王常清[1]（2021）在《高温胁迫对二斑叶螨生物学特性、解毒酶及耐药性的影响》文中指出随着设施农业的发展,草莓大棚种植已经在甘肃形成了一个稳定而强大的产业。二斑叶螨Tetrarcychus urticae作为草莓上的优势害螨之一,更容易在温室的小气候环境中爆发成灾,对草莓生长造成严重危害。为明确在高温和长期施用农药的选择压力下二斑叶螨如何维持其种群,包括相关的生物学特性、体内解毒酶系、高温对其耐药性的变化,本试验设置了36℃、39℃、42℃3个高温对二斑叶螨分别进行2 h、4 h、6 h的胁迫,然后测定二斑叶螨的存活、发育及生殖等指标,同时测定二斑叶螨体内解毒酶系的酶比活力及酶动力学常数的变化,最后测定二斑叶螨对联苯肼酯的耐药性变化,旨在探究二斑叶螨适应高温胁迫及高温胁迫后对杀螨剂耐药性的影响。主要研究结果如下:1.高温胁迫对二斑叶螨存活、生长发育及繁殖的影响通过对二斑叶螨的卵、幼螨、雌成螨分别进行高温胁迫,测定各胁迫处理后卵的孵化率、幼螨和雌成螨的存活率、后续螨态的发育历期、生殖力等指标。结果表明:卵和幼螨经高温胁迫后,卵的孵化率和幼螨的存活率随温度升高和时间延长显着降低,均在42℃胁迫6 h时降到最低,后续螨态的发育历期随温度的升高和时间的延长而延长,均在42℃胁迫6 h时延至最长。雌成螨经高温胁迫后全部存活,产卵期、单雌产卵量、F1代卵孵化率均不受影响。说明高温胁迫主要影响二斑叶螨卵的孵化率、幼螨的存活率、后续发育历期,而对雌成螨的生殖无显着影响。2.高温胁迫对二斑叶螨体内解毒酶系的影响通过对二斑叶螨雌成螨进行高温胁迫,测定各胁迫处理后螨体内多功能氧化酶（MFO）、羧酸酯酶（Car E）、谷胱甘肽S-转移酶（GST）的酶比活力以及酶动力学常数(米氏常数Km和最大反应速率Vmax)的变化。结果表明:经36℃,39℃和42℃胁迫后,二斑叶螨体内Car E、MFO、GST的酶比活力和酶动力学常数的变化均受到不同程度的影响。酶比活力:Car E的比活力均高于对照（除39℃胁迫6 h外）,MFO的比活力均高于对照（除42℃胁迫6 h外）,GST的酶比活力也均高于对照（除42℃胁迫2 h外）。酶动力学常数:Car E的Km值均高于对照（除36℃胁迫2 h和4 h、39℃胁迫6 h外）,MFO的Km值均低于对照（除39℃胁迫6 h、42℃胁迫4 h外）,GST的Km值均高于对照（除36℃胁迫2 h外）。Car E的Vmax值均高于对照（除36℃胁迫2 h和4 h外）,MFO的Vmax值均高于对照（除42℃胁迫4 h外）,GST的Vmax值均高于对照。说明高温胁迫可诱导二斑叶螨体内解毒酶活性发生改变参与解毒代谢,相比较Car E和GST,MFO与底物的亲和力最大,反应速率最快,表明其在应对高温胁迫后的解毒代谢中可能起主导作用。3.高温胁迫对二斑叶螨耐药性的影响高温胁迫预先处理后施用联苯肼酯测定高温胁迫下二斑叶螨的耐药性变化。结果表明:高温36℃提高了二斑叶螨雌成螨和幼螨对联苯肼酯的耐药性,而高温39℃和42℃则降低了二斑叶螨雌成螨和幼螨对联苯肼酯的耐药性。36℃胁迫后施用联苯肼酯:雌成螨的死亡率均低于对照,幼螨的死亡率虽均高于对照,但与对照相比没有显着差异性。39℃胁迫后施用联苯肼酯:雌成螨的死亡率均高于对照,幼螨的死亡率也均高于对照（除39℃胁迫2 h外）。42℃胁迫后施用联苯肼酯:雌成螨和幼螨的死亡率均显着高于对照。说明高温胁迫会影响二斑叶螨对杀螨剂的耐药性,而适当的高温（36℃）则会促进二斑叶螨对杀螨剂耐药性的增强。
岳远浩[2]（2021）在《内生菌定殖对水稻中毒死蜱降解及植物毒性的影响》文中进行了进一步梳理毒死蜱是一种广泛用于农业生产中的有机磷杀虫剂,主要用于稻飞虱、稻纵卷叶螟、二化螟等稻田害虫的防治。环境中毒死蜱残留能通过食物链富集对人体健康产生一定的影响。本研究从长期遭受毒死蜱污染的水稻中分离筛选出三株具有毒死蜱降解特性的内生菌,将三株内生菌分别定殖到水稻中,研究其对水稻生长以及毒死蜱降解的影响,并初步解析内生菌与水稻协同促进毒死蜱残留代谢的机制。主要研究内容及结果如下:1.从长期受到毒死蜱残留污染的水稻中分离出三株具有毒死蜱降解特性的内生菌,分别命名为DJ-1、DJ-2、DJ-3,三株菌能在以毒死蜱作为唯一碳源的无机盐培养基中生长。经过16Sr DNA鉴定,DJ-1为沙雷氏菌,DJ-2和DJ-3为芽孢杆菌。建立了无机盐培养基中毒死蜱的提取、气相色谱检测方法。在加有毒死蜱的MSM培养基中培养15 d,DJ-1、DJ-2、DJ-3对毒死蜱的降解率分别为16.94%、21.60%、19.32%。以毒死蜱的降解率为研究对象,以培养温度、培养基p H和毒死蜱浓度作为自变量,使用中心组合响应面法优化了三株内生菌的体外降解条件。菌株DJ-1最佳降解条件为温度32℃、p H=8.3、毒死蜱浓度为35 mg/L,毒死蜱降解率为17.48%;菌株DJ-2最佳降解条件为温度30℃、p H=7.5、毒死蜱浓度为25mg/L,毒死蜱降解率为24.11%;菌株DJ-3最佳降解条件为温度30℃、p H=7.8、毒死蜱浓度为30 mg/L,毒死蜱降解率为22.45%。2.使用三亲本杂交法将绿色荧光蛋白基因分别成功导入DJ-1、DJ-2、DJ-3这三株菌,并通过浸根法将带有绿色荧光蛋白的三株菌分别定殖到三叶一心期的水稻中,使用激光共聚焦显微镜观察这三株菌在水稻不同组织中的分布情况。使用抗生素标记法计算得到三株内生菌在水稻中的定殖动态。DJ-1、DJ-2、DJ-3定殖水稻能够显着促进毒死蜱胁迫下水稻植株的生长,相比于对照组,内生菌定殖的水稻鲜重提高了44.28%-64.66%。DJ-1、DJ-2、DJ-3定殖水稻对水稻中毒死蜱的降解也有一定的促进作用,内生菌定殖水稻中毒死蜱降解半衰期缩短了0.5 d-1.0d。3.体外促生试验表明DJ-1、DJ-2、DJ-3都能够产生吲哚乙酸（IAA）与铁载体、具有氨基环丙烷羧酸（ACC）脱氨酶活性并且具有磷溶解特性,能够促进水稻快速生长,并且增强水稻对毒死蜱残留的降解代谢。对水稻进行毒死蜱处理后,水稻中细胞色素P450含量显着上升,羧酸脂酶活性受到抑制,谷胱甘肽-S-转移酶活性没有发生显着性的变化;内生菌DJ-1、DJ-2、DJ-3定殖水稻后,和对照组相比细胞色素P450含量、羧酸脂酶活性没有发生显着的变化,谷胱甘肽-S-转移酶活性显着上升。
李一帆[3]（2021）在《小菜蛾解毒酶对4类化合物的作用机理研究》文中进行了进一步梳理小菜蛾Plutella xylostella（L.）是十字花科作物的重要害虫,具有分布广、世代短、繁殖快、抗药性发展迅速等特点,给蔬菜生产造成了巨额的经济损失。由于化学杀虫剂的不合理使用,导致小菜蛾对目前市面上所有类型的杀虫剂都产生了不同程度的抗药性,所以探究小菜蛾对杀虫剂的抗药性机理迫在眉睫。解毒酶介导的代谢抗性在小菜蛾对杀虫剂的抗药性机理中尤为重要,但小菜蛾解毒酶对很多杀虫剂解毒代谢的分子机制尚不明确。因此,研究小菜蛾解毒酶的作用机理对解决小菜蛾的抗药性问题具有重要科学价值和应用前景。本研究通过解毒酶活性分析的方法,研究了小菜蛾解毒酶对斑蝥素的解毒代谢功能;采用分子生物学实验和计算机分子模拟结合的手段研究了小菜蛾谷胱甘肽-S-转移酶（PxGSTs）对唑虫酰胺（TFP）解毒代谢的分子机理;联合使用同源模建、分子动力学（MD）模拟、单残基能量分解、计算丙氨酸扫描（CAS）等方法,以谷胱甘肽-S-转移酶（GST）抑制剂——S-己基谷胱甘肽（GTX）为分子探针分析了PxGSTs与化合物的相互作用方式以及结合的关键氨基酸;通过蛋白质三维结构模建、分子对接、分子动力学模拟等技术联合分子生物学实验,阐明了小菜蛾羧酸酯酶（PxEst-6）代谢4种拟除虫菊酯（联苯菊酯,氟氯氰菊酯,氯氰菊酯和λ-氯氟氰菊酯）的分子机理。主要研究结果如下:1.小菜蛾解毒酶系对斑蝥素的解毒代谢目前关于小菜蛾对生物源杀虫剂的解毒代谢已有大量的报道,但是相关研究还未涉及小菜蛾对斑蝥素的解毒代谢。我们通过对小菜蛾解毒酶系（谷胱甘肽-S-转移酶,羧酸酯酶和细胞色素P450酶）和PSPs酶系活性的测定,发现亚致死剂量的斑蝥素处理后小菜蛾体内PSPs的活性呈现出随时间先降低后逐步恢复的趋势;而小菜蛾体内解毒酶系的活性呈现出先降低后升高的趋势（P450酶活性的升高最为显着）,且解毒酶系活性升高的趋势与PSPs酶系活性恢复的趋势相同。该结果表明小菜蛾解毒酶能够在体内对斑蝥素解毒代谢,并使PSPs被抑制的活性逐渐恢复,该研究结果填补了小菜蛾解毒酶系对斑蝥素的解毒代谢功能的空白。2.小菜蛾PxGSTs对唑虫酰胺的解毒代谢作用关于昆虫GSTs在唑虫酰胺解毒代谢中的作用目前还知之甚少。我们以小菜蛾为研究对象通过RT-q PCR分析发现,小菜蛾在经唑虫酰胺处理后PxGSTs（PxGSTδ、PxGSTσ和PxGSTε）的表达量明显上调。体外抑制实验和代谢实验发现,唑虫酰胺对PxGSTs具有一定的抑制效果,并且PxGSTs能够在体外代谢唑虫酰胺,其中PxGSTσ具有最高的代谢效率。基于分子对接的结合模式分析结果表明,Tyr107和Tyr162侧链提供的氢键是PxGSTσ代谢唑虫酰胺的关键相互作用。对Tyr107（PxGSTσY107A）和Tyr162（PxGSTσY162A）位点进行丙氨酸定点突变后发现,突变体蛋白对唑虫酰胺的结合和代谢能力大幅度下降,揭示了PxGSTs和唑虫酰胺之间的代谢相互作用,并阐明了PxGSTσ对唑虫酰胺代谢的分子机理,为新型唑虫酰胺类杀虫剂的设计和优化提供了新的方法。3.小菜蛾PxGSTs与其抑制剂GTX的相互作用昆虫GSTs参与了多种杀虫剂的代谢抗性,以GST抑制剂GTX为分子探针可以揭示杀虫剂抑制昆虫GSTs的分子机理。我们采用同源性模建和分子对接的方法构建了PxGSTσ与GTX分子的三维结构模型（PxGSTσ-GTX）,并通过分子动力学（MD）模拟和结合自由能计算描述了PxGSTσ-GTX复合物的稳定性。通过结合自由能的分析发现,PxGSTσ-GTX复合物的形成和稳定主要由氨基酸残基侧链提供的氢键和疏水相互作用来驱动。通过丙氨酸扫描和定点诱变发现,Lys43和Arg99是PxGSTσ与GTX结合的关键氨基酸位点。并且结合唑虫酰胺与PxGSTσ相互作用的关键位点分析,发现Tyr107可能是化合物对PxGSTσ产生抑制作用的关键残基。该结果为研究现有杀虫剂抑制GST解毒酶系的分子机理提供了结构生物学的参照,为评估新型杀虫剂与GST解毒酶系的相互作用提供了理论指导。4.小菜蛾羧酸酯酶PxEst-6对拟除虫菊酯的代谢机理羧酸酯酶（Car Es）是昆虫体内一种涉及拟除虫菊酯抗药性的解毒酶。我们通过RT-q PCR分析发现,PxEst-6在小菜蛾三龄幼虫的中肠和表皮内高表达,在经4种拟除虫菊酯类杀虫剂（联苯菊酯,氟氯氰菊酯,氯氰菊酯和λ-氯氟氰菊酯）处理后,PxEst-6的表达量迅速上调。通过杀虫剂代谢实验发现PxEst-6具有代谢这4种拟除虫菊酯杀虫剂的能力。通过三维结构模建、分子对接和分子动力学模拟分析了PxEst-6与拟除虫菊酯的结合模式,揭示了参与代谢的关键氨基酸残基和相互作用方式,结果表明PxEst-6通过Gln431、His451和Lys458残基与拟除虫菊酯的乙酸酯基团发生极性或氢键相互作用从而对其进行代谢,并以丙氨酸定点突变对这一结果进行了验证,阐明了PxEst-6代谢拟除虫菊酯类杀虫剂的分子机理。
高海鸣[4]（2020）在《华山松大小蠹解毒酶基因克隆与表达响应》文中提出华山松大小蠹（Dendroctonus armandi）是我国秦岭巴山林区中最具破坏性的森林害虫之一。华山松大小蠹主要危害30年以上的华山松（Pinus armandi）健康木,给华山松天然次生林和人工林带来毁灭性的灾害。小蠹虫利用自身和共生真菌的酶代谢和生理生化作用克服寄主树木的原生性和诱导性抗性,从而完成在寄主树木树干组织内的生存和生活史,其中解毒酶基因不仅能降解寄主树木次生性萜类物质的毒素,还参与小蠹虫体内信息素和激素的合成。本研究以华山松大小蠹为研究对象,通过对华山松大小蠹谷胱甘肽S-转移酶（GSTs）和羧酸酯酶（Car Es）基因的系统发育,华山松大小蠹GSTs和Car Es基因在不同发育时期的表达,GSTs基因在不同组织部位的表达差异,华山松大小蠹GSTs和Car Es基因对华山松挥发性物质的表达响应,以及华山松大小蠹不同世代间体重、能量物质储存和解毒酶活性的差异等研究,旨在揭示华山松大小蠹主要解毒酶基因表达与克服寄主华山松抗性的机制。研究结果如下:1.华山松大小蠹第一代成虫中雄虫的比例为45.79%,而第二代为39.70%。不同性别和不同世代的华山松大小蠹体重、能量物质储存和解毒酶活性均存在显着性差异,其中雌虫具有更大的体重和更多的脂肪储存。2.克隆获得华山松大小蠹谷胱甘肽S-转移酶基因（GSTs）家族16个全长序列,分别属于delta、epsilon、sigma和theta 4个亚族。多重序列比对分析表明,华山松大小蠹Da GSTs基因与其他昆虫的GSTs基因具有高度的同源性。克隆得到了华山松大小蠹8个Car Es基因,其中Da Car E3,Da Car E5和Da Car E6属细胞溶质型,Da Car E1,Da Car E2,Da Car E4,Da Car E7和Da Car E8属分泌蛋白型。8个华山松大小蠹Car Es基因与鳞翅目和双翅目Car Es基因无密切的亲缘关系。3.华山松大小蠹GSTs基因在不同发育时期和入侵成虫不同性别的表达水平有显着差异。华山松大小蠹GSTs基因在雌虫中上调表达,在雄性中下调表达,与雌虫首先入侵寄主树木克服寄主树木萜烯类防御性物质有关。华山松大小蠹所有GSTs基因在雄性触角中均上调表达,说明GSTs基因参与华山松大小蠹信息传递和气味代谢。此外,取食寄主韧皮部的雌虫GSTs基因均上调表达,说明GSTs基因参与华山松大小蠹对寄主萜烯类物质的代谢。4.在华山松大小蠹不同发育时期Car Es表达水平存在显着差异,其中Da Car E1-Da Car E4呈现稳定的转录表达,而Da Car E5-Da Car E8在老熟幼虫、化蛹和蛹羽化阶段表达水平显着差异;Da Car E1-Da Car E7在雌雄迁飞成虫中的表达水平无显着差异,这与其行使的特殊功能和参与特定的行为有关。随华山松大小蠹取食寄主韧皮部时间的延长,Car Es基因的表达水平存在显着差异。5.华山松大小蠹取食不同饲料后,成虫主要解毒酶基因的表达水平存在显着差异,含有华山松韧皮部组织和（-）-α-蒎烯、（-）-β-蒎烯、（+）-3-莰烯、（±）-柠檬烯和松节油的纯人工饲料均诱导解毒酶基因表达的差异,这说明华山松大小蠹主要解毒酶基因具有对寄主华山松抗性特定的表达响应机制。
杨普煜[5]（2020）在《3-氯丙醇酯在大鼠体内的亚慢性毒性作用及其机制研究》文中认为3-氯-1,2-丙二醇酯（3-monochloropropane 1,2-diol ester）,也称为3-氯丙醇酯,是游离3-氯丙醇与长链脂肪酸形成的酯类化合物。3-氯丙醇酯是食品热加工过程中产生的具有潜在毒性的物质,其安全性问题引起了食品科学界的广泛关注。然而,至今为止,3-氯丙醇酯的亚慢性毒性机制尚不明确,对于模式动物较长时间暴露于3-氯丙醇酯后所引起的内源性物质变化的研究也较为匮乏。因此,本论文选择两种具有代表性的3-氯丙醇单酯,包括3-氯丙醇-1-硬脂酸酯和3-氯丙醇-1-油酸酯作为研究对象,通过化学合成高纯度单体化合物,并采用液质联用和核磁共振波谱技术确证了其结构和纯度。采用Sprague-Dawley（SD）大鼠作为模式动物构建亚慢性毒性动物模型,模拟人体在日常饮食中可能摄入3-氯丙醇酯的剂量条件,进而评价其亚慢性毒性。病理切片研究结果表明,两种结构的3-氯丙醇酯在其高、低两个剂量下,分别拥有相似的毒性作用。毒性作用靶器官主要为肾脏和睾丸,对胸腺和肺也有一定程度的损伤,在肝脏和肠道组织中也引起了少量的炎症反应,且毒性作用均存在剂量依赖性。此外,3-氯丙醇酯受试组大鼠血清中的尿酸、尿素氮和肌酐等肾损伤相关指标、IFN-γ和TGF-β等炎症因子指标的水平显着上调,血清中睾酮指标的水平显着下调,且存在剂量依赖性。为了深入研究3-氯丙醇酯的亚慢性毒性作用机制,本论文运用蛋白质组学方法分析了3-氯丙醇酯对大鼠肾脏与睾丸组织中相关蛋白的差异表达情况,并采用GO分析和KEGG通路分析数据库对蛋白质组学结果进行分析。蛋白质组学结果表明,两种结构的3-氯丙醇酯呈现出相似的肾脏、睾丸亚慢性毒性作用。在大鼠肾脏中,3-氯丙醇酯主要影响了离子转运相关的蛋白,导致钙离子在体内的堆积,从而引发肾细胞凋亡,同时也激活了体内的二相酶和转运酶。此外,各种内源性生物代谢相关蛋白也发生了显着性变化,其中包括碳水化合物、氨基酸、氮、脂质、脂肪酸代谢和三羧酸循环相关蛋白。在大鼠睾丸中,3-氯丙醇酯主要引起了炎症反应,进而引发睾丸细胞坏死。为了进一步验证3-氯丙醇酯诱导肾细胞凋亡和睾丸细胞坏死的作用及机制,本论文分别采用大鼠肾小管导管上皮细胞系NRK-52E和小鼠睾丸间质细胞系TM3为细胞模型,通过si RNA干扰技术降低相关因子的表达后,研究发现3-氯丙醇酯可通过Caspase-9因子介导的内源性细胞凋亡途径引发肾细胞毒性,通过RIPK1和MLKL因子介导的细胞坏死途径引发睾丸细胞毒性的分子机制。此外,本论文还通过高分辨质谱结合代谢组学分析,初步探究了3-氯丙醇酯的中长期暴露对大鼠内源性物质代谢的影响,筛选出了3-氯丙醇酯在大鼠血浆、尿液和粪便中的11个生物学标志物,包括高半胱氨酸、4-庚酮、乙酰苯丙氨酸、γ-谷氨酰胺异亮氨酸、3-酮基-2-甲基丁酸、甲基丙二酰基肉碱、溶血磷脂胆碱、反式肉碱、15d-前列腺素J2、13,14-二氢前列腺素F-1α和四氢脱氧皮质醇,这些生物学标志物为3-氯丙醇酯中长期暴露诊断和安全评价提供了科学依据。
许皖[6]（2020）在《葛花、枳椇子及其配伍对急性酒精性肝损伤小鼠保护作用的实验研究》文中指出研究背景:“酒精滥用”和“酒精依赖”是造成酒精性肝病高发病率和死亡率的主要危险因素,已成为仅次于病毒性肝病的第二大肝病,严重危害人类健康。酒精性肝脏疾病是由急性或慢性饮酒引起的肝脏代谢疾病,早期以单纯性脂肪肝病变为主,继而向脂肪性肝炎、肝纤维化、肝硬化和肝癌等不可逆病变发展。尽管酒精性肝脏疾病对全球的经济和健康产生了深远的影响,但目前对于该病治疗药物的研究进展甚微,除戒酒和营养支持外,尚无令人满意的治疗策略。酒精性肝病当属中医“酒疸”、“酒痨”、“酒癖”、“酒臌”、“伤酒”、“酒中毒”等范畴。急性酒精性肝损伤的发生,主要是由于酒食不节,酒毒湿热之邪蕴阻中焦,继而伤及脾胃,致运化失司,水湿失运,变生痰浊,而后湿热搏结,阻滞中焦或土雍木郁,致肝脾同病。其病位在肝,涉及胆、脾、胃,酒毒湿热之邪蕴结体内是根本病机。葛花和枳椇子为我国传统解酒中药,古代医药文献有对两药同用解酒毒的记载。葛花发散宣透,引湿热从肌表而散枳椇子渗泄利尿,使湿热之邪从小便而下,二者配伍,散渗结合,分消湿浊,因势利导,使酒湿邪气排出体外,起到解酒保肝的作用。课题组前期已经完成单味中药葛花、枳椇子对急性酒精中毒性治疗,并进行了葛花枳椇子不同比例配伍对慢性酒精性肝损伤的实验研究,研究明确了二者配伍对酒精性肝损伤显示出一定的防治作用,可以不同程度地改善相关指标,起到解酒护肝的作用。研究目的:酒精性肝损伤是全球亟待解决的公共卫生问题之一,是疾病晚期难以治愈的进行性疾病,若早期阶段能及时防治,可阻止其向不可逆病变发展,故防治急性酒精性肝损伤尤为迫切,但目前相关研究较薄弱。乙醛介导的毒性,氧化应激和脂质代谢失衡通常认为与酒精性肝病的发病密切相关。转录因子Nrf2是防治氧化应激介导疾病的关键治疗靶标,Keap1-Nrf2-ARE信号通路是调控细胞保护酶的关键调节剂,在酒精性肝损伤的早期发挥着重要作用。故本课题在前期研究的基础上,以葛花和枳椇子配伍为研究对象,开展二者配伍对酒精引起的急性肝脏损伤保护作用的实验研究。采用白酒灌胃复制动物模型,动态观察肝损伤情况,通过生物化学、组织病理学、分子生物学等技术方法,探讨二者配伍能否激活Keap1-Nrf2-ARE通路诱导抗氧化酶活性而保肝。中医理论认为急性酒精性肝损伤的发生,主要是由于湿热毒邪蕴结体内,损伤及脾,致脾之运化功能失司,累及肝胆,诱发“伤酒”。越来越多的证据显示,水通道蛋白AQPs的正常表达可能是运化水湿,津液输布,维持体内水代谢稳态的分子生物学基础,而AQP表达异常可能是湿热证病理机制之一。酒精诱导的氧化应激在急性酒精性肝病的早期阶段发挥着重要作用,是引发脂质代谢异常,促进脂质过氧化,造成肝脏脂质蓄积的关键因素。水甘油通道蛋白AQP9是参与甘油和甘油三酯代谢的重要通道蛋白,在调控脂质代谢,维持甘油代谢平衡方面发挥着重要作用。故本研究同时尝试结合中医发病机制,探讨二者配伍能否影响水-甘油通道蛋白AQP9表达而调节肝中脂质代谢,从而研究药物对急性酒精性肝损伤的保护作用,为临床用药提供科学依据,并为开展其他酒精性相关疾病的研究提供思路和借鉴。研究方法:1.葛花、枳椇子及其配伍对急性酒精性肝损伤小鼠乙醇代谢的影响:小鼠按体重随机分成模型组、阳性对照药（水飞蓟宾）组、葛花组、枳椇子组、葛花枳椇子配伍Ⅰ（1:1）组、葛花枳椇子配伍Ⅱ（1:2）组、葛花枳椇子配伍Ⅲ（2:1）组,共计7组,每组15只。采用56%（V/V）红星二锅头白酒,一次大量灌胃（模型Ⅰ组）和连续多次灌胃（模型Ⅱ组）两种方法复制急性酒精性肝损伤动物模型。根据酒精在体内的代谢特点,分别于酒后不同时间点（1h、4h和10d）取材,运用顶空气相色谱法和紫外-可见分光光度法检测血液中乙醇浓度和肝中乙醇脱氢酶活性。2.葛花、枳椇子及其配伍对急性酒精性肝损伤小鼠肝脏功能、血脂水平和肝组织病理形态的影响:小鼠按体重随机分成空白组、模型组、阳性对照药（水飞蓟宾）组、葛花组、枳椇子组、葛花枳椇子配伍Ⅰ（1:1）组、葛花枳椇子配伍Ⅱ（1:2）组、葛花枳椇子配伍Ⅲ（2:1）组,共计8组,每组15只。采用56%（V/V）红星二锅头白酒,一次大量灌胃（模型Ⅰ组）和连续多次灌胃（模型Ⅱ组）两种方法复制急性酒精性肝损伤动物模型。根据血清酶学改变特点,分别于酒后不同时间点（4h、6h、12h、16h和10d）取材,检测肝功能（ALT、AST、ALP、ALB和TP含量）、血脂水平（TG和CHO含量）及肝组织形态变化。3.葛花、枳椇子及其配伍对急性酒精性肝损伤小鼠肝脏组织氧化应激的影响:运用紫外分光光度法检测酒后不同时间点（4 h、6 h、12 h、16 h和10 d）小鼠肝脏组织中SOD、MDA和GSH的吸光度,荧光分光光度法测定肝组织中ROS的吸光度,并计算其在组织中的活力。4.葛花、枳椇子及其配伍对急性酒精性肝损伤小鼠保护作用机制的探讨:运用RT-PCR和Western blot方法,分析检测酒后不同时间点（12 h和10 d）小鼠肝脏组织中Keap 1、Nrf2和AQP9 mRNA和蛋白表达水平。研究结果:1.葛花、枳椇子及其配伍对急性酒精性肝损伤小鼠血液乙醇浓度与肝中乙醇脱氢酶的影响:①酒精性肝损伤模型Ⅰ组小鼠（酒后1h和4h）:与模型组相比,葛花、枳椇子及各配伍组（1:1、1:2和2:1）均显着降低血液中乙醇浓度,并升高肝脏乙醇脱氢酶活性,其中葛花-枳椇子（2:1）组在促进乙醇的代谢方面具有较好的治疗作用,显现出较好的解酒作用。②酒精性肝损伤模型Ⅱ组小鼠（酒后10d）:与模型组相比,葛花、枳椇子及各配伍组（1:1、1:2和2:1）血清中乙醇含量显着降低,肝组织中乙醇脱氢酶活性增强,即各给药组通过调控ADH脱氢酶系统,促进乙醛的消除,并减轻乙醇诱导的肝脏损伤,显现出一定的解酒作用。其中,葛花-枳椇子（2:1）组在加速酒精代谢方面,显现出较好的治疗作用,具有出较好的解酒作用。2.葛花、枳椇子及其配伍对急性酒精性肝损伤小鼠肝脏功能与肝组织病理形态学的影响:①酒精性肝损伤模型Ⅰ组小鼠（酒后4h、6h、12h和16h）:与空白组相比,模型组小鼠血清AST、ALT和ALP水平显着升高,TP和ALB含量显着降低,光镜下肝小叶和肝索结构紊乱,肝细胞水肿或空泡变性,并伴有炎性细胞浸润、脂肪滴的形成,即酒精造成肝脏组织及功能受损,提示模型复制成功。与模型组相比,葛花、枳椇子及各配伍组（1:1、1:2和2:1）均可显着降低小鼠血清中AST、ALT和ALP水平,升高小鼠血清TP和ALB含量,从而改善小鼠的肝脏功能。葛花-枳椇子（2:1）组在改善酒精（酒后12h）造成的肝脏血清转氨酶及肝脏蛋白质合成功能异常方面优于其它各给药组。此外,各给药组均不同程度地改善酒精诱发的微泡样脂肪变性、脂质滴积聚、肝细胞水肿和炎性损伤等病理改变,对酒精诱发的急性肝损伤具有保护作用。②酒精性肝损伤模型Ⅱ组小鼠（酒后10 d）:与空白组相比,模型组小鼠血清ALT、AST和ALP含量显着升高,TP和ALB水平明显降低,表明酒精引起小鼠肝脏功能异常,造成了急性肝脏损伤。与模型组相比,葛花、枳椇子及各配伍组（1:1、1:2和2:1）均不同程度地改善肝脏功能和蛋白合成功能。葛花-枳椇子（2:1）组在改善肝脏功能及蛋白合成功能方面优于其它各给药组,即该配伍组对酒精诱导的肝损伤具有较好的肝保护作用。此外,各给药组均不同程度地改善酒精诱发的肝细胞肿胀、微泡样脂肪变性、炎性细胞浸润和脂质滴积累等病理变化。3.葛花、枳椇子及其配伍对急性酒精性肝损伤小鼠血脂水平及其作用机制的影响:①酒精性肝损伤模型Ⅰ组小鼠（酒后4h、6h、12h和16h）:与空白组相比,模型组小鼠血清TG和CHO水平显着升高,即酒精造成小鼠血脂功能的异常。与模型组相比,葛花、枳椇子及各配伍组（1:1、1:2和2:1）均显着改善血清脂质代谢紊乱。葛花-枳椇子（2:1）组在降低酒精（酒后12h）引起的血清TG和CHO水平升高方面优于其他各给药组。此外,葛花、枳椇子及其各配伍组（1:1、1:2和2:1）均能抑制AQP9的表达,减少肝细胞对甘油的摄入,改善脂质代谢,从而有效缓解肝脏脂肪变性,起到保护肝脏的作用。各给药组在调控AQP9表达,缓解酒精引起的脂质代谢异常方面,均无显着差异。②酒精性肝损伤模型Ⅱ组小鼠（酒后10 d）:模型组小鼠血清TG和CHO水平显着高于空白组,即急性酒精摄入造成小鼠脂质代谢紊乱。葛花、枳椇子及各配伍组（1:1、1:2和2:1）均显着降低血清TG和CHO的水平,并抑制AQP9的表达,对酒精造成的血脂异常具有一定的改善作用,起到保护肝脏的作用。葛花-枳椇子（2:1）组在改善急性酒精摄入造成的高脂血症方面优于其他各给药组,即该配伍组在减少肝脂质积累,缓解脂质代谢异常方面显现出较好的治疗作用。4.葛花、枳椇子及其配伍对急性酒精性肝损伤小鼠肝脏氧化与抗氧化平衡及其作用机制的影响:①酒精性肝损伤模型Ⅰ组小鼠（酒后4 h、6 h、12 h和16 h）:与空白组相比,模型组小鼠肝脏SOD和GSH水平均明显降低,MDA和ROS活力均显着升高,即表明单次大剂量酒精灌胃会造成小鼠氧化应激损伤。与模型组相比,葛花、枳椇子及各配伍组（1:1、1:2和2:1）均可增强抗氧化酶活性,促进肝细胞对脂质过氧化产物的清除,即各给药组均具有抗氧化应激作用,对酒精诱导的肝脏损伤具有潜在的保护作用。其中葛花-枳椇子（2:1）组在增强抗氧化活性,抑制脂质过氧化作用,缓解酒精（酒后12 h）介导的肝细胞氧化应激损伤方面显现出较好的治疗作用,即该配伍组可显着预防酒精引起的急性肝损伤。此外,葛花、枳椇子及各配伍组（1:1、1:2和2:1）可通过抑制Keap1表达,激活Nrf2表达,从而有效地抑制自由基的产生和脂质过氧化,缓解小鼠氧化应激反应,保护肝脏免受酒精诱导的肝细胞损伤。各给药组在调控Keap1-Nrf2-ARE信号传导通路,保护肝组织免受酒精诱导的氧化损伤方面,均无显着差异。②酒精性肝损伤模型Ⅱ组小鼠（酒后10 d）:与空白组相比,模型组小鼠在白酒连续灌胃10天后,肝脏SOD和GSH活性均明显降低,MDA和ROS含量均显着升高,即表明连续大量酒精摄入会造成小鼠氧化应激损伤。与模型组相比,葛花、枳椇子及各配伍组（1:1、1:2和2:1）均通过激活Keap1-Nrf2-ARE信号通路,增强肝脏内抗氧化酶的表达（SOD和GSH）,加快脂质过氧化物（MDA和ROS）分解代谢,减少酒精对小鼠肝组织的损害。此外,葛花-枳椇子（2:1）组在增强小鼠抗氧化能力,减轻脂质过氧化作用,改善氧化应激诱导的细胞损伤方面优于其他各给药组,即该配伍组对缓解酒精诱导的肝损伤表现出积极作用。研究结论:综上所述,本研究证实葛花、枳椇子及各配伍组（1:1,1:2和2:1）对酒精诱导的急性肝损伤具有保护作用。首先,各给药组通过激活Keap1-Nrf2-ARE信号通路,增强抗氧化酶活性,减轻脂质过氧化作用,改善氧化应激诱导的细胞损伤,从而缓解酒精对小鼠的肝脏损害,发挥保护肝脏的作用。其次,各给药组通过调控水-甘油通道蛋白AQP9的表达,降低甘油的渗透性,减少甘油的摄入,改善肝脏脂质代谢异常,从而缓解酒精诱导的氧化应激和肝脂肪变性,起到保护肝细胞的作用。值得注意的是,葛花-枳椇子（2:1）组在促进酒精代谢,改善肝脏功能,减轻肝脏脂肪变性,提高小鼠抗氧化能力方面显现出积极作用,即该配伍组对酒精诱导的肝脏损伤具有较好的保护作用。因此,本研究证实葛花枳椇子配伍对急性酒精性肝损伤显示出一定的防治作用,并明确了二者配伍产生相须为用、协同增效的功用,具有增强解酒保肝的效果,是治疗酒精性肝病的天然解酒保肝药物,为临床应用葛花枳椇子防治急性酒精性肝损伤提供了科学依据。
程超[7]（2020）在《热激、MeJA及ABA富集芥菜芽苗褪黑素技术及机理研究》文中指出十字花科芸薹属植物芥菜（Brassia junceaL.）是中国的特产蔬菜,其营养物质含量丰富,籽粒经发芽后芽苗中内源酶系统被激活,尤其是具有多种生理作用的褪黑素等功能性物质得以富集。高等植物中褪黑素主要由色氨酸经过四步酶促反应生成,其中色氨酸脱羧酶（TDC）、色胺5-羟化酶（T5H）、血清素N-乙酰转移酶（SNAT）、N-乙酰基-5-羟色胺-甲基转移酶（ASMT）是合成褪黑素的关键酶。植物在逆境胁迫条件下褪黑素合成酶激活,内源褪黑素含量显着提高。热激、茉莉酸甲酯（MeJA）及脱落酸（ABA）处理芥菜芽苗可显着提高芥菜芽苗内源褪黑素生物合成,本文通过qRT-PCR、i-TRAQ蛋白组学等技术,从生理代谢、基因转录和蛋白质组三个层面探讨这3种处理调控芥菜芽苗富集褪黑素的作用机制,主要研究结果如下:1、研究了热激、MeJA及ABA处理对芥菜芽苗生理代谢和褪黑素富集的影响。经不同胁迫处理4 d后,各处理下芽苗生长受到不同程度抑制,芽长、干物质含量以及单株芥菜芽苗鲜重均显着下降;热激、MeJA及ABA处理造成芥菜芽苗细胞膜损伤,表现为电解质渗透率和H2O2含量显着上调;同时引起Ca2+和可溶性糖含量的增加,总酚、花色苷和异硫氰酸酯（ITC）含量在胁迫后显着发生变化,芽苗抗氧化能力提高;热激、MeJA及ABA胁迫处理后,4d芥菜芽苗中褪黑素含量较对照分别提高1.88,10.4和3.67倍,实现了芽苗褪黑素的富集。2、研究热激、MeJA及ABA处理后对芥菜芽苗褪黑素合成酶基因表达的影响。采用分子生物学方法,在芥菜中鉴定了11个与褪黑素生物合成酶同源的关键基因。包括2个BjTDC基因,2个BjT5H基因,4个BjSNAT基因和3个BjASMT基因。热激胁迫下,发芽4d和7d的芥菜芽苗中BjTDC 1和BjTDC2表达量均显着上调（p<0.05）,BjT5H1和BjT5H2在4 d表达量显着上升（p<0.05）,而在7d无显着性变化（p>0.05）;BjSN4T1和BjSNAT4在4d表达量显着提高,BjSNAT2和BjSNAT3在4d和7d表达量均显着下调（p<0.05）,BjASMT 1在4 d表达量均上调,而BjASMT2和BjASMT3下调。MeJA处理后,BjTDC 1和BjTDC 2在4d表达量均显着上调（p<0.05）,7d表达量均无显着性变化（p>0.05）,BjT5H1和BjT5H 2在4d和7d表达量均显着上升（p<0.05）。BjSNAT1、BjSNAT2和BjNAT4在4d表达量均显着上升（p<0.05）,BjSNAT3表达量在4d下调而在7d表达量上升,BjASMT 1在4d表达量显着上调,而BjASMT2和BjASMT3表达量显着下调（p<0.05）。ABA处理后,只有BjSNAT 1和BjASMT3在4d显着下调（p<0.05）,其余褪黑素合成酶均显着上调（p<0.05）。结果表明,这三种处理均上调芥菜芽苗BjTDC、BjT5H和下调BjSNAT3,以及不同程度调控其它褪黑素合成关键酶基因表达影响褪黑素的合成。3、研究热激、MeJA及ABA处理后芥菜芽苗中蛋白质组差异表达。芥菜芽苗经这三种胁迫处理后,分别鉴定出172个、156和237个差异蛋白,各处理下芽苗中差异蛋白均参与碳水化合物代谢、能量、响应胁迫、核苷酸代谢、氨基酸代谢、次级代谢、蛋白质生物合成、信号传递等功能,分布于细胞核、核糖体、液泡、线粒体、叶绿体、内质网及细胞质骨架等部位。各处理对芥菜芽苗色氨酸代谢途径均具有调控作用,但是处理间调控蛋白位点及蛋白表达丰度有所差异,影响各处理间褪黑素富集量。此外,热激处理主要富集内质网中的蛋白质加工及光合作用途径,而MeJA及ABA处理下主要影响核糖体及次级代谢,ABA处理还富集了谷胱甘肽代谢途径。这三种处理通过调控胞内信号传递,核酸转录翻译,提高能量代谢,促进蛋白转运及合成,加强抗氧化系统等,间接影响褪黑素合成,累积具有活性的次级代谢物质及其它生理功能调节物质共同增强其对胁迫的耐受性。
杨奕[8]（2020）在《SIRT3在抗肿瘤药物心血管毒性中的作用及机制研究》文中进行了进一步梳理背景随着现代抗肿瘤化疗技术疗效的提高,抗肿瘤化疗药物诱发的心血管毒性逐渐受到学术关注。抗肿瘤药物引起的临床常见心血管系统副作用包括血压升高、左室射血分数（left ventricular ejection fraction,LVEF）降低、心律失常等,常导致接受化疗的肿瘤患者生活质量下降、一些患者不得不停止抗肿瘤化疗,甚至导致部分患者在癌症治愈后最终死于心血管系统疾病,这一现象已经成为抗肿瘤化疗进程中的一个难题。目前,抗肿瘤药物导致心血管毒性的病理生理机制尚不完全明了。探索抗肿瘤药物导致心血管毒性的细胞分子机制,寻找预防和诊疗策略,对为肿瘤患者提供更全面、更长远的诊疗服务具有重大意义。在临床广泛应用的抗肿瘤药物中,酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitor,TKI）类药物是一类通过抑制血管内皮生长因子下游的酪氨酸激酶,抑制肿瘤血管新生,破坏肿瘤微循环血液供应,实现抗肿瘤药效的药物。然而由于心脏和肿瘤都具有高代谢、高耗能的特点,心脏的正常生理功能同样高度依赖微循环血液供应,因此,心肌组织对TKI类药物抑制血管新生的作用同样敏感。既往研究表明,TKI类药物可诱发一系列心血管系统副作用,如血压升高、左室功能减退等。TKI类药物中,舒尼替尼是一种代表性TKI类药物,在我国被用于肾细胞癌等肿瘤的一线治疗。舒尼替尼最常见心血管系统副作用之一是左室功能减退,新近研究表明,心脏微血管周细胞受损与减少、心脏微循环供血受损,是舒尼替尼导致小鼠左室功能减退的主要病理学基础。周细胞是一种镶嵌于全身微血管系统基底膜外侧的、对全身微血管系统结构与功能具有重要调节功能的细胞群,在心肌组织中,心脏微血管周细胞密切调节心肌微血管的结构、管径、流量、微血管壁通透性等,是参与多种心血管系统疾病的重要细胞群。舒尼替尼通过高效抑制血小板源性生长因子受体β（platelet derived growth factor receptors β,PDGFRβ）信号通路,导致小鼠心脏微血管周细胞减少,心脏微血管周细胞覆盖率降低、迂曲度降低、管壁通透性增加、生理功能失调,心脏微循环供血损伤,最终导致小鼠左室功能减退。沉默调节因子3（Sirtuin 3,SIRT3）是存在于线粒体基质中的重要的去乙酰化酶,其作用于广泛的蛋白底物,调控庞大的分子通路网络,已被证实在多种心血管疾病和肿瘤中具有重要作用。新近研究提示,人SIRT3可通过抑制自噬增加肝细胞对外源性肝毒性物质的敏感性;亦有研究报道,人SIRT3可通过抑制谷胱甘肽S-转移酶pi 1（glutathione S-transferase pi 1,GSTP1）/c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase,JNK）通路增强肝癌细胞对TKI类药物索拉非尼的敏感性;且GSTP1/JNK通路可在人骨肉瘤细胞中促进自噬。然而目前尚未有研究探讨SIRT3对心脏微血管周细胞自噬是否有影响、SIRT3是否通过GSTP1/JNK通路影响心脏微血管周细胞自噬,及SIRT3是否在心脏微血管周细胞通过GSTP1/JNK/自噬轴对舒尼替尼诱发左室收缩功能减退产生潜在作用。SIRT3在舒尼替尼诱发小鼠左室收缩功能减退中的作用及其具体机制,仍有待进一步探讨。基于以上研究背景,本课题通过建立小鼠舒尼替尼诱发左室功能减退模型、周细胞舒尼替尼毒性模型,在体内、体外水平对舒尼替尼心血管毒性的内在机制、SIRT3在舒尼替尼导致小鼠左室功能减退中的作用及细胞分子机制展开深入探讨,其研究结果或可为以SIRT3作为潜在分子靶点研发舒尼替尼心血管毒性的预防与治疗策略提供研究依据。目的1.探讨SIRT3在舒尼替尼所致小鼠左室功能减退中的作用;2.探讨SIRT3对舒尼替尼所致左室功能减退的影响是否为自噬介导;3.探讨SIRT3对自噬的调控是否为GSTP1/JNK通路介导。方法1.实验动物所有动物实验均符合国家卫生部动物管理办法（文案号No.55,2001）和山东大学齐鲁医院伦理委员会对动物实验的要求和规定。8 w雄性129野生型（wild type,WT）小鼠购自美国Charles River Laboratories;8 w雄性、雌性SIRT3敲除（knockout,KO）小鼠购自美国Jackson Laboratory,基因背景为129S6/SvEvTac。小鼠购回后进行繁育扩群。SIRT3过表达小鼠由尾静脉注射SIRT3过表达慢病毒（lentivirus,LV）获得,同时构建相应慢病毒载体对照小鼠。2.构建小鼠舒尼替尼诱发左室功能减退模型小鼠64只,称重后,灌胃给予舒尼替尼（40 mg/kg/day）4w,以诱导小鼠舒尼替尼诱发左室功能减退模型。对照组小鼠组每日同体积安慰剂（橄榄油）灌胃。干预期间继续给予普通饮食喂养。3.血压测量采用Softron无创尾套系统测定小鼠收缩压（systolic blood pressure,SBP）、平均血压（mean blood pressure,MBP）、舒张压（diastolic blood pressure,DBP）等血压参数。每只小鼠重复测量3次血压,最终获得各参数的平均值和标准误。4.超声心动图测量采用VisuaISonics Vevo 770小动物超声仪对每只小鼠进行至少3次M-mode、二维超声心动图和脉冲多普勒（pulse wave doppler,PWD）超声模式的图形采集,分析计算LVEF、缩短分数（fractional shortening,FS）、E/A 比等。5.免疫组织化学染色对小鼠实行安乐死,取材后,心肌组织切片进行苏木素&伊红（hematoxylin and eosin,H&E）染色观察形态,Masson染色评估胶原含量;麦胚凝集素（wheat germ agglutinin,WGA）荧光染色评估心肌细胞肥大程度;同工凝集素I-B4（isolectin I-B4,IB4）免疫荧光染色评估微血管密度;神经/胶质抗原2（neural/glial antigen 2,NG2）和IB4免疫荧光双标染色计算微血管周细胞覆盖率;SIRT3/NG2免疫荧光双标染色评估体内水平心脏周细胞内SIRT3表达水平。使用Zeiss激光共聚焦扫描显微镜获取图像,并用Image Pro Plus 6.0软件进行图像分析。6.原代心脏微血管周细胞的提取和鉴定无菌取3 w小鼠心室肌,在汉克平衡盐溶液（Hank’s Balanced Salt Solution,HBSS）中剪碎,以混合蛋白酶溶液消化,以铜网反复过滤至分散为单个细胞,Percoll梯度离心法分离出心脏微血管周细胞组分。将分离出的周细胞于内皮细胞培养基中培养、传代,在传至第三代时更换培养基为周细胞培养基。免疫荧光染色NG2、PDGFRβ鉴定心脏微血管周细胞。由SIRT3-KO小鼠提取SIRT3-KO原代心脏冠脉微血管周细胞。向WT周细胞转染SIRT3过表达慢病毒获得LV-SIRT3周细胞。向WT周细胞转染siRNA-GSTP1获得沉默GSTP1的周细胞。7.原代心肌细胞的提取和鉴定无菌取新生大鼠乳鼠心室组织,用HBSS冲洗3次,剪碎,后将切碎的组织以胶原酶B反复消化,利用差速贴壁法分批次收集心肌细胞,于杜贝克改良鹰培养基（Dulbecco’s Modified Eagle Medium,DMEM）中培养。免疫荧光标记心肌细胞标记物心肌肌钙蛋白I（cardiactroponin l,cTnl）鉴定心肌细胞。8.细胞活力测定细胞计数试剂盒-8（Cell Counting Kit-8,CCK-8）试剂盒检测细胞活性。9.细胞自噬流检测取生长良好细胞,转染mCherry-绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）-微管相关蛋白1A/1B轻链3（microtubule-associated protein 1A/1B-Iight chain 3,LC3）腺病毒,激光共聚焦扫描显微镜观察细胞自噬流。每组至少5个细胞分析自噬小泡的数量。10.蛋白免疫印迹提取心肌组织、细胞总蛋白,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）分离蛋白样品,转移蛋白至聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride,PVDF）膜,封闭,一抗4℃孵育过夜,二抗室温孵育2 h,以电化学发光（electrochemiluminescence,ECL）显影目的蛋白条带,使用LAS-4000化学发光仪获取图像,ImageJ 1.46r软件分析条带灰度值以进行后续统计学分析。11.免疫共沉淀一抗和protein A-Sepharose与总蛋白在4℃共孵育24 h,使用洗涤缓冲液洗涤珠子五次,煮沸10 min洗脱。对样本进行SDS-PAGE电泳,然后使用抗对方蛋白的一抗进行免疫印迹检测对方蛋白共沉淀水平。12.统计学分析所有实验数据均来自3次及以上独立重复实验,采用SPSS 20.0软件包处理,定量资料均以均数（x）±标准差（standard deviation,SD）表示。两组之间比较采用独立样本的t检验,设p<0.05为有统计学意义。结果1.小鼠舒尼替尼诱发左室功能减退模型的构建我们对WT小鼠给予舒尼替尼或安慰剂灌胃28 d。小鼠血压测量结果示,舒尼替尼组小鼠SBP为136.8±7.7 mmHg,安慰剂组小鼠SBP为111.0±5.2 mmHg:超声心动图结果显示舒尼替尼组小鼠LVEF为0.75±0.13、FS为0.48±0.03,安慰剂组小鼠LVEF为0.93±0.05、FS为0.67±0.11。这些结果提示与安慰剂组相比,舒尼替尼组小鼠血压显着升高、左室收缩功能显着降低,提示小鼠舒尼替尼诱发左室功能减退模型构建正确。2.舒尼替尼对小鼠心脏微血管周细胞的影响舒尼替尼或安慰剂处理的WT小鼠的心肌组织切片H&E染色、Masson染色、WGA染色、IB4免疫荧光染色结果示,与安慰机组小鼠相比,舒尼替尼未导致小鼠心肌组织炎症细胞浸润、纤维化、心肌细胞肥大、微血管密度降低,提示舒尼替尼导致的左室功能障碍非以上病理学改变介导。舒尼替尼或安慰剂处理的WT小鼠心肌组织切片NG2/IB4免疫荧光双标染色和组织蛋白免疫印迹分析结果示,与安慰机组小鼠相比舒尼替尼导致小鼠心脏冠脉微血管周细胞含量显着下降。我们进而对体外培养原代小鼠心脏微血管周细胞进行不同剂量（0,2,4,6,8,10 μM）舒尼替尼处理,CCK-8细胞活力测定显示舒尼替尼剂量依赖性降低体外培养的周细胞的活力。这些结果与既往研究结果相符,提示心脏微血管周细胞减少是舒尼替尼导致小鼠左室功能障碍的主要病理学改变。3.舒尼替尼对小鼠心脏微血管周细胞SIRT3水平的影响舒尼替尼或安慰剂处理的原代小鼠心脏微血管周细胞和原代大鼠心肌细胞的细胞蛋白免疫印迹实验结果显示,舒尼替尼剂量依赖性上调了周细胞中SIRT3表达水平,但未影响心肌细胞中SIRT3的表达水平;小鼠心肌组织切片SIRT3/NG2免疫荧光双标染色实验结果示,与安慰机组小鼠相比,舒尼替尼组小鼠心脏周细胞SIRT3表达水平升高。这些结果提示舒尼替尼可在体内、体外水平上调心脏周细胞SIRT3水平,心脏周细胞SIRT3或可在舒尼替尼致左室功能减退中发挥重要作用。4.SIRT3对小鼠对舒尼替尼心血管毒性的敏感性的影响我们对WT、SIRT3-KO、LV-vehicle和LV-SIRT3小鼠予舒尼替尼或安慰剂灌胃。结果示,舒尼替尼灌胃后,与WT小鼠相比,SIRT3-KO小鼠的血压的升高、左室收缩功能的降低受到显着缓解,安慰剂灌胃的WT和SIRT3-KO小鼠的血压和左室收缩功能没有显着差异;与LV-vehicle小鼠相比,LV-SIRT3小鼠的血压的升高、左室收缩功能的降低幅度显着加剧,安慰剂灌胃的LV-vehicle和LV-SIRT3小鼠的血压和左室收缩功能没有显着差异。这些结果表明SIRT3增强了小鼠对舒尼替尼所致心血管毒性的敏感性。5.SIRT3对周细胞对舒尼替尼损伤的敏感性的影响我们在体内水平对接受舒尼替尼或安慰剂的WT、SIRT3-KO、LV-vehicle、LV-SIRT3小鼠进行心肌组织切片的NG2/IB4免疫荧光双标染色和心肌组织蛋白的NG2免疫印迹分析,结果示SIRT3-KO小鼠与WT小鼠相比,舒尼替尼诱发的周细胞减少较轻微,而LV-SIRT3小鼠与LV-vehicle小鼠相比,舒尼替尼诱发的周细胞减少加重。这些结果提示SIRT3在体内水平可加剧舒尼替尼诱发的周细胞减少。我们进而在体外水平对接受舒尼替尼或安慰剂处理的WT、SIRT3-KO、LV-vehicle、LV-SIRT3周细胞进行细胞活力测定,结果示,SIRT3-KO周细胞与WT周细胞相比,舒尼替尼诱发的活力下降受到缓解,而LV-SIRT3周细胞与LV-vehicle周细胞相比,舒尼替尼诱发的活力下降加剧。这些结果提示SIRT3在体外水平可加剧舒尼替尼诱发的周细胞活力降低。体内、体外实验结果表明,SIRT3可加剧周细胞对舒尼替尼损伤的敏感性。6.SIRT3增强周细胞中舒尼替尼对自噬的抑制作用我们通过免疫印迹实验检测了舒尼替尼或安慰剂处理下周细胞的凋亡标志物的水平,结果表明舒尼替尼未显着改变周细胞凋亡标志物水平,提示舒尼替尼诱发周细胞损伤非凋亡介导。我们进而通过免疫印迹实验和mCherry-GFP-LC3腺病毒转染实验检测了舒尼替尼或安慰剂处理下周细胞的自噬水平,结果表明与安慰机组相比,舒尼替尼组细胞自噬标志物LC3-Ⅱ与LC3-Ⅰ比值显着升高、镜下胞内自噬小泡积累量显着升高,提示舒尼替尼可抑制周细胞晚期自噬。我们以晚期自噬抑制剂巴伐洛霉素A1、自噬激活剂雷帕霉素预处理周细胞,发现与对照组周细胞相比,舒尼替尼诱发的周细胞活力降低可被雷帕霉素显着缓解、被巴伐洛霉素A1显着加剧,表明舒尼替尼诱发周细胞损伤至少部分由自噬抑制介导。我们接下来研究了SIRT3对周细胞自噬的影响。免疫印迹实验和腺病毒转染实验显示,SIRT3-KO可抑制舒尼替尼诱发的周细胞LC3-Ⅱ与LC3-Ⅰ比值的升高和自噬小泡的积累,而LV-SIRT3可加剧舒尼替尼诱发的周细胞LC3-Ⅱ与LC3-Ⅰ比值的升高和自噬小泡的积累。这些结果表明SIRT3可加剧舒尼替尼诱发的周细胞自噬抑制。7.SIRT3通过抑制GSTP1/JNK通路增强周细胞对舒尼替尼抑制自噬的敏感性我们首先通过免疫印迹实验检测了调控自噬的经典信号通路5’磷酸腺苷活化蛋白激酶（5’adenosine monophosphate-activated protein kinase,AMPK）/雷帕霉素靶体蛋白（mechanistic target of rapamycin,mTOR）蛋白水平和磷酸化水平,发现安慰剂和舒尼替尼处理的周细胞该通路蛋白水平和磷酸化水平无显着差异,提示该信号通路未参与舒尼替尼诱发的周细胞损伤。我们进而进行了免疫印迹、siRNA转染等实验检测安慰剂和舒尼替尼处理的周细胞GSTP1/JNK通路蛋白水平、磷酸化水平,并进行免疫共沉淀实验检测SIRT3与GSTP1的相互结合,证实在周细胞中SIRT3与GSTP1存在直接结合相互作用,且SIRT3可负调控GSTP1表达,促进GSTP1下游JNK磷酸化,从而抑制自噬,增强周细胞对舒尼替尼损伤的敏感性。结论1.SIRT3可增强小鼠对舒尼替尼诱发左室功能减退的敏感性;2.SIRT3可通过抑制心脏周细胞自噬增强小鼠对舒尼替尼损伤的敏感性;3.SIRT3可通过抑制GSTP1/JNK通路抑制心脏周细胞自噬。背景周细胞是一类包裹于全身微循环系统微血管基底膜外侧的具有重要调节功能和分化潜能的细胞。周细胞最早于1873年由Rouget首次发现,并在很长一段时间里,被认为仅是一类参与血管收缩的、无重要生理学作用的细胞。近50年来,大量关于不同系统和器官中的周细胞的生理、病理功能的临床与基础研宄极大地拓展了人们对周细胞功能的认识。研究表明,周细胞在血管新生、微血管壁通透性及物质转运、微血管血流量、胞外基质的组织和信号转导、血脑屏障等多种生理过程中发挥重要的调节作用,并在修复性纤维化、疤痕形成、肿瘤生长和转移、侧枝血管生成等方面具有极大的治疗潜力。周细胞位于微血管腔和组织之间的独特解剖位置决定了周细胞在循环系统与组织之间物质交换中发挥第一手参与者的关键性作用。因此,在新陈代谢旺盛、高度依赖微循环血液供应和物质交换的组织如心肌、肿瘤等中,周细胞结构与功能的变化对组织的影响尤为显着。有关组织中药物代谢的研宄表明,周细胞直接参与组织对经血液循环运输的抗肿瘤化疗药物的敏感性与耐药性的调节:甲状腺癌组织中的周细胞是介导癌组织对索拉非尼和维罗非尼的耐药性的主要细胞;另一方面,心脏微血管周细胞是酪氨酸激酶抑制剂舒尼替尼诱发心血管毒性的重要靶细胞。这些信息提示,心脏周细胞或可在心脏对药物的敏感性与耐药性起到重要调节作用。尽管如此,心脏周细胞在心脏对药物的敏感性与耐药性中的作用少有研宄探讨。探宄心脏周细胞在心脏对药物敏感性与耐药性中的作用及具体细胞分子生物学机制,将有助于开发以心脏周细胞为靶点的副作用更少、药效更强的心血管系统药物。Sirtuin 3（SIRT3）是存在于线粒体中的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide,NAD）依赖的去乙酰化酶。近年研究报道,SIRT3可调控不同细胞对多种抗肿瘤化疗药物的敏感性与耐药性,如SIRT3可在乳腺癌细胞中增强细胞对他莫昔芬和顺铂的耐药性,或在肝癌细胞中增加细胞对索拉非尼、阿霉素和表阿霉素的敏感性。在我们前期研宄中,我们证实小鼠心脏微血管周细胞SIRT3可通过抑制谷胱甘肽S-转移酶#141的3岀丨〇116 5-transferase pi 1,GSTP1)增强周细胞对抗肿瘤化疗药物舒尼替尼损伤的敏感性。除此之外,未有更多研宄探讨SIRT3在心脏周细胞药物代谢中的作用及机制。SIRT3对心脏周细胞药物代谢方面的作用及机制仍有待进一步了解。在本研究中,我们对体外培养的原代小鼠心脏周细胞标本进行串联质谱标记（tandem mass tag,TMT）定量蛋白质组学和生物信息学分析,揭示小鼠心脏周细胞SIRT3缺失可显着改变周细胞细胞色素P450（cytochrome P450,CYP450）相关药物代谢蛋白信号通路。我们进一步通过体外实验验证,SIRT3敲除可有效降低周细胞对抗肿瘤化疗药物索拉非尼和维罗非尼的损伤的敏感性,其中,对索拉非尼的敏感性的调控由上调谷胱甘肽S-转移酶的3比阳5-transferasealpha4,GSTA4)介导。这些结果扩展了目前对心脏周细胞在药物代谢中作用的认识,并提示SIRT3可能是心脏周细胞CYP450相关药物代谢通路的关键调节因子,结果或可为研发更安全、更有效的心血管系统相关药物提供新的细胞分子策略和研宄佐证。目的1.研宄小鼠心脏周细胞SIRT3对蛋白质组CYP450相关药物代谢通路的影响;2.研宄小鼠心脏周细胞SIRT3对GSTA4蛋白水平的调控作用;3.研宄小鼠心脏周细胞SIRT3通过调控GSTA4在细胞对不同抗肿瘤化疗药物的敏感性中的作用。方法1.原代小鼠心脏周细胞提取和培养研宄涉及的动物实验均符合国家卫生部动物管理办法（文案号No,55,2001）和山东大学齐鲁医院伦理委员会规定的相关条例。8 w雄性129野生型（wild type,WT）小鼠购自美国Charles River Laboratories。8 w雄性、雌性SIRT3敲除（knockout,K0）小鼠自美国Jackson Laboratory购买。小鼠购回后进行繁育扩群。WT和SIRT3-K0原代小鼠心脏周细胞分别由20只3 w 129 WT雄性小鼠和20只3 w 129 SIRT3-K0雄性小鼠提取,每10只小鼠提取的细胞合并为1个混合样品,每组共包括2个混合样品。无菌将3 w小鼠心室肌在汉克平衡盐溶液（Hank’s Balanced Salt Solution,HBSS）中剪碎,以混合蛋白酶溶液酶解组织块,使用铜网反复过滤至分散为单个细胞,Percoll梯度离心法梯度分离周细胞组分。以内皮细胞培养基重悬周细胞并于培养瓶中培养、传代,在传至第三代时更换培养基为周细胞培养基。免疫焚光检测神经/胶质抗原2（neural/glial antigen 2,MG2）、血小板源性生长因子受体P（platelet derived growth factor receptors p,PDGFRP）鉴定心脏周细胞提取正确。2.细胞蛋白样品制备取刚刚长满处于最佳状态的细胞,弃培养基,以磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline,PBS）清洗。在适当体积的PBS中将细胞轻轻刮下,收集于离心管中,12000 rpm离心5 min,弃上清液。取沉淀,置于SDT裂解缓冲液中于100°C裂解15 min,14000 g离心15 min。取上清液,二喹啉甲酸（bicinchoninic acid,BCA）法测定上清液蛋白浓度,依据蛋白浓度进行十二院基硫酸钠-聚丙烯酿胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）,并考马斯亮蓝染色。3.过滤辅助样品制备（filter aided sample preparation,FASP）和TMTIOplex?标记对样品进行FASP。各蛋白样品使用二硫苏糖醇（Dithiothreitol,DTT）还原二硫键,使用碘乙酰胺氧化二硫键、半胱氨酸残基等,4 g/L溶于碳酸氢铵的胰酶酶切16-18 h,重新离心收集滤液,C18脱盐柱脱盐,冻千,甲酸复溶,紫外分光光度法测定肽链含量。使用TMTIOplex?同异位标签试剂盒标记各组样品。4?液相色谱-质谱（liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS/MS）分析与数据处理样品使用Easy nLC系统色谱分离。使用Q Exactive plus质谱仪进行LC-MS/MS分析。使用Proteome Discoverer 2.1软件将Raw文件转化为.mgf文件。使用MASCOT2.6服务器在UniprotMusMusculus1699820180905数据库中检索,获取.dat文件。5.生物信息学分析对于差异表达的蛋白进行生物信息学分析:基因本体（gene ontology,GO）功能注释分析使用Blast2G0进行;使用京都基因与基因组百科全书（The Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）KEGG Orthology and Links Annotation（KOALA）数据库进行通路注释分析;使用Python library matplotlib软件进行蛋白质聚类分析,生成层次聚类热图;对重要通路中的差异蛋白进行IPA?（Ingenuity Pathway Analysis）分析,并构建功能相互作用网络。6.免疫印迹分析提取心脏周细胞总蛋白,SDS-PAGE分离蛋白样品,转移至聚偏氟乙烯（polyvinylidenefluoride,PVDF）膜,封闭,一抗4°C孵育过夜,二抗室温孵育2h,并以电化学发光（electrochemiluminescence,ECL）显影目的蛋白条带,使用LAS-4000化学发光仪拍摄条带图像,使用ImageJ 1.46r软件分析条带灰度值,以进行后续统计学分析。7.细胞处理与细胞活力测定用不同浓度索拉非尼（0,2,4,6,8,10 pM）或维罗非尼（0,100,200,300,400,500 nM）分别处理体外培养的心脏周细胞48 h、72 h。细胞计数试剂盒-8（Cell Counting Kit-8,CCK-8）试剂盒检测细胞活性。8.SiRNA转染向6孔板中培养的周细胞转染50 nMol沉默GSTA4的siRNA序列（5’-3’）GCUGCCAAGUACAACUUGUTTACAAGUUGUACUUGGCAGCTT沉默GSTA4表达。9.统计学分析所有实验数据均来自3次及以上独立重复实验。数据采用SPSS 20.0软件包处理,定量资料以均数（x）±标准差（standard deviation,SD）表示。两组之间比较采用独立样本的t检验,设p<O.O5为有统计学意义。结果1.心脏周细胞蛋白质组定量分析我们分别提取、培养WT、SIRT3-K0原代小鼠心脏微血管周细胞,免疫荧光鉴定所提取细胞周细胞标志物NG2、PDGFRP阳性。TMT定量蛋白质组学结果示蛋白样品中一共检测出38383种肽链和5110种蛋白。蛋白在UniprotMusMusculus1699820180905数据库中进行匹配。2.心脏周细胞SIRT3敲除对CYP450相关药物代谢通路的影响在5110种检测出的蛋白中,共有415种蛋白在WT、SIRT3-KO样品之间的表达差异有统计学意义,其中159种蛋白在SIRT3-KO周细胞中较在WT周细胞中显着上调,256种蛋白显着下调。差异蛋白KEGG通路注释分析共获得277个蛋白通路网;差异蛋白KEGG通路富集分析结果示CYP450相关药物和外源物质代谢通路是SIRT3-K0周细胞与WT周细胞相比第二大显着改变的KEGG通路,其包括16种差异蛋白。差异蛋白GO功能注释分析共识别3711个GO注释。第一级注释中,有2541个（68.47%）生物过程注释、683个（18.40%）分子功能注释、487个（13.12%）细胞组分注释,提示生物过程是Sirt3-KO周细胞与WT周细胞相比改变最显着的功能注释。在生物过程注释类别中,二级注释细胞过程（15.96%）和代谢过程（15.96%）是占比最大的两个注释。差异表达蛋白质GO富集分析结果示,生物过程注释类别中外源物质代谢过程注释在Sirt3-K0周细胞中与WT周细胞相比显着改变,其包括9种差异蛋白。GO功能注释分析结果支持CYP450相关药物和外源物质代谢通路在SIRT3-K0周细胞中与WT周细胞相比显着改变。3.心脏周细胞SIRT3敲除对CYP450相关药物代谢通路差异蛋白的影响KEGG通路注释分析检测的16种差异蛋白中,10种在SIRT3-KO周细胞中较WT周细胞中显着上调,包括CYP450 1B1（CYP1B1）,3种谷胱甘肽S-转移酶（glutathione S-transferase,GST）GSTA4、谷胱甘肽S-转移酶alpha 3（glutathione S-transferase alpha 3,GSTA3）和谷胱甘肽S-转移酶mu 1（glutathione S-transferase mu 1,GSTM1）,和2种尿苷二怜酸葡萄糖酸酸转移酶（uridine diphosphate glucuronyltransferase,UDPGT）UDPGT1-7C和UDPGT1-6,6种在SIRT3-K0周细胞中较WT周细胞中显着下调,包括3种含黄素单加氧酶（Flavin-containing monooxygenases,FMO）FM01、FM02、FM03。IPA?分析示这些差异蛋白通过分子功能或相互作用联系成功能相互作用网络。4.SIRT3敲除降低周细胞对抗肿瘤药物损伤的敏感性我们以抗肿瘤药物索拉非尼（0,2,4,6,8,10 nM）处理体外培养的WT、SIRT3-K0心脏周细胞48h,或以维罗非尼（0,100,200,300,400,500 nMol）处理体外培养的心脏周细胞72 h。CCK-8细胞活力测定结果示,索拉非尼和维罗非尼均可浓度依赖性降低WT周细胞活力,而与WT细胞相比,SIRT3-K0细胞受索拉非尼和维罗非尼诱导的活力下降显着缓解,提示SIRT3敲除可降低周细胞对抗肿瘤药物索拉非尼和维罗非尼损伤的敏感性。5.SIRT3敲除上调周细胞GSTA4表达在3种SmT3-K0细胞中显着上调的GST中,GSTA4的上调具有最高的统计学显着性。我们进一步通过免疫印迹实验结果证实心脏周细胞SIRT3敲除可导致GSTA4蛋白水平显着上调。6.SIRT3敲除通过上调GSTA4降低周细胞对索拉非尼损伤的敏感性我们以索拉非尼和维罗非尼处理WT周细胞、SIRT3-K0周细胞和沉默GSTA4的SIRT3-K0周细胞,CCK-8检测细胞活力。结果提示,索拉非尼和维罗非尼诱导WT细胞活力显着下降;与WT细胞相比,SIRT3-K0细胞受到索拉非尼和维罗非尼诱导的活力下降显着缓解;与SIRT3-K0细胞相比,沉默GSTA4的SIRT3-K0细胞受到索拉非尼诱导的活力下降显着加剧,而受到维罗非尼诱导的活力下降与SIRT3-K0细胞无显着差异。这些结果提示SIRT3敲除通过上调GSTA4降低了周细胞对索拉非尼损伤的敏感性,而SIRT3降低周细胞对维罗非尼损伤的敏感性并非由GSTA4介导。结论1.小鼠心脏周细胞SIRT3敲除可显着影响蛋白质组CYP450相关药物代谢通路;2.小鼠心脏周细胞SIRT3敲除可降低细胞对抗肿瘤化疗药物索拉非尼、维罗非尼损伤的敏感性;3.小鼠心脏周细胞SIRT3敲除可上调GSTA4蛋白水平;4.小鼠心脏周细胞SIRT3敲除通过上调GSTA4降低细胞对索拉非尼损伤敏感性,而SIRT3敲除降低细胞对维罗非尼损伤敏感性的作用非GSTA4介导。
余元元[9]（2020）在《十溴联苯醚降解菌群GY1结构分析及其优势菌Microbacterium Y2的降解机理研究》文中研究指明十溴联苯醚（BDE-209）是一种广泛使用的多溴联苯醚类阻燃剂,由于其具有长的半衰期,已在环境中被频繁检出。BDE-209具有生物积累性和生物毒性,严重威胁人类健康和生态安全,因此开发有效的方法从污染环境中消除BDE-209至关重要。本研究通过筛选获得新型微生物菌群GY1,分析了GY1对BDE-209降解性能、转化机制以及降解过程中群落变化。对GY1进一步分离获得微杆菌Y2,开展了其对BDE-209的降解性能、降解产物以及BDE-209胁迫下细胞生理响应及细胞膜特性变化研究,利用i TRAQ（isobaric tags for relative and absolute quantitation）和高通量测序技术分析了微杆菌Y2在BDE-209胁迫下的差异蛋白以及水-沉积物修复过程中微杆菌Y2和土着微生物之间的相互作用关系。主要研究结果如下:测序结果表明Hyphomicrobium、Pseudomonas、Aminobacter、Chryseobacterium、Bacillus、Pseudaminobacter、Stenotrophomonas、Sphingobacterium和Microbacterium是GY1中主要菌属。功能预测结果表明富集过程中BDE-209降解效果的不断提升归功于与BDE-209转化相关的功能基因的高度表达。微生物菌群GY1能以BDE-209为碳源和能源进行生长。降解优化结果表明在温度为30℃,p H为7,投菌量为2 g/L条件下,GY1在7天内对1 mg/L的BDE-209降解率达到51.3%。GY1降解BDE-209主要依靠胞内酶的作用,此外,共检测到12种脱溴产物,包括BDE-208、BDE-207、BDE-206、BDE-205、BDE-190、BDE-181、BDE-155、BDE-154、BDE-99、BDE-47、BDE-17和BDE-7,表明GY1对BDE-209的有氧降解是一系列脱溴过程。毒性实验结果表明,经GY1处理后的体系毒性降低,证明GY1与BDE-209的反应是一个解毒过程。研究还发现在BDE-209胁迫下GY1细胞活力发生改变,胞内丙二醛（MDA）含量明显上升,低浓度的BDE-209（≤3 mg/L）促进了超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）的表达,但在高浓度BDE-209（>3 mg/L）胁迫下观察到SOD和CAT酶活性受到了明显的抑制。群落分析结果表明将GY1富集培养之后,优势菌种发生明显变化,部分菌种甚至完全丢失。Stenotrophomonas、Microbacterium和Sphingobacterium转变成其主要菌属,并在BDE-209降解过程中占有重要地位。通过传统划线分离法得到BDE-209降解菌Y2,系统发育树结果表明Y2为微杆菌。优化实验表明在温度为30℃、p H为7、接种量为2g/L、氮源为硫酸铵时,微杆菌对1 mg/L的BDE-209在5天内降解效果为57.6%,其中胞内酶在降解过程中占有主导地位。在BDE-209降解过程中共检测到11种脱溴产物,包括BDE-208、BDE-207、BDE-206、BDE-205、BDE-181、BDE-154、BDE-99、BDE-47、BDE-17、BDE-15和BDE-7。BDE-209胁迫下微杆菌Y2细胞膜通透性和疏水性发生改变,同时BDE-209诱导了过量活性氧簇（ROS）的产生,致使细胞发生脂质过氧化反应,细胞膜电位下降。抗氧化酶SOD和CAT酶被激活以抵消BDE-209引起的氧化应激。此外,BDE-209作用扰乱了微杆菌Y2细胞正常周期,并引起细胞启动凋亡程序以适应外界不利环境。蛋白组学分析结果表明,卤酸脱卤酶和谷胱甘肽S-转移酶是微杆菌Y2降解BDE-209的关键功能蛋白,此外ABC转运蛋白的表达可以促进BDE-209及其代谢产物的排出,从而降低污染物毒性并有助于BDE-209的降解。为抵抗BDE-209对菌体的损伤,SOD、CAT、热休克蛋白90、核糖核酸酶E、寡聚核糖核苷酸降解酶、30S核糖体蛋白、50S核糖体蛋白以及多药耐药蛋白等在降解过程中均呈现明显上调。BDE-209通过诱导丙酮酸脱氢酶E1组分β亚基和二氢硫辛酰胺脱氢酶的上调加快丙酮酸复合酶的合成来支持葡萄糖代谢、脂肪酸代谢以及TCA循环。丙氨酸脱氢酶可逆催化丙氨酸氧化脱氨形成丙酮酸,并通过TCA循环为细胞提供能量。预苯酸脱水酶的上调有利于L-苯丙氨酸相关蛋白质的合成从而影响微杆菌Y2的细胞活性。此外,谷氨酸脱氢酶、异亮氨酰-t RNA合成酶和缬氨酰-t RNA合成酶的表达量在BDE-209降解过程中显着下调,这表明微杆菌Y2细胞内蛋白质的合成在一定程度上受到了抑制。毒性评估实验表明微杆菌Y2降解BDE-209的过程是一个解毒的过程,这有利于BDE-209污染环境的微生物修复。与对照组相比,加入微杆菌Y2的水-沉积物样品中BDE-209的降解率明显提高,并在7周后降解率达到40.0%。高通量测序结果表明微杆菌Y2能够在水-沉积物修复体系中定殖并稳定生长,此外Luteimonas、Methylovorus、Hyphomicrobium、Methylobacillus和Ramlibacter也可能参与了水-沉积物中BDE-209的降解。功能预测结果分析发现细胞色素P450还原酶、儿茶酚2,3-双加氧酶、2-卤代酸脱卤酶以及谷胱甘肽S-转移酶的过量表达可能与水-沉积物中BDE-209的降解相关。这一结果说明水-沉积物中BDE-209的降解可能不仅与引入的微杆菌Y2的活性有关,而且还可能与引入的细菌所刺激的土着微生物种群功能的改变有关。
高照[10]（2020）在《欧前胡素对APAP诱导急性肝损伤的保护作用机制及其脂质体制备的研究》文中提出目的:药物不良反应（ADR）是临床上导致疾病和诱发死亡的重要原因。据世界卫生组织公布的数据,药物性肝损伤（DILI）作为最严重的药物不良反应之一,已经成为全球第五大死亡因素。对乙酰氨基酚（APAP）是使用最广泛的非处方止痛和解热药之一,过量或长期服用可导致肝毒性,严重者甚至诱发急性肝功能衰竭。目前研究揭示APAP肝毒性主要与体内亲电反应性代谢中间体的形成,及诱发的氧化应激和线粒体功能损伤有关,但机理尚未完全明确,对其诱导的急性肝损伤临床尚无特效药物,主要为NAC等抗氧化剂对症治疗。欧前胡素（Imperatorin,IMP）是白芷中主要的6,7-呋喃香豆素类天然活性提取物,研究揭示其具有良好的抗氧化应激、抗炎症、抗癌、神经保护及调节糖脂代谢和护肝等生物活性作用,但对于APAP引起的急性肝损伤的保护作用尚不清楚。本研究从肝组织病理损伤和氧化应激以及线粒体功能及凋亡和炎症反应等方面对欧前胡素的肝保护作用进行药效学评价和验证,并基于肝脏代谢调节关键药物靶点FXR核受体,对IMP肝保护作用分子机制进行研究并探索建立IMP长循环脂质体以改善药物生物利用度。方法:1.IMP对APAP诱导C57BL/6小鼠及原代肝细胞的肝损伤保护作用SPF级雄性C57BL/6小鼠随机分为5组（n=6）,即正常对照组、肝损伤模型组、IMP低剂量给药组（50 mg/kg/d）、IMP高剂量给药组（100 mg/kg/d）、OCA阳性激动剂给药组（10 mg/kg/d）。正常对照组给予等体积溶媒（0.5%CMC-Na）,其余各组连续灌胃给药5d,末次给药后过夜禁食12h。模型组及各剂量组小鼠腹腔注射APAP（300 mg/kg）,对照组给予等量生理盐水。APAP暴露10h后,取小鼠血清及肝组织进行肝损伤血清生化指标及组织病理学分析,以TUNEL法原位检测肝细胞凋亡,并通过小鼠生存率实验评价IMP对APAP诱导肝损伤的保护作用。通过分离C57BL/6小鼠原代肝细胞体外培养,构建肝细胞损伤及IMP预给药保护体外模型。IMP给药组分别给予浓度为10 μM、20 μM IMP预处理24h后,IMP给药组及损伤模型组分别加入10 mM APAP,空白对照组加入等体积DMSO溶媒,诱导24h后收获细胞进行相关指标研究。选择氧化应激损伤、炎症反应及细胞凋亡相关因子,以Western blot法检测小鼠肝组织中JNK磷酸化水平和和Nrf2、Bcl2、Bax表达;以试剂盒测定小鼠血清GSH/GSSG 比率以及MDA水平;以ELISA法测定小鼠血清TNF-α、IL-1 β、IL-6水平;同时以qRT-PCR法分析小鼠肝组织及各组原代肝细胞TNF-α、IL-1 β、IL-6、IL-10、COX2 mRNA转录水平;LC-MS/MS测定小鼠肝组织中花生四烯酸代谢物类炎症介质前列腺素E2（PGE2）、白三烯B4（LTB4）、血栓素B2（TXB2）及20-羟-二十烷四烯酸（20-HETE）水平;以CCK-8法检测原代肝细胞损伤模型的细胞存活率;并结合流式细胞术及荧光染色法检测原代肝细胞ROS水平,JC-1膜电位荧光探针检测原代肝细胞线粒体跨膜电位（ΔΨm）;同时以qRT-PCR法分析原代肝细胞损伤模型实验各组炎症因子及Bcl2/Bax mRNA相对转录水平;对上述结果进行对比分析,阐述作用机制。对各组大鼠肝组织进行转录组测序分析,筛选差异表达基因,并通过KEGG通路注释及富集数据库对其进行功能注释及富集性分析,筛选出显着差异表达基因FXR;结合Western blot、qRT-PCR实验结果,双荧光素酶报告基因以及分子对接实验分析,验证IMP对于FXR核受体的作用。2、FXR（Nr1h4）敲除小鼠及原代肝细胞验证IMP保护APAP诱导肝损伤分子作用机制FXR基因敲除(FXR-/-雄性小鼠,随机分为4组（n=6）,即正常对照组、肝损伤模型组、IMP给药组（100 mg/kg/d）和OCA阳性激动剂给药组（10 mg/kg/d）。正常对照组给予等体积溶媒灌胃,其余各组连续灌胃给药5d,末次给药并禁食12h后,模型组及各剂量组腹腔注射APAP（300 mg/kg）,对照组给予等容量的生理盐水。APAP暴露10h后取小鼠血清及肝组织,进行肝损伤血清生化指标及组织病理学分析和TUNEL法原位检测肝细胞凋亡。通过分离FXR-/-小鼠原代肝细胞体外培养,构建FXR-/-肝细胞损伤及IMP/OCA阳性激动剂预给药保护体外模型。IMP/OCA给药组分别给予浓度为20 μM IMP、10μM OCA预处理24h后,各给药组及损伤模型组分别加入10mM APAP,空白对照组加入等体积DMSO溶媒,诱导24h后收获细胞,进一步对FXR肝保护相关作用机制进行分析。通过小动物活体荧光成像系统（BFI）测定IMP给药预处理FXR+/+/FXR-/-小鼠肝组织ROS水平。以Western blot法检测FXR-/-小鼠肝组织中抗氧化和凋亡相关因子Nrf2、Bcl2、Bax表达;以试剂盒测定小鼠血清GSH/GSSG比率以及MDA水平;以ELISA法测定小鼠血清TNF-α、IL-1 β、IL-6水平;并通过qRT-PCR法检测 FXR-/-肝组织中 TNF-α、IL-1 β、IL-6、COX2 mRNA 的 mRNA 转录水平,LC-MS/MS测定FXR-/-小鼠肝组织中花生四烯酸代谢物类炎症介质PGE2、LTB4、TXB2、20-HETE水平。CCK-8法测定FXR-/-原代肝细胞存活率;通过流式细胞术及荧光染色法检测胞内ROS水平,JC-1膜电位荧光探针检测肝细胞线粒体跨膜电位（Δ Ψm）;以qRT-PCR法分析原代肝细胞损伤模型炎症因子及Bcl2/Bax mRNA相对转录水平;比较各组间差异并进一步验证IMP肝保护作用通路。3、IMP长循环脂质体的构建及动物体内药代动力学特征研究以蛋黄卵磷脂（EPC）作和胆固醇作为膜材,以DSPE-PEG2000为表面活性修饰剂,IMP为底物,探索通过薄膜分散法制备IMP长循环脂质体,并利用马尔文激光纳米散射仪表征和验证。通过对IMP电喷雾离子源（ESI）质谱碎裂特征的分析研究,建立高专属性和灵敏度的液相色谱质谱方法,对SD大鼠尾静脉注射IMP长循环脂质体及游离IMP药代动力学特征参数进行研究,并结合体外释放实验和体外红细胞溶血实验,对脂质体递药系统生物利用度、代谢稳定性及安全性等进行研究。结果:1.IMP给药预处理对APAP诱导C57BL/6小鼠及原代肝细胞肝损伤的保护作用动物水平实验结果表明,与APAP损伤模型组相比,IMP高、低剂量给药预处理可以显着提高小鼠存活率（P<0.05）;同时IMP高剂量给药预处理组小鼠血清ALT和AST水平较模型组显着降低（P<0.05）,小鼠肝组织病理坏死面积较损伤模型组明显减小（P<0.01）;显示IMP可以对于APAP诱导C57BL/6小鼠肝组织损伤具有明显保护作用。2.IMP给药预处理改善APAP诱导C57BL/6小鼠肝损伤所致的氧化应激IMP高剂量给药预处理组显着提高小鼠血清GSH/GSSG水平（P<0.05）,同时降低血清MDA含量（P<0.01）;小鼠肝组织及体外原代肝细胞高剂量给药预处理组SOD2及Nrf2 mRNA转录水平明显上调（P<0.05）,Western blot结果表明IMP给药预处理组小鼠肝组织中Nrf2表达明显增强;同时荧光显微镜及流式细胞仪检测结果显示,相较于损伤模型组,IMP高剂量给药预处理组原代肝细胞内ROS水平均较模型组明显降低（P<0.05）,同时细胞线粒体膜通透性改变所致跨膜电位（Δ Ψm）的耗散明显改善;显示IMP可以显着抑制APAP诱导氧化应激所导致的肝细胞抗氧化防御系统失衡及线粒体功能紊乱。3.IMP给药预处理抑制APAP诱导C57BL/6小鼠肝损伤所致的肝细胞凋亡Western blot结果显示与APAP损伤模型组相比,IMP给药预处理小鼠肝组织JNK磷酸化表达水平降低,Bcl2/Bax蛋白相对表达水平显着高于模型组（P<0.05）;IMP高、低剂量预处理组TUNEL荧光染色标记凋亡细胞减小。体外原代肝细胞实验结果显示,IMP预处理组肝细胞存活率明显高于模型组（P<0.01）、线粒体跨膜电位（ΔΨm）升高,Bcl2/Bax mRNA相对转录水平显着高于模型组（P<0.05）,显示IMP可抑制APAP引起的肝细胞线粒体途径凋亡。4.IMP给药预处理能够抑制APAP诱导肝损伤有关炎症因子的表达IMP高剂量给药预处理组小鼠血清中TNF-α、IL-1 β、IL-6水平及肝组织和原代肝细胞中TNF-α、IL-1 β、IL-6、COX-2 mRNA转录水平明显低于模型组（P<0.05）;同时 LC-MS/MS 测定小鼠肝组织中 PGE2、LTB4、TXB2 和 20-HETE 表达相比于模型组明显降低（P<0.05）,结果提示IMP给药预处理可以抑制APAP诱导肝损伤所致的炎症反应。体内外实验结果提示,过量APAP诱发小鼠严重的肝损伤并伴随明显的氧化应激、线粒体功能损伤及肝细胞凋亡和炎症反应。而IMP预处理可以有效保护APAP引起的肝损伤,作用机制与改善氧化应激损伤所致的ROS-JNK激活和线粒体功能损伤及抑制肝细胞凋亡和炎症反应相关。5.FXR（Nr1h4）-/-敲除小鼠及基因敲除FXR-/-肝细胞验证IMP保护APAP肝损伤的分子作用机制FXR基因敲除后,IMP及OCA阳性激动剂预处理组小鼠血清ALT及AST水平、GSH/GSSG比率、MDA水平,肝组织Tunel标记阳性凋亡细胞,肝组织病理坏死面积均与模型组无明显差异（P>0.05）;同时FXR-/-小鼠肝组织Nrf2及Bcl2/Bax蛋白相对表达水平及肝组织SOD2及Nrf2 mRNA转录水平抑制无明显改善（P>0.05）;小动物活体成像肝组织ROS结果显示FXR敲除后,IMP给药预处理失去对小鼠肝脏ROS升高的抑制作用;FXR-/-小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平及肝组织和原代肝细胞中TNF-α、IL-1 β、IL-6、COX-2 mRNA转录水平,肝组织中花生四烯酸代谢物类炎症介质表达水平与损伤模型组相比无显着变化（P>0.05）。IMP/OCA给药预处理对于FXR-/-原代肝细胞存活率、细胞内ROS水平、线粒体跨膜电位（Δ Ψm）及SOD2和Nrf2 mRNA转录水平,与模型组相比无明显改善（p>0.05）。上述结果均表明IMP通过FXR通路激活依赖性地发挥肝保护作用。6.欧前胡素长循环脂质体表征和药代动力学实验结果欧前胡素脂质体平均粒径为:125.30±0.95 nm,Zeta电位为:-24.64±0.67 mv;聚合物分散性指数（PDI）为:0.25±0.04;包封率（EE,%）为:6.27±0.77;装载效率（LE,%）为:41.06±5.41。表明欧前胡素脂质体粒径较小且分布均匀（PDI<0.30）,包封率及装载率符合脂质体载药要求。大鼠药代动力学结果显示,相较欧前胡素游离药物,欧前胡素长循环脂质体药时曲线下面积（AUC）、一阶矩曲线下面积（AUMC）、体内循环时间及血浆药物峰值浓度(Cmax均显着提升（P<0.01）,血浆总清除率(CLz显着降低（P<0.01）。同时药物体内平均滞留时间（MRT）及末端消除半衰期t1/2z也有所增加,显示出欧前胡素长循环脂质体较好的生物利用度和药效作用时间。体外释放实验证实欧前胡素长循环脂质体较好的药物缓释作用,红细胞体外溶血实验结果表明脂质体未发生溶血现象。结果提示:欧前胡素脂质体有较好的体内代谢稳定性及缓释作用且具有初步的制剂安全性。结论:1.IMP对APAP诱导急性肝损伤具有预防性保护作用。2.IMP损伤保护机制与抗氧化应激反应、抗细胞凋亡及抑制炎症相关因子表达有关。3.IMP通过FXR核受体激活依赖性地发挥对APAP诱导肝损伤的保护作用。4.欧前胡素长循环脂质体（IMP-PEG-LPs）可以有效提高欧前胡素在大鼠体内生物利用度和延长药物体内作用时间。
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本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
| 摘要 |
| SUMMARY |
| 前言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 二斑叶螨概况 |
| 1.1.1 二斑叶螨生物学特性 |
| 1.1.2 二斑叶螨的发生与危害 |
| 1.2 二斑叶螨防治 |
| 1.2.1 农业防治 |
| 1.2.2 化学防治 |
| 1.2.3 生物防治 |
| 1.3 昆虫或螨的耐药性机制 |
| 1.3.1 羧酸酯酶(Car E) |
| 1.3.2 多功能氧化酶(MFO) |
| 1.3.3 谷胱甘肽S-转移酶(GST) |
| 1.4 高温对昆虫或螨生物学特性的影响 |
| 1.4.1 高温对昆虫和螨存活及生长发育的影响 |
| 1.4.2 高温对昆虫和螨繁殖的影响 |
| 1.5 高温对昆虫和螨解毒酶系的影响 |
| 1.6 高温对昆虫和螨耐药性的影响 |
| 1.7 联苯肼酯简介 |
| 第二章 高温胁迫对二斑叶螨生物学特性的影响 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 供试螨源 |
| 2.1.2 供试仪器 |
| 2.1.3 饲养台制作 |
| 2.1.4 高温胁迫处理 |
| 2.1.5 高温胁迫卵对其孵化及后续发育的影响 |
| 2.1.6 高温胁迫幼螨对其存活及后续发育的影响 |
| 2.1.7 高温胁迫雌成螨对其存活及繁殖的影响 |
| 2.2 数据处理 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 高温胁迫对二斑叶螨卵孵化率的影响 |
| 2.3.2 高温胁迫二斑叶螨卵对其后续发育的影响 |
| 2.3.3 高温胁迫二斑叶螨幼螨对其存活率的影响 |
| 2.3.4 高温胁迫二斑叶螨幼螨对其后续发育的影响 |
| 2.3.5 高温胁迫二斑叶螨雌成螨对其存活的影响 |
| 2.3.6 高温胁迫二斑叶螨雌成螨对其生殖的影响 |
| 2.4 小结与讨论 |
| 第三章 高温胁迫对二斑叶螨解毒酶系的影响 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 供试螨源 |
| 3.1.2 供试药剂 |
| 3.1.3 供试仪器 |
| 3.1.4 试验方法 |
| 3.1.4.1 高温胁迫处理 |
| 3.1.4.2 牛血清蛋白标准曲线制作 |
| 3.1.4.3 酶源蛋白制备及含量测定 |
| 3.1.4.4 羧酸酯酶(Car E)比活力测定 |
| 3.1.4.5 多功能氧化酶(MFO)比活力测定 |
| 3.1.4.6 谷胱甘肽S-转移酶(GST)比活力测定 |
| 3.1.4.7 酶动力学常数测定 |
| 3.2 数据处理 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 牛血清蛋白标准曲线 |
| 3.3.2 α-萘酚标准曲线 |
| 3.3.3 对硝基苯酚曲线 |
| 3.3.4 高温胁迫对二斑叶螨体内三种解毒酶比活力的影响 |
| 3.3.4.1 高温胁迫对羧酸酯酶(Car E)比活力的影响 |
| 3.3.4.2 高温胁迫对多功能氧化酶(MFO)比活力的影响 |
| 3.3.4.3 高温胁迫对谷胱甘肽S-转移酶(GST)比活力的影响 |
| 3.3.5 高温胁迫对二斑叶螨体内三种解毒酶动力学常数的影响 |
| 3.3.5.1 高温胁迫对解毒酶米氏常数(K_m)的影响 |
| 3.3.5.2 高温胁迫对解毒酶最大反应速率(V_(max))的影响 |
| 3.4 小结与讨论 |
| 第四章 高温胁迫对二斑叶螨耐药性的影响 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试验材料 |
| 4.1.2 试验方法 |
| 4.1.2.1 联苯肼酯对二斑叶螨的毒力测定 |
| 4.1.2.1.1 联苯肼酯对幼螨的毒力测定 |
| 4.1.2.1.2 联苯肼酯对雌成螨的毒力测定 |
| 4.1.2.2 高温胁迫对二斑叶螨耐药性的影响 |
| 4.1.2.2.1 高温胁迫二斑叶螨幼螨对联苯肼酯耐性的影响 |
| 4.1.2.2.2 高温胁迫二斑叶螨雌成螨对联苯肼酯耐性的影响 |
| 4.2 数据处理 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 联苯肼酯对二斑叶螨的毒力测定 |
| 4.3.2 高温胁迫对二斑叶螨幼螨耐药性的影响 |
| 4.3.3 高温胁迫对二斑叶螨雌成螨耐药性的影响 |
| 4.4 小结与讨论 |
| 第五章 主要结论、创新点及研究展望 |
| 5.1 主要结论 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 研究展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 在读期间发表论文 |
| 导师简介 |
| 摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 1 综述 |
| 1.1 毒死蜱 |
| 1.1.1 毒死蜱理化性质 |
| 1.1.2 毒死蜱毒理学研究 |
| 1.1.3 毒死蜱的降解残留 |
| 1.1.4 毒死蜱降解菌 |
| 1.2 植物内生菌 |
| 1.2.1 植物内生菌的起源 |
| 1.2.2 植物内生菌的分布 |
| 1.2.3 植物内生菌的作用 |
| 1.2.3.1 溶磷解钾作用 |
| 1.2.3.2 固氮作用 |
| 1.2.3.3 产铁载体作用 |
| 1.2.3.4 产植物激素作用 |
| 1.2.3.5 抗逆作用 |
| 1.2.3.6 促宿主产生次生代谢产物 |
| 1.3 内生菌在修复环境污染物领域中的应用 |
| 1.3.1 内生菌在修复重金属污染领域的应用 |
| 1.3.1.1 内生菌促进植物生长 |
| 1.3.1.2 内生菌增强宿主植物重金属抗性 |
| 1.3.2.3 内生菌参与重金属脱毒 |
| 1.3.2 内生菌在修复有机物污染领域的应用 |
| 1.3.2.1 内生菌促植物生长,增强植物代谢能力 |
| 1.3.2.2 内生菌在植物体内的共代谢 |
| 1.3.2.3 内生菌直接降解有机污染物 |
| 1.4 研究内容及创新点 |
| 1.4.1 研究内容 |
| 1.4.2 意义与创新点 |
| 2 毒死蜱降解内生菌的筛选与鉴定 |
| 2.1 实验材料与仪器 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 内生菌的筛选 |
| 2.2.1.1 毒死蜱处理水稻以及样品采集 |
| 2.2.1.2 样品表面消毒 |
| 2.2.1.3 内生菌的筛选、纯化 |
| 2.2.2 内生菌的鉴定 |
| 2.2.3 无机盐培养基中毒死蜱分析方法建立 |
| 2.2.3.1 仪器检测方法 |
| 2.2.3.2 标准曲线的建立 |
| 2.2.3.3 毒死蜱在无机盐培养基中加标回收实验 |
| 2.2.4 内生菌对毒死蜱的体外降解特性 |
| 2.2.5 内生菌对毒死蜱的体外降解条件优化 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 毒死蜱降解内生菌的筛选与鉴定 |
| 2.3.2 无机盐中毒死蜱提取方法 |
| 2.3.2.1 标准曲线的建立 |
| 2.3.2.2 加标回收实验 |
| 2.3.3 毒死蜱降解菌体外降解特性 |
| 2.3.4 毒死蜱降解菌体外降解条件优化 |
| 2.3.4.1 菌株DJ-1响应面实验设计及结果 |
| 2.3.4.2 菌株DJ-2响应面实验设计及结果 |
| 2.3.4.3 菌株DJ-3响应面实验设计及结果 |
| 2.3.4.4 毒死蜱体外降解条件优化结果及检验 |
| 2.4 小结 |
| 3 内生菌定殖对水稻降解毒死蜱的影响 |
| 3.1 材料与仪器 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 绿色荧光蛋白标记内生菌 |
| 3.2.2 内生菌定殖水稻 |
| 3.2.2.1 水稻植株的培养 |
| 3.2.2.2 内生菌定殖水稻能力验证 |
| 3.2.2.3 内生菌在水稻中的定殖动态 |
| 3.2.3 水稻中毒死蜱检测方法的建立 |
| 3.2.3.1 仪器检测方法 |
| 3.2.3.2 水稻中毒死蜱提取方法 |
| 3.2.3.3 标准曲线的建立 |
| 3.2.3.4 毒死蜱在水稻中组织中的加标回收实验 |
| 3.2.4 内生菌定殖对毒死蜱胁迫下水稻鲜重的影响 |
| 3.2.5 内生菌定殖对水稻中毒死蜱降解的影响 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 绿色荧光蛋白标记内生菌 |
| 3.3.2 内生菌定殖水稻 |
| 3.3.2.1 转绿色荧光蛋白内生菌在水稻中的分布 |
| 3.3.2.2 内生菌在水稻中的定殖动态 |
| 3.3.3 内生菌定殖对毒死蜱胁迫水稻生物量的影响 |
| 3.3.4 毒死蜱在不同水稻组织中加标回收实验 |
| 3.3.5 内生菌定殖对水稻降解毒死蜱的影响 |
| 3.4 小结 |
| 4 内生菌协助水稻抵抗毒死蜱药害的机制解析 |
| 4.1 材料与仪器 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 培养基与试剂 |
| 4.1.3 仪器 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 内生菌促生能力 |
| 4.2.1.1 产生IAA的能力 |
| 4.2.1.2 溶磷性 |
| 4.2.1.3 产铁载体的能力 |
| 4.2.1.4 ACC脱氨酶活性 |
| 4.2.2 内生菌定殖对水稻解毒酶的影响 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 内生菌促生能力 |
| 4.3.1.1 内生菌产生IAA能力 |
| 4.3.1.2 内生菌的溶磷性 |
| 4.3.1.3 内生菌产生铁载体的能力 |
| 4.3.1.4 内生菌ACC脱氨酶的活性 |
| 4.3.2 内生菌定殖对水稻解毒酶的影响 |
| 4.3.2.1 内生菌定殖对水稻细胞色素P450含量的影响 |
| 4.3.2.2 内生菌定殖对水稻谷胱甘肽-S-转移酶活力的影响 |
| 4.3.2.3 内生菌定殖对水稻羧酸脂酶活力的影响 |
| 4.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 小菜蛾的危害及分布 |
| 1.2 小菜蛾的抗药性 |
| 1.2.1 小菜蛾的田间抗药性 |
| 1.2.2 昆虫抗药性机理 |
| 1.3 昆虫解毒酶 |
| 1.3.1 谷胱甘肽-S-转移酶 |
| 1.3.2 羧酸酯酶 |
| 1.3.3 细胞色素P450酶 |
| 1.4 斑蝥素、吡唑和嘧啶类及拟除虫菊酯类杀虫剂 |
| 1.4.1 斑蝥素 |
| 1.4.2 吡唑和嘧啶类杀虫杀螨剂 |
| 1.4.3 拟除虫菊酯类杀虫剂 |
| 1.5 昆虫解毒酶对杀虫剂的解毒代谢 |
| 1.6 研究的目的和意义 |
| 第二章 小菜蛾解毒酶系对斑蝥素的解毒代谢 |
| 2.1 材料与仪器 |
| 2.1.1 供试昆虫 |
| 2.1.2 试剂与材料 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 斑蝥素对小菜蛾的生物测定 |
| 2.2.2 亚致死剂量斑蝥素对小菜蛾的处理 |
| 2.2.3 斑蝥素处理后PSPs酶活性检测 |
| 2.2.4 斑蝥素处理后解毒酶系活性测定 |
| 2.2.5 统计分析方法 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 斑蝥素对小菜蛾的胃毒活性 |
| 2.3.2 斑蝥素对小菜蛾的PSPs活性的影响 |
| 2.3.3 斑蝥素处理后小菜蛾解毒酶系活性的变化 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 小菜蛾PxGSTs对唑虫酰胺的解毒代谢作用 |
| 3.1 材料与仪器 |
| 3.1.1 供试昆虫 |
| 3.1.2 试剂和材料 |
| 3.1.3 缓冲液配制 |
| 3.1.4 实验仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 唑虫酰胺对小菜蛾的生物测定 |
| 3.2.2 唑虫酰胺对小菜蛾的处理 |
| 3.2.3 小菜蛾的RNA提取 |
| 3.2.4 用于实时定量PCR的 c DNA模板制作 |
| 3.2.5 实时定量PCR检测 |
| 3.2.6 PxGSTs基因合成和表达菌株构建 |
| 3.2.7 PxGSTs蛋白表达及纯化 |
| 3.2.8 PxGSTs重组蛋白酶动力学检测 |
| 3.2.9 杀虫剂对PxGSTs重组蛋白抑制检测 |
| 3.2.10 PxGSTs对唑虫酰胺的代谢效率测定 |
| 3.2.11 唑虫酰胺和PxGSTσ的结合模式分析 |
| 3.2.12 结合自由能运算 |
| 3.2.13 PxGSTσ基因定点突变与蛋白表达 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 唑虫酰胺对小菜蛾的胃毒作用 |
| 3.3.2 唑虫酰胺处理后小菜蛾PxGSTs转录水平变化 |
| 3.3.3 PxGSTs重组蛋白的表达和动力学分析 |
| 3.3.4 杀虫剂在体外对PxGSTs重组蛋白的抑制作用 |
| 3.3.5 PxGSTs重组蛋白对唑虫酰胺的代谢效率测定 |
| 3.3.6 PxGSTσ与唑虫酰胺结合模式分析 |
| 3.3.7 PxGSTσ定点突变和代谢效率测定 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 小菜蛾PxGSTs与其抑制剂GTX的相互作用 |
| 4.1 材料与仪器 |
| 4.1.1 试剂和材料 |
| 4.1.2 缓冲液配制 |
| 4.1.3 实验仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 3种PxGSTs的基因合成、蛋白表达与纯化 |
| 4.2.2 PxGSTs重组蛋白酶动力学检测 |
| 4.2.3 GTX对 PxGSTs重组蛋白的抑制作用 |
| 4.2.4 PxGSTσ蛋白三维结构的同源模建和PxGSTσ-GTX复合物结构 |
| 4.2.5 分子动力学(MD)模拟 |
| 4.2.6 结合自由能计算 |
| 4.2.7 结合自由能单残基能量分解 |
| 4.2.8 丙氨酸扫描计算 |
| 4.2.9 PxGSTσ基因定点突变、蛋白表达和抑制检测 |
| 4.2.10 统计分析方法 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 GTX对 PxGSTs的抑制作用 |
| 4.3.2 PxGSTσ三维结构模型的构建 |
| 4.3.3 PxGSTσ-GTX复合物的分子动力学分析 |
| 4.3.4 PxGSTσ-GTX复合物结合模式分析。 |
| 4.3.5 结合自由能计算 |
| 4.3.6 氨基酸残基的自由能分解 |
| 4.3.7 基于CAS的定点突变 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 小菜蛾羧酸酯酶PxEst-6 对拟除虫菊酯的代谢机理 |
| 5.1 材料与仪器 |
| 5.1.1 供试昆虫 |
| 5.1.2 试剂和材料 |
| 5.1.3 缓冲液配制 |
| 5.1.4 实验仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 拟除虫菊酯对小菜蛾的胃毒测定 |
| 5.2.2 拟除虫菊酯类杀虫剂对小菜蛾的处理 |
| 5.2.3 实时定量PCR检测 |
| 5.2.4 PxEst-6 基因合成和定点突变 |
| 5.2.5 PxEst-6 的表达和纯化 |
| 5.2.6 PxEst-6 酶活力和酶抑制分析 |
| 5.2.7 PxEst-6 对拟除虫菊酯类杀虫剂的代谢效率分析 |
| 5.2.8 PxEst-6 三维结构模型的构建 |
| 5.2.9 分子对接模拟 |
| 5.2.10 分子动力学(MD)模拟 |
| 5.2.11 结合自由能计算 |
| 5.2.12 统计分析方法 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 4 种拟除虫菊酯对小菜蛾的毒杀作用 |
| 5.3.2 小菜蛾PxEst-6 的组织特异性表达 |
| 5.3.3 拟除虫菊酯处理后小菜蛾PxEst-6 转录水平变化 |
| 5.3.4 拟除虫菊酯对PxEst-6 的抑制活性以及PxEst-6 对拟除虫菊酯的代谢 |
| 5.3.5 4 种拟除虫菊酯与PxEst-6 的结合模式分析和分子动力学模拟 |
| 5.3.6 利用丙氨酸突变揭示4 种拟除虫菊酯代谢中的关键氨基酸 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 酶代谢及其产物与昆虫抗性 |
| 1.1.1 植物防御机制 |
| 1.1.2 昆虫解毒酶与不同植物次生物质的关系 |
| 1.2 谷胱甘肽S-转移酶与抗性 |
| 1.2.1 谷胱甘肽S-转移酶概述 |
| 1.2.2 昆虫谷胱甘肽S-转移酶的研究概况 |
| 1.3 羧酸酯酶与抗性 |
| 1.3.1 羧酸酯酶概述 |
| 1.3.2 昆虫羧酸酯酶的研究概况 |
| 1.4 小蠹类森林害虫 |
| 1.4.1 概述 |
| 1.4.2 寄主针叶树和小蠹虫之间的相互作用 |
| 1.5 研究目的意义 |
| 1.6 研究的主要内容 |
| 第二章 华山松大小蠹三大解毒酶活性差异与生长发育的关系 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 供试昆虫 |
| 2.1.2 主要试剂(盒)与仪器 |
| 2.1.3 昆虫体重测定和性别比例的统计 |
| 2.1.4 昆虫能量存储测量 |
| 2.1.5 昆虫解毒酶测定 |
| 2.1.6 统计分析 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 体重和性别比例 |
| 2.2.2 能量物质储备 |
| 2.2.3 解毒酶活性 |
| 2.3 小结 |
| 第三章 华山松大小蠹谷胱甘肽S-转移酶基因的克隆与表达 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 供试昆虫 |
| 3.1.2 主要试剂(盒)与仪器 |
| 3.1.3 华山松大小蠹GSTs基因的克隆 |
| 3.1.4 华山松大小蠹GSTs基因序列分析 |
| 3.1.5 华山松大小蠹GSTs基因表达谱分析 |
| 3.1.6 华山松大小蠹不同发育阶段GSTs基因表达水平 |
| 3.1.7 华山松大小蠹不同组织GSTs基因分布 |
| 3.1.8 取食寄主韧皮部对华山松大小蠹GSTs基因表达水平的诱导 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 华山松大小蠹GSTs基因序列分析 |
| 3.2.2 华山松大小蠹GSTs基因在不同发育时期的转录水平差异 |
| 3.2.3 华山松大小蠹GSTs基因在不同组织部位的分布与表达水平差异 |
| 3.2.4 取食寄主韧皮部对华山松大小蠹GSTs基因表达水平的影响 |
| 3.3 小结 |
| 第四章 华山松大小蠹羧酸酯酶基因的克隆与表达分析 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 供试昆虫 |
| 4.1.2 主要试剂(盒)与仪器 |
| 4.1.3 华山松大小蠹CarEs基因的克隆 |
| 4.1.4 华山松大小蠹CarEs基因序列分析 |
| 4.1.5 华山松大小蠹CarEs基因表达谱分析 |
| 4.1.6 华山松大小蠹不同发育阶段CarEs基因表达水平 |
| 4.1.7 华山松大小蠹CarEs基因对取食华山松韧皮部的响应 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 华山松大小蠹CarEs基因序列分析 |
| 4.2.2 华山松大小蠹CarEs基因在不同发育阶段的转录水平差异 |
| 4.2.3 取食与饥饿处理对华山松大小蠹成虫CarEs基因表达水平的影响 |
| 4.3 小结 |
| 第五章 华山松大小蠹三大解毒酶基因对萜类物质的表达响应 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.1.1 试供昆虫 |
| 5.1.2 主要试剂(盒)与仪器 |
| 5.1.3 韧皮部萜类化合物及松节油成分气相色谱-质谱联用分析 |
| 5.1.4 取食不同类型饲料对华山松大小蠹解毒酶基因表达水平的诱导 |
| 5.1.5 华山松大小蠹取食不同类型饲料后解毒酶基因表达谱分析 |
| 5.1.6 华山松大小蠹解毒酶基因对萜类物质的耐受性 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 韧皮部萜类化合物组成及松节油主要成分 |
| 5.2.2 华山松大小蠹取食不同类型饲料后解毒酶基因的表达水平 |
| 5.2.3 萜类物质熏蒸对不同发育时期解毒酶基因表达水平的影响 |
| 5.2.4 萜类物质熏蒸后不同组织部位GSTs基因的表达水平 |
| 5.3 小结 |
| 第六章 讨论与结论 |
| 6.1 讨论 |
| 6.1.1 不同世代和性别的解毒酶及能量物质参与昆虫的抗性生理 |
| 6.1.2 华山松大小蠹GSTs多样性及表达谱分析 |
| 6.1.3 华山松大小蠹CarEs多样性及表达谱分析 |
| 6.1.4 华山松大小蠹解毒酶基因对萜类物质的响应模式 |
| 6.2 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 概述 |
| 1.2 3-氯丙醇酯在食品中的分布 |
| 1.3 3-氯丙醇酯的形成机理 |
| 1.3.1 3-氯丙醇酯的有机合成方法 |
| 1.3.2 3-氯丙醇酯的分子形成机理 |
| 1.4 3-氯丙醇酯的检测方法 |
| 1.4.1 间接检测法 |
| 1.4.2 直接检测法 |
| 1.5 3-氯丙醇酯的毒性研究 |
| 1.5.1 3-氯丙醇酯的急性毒性研究 |
| 1.5.2 3-氯丙醇酯的亚急性毒性研究 |
| 1.5.3 3-氯丙醇酯的亚慢性毒性研究 |
| 1.5.4 3-氯丙醇酯的体外毒性研究 |
| 1.6 3-氯丙醇酯的代谢研究 |
| 1.7 3-氯丙醇酯的生物组学研究 |
| 1.7.1 3-氯丙醇酯的蛋白质组学研究 |
| 1.7.2 3-氯丙醇酯的代谢组学研究 |
| 1.8 论文研究意义与内容 |
| 1.8.1 研究意义 |
| 1.8.2 研究内容 |
| 第二章 3-氯丙醇酯的合成及结构鉴定 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与仪器 |
| 2.2.1 实验试剂 |
| 2.2.2 实验耗材与仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 3-氯丙醇酯的合成与纯化方法 |
| 2.3.2 液相串联飞行时间质谱检测方法 |
| 2.3.3 核磁共振检测方法 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 3-氯丙醇酯的合成与纯化方法比较 |
| 2.4.2 3-氯丙醇酯的结构鉴定 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 3-氯丙醇酯的亚慢性毒性作用研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与仪器 |
| 3.2.1 实验试剂 |
| 3.2.2 实验耗材与仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 动物实验 |
| 3.3.2 血液采集与血常规指标测定 |
| 3.3.3 组织切片及苏木精-伊红染色 |
| 3.3.4 统计分析 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 动物状态、体重及脏器重量 |
| 3.4.2 血常规指标分析 |
| 3.4.3 组织病理学 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 3-氯丙醇酯的肾脏毒性作用机制研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与仪器 |
| 4.2.1 实验试剂 |
| 4.2.2 实验耗材与仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 肾功能血清生化指标测定 |
| 4.3.2 蛋白质组学分析 |
| 4.3.3 蛋白免疫印迹分析 |
| 4.3.4 平行反应监测分析 |
| 4.3.5 细胞培养 |
| 4.3.6 细胞存活率测定 |
| 4.3.7 细胞转染 |
| 4.3.8 基因表达量测定 |
| 4.3.9 流式细胞仪分析 |
| 4.3.10 统计分析 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 肾功能血清生化指标 |
| 4.4.2 蛋白质组学分析 |
| 4.4.3 蛋白质组学结果验证 |
| 4.4.4 细胞存活率分析 |
| 4.4.5 细胞毒性机制分析 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 3-氯丙醇酯的睾丸毒性作用机制研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料与仪器 |
| 5.2.1 实验试剂 |
| 5.2.2 实验耗材与仪器 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 血清中炎症因子与睾酮含量测定 |
| 5.3.2 蛋白质组学分析 |
| 5.3.3 蛋白免疫印迹分析 |
| 5.3.4 平行反应监测分析 |
| 5.3.5 细胞培养 |
| 5.3.6 细胞存活率测定 |
| 5.3.7 细胞转染 |
| 5.3.8 基因表达量测定 |
| 5.3.9 流式细胞仪分析 |
| 5.3.10 统计分析 |
| 5.4 结果与讨论 |
| 5.4.1 血清中炎症因子与睾酮含量 |
| 5.4.2 蛋白质组学分析 |
| 5.4.3 蛋白质组学结果验证 |
| 5.4.4 细胞存活率分析 |
| 5.4.5 细胞毒性机制分析 |
| 5.5 本章小结 |
| 第六章 3-氯丙醇酯在体内的代谢组学研究 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 实验材料与仪器 |
| 6.2.1 实验试剂 |
| 6.2.2 实验耗材与仪器 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 样品采集 |
| 6.3.2 样品制备 |
| 6.3.3 液相串联飞行时间质谱检测方法 |
| 6.3.4 代谢组学分析 |
| 6.3.5 统计分析 |
| 6.4 结果与讨论 |
| 6.4.1 代谢组学分析 |
| 6.4.2 生物学标志物的鉴定 |
| 6.5 本章小结 |
| 第七章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 谢辞 |
| 博士在读期间科研成果 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 急性酒精肝损伤发病机制及治疗研究现状 |
| 参考文献 |
| 综述二 葛花、枳椇子化学成分和药理作用研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述三 酒精性肝损伤动物模型制备的研究进展 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第二部分 实验研究 |
| 实验一 葛花、枳椇子及其配伍对急性酒精性肝损伤小鼠肝脏保护作用的研究 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 实验二 葛花、枳椇子及其配伍对急性酒精性肝损伤小鼠乙醇浓度及乙醇脱氢酶活性的研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 实验三 葛花、枳椇子及其配伍对急性酒精性肝损伤小鼠肝脏抗氧化作用的研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 实验四 葛花、枳椇子及其配伍对急性酒精性肝损伤小鼠肝脏组织病理形态的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 实验五 葛花、枳椇子及其配伍对急性酒精性肝损伤小鼠肝脏Keap1和Nrf2基因及蛋白表达的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 实验六葛花、枳椇子及其配伍对急性酒精性肝损伤小鼠肝脏AQP9基因及蛋白表达的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 展望 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 在学期间主要研究成果 |
| 个人简历 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩写词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1 褪黑素概述 |
| 2 植物中褪黑素的生物合成途径 |
| 3 非生物逆境胁迫对植物褪黑素的含量的影响 |
| 4 植物中褪黑素富集与信号传导的关系 |
| 5 植物中褪黑素合成关键酶基因表达 |
| 6 芸薹属植物非生物胁迫下组学研究 |
| 7 本研究目的意义及研究内容 |
| 7.1 本研究目的意义 |
| 7.2 主要研究内容 |
| 第二章 褪黑素富集技术及热激、MeJA及ABA对芥菜芽苗生理代谢的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要实验仪器设备 |
| 1.4 试验方法 |
| 1.5 测定指标与方法 |
| 1.6 数据处理与统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 不同处理对芥菜芽苗形态及褪黑素的影响 |
| 2.2 热激、MeJA及ABA处理对芥菜芽苗生理生化的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 第三章 热激、MeJA及ABA处理下芥菜芽苗褪黑素合成关键酶的基因表达研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 1.4 试验方法 |
| 1.5 数据处理与统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 褪黑素合成关键酶序列 |
| 2.2 褪黑素合成关键酶基因表达变化 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 第四章 热激、MeJA及ABA处理下芥菜芽苗蛋白组差异表达研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 1.4 试验方法 |
| 1.5 指标测定方法 |
| 1.6 数据处理与统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 芥菜芽苗中差异蛋白统计 |
| 2.2 芥菜芽苗中差异蛋白层次聚类分析 |
| 2.3 芥菜芽苗中差异蛋白富集分析 |
| 2.4 芥菜芽苗中差异蛋白KEGG通路分析 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 全文总结 |
| 攻读学位期间研究成果 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 第一部分: SIRT3在舒尼替尼诱发小鼠左室功能减退中的作用及其机制 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 创新性 |
| 局限性 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第二部分: SIRT3对小鼠心脏周细胞CYP450相关药物代谢通路的作用及机制研究 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 创新性 |
| 局限性 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间科研情况 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 英文论文Ⅰ |
| 英文论文Ⅱ |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 十溴联苯醚污染特性及其污染现状 |
| 1.1.1 十溴联苯醚概述 |
| 1.1.2 BDE-209特性及其污染现状 |
| 1.2 BDE-209降解消除技术的研究 |
| 1.2.1纳米零价铁降解BDE-209 |
| 1.2.2光降解BDE-209 |
| 1.2.3植物去除BDE-209 |
| 1.2.4微生物降解BDE-209 |
| 1.3 蛋白组学技术在环境生态领域的应用 |
| 1.4 生物强化修复及微生物群落研究 |
| 1.5 本论文的研究工作 |
| 1.5.1 研究目的和意义 |
| 1.5.2 研究内容 |
| 1.5.3 技术路线 |
| 第二章 BDE-209降解微生物菌群筛选及降解性能研究 |
| 2.1 材料与设备 |
| 2.1.1 实验药品 |
| 2.1.2 主要实验试剂的配制 |
| 2.1.3 实验设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 降解菌群的筛选与培养 |
| 2.2.2 筛选过程中微生物菌群降解能力测定 |
| 2.2.3 高通量测序 |
| 2.2.4 降解特性研究 |
| 2.2.5 实际水体修复 |
| 2.2.6 BDE-209含量测定 |
| 2.2.7 数据分析 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 微生物菌群筛选过程中菌群降解能力测定 |
| 2.3.2 微生物菌群筛选过程中群落变化 |
| 2.3.3 微生物菌群功能基因预测 |
| 2.3.4 接种量对微生物菌群降解BDE-209的影响 |
| 2.3.5 实际水体中BDE-209的降解 |
| 2.3.6 温度和pH对微生物菌群降解BDE-209的影响 |
| 2.3.7 BDE-209 初始浓度对微生物菌群降解BDE-209 的影响 |
| 2.3.8 BDE-209降解率随时间的变化 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 微生物菌群GY1对BDE-209的降解机理研究 |
| 3.1 材料与设备 |
| 3.1.1 试剂盒 |
| 3.1.2 试验药品 |
| 3.1.3 实验设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 BDE-209降解过程中在GY1胞内胞外的分布 |
| 3.2.2 GY1胞内胞外粗酶液对BDE-209的降解 |
| 3.2.3 BDE-209降解过程中GY1细胞活力检测 |
| 3.2.4 BDE-209 降解过程中SOD酶含量检测 |
| 3.2.5 BDE-209 降解过程中CAT酶含量检测 |
| 3.2.6 BDE-209 降解过程中MDA含量检测 |
| 3.2.7 BDE-209降解产物测定 |
| 3.2.8 降解产物毒性评估 |
| 3.2.9 BDE-209降解过程中GY1群落及功能转变 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 BDE-209降解过程中在GY1胞内胞外的分布 |
| 3.3.2 胞内胞外酶对BDE-209的降解 |
| 3.3.3 BDE-209降解过程中GY1细胞活力变化 |
| 3.3.4 BDE-209 降解过程中GY1 细胞SOD和 CAT酶含量变化 |
| 3.3.5 BDE-209 降解过程中GY1 细胞MDA含量变化 |
| 3.3.6 BDE-209降解途径分析 |
| 3.3.7 毒性评估 |
| 3.3.8 BDE-209降解过程中GY1群落变化 |
| 3.3.9 BDE-209降解过程中微生物菌群功能基因预测 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 GY1中高效降解菌分离鉴定及其对BDE-209降解性能和机理研究 |
| 4.1 材料与设备 |
| 4.1.1 试剂盒 |
| 4.1.2 实验药品 |
| 4.1.3 实验设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 功能菌分离和降解效率测定 |
| 4.2.2 菌种鉴定 |
| 4.2.3 BDE-209降解特性研究 |
| 4.2.4 降解产物分析 |
| 4.2.5 数据处理 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 功能菌降解效果测定 |
| 4.3.2 菌种鉴定 |
| 4.3.3 不同氮源对微杆菌Y2降解BDE-209的影响 |
| 4.3.4 投菌量对微杆菌Y2降解BDE-209的影响 |
| 4.3.5 时间对微杆菌Y2降解BDE-209的影响 |
| 4.3.6 温度和p H对微杆菌Y2 降解BDE-209 的影响 |
| 4.3.7 微杆菌Y2对不同浓度BDE-209的降解 |
| 4.3.8 BDE-209降解过程中在微杆菌Y2胞内胞外的分布 |
| 4.3.9 微杆菌Y2胞内胞外酶对BDE-209的降解 |
| 4.3.10 降解产物分析及降解路径推导 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 BDE-209降解过程中微杆菌Y2细胞的胁迫响应及生理生化特性变化 |
| 5.1 材料与设备 |
| 5.1.1 试剂盒 |
| 5.1.2 实验药品 |
| 5.1.3 实验设备 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 表面疏水性检测 |
| 5.2.2 细胞膜通透性检测 |
| 5.2.3 胞内ROS含量检测 |
| 5.2.4 细胞膜电位检测 |
| 5.2.5 SOD、CAT和 MDA含量测定 |
| 5.2.6 细胞凋亡率变化 |
| 5.2.7 细胞周期变化 |
| 5.2.8 数据处理 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 BDE-209胁迫下微杆菌Y2表面疏水性的变化 |
| 5.3.2 BDE-209胁迫下微杆菌Y2细胞膜通透性的变化 |
| 5.3.3 BDE-209 胁迫下微杆菌Y2 细胞内ROS含量变化 |
| 5.3.4 BDE-209胁迫下微杆菌Y2细胞膜电位变化 |
| 5.3.5 BDE-209 胁迫下微杆菌Y2 胞内SOD、CAT和 MDA含量变化 |
| 5.3.6 BDE-209胁迫下微杆菌Y2细胞凋亡变化 |
| 5.3.7 BDE-209胁迫下微杆菌Y2细胞周期变化 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 微杆菌Y2在BDE-209胁迫下差异蛋白功能分析 |
| 6.1 材料与设备 |
| 6.1.1 实验试剂和耗材 |
| 6.1.2 实验仪器 |
| 6.1.3 培养基和菌种 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 菌种培养 |
| 6.2.2 蛋白质提取 |
| 6.2.3 蛋白质定量 |
| 6.2.4 蛋白FASP酶解 |
| 6.2.5 iTRAQ标记 |
| 6.2.6 第一维液高pH-RP液相分离 |
| 6.2.7 第二维反向液质联用RPLC-MS |
| 6.2.8 数据检索 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 蛋白质鉴定及差异蛋白定量 |
| 6.3.2 差异蛋白功能分类 |
| 6.3.3 BDE-209作用下与降解相关的差异蛋白 |
| 6.3.4 BDE-209作用下与细胞应激响应相关的差异蛋白 |
| 6.3.5 BDE-209作用下与分解和合成代谢相关的差异蛋白 |
| 6.4 小结 |
| 第七章 生物强化降解BDE-209及微生物群落研究 |
| 7.1 实验设备和材料 |
| 7.1.1 菌种和培养基 |
| 7.1.2 实验设备 |
| 7.1.3 实验材料 |
| 7.2 实验方法 |
| 7.2.1 毒性评价 |
| 7.2.2 水-沉积物修复体系 |
| 7.2.3 微生物菌群分析 |
| 7.3 结果与讨论 |
| 7.3.1 毒性评估 |
| 7.3.2 水-沉积物修复体系中BDE-209的降解 |
| 7.3.3 水-沉积物修复过程中微生物群落多样性分析 |
| 7.3.4 水-沉积物修复过程中微生物群落结构分析 |
| 7.3.5 微生物群落功能基因预测 |
| 7.4 小结 |
| 结论与展望 |
| 结论 |
| 本论文创新之处 |
| 对未来的工作建议 |
| 参考文献 |
| 附录1 |
| 附录2 GC-MS/MS 参数及目标产物保留时间 |
| 附录3 Microbacterium Y2 双向测序拼接序列 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 1.1 药物性肝损伤的研究背景 |
| 1.2 对乙酰氨基酚(APAP)诱导的肝损伤的研究背景 |
| 1.3 APAP体内代谢、灭活及肝毒性机制 |
| 1.4 ROS和TNF-α交互作用介导的氧化应激—炎症反应正反馈回路 |
| 1.5 ROS-JNK激活介导APAP诱发急性肝损伤所致肝细胞线粒体功能紊乱和细胞凋亡及坏死 |
| 1.6 FXR结构与功能 |
| 1.6.1 FXR与炎症反应 |
| 1.6.2 SIRT1/FXR/AMPK介导的肝保护作用 |
| 1.7 中药白芷及其提取物欧前胡素的研究现状 |
| 1.7.1 中药白芷概述 |
| 1.7.2 欧前胡素等香豆素类中药成分的研究进展 |
| 第二章 IMP对于APAP诱导急性肝损伤的保护作用及机制研究 |
| 2.1 实验目的 |
| 2.2 材料与仪器 |
| 2.2.1 药物、试剂和材料 |
| 2.2.2 主要实验仪器 |
| 2.3 实验动物 |
| 2.3.1 动物分组、造模与给药 |
| 2.3.2 动物样本采集 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 血清和肝组织液生化指标检测 |
| 2.4.2 小鼠肝脏H&E病理切片 |
| 2.4.3 TUNEL法分析肝组织细胞凋亡 |
| 2.4.4 小鼠原代肝细胞分离 |
| 2.4.5 CCK-8测定细胞存活率 |
| 2.4.6 小鼠原代肝细胞活性氧测定 |
| 2.4.7 JC-1法检测线粒体膜电位ΔΨm(mitochondrial membrane potential) |
| 2.4.8 双荧光素酶报告基因检测 |
| 2.4.9 分子对接实验 |
| 2.4.10 Western Blot蛋白免疫印迹实验 |
| 2.4.11 qRT-PCR实时荧光定量实验 |
| 2.4.12 三重四极杆质谱法(LC-MS/MS)检测小鼠肝脏花生四烯酸代谢物变化 |
| 2.4.13 统计方法 |
| 2.5 实验结果 |
| 2.5.1 IMP对小鼠急性肝损伤的保护作用 |
| 2.5.2 IMP对APAP诱导肝损伤相关抗氧化关键因子表达的影响 |
| 2.5.3 IMP对APAP诱导损伤小鼠肝细胞内活性氧(ROS)水平和线粒体膜电位的影响 |
| 2.5.4 IMP对APAP所致肝损伤诱导活性氧/c-Jun氨基末端激酶激活及肝细胞凋亡的影响 |
| 2.5.5 IMP对APAP诱导肝损伤相关促炎性细胞因子和炎症介质表达的影响 |
| 2.5.6 转录组测序筛选IMP预先给药对于保护APAP诱导肝损伤主要差异表达基因及分析 |
| 2.5.7 欧前胡素激活FXR核受体作用的实验验证 |
| 2.5.8 IMP对于APAP诱导损伤小鼠肝组织中相关药物代谢酶的调控作用 |
| 2.6 讨论 |
| 第三章 IMP通过FXR激活对APAP诱导肝损伤保护作用的分子机制的研究 |
| 3.1 实验目的 |
| 3.2 材料与仪器 |
| 3.2.1 药物、试剂和材料 |
| 3.2.2 主要实验仪器 |
| 3.3 实验动物 |
| 3.3.1 动物分组、造模与给药 |
| 3.3.2 动物样本采集 |
| 3.4 实验方法 |
| 3.4.1 小鼠血清肝损伤生化指标检测 |
| 3.4.2 小鼠肝脏H&E病理切片 |
| 3.4.3 TUNEL法分析肝组织细胞凋亡 |
| 3.4.4 小动物活体荧光成像系统测定小鼠肝脏活性氧水平 |
| 3.4.5 肝脏特异性敲除SIRT1小鼠构建和鉴定 |
| 3.4.6 小鼠原代肝细胞分离与培养 |
| 3.4.7 细胞免疫荧光实验 |
| 3.4.8 CCK-8测定细胞存活率 |
| 3.4.9 小鼠原代肝细胞活性氧测定 |
| 3.4.10 JC-1法检测线粒体膜电位ΔΨm(mitochondrial membrane potential) |
| 3.4.11 Western Blot蛋白免疫印迹实验 |
| 3.4.12 qRT-PCR实时荧光定量实验 |
| 3.4.13 三重四极杆质谱法(LC-MS/MS)检测小鼠肝脏花生四烯酸代谢物变化 |
| 3.4.14 统计方法 |
| 3.5 实验结果 |
| 3.5.1 FXR基因敲除小鼠有效性验证 |
| 3.5.2 IMP对APAP诱导FXR~(-/-)小鼠急性肝损伤失去明显保护作用 |
| 3.5.3 IMP对APAP诱导肝损伤FXR~(-/-)小鼠肝组织及体外原代肝细胞抗氧化因子表达失去调控作用 |
| 3.5.4 IMP对APAP诱导肝损伤FXR~(-/-)小鼠肝细胞内ROS产生及线粒体膜电位损失失去明显保护作用 |
| 3.5.5 IMP对APAP诱导肝损伤FXR~(-/-)小鼠肝细胞凋亡及相关凋亡调控因子表达无明显调节作用 |
| 3.5.6 IMP对APAP诱导FXR~(-/-)小鼠炎症介质表达无明显调控作用 |
| 3.5.7 SIRT1/FXR对于保护APAP诱导肝损伤的介导作用 |
| 3.6 讨论 |
| 第四章 欧前胡素长循环脂质体制备以及大鼠体内药代动力学研究 |
| 4.1 实验目的 |
| 4.2 材料与仪器 |
| 4.2.1 药物、试剂和材料 |
| 4.2.2 主要仪器 |
| 4.3 实验动物 |
| 4.4 实验方法 |
| 4.4.1 脂质体制备方法 |
| 4.4.2 大鼠血浆样品前处理方法 |
| 4.4.3 液相色谱条件 |
| 4.5 实验结果 |
| 4.5.1 质谱多反应监测(multiple reaction monitoring,MRM)检测欧前胡素采集方法的优化建立 |
| 4.5.2 欧前胡素定性定量方法学验证 |
| 4.5.3 欧前胡素长循环脂质体表征研究实验结果 |
| 4.5.4 欧前胡素脂质体体外释放实验结果 |
| 4.5.5 欧前胡素脂质体外体红细胞溶血实验结果 |
| 4.5.6 欧前胡素脂质体药代动力学实验结果 |
| 4.6 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附件 |
| 在校期间发表论文情况 |
| 致谢 |
| 详细摘要 |
