非小细胞肺癌神经内分泌分化与bcl-2、Bax表达的相关性

一、非小细胞肺癌中神经内分泌分化与bcl-2、Bax表达的相关性研究（论文文献综述）

李晓蔻^[1]（2021）在《基于miRNA-202-3p过表达探讨疏木六君子汤抑制MKN28增殖的机制》文中指出第一部分:探究血清中miRNA-202-3p作为诊断1型g-NEN的潜在标志物背景:胃神经内分泌肿瘤（gastric neuroendocrine neoplasms,g-NENs）是罕见的恶性肿瘤,主要来源于肠嗜铬样（enterochromaffin-like cells,ECL）细胞。根据WHO分类,源自ECL细胞的高分化g-NENs可以分为1型,2型和3型。其中,1型g-NEN由于缺乏神经内分泌肿瘤（neuroendocrine neoplasm,NEN）的特定症状,而肿瘤组织的血液供应丰富,循环生物标志物具有重要的诊断价值。微小核糖核酸（miRNA）是小的非编码RNA,miRNA与多种肿瘤的发生相关,并在不同疾病中起原癌作用和抑癌作用。而目前尚无针对胃神经内分泌肿瘤（g-NENs）的循环诊断生物标志物。目的:前期研究发现miRNA-202-3p在1型g-NEN肿瘤组织中过表达。由于1型g-NEN肿瘤组织的血液供应丰富,推测miRNA-202-3p很可能在循环血液中高表达。故本研究的目的是确定miRNA-202-3p在1型g-NEN患者的血液中是否高表达,以及能否作为1型g-NEN潜在肿瘤标志物。方法:本研究共纳入27例1型g-NEN患者和27例正常对照者,静脉采血后获得的血清,并通过qRT-PCR测量两组患者血清中miRNA-202-3p表达水平差异。结果:患者组（3.84×107copies/nl）中miRNA-202-3p的表达显着高于对照组（0.635×107 copies/nl）,P<0.01。ROC 曲线下面积（AUC）为 0.878（95%CI:0.788～0.968）,最佳分界点约为1.12×107 copies/nl。敏感性和特异性分别为88.9%和77.8%。结论:这项研究表明,miRNA-202-3p在1型g-NEN患者血清中的表达显着升高,可作为1型g-NEN诊断的潜在生物标志物。第二部分:基于miRNA-202-3p过表达探讨疏木六君子汤抑制MKN28增殖的机制背景:1型g-NEN其恶性程度远低于胃腺癌,且与肿瘤相关的死亡率也较低,但复发率较高。如何有效降低1型g-NEN的复发率已成为神经内分泌肿瘤研究领域的迫切问题。1型g-NEN患者的最常见的证候分型是肝郁脾虚证,谭煌英教授发挥中医药“治未病”的优势,临床中经常使用自拟方“疏木六君子汤”对这类患者进行治疗,预防肿瘤复发。课题组前期临床研究表明,中药组复发率为25.6%,中位复发时间为22个月,对照组54例,复发率为40.7%,中位复发时间为8个月,由此可见,疏木六君子汤能够显着延长患者复发时间（P=0.001）。本课题研究的第一部分中,我们发现miRNA-202-3p在患者肿瘤组织和外周血循环中高表达,并且可作为1型g-NEN的潜在的肿瘤生物标记物。因此,中药疏木六君子汤预防1型g-NEN复发的作用机制可能与调节miRNA-202-3p的表达有关。目的:通过细胞生物学和分子生物学技术,进一步探讨中药疏木六君子汤预防1型g-NEN复发的作用机制,并在第一部分的基础上进一步阐明miRNA-202-3p的作用机制和作用通路。方法:首先培养1型g-NEN细胞。在实际实验中,曾多次反复尝试通过胃镜收集1型g-NEN患者的肿瘤组织后,进行原代培养1型g-NEN细胞均失败。经过反复论证,我院临床研究所专家认为1型g-NEN本身具有恶性程度低和增殖缓慢的特性,其原代细胞培养过于困难,目前国内外又无可用的细胞株,坚持尝试原方案可能会影响本课题的顺利实施。查阅文献后,miRNA-202-3p在肠型胃癌中高表达,考虑到胃神经内分泌肿瘤是高度分化的恶性肿瘤,因此选择高分化胃癌细胞系MKN28进行后续研究。1.使用细胞生物学方法,培养分化良好的胃肿瘤细胞MKN28。2.采用人工脂质体转染法对MKN28细胞进行miRNA-202-3p的模拟物（mimics）和抑制物（inhibitors）的转染。3.转染后,使用qRT-PCR确定miR-202-3p在MKN28中的表达。4.使用CCK-8法观察MKN28细胞的增殖情况。5.通过Western Blot方法验证了 miR-202-3p靶基因DUSP1的表达,并检测凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的表达。6.制备不同浓度的疏木六君子汤含药血清,分别以高,中,低浓度含药血清组干预各组MKN-28细胞。采用CCK-8法比较各组细胞间增殖活性,采用Western Blot法检测各组中DUSP1,Bcl-2和Bax蛋白的表达情况。结果:1.用 miRNA-202-3p 转染 MKN28 细胞后:1.1用CCK8法观察各组的OD值。与对照组相比,miRNA-202-3p过表达组的OD值升高,差异有统计学意义（P<0.01）。1.2Western Blot法用于定量分析每组MKN28细胞中DUSP1的表达,与miRNA-202-3p过表达组相比,miRNA-202-3p抑制组DUSP1的表达增加（P<0.01）。MKN28细胞中抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,与对照组相比,miRNA-202-3p过表达组Bcl-2的表达水平无统计学差异,但有增加趋势（P>0.05）。促凋亡蛋白Bax的表达,与对照组相比,miRNA-202-3p过表达中Bcl-2的表达水平无统计学差异,但有下降趋势（P>0.05）。2.用DUSP1转染MKN28细胞后:用CCK8法观察各组的OD值,结果发现DUSP1过表达组的OD值较对照组降低,差异有统计学意义（P<0.01）。3.疏木六君子汤含药血清干扰MKN28细胞后:3.1用CCK8法观察各组的OD值。与对照组相比,疏木六君子汤在低,中,高浓度组的OD值差异无统计学差异,但有下降趋势（P>0.05）,各浓度之间的表达差异无统计学意义（P>0.05）。3.2用Western Blot法定量分析每组MKN28细胞中DUSP1的表达。低,中,高浓度组与对照组相比,DUSP1的表达无统计学差异,但有升高的趋势（P>0.05）。各浓度组间DUSP1表达无统计学差异（P>0.05）。与对照组相比,疏木六君子汤低浓度、中浓度和高浓度组Bcl-2的表达量虽无统计学差异但有降低趋势（P>0.05）,各浓度组之间Bcl-2的表达量无统计学差异（P>0.05）。与对照组相比,疏木六君子汤低浓度、中浓度和高浓度组Bax的表达量虽无统计学差异但有增高趋势（P>0.05）,各浓度组之间Bax的表达量无统计学差异（P>0.05）。结论:miRNA-202-3p在人高分化胃肿瘤细胞MKN28细胞中高表达,具有抑制其靶基因DUSP1表达的趋势。通过促进其下游抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,抑制促凋亡蛋白Bax的表达,从而抑制人胃肿瘤MKN28细胞凋亡并促进生长。中药疏木六君子汤含药血清具有促进DUSP1靶基因的表达,从而抑制其下游抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,促进凋亡蛋白Bax的表达,从而促进人胃肿瘤细胞MKN28细胞凋亡,抑制增殖趋势。

李姗姗^[2]（2021）在《长链非编码RNA CAR10通过调节miR-892a/GJB2途径促进非小细胞肺癌细胞转移及侵袭的机制研究》文中进行了进一步梳理目的肺癌已成为全世界范围内发病人数最多且死亡率很高的癌症种类。小细胞肺癌（SCLC）和非小细胞肺癌（NSCLC）是肺癌的两种主要的病理分型,其中NSCLC占肺癌总数的大多数。目前有确切证据表明,大多数肿瘤患者死于肿瘤的转移和复发,侵袭性生长和转移潜能是肿瘤高死亡率的根本原因,因此阐明NSCLC的关键侵袭转移机制,有针对性的研究NSCLC的早期诊断标志物和治疗靶标、明确其调控机制,具有重要的意义。长链非编码RNAs（lnc RNAs）的长度大于200个核苷酸,在功能上不具有编码蛋白质的能力。许多研究表明lnc RNAs参与了包括NSCLC在内的多种肿瘤的侵袭转移过程。本研究旨在明确lnc RNA染色体相关RNA 10（chromosome associated RNA 10,CAR10）通过调控GJB2来促进非小细胞肺癌的侵袭转移作用及其具体作用机制。方法1.长链非编码RNA CAR10在非小细胞肺癌中的表达及其临床意义（1）采用生物信息学分析CAR10在Gene Expression Omnibus（GEO）数据库中非小细胞肺癌相关数据集GSE19188、GSE30219和GSE118370中的表达。（2）收集50例非小细胞肺癌患者的癌及癌旁组织标本,采用皮尔森卡方检验（Pearson Chi-Square test）及Fisher精确检验分析不同CAR10表达水平与NSCLC临床特征的相关性。（3）应用RT-qPCR的方法检测CAR10在人支气管上皮细胞16HBE及NSCLC细胞系A549、H1299和H1975中的表达。2.长链非编码RNA CAR10调控GJB2促进非小细胞肺癌A549和H1299迁移及侵袭能力的实验研究（1）设计并构建特异性CAR10小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）,采用细胞转染的方式构建不同CAR10表达水平的非小细胞肺癌细胞系,并用RTq PCR的方法进行验证;采用Transwell实验检测不同CAR10表达水平细胞的迁移及侵袭能力的影响。（2）分析GEO数据库中的非小细胞肺癌相关数据集GSE19188、GSE30219和GSE118370差异表达的基因;通过Kaplan-Meier分析筛选差异表达的基因与NSCLC患者预后的相关性;免疫组织化学法检测不同分级非小细胞肺癌组织中GJB2的表达水平;应用RT-qPCR的方法检测GJB2在人支气管上皮细胞16HBE及非小细胞肺癌细胞系A549、H1299、SPCA1和H1975中的差异表达。（3）根据GSE19188、GSE30219和GSE118370数据集中CAR10和GJB2表达的read值,Spearman相关分析CAR10和GJB2表达的相关性;采用Westernblot法检测不同CAR10表达水平对非小细胞肺癌细胞系A549和H1299细胞中GJB2蛋白的表达水平的影响;用Transwell实验检测不同CAR10水平对非小细胞肺癌细胞系A549和H1299细胞的迁移及侵袭能力的影响。（4）在A549和H1299细胞中共转染CAR10过表达质粒（oeCAR10）及特异性GJB2小干扰RNA（siGJB2）,同步转染空白对照（oeCTR及siSCR）,采用Transwell实验检测改变GJB2表达水平对CAR10介导的非小细胞肺癌细胞系A549和H1299细胞的迁移及侵袭能力的影响。3.长链非编码RNA CAR10作为ceRNA调控GJB2促进A549和H1299迁移及侵袭的机制研究（1）通过在线预测网站（RegRNA 2.0,miRWalk,miRDB和Targetscan）预测可以和GJB2或者CAR10相互作用的miRNAs,选取这4个数据库中miRNAs的交集,共筛选出5种可能和CAR10及GJB2相互作用的miRNAs;分析非小细胞肺癌相关数据集GSE19945中miR-892a的表达情况;采用RT-qPCR的方法检测50例非小细胞肺癌患者的癌和癌旁组织中miR-892a的表达水平;Spearman相关分析miR-892a和GJB2表达的相关性。（2）在A549和H1299细胞中转染miR-892a的模拟物和抑制物,用RT-qPCR的方法检测构建的细胞模型中miR-892a的表达水平;采用Western-blot的方法,检测不同miR-892a表达水平的非小细胞肺癌细胞A549及H1299中GJB2蛋白的表达水平。（3）在A549细胞中共转染miR-892a的模拟物（miR-892a mimic）及GJB2过表达质粒（oe GJB2）,同步转染空白对照（NC mimic及oeCTR）,用Transwell实验检测改变GJB2表达水平对miR-892a介导的非小细胞肺癌细胞系A549细胞的迁移及侵袭能力的影响;相反地,在H1299细胞中共转染miR-892a的抑制物（miR-892a inhibitor）及特异性GJB2小干扰RNA（siGJB2）同步转染空白对照（NC inhibitor及siSCR）,用Transwell实验检测改变GJB2表达水平对miR-892a介导的非小细胞肺癌细胞系H1299细胞的迁移及侵袭能力的影响;采用Tagertscan软件在线预测miR-892a和GJB2的结合靶点,构建含有miR-892a结合位点的野生型报告质粒（GJB2-luc-WT）和含有miR-892a突变结合位点的突变型报告质粒（GJB2-luc-MUT）,将GJB2-luc-WT与miR-892a mimic及GJB2-luc-MUT与miR-892a mimic分别共转染至非小细胞肺癌细胞A549及H1299中,检测荧光素酶的活性。（4）在A549和H1299细胞中共转染CAR10过表达质粒（oeCAR10）及miR-892a模拟物（miR-892a mimics）,同步转染空白对照（oeCTR及NC mimic）,采用Western-blot的方法,检测改变miR-892a和CAR10表达水平对非小细胞肺癌细胞A549及H1299中GJB2蛋白的表达水平的影响;采用在线分析软件预测CAR10与miR-892a的结合靶点,构建含有miR-892a结合位点的野生型报告质粒（CAR10-luc-WT）和含有miR-892a突变结合位点的突变型报告质粒（CAR10-lucMUT）,将CAR10-luc-WT与miR-892a mimic及CAR10-luc-MUT与miR-892a mimic分别共转染至非小细胞肺癌细胞A549及H1299中,检测荧光素酶的活性。（5）在A549及H1299细胞中分别或共转染CAR10过表达质粒（oeCAR10）、GJB2小干扰RNA（siGJB2）、miR-892a抑制物（miR-892a inhibitor）和含有miR-892a突变位点的CAR10过表达质粒（oeCAR10-MUT）,同步转染空白对照（oeCTR）,将细胞分为oeCTR组、oeCAR10组、oeCAR10-MUT组、oeCAR10+siGJB2组及oeCAR10+siGJB2+miR-892a inhibitor组,采用Western-blot的方法,检测改变miR-892a、CAR10和GJB2表达水平对非小细胞肺癌细胞A549及H1299中GJB2蛋白的表达水平的影响;在相同分组的情况下,用Transwell实验检测改变miR-892a、CAR10和GJB2表达水平对非小细胞肺癌细胞A549及H1299细胞的迁移及侵袭能力的影响。结果1.长链非编码RNA CAR10在非小细胞肺癌中的表达及其临床意义（1）生物信息学分析显示:CAR10在Gene Expression Omnibus（GEO）数据库中非小细胞肺癌相关数据集GSE19188、GSE30219和GSE118370中癌组织的表达高于其在癌旁或正常肺组织的表达。（2）皮尔森卡方检验（Pearson Chi-Square test）及Fisher精确检验分析50例非小细胞肺癌患者的癌及癌旁组织标本显示:更高表达的CAR10与更高的病理分级（P=0.000）与更频繁的淋巴结转移（P=0.018）有关;单因素方差分析（One-way ANOVA）不同淋巴结分期患者的CAR10的表达量表明:非小细胞肺癌患者的淋巴结分期越高,患者CAR10的表达量越高;Kaplan-Meier分析发现:CAR10的高表达与患者更短的生存时间有关（P=0.014）。（3）RT-qPCR检测发现:CAR10在非小细胞肺癌细胞系（A549、H1299和H1975）中的表达明显高于其在人支气管上皮细胞16HBE的表达（P<0.001）。2.长链非编码RNA CAR10调控GJB2促进非小细胞肺癌A549和H1299迁移及侵袭能力的实验研究（1）RT-qPCR检测三种CAR10小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）在非小细胞肺癌细胞系A549、H1299中的转染效率显示:转染si CAR10-2的细胞中CAR10的表达量最低（P<0.01）;RT-qPCR检测转染si CAR10-2和CAR10过表达的质粒（oeCAR10）的非小细胞肺癌细胞系A549、H1299中CAR10的表达水平显示:细胞中CAR10的表达水平分别降低和增高（P<0.01;P<0.0001）;Transwell实验显示:下调CAR10的表达削弱了非小细胞肺癌细胞系A549、H1299细胞的迁移及侵袭能力,增加CAR10的表达促进了非小细胞肺癌细胞系A549、H1299细胞的迁移及侵袭能力（P<0.01）。（2）筛选了8个在三个数据集中都存在的差异表达的基因,分别是:COL11AL、MMP12、SPP1、KRT6A、MMP1、GJB2、SCG5和HS6ST2;明确这8个基因在GSE19188、GSE30219和GSE118370中的差异表达的倍数及Kaplan-Meier生存分析筛选差异表达的基因与NSCLC患者预后的相关性后,筛选出GJB2;免疫组织化学的方法明确了随着非小细胞肺癌患者临床分级的增加,GJB2的表达量增多（p<0.0001）;RT-qPCR的方法明确GJB2在非小细胞肺癌细胞系A549、H1299、SPCA1和H1975中的表达明显高于其在人支气管上皮细胞16HBE的表达（p<0.001）。（3）皮尔森相关分析明确了在非小细胞肺癌相关数据集GSE19188、GSE30219和GSE118370中CAR10与GJB2的表达呈正相关;Western-blot结果显示:在非小细胞肺癌细胞系A549、H1299中下调或者上调CAR10的表达可以降低或增加GJB2蛋白的表达（P<0.01）;Transwell实验表明:在非小细胞肺癌细胞系A549、H1299中,过表达CAR10后,细胞的迁移及侵袭能力增强,在过表达CAR10的同时沉默GJB2的表达,可降低过表达CAR10对细胞迁移及侵袭能力的促进作用（P<0.001）。（4）在A549和H1299细胞中共转染CAR10过表达质粒（oeCAR10）及特异性GJB2小干扰RNA（siGJB2）,同步转染空白对照（oeCTR及siSCR）,采用Transwell实验检测改变GJB2表达水平对CAR10介导的非小细胞肺癌细胞系A549和H1299细胞的迁移及侵袭能力的影响。3.长链非编码RNA CAR10作为ceRNA调控GJB2促进A549和H1299迁移及侵袭的机制研究（1）在线预测网站预测了5种可以和GJB2或者CAR10相互作用的miRNAs;分析非小细胞肺癌相关数据集GSE19945表明:miR-892a在癌组织中的表达明显低于其在正常肺组织中的表达;RT-qPCR的方法明确:miR-892a在50例非小细胞肺癌患者的癌组织中的表达明显低于其在癌旁组织中的表达;Spearman相关分析明确miR-892a和GJB2的表达呈负相关。（2）RT-qPCR明确:在非小细胞肺癌细胞系A549和H1299中转染miR-892a的模拟物（miR-892a mimics）和抑制物（miR-892a inhibitor）,细胞中的miR-892a的表达水平增高和降低（P<0.01;P<0.0001）;Western-blot的方法检测:在非小细胞肺癌细胞系A549和H1299中,上调或者下调miR-892a的表达可以降低或增加GJB2蛋白的表达（P<0.01）。（3）Transwell实验结果显示:在非小细胞肺癌细胞系A549中转染miR-892a模拟物后,细胞的迁移及侵袭能力减低,而转染miR-892a模拟物同时转染GJB2过表达质粒,过表达GJB2可以逆转过表达miR-892a对A549细胞迁移及侵袭能力的抑制作用（P<0.001）;在H1299细胞中转染miR-892a抑制物后,细胞的迁移及侵袭能力增强,而转染miR-892a抑制物同时转染GJB2小干扰RNA,下调GJB2可以逆转沉默miR-892a对A549细胞迁移及侵袭能力的促进作用（P<0.001）;双荧光素酶实验表明:在非小细胞肺癌细胞系A549、H1299中,过表达的miR-892a能够显着降低GJB2野生型质粒连接的荧光素酶的活性,而对GJB2突变型质粒连接的荧光素酶的活性却无显着影响（P<0.01）。（4）Western-blot结果显示:在非小细胞肺癌细胞系A549、H1299中转染CAR10过表达质粒后,细胞中GJB2蛋白的表达水平增高,转染CAR10过表达质粒同时转染miR-892a模拟物后,GJB2的表达比oeCAR10组的表达降低（P<0.01）;双荧光素酶实验表明:在非小细胞肺癌细胞系A549、H1299中,过表达的miR-892a能够显着降低CAR10野生型质粒连接的荧光素酶的活性,而对CAR10突变型质粒连接的荧光素酶的活性却无显着影响（P<0.01）。（5）Western-blot结果显示:在非小细胞肺癌细胞系A549、H1299中转染CAR10过表达质粒后,细胞中GJB2蛋白的表达水平增高,在转染含有miR-892a突变位点的CAR10过表达质粒（oeCAR10-MUT）后GJB2蛋白的表达水平降低;在转染siGJB2后,GJB2蛋白的表达水平降低较转染oeCAR10组的降低;在同步转染siGJB2和miR-892a抑制物后,细胞的GJB2蛋白的表达水平升高（P<0.01）;Transwell实验验证:在非小细胞肺癌A549、H1299中转染CAR10过表达质粒后,细胞的迁移侵袭能力增强;在转染含有miR-892a突变位点的CAR10过表达质粒（oeCAR10-MUT）后细胞的迁移侵袭能力减弱;在转染siGJB2后,细胞的迁移侵袭能力较转染oeCAR10组的减弱;在同步转染siGJB2和miR-892a抑制物后,细胞的迁移及侵袭能力增强（P<0.01）。结论1.CAR10在非小细胞肺癌的组织及细胞中均高表达且与患者的临床特点有关。2.高表达CAR10的非小细胞肺癌细胞系A549、H1299的迁移及侵袭能力增强;GJB2在非小细胞肺癌组织及细胞系中的表达均增高且与患者的不良预后有关;GJB2参与CAR10介导的非小细胞肺癌的迁移及侵袭作用。3.MiR-892a在非小细胞肺癌组织中低表达且与GJB2的表达呈负相关;CAR10促进GJB2诱导的侵袭转移是通过粘附miR-892a实现的。

李雪^[3]（2021）在《PHLDB3、P53、Bax、Bcl-2在非小细胞肺癌中的表达及临床意义》文中指出目的:非小细胞肺癌（NSCLC）是肺癌最常见的类型,其发病率高,预后不良,且发生发展机制错综复杂。本研究主要通过检测非小细胞肺癌组织中pleckstrin同源样结构域家族B成员3（PHLDB3）、抑癌基因P53、凋亡促进因子Bax、凋亡抑制因子Bcl-2蛋白的表达,分析其相互关系及表达意义,以探究PHLDB3在非小细胞肺癌中的作用及可能的作用机制,拟为进一步探究PHLDB3在非小细胞肺癌中的具体调控机制奠定组织学基础、为非小细胞肺癌患者治疗的靶点选择提供参考依据。方法:选取108例非小细胞肺癌病例,收集其手术切除的非小细胞肺癌组织蜡块108例,并收集部分癌组织5cm以外的正常肺组织蜡块45例作为对照。用免疫组织化学技术检测PHLDB3、P53、Bax、Bcl-2蛋白在非小细胞肺癌组织及邻近正常肺组织（对照组）中的表达情况,分析各蛋白表达与患者临床病理特征之间的关系,分析各蛋白表达之间的相互关系及各蛋白表达对非小细胞肺癌患者预后的影响。结果:1.PHLDB3、P53、Bax、Bcl-2蛋白在非小细胞肺癌组织中的表达情况:PHLDB3在非小细胞肺癌组织中的阳性率为69.4%,在对照组中的阳性率为26.7%;P53在非小细胞肺癌组织中的阳性率为36.1%,在对照组中的阳性率为0.0%;Bax在非小细胞肺癌组织中的阳性率为38.9%,在对照组中的阳性率为80.0%;Bcl-2在非小细胞肺癌组织中的阳性率为82.4%,在对照组中的阳性率为26.7%。与对照组相比,在非小细胞肺癌组织中,PHLDB3表达更高,P53表达更高,Bax表达更低,Bcl-2表达更高（P<0.05）。2.非小细胞肺癌组织中,PHLDB3、P53、Bax、Bcl-2蛋白表达与患者临床病理特征之间的关系:PHLDB3表达与非小细胞肺癌患者的年龄、性别、肿瘤最大径、分化程度、TNM分期及淋巴结转移有关:年龄>60岁、男性、肿瘤最大径>3cm、分化程度为中/低分化、TNM分期为Ⅲ和Ⅳ期或伴淋巴结转移者,PHLDB3阳性率更高;P53表达与非小细胞肺癌患者的肿瘤最大径、吸烟史、分化程度及TNM分期有关:肿瘤最大径>3cm、有吸烟史、分化程度为中/低分化或TNM分期为Ⅲ和Ⅳ期者,P53阳性率更高;Bax表达与非小细胞肺癌患者的分化程度及淋巴结转移有关:分化程度为高分化或未见淋巴结转移者,Bax阳性率更高;Bcl-2表达与非小细胞肺癌患者的TNM分期及淋巴结转移有关:TNM分期为Ⅲ和Ⅳ期或伴淋巴结转移者,Bcl-2阳性率更高（P<0.05）。3.在非小细胞肺癌组织中,PHLDB3、P53、Bax、Bcl-2蛋白表达之间的相互关系:PHLDB3的表达与P53的表达呈正相关关系（r=0.258,P=0.007）、与Bax的表达呈负相关关系（r=-0.477,P<0.001）、与Bcl-2的表达呈正相关关系（r=0.650,P<0.001）;P53的表达与Bcl-2的表达呈正相关关系（r=0.339,P<0.001）;Bax的表达与Bcl-2的表达呈负相关关系（r=-0.509,P<0.001）。Bax在P53（+）PHLDB3（+）组及P53（-）PHLDB3（+）组的表达均显着低于其在P53（-）PHLDB3（-）组的表达（P<0.05）,而其在P53（+）PHLDB3（+）组的表达与其在P53（-）PHLDB3（+）组的表达差异无统计学意义（P>0.05）。Bcl-2在P53（+）PHLDB3（+）组及P53（-）PHLDB3（+）组的表达均显着高于其在P53（-）PHLDB3（-）组的表达（P<0.05）,而其在P53（+）PHLDB3（+）组的表达与其在P53（-）PHLDB3（+）组的表达差异无统计学意义（P>0.05）。4.PHLDB3、P53、Bax、Bcl-2蛋白表达与非小细胞肺癌患者预后的关系:在非小细胞肺癌中,PHLDB3阳性患者的总生存时间较PHLDB3阴性患者的生存时间短;P53阳性患者的总生存时间较P53阴性患者的生存时间短;Bcl-2阳性患者的总生存时间较Bcl-2阴性患者的生存时间短（P<0.05）。PHLDB3、P53、Bcl-2均是影响患者预后的因素。P53（+）PHLDB3（+）组及P53（-）PHLDB3（+）组患者的总生存时间均显着低于P53（-）PHLDB3（-）组患者的总生存时间（P<0.05）,而P53（+）PHLDB3（+）组患者的总生存时间与P53（-）PHLDB3（+）组患者的总生存时间相比差异无统计学意义（P>0.05）。5.单因素及多因素分析:PHLDB3和TNM分期是影响非小细胞肺癌患者预后的独立因素（P<0.05）。结论:1.PHLDB3、P53、Bax、Bcl-2可能参与非小细胞肺癌的发生发展;PHLDB3阳性提示非小细胞肺癌患者预后不良,PHLDB3可能是影响非小细胞肺癌患者预后的独立因素。2.在非小细胞肺癌组织中,PHLDB3表达与Bax表达成负相关、而与Bcl-2表达成正相关;P53表达与Bcl-2表达成正相关;PHLDB3、P53可能参与细胞的凋亡过程,从而影响非小细胞肺癌的发生发展。3.PHLDB3在非小细胞肺癌组织中的表达与P53有关,P53的突变可能导致PHLDB3的表达增加,P53可能是PHLDB3的上游调节因子之一。

庞晨^[4]（2020）在《铁皮石斛对肺腺癌细胞裸鼠移植瘤的抑制作用和对自噬相关因子、肿瘤相关因子表达影响的研究》文中指出目的:通过裸鼠体内移植瘤实验研究,初步探讨鲜铁皮石斛对人肺腺癌细胞移植瘤的抑制作用及其机制。方法:1、培养实验所需细胞并通过HE染色和免疫组织化学染色对其种属和来源进行相关的鉴定。2、建立A549肺腺癌细胞裸鼠移植瘤模型并进行实验研究:将裸鼠随机分为6组,包括空白对照组、阴性对照组（模型组）、阳性对照组（环磷酰胺组,CTX）、铁皮石斛低浓度组、铁皮石斛中浓度组、铁皮石斛高浓度组。裸鼠空白对照组和阴性对照组生理盐水灌胃（每天30m L/kg）、环磷酰胺组腹腔注射给药（每隔一天给药,0.025 g/kg）,低浓度铁皮石斛、中浓度铁皮石斛、高浓度铁皮石斛每天分别以6.25g/kg、12.5g/kg、25 g/kg灌胃给药,在给药期间,每隔一天测量一次瘤体积。停药次日,处死裸鼠,剥离瘤体称重测量后待用。3、HE染色法观察各组移植瘤组织的病理形态学变化;免疫组织化学法观察铁皮石斛对裸鼠移植瘤瘤组织中自噬相关因子Beclin1以及增值指数Ki67的蛋白表达的影响。4、RT-PCR技术检测铁皮石斛对裸鼠移植瘤组织中的抑癌基因p53、p16以及EGFR基因表达的影响。结果:1、鉴定实验表明目标细胞为人的肺腺癌细胞株且成功建立A549肺腺癌细胞裸鼠移植瘤模型。2、与阴性对照组（模型组）相比,阳性对照组以及铁皮石斛低、中、高浓度组药物均可减缓裸鼠移植瘤生长,缩小肿瘤体积,且差异有统计学意义（P<0.05）;环磷酰胺组和低中高3个浓度剂量的抑瘤率分别达到62%、51%、52%、56%,并呈剂量依赖关系。3、免疫组化结果显示:同阴性对照组相比,中浓度铁皮石斛组、高浓度铁皮石斛组、阳性对照组的Beclin1阳性表达率逐渐升高;高浓度铁皮石斛组、阳性对照组的Ki67阳性率逐渐降低。4、RT-PCR结果显示:与阴性对照组相比,中浓度和高浓度铁皮石斛给药组裸鼠移植瘤组织中的EGFR m R N A水平均显示下调且高浓度铁皮石斛给药组差异性有统计学意义（P<0.05）;各浓度铁皮石斛给药组裸鼠移植瘤组织中的p53和p16 m RNA水平均显示上调;其中与阴性对照组相比,中浓度和高浓度铁皮石斛给药组裸鼠移植瘤组织中的p 1 6 m R N A差异性有统计学意义（P<0.0 5）;各浓度铁皮石斛给药组裸鼠移植瘤组织中的p53 m RNA差异性均有统计学意义（P<0.0 5）。结论:铁皮石斛具有抑制肺腺癌A549细胞裸鼠移植瘤组织生长的作用,其作用机制可能与上调自噬相关因子B e c l i n 1和抑癌基因p 1 6和p 5 3的表达、下调E G F R的表达相关;可能通过启动细胞自噬从而诱导细胞凋亡。

童琴^[5]（2020）在《MYCN调控HES1通过凋亡途径参与小细胞肺癌化疗耐药的研究》文中认为研究背景肺癌是当今世界严重危害人类健康的恶性肿瘤,已成为我国癌症相关死亡的首要原因。小细胞肺癌（small cell lung cancer,SCLC）约占所有肺癌的13%-15%,具有高度侵袭性,生存期短,预后极差。尽管小细胞肺癌最初对化疗敏感,但大多数患者会迅速产生耐药性,从而导致化疗失败。因此,充分阐明小细胞肺癌耐药性的分子机制对于提高一线化疗疗效和延长患者的生存有至关重要的意义。研究目的课题组前期利用基因表达谱芯片比较分析小细胞肺癌耐药细胞（H69AR）和敏感细胞（H69）间基因表达差异,发现耐药细胞株中MYCN的表达显着高于敏感细胞株（2.3倍）,提示MYCN可能参与了 SCLC化疗耐药。本课题通过体外细胞和体内动物实验进一步明确MYCN在SCLC化疗耐药中的作用;通过转录组测序和生物信息分析寻找MYCN的下游信号分子,探讨MYCN参与SCLC化疗耐药的分子机制,为下一步开展逆转SCLC化疗耐药的研究提供实验依据。研究方法及结果1.MYCN与小细胞肺癌多药耐药相关（1）siRNA下调细胞中的MYCN,CCK8结果显示在MYCN下调的细胞中,化疗药物的IC50值明显降低,药物的敏感性显着增加。（2）转染过表达质粒上调细胞中的MYCN,CCK8结果显示在MYCN上调的细胞中,化疗药物的IC50值明显增加,药物的敏感性显着降低。（3）构建慢病毒稳转细胞株后,进行裸鼠皮下成瘤实验:下调MYCN可以减缓瘤体的增长速度,抑制瘤体的体积,增加化疗敏感性;上调MYCN可以促进瘤体的增长速度,增加瘤体的体积,减弱化疗敏感性。2.MYCN通过影响细胞凋亡参与小细胞肺癌化疗耐药（1）在MYCN下调的细胞株中加入化疗药物,流式检测提示小细胞肺癌细胞早期凋亡率明显增加;Western Blot显示BAX表达增加,Bcl-2表达减少。（2）在MYCN上调的细胞株中加入化疗药物,流式检测提示小细胞肺癌细胞早期凋亡率明显下降;Western Blot显示BAX表达减少,Bcl-2表达增加。3.MYCN直接结合于HES1启动子区,激活Notch通路（1）经转录组测序和生物信息分析,发现Notch通路可能受MYCN的调控。经Western Blot验证,该通路上的NOTCH1,JAG2,HES1与MYCN的表达呈正相关。（2）CHIP-qPCR实验和荧光素酶实验证实MYCN可结合在HES1的启动子区域,并促进其转录。4.HES1参与MYCN介导的小细胞肺癌多药耐药（1）用siRNA干扰HES1的表达,CCK8结果显示化疗药物的IC50值明显下降,药物敏感性显着增高。（2）在MYCN上调的细胞株中用Notch通路抑制剂FLI-06抑制HES1活性,可以挽救MYCN上调导致的耐药性升高。（3）裸鼠皮下成瘤实验:FLI-06联合化疗组皮下成瘤的体积较化疗组及FLI-06组小,增长速率较化疗组及FLI-06组慢。5.MYCN与小细胞肺癌患者的耐药和生存相关（1）免疫组化技术分析小细胞肺癌患者肿瘤组织标本,化疗耐药组中MYCN的阳性表达率明显高于化疗敏感组,且MYCN和HES1表达呈正相关。（2）生存分析提示MYCN高表达患者的生存时间较低表达患者短。结论1.MYCN与小细胞肺癌化疗耐药呈正相关。2.MYCN通过影响凋亡参与小细胞肺癌化疗耐药。3.MYCN调控Notch通路,并可直接结合在HES1启动子区域,促进其转录。4.HES1与MYCN介导的小细胞肺癌化疗耐药相关。5.化疗耐药组中MYCN的阳性表达率明显高于化疗敏感组,MYCN高表达患者的生存时间短,临床预后差。

张静芸^[6]（2020）在《艾迪注射液治疗肺鳞癌靶基因筛选及机制的研究》文中进行了进一步梳理背景肺癌是一种在全世界范围内发病率与病死率都很高的癌症,为患者和社会带来了极大的疾病负担。其中,肺鳞癌（lung squamous cell cancer,LUSC）约占所有肺癌的30%-40%,患者预后较差且缺乏效果明确的靶向药物。目的了解中医药治疗肺癌的研究现状和热点;探索肺鳞癌患者预后相关和免疫相关的基因标志物;探究艾迪注射液治疗肺鳞癌的潜在靶点和机制并验证。方法1)文献计量学分析:根据检索策略,检索中国生物医学文献数据库（CBM）、中国知网（CNKI）和万方数据库等三个中文数据库,以及英文文献数据库PubMed,检索时间为建库至2019年9月23日;然后根据纳入排除标准,利用EndNote 7软件进行文献筛选并手工标引和核对需要分析的词条;最后利用书目共现系统分析软件BICOMS 2.0和相关辅助软件如gCluto、Ucient和NetDraw,分析中药治疗肺癌的研究现状和研究热点;2)生物信息学分析:首先从TCGA数据库得到LUSC患者相关的表达谱、表型和生存数据,并进行数据清洗;然后利用差异表达分析、单变量COX风险比例回归和LASSO方法,筛选出预后相关基因,得到预后预测模型（即预后指数）;接下来在7个独立GEO数据集中验证其预测效果,并通过meta分析的方法合并验证结果,同时还对其预测能力与已有文献中的基因标志物做对比;最后通过肿瘤免疫细胞浸润在线分析工具CIBERSORT、免疫相关基因数据库ImmPort等,研究LUSC患者免疫相关的基因标志物和免疫细胞浸润情况;3)网络药理学研究:首先通过文献回顾,研究艾迪注射液的有效成分;然后通过网络药理学的研究方法,探索艾迪注射液有效成分的作用靶点,得到“药-靶”网络关系图;再次结合数据挖掘和生物信息学的手段,得到艾迪注射液与LUSC患者预后相关的潜在作用靶点,得到艾迪注射液与LUSC相关的“药-靶”子网络;最后通过GO和KEGG富集分析,以及对核心靶基因的功能的分析,研究艾迪注射液靶基因的生物学功能,并预测艾迪注射液治疗LUSC的潜在作用机制。4)基础实验:首先通过MTT法观察艾迪注射液对人LUSC细胞NCI-H226生长的抑制作用;然后通过Annexin V/PI双染色法和流式细胞仪检测艾迪注射液对H226细胞的凋亡和周期的影响;最后,对p53通路、凋亡通路和细胞周期通路相关基因和蛋白p53、BAX、Bcl-2、CASP3、CDK1和CyclinB1进行qRT-PCR和WB检测,以验证艾迪注射液治疗LUSC的作用机制。结果1)中药治疗肺癌的研究现状和热点:共687本中文期刊刊载的6308篇研究和128本英文期刊刊载的370篇研究被纳入分析,其中第一篇中、英文文献分别发表于1977年和1986年。共有21个国家和地区参与了相关研究,但研究的中心仍然在中国大陆（占所有国家和的地区发文频次的67.69%）,且国内的研究中心在江苏、上海等东部地区。虽然相关研究数量飞速增长,但质量普遍不高,中文主要刊载在非中文核心期刊上,而英文期刊的影响因子普遍不高。中药治疗肺癌的研究热点为临床疗效和基础实验研究,主要集中在中晚期非小细胞肺癌,针对肺腺癌的研究居多。2)LUSC预后的基因标志物、免疫细胞和免疫相关基因:对TCGA中533个LUSC样本的表型、预后以及20530个mRNA和1046个miRNA的表达数据进行生物信息学分析,得到18个RNA（SCRIB、PLIN2、COBL、TRIB3、RHOF、PAQR5、TGM2、STC2、RPH3AL、MYEOV、TREM1、TMEM99、S1PR5、STAR、GALNT14、AP3B2、DQX1和hsa-mir-101-2）组成的预后基因标志物,其风险比（Hazard ratio,HR）为3.40（2.33,4.96）,且在7个独立的GEO数据集中进行验证,合并的HR仍然是统计学显着的。单核细胞和嗜酸性粒细胞与LUSC患者的总生存期相关,浆细胞、阳性自然杀伤细胞和嗜酸性粒细胞与无进展生存期相关,其中阳性自然杀伤细胞可能是疾病进展的保护性因素（HR=0.03<1,p=0.0472）,其余均为预后危险因素。同时,由于A2M与单核细胞存在相关性（r=0.212,p<0.05）,B2M与阳性自然杀伤细胞存在相关性（r=0.199,p<0.05）,故A2M和B2M可能是与LUSC患者预后相关的免疫基因。3)艾迪注射液共有22种有效成分,其中13个有效成分和对应的102个靶基因构成了艾迪注射液的“药-靶”互作用网络。通过生物信息学和数据挖掘的手段,得到艾迪注射液与LUSC患者预后相关的8个有效成分（斑蝥素、松柏苷、异嗪皮啶、芒柄花素、紫丁香苷、人参皂苷Rd、人参皂苷Re和人参皂苷Rg3）和7个核心基因（CASP3、CHRM3、LTA4H、PDE3A、DPP4、STAR和HTR3A）的互作用网络。最后由于艾迪注射液的靶基因中包含TP53、BAX、BCL-2和CASP3等基因,且功能富集于大多数癌症相关通路如p53信号转导通路、凋亡通路和细胞周期通路,说明艾迪注射液治疗LUSC的可能机制之一是激活了这些通路。4)首先艾迪注射液对H226细胞生长具有抑制作用,且与给药浓度和作用时间呈正相关关系,24h、48h和72h的半数抑制浓度分别为101.29mg/ml、47.13mg/ml和26.09mg/ml。然后流式细胞仪检测结果显示,艾迪注射液能够诱导H226细胞凋亡并发生G2/M期阻滞,且呈现出与给药浓度和给药时间的正相关性。最后通过qRT-PCR和WB技术,得到给药48h后,高、低浓度的艾迪注射液都会使得p53表达上调、BAX表达上调、Bcl-2表达下调、Caspase3表达上调、CDK1和CyclinB1表达下调。结论1)目前中药治疗肺癌研究的关注度不断提高,核心作者间合作紧密,但现有中英文研究的质量普遍不高。2)本研究得到由18个RNA组成的LUSC预后基因标志物,对LUSC患者预后有良好的预测效果。其次LUSC组织中嗜酸性粒细胞、A2M和B2M可能是LUSC患者潜在的免疫相关预后标志物。3)艾迪注射液共有22个有效成分和102个靶基因,其中与LUSC患者预后相关包括8个有效成分和7个核心基因,艾迪注射液治疗LUSC潜在的作用机制之一是激活p53信号转导通路、凋亡通路和细胞周期通路,从而起到抑癌作用。4)实验证实艾迪注射液可以抑制人LUSC细胞NCI-H226的生长,能够诱导H226细胞凋亡并发生G2/M期阻滞,验证了艾迪注射液抑制H226细胞的机制之一是通过激活p53通路、凋亡通路和细胞周期通路,导致H226凋亡和G2/M期阻滞,从而起到抑癌作用。

苏春晓^[7]（2020）在《白杨素联合洛铂对人肺腺癌A549细胞作用机制的研究》文中研究表明目的:体外研究白杨素（Chyrsin,Chy）联合洛铂（Lobaplatin,Lob）对人肺腺癌A549细胞株的增殖、凋亡以及Bax、Bcl-2表达的影响。并且进一步探究白杨素联合洛铂在抑制人肺腺癌A549细胞增殖、诱导凋亡方面的机制。材料与方法:体外培养人肺腺癌A549细胞。（1）不同浓度的白杨素（0、5、10、20、40、80mmol/L）、洛铂（0、2.5、5、10、20、40mmol/L）分别在24h、48h、72h下处理人肺腺癌A549细胞,CCK-8法检测细胞增殖率,并由此确定白杨素的48h半数有效抑制浓度（42.276±0.544μg/ml）及洛铂的48h半数有效抑制浓度（18.596±2.074μmol/L）,用于后续实验;（2）白杨素（IC50）及洛铂（IC50）单用或联用,于不同时间（24h,36h,48h）的条件下处理人肺腺癌A549细胞,以CCK-8法检测细胞的增殖抑制率;（3）应用流式细胞仪来检测人肺腺癌A549细胞的凋亡率分布;（4）Western blot检测Bax及Bcl-2蛋白的表达情况。结果:1.运用CCK-8法检测不同浓度的白杨素以及洛铂作用于人肺腺癌A549细胞,研究结果发现,随着白杨素以及洛铂药物浓度的升高,人肺腺癌A549细胞的细胞增殖抑制率亦随之逐渐升高,呈剂量依赖性（P<0.05）,具有统计学差异。2.运用CCK-8法检测各组（对照组,白杨素组,洛铂组,白杨素联合洛铂组）药物作用于人肺腺癌A549细胞,发现白杨素联合洛铂组作用于人肺腺癌A549细胞时,其增殖抑制率明显优于对照组以及单药组（P<0.05）,并且呈时间依赖性（P<0.05）,其差异具有统计学意义。3.应用流式细胞仪检测各组（对照组,白杨素组,洛铂组,白杨素联合洛铂组）人肺腺癌A549细胞凋亡率,并进行比较,发现白杨素联合洛铂组作用于人肺腺癌A549细胞的总凋亡率（24.06±1.502%）明显多于白杨素组的总凋亡率（14.98±7.237%）和洛铂组的总凋亡率（11.743±3.843%）（P<0.05）,其差异具有统计学意义。4.Western Blot法检测示:与对照组相对比,当白杨素（42.276μmol/L）组在作用于人肺腺癌A549细胞后,可引起Bax（2.216±0.03）蛋白相对表达量的上调以及Bcl-2（1.071±0.007）蛋白相对表达量的下调;洛铂（18.596μmol/L）组作用人肺腺癌A549细胞后,引起Bax（2.028±0.025）蛋白相对表达量的上调,Bcl-2（0.892±0.011）蛋白相对表达量的下调。而相较于对照组和单药组（白杨素组,洛铂组）,两药联合组（白杨素组联合洛铂组）作用于人肺腺癌A549细胞后,引起Bax（2.545±0.166）蛋白相对表达量的上调以及Bcl-2（0.469±0.013）蛋白相对表达量的下调,相对表达量水平有显着差异（P<0.05）,差异具有统计学意义。结论:1.白杨素及洛铂分别在（5～160μmol/L以及2.5～80μmol/L）的浓度范围内,能够抑制人肺腺癌A549细胞的增殖,并且两药联合要明显优于单药。2.虽然白杨素及洛铂均能诱导人肺腺癌A549细胞凋亡,但是两药联合诱导人肺腺癌A549细胞的凋亡能力明显优于单药。3.白杨素联合洛铂作用于人肺腺癌A549细胞的增殖、凋亡的影响与其下调Bcl-2蛋白,上调Bax蛋白的表达具有相关性。

刘思远^[8]（2019）在《基于IL-6/PI3K/Akt/mTOR通路探究肺抑瘤合剂抑制肺腺癌的临床与机制研究》文中指出目的:观察肺抑瘤合剂对ⅢB或Ⅳ期肺腺癌患者临床疗效,并利用动物、细胞实验探讨肺抑瘤合剂通过IL-6/PI3K/Akt/mTOR信号通路抑瘤机制。方法:临床研究选择符合标准的ⅢB或Ⅳ期肺腺癌患者110例,采用简单数字的随机方法分为对照组和治疗组,每组55例。两组均采用规范的西药治疗,对照组给予AP（培美曲塞+顺铂）化疗方案,治疗组在AP（培美曲塞+顺铂）方案基础上给予肺抑瘤合剂口服,约100ml,分早晚两次服用。观察两组患者生活质量评分、临床症状积分、血清中细胞炎性因子IL-6水平变化、瘤体改善情况、无进展生存期（PFS）、总生存期（OS）及安全性指标等,统计临床疗效。动物研究采用人肺腺癌A549细胞种植裸鼠方式造模,形成裸鼠A549肺癌模型,将36只造模成功的裸鼠随机分为六组,分为生理盐水组、肺抑瘤合剂低浓度组、肺抑瘤合剂中浓度组、肺抑瘤合剂高浓度组、顺铂组、肺抑瘤合剂中浓度联合顺铂组,每组各6只（前期预实验证明,肺抑瘤合剂以中浓度组为最佳）。分组给药,裸鼠每日以中药、顺铂和生理盐水灌胃、注射。每日一次,连续4周。观察小鼠各组抑瘤率大小;Elisa检测血中IL-6水平;Western Blot检测瘤体中PI3k、Akt、p-Akt、mTOR、S6K1、Bcl-2、Bax表达;免疫组化检测IL-6、S6K1、Bcl-2水平。细胞实验选用人肺腺癌A549细胞为研究对象,MTT检测浓度分别为10、20、30μg/ml的肺抑瘤合剂抑制A549细胞增殖情况,Elisa检测各浓度中药组中IL-6的表达,结合用药安全等考虑筛选出中药组最佳浓度。将细胞分为对照组、肺抑瘤合剂组、顺铂组和联合组,分别进行干预,MTT、Transwell、Elisa法分别检测干预药物对A549细胞增殖、侵袭及炎性因子IL-6表达情况。结果:临床研究发现,联合组较对照组在生活质量评分、临床症状积分、IL-6表达水平、无进展生存期（PFS）、客观缓解率（ORR）等方面优势明显,差异具有统计学意义（P<0.05）,但在部分瘤体改善情况、总生存期（OS）、部分安全性指标等方面虽然相对于对照组有所缓解,但P>0.05,无统计学意义;动物实验证实肺抑瘤合剂明显抑制肺腺癌肿瘤生长,降低IL-6、PI3K、p-Akt、mTOR、S6K1、Bcl-2水平,促进Bax表达,以联合组效果最优,差异具有统计学意义（P<0.05）;细胞实验发现,肺抑瘤合剂明显降低IL-6水平,抑制细胞增殖与侵袭,以联合组效果最为明显。结论:临床及实验研究证实,肺抑瘤合剂均能降低IL-6表达,动物、细胞实验进一步验证了肺抑瘤合剂可通过影响IL-6/PI3K/Akt/mTOR/S6K1通路,抑制细胞增殖,且可能与凋亡相关因子Bcl-2、Bax有关。

黄佳圆^[9]（2015）在《Notch-1/AP-1/miR-451信号轴参与人肺腺癌细胞化疗耐药表型形成的分子机制研究》文中指出背景与目的随着紫杉醇、多西紫杉醇、吉西他滨、长春瑞滨等三代临床化疗新药的开发应用,临床上治疗非小细胞肺癌的缓解率有所改善。其中多西紫杉醇联合铂类对晚期非小细胞肺癌（NSCLC）的客观有效率（OR）提升至近40%,无病进展生存期（PFS）达到近4个月。但仍然有超过半数以上的病人无法从中获益,导致肿瘤持续进展。化学耐药的产生是限制晚期肺腺癌病人临床疗效的重要障碍,化疗耐药的机制错综复杂,涉及众多耐药相关基因的表达调控异常,还通过复杂的网络信号轴参与调节各种生理和病理过程。近年来,分子标志物指导临床个体化靶向治疗的研究不断聚焦,然而2014年ESMO会议上公布的ET研究和2013年美国ASCO年会上公布的两项既往研究结果均展现了切除修复交叉互补1蛋白（ERCC1）的表达并不能预测非小细胞肺癌使用含铂类方案化疗的疗效和预后,这一阴性结果无疑警醒我们分子标记物指导临床治疗研究的道路仍任重道远,因此阐明化疗耐药相关机制、发现重要分子靶标的研究进程尚面临巨大的挑战。在多种生物体内Notch信号通路,尤其是其中重要的受体Notch-1,在决定细胞命运和联系细胞间信号通讯发挥了显着的作用,包括干细胞表型维持、调节肿瘤分化、增殖、凋亡和化疗耐药形成。Notch信号通路与微小RNA（miRNAs）之间亦存在交互调控作用。本研究旨在寻找参与人肺腺癌耐药表型形成的分子靶标,借助信号通路特异性抑制剂和基因转染等方式人为调控基因表达,体内外验证Notch信号通路上受体Notch-1对肺腺癌化疗耐药的影响,结合课题组前期针对miRNA在肺腺癌中已取得的研究进展,深入研究肺腺癌中Notch通路和miRNAs之间的交叉对话作用。继而探索microRNA-4-51在肺腺癌耐药中的功能,凭借生物信息学分析和应用分子生物学方法明确激活蛋白1为重要枢纽后,试阐明Notch-1/AP-1/miR-45 1/MDR-1信号轴参与调控化疗耐药表型形成的分子机制。材料与方法1.收集101例诊断肺腺癌的病人标本,其中39例接受过紫杉类化疗方案的病人入组,免疫组化法检测Notch-1表达。2.所有病例密切随访,总生存时间为手术期至最近一次随访或死亡时间。运用统计学方法分析Notch-1与临床病理因素以及预后的相关性。3.人肺腺癌化疗耐药细胞系SPC-A1/DTX和H1299/DTX由本实验室前期自建。结合cDNA芯片分析结果,采用实时定量PCR（real-time RT-PCR）和Western Blot法检测Notch-1表达。时间依赖性诱导实验中多他赛以不同浓度（0,3,5μg/L）处理亲本细胞相同时间,浓度依赖性诱导实验中多西他赛以5μg/L浓度作用亲本细胞不同时间（0,3,5,7days）。实时定量PCR和Western Blot法检测Notch-1 表达。4.Notch信号通路特异性抑制剂DAPT的效果采用实时定量PCR法检测Notch各受体配体的表达,通过DAPT抑制剂的浓度梯度实验选择最合适的浓度用于后续实验。DAPT对多西他赛耐药细胞的体外功能通过CCK-8,克隆形成实验和流式细胞技术检测,以反映其化疗敏感性,增殖能力,凋亡水平以及细胞周期分布改变。5.基于SPC-A1/DTX建立的体内移植瘤模型被用于验证Notch信号通路活性与体内化疗敏感性的关系。当平均肿瘤体积达到1 00mm3时,随机分成四组,分别腹腔内注射1mg/kg多西他赛及100mg/kg DAPT,或联合应用二者,以生理盐水作为对照。H&E染色明确肿瘤结构,免疫组化染色增殖相关分子标志物以验证肿瘤体内增殖能力。6.与亲本细胞相比,Notch-1在耐药细西胞中的表达显着增高。Notch短发夹质粒（pGPU6/sh-Notch-1）和Notch-1 过表达质粒（pcDNA3/Notch-1）被分别转染进入耐药或亲本细胞以调控Notch-1表达,G418筛选出稳定转染的细胞株。Notch-1在肺腺癌耐药细胞上的功能通过CCK-8,克隆形成实验和流式细胞技术检测,以反映其化疗敏感性,增殖能力,凋亡水平以及细胞周期分布改变。7.肺腺癌耐药细胞分别稳定转染shRNA-Notch-1和对照空载体后皮下注射建立转移瘤体内模型。成瘤后隔日腹腔内注射多西他赛一次,维持治疗两周,记录绘制肿瘤生长曲线。最终通过H&E染色明确肿瘤结构,免疫组化法对增殖相关分子marker进行染色,分析肿瘤细胞的成瘤能力和对多西他赛的敏感性。8.MiRNAs与Notch信号通路各受体配体之间存在相应的交互调控关系,尤其重要受体之一的Notch-1。结合高通量miRNA芯片筛选结果和前期研究成果,本课题组已证实五条miRNAs（miR-200b,miR-100,miR-451,Let-7c and miR-650）与肺腺癌化疗敏感性紧密相关,q-PCR法检测Notch-1抑制后这五条miRNA的表达变化,miR-451被选为进一步研究对象。通过CCK-8,克隆形成实验和流式细胞技术检测MiR-451的功能,采用western blot等分子生物学方法进行拯救实验,检测共转染shRNA-Notch-1和miR-451 inhibitor的功能改变。9.应用三种免费开放的 miRNA 数据库（Pictar:http://pictar.mdc-berlin.de;TargetScan:http://www.targetscan.org;MirBase:http://mirbase.org/index,shtml）分析预测miR-451的靶基因。双荧光素酶报告基因验证下游靶基因。Western Blot法检测肺腺癌耐药细胞中Notch-1与miR-451调控后靶基因的蛋白表达。10.应用TFSEARCH（ver.1.3）分析MiR-451上游大约3kb左右序列作为其启动子区,运用染色质免疫共沉淀和荧光素酶活性实验进一步验证。通过Western blot等方法检测共转染GV144/c-Jun和miR-451 inhibitor的功能逆转。结果1.Notch-1是肺腺癌不同病理学组织类型的诊断及预后分析中重要的分子标志物,能够为临床治疗提供有效的理论指导。根据病人化疗的不同反应,我们将完全缓解,部分缓解和病情稳定的病人定义为化疗敏感型,而将明显进展的病人定义为化疗抵抗型。Notch-1在化疗抵抗型中呈现高表达。2.接受过紫杉类化疗方案的肺腺癌病人中,Notch-1高表达被发现与淋巴结转移（p=0.023）、复发（p=0.014）和预后差（p=0.026）密切相关。总生存与无病生存期缩短被证实与Notch-1高表达和TNM临床分期差存在关联性。Notch-1在肺腺癌中能够作为独立预后因素。3.前期cDNA基因芯片显示Notch-1在耐药株中表达高于亲本34.5倍,Notch-1的表达在耐药细胞中呈现明显高表达,并且随着浓度升高和时间延长,Notch-1表达进行性升高。4.DAPT有效抑制大多数Notch信号通路上受体和配体的表达,包括Notch-1。10μM DAPT被选为最适浓度用于后续实验。DAPT能够协同作用多西他赛,明显改善化疗敏感性,抑制肿瘤细胞增殖能力,促进凋亡进程,诱导G2/M期阻滞,同时减低G1期和S期。5.相比较其他处理组,化疗药与抑制剂联合应用后,裸鼠体内移植瘤的生长曲线明显降低,瘤重减轻。DAPT抑制剂处理后Notch-1受到抑制,与化疗药联合应用后,增殖指标ki-67与细胞核增殖抗原PCNA的阳性率明显降低,显着的核碎裂表象提示凋亡增加。6.在肺腺癌耐药细胞SPC-A1/DTX和H1299/DTX转染sh-Notch-1质粒,人为下调使Notch-1表达明显下降,多西他赛对耐药细胞的半数抑制能力（IC50）明显减弱,细胞体外增殖能力受到抑制,凋亡增加,并且还介导细胞周期G1期和G2/M期升高,S期减低。在亲本细胞SPC-A1和H1299转染pcDNA3/Notch-1过表达质粒,人为上调Notch-1表达后,亲本细胞对多西他赛的药物敏感性减弱,体内外增殖能力增强。7.在裸鼠移植瘤模型中,抑制Notch表达可以与多西他赛产生协同作用,抑制SPC-A1/DTX细胞的成瘤能力,显着提高多西他赛的化疗敏感性,降低体内ki-67和PCNA的阳性率,促进核分裂。8.在SPC-A1/DTX中干扰Notch-1表达后,miR-451明显升高,而miR-451原本在耐药细胞中呈现低表达。过表达的miR-451能够诱导药物敏感性增加,体外增殖能力降低,凋亡增加和介导细胞周期G2/M期阻滞。MiR-451与Notch-1之间呈负向调控关系,干扰miR-451表达能够部分逆转Notch-1抑制后影响。9.MDR-1为miR-451下游靶基因,其在耐药细胞中呈明显高表达。在亲本或耐药细胞中分别人为调控Notch-1或miR-451表达后,MDR-1表达出现相应改变。在耐药细胞中加入DAPT作用亦能减弱MDR-1表达,同时干扰miR-451后可逆转此现象。10.分析发现miR-451启动子区存在五处激活蛋白AP-1的互补结合位点。AP-1为已知的Notch-1下游功能靶点,c-Jun磷酸化水平与AP-1活化程度密切相关。在SPC-A1/DTX中抑制Notch-1表达使c-Jun磷酸化水平明显增加。荧光素酶活性实验和染色质免疫共沉淀证实c-Jun可能的miR-451启动子区结合位点为705-957bp,986-1252bp,2402-2697bp和2706-3005bp。干扰miR-451 能够部分恢复c-Jun上调引起的MDR-1降低。结论与意义1.Notch-1在肺腺癌化疗耐药表型形成中发挥重要作用,抑制其表达能够促进肺腺癌化疗增敏,抑制增殖,增加凋亡和改变细胞周期分布水平。2.MiR-451与Notch-1负向调控,呈抑癌基因表现,与化疗增敏作用,增殖抑制,凋亡增加和细胞周期再分布密切相关。3.MDR-1为miR-451直接靶基因,AP-1与miR-451启动子区存在可能结合位点。Notch-1/AP-1/miR-451功能轴的调控异常促进肺腺癌化疗耐药表型的形成。4.本研究首次探讨了Notch-1/AP-1/miR-451信号轴调控异常在人肺腺癌化疗耐药中的重要作用,其为肺腺癌临床个体化治疗和逆转化疗耐药提供了新的依据和思路。

邢鹏程^[10]（2008）在《非小细胞肺癌凋亡指数检测与Bax表达的临床病理意义》文中进行了进一步梳理目的:探讨TUNEL法检测非小细胞肺癌凋亡指数与Bax表达的临床病理意义,以及二者的相互关系。方法:应用免疫组织化学S-P法检测46例非小细胞肺癌切除标本以及23例癌旁正常肺组织（镜下证实无癌细胞浸润和转移）的Bax表达情况。同时应用TUNEL法检测非小细胞肺癌及癌旁正常肺组织的凋亡指数的大小。结果:Bax在肺鳞癌与肺腺癌组织中的阳性表达率分别为52.38%,64%,均低于癌旁肺组织91.30%,比较差异有统计学意义（P<0.05）,Bax在非小细胞肺癌中的表达与肿瘤的类型、分化程度、年龄、淋巴结有无转移以及TNM分期均无关（P>0.05）。同时应用TUNEL法检测肺鳞癌与肺腺癌凋亡指数的大小,发现在肺鳞癌中的凋亡指数（5.67±3.11）%与肺腺癌中的凋亡指数（6.58±3.58）%均低于癌旁肺组织（14.07±5.16）%,分别比较均有统计学意义（P<0.05）,但对肺鳞癌和肺腺癌组织不同临床病理特征凋亡指数进行分组比较,发现肺癌Ⅲ～Ⅳ期患者凋亡指数高于Ⅰ～Ⅱ期患者,比较差异有统计学意义（P<0.05）,在不同类型、不同级别、淋巴结转移情况以及年龄等因素的分组比较中均未见有统计学差异（P>0.05）。Bax阳性表达的患者凋亡指数为（6.93±2.90）%高于Bax阴性表达的患者（5.04±3.76）%,但二者比较无统计学差异（P>0.05）。结论:Bax在非小细胞肺癌患者中表达下调,缺失以及凋亡指数的下降可能在肿瘤的发生、发展中起一定的作用,随着肺癌患者病程的进展凋亡指数增加。同时,以上结果也提示肿瘤的发生、发展是一个多因素参与、多步骤演变的一个复杂的过程,Bax表达情况、凋亡指数的检测以及二者的联合应用能否成为临床上判断肿瘤生物学行为的有用的指标,还有待更多的研究以证实。

二、非小细胞肺癌中神经内分泌分化与bcl-2、Bax表达的相关性研究（论文开题报告）

（1）论文研究背景及目的

此处内容要求：

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例：

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

（2）本文研究方法

调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、非小细胞肺癌中神经内分泌分化与bcl-2、Bax表达的相关性研究（论文提纲范文）

（1）基于miRNA-202-3p过表达探讨疏木六君子汤抑制MKN28增殖的机制（论文提纲范文）

（2）长链非编码RNA CAR10通过调节miR-892a/GJB2途径促进非小细胞肺癌细胞转移及侵袭的机制研究（论文提纲范文）

（3）PHLDB3、P53、Bax、Bcl-2在非小细胞肺癌中的表达及临床意义（论文提纲范文）

（4）铁皮石斛对肺腺癌细胞裸鼠移植瘤的抑制作用和对自噬相关因子、肿瘤相关因子表达影响的研究（论文提纲范文）

（5）MYCN调控HES1通过凋亡途径参与小细胞肺癌化疗耐药的研究（论文提纲范文）

（6）艾迪注射液治疗肺鳞癌靶基因筛选及机制的研究（论文提纲范文）

（7）白杨素联合洛铂对人肺腺癌A549细胞作用机制的研究（论文提纲范文）

（8）基于IL-6/PI3K/Akt/mTOR通路探究肺抑瘤合剂抑制肺腺癌的临床与机制研究（论文提纲范文）

（9）Notch-1/AP-1/miR-451信号轴参与人肺腺癌细胞化疗耐药表型形成的分子机制研究（论文提纲范文）

（10）非小细胞肺癌凋亡指数检测与Bax表达的临床病理意义（论文提纲范文）

四、非小细胞肺癌中神经内分泌分化与bcl-2、Bax表达的相关性研究（论文参考文献）

• [1]基于miRNA-202-3p过表达探讨疏木六君子汤抑制MKN28增殖的机制[D]. 李晓蔻. 北京中医药大学, 2021(08)
• [2]长链非编码RNA CAR10通过调节miR-892a/GJB2途径促进非小细胞肺癌细胞转移及侵袭的机制研究[D]. 李姗姗. 沈阳医学院, 2021(09)
• [3]PHLDB3、P53、Bax、Bcl-2在非小细胞肺癌中的表达及临床意义[D]. 李雪. 西南医科大学, 2021(01)
• [4]铁皮石斛对肺腺癌细胞裸鼠移植瘤的抑制作用和对自噬相关因子、肿瘤相关因子表达影响的研究[D]. 庞晨. 广西中医药大学, 2020(02)
• [5]MYCN调控HES1通过凋亡途径参与小细胞肺癌化疗耐药的研究[D]. 童琴. 南方医科大学, 2020(01)
• [6]艾迪注射液治疗肺鳞癌靶基因筛选及机制的研究[D]. 张静芸. 兰州大学, 2020(01)
• [7]白杨素联合洛铂对人肺腺癌A549细胞作用机制的研究[D]. 苏春晓. 辽宁中医药大学, 2020(02)
• [8]基于IL-6/PI3K/Akt/mTOR通路探究肺抑瘤合剂抑制肺腺癌的临床与机制研究[D]. 刘思远. 山东中医药大学, 2019
• [9]Notch-1/AP-1/miR-451信号轴参与人肺腺癌细胞化疗耐药表型形成的分子机制研究[D]. 黄佳圆. 南京大学, 2015(01)
• [10]非小细胞肺癌凋亡指数检测与Bax表达的临床病理意义[D]. 邢鹏程. 新疆医科大学, 2008(02)