物种保守性特征 |
| 3.2.2 靶基因及其功能 |
| 3.2.3 应答低磷逆境表达模式 |
| 3.2.4 转化株系植株磷素吸收特性 |
| 3.2.5 转化株系PT基因表达模式 |
| 3.3 小麦促分裂原活化蛋白激酶TAMAPKK1 的表达模式和亚细胞定位特征 |
| 3.3.1 分子特征 |
| 3.3.2 系统进化特征 |
| 3.3.3 应答逆境表达特性 |
| 3.3.4 亚细胞定位载体构建 |
| 3.3.5 亚细胞定位分析 |
| 3.4 小麦促分裂原活化蛋白激酶TAMAPKKK;A的表达模式和亚细胞定位特征 |
| 3.4.1 分子特征 |
| 3.4.2 系统进化特征 |
| 3.4.3 应答逆境表达模式 |
| 3.4.4 亚细胞定位特征 |
| 4 讨论 |
| 4.1 TAMIR5062 在介导植株抵御渗透胁迫中发挥着重要作用 |
| 4.2 TAMIR1139 在介导植物抵御低磷逆境中发挥着重要作用 |
| 4.3 TAMAPKK1和TAMAPKKK;A对高盐、干旱胁迫的应答特征 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简历 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语检索 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 三七干旱胁迫研究进展 |
| 1.2 植物内源小RNA(s RNA)的形成与作用机制 |
| 1.1.1 植物内源microRNA的形成过程与作用机制 |
| 1.1.2 植物内源phasiRNA和 tasiRNA的形成过程与作用机制 |
| 1.1.3 植物内源其他小分子RNA的形成过程与作用机制 |
| 1.1.3.1 植物内源t RNA来源siRNA(tsiRNA)的形成过程与功能 |
| 1.1.3.2 异染色质siRNA(hc-siRNA) |
| 1.1.3.3 反义转录siRNA(nat-siRNA) |
| 1.1.3.4 长siRNA(lsiRNA) |
| 1.3 植物s RNA的鉴定、识别和靶基因预测 |
| 1.3.1 植物sRNA的鉴定与识别方法 |
| 1.3.2 植物sRNA靶基因和靶点预测方法 |
| 1.3.3 植物常用sRNA数据库 |
| 1.4 植物s RNA的克隆及其功能验证 |
| 1.4.1 植物sRNA靶点的实验验证 |
| 1.4.2 植物sRNA的克隆与功能验证 |
| 1.5 植物s RNA生物学功能研究 |
| 1.5.1 s RNA参与植物的生长发育过程 |
| 1.5.2 s RNA参与植物非生物和生物胁迫响应 |
| 1.5.3 sRNA在植物次级代谢中的研究进展 |
| 1.6 本研究的目的和意义 |
| 1.7 技术路线 |
| 第二章 干旱胁迫下三七转录组分析与差异基因识别 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 植物材料与处理方法 |
| 2.1.2 总RNA提取 |
| 2.1.3 转录组文库构建与测序 |
| 2.1.4 基于三七基因组的有参转录组生物信息分析流程 |
| 2.1.5 统计与画图 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 三七转录组数据质量和比对基因组结果 |
| 2.2.2 干旱胁迫下三七根和叶转录组组间相关性和PCA分析 |
| 2.2.3 干旱胁迫下三七根和叶差异表达基因分析 |
| 2.2.4 干旱胁迫下三七差异表达基因功能分析 |
| 2.2.4.1 干旱胁迫下三七叶和根差异表达基因KEGG和 GO通路分析 |
| 2.2.4.2 干旱胁迫对三七皂苷合成基因的影响 |
| 2.2.4.3 干旱胁迫对三七苯丙烷生物合成途径基因的影响 |
| 2.2.4.4 干旱胁迫对三七转录因子和内源激素信号通路基因表达的影响 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 干旱胁迫对三七皂苷合成基因与苯丙烷代谢基因的影响 |
| 2.3.2 干旱胁迫对三七内源激素响应基因和转录因子的影响 |
| 第三章 三七干旱胁迫诱导的microRNA识别 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 植物材料与处理方法 |
| 3.1.2 总RNA提取 |
| 3.1.3 小RNA文库构建与测序 |
| 3.1.4 基于三七转录组的miRNA生物信息分析流程 |
| 3.1.4.1 小RNA文件生成与长度分布分析 |
| 3.1.4.2 保守mi RNA及其前体序列预测分析 |
| 3.1.4.3 非保守mi RNA及其前体序列预测分析 |
| 3.1.4.4 mi RNA的差异分析 |
| 3.1.5 基于降解组的三七miRNA靶基因及靶点生物信息学分析流程 |
| 3.1.5.1 三七降解组建库测序 |
| 3.1.5.2 mi RNA靶基因及靶点生物信息学分析流程 |
| 3.1.6 基于三七基因组的TAS基因座预测 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 三七小分子RNA测序数据质量与miRNA的长度分析 |
| 3.2.2 三七保守miRNA的识别及其前体的二级结构分析 |
| 3.2.3 三七保守miRNA表达量组间相关性和PCA分析 |
| 3.2.4 三七响应干旱胁迫的保守miRNA表达模式分析 |
| 3.2.5 三七非保守miRNA的识别及其前体的二级结构分析 |
| 3.2.6 三七miRNA靶基因预测 |
| 3.2.7 三七响应干旱胁迫的miRNA靶基因功能分析 |
| 3.2.8 三七响应干旱胁迫的保守miRNA及其靶基因表达量相关性分析 |
| 3.2.9 调控三七皂苷萜类骨架合成通路的miRNA及其靶基因分析 |
| 3.2.10 三七TAS3 基因座的识别与分析结果 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 干旱胁迫诱导的三七皂苷合成通路microRNA及其靶基因表达和靶点验证 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 植物材料与处理方法 |
| 4.1.2 香草醛—冰醋酸显色法测定总皂苷含量 |
| 4.1.3 总RNA提取 |
| 4.1.4 cDNA第一链合成与实时荧光定量PCR |
| 4.1.4.1 基因c DNA第一链合成 |
| 4.1.4.2 mi RNA的 c DNA第一链合成 |
| 4.1.5 实时荧光定量PCR |
| 4.1.5.1 基因实时荧光定量PCR |
| 4.1.5.2 mi RNA实时荧光定量PCR |
| 4.1.6 5 ’RLM-RACE验证miRNA靶点 |
| 4.1.7 基因和miRNA前体的瞬时报告质粒构建与瞬时表达 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 实时荧光定量PCR检测皂苷萜类骨架合成酶基因的表达 |
| 4.2.2 干旱胁迫对三七叶子和根总皂苷含量的影响 |
| 4.2.3 5 ’RLM-RACE验证4个miRNA靶点 |
| 4.2.4 Pn HMGCS和 miRNA Pre-t49562107前体克隆与瞬时表达质粒构建 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.1.1 在三七萜类骨架合成代谢途径中发掘出了15 个差异表达基因 |
| 5.1.2 挖掘出4 个响应干旱胁迫,调控三七萜类骨架合成代谢途径的miRNA.. |
| 5.1.3 确定了t49562107在HMGCS基因上的靶点,验证了t49562107对HMGCS表达的抑制作用 |
| 5.2 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录A 攻读学位期间发表论文 |
| 附表B |
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 三七黑斑病研究现状 |
| 1.2 植物microRNA研究概况 |
| 1.2.1 植物microRNA的产生和作用机制 |
| 1.2.2 植物microRNA的生物学功能 |
| 1.2.3 植物microRNA的测序和生物信息分析方法概况 |
| 1.2.3.1 植物microRNA的建库测序方法 |
| 1.2.3.2 植物microRNA的生物信息分析方法概况 |
| 1.2.3.3 植物microRNA靶基因研究方法 |
| 1.3 三七microRNA研究进展 |
| 1.4 研究背景、目的、意义 |
| 1.5 本研究内容及创新点 |
| 1.6 本研究技术路线 |
| 第二章 黑斑病诱导的三七microRNA鉴定 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.1.1 菌种培养方法 |
| 2.1.1.2 三七黑斑病叶片侵染方法 |
| 2.1.1.3 黑斑病诱导的三七叶片总RNA提取 |
| 2.1.2 microRNA的建库测序及分析流程 |
| 2.1.2.1 microRNA文库构建与测序 |
| 2.1.2.2 黑斑病诱导的三七microRNA测序数据的质量过滤 |
| 2.1.2.3 黑斑病诱导的三七microRNA长度分布鉴定方法 |
| 2.1.2.4 黑斑病诱导的三七保守microRNA的鉴定方法 |
| 2.1.2.5 黑斑病诱导的三七保守microRNA的表达量计算方法 |
| 2.1.2.6 黑斑病诱导的三七非保守microRNA的鉴定方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 三七黑斑病致病菌人工接种结果 |
| 2.2.2 黑斑病诱导的三七microRNA测序数据质量 |
| 2.2.3 黑斑病诱导的三七microRNA长度分布统计结果 |
| 2.2.4 黑斑病诱导的三七sRNA数据比对到不同数据库的结果 |
| 2.2.5 黑斑病诱导的三七microRNA预测结果 |
| 2.2.5.1 黑斑病诱导的三七保守microRNA预测结果 |
| 2.2.5.2 黑斑病诱导的三七非保守microRNA预测结果 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 黑斑病诱导的三七microRNA靶基因预测及其功能分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 降解组测序 |
| 3.1.1.1 降解组文库构建与测序 |
| 3.1.2 转录组测序简介 |
| 3.1.2.1 转录组测序的建库测序方法 |
| 3.1.3 基于降解组的microRNA靶基因预测分析流程 |
| 3.1.3.1 基于CleaveLand预测靶基因分析流程 |
| 3.1.3.2 基于Seqtar预测靶基因分析流程 |
| 3.1.3.3 无参和有参转录组合并 |
| 3.1.3.4 保守microRNA与靶基因表达量相关性分析方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 降解组测序数据质量 |
| 3.2.2 转录组测序数据质量 |
| 3.2.3 SeqTar保守microRNA靶基因预测结果 |
| 3.2.4 CleaveLand保守microRNA靶基因预测结果 |
| 3.2.5 预测结果比较 |
| 3.2.6 保守microRNA靶基因功能分析 |
| 3.2.6.1 保守microRNA及其靶基因时序分析 |
| 3.2.6.2 保守microRNA靶基因GO分析结果 |
| 3.2.6.3 保守microRNA靶基因KEGG分析结果 |
| 3.2.7 非保守microRNA靶基因预测结果 |
| 3.2.8 保守microRNA与靶基因表达量相关性分析结果 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 黑斑病诱导的三七microRNA实验验证 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验方法 |
| 4.1.2.1 cDNA第一链的合成 |
| 4.1.2.2 实时荧光定量分析方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 保守microRNA与靶基因RT-qPCR分析结果 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 A 攻读学位期间发表论文目录 |
| 附录 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 MicroRNA-具有调节功能的非编码RNA |
| 1.1.1 MicroRNA的发现 |
| 1.1.2 MicroRNA的形成及作用机制 |
| 1.1.3 MicroRNA对植物的调控作用 |
| 1.2 miR167对植物的调控作用 |
| 1.3 花药发育的研究进展 |
| 1.3.1 花药发育的细胞生物学机制 |
| 1.3.2 植物激素参与花药开裂的调节 |
| 1.4 胚乳发育的研究进展 |
| 1.4.1 胚乳发育过程 |
| 1.4.2 胚乳发育调控 |
| 1.5 本研究的目的与意义 |
| 1.6 技术路线 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 拟南芥材料 |
| 2.1.2 玉米材料 |
| 2.1.3 菌株、载体与试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 DNA提取 |
| 2.2.2 RNA提取、反转录及实时定量PCR |
| 2.2.3 转基因载体构建 |
| 2.2.4 植物转化与筛选 |
| 2.2.5 组织细胞学 |
| 2.2.6 拍照与表型统计 |
| 2.2.7 基因枪瞬时转化 |
| 2.2.8 酵母单杂交 |
| 2.2.9 拟南芥转录组测序与分析 |
| 2.2.10 玉米小RNA测序与降解组测序 |
| 2.2.11 玉米转录组测序 |
| 2.2.12 玉米小RNA、转录组与降解组测序数据分析 |
| 2.2.13 系统进化树构建 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 miR167调控拟南芥花药开裂的机理研究 |
| 3.1.1 mARF6和mARF8弱突变体的创制与鉴定 |
| 3.1.2 mir167突变体创制与鉴定 |
| 3.1.3 mir167a、mARF6和mARF8突变体的表型分析 |
| 3.1.4 mARF8突变体全基因组表达模式分析 |
| 3.1.5 EXPA8和XTH19在mARF6和mARF8花药中表达区域扩大 |
| 3.1.6 miR167调控花药开裂的方式 |
| 3.1.7 miR167的产生不依赖茉莉酸信号作用通路 |
| 3.2 miR167在玉米胚乳中的调控功能及机制初探 |
| 3.2.1 玉米胚乳发育过程中差异表达miRNA的鉴定 |
| 3.2.2 miR167在胚乳中的表达模式分析 |
| 3.2.3 靶基因筛选与鉴定 |
| 3.2.4 靶基因过表达材料的RNA-Seq分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 拟南芥miR167限制花药生长 |
| 4.2 拟南芥花药生长受限是花药开裂的前提 |
| 4.3 MIR167a对拟南芥育性至关重要 |
| 4.4 拟南芥miR167-ARF6/ARF8对基因表达的影响 |
| 4.5 拟南芥miR167和茉莉酸独立行使功能 |
| 4.6 miR167-ARF9/ARF18参与玉米胚乳发育调控 |
| 4.7 miR167可能限制玉米胚乳生长 |
| 5 全文总结及创新点 |
| 5.1 全文总结 |
| 5.2 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 作者简历 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 1 研究样本基本信息 |
| 2 早期停育胎盘绒毛组织病理变化研究 |
| 2.1 停育胎盘绒毛滋养层细胞入侵情况 |
| 2.2 滋养层细胞和蜕膜间质细胞分布的情况 |
| 2.3 胎盘细胞凋亡情况 |
| 3 胚胎停育组织差异表达miRNA的筛选 |
| 3.1 组织芯片的排列方式 |
| 3.2 miR-98在胚胎停育组织中的表达 |
| 3.3 miR-16在胚胎停育组织中的表达 |
| 3.4 miR-503在胚胎停育组织中的表达 |
| 3.5 miR-125a在胚胎停育组织中的表达 |
| 4 候选miRNA在胎盘绒毛组织中的作用机制研究 |
| 4.1 miR-98在胎盘绒毛组织中的作用机制研究 |
| 4.2 miR-125a在胎盘绒毛组织中的作用研究 |
| 讨论 |
| 1. 早期停育胎盘绒毛组织中的病理学变化 |
| 2. miRNA与胚胎停育发生的相关性 |
| 3. miR-98和miR-125a在胚胎停育发生中的作用机制 |
| 结论 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 综述一 |
| 参考文献 |
| 综述二 |
| 参考文献 |
| 英汉缩略语名词对照表 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 1 前言 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 植物甜菜素生物合成研究进展 |
| 1.2.1 甜菜素生物合成的途径 |
| 1.2.2 甜菜素生物合成途径中的关键基因 |
| 1.2.3 影响甜菜素生物合成的环境因子 |
| 1.3 miRNA研究进展 |
| 1.3.1 miRNA的发现 |
| 1.3.2 miRNA的生物合成及作用模式 |
| 1.3.3 植物miRNA的鉴定及表达验证 |
| 1.3.4 植物miRNA靶基因的预测及其验证 |
| 1.3.5 miRNA与色素合成 |
| 1.3.6 miRNA在果树上的研究进展 |
| 1.4 本研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 小RNA测序与转录组测序 |
| 2.2.1 小RNA文库的构建与测序 |
| 2.2.2 转录组文库的构建与测序 |
| 2.3 测序数据的生物信息学分析 |
| 2.4 总RNA的提取 |
| 2.5 反转录实验 |
| 2.6 靶基因5′-RACE验证 |
| 2.6.1 实验原理 |
| 2.6.2 cDNA第一链的合成 |
| 2.6.3 cDNA末端快速克隆 |
| 2.6.4 目的片段连接克隆载体 |
| 2.6.5 转化大肠杆菌感受态及克隆鉴定测序 |
| 2.7 相关miRNA及其靶基因的表达分析 |
| 2.7.1 miRNA表达分析 |
| 2.7.2 靶基因的表达分析 |
| 2.8 烟草瞬时转化验证miRNA与靶基因的互作 |
| 2.8.1 瞬时转化载体构建 |
| 2.8.2 农杆菌介导的瞬时转化 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 火龙果小RNA测序结果 |
| 3.2 火龙果中miRNA的鉴定 |
| 3.2.1 火龙果保守miRNAs鉴定 |
| 3.2.2 火龙果新miRNAs的预测 |
| 3.2.3 甜菜素生物合成相关miRNAs的预测 |
| 3.3 火龙果转录组测序结果 |
| 3.4 基因功能注释 |
| 3.4.1 GO功能分析 |
| 3.4.2 KOG注释 |
| 3.4.3 KEGG注释 |
| 3.5 火龙果果肉三个发育阶段的差异基因鉴定 |
| 3.6 火龙果发育过程中果肉甜菜素合成途径分析 |
| 3.7 靶基因的预测 |
| 3.8 实时定量分析miRNA在火龙果果实发育过程中的表达 |
| 3.9 可能参与甜菜素合成的转录因子及结构基因的表达分析 |
| 3.10 靶基因RLM-5′-RACE验证及其表达 |
| 3.11 瞬时转化验证miRNA与其靶基因的关系 |
| 4 讨论与结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录1 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩写词及英汉对照 |
| 1 前言 |
| 1.1 水稻干尖线虫及其发生概况 |
| 1.2 miRNA概述 |
| 1.2.1 miRNA的发现 |
| 1.2.2 miRNA的特点 |
| 1.2.3 miRNA的生物功能 |
| 1.3 miRNA的鉴定和检测方法 |
| 1.3.1 miRNA的鉴定 |
| 1.3.2 miRNA的实验验证 |
| 1.4 内参基因研究进展 |
| 1.5 本研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 供试线虫 |
| 2.1.2 供试植物材料 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.1.4 主要试剂 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 水稻干尖线虫的培养与分离 |
| 2.2.1.1 胡萝卜愈伤组织的制备和水稻干尖线虫的扩繁 |
| 2.2.1.2 胡萝卜愈伤组织上的水稻干尖线虫分离 |
| 2.2.2 两个线虫群体miRNA高通量测序及分析 |
| 2.2.2.1 总RNA的提取 |
| 2.2.2.2 高通量测序 |
| 2.2.2.3 生物信息学分析 |
| 2.2.3 miRNA高通量测序的验证和分析 |
| 2.2.3.1 两个群体间的差异miRNA选择 |
| 2.2.3.2 不同虫态间的miRNA表达分析 |
| 2.2.3.3 qPCR数据分析 |
| 2.2.3.4 miRNA原位杂交 |
| 2.2.4 水稻干尖线虫qPCR内参基因的克隆及筛选 |
| 2.2.4.1 供试线虫样品的收集 |
| 2.2.4.2 总RNA的提取与检测 |
| 2.2.4.3 cDNA第一链合成 |
| 2.2.4.4 候选内参基因片段的克隆和分析 |
| 2.2.4.5 候选内参基因的qPCR引物设计 |
| 2.2.4.6 候选内参基因的qPCR反应 |
| 2.2.4.7 标准曲线的绘制及基因扩增效率 |
| 2.2.4.8 数据分析 |
| 2.2.5 miRNA靶基因的功能预测 |
| 2.2.6 水稻干尖线虫miR-34 的靶基因验证 |
| 2.2.6.1 供试线虫和试剂 |
| 2.2.6.2 线虫的收集、处理及回收 |
| 2.2.6.3 miR-34 靶基因的荧光定量PCR检测及分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 水稻干尖线虫总RNA的提取结果 |
| 3.2 水稻干尖线虫高通量测序结果及生物信息学分析 |
| 3.2.1 原始测序数据 |
| 3.2.2 两文库小RNA共有和特有序列分析 |
| 3.2.3 Rfam数据库比对 |
| 3.2.4 小RNA分类注释 |
| 3.2.5 已知miRNA和新miRN A的鉴定 |
| 3.2.5.1 已知miRNA的鉴定 |
| 3.2.5.2 新miRNA的预测 |
| 3.2.6 miRNA差异表达分析 |
| 3.2.7 两个群体间的差异miRNA验证 |
| 3.2.8 水稻干尖线虫N10和S24群体不同虫态间miRNA表达分析 |
| 3.2.9 水稻干尖线虫miR-34 原位杂交分析结果 |
| 3.3 水稻干尖线虫qPCR内参基因的克隆及筛选 |
| 3.3.1 总RNA质量检测 |
| 3.3.2 候选内参基因片段克隆及分析 |
| 3.3.3 候选内参基因qPCR的引物分析 |
| 3.3.4 候选内参基因qPCR表达 |
| 3.3.5 内参基因的稳定性 |
| 3.3.5.1 ΔCt法分析 |
| 3.3.5.2 geNorm分析 |
| 3.3.5.3 NormFinder分析 |
| 3.3.5.4 RefFinder分析结果 |
| 3.4 miRNA靶基因预测及功能分析 |
| 3.5 miRNA mimics处理后水稻干尖线虫miR-34 和其靶基因的qPCR分析 |
| 3.5.1 miRNA mimics处理后的miR-34 的qPCR分析 |
| 3.5.2 miRNA mimics处理后的靶基因的qPCR分析 |
| 4 结论与讨论 |
| 4.1 水稻干尖线虫N10和S24群体高通量测序及生物信息学分析 |
| 4.2 水稻干尖线虫N10和S24文库miRNA的qPC R验证及分析 |
| 4.3 水稻干尖线虫的内参基因筛选 |
| 4.4 水稻干尖线虫miRNA靶基因的分析 |
| 4.5 miR-34 mimics处理水稻干尖线虫的可行性 |
| 4.6 本研究的创新性及意义 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录A miR-34预测的252个靶基因及其KEGG注释结果 |
| 附录B miR-34靶基因的KEGG富集结果 |
