蔡彬[1]（2021）在《BMSCs治疗犬皮肤烧伤的效果及可能机制》文中提出目的:本试验通过建立犬皮肤三度烧伤模型,初步探索骨髓间充质干细胞（BMSCs）治疗犬皮肤三度烧伤的效果及可能机制,为治疗犬三度烧伤提供理论依据。方法:1.犬皮肤三度烧伤模型建立采用热水间接烫伤法建立烧伤模型,用97℃热水间接烫伤时间为18s、23s、28s、33s,通过临床观察和组织病理学观察,确定97℃热水间接烫伤模型建立的最佳时间。2.BMSCs治疗烧伤的效果观察选取6只健康的犬做正常组,36只烧伤模型试验犬分模型组、磺胺组、BMSCs组。采用CM-Dil标记BMSCs,在烧伤部位四周皮下注射4×106个BMSCs,第7、14、21、28天取皮肤做冰冻切片,观察BMSCs的迁移分布情况;第7、14、21、28天观察伤口的愈合情况,计算愈合率;第14、21、28天取材固定做HE染色观察的组织学变化,马松染色观察胶原纤维的分布排序,天狼星红染色观察Ⅰ、Ⅲ型胶原纤维分布。3.BMSCs治疗烧伤的可能机制6只健康的犬做正常组,选取36试验犬只制备烧伤造模分模型组、磺胺组、BMSCs组。第7、14、21、28天取正常组、模型组、磺胺组、BMSCs组的皮肤组织,ELISA法测定皮肤组织中TGF-β1、α-SMA、IL-6、TNF-α、b FGF、VEGF各个阶段的含量。第28天取正常组、模型组、磺胺组、BMSCs组的皮肤固定,免疫组织化学法检测CD34,计算MVD值。结果:1.成功建立犬皮肤三度烧伤模型33s烧伤有硬痂皮,皮肤组织全层被破坏,但伤及皮下肌肉,烧伤程度较深;28s烧伤有硬痂皮,皮肤全层被破坏,表皮和真皮的凝固性坏死,皮下肌肉的损伤较轻微;18s、23s烧伤有水疱和血肿形成,表皮层和真皮层的部分受损伤。综上所述,根据皮肤三度烧伤模型建立标准,确定97℃热水间接烫伤28s为三度烧伤模型建立的最佳方法。2.BMSCs治疗烧伤的效果CM-Dil标记的BMSCs,移植到皮肤中,第7天BMSCs个数和荧光强度达到峰值,之后BMSCs个数逐渐减少,荧光强度减弱,第28天皮肤组织中仍有标记的BMSCs存在;7、14、21、28天BMSCs组愈合率与模型组相比显着升高（P<0.05）;第7天BMSCs组与磺胺组相比差异不显着（P>0.05）,磺胺组与模型组差异不显着（P>0.05）;第14、21、28天BMSCs组与磺胺组相比显着升高（P<0.05）;磺胺组与模型组相比显着升高（P<0.05）;14天模型组少量血管,肉芽组织生成,大量炎性细胞;磺胺组肉芽组织和毛血管生成,炎性细胞较多;BMSCs组大量新生血管和肉芽组织,炎性细胞较少。第21天模型组纤维排列不规则,新生血管减少,角化过度,表皮层增厚;磺胺组新生血管减少,纤维排列疏松,表皮层较厚;BMSCs组新生血管减少,纤维排列有序;第28天模型组棘层肥厚,不规则增生,角化过度;磺胺组皮肤结构完整,棘层厚薄不一;BMSCs组的各层结构完整;第14天至28天模型组胶原纤维由少量到胶原纤维含量增多,排列无序且胶原纤维排列致密,由瘢痕化的趋势,最终形成瘢痕;磺胺组胶原由含量少到多,排列逐渐有序,但是排列密集,有瘢痕化的趋势;BMSCs组胶原含量增多,排列较疏松有序,无瘢痕生成;BMSCs组Ⅰ胶原纤维含量最少,磺胺组次之,模型组Ⅰ型胶原纤维含量最多;BMSCs组Ⅲ型胶原纤维含量最多,磺胺组次之,模型组Ⅲ型胶原纤维含量最少。BMSCs组Ⅰ胶、Ⅲ型胶原纤维比例接近正常组织。3.BMSCs治疗烧伤的可能机制第7、14、21、28天,模型组TGF-β1的含量与正常组、磺胺组、BMSCs组相比极显着性升高（P<0.01）;磺胺组与正常组、BMSCs组相比极显着性升高（P<0.01）;BMSCs组与正常组相比极显着性升高（P<0.01）。第7、14、21、28天,模型组α-SMA的含量与正常组、BMSCs组相比极显着升高（P<0.01）,第7、14、28天,模型组与磺胺组相比极显着升高（P<0.01）,第21天相比则无差异（P>0.05）;第7、14、21、28天,磺胺组与正常组、BMSCs组相比极显着升高（P<0.01）;BMSCs组与正常组相比极显着升高（P<0.01）。第7、14、21、28天,模型组TNF-α的含量与正常组、BMSCs组相比极显着升高（P<0.01）,第7天模型组与磺胺组相比显着升高（P<0.05）,第14、21、28天模型组与磺胺组无差异（P>0.05）;第7、14、21、28天,磺胺组与正常组、BMSCs组相比极显着升高（P<0.01）;第7、14、21、28天,BMSCs组与正常组相比极显着升高（P<0.01）。第7、14、21、28天,模型组IL-6的含量与正常组、BMSCs组相比极显着升高（P<0.01）,第14、21天模型组IL-6的含量与磺胺组相比显着升高（P<0.05）,第7、28天模型组IL-6与磺胺组无差异（P>0.05）;第7、14、21、28天,磺胺组与正常组、BMSCs组相比极显着升高（P<0.01）;BMSCs组IL-6的含量与正常组相比极显着升高（P<0.01）。第7、14、21、28天,模型组VEGF的含量与磺胺组、BMSCs组相比极显着降低（P<0.01）;第7、14、21天模型组与正常组相比极显着升高（P<0.01）,第28天显着升高（P<0.05）;BMSCs组与正常组、磺胺组相比极显着升高（P<0.01）,磺胺组与正常组相比极显着升高（P<0.01）。第7、14、21、28天,模型组b FGF的含量与磺胺组、BMSCs组相比极显着降低（P<0.01）,第7、14、21天模型组与正常组相比极显着升高（P<0.01）,第28天无差异（P>0.05）;第7、14、21、28天,BMSCs组与正常组、磺胺组相比极显着升高（P<0.01）,磺胺组与正常组相比极显着升高（P<0.01）。模型组的积分光密度值（IOD）与正常组、BMSCs组相比极显着降低（P>0.01）,模型组与磺胺组无差异（P>0.05）;磺胺组与正常组、BMSCs组相比极显着降低（P>0.01）;BMSCs与正常组无差异（P>0.05）。BMSCs组MVD值与模型组和磺胺组相比显着升高（P<0.05）,与正常组无差异（P>0.05）;模型组和磺胺组MVD值与正常组相比显着降低（P<0.05）;模型组和磺胺组无差异（P>0.05）。结论:通过97℃热水间接烫伤皮肤28 s,可以建立皮肤三度烧伤模型。用CM-Dil标记BMSCs,在皮肤伤口中被检测到,表明BMSCs在愈合过程中一直存在于伤口中,可能直接地参与烧伤的愈合。BMSCs抑制皮肤组织分泌TGF-β1、α-SMA、IL-6、TNF-α,减少I型胶原纤维和瘢痕的生成,减少炎症的发生,可能通过旁分泌促进VEGF、b FGF的分泌,上调CD34的表达,提高MVD值,促进血管生成和创面愈合。
孙岩伟[2]（2021）在《PRP调节表皮干细胞修复深二度烧伤及供皮区创面的实验研究》文中指出研究背景烧伤是常见的意外伤,临床上依据烧伤深度和程度的不同而采取不同的治疗方案。烧伤发生后皮肤的完整性遭到破坏,容易继发缺血、感染,创面愈合后形成瘢痕。烧伤治疗的目的是在尽可能短的时间内实现创面的再上皮化,减少感染的发生和瘢痕的形成,最大限度恢复皮肤的结构和功能。深二度烧伤的治疗不同于三度烧伤,具有自身的特点。深二度烧伤损伤深度为皮肤表皮全层和真皮深层,仍残留部分真皮和皮肤附件,能够为创面的再上皮化提供“种子细胞”,创面可以通过换药愈合,但是愈后通常留有瘢痕,尤其关节部位的瘢痕会影响功能,造成患者心理和生理上的不适,降低生活质量。因此,如何调节创面边缘及残存“种子细胞”的生物学活性,加速创面再上皮化,减轻瘢痕形成,是目前烧伤创面研究的热点和难点。创面再上皮化,恢复皮肤结构和功能的完整性,是创面修复的关键。表皮干细胞（Epidermal stem cells,ESCs）是创面发生再上皮化过程中发挥关键作用的细胞,其增殖、分化和迁移等生物学行为在皮肤自我更新和创面修复中发挥重要作用。当皮肤受到损伤后,周围或基底的ESCs即产生应答,开始增殖并向损伤部位迁移,最终分化为表皮细胞,覆盖创面,完成创面的修复。ESCs在创面的修复中具有良好的应用前景,但目前尚无增强ESCs生物学活性的可靠方法,并且ESCs本身具有慢周期性和粘附性,使其在创面修复中的作用受到限制。此外,病理条件的改变（如孕期、糖尿病、烧伤等）也会对ESCs的生物学活性产生负面影响,使创面愈合时间延长,甚至不愈,形成瘢痕。不过,最近研究发现,ESCs的生物学行为与自身所处微环境密切相关。改变ESCs所处外在微环境,如增加表皮生长因子含量,可以促进其增殖和迁移,促进创面修复,改善愈合质量。因此,如何通过改变ESCs的内在或外在因素,调节其增殖和迁移能力,更好的促进创面修复是我们研究的靶点。富血小板血浆（PRP）是富含血小板的血浆浓缩产物,与生理全血相比,其血小板浓度至少升高3-5倍。PRP中高浓度的血小板被激活后可以释放大量的生长因子,包括血小板衍生生长因子（PDGF）、血管内皮生长因子（VEGF）、成纤维细胞生长因子（bFGF）、表皮生长因子（EGF）、胰岛素样生长因子（IGF）及转化生长因子等,这些生长因子单独或协同通过各种机制促进急慢性创面的修复与重建,目前应用越来越广泛。目前PRP在烧伤创面治疗中的研究主要集中在其抗炎、抗感染、调节细胞外基质合成及促进血管形成方面,对其促进创面再上皮化的研究较少。在干细胞研究方面,PRP能够调节多种干细胞的生物学活性,包括脂肪源性干细胞,骨髓间充质干细胞及ESCs等。但目前对PRP作用于ESCs的研究较少,作用机制尚不清楚,是否存在浓度依赖性仍不明确。此外,烧伤不同于一般的外伤,对皮肤组织产生额外的热损伤,PRP对这种病理损伤条件下即热损伤后ESCs的生物学行为是否有调节作用呢?另外,在体内条件下,PRP能否通过释放大量生长因子改变ESCs所处的微环境,从而调节ESCs的增殖、凋亡、迁移等生物学行为,进而促进创面的再上皮化呢?为了回答以上问题,我们主要进行了如下研究:第一部分在体外条件下研究自体PRP对ESCs增殖的影响,确定作用浓度;并进一步研究PRP对热损伤ESCs增殖、凋亡和迁移的影响,初步探索其作用机制。第二部分在体内条件下研究PRP对ESCs生物学行为的调节作用及对深二度烧伤创面愈合的影响,探索作用机制。另外,供皮区创面是烧伤治疗中最常见的创面。中厚皮片供皮区与深二度烧伤致伤原因不同,但深度相似,也伤及真皮层,愈后容易形成瘢痕,给医生和患者造成困扰。PRP在体外条件下可以促进ESCs的增殖和迁移,在人体内条件下是否能够通过调节供皮区ESCs的生物学行为进而促进创面愈合,减轻瘢痕呢?我们在第三部分的研究中,将PRP临床应用于中厚皮片供皮区创面,研究PRP对供皮区ESCs增殖的影响,评价其治疗效果和抗瘢痕作用,同时评价了抗血小板药物对PRP作用的影响。我们期望通过这些研究,能够为PRP在烧伤及供皮区创面临床治疗中的应用提供理论依据和基础实验支持。研究目的1.体外条件下,评价自体PRP对人ESCs增殖的影响,确定作用浓度,并研究PRP对热损伤ESCs凋亡、增殖和迁移的影响,探索其作用机制。2.体内条件下,研究PRP对猪深二度烧伤创面ESCs生物学活性的调节作用,评价PRP对深二度烧伤创面再上皮化的影响,探索其作用机制。3.在临床实验中评价PRP对中厚皮片供皮区创面的治疗效果,并研究抗血小板药物（阿司匹林）对PRP作用效果的影响。材料与方法1.PRP调节热损伤ESCs生物学行为的实验研究（1）ESCs的培养与鉴定:Ⅳ型胶原粘附法培养ESCs,流式细胞术检测ESCs标志物CK19和β1整合素的表达。（2）不同体积浓度PRP对ESCs增殖的影响:二次离心法制备PRP,CCK-8实验测定不同体积浓度PRP对ESCs增殖的影响,绘制生长曲线,确定合适浓度的 PRP。（3）PRP对热损伤ESCs生物学行为的影响:制备热损伤ESCs模型。流式细胞术检测PRP对热损伤ESCs凋亡的影响,CCK-8检测PRP对热损伤ESCs增殖的影响,细胞划痕实验分析PRP对热损伤ESCs迁移的影响。Western blot检测PRP作用于热损伤ESCs后信号通路中相关蛋白的表达。2.PRP调节ESCs修复猪深二度烧伤创面的实验研究（1）猪深二度烧伤模型的建立:应用温控热压仪在巴马香猪背部制备深二度烧伤创面,H&E染色和HMGB1染色鉴定损伤深度。二次离心法制备PRP,分别应用PRP与生理盐水治疗作为PRP组和对照组。（2）PRP对猪深二度烧伤创面愈合的影响:比较两组创面愈合时间,H&E染色分析愈合后创面皮肤厚度与结构。（3）PRP对猪深二度烧伤创面细胞生物学活性的影响:免疫组化染色分析比较两组不同时间点Ki67（+）细胞和CK19（+）细胞评分,TUNEL染色检测细胞凋亡,Western blot检测PRP作用后组织AKT和pAKT的表达变化。（4）PRP对猪深二度烧伤创面血管形成的影响:免疫组化染色分析比较两组不同时间点α-SMA（+）血管评分。（5）PRP对猪深二度烧伤创面微环境改变的影响:ELISA法定量两组不同时间点创面组织生长因子EGF,bFGF,VEGF的表达。3.PRP修复中厚皮片供皮区创面愈合的临床研究（1）患者分组:选取2013年06月至2015年12月在作者医院接受中厚皮片移植的手术患者进行分组。二次离心方法制备PRP。实验分组1:采用自身对照,根据随机原则分为PRP组和对照组。实验分组2:收集口服抗血小板药物（阿司匹林,100mg/天,持续服用时间>6月）患者作为阿司匹林组,分组1中患者作为对照PRP组进行研究,供皮区创面应用PRP治疗。（2）PRP对供皮区创面ESCs增殖的影响:术后第10天针刺活检获取3例患者创面组织进行CK19染色并评分比较。（3）PRP对供皮区创面愈合的影响:记录患者创面愈合时间,评估创面出血情况,以视觉模拟评分法（VAS）评估患者第7,10,14天换药时疼痛指数,温哥华瘢痕量表（VSS）对术后1,3月供皮区创面瘢痕进行评分。（4）阿司匹林对PRP作用的影响:比较两组患者创面愈合时间和术后第1,3月VSS评分,评估创面出血情况。4.统计学分析数据结果采用统计学软件（SPSS 17.0,IBM,Chicago,IL）进行分析。数据以平均数±标准差表示。两组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA）。以P<0.05判定为有统计学意义。结果1.PRP调节热损伤ESCs生物学行为的实验研究（1）ESCs的培养与鉴定:在培养皿中预铺Ⅳ型胶原,培养细胞,第5天镜下观察可见呈长梭形生长的贴壁细胞,散在分布;第14天可见到基本长满皿底的贴壁细胞,生长良好。流式细胞术检测细胞表面标志物CK19和β1整合素,阳性率分别为90.72%和92.83%,符合ESCs的表现。（2）不同浓度PRP对ESCs增殖的影响:①PRP制备结果:正常全血血小板浓度（280.67±54.56）×109/L,PRP 血小板浓度（1195.00±262.50）×109/L,PRP中血小板浓度大于常规血液4倍。②CCK-8结果:在0-10%体积浓度范围内,随着浓度增加PRP促进ESCs增殖能力增强,但增加至一定浓度后,10%与20%（Vol/Vol）体积分数相比,PRP促进ESCs增殖的能力无明显统计学差异。（3）PRP对热损伤ESCs生物学行为的影响:①流式细胞术结果:热损伤后24小时,PRP组凋亡率明显少于对照组（9.77±0.47%,31.07±0.72%,P<0.05）,PRP抑制热损伤ESCs的凋亡。②CCK-8结果:热损伤后48小时,PRP组细胞吸光度值明显高于对照组（0.49±0.01,0.23±0.01,P<0.05）,PRP促进热损伤ESCs的增殖。③细胞划痕实验结果:PRP组迁移面积优于对照组（86.19±1.90,71.49±5.31,P<0.05）,PRP促进热损伤ESCs的迁移。④Western blot结果:热损伤后24小时,ESCs中pAKT表达减少,PRP组中pAKT的表达较热损伤组增加,加入PI3K抑制剂LY294002阻断PI3K/AKT通路后,PRP上调pAKT表达的作用减弱。⑤流式细胞术结果:加入PI3K抑制剂LY294002后PRP抑制热损伤 ESCs 凋亡的作用减弱（9.77±0.47%,30.90±1.31%,P<0.05）。⑥CCK-8结果:加入PI3K抑制剂LY294002后PRP促进热损伤ESCs增殖的作用减弱（0.49±0.01,0.25±0.02,P<0.05）。2.PRP调节ESCs修复猪深二度烧伤创面的实验研究（1）猪深二度烧伤模型的建立:①猪深二度烧伤模型建立成功。烧伤后24小时,H&E染色观察到表皮层及真皮层的细胞和胶原纤维变性,坏死。HMGB1染色在汗腺及毛囊周围细胞质及细胞间隙中有阳性结果,热损伤侵及真皮深层。②PRP制备:PRP中平均血小板含量为（1123.83±94.65）×109/L,正常血液中血小板含量为（356.50±26.63）×109/L,PRP中血小板含量多于全血含量的3倍。（2）PRP对猪深二度烧伤创面愈合的影响:①创面愈合时间比较:PRP组创面平均愈合时间为（16.67±1.75）天,短于对照组（19.33±1.63）天（P<0.05）。②皮肤厚度与结构比较:PRP组表皮层厚度为（100.47±19.03）μm,较对照组（82.10±16.09）μm增加（P<0.05）,且PRP组表皮层次更加分明。PRP组真皮层厚度为（2060.00±163.16）μm,对照组为（1996.67±244.22）μm,其差异无统计学意义（P=0.24）。（3）PRP对猪深二度烧伤创面细胞生物学活性的影响:①Ki67（+）染色评分结果:烧伤后第1,2周PRP组与对照组Ki67（+）增殖细胞平均评分分别为（2.50±0.51,1.90±0.66,P<0.05）,（3.30±0.47,2.83±0.75,P<0.05）,差异有统计学意义,PRP促进创面细胞增殖。②CK19（+）染色评分结果:烧伤后第1,2周PRP组与对照组CK19（+）增殖细胞平均评分分别为（0.73±0.69,0.23±0.43,P<0.05）,（2.10±0.66,1.37±0.89,P<0.05）,PRP 促进创面 ESCs 的增殖。③TUNEL染色评分结果:烧伤后第1周PRP组与对照组凋亡细胞平均评分分别为（1.03±0.77,2.40±0.62,P<0.05）,PRP抑制创面细胞凋亡。④Western blot结果:烧伤后第1周,PRP上调创面pAKT的表达。（4）PRP对猪深二度烧伤创面血管形成的影响:α-SMA（+）血管评分结果:烧伤后第1,2周PRP组与对照组α-SMA（+）血管平均评分分别为（1.60±0.68,0.57±0.63,P<0.05）,（2.53±0.73,1.83±0.65,P<0.05）,PRP 促进创面血管形成。（5）PRP对猪深二度烧伤创面微环境改变的影响:ELISA结果:烧伤后第1,2 周 PRP 组与对照组 EGF 表达分别为（643.14±61.81,331.56±63.70,P<0.01）（pg/ml）,（801.13±88.08,622.59±19.59,P<0.01）（pg/ml）;bFGF 表达分别为（510.56±56.77,276.13±22.90,P<0.01）（pg/ml）,（757.07±68.23,558.65±70.85,P<0.01）（pg/ml）;VEGF 表达分别为（808.45±49.51,314.16±93.23,P<0.01）（pg/ml）,（1104.32±120.80,802.73±37.45,P<0.01）（pg/ml）,PRP 组生长因子表达水平高于对照组,PRP通过上调生长因子的表达改变创面微环境。3.PRP修复中厚皮片供皮区创面愈合的临床研究（1）患者分组:①两组分别收集病例15例,患者年龄、性别、供皮区创面面积无明显差异。②PRP制备结果:在分组1中患者全血标本血小板含量为（231.80±67.98）×109/L,制备 PRP 中血小板含量为（954.53±329.93）×109/L。PRP中平均血小板含量高于全血标本4倍。在分组2中阿司匹林组患者全血标本血小板含量为（244.27±52.73）×109/L,制备PRP中血小板含量为（984.33±329.93）×109/L。PRP中平均血小板含量高于全血标本4倍。（2）PRP对供皮区创面ESCs增殖的影响:CK19染色评分结果:PRP组与对照组CK19（+）细胞平均评分分别为（1.03±0.67,0.67±0.55,P<0.05）,PRP促进供皮区创面ESCs的增殖。（3）PRP对供皮区创面愈合的影响:①愈合时间的比较:PRP组供皮区愈合时间为（17.47±2.17）天,对照组愈合时间为（20.60±3.40）天,PRP组供皮区愈合时间明显短于对照组（P<0.01）。②VAS评分比较:术后第7、10、14天换药时PRP与对照组疼痛评分（VAS）分别为（5.67±0.98,7.33±0.90,P<0.01）、（3.20±0.86,4.33±0.72,P<0.01）、（1.00±0.54,1.67±0.72,P<0.01）,PRP 组疼痛评分明显低于对照组,PRP减轻换药疼痛。③VSS评分比较:术后1月PRP组愈合创面VSS评分为（5.60±1.45）,低于对照组VSS评分（7.87±2.01）（P<0.05）;术后3月PRP组愈合创面VSS评分为（3.93±1.94）,低于对照组VSS评分（5.87±2.42）（P<0.05）,PRP减轻创面瘢痕形成。（4）阿司匹林对PRP作用的影响:①愈合时间比较:阿司匹林组创面愈合时间为（18.00±1.77）天,对照PRP组为（17.47±2.17）天,两组差别无统计学意义（P=0.47）,阿司匹林不影响PRP促进创面愈合的作用。②术后1月对照PRP组愈合创面VSS评分为（5.60±1.45）,阿司匹林组VSS评分（6.40±1.06）,两组差异无统计学意义（P=0.10）;术后3月对照PRP组愈合创面VSS评分为（3.93±1.94）,阿司匹林组VSS评分为（4.87±1.51）,两组VSS评分无明显差异（P=0.15）。③服用阿司匹林（100 mg/天）不会增加供皮区创面的出血风险。结论1.体外条件下,自体PRP能够促进ESCs的增殖,10%体积浓度为适宜浓度。2.体外条件下,PRP能够促进热损伤ESCs的增殖和迁移,抑制其凋亡。3.体外条件下,PRP通过PI3K/AKT通路上调热损伤ESCs中pAKT的表达,发挥其调节热损伤ESCs生物学行为的作用。4.体内条件下,PRP能够促进深二度烧伤创面ESCs的增殖,抑制细胞凋亡,上调pAKT的表达,改变创面微环境中生长因子（EGF,bFGF,VEGF）的表达。5.体内条件下,PRP能够促进猪深二度烧伤创面血管形成。6.自体PRP能够促进猪深二度烧伤创面愈合,提高愈合质量。7.自体PRP能够促进人中厚皮片供皮区ESCs增殖,缩短创面愈合时间,缓解创面换药疼痛,减轻中厚皮片供皮区创面愈后瘢痕,促进供皮区创面愈合。8.口服抗血小板药物阿司匹林不影响PRP促进创面愈合的作用,不增加供皮区创面出血风险。
李建德[3]（2021）在《小鼠角膜碱烧伤及雷帕霉素对其修复的机制研究》文中进行了进一步梳理眼角膜暴露于外部环境,极有可能受到各种损伤。角膜化学损伤占眼科急诊的11.5%至22.1%,其中,碱烧伤通常比其他类型的损伤更严重,这是由于碱试剂亲脂性的特征使其能迅速穿透组织,造成更为严重的创伤。即使采取及时的临床治疗,大多也会由于伤口愈合过程中形成角膜瘢痕和新生血管而造成永久性失明。因此,角膜的碱烧伤修复不仅是基础科学研究的热点,也是一个急需解决的重要医学问题。然而,大量的研究多集中在药物对角膜碱烧伤的影响上,对损伤引起的系统性应答机制研究较少,不利于靶点药物的筛选。角膜碱烧伤引发的应答是一个复杂的级联反应,涉及细胞因子介导下的角膜上皮细胞、基质细胞和免疫细胞之间的相互作用,其中最为重要的是损伤引起的角膜血管新生、纤维化和严重的炎症反应。近年来,雷帕霉素（Rapamycin,Rapa）被发现具有抗角膜损伤引起的纤维化和血管生成作用,但其介导哺乳动物雷帕霉素靶点（Mammalian target of Rapa,m TOR）调节角膜血管新生的机制研究甚少。本研究通过建立小鼠角膜碱烧伤模型,采用Hematoxylin&Eosin（H&E）染色、免疫荧光染色、实时定量聚合酶链式反应（Quantitative real-time polymerase chain reaction,q RT-PCR）、亚硫酸氢钠测序PCR（Bisulfite sequencing PCR,BSP）、电泳迁移率实验（Electrophoretic mobility shift assay,EMSA）、蛋白免疫印迹法（Western blot,WB）、流式细胞术（Flow cytometry,FCM）和酶联免疫吸附测定（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）技术,从形态、组织和分子水平,确定小鼠角膜碱烧伤及Rapa干预下血管生成的DNA甲基化调控机制、转录因子调控机制、MAPK/ERK1/2和PI3K/AKT信号通路调控机制、以及角膜碱烧伤引起的机体免疫应答与药物干预下的修复机制,得到以下结论:Ⅰ.碱烧伤引起的小鼠角膜浑浊化及Rapa干预下血管生成的DNA甲基化调控、转录因子调控、及MAPK/ERK1/2和PI3K/AKT信号通路调控:1.碱烧伤引发血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）介导的血管新生,并诱导静止的角质细胞分化为成纤维细胞,成纤维细胞表达α-平滑肌肌动蛋白（Alpha-smooth muscle actin,α-SMA）转化为肌成纤维细胞导致角膜纤维化。Rapa通过降低VEGF和α-SMA介导的血管生成和角膜纤维化,减轻角膜碱烧伤引起的损伤。2.碱烧伤诱导的角膜细胞增殖主要来自于基质细胞,而Rapa诱导的损伤角膜细胞增殖主要来自于上皮细胞。此结果显示出Rapa作为治疗角膜碱烧伤备选药物的可行性:能有效促进损伤角膜上皮细胞的增殖以达到修复创伤面的目的,并可能抑制因损伤引起的基质细胞增殖,保证了角膜基质的均一性和良好的光线折射性。3.小鼠角膜碱烧伤可诱导DNA甲基转移酶3b（DNA methyltransferases 3b,Dnmt3b）表达升高并介导m TOR基因启动子发生从头DNA甲基化修饰,而Rapa通过抑制Dnmt3b的表达降低碱烧伤诱导的甲基化。这种调控机制在如碱烧伤类的损伤中主要借助于基因启动子区一些关键的Cp Gs位点实现其对转录水平的影响。4.转录因子ETS变体5（The transcription factor ETS-variant 5,ETV5）结合在Rapa诱导的m TOR基因去甲基化位点并负调控基因表达,在角膜碱烧伤后的Rapa修复中发挥重要作用。5.小鼠角膜碱烧伤模型中,损伤诱导PI3K/AKT/m TOR信号通路活化和低氧诱导因子-1α（Hypoxia-inducible factor-1alpha,HIF-1α）高调,引起VEGF高表达。因此得到一条角膜碱烧伤引起的血管生成调控轴:PI3K/AKT/m TOR/HIF-1/VEGF。6.MAPK/ERK1/2和PI3K/AKT信号通路通过m TOR分子调控VEGF的表达,因此,对以上通路的联合抑制,有利于血管生成疾病的治疗。Ⅱ.小鼠角膜碱烧伤及Rapa干预下的免疫应答:1.角膜碱烧伤引起包括巨噬细胞和中性粒细胞在内的白细胞浸润,它们通过角膜缘迁移进入基质,释放白介素1α（Interleukin-1α,IL-1α）和肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor-alpha,TNF-α）,启动Toll样受体4（Toll-like receptor 4,TLR4）和NOD样受体家族3（Nucleotide binding oligomerization domain-like receptors,NLRP3）炎症信号通路,招募基质金属蛋白酶-2（Matrix metalloproteinases-2,MMP-2）,发展了损伤角膜的急性炎症反应和与之相关的血管生成。Rapa通过抑制白细胞的浸润和炎症因子的表达降低了碱烧伤引起的角膜炎症反应和炎症相关的血管生成。2.Rapa促进角膜中碱烧伤诱导的CD4+T细胞向CD4+CD25high Treg细胞转化。
张云峰[4]（2021）在《促绵羊iPSC生成效率的miRNAs筛选与评价及向雌性PGC样细胞定向分化研究》文中研究表明绵羊是一种非常重要的家养动物,利用基因修饰手段来改良或育种是一个方向。目前利用转基因技术进行分子育种,存在较难控制外源基因与效率较低等问题。基于小鼠胚胎干细胞（ESC）的基因打靶技术能进行精确有效的敲入或敲出。由于绵羊ESC很难分离获得,利用同样具有多能性的诱导多能干细胞（iPSC）代替ESC进行精确遗传工程操作成为目前急需解决的问题。目前绵羊的iPSC存在诱导效率低,难以获得完全重编程的iPSC的问题。microRNA是基因表达转录后的调节器,研究证明ESC特异性的miRNAs能促进体细胞重编程。因此,筛选能促绵羊体细胞重编程的miRNAs,并探讨其重编程机制,有望建立一种高效获得绵羊iPSC的体系,对优质绵羊培育具有应用价值,也为获得绵羊ESC奠定基础。生殖细胞是唯一将基因组和表观遗传信息传递给下一代的细胞谱系,但在体外重建生殖细胞发育一直是生物学研究的挑战。随着小鼠多能干细胞在体外可以分化为原始生殖细胞样细胞（PGCLC）,进而发育为卵母细胞并能进行生殖系传代,为绵羊多能干细胞在体外生产PGC提供了理论依据和方法。研究绵羊iPSC定向分化为雌性PGCLC,为绵羊PGC的发育研究可以提供一种细胞模型,为后期分化为功能卵子奠定了基础,对提高绵羊优质配子利用,加快畜群的改良速度具有重要的应用价值。目的:（1）筛选出能促进绵羊体细胞重编程的microRNA;（2）初步探索microRNA在绵羊体细胞重编程过程中的机制;（3）建立一种利用绵羊iPSC诱导分化为原始生殖样细胞的方法。方法:（1）组织块法分离培养妊娠45d左右的绵羊胎儿肾细胞（SKC）,作为重编程的起始细胞;胰酶消化法分离CF-1小鼠胎儿成纤维细胞（MEF）,丝裂霉素C处理后,作为诱导绵羊iPSC的饲养层细胞。（2）结合文献报道和数据库综合分析在小鼠和人干细胞中高表达或可促进重编程的miRNAs,筛选出可能促绵羊体细胞重编程的miR302/367簇、miR200b-200a-429簇、miR200c-141簇,并包装慢病毒;同时将Oct4、Klf4、Sox2、c-Myc、Nanog、Lin28、SV40T、h TERT等八种人源转录因子包装慢病毒;利用不同慢病毒感染SKC进行诱导重编程,通过碱性磷酸酶（AP）染色统计诱导效率,筛选出可促进绵羊体细胞重编程的最优miRNA;并对获得的绵羊iPSC从AP染色、实时定量PCR、细胞免疫荧光、核型分析、甲基化测序分析、拟胚体分化这几个方面进行鉴定。（3）利用miRbase和Target Scan等生物信息平台预测miR-200c靶基因,并送公司合成oar-miR-200c模拟物、抑制物和阴性对照;设计引物,克隆靶基因结合位点的3’UTR区及突变3’UTR,构建ZEB1和TWISTNB靶基因的双荧光素酶报告分析载体。（4）通过oar-miR-200c mimics转染细胞,利用荧光素酶报告载体分析与靶基因的作用;利用qRT-PCR检测靶基因的转录水平;利用Western blot检测靶基因的蛋白水平;探讨oar-miR-200c在绵羊体细胞重编程过程的作用机制。（5）设计引物,扩增克隆绵羊生殖相关基因DAZL和BOULE,并构建慢病毒载体PLVX-Dazl和PLVX-Boule,并进行包装慢病毒。（6）组织块法分离培养原代绵羊卵巢细胞;DAZL和BOULE慢病毒感染绵羊iPSC,建立转基因绵羊iPSC;通过摸索培养体系和条件,利用绵羊iPSC定向分化原始生殖细胞;利用qRT-PCR检测绵羊生殖细胞特异因子的转录水平,利用Western blotting检测生殖细胞特异因子的蛋白水平。结果:（1）成功分离绵羊体细胞SKC,其表达角蛋白CK18;成功分离小鼠CF-1MEF细胞,并制备饲养层细胞,能很好的支持siPSC生长。（2）筛选的三个miRNA簇,成功包装miRNA慢病毒;成功包装8种转录因子的慢病毒;慢病毒感染绵羊SKC后,通过诱导效率比较分析,筛选出miR-200c-141簇可将重编程效率提高到0.95%;获得的绵羊iPSC经鉴定呈阳性;（3）成功构建miR-200c靶基因ZEB1和TWISTNB的双荧光素酶报告载体;（4）双荧光素酶报告分析,oar-miR-200c靶向ZEB1和TWISTNB的3’UTR;qRT-PCR和Western blotting检测oar-miR-200c可显着降低ZEB1和TWISTNB基因的表达,但可增加E-cadherin的表达;oar-miR-200c通过对TGF-β信号通路的影响,提高MET转化,从而提高绵羊体细胞重编程效率;（5）成功构建绵羊生殖相关基因慢病毒载体LVX-Dazl-F2A-mcherry-IRES-NEO和PLVX-Boule-F2A-mcherry-IRES-NEO,并成功包装慢病毒;（6）成功建立稳转Dazl和Boule基因的绵羊iPSC,在培养液中添加Activin A、bFGF、BMP4、LIF、EGF等因子及卵巢细胞培养上清,可使绵羊iPSC分化为PGC样细胞,分化第八天可表达生殖相关标记蛋白PRDM1、PRDM14和VASA,其基因Dazl、Boule、Prdm14和Vasa的mRNA转录呈高水平状态。结论:（1）成功筛选出miR-200c-141可以促进绵羊体细胞重编程为iPSC;（2）oar-miR-200c靶向Zeb1和Twist NB基因的3’UTR,显着降低Zeb1和Twist NB表达水平,增加E-cadherin的表达;oar-miR-200c通过对TGF-β信号通路的影响,提高MET转化,从而提高绵羊体细胞重编程效率。（3）利用生殖系相关基因DAZL和BOULE的慢病毒感染绵羊iPSC,在添加activin A、b FGF、BMP4、LIF、EGF等因子的条件下,可以将绵羊iPSC诱导分化为原始生殖样细胞。
邓亚鹏[5]（2021）在《富血小板血浆联合体外冲击波治疗低氧环境下兔跟腱病的实验研究》文中研究指明目的:跟腱病是常见的临床疾病和运动损伤疾病之一,过度使用造成跟腱损伤退变是其主要原因,表现为局部疼痛和功能受损,严重影响患者的工作和生活。富血小板血浆（Platelet-Rich Plasma,PRP）和体外冲击波（Extracorporeal Shock-Wave,ESW）是肌腱病治疗的可选方案,各具优势及良好的应用前景,但两种治疗方法疗效缺乏稳定性,本研究拟通过筛选ESW治疗兔跟腱病的最佳治疗参数,将PRP生物治疗与ESW物理治疗相结合,探索跟腱病治疗的最佳方案,并验证进一步推广至低氧环境下兔跟腱病治疗的有效性,以期为临床肌腱病治疗提供一种新的可替代方案。方法:本实验由三部分组成1.ESW治疗兔跟腱病模型最佳能量参数评价和筛选:（40）型胶原酶注射构建双侧兔跟腱病模型,造模成功后按照试验预设的体外冲击波治疗（Extracorporeal Shock-Wave Therapy,ESWT）能量参数（1.0bar、1.5bar、2.0bar和2.5bar）随机将实验兔分为4组,各组选择相同脉冲次数2000脉冲和脉冲频率10Hz间隔5天治疗3次,治疗完成观察4周后进行兔跟腱超声、组织H&E染色、TEM（Transmission Electron Microscope,透射电镜）扫描评价ESWT对跟腱胶原纤维的排列与分布的影响;生物力学性能检测评价跟腱最大拉伸断裂载荷及刚度;RT-PCR检测其基质胶原蛋白、生长因子和炎症因子的相对表达量,采用统计学分析比较不同能量水平ESW治疗结果从而筛选出最佳能量参数。2.ESW治疗兔跟腱病模型最佳脉冲数参数评价和筛选:以上部分实验筛选的ESW治疗兔模型跟腱病的最佳能量参数为依据,兔跟腱病模型构建成功后,依据试验预设的ESWT脉冲数参数（500脉冲、1000脉冲、1500脉冲和2000脉冲）随机将实验兔分为4组,以相同能量和脉冲频率10Hz间隔5天治疗3次,治疗完成观察4周后进行兔跟腱超声、组织H&E染色、TEM、生物力学性能检测和RT-PCR检测评价跟腱愈合结果,采用统计学分析比较不同脉冲数ESW治疗效果从而筛选出最佳脉冲数参数。3.超声引导下PRP注射联合ESW治疗对模拟高原低氧环境下兔跟腱病修复能力的研究:选择12只实验兔,其中4只为空白对照组,另外8只实验兔选择左侧后肢行超声引导下PRP注射联合ESW治疗,作为空白联合治疗组;选择32只实验兔随机分为4组,其中3组在常氧环境下（40）型胶原酶注射构建双侧兔跟腱病模型,造模成功后分为ESW治疗组、超声引导下PRP注射治疗组、超声引导下PRP注射联合ESW治疗组完成兔模型跟腱病治疗;剩余1组在模拟高原低氧环境下（模拟海拔5500米高原环境）（40）型胶原酶注射建立兔双侧跟腱病模型,建模成功后完成超声引导下PRP注射联合ESW治疗。以前部分实验筛选的最佳能量参数和最佳脉冲数以及脉冲频率10Hz为ESW治疗参数,间隔5天治疗3疗程;PRP注射联合ESWT模式为在第一疗程ESW治疗完成后24小时进行跟腱及跟腱周围PRP注射,之后4天后完成第2疗程ESW治疗,之后间隔5天后完成第3疗程ESW治疗。治疗完成观察4周后完成各项指标检测并进行统计学分析（同摘要方法1）,通过比较超声引导下PRP注射联合ESW治疗、单独超声引导下PRP注射以及单独ESW治疗对兔跟腱病模型的组织修复能力,评价超声引导下PRP注射联合ESW的治疗效果;通过评价PRP注射联合ESWT对正常跟腱的影响探讨PRP联合ESW治疗的安全性;并进一步评价超声引导下PRP注射联合ESWT在高原低氧环境下对兔跟腱病模型的治疗效果,探究PRP注射联合ESWT对模拟高原环境下兔跟腱病治疗的有效性。结果:1.1.5bar能量水平ESW治疗对兔跟腱病组织修复能力最强,超声弹性评价结果显着改善（P<0.001）、极限拉伸载荷值表现出更大的趋势（P=0.00）、TEM检测发现胶原原纤维平均截面积明显较大（P<0.0001）,总胶原原纤维和>0.1（?）m直径胶原原纤维体积比增加（P<0.01）,组织H&E染色评价明显优于其他能量水平组（P<0.05）,胶原蛋白Collagen（40）,生长因子b FGF、VEGF和TGF-β表达显着上调。2.1000脉冲数ESW治疗对兔跟腱病组织修复能力最强,超声弹性评价值显着增加（P<0.0001）,极限拉伸载荷值显着增大（P<0.05）,较1500脉冲数组有较大趋势（P>0.05）,胶原原纤维平均截面积和体积比明显增大（P<0.001）,组织切片H&E染色综合评分明显改善（P<0.05）,明显上调了胶原蛋白Collagen（40）和生长因子b FGF、VEGF和TGF-β表达（P<0.05）。3.ESW联合PRP治疗能够有效协同促进兔跟腱病跟腱组织修复,较单独ESW治疗和单独PRP治疗表现出更好的超声截面积改善程度（P=0.009）,剪切波弹性值明显增加（P<0.05）,超声结构和血流信号有更好的改善趋势（P>0.05）,组织极限拉升载荷显着增大（P<0.05）,总胶原原纤维和>0.1（?）m直径的胶原原纤维截面积及直径明显增加（P<0.05）,组织学评分显着优于其他干预组（P<0.05）,胶原蛋白Collagen（40）和生长因子b FGF、VEGF和TGF-β表达显着上调（P<0.05）,胶原蛋白Collagen III和炎症因子TNF-α、IL-10显着下调（P<0.05）。通过正常跟腱与PRP联合ESWT对正常跟腱组织干预后结果比较,评价PRP联合ESWT治疗的安全性发现,联合治疗后正常跟腱组织超声截面积轻度增加,结构无明显损伤,血流轻度改善,剪切波弹性值、组织极限拉伸载荷和组织刚度与正常跟腱无差异（P>0.05）,>0.1（?）m直径的胶原原纤维截面积较正常跟腱明显增加（P<0.05）,组织学评分最低,但与M&EP组无显着差异（P>0.05）,胶原蛋白Collagen（40）表达最高（P<0.05）,生长因子（b FGF、VEGF和TGF-β）低表达。PRP联合ESW治疗应用于模拟高原低氧环境下兔跟腱病治疗的适用性研究表明其对跟腱病修复能力明显受限,各项检测结果明显差于常氧环境下ESWT联合PRP治疗组（P<0.05）,但优于模型组结果（P<0.05）。结论:ESWT治疗兔跟腱病的最佳治疗参数为1.5bar、1000脉冲数。相比于单独超声引导下PRP注射和单独ESW治疗,PRP注射联合ESW治疗更能促进兔跟腱病模型跟腱的愈合,且无明显组织损伤作用,是肌腱病治疗的更优选择。此外,PRP注射联合ESWT治疗对模拟高原低氧环境下兔跟腱病的修复能力受限。
刘振辉[6]（2021）在《仿生导电人工神经支架的研究》文中进行了进一步梳理目的:（1）制备具有导电功能的多微通道多壁碳纳米管琼脂糖导电支架,并对其进行表征,验证其生物相容性,利用支架进行细胞三维立体培养,研究电刺激对RSC96细胞生长的影响。（2）制备具有取向性纳米纤维的PLLA纤维膜,并对其进行表征,验证其生物相容性,研究纤维取向性对RSC96细胞信号蛋白的影响。（3）制备仿生导电人工神经支架,将支架植入大鼠坐骨神经缺损,探讨仿生导电人工神经支架对大鼠坐骨神经修复效果和机制。方法:（1）利用梯度冷冻和冷冻干燥技术制备出具有多微通道多壁碳纳米管琼脂糖导电支架。通过微结构、溶胀和脱溶涨、导电率、形状记忆功能、载药及药物释放性能、力学性能和生物相容性对制备的多微通道多壁碳纳米管琼脂糖导电支架进行表征,对三维立体培养的RSC96细胞进行组织学评价,观察不同培养条件下细胞生长行为。（2）利用静电纺丝技术制备出具有取向纳米纤维的PLLA纤维膜。通过扫描电镜、力学性能、降解性和生物相容性对制备的PLLA纤维膜进行表征。利用免疫荧光技术研究纤维取向性对RSC96细胞ERK、P38MAPK、MEK和LRP4蛋白的影响。（3）利用定制的模具制备多微通道导电支架,将第二部分制备的高取向PLLA纤维膜和定制的多微通道导电支架组合成仿生导电人工神经支架,并将神经支架植入到大鼠坐骨神经缺损处。将实验动物分为支架组（S）、支架联合电刺激组（S&E）和自体神经移植组（AT）,通过坐骨神经功能指数、神经电生理检测、肌肉组织学检测、再生神经的组织学检测来分析仿生导电神经支架对周围神经再生的影响。结果:（1）加入的多壁碳纳米管没有影响琼脂糖支架的孔隙组成比和形状记忆功能,但0.025%wt多壁碳纳米管提高了支架在溶胀平衡状态下的溶胀率和保水能力。多壁碳纳米管改变了琼脂糖支架的电导率、载药及药物释放能力和力学性能。高浓度多壁碳纳米管对RSC96细胞和PC12细胞的增殖有一定影响。电镜下PC12细胞在多壁碳纳米管琼脂糖支架上生长状态良好。多壁碳纳米管的加入未改变RSCs细胞的S100β表达量。当电刺激存在时,RSC96细胞层沿支架纵轴排列较好,0.025%MWCNT-琼脂糖支架和0.05%MWCNT-琼脂糖支架表现出更好的细胞黏附性。（2）制备的PLLA纤维膜为多孔结构,纤维大部分为取向排列,高取向纤维膜的纤维取向性更高,其表面光滑,粗细均匀,纤维间形成立体的三维孔隙并分布于整个纤维膜。取向PLLA纤维膜的拉伸强度为（59.06±2.49）MPa,取向PLLA纤维膜的拉伸强度为（56.82±2.80）MPa,两种纤维膜拉伸强度没有统计学差异;取向PLLA纤维膜的杨氏模量为（1037.07±133.30）MPa,高取向PLLA纤维膜的杨氏模量为（971.45±112.39）MPa,两种纤维膜杨氏模量没有统计学差异;取向PLLA纤维膜的断裂伸长率为364.48±53.79,高取向PLLA纤维膜的断裂伸长率为356.89±40.21,两种纤维膜断裂伸长率没有统计学差异。增加PLLA纤维膜的取向,并未明显改变纤维膜的拉伸强度、杨氏模量和断裂延伸率。改变纤维膜的纤维取向程度,对PLLA纤维膜的降解速率没有影响。取向PLLA纤维膜和高取向PLLA纤维膜对RSC96细胞的增殖均没有影响。和取向性纤维膜相比,高取向的PLLA纤维膜上的RSC96细胞呈现出现明显的丝状伪足,沿着排列整齐的纳米纤维延伸。和取向性PLLA纤维膜相比,高取向PLLA纤维增加了RSC96细胞ERK、P38 MAPK、MEK和LRP4蛋白表达量（P<0.01）。（3）制备的仿生导电人工神经支架跟大鼠坐骨神经匹配良好,植入神经缺损出未见异物反应。S&E组坐骨神经功能指数、神经电生理结果、肌肉组织学结果、轴突和髓鞘再生效果接近AT组,好于S组。术后12周时免疫组化结果显示,NF-H蛋白和S00-β蛋白表达,S&E组和AT组的高于S组（P<0.01）,而S&E组接近AT组。LRP4蛋白和P38MAPK蛋白表达,AT组高于S组（P<0.01）,但AT和S&E组,S&E组和S组相比均无差异无统计学意义。ERK蛋白和MEK蛋白表达情况,AT组高于S组和S&E组（P<0.01）,S&E组和S组两者相比差异无统计学意义。结论:（1）多壁碳纳米管琼脂糖支架具有高的孔隙率、一定的形状记忆功能、载药及药物释放能力、导电能力,良好的生物相容性。在电刺激存在时,具有导电性能的多壁碳纳米管琼脂糖支架对RSC96细胞生长具有引导作用。（2）和取向性的PLLA纤维膜相比,高取向性的PLLA纤维膜未改变其力学性能、降解性和生物相容性,但增加了ERK、P38 MAPK、MEK和LRP4蛋白的表达量,能引导RSC96细胞生长和迁移,这有利于其在周围神经再生中的应用。（3）仿生导电人工神经支架联合电刺激能够增强周围神经再生。电刺激可能通过ES通过与MAPK信号通路的激活促进周围神经再生,ERK、P38MAPK、MEK和LRP4可能参与周围神经再生。
雷文艺[7]（2021）在《CO2点阵激光联合rb-bFGF治疗萎缩性痤疮瘢痕的临床疗效观察》文中研究说明目的:评估CO2点阵激光联合重组牛碱性成纤维细胞生长因子（rb-bFGF）凝胶治疗萎缩性痤疮瘢痕的临床疗效及不良反应。方法:入选29名面部患有不同程度的萎缩性痤疮瘢痕的患者。采取同一患者治疗前后自身对照研究。洁面、局麻后采用KL型CO2点阵激光治疗仪（吉林省科英激光技术有限责任公司）对患者面部萎缩性痤疮瘢痕进行治疗,治疗过程中观察并记录不良反应。治疗后立刻于治疗区域均匀、足量涂抹rb-bFGF凝胶,1个月治疗1次,共治疗3次。每次治疗结束后,嘱患者自行涂抹rb-bFGF凝胶1周,每天3次。使用VISIA皮肤检测仪（Canfield公司,美国）采集患者正面图像资料,检测纹理、毛孔、棕斑、红斑等指标,客观评估治疗效果。由2名未参与治疗的固定皮肤科医师在治疗前、第一次治疗后1个月、第二次治疗后1个月、疗程结束后1个月及疗程结束后3个月根据ECCA权重评分表及IGA量表评估患者ECCA值和IGA临床改善情况。患者术中疼痛、满意度通过患者问卷调查进行评分。结果:29例患者中27例患者完成治疗和随访,女性13名（48.1%）,男性14名（51.9%）。患者年龄20-35岁,平均25.8±4.6岁,痤疮瘢痕持续时间1.5-12年,平均6.7±5.6年。17名（63.0%）患者为Fitzpatrick Ⅲ型皮肤,10名（37.0%）为Fitzpatrick Ⅳ型皮肤。完成治疗和随访的27名痤疮瘢痕患者治疗前痤疮瘢痕严重程度ECCA平均值为62.4±18.3,疗程结束后3个月ECCA平均值下降到33.5±16.5,且差异学具有统计学意义（P<0.05）。痤疮瘢痕IGA疗效评价显示疗程结束后1个月有效率为44.4%,疗程结束3个月有效率为63.0%,有效率随着治疗次数的增加呈上升趋势。VISIA皮肤定量检测疗程结束后纹理、毛孔指标均较治疗前明显改善,且差异具有统计学意义（P<0.05）。27名患者中,16名患者（59.3%）有轻度疼痛,11名患者（40.7%）有中度疼痛,VAS平均分为3.65±0.58分。疗程结束后3个月,患者满意度为85.2%。CO2点阵激光治疗后,所有患者均出现不同程度的红斑、肿胀、灼热、结痂,灼热感在术后24小时内消退,红斑、肿胀在3-5天后逐渐消退,痂皮在5-7天内脱落,误工期5-7天。2名患者出现一过性炎症后色素沉着。在疗程结束后3个月的随访中,未出现感染,未观察到明显的增生性瘢痕、色素沉着或色素减退。结论:CO2点阵激光联合rb-bFGF治疗萎缩性痤疮瘢痕临床疗效确切。治疗后未发生严重不良反应,虽误工期相对较长,但患者满意度高,是一种安全有效的治疗萎缩性痤疮瘢痕的方法。
张开华[8]（2020）在《局部外用表皮生长因子促进糖尿病足溃疡创面愈合的临床研究》文中提出第一部分表皮生长因子联合纳米银敷料促进糖尿病足溃疡创面愈合的临床研究目的:探究表皮生长因子联合纳米银敷料促进糖尿病足溃疡创面愈合的临床效果。方法:筛选2017-06至2020-06南昌大学第二附属医院收治的120例糖尿病足部溃疡患者,均自愿参与本实验并签署知情同意书。采用随机表法将120例患者随机分为4组:表皮生长因子组30例、纳米银敷料组30例、联合组30例、生理盐水对照组（生理盐水为常规治疗方式）30例。表皮生长因子组每次换药时使用重组人表皮生长因子40IU/平方厘米;纳米银敷料组每次换药给予外用纳米银敷料,联合组使用表皮生长因子和纳米银敷料;其余治疗（生理盐水常规治疗方式）四组均相同。对照组仅用生理盐水进行常规治疗。各组都给予隔日换药一次,观察创面修复到各愈合阶段所需时间,愈合阶段分创面表皮愈合率及肉芽组织生长程度进行分级。治疗2周和4周后分别对创面渗出液进行细菌培养。结果:4组病例达到治疗有效阶段（1级）的时间无明显差异。与对照组相比,表皮生长因子组和联合组达到创面修复2、3级的时间更短,差异有显着性（P<0.05）;且联合组的创面修复时间比表皮生长因子组更短（P<0.05）。纳米银敷料组的创面修复时间比对照组短,但差异无显着性（P>0.05）。结论:在临床显效期内,四组的创面愈合效果无明显差异,在此期后使用表皮细胞生长因子能促进创面愈合,纳米银敷料对创面愈合有积极影响但效果不够明显;联合使用重组表皮生长因子和纳米银敷料则具有明显良好的促进创面愈合效果且能有效预防感染的发生。第二部分表皮生长因子联合酸性成纤维细胞生长因子治疗糖尿病足创面的临床研究目的:探究表皮生长因子联合酸性成纤维细胞生长因子对糖尿病足创面的愈合影响。方法:筛选2018-02至2020-02南昌大学第一附属医院烧伤科创面治疗中心及南昌大学附属九江医院普外科收治的80例糖尿病足部溃疡患者,均自愿参与本实验并签署知情同意书。采用随机表法将80例患者随机分为4组:重组人表皮生长因子组20例、酸性成纤维细胞生长因子组20例、生长因子联合组20例、桐叶烧伤油对照组（桐叶烧伤油为常规治疗方式）20例。各组患者在接受创面治疗期间,均将空腹血糖控制在11.1mmol/L以下,伴感染者使用相应抗生素治疗至感染完全控制,创面清创、清洗、去除病理性肉芽。联合用药组每次给予外用重组人表皮生长因子40IU/平方厘米,外用酸性成纤维细胞生长因子100/平方厘米,其余治疗（桐叶烧伤油常规治疗方式）同对照组;重组人表皮生长因子组每次单纯给予外用重组人表皮生长因子40IU/平方厘米,其余治疗（桐叶烧伤油常规治疗方式）同对照组;酸性成纤维细胞生长因子组每次给予外用酸性成纤维细胞生长因子100U/平方厘米,其余治疗（桐叶烧伤油常规治疗方式）同对照组;桐叶烧伤油对照组仅用桐叶烧伤油进行常规治疗（以桐叶烧伤油浸泡纱布,将油纱敷于创面,主要为创面保湿及收敛创面作用,是临床上常规创面换药方式）。各组都给予每日换药一次,观察创面修复到各愈合阶段所需时间,愈合阶段分创面表皮愈合率及肉芽组织生长程度进行分级。结果:研究纳入糖尿病足患者80例,患者均进入结果分析。创面处理后各组创面愈合到各阶段的时间比较:4组在治疗开始后第3-4天（即临床显效期）,创面愈合情况相近（P>0.05）;而在此之后,联合用药组的愈合情况明显优于对照组（P<0.05）且表皮生长因子组的情况与联合组更为相近。4组病例在治疗开始后第3-4天（临床显效期）,肉芽组织生长情况相近（P>0.05）;在后期,联合用药组的愈合情况明显优于对照组（P<0.05）且表皮生长因子组的情况与联合组更为相近。结论:两种生长因子在临床显效期内对促进创面愈合的效果无明显差异,在此期后单独使用表皮细胞生长因子或酸性成纤维细胞生长因子,对创面愈合有积极影响但效果不够明显,而联合使用重组表皮生长因子和酸性成纤维细胞生长因子则具有明显良好的促进创面愈合效果。第三部分表皮生长因子等多种生长因子在糖尿病足溃疡管理中的作用:临床试验的系统评价和荟萃分析目的:生长因子是糖尿病足溃疡的新兴疗法,尽管已有临床报道,但尚未有研究对生长因子在糖尿病足溃疡中的功效和安全性进行临床证据的全面、系统评估。我们通过对随机对照试验（RCT）进行系统综述来解决这一问题,并通过荟萃分析探究表皮生长因子对糖尿病足溃疡的治疗效果,为其临床使用提供循证医学证据。方法:搜索Pub Med,Cochrane库,Scopus,Embase和Google Scholar数据库,并选择有关生长因子治疗糖尿病患者溃疡创面的RCT研究文献。文献检索和评估由两名独立的审阅者进行。研究的方法学质量使用雅达量表进行评估。我们搜索数据库包括Pub Med,EMBASE,Cochrane图书馆,Web of Science,EBSCOhost,Science Direct和Scopus（截至2020年6月）,筛选表皮生长因子和安慰剂治疗糖尿病足溃疡创面的研究文章,并进行文献质量评估,从而纳入高质量文献。以糖尿病足治愈率为对比指标,根据给药途径的类型进行分层荟萃分析（局部注射和局部应用）,通过计算比值比（OR）和95%置信区间（95%CI）确定研究结论的准确性。结果:我们鉴定了涉及糖尿病的糖尿病患者的18项RCT,评估了血小板衍生生长因子,表皮生长因子,成纤维细胞生长因子,粒细胞集落刺激因子,血管内皮生长因子,促红细胞生成素,转化生长因子的有效性。主要的主要结局是完全愈合,尽管采用了不同的指标来定义这一点,例如伤口闭合,肉芽组织形成或完全再上皮化。很少有研究有随访期来报告任何复发和截肢率。由于干预,没有不良反应的报道。Meta分析共纳入六项研究,涉及530例患者符合分析条件。组合的OR（局部注射和局部适用）是4.005（95%CI:（2.248;7.135）,p<0.001）。病灶内注射和局部用药应用分别为3.599（95%CI:（1.213;10.677）,p=0.021）和4.176（95%CI:（2.112;8.256）,p<0.001）。统计异质性在整体治疗和两个子组（I2:24.56,p=0.25,I2:33.26,p=0.213）中并无明显意义（I2=15.17,p=0.317）。结论:总体而言,文献分析关于EGF增强糖尿病溃疡愈合效果的共识更大,meta分析结果也支持使用表皮生长因子对治疗糖尿病足创面溃疡有效。然而,由于大多数生长因子的试验很少,并且可用的研究方法也不相同,因此其他生长因子治疗糖尿病足创面的有效性缺乏明确循证医学证据。
闫欢欢[9]（2020）在《贻贝仿生导电性苯胺齐聚物生物材料的制备及在组织工程中的应用》文中认为随着生物医用高分子材料的发展,导电高分子以其独特的物理和化学性质在生物医学领域被广泛研究和应用探索。导电高分子,如聚苯胺、聚噻吩等在提供导电性的同时,本身表现出良好的氧化还原活性即电活性,能够诱导细胞生长和分化。但这些导电聚合物用于组织工程时,不可降解性、不可吸收性和加工性差等成为限制它们应用的主要因素,因此多种类型的可降解导电性和电活性高分子被设计和合成。苯胺齐聚物（如苯胺三聚体、四聚体等低聚体）具有规整的分子结构、可逆的氧化还原性和较好的生物相容性,且可在生理环境中通过肾脏清除并排出体外。因此,开发基于苯胺齐聚物的可降解功能支架材料用于组织工程修复具有重要的意义。外加电刺激被报道可以有效的调控细胞行为和促进组织再生,而包含苯胺齐聚物的导电生物材料可以实现局部定位电刺激,提高电刺激效率,从而更好的调控细胞粘附、迁移、增殖和分化。然而,简单有效地合成出生物相容、成型方便的导电性和电活性聚合物依然是组织工程中的难点和挑战,有待进一步设计和挖掘。因此,我们设计并合成了一系列新颖的导电性和电活性聚合物,进一步通过静电纺丝和静电滴球技术等分别制备了图案化导电性纳米纤维毡和电活性微球等不同应用形式的材料,然后通过体内和体外实验,系统地评价了它们潜在的生物医用前景,全文主要包括以下四部分的内容。（1）我们以苯胺四聚体、多巴胺和聚乙二醇为原料,通过自由基加成反应合成了具有粘附性的导电无规共聚物poly（ATMA-co-DOPAMA-co-PEGMA）（PAT）。该材料不仅保持一定的导电性和电活性,还具有良好的亲水性和血液相容性,结合电刺激具有协同提高MC3T3-E1细胞增殖、碱性磷酸酶活性、细胞外基质钙沉积和成骨基因表达的特性。贻贝来源多巴胺分子的引入赋予材料良好的粘附性和生物相容性,使其应用形式更灵活、更广泛。（2）在高碘酸钠作用下,将上述电活性共聚物（PAT）通过其多巴胺段的氧化还原反应修饰于可降解PLGA/HA微球上,制备出电活性微球（PAT@HA/PLGA）。进一步地将含YKYKY的胰岛素样生长因子（IGF-1）在酪氨酸酶作用下转变为DOPA-IGF-1并固定于微球表面,制备出具有电活性和生物活性的可降解微球。体外细胞培养表明,所制备的微球具有良好的生物相容性,显着提高成骨细胞增殖效率和分化的特性。将不同功能性微球注射到5 mm尺寸的大鼠颅骨临界缺损处,植入8周后的修复结果表明,电活性和生物活性微球可显着促进缺损处新骨的生成和骨愈合效果。（3）将PAT共聚物和聚己内酯（PCL）复合,通过静电纺丝方法制备出生物降解的图案化导电性纳米纤维毡,利用PAT内的DOPA分子将神经生长因子（NGF）修饰于纤维表面,进而应用于神经组织工程。获得的导电纤维毡具有连续交替的谷和脊图案化结构。在电刺激下,具有特定形貌的的导电性纤维毡固定有NGF后,对神经干细胞（NSCs）的增殖和分化具有正向协同作用,促进NSCs向神经元方向分化,并抑制向星形胶质细胞方向的分化,表明有利于神经的再生与修复。（4）将苯胺三聚体和PCL通过逐步加成反应合成了导电聚合物（PCL-IPDI-AT）,以高温溶剂蒸发法制备了形状记忆性的导电弹性体薄膜,并初步探索了其体外生物相容性和应用性。该共聚物薄膜具有尺寸均一的多孔结构、优异的可拉伸性和形状记忆性。这种具有导电性、一定粗糙度和多孔结构的导电弹性体材料在电刺激下促进了成骨细胞的生长和成骨分化。综上所述,我们制备的多种应用形式的导电性和电活性功能支架材料不仅加快细胞间电信号的传导,而且在外加电刺激的作用下可调控植入材料表面的细胞行为,进而有效的促进了细胞的功能性分化以及体内缺损组织的修复和再生。
完颜萍萍[10]（2020）在《慢性间歇性缺氧对肾脏纤维化的影响及相关机理研究》文中认为目的:阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征（Obstructive sleep apnea hypopnea syndrome,OSAHS）可引起呼吸暂停反复出现,且多为动脉氧饱和度降低。研究表明,OSAHS引起的心血管和靶器官损伤来源于间歇性缺氧。缺氧可对众多组织造成损伤。临床研究和动物实验均表明OSAHS可引起机体发生炎症反应,并可通过激活机体肾素-血管紧张素系统,介导慢性肾脏疾病（Chronic kidney diaelace,CKD）的发展,其引起的病理变化为肾脏组织的纤维化。目前为止,OSAHS是如何引起肾脏纤维化的具体作用机制还尚未研究清楚。因此,本研究拟采用慢性间歇性缺氧大鼠模型和细胞模型来初步探讨缺氧在肾脏纤维化进展中的作用及其可能机制。方法:1、模型建立及纤维化相关指标的检测:模拟OSAHS的发病特点,建立慢性间歇性缺氧大鼠模型,实验分组为:正常对照组（NC组）、轻度间歇性缺氧组（CIH 1组）、中度间歇性缺氧组（CIH 2组）和重度间歇性缺氧组（CIH 3组）。各实验组大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6和MCP-1水平通过Elisa法进行检测;各实验组大鼠肾脏组织病理学变化和胶原分布分别通过HE染色和MAsson染色方法进行观察;CD3和CD68表达通过免疫组化的方法进行检测;α-SMA、IL-1β、Col I和FN表达通过免疫荧光法进行检测;MCP-1、MIP-1β、Col I、FN、TNF-α和IL-1βm RNA表达通过RT-PCR的方法进行检测;MCP-1、MIP-1、Caspase-1和TNF-α蛋白表达通过Western blot的方法检测;2、采用转录组测序技术对正常大鼠和慢性间歇性缺氧模型大鼠肾脏组织进行测序,根据测序结果,筛选出差异表达基因、并对其进行GO功能和KEGG通路富集分析,进一步获得与纤维化相关的差异表达基因,并且通过RT-PCR方法验证其表达水平;3、通过HK-2细胞构建缺氧损伤模型,通过MTT法对细胞活力进行检测,通过Western blot的方法对各组细胞中Aqp1和HIF-1α蛋白表达变化进行检测;通过免疫组化Aqp1在慢性间歇性缺氧诱导的大鼠肾脏组织中的表达进行检测;4、通过对转录组测序数据分析得到Aqp1在慢性间歇性缺氧诱导的大鼠肾脏组织中显着上调,选择该靶基因进行以下研究:TGF-β诱导HK-2细胞纤维化模型,构建Aqp1干扰载体并转染HK-2细胞,转染后的HK-2细胞活力利用MTT进行检测;HK-2细胞中TNF-α、IL-1β、α-SMA和FN m RNA的表达水平利用RT-PCR法检测进行检测;采用免疫荧光技术检测E-cadherin、Fsp1和Vimentin的表达;同时利用western blot对细胞中E-cadherin、Vimentin、Erk、p-Erk和Aqp1等蛋白的表达变化进行检测。结果:（1）Elisa实验结果表明,与NC组比较,CIH 1组大鼠血清中IL-1β、TNF-α、IL-6、MCP-1和IFN-γ含量未见明显变化,CIH 2组和CIH 3组IL-1β、TNF-α、IL-6、MCP-1和IFN-γ含量明显增加,并且随着缺氧程度的加深,其含量增加越显着;（2）HE染色结果表明,与NC组比较,CIH 1组大鼠肾脏组织未发生明显病理学损伤,CIH 2组大鼠肾脏组织出现轻微损伤,CIH 3组大鼠肾脏组织损伤加重;Masson染色结果表明,与NC组比较,CIH组肾小管周围出现胶原沉积现象,并且随着缺氧程度的加深,胶原沉积越多;（3）免疫组化染色结果表明,与NC组比较,CIH 1组、CIH 2组和CIH 3组大鼠肾脏组织中CD3、CD68、FN和Col I表达均增加,并且随着缺氧程度的加深,其表达水平升高越显着;（4）免疫荧光结果表明,与NC组比较,CIH 1组、CIH 2组和CIH 3组大鼠肾脏组织中IL-1β和α-SMA表达均增加,并且随着缺氧程度的加深,其表达水平升高越显着;（5）RT-PCR结果表明,与NC组比较,CIH 1组、CIH 2组和CIH 3组大鼠肾脏组织中MCP-1、MIP-1β、Col I、FN、TNF-α和IL-1βm RNA表达均增加,并且随着缺氧程度的加深,其表达水平升高越显着;Western blot结果表明,与NC组比较,CIH 1组、CIH 2组和CIH 3组大鼠肾脏组织中MCP-1、MIP-1β、Caspase-1和TNF-α蛋白表达水平表达均增加,并且随着缺氧程度的加深,其表达水平升高越显着;（6）RNA-seq结果表明,较NC组比较,CIH组大鼠肾脏组织中有20个差异表达基因,其中13个显着上调、7个显着下调;结合现有文献,发现Fos、Erg1和Aqp1与肾脏纤维化相关,RT-PCR验证其m RNA在大鼠肾脏组织中的表达,结果与RNA-seq一致;此外,差异表达基因主要被注释到转录调节、血管发育、细胞增殖和细胞分化等GO功能;主要被注释到凋亡、近端小管重碳酸盐回收、肾素血管紧张素系统、钙吸收、肾素分泌等KEGG信号通路上;（7）成功建立HK-2细胞缺氧模型,与正常对照组比较,缺氧12 h、24 h和48 h后,HK-2细胞中HIF-1α和Aqp1蛋白表达均显着升高。对大鼠肾脏组织Aqp1表达水平进行检测,发现较NC组,CIH 1组、CIH 2组和CIH 3组Aqp1表达水平明显增加,并且随着缺氧程度的加深,其表达水平升高越显着;（8）TGF-β成功诱导HK-2细胞发生纤维化,转染Ad-si Aqp1腺病毒后,结果发现,较Model组比较,Aqp1干扰可抑制HK-2细胞增殖,细胞中E-cadherin表达明显升高,Fsp1和Vimentin表达明显降低;TNF-α、IL-1β、MCP-1、α-SMA和FN m RNA水平均显着降低;（9）Western blot实验结果表明,通过与Blank组进行比较,Model组HK-2细胞中蛋白Erk、p-Erk和Aqp1的表达水平升高;通过与Model组进行比较,Ad-si Aqp1组中蛋白Erk和p-Erk的表达水平不具有统计学差异,Vimentin和Aqp1的蛋白水平降低,E-Caherin蛋白水平升高;Ad-si Aqp1+PD98059组、PD98059组的Vimentin、Erk、p-Erk和Aqp1等蛋白水平均降低,E-Cadherin蛋白水平升高;与Ad-si Aqp1组进行比较,Ad-si Aqp1+PD98059组中蛋E-Caherin蛋白水平升高,Erk、p-Erk、Aqp1和Vimentin等的蛋白水平降低;与Ad-si Aqp1+PD98059组进行比较,PD98059组中蛋白E-Caherin蛋白水平降低,Aqp1和Vimentin蛋白水平升高,Erk和p-Erk蛋白水平没有差异。结论:（1）慢性间歇性缺氧可引起大鼠肾脏组织发生纤维化;（2）慢性间歇性缺氧可引起大鼠肾脏组织中基因表达发生改变,其中Fos、Aqp1和Egr1基因与肾脏纤维化关系密切;（3）Aqp1参与TGF-β诱导的HK-2细胞EMT过程;（4）Erk/Aqp1信号通路参与HK-2细胞纤维化发展。
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 犬皮肤的概述 |
| 1.2 皮肤烧伤 |
| 1.3 展望 |
| 第2章 前言 |
| 第3章 犬皮肤三度烧伤模型的建立 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.3 试验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 BMSCs治疗烧伤的效果 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第5章 BMSCs治疗烧伤的可能机制 |
| 5.1 试验材料 |
| 5.2 试验方法 |
| 5.3 试验结果 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第6章 全文总结 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 创新点 |
| 参考文献 |
| 英文简写索引 |
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一部分 PRP调节热损伤表皮干细胞生物学行为的实验研究 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第一部分附图、附表 |
| 第二部分 PRP调节表皮干细胞修复猪深二度烧伤创面的实验研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分附图、附表 |
| 第三部分 PRP修复中厚皮片供皮区创面的临床研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三部分附图、附表 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 PRP在创面治疗中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| English Paper 1 |
| English Paper 2 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 哺乳动物眼球及角膜结构 |
| 1.1.1 眼球的结构 |
| 1.1.2 角膜的结构 |
| 1.2 角膜碱烧伤引起的主要不良病变 |
| 1.3 小鼠角膜碱烧伤引起的血管新生和纤维化病变研究 |
| 1.3.1 哺乳动物角膜碱烧伤引起的血管新生 |
| 1.3.2 哺乳动物角膜碱烧伤引起的角质细胞向成纤维细胞和肌成纤维细胞的转化 |
| 1.4 角膜碱烧伤的甲基化调控研究 |
| 1.4.1 表观调控及甲基化调控简介 |
| 1.4.2 角膜疾病中的甲基化调控研究及研究意义 |
| 1.5 角膜碱烧伤引起的炎症反应和免疫应答 |
| 1.6 Rapamycin(Rapa)对角膜碱烧伤治疗的研究 |
| 1.6.1 Rapa及mTOR简介 |
| 1.6.2 Rapa在碱烧伤治疗中的应用和研究意义 |
| 1.7 PI3K/AKT/mTOR、MAPK信号通路和HIF-1 对角膜碱烧伤影响的研究 |
| 1.7.1 PI3K/AKT/m TOR信号通路对血管生成的调控 |
| 1.7.2 HIF-1/VEGF通路对血管生成的调控 |
| 1.7.3 MAPK信号通路对血管生成的调控 |
| 1.8 选题依据、意义及研究内容 |
| 1.9 本研究的创新 |
| 第二章mTOR因子介导的小鼠角膜碱烧伤及Rapa干预下血管生成的甲基化调控、转录因子调控及信号通路PI3K/AKT和 MAPK/ERK调控 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 主要药物和试剂 |
| 2.2.2 主要实验仪器 |
| 2.2.3 实验动物及模型建立 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 碱烧伤引起的角膜新生血管形态学数据采集 |
| 2.3.2 石蜡切片和Hematoxylin and Eosin(H&E)染色 |
| 2.3.3 冰冻切片及CD31、HIF-1α和VEGF免疫荧光染色 |
| 2.3.4 石蜡切片和Brd U免疫荧光染色 |
| 2.3.5 RNA提取及实时定量聚合酶链式反应(Quantitativereal-time polymerase chain reaction,q RT-PCR) |
| 2.3.6 DNA亚硫酸氢钠测序PCR(Bisulfite sequencing PCR,BSP) |
| 2.3.7 电泳迁移率实验(Electrophoretic mobility shift assay,EMSA) |
| 2.3.8 蛋白提取及Western blot |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 时间梯度的筛选和建立 |
| 2.4.2 碱烧伤引起的角膜血管新生和Rapa处理对其形态的影响 |
| 2.4.3 碱烧伤及Rapa处理对角膜上皮层和基质层结构的影响 |
| 2.4.4 碱烧伤及Rapa处理对角膜细胞增殖的影响(Brd U+细胞染色) |
| 2.4.5 碱烧伤及Rapa处理对角膜血管生成的影响(CD31 染色) |
| 2.4.6 碱烧伤及Rapa处理对角膜VEGF和 α-SMA表达的影响 |
| 2.4.7mTOR因子介导的小鼠角膜碱烧伤及Rapa干预下血管生成的甲基化调控(DNA水平调控) |
| 2.4.8 转录因子ETV对去甲基化位点的负调控(转录水平调控) |
| 2.4.9 Rapa通过抑制碱烧伤诱导的PI3K/AKT/mTOR、HIF-1和MAPK信号通路活化,降低了VEGF的表达(蛋白水平调控) |
| 2.5 讨论 |
| 2.5.1 碱烧伤诱导VEGF和 α-SMA表达与Rapa对角膜血管生成和纤维化的抑制作用 |
| 2.5.2 碱烧伤引起的角膜组织损伤和Rapa对其的修复 |
| 2.5.3 角膜碱烧伤及Rapa对其修复的分子机制 |
| 2.6 本章主要结论 |
| 第三章 小鼠角膜碱烧伤及Rapa治疗过程中的免疫应答 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 主要药物和试剂 |
| 3.2.2 主要实验仪器 |
| 3.2.3 实验动物及模型建立 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 小鼠血清的采集 |
| 3.3.2 石蜡切片和H&E染色 |
| 3.3.3 CD45、F4/80和MPO冰冻切片的免疫荧光染色 |
| 3.3.4 RNA提取及qRT-PCR |
| 3.3.5 血清中TGF-β和 Foxp3的ELISA测定 |
| 3.3.6 流式细胞术对脾脏淋巴细胞的测定 |
| 3.3.7 角膜中TNF-α、MMP-2、p-mTOR和VEGF蛋白的检测 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 CD45+、F4/80+、MPO+细胞通过角膜缘浸润进入基质 |
| 3.4.2 Rapa抑制碱烧伤诱导的炎症因子高表达 |
| 3.4.3 脾脏T细胞对小鼠角膜碱烧伤及Rapa处理的响应 |
| 3.5 讨论 |
| 3.5.1 碱烧伤引起的炎症细胞浸润和Rapa对其过程的抑制 |
| 3.5.2 Rapa在多重细胞因子调控的炎症和血管生成中发挥作用 |
| 3.5.3 MMP-2对碱烧伤引起的血管重构发挥炎症因子作用 |
| 3.5.4 Rapa通过诱导CD4+CD25highTreg细胞生成调控角膜的损伤修复 |
| 3.6 本章主要结论 |
| Rapa在角膜碱烧伤诱导的损伤应答中的主要作用 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1 研究的目的和意义 |
| 2 国内外研究进展 |
| 2.1 诱导多能干细胞的研究进展 |
| 2.1.1 体细胞重编程的机制 |
| 2.1.2 多能干细胞由不同信号通路调节 |
| 2.1.3 提高体细胞重编程效率的研究 |
| 2.2 家畜诱导多能干细胞的研究现状 |
| 2.2.1 猪诱导多能干细胞 |
| 2.2.2 绵羊和山羊诱导多能干细胞 |
| 2.2.3 牛诱导多能干细胞 |
| 2.3 miRNAs与多能干细胞 |
| 2.3.1 miRNA简介及生物学功能 |
| 2.3.2 miRNA在多能干细胞中的作用 |
| 2.3.3 miRNAs促进体细胞重编程 |
| 2.4 多能干细胞定向分化原始生殖细胞的研究进展 |
| 2.4.1 形成原始生殖细胞的关键因子和基因 |
| 2.4.2 ESC/iPSC定向分化原始生殖细胞的途径 |
| 2.4.3 ESC/iPSC体外诱导分化为生殖细胞的培养体系 |
| 3 研究内容 |
| 4 技术路线 |
| 第二章 试验研究 |
| 试验一 促进绵羊体细胞重编程miRNAs的筛选研究 |
| 1.材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 动物和细胞 |
| 1.1.2 主要仪器和设备 |
| 1.1.3 主要试剂耗材 |
| 1.1.4 质粒 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 绵羊肾细胞(SKC)分离培养及鉴定 |
| 1.2.2 小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)分离培养与饲养层细胞制作 |
| 1.2.3 促绵羊体细胞重编程miRNAs的初步筛选 |
| 1.2.4 慢病毒质粒提取与酶切鉴定 |
| 1.2.5 慢病毒包装 |
| 1.2.6 慢病毒收集及病毒滴度测定 |
| 1.2.7 miRNAs促绵羊肾上皮细胞重编程效率比较 |
| 1.2.8 siPSC的鉴定 |
| 1.2.9 数据统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 绵羊体细胞的分离纯化 |
| 2.2 MEF细胞分离培养及饲养层细胞的制备 |
| 2.3 慢病毒质粒提取与酶切鉴定 |
| 2.4 成功包装各类慢病毒 |
| 2.5 促绵羊SKC重编程的miRNAs筛选 |
| 2.5.1 慢病毒成功感染SKC |
| 2.5.2 比较不同miRNA诱导绵羊SKC的效率 |
| 2.5.3 miR-200c-141+8因子诱导绵羊iPSC |
| 2.6 由miR-200c-141促进重编程获得的siPSC的多能性鉴定 |
| 2.6.1 AP染色鉴定 |
| 2.6.2 细胞免疫荧光技术鉴定siPSC中多能性蛋白因子表达 |
| 2.6.3 qPCR鉴定siPSC中多能性因子基因转录 |
| 2.6.4 siPSC中多能基因Nanog启动子甲基化分析 |
| 2.6.5 siPSC核型分析 |
| 2.6.6 siPSC向拟胚体(EB)三胚层分化鉴定 |
| 3 讨论 |
| 3.1 绵羊iPSC的特征及诱导效率 |
| 3.2 miRNA提高干细胞诱导效率 |
| 4 小结 |
| 试验二 miR-200c提高羊体细胞重编程机制研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 细胞和载体 |
| 1.1.2 重要仪器和设备 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 miR-200c靶蛋白的预测 |
| 1.2.2 合成绵羊miR-200c模拟物、抑制物和阴性对照 |
| 1.2.3 双荧光素酶报告基因载体的构建 |
| 1.2.4 双荧光素酶报告基因分析miR-200c靶基因 |
| 1.2.5 实时荧光定量PCR检测miR-200c靶基因的m RNA水平 |
| 1.2.6 Western blot检测miR-200c靶基因的蛋白水平 |
| 1.2.7 数据统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 miR-200c靶基因的预测 |
| 2.2 双荧光素酶报告基因载体的构建 |
| 2.2.1 靶基因ZEB1和TWISTNB3’UTR区扩增测序 |
| 2.2.2 靶基因双荧光素酶报告载体的构建 |
| 2.3 靶基因双荧光素酶报告系统分析 |
| 2.4 实时荧光定量PCR检测ZEB1、TWISTNB及 E-cadherin转录水平 |
| 2.5 Western blot检测ZEB1、TWISTNB及 E-cadherin蛋白表达水平 |
| 3 讨论 |
| 3.1 TGF-β信号通路与细胞重编程 |
| 3.2 miRNA提高重编程的机制 |
| 4 小结 |
| 试验三 绵羊iPSC定向分化雌性PGC样细胞研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 细胞和载体 |
| 1.1.2 重要仪器和设备 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 绵羊生殖相关基因DAZL和 BOULE慢病毒载体的构建 |
| 1.2.2 PLVX-Dazl和 PLVX-Boule的慢病毒包装 |
| 1.2.3 慢病毒滴度测定 |
| 1.2.4 绵羊卵巢细胞的分离培养 |
| 1.2.5 绵羊iPSC定向分化原始生殖细胞样细胞(PGCLC) |
| 1.2.6 绵羊iPSC定向分化雌性PGC样细胞鉴定 |
| 1.2.7 数据统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 绵羊生殖相关基因DAZL和 BOULE慢病毒载体的构建 |
| 2.1.1 绵羊生殖相关基因DAZL和 BOULE的扩增 |
| 2.1.2 成功构建绵羊生殖相关基因DAZL和 BOULE慢病毒载体 |
| 2.1.3 成功包装慢病毒LV-DAZL和 LV-BOULE |
| 2.2 绵羊卵巢细胞分离培养 |
| 2.3 稳转DAZL和 BOULE基因siPSC的建立 |
| 2.4 原始生殖细胞样细胞(PGCCL)的鉴定 |
| 2.4.1 绵羊PGC样细胞的分化条件和过程 |
| 2.4.2 细胞免疫荧光技术检测绵羊PGC样细胞 |
| 2.4.3 实时定量RT-PCR验证绵羊PGC样细胞 |
| 3 讨论 |
| 3.1 原始生殖细胞与多能干细胞 |
| 3.2 体外重构原始生殖细胞的方法 |
| 4 小结 |
| 全文结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 作者简历 |
| 石河子大学博士研究生学位论文导师评阅表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 第一章 体外冲击波治疗兔跟腱病模型最佳能量参数的评价和筛选 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 主要实验试剂和耗材 |
| 1.1.3 主要实验仪器设备 |
| 1.2 实验内容 |
| 1.2.1 I型胶原酶溶液的配制 |
| 1.2.2 兔跟腱病模型实验分组 |
| 1.2.3 兔跟腱病模型的建立 |
| 1.2.4 ESWT治疗兔跟腱病模型最佳能量参数的筛选 |
| 1.2.5 跟腱超声评价 |
| 1.2.6 跟腱组织H&E染色病理评价 |
| 1.2.7 跟腱组织力学测试 |
| 1.2.8 跟腱组织透射电镜检测 |
| 1.2.9 RT-PCR检测跟腱组织基因相对表达量 |
| 1.2.10 统计学分析 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.3.1 一般情况观察 |
| 1.3.2 兔跟腱病动物模型有效性评价 |
| 1.3.3 超声检测 |
| 1.3.4 力学性能测试 |
| 1.3.5 透射电镜检测 |
| 1.3.6 组织学评价 |
| 1.3.7 RT-PCR检测相关基因相对表达水平 |
| 1.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 体外冲击波治疗兔跟腱病模型最佳脉冲参数的评价和筛选 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 主要实验试剂和耗材 |
| 2.1.3 主要实验仪器设备 |
| 2.2 实验内容 |
| 2.2.1 兔跟腱病模型的建立和实验分组 |
| 2.2.2 ESWT治疗兔跟腱病模型最佳能量参数的筛选 |
| 2.2.3 跟腱超声评价 |
| 2.2.4 跟腱组织H&E染色病理评价 |
| 2.2.5 跟腱组织力学性能测试 |
| 2.2.6 跟腱组织透射电镜检测 |
| 2.2.7 RT-PCR检测跟腱组织基因相对表达量 |
| 2.2.8 数据统计和分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 一般情况观察 |
| 2.3.2 超声检测 |
| 2.3.3 力学性能测试 |
| 2.3.4 透射电镜检测 |
| 2.3.5 组织学评价 |
| 2.3.6 RT-PCR检测相关基因相对表达水平 |
| 2.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 超声引导下PRP注射联合ESWT治疗对模拟低氧环境下兔跟腱病修复的实验研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 主要实验试剂及耗材 |
| 3.1.3 主要仪器设备 |
| 3.2 实验内容 |
| 3.2.1 兔跟腱病模型的建立和实验分组 |
| 3.2.2 PRP制备 |
| 3.2.3 ESWT治疗干预和超声引导下PRP注射 |
| 3.2.4 跟腱超声评价 |
| 3.2.5 跟腱组织 H&E 染色病理评价 |
| 3.2.6 跟腱组织力学性能测试 |
| 3.2.7 跟腱组织透射电镜检测 |
| 3.2.8 RT-PCR检测跟腱组织基因相对表达量 |
| 3.2.9 统计分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 一般情况观察 |
| 3.3.2 PRP制备结果 |
| 3.3.3 超声检测 |
| 3.3.4 力学性能检测 |
| 3.3.5 透射电镜检测 |
| 3.3.6 组织学评价 |
| 3.3.7 RT-PCR检测相关基因相对表达水平 |
| 3.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 结论 |
| 4.1 主要结论 |
| 4.2 研究展望 |
| 文献综述 体外冲击波治疗肌腱病有效性研究现状 |
| 参考文献 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
| 中英文缩略词对照表 |
| 摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 第一部分 多微通道导电神经支架的设计和制备及物理性能和生物相容性能检测评价 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 实验对象及主要试剂 |
| 1.3 实验分组及方法 |
| 1.4 统计方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 聚左旋乳酸取向性纤维膜及其生物相容性的研究 |
| 1 研究方法与内容 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 实验对象及主要试剂 |
| 1.3 实验分组及方法 |
| 1.4 统计方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 仿生导电人工神经支架修复大鼠坐骨神经缺损的研究 |
| 1 研究方法与内容 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 实验对象和主要试剂 |
| 1.3 实验分组和方法 |
| 2 结果 |
| 3.讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 周围神经损伤修复的细胞和分子机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间获得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 导师评阅表 |
| 摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1.研究对象 |
| 1.1 患者一般情况 |
| 1.2 入选标准 |
| 1.3 排除标准 |
| 2.研究材料 |
| 3.研究方法 |
| 3.1 术前准备 |
| 3.2 治疗及随访 |
| 3.3 数据收集 |
| 4.疗效评价 |
| 4.1 医师主观评价 |
| 4.2 VISIA客观评价 |
| 4.3 术中疼痛评价 |
| 4.4 患者满意度评价 |
| 4.5 不良反应评价 |
| 5.统计学处理 |
| 结果 |
| 1.患者基本资料 |
| 2.疗效评价结果 |
| 2.1 医师主观评价结果 |
| 2.2 VISIA客观评价结果 |
| 2.3 术中疼痛主观评价结果 |
| 2.4 患者满意度评价结果 |
| 2.5 不良反应记录 |
| 3.临床效果对比照片 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 bFGF在皮肤创伤愈合中临床应用及研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文缩写词表 |
| 第一部分:表皮生长因子联合纳米银敷料促进糖尿病足溃疡创面愈合的临床研究 |
| 引言 |
| 资料与方法 |
| 1.资料与方法 |
| 结果 |
| 2.1 参与者的基本信息和组间差异的比较 |
| 2.2 各组伤口愈合效果比较 |
| 2.3 各组新肉芽组织生长率比较 |
| 2.4 两组患者的细菌培养结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 第二部分:表皮生长因子联合酸性成纤维细胞生长因子治疗糖尿病足创面的临床研究 |
| 引言 |
| 1 实验材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验对象 |
| 1.3 治疗分组 |
| 1.4 观察指标 |
| 1.5 统计学分析 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 描述性统计 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 第三部分:表皮生长因子等多种生长因子在糖尿病足溃疡管理中的作用:临床试验的系统评价和荟萃分析 |
| 1 引言 |
| 2 资料与方法 |
| 2.1 搜索策略 |
| 2.2 学习程序 |
| 2.3 数据综合与分析 |
| 2.4 偏见风险及出版偏差 |
| 2.5 敏感性分析 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 血小板源性生长因子 |
| 3.2 表皮生长因子 |
| 3.3 成纤维生长因子 |
| 3.4 其他生长因子 |
| 3.5 不良事件与质量评估 |
| 3.6 表皮生长因子meta分析的研究项目选择 |
| 3.7 meta分析纳入研究的特征 |
| 3.8 rhEGF与安慰剂的完全治愈率对比 |
| 3.9 证据质量与偏见风险评估 |
| 3.10 出版偏差与敏感性分析 |
| 4 讨论 |
| 5.结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 综述 关于生长因子及细胞因子在糖尿病足临床治疗应用的研究进展 |
| 参考文献 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 导电高分子材料 |
| 1.2.1 导电高分子概述 |
| 1.2.2 导电高分子的合成、结构和掺杂 |
| 1.2.3 导电高分子复合材料 |
| 1.2.4 导电高分子存在的不足 |
| 1.3 含导电高分子齐聚物的生物材料 |
| 1.3.1 含导电高分子齐聚物生物材料概述 |
| 1.3.2 含苯胺齐聚物的生物材料 |
| 1.4 导电性生物材料的应用形式 |
| 1.4.1 导电性薄膜 |
| 1.4.2 导电性纳米纤维 |
| 1.4.3 导电性水凝胶 |
| 1.4.4 导电性复合材料3D支架 |
| 1.5 导电性生物材料的组织工程应用 |
| 1.5.1 骨组织工程 |
| 1.5.2 骨骼肌组织工程 |
| 1.5.3 神经组织工程 |
| 1.5.4 心脏组织工程 |
| 1.5.5 皮肤组织工程 |
| 1.6 电刺激的生物学反应 |
| 1.6.1 电刺激对蛋白质行为的影响 |
| 1.6.2 电刺激对细胞行为的影响 |
| 1.6.3 导电生物材料结合电刺激在组织工程中的应用 |
| 1.7 论文的设计思路和研究内容 |
| 第2章 贻贝仿生的导电性生物粘合剂的制备及在体外成骨诱导方面的研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 主要试剂与仪器 |
| 2.2.2 苯胺四聚体甲基丙烯酰胺(ATMA)单体的合成 |
| 2.2.3 多巴胺甲基丙烯酰胺(DOPAMA)单体的合成 |
| 2.2.4 电活性无规共聚物的合成 |
| 2.2.5 材料的基本表征 |
| 2.2.6 血液相容性测试 |
| 2.2.7 体外生物学实验 |
| 2.2.8 统计学分析 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 材料的合成和表征 |
| 2.3.2 共聚物的电化学性质及电导率 |
| 2.3.3 共聚物表面的亲水性 |
| 2.3.4 共聚物的粘结强度 |
| 2.3.5 PAT共聚物体外生物相容性评估 |
| 2.3.6 电刺激下PAT共聚物上MC3T3-E1细胞成骨分化评估 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 电活性和生物活性微球的制备及在大鼠颅骨缺损修复中的应用研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 主要试剂与仪器 |
| 3.2.2 材料的合成 |
| 3.2.3 PLGA/HA微球的制备 |
| 3.2.4 PLGA/HA微球的功能化 |
| 3.2.5 材料的基本表征 |
| 3.2.6 QCM-D测定微球对DOPA-IGF-1生长因子的吸附能力 |
| 3.2.7 体外生物学实验 |
| 3.2.8 大鼠颅骨缺损修复研究 |
| 3.2.9 统计学分析 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 电活性微球的制备与表征 |
| 3.3.2 DOPA-IGF-1在微球上的粘附性表征 |
| 3.3.3 电活性生物活性微球的体外生物学性质研究 |
| 3.3.4 电活性生物活性微球的体内生物学评估(大鼠颅骨缺损修复) |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 图案化导电性静电纺丝纤维毡的制备及在体外神经分化方面的研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 主要试剂与仪器 |
| 4.2.2 材料的合成 |
| 4.2.3 PAT/PCL复合材料无序和图案化纤维毡的制备 |
| 4.2.4 静电纺丝材料的掺杂 |
| 4.2.5 材料的基本表征 |
| 4.2.6 ELISA法测定静电纺丝材料对NGF的吸附能力 |
| 4.2.7 体外生物学研究 |
| 4.2.8 统计学分析 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 PCAT纳米纤维的制备 |
| 4.3.2 PCAT纳米纤维的电化学性质和电导率 |
| 4.3.3 PCAT纳米纤维的亲水性 |
| 4.3.4 静电纺丝纳米纤维毡的形貌 |
| 4.3.5 纺丝纤维对NGF蛋白的粘附能力 |
| 4.3.6 无序纺丝纤维的生物相容性评价 |
| 4.3.7 电刺激下PCAT纤维毡对神经细胞生物活性和分化的影响 |
| 4.4 本章小结 |
| 第5章 导电性形状记忆弹性体的制备及在体外成骨诱导方面的应用研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验部分 |
| 5.2.1 主要试剂与仪器 |
| 5.2.2 端氨基苯胺三聚体(ACAT)的合成 |
| 5.2.3 PCL的合成 |
| 5.2.4 导电弹性体的合成 |
| 5.2.5 材料的基本表征 |
| 5.2.6 弹性体的宏观记忆性评估 |
| 5.2.7 体外生物学实验 |
| 5.2.8 统计学分析 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 导电性聚氨酯弹性体的合成与表征 |
| 5.3.2 导电性弹性体的热力学性质 |
| 5.3.3 导电性弹性体的形状记忆性 |
| 5.3.4 导电性弹性体的表面形貌 |
| 5.3.5 导电性弹性体的细胞相容性评价 |
| 5.3.6 ALP活性和钙沉积 |
| 5.3.7 成骨基因表达 |
| 5.3.8 成骨蛋白免疫荧光染色和western blotting分析 |
| 5.4 本章小结 |
| 第6章 全文总结和展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征 |
| 1.1.1 OSAHS定义和主要临床表现 |
| 1.1.2 流行病学 |
| 1.1.3 高危因素 |
| 1.1.4 并发症 |
| 1.2 肾脏纤维化 |
| 1.2.1 肾脏纤维化的病因学和病理生理学 |
| 1.2.2 肾脏纤维化和炎症反应 |
| 1.2.3 肾脏纤维化和TGF-β信号 |
| 1.2.4 肾脏纤维化对人类健康的影响 |
| 1.3 研究目的及意义 |
| 第二章 慢性间歇性缺氧对大鼠肾脏纤维化的影响 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 OSAHS大鼠模型建立 |
| 2.2.2 Elisa实验 |
| 2.2.3 HE染色 |
| 2.2.4 Masson染色 |
| 2.2.5 免疫组织化学 |
| 2.2.6 免疫荧光 |
| 2.2.7 RT-PCR |
| 2.2.8 Western blot |
| 2.2.9 统计学分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 慢性间歇性缺氧对大鼠体重的影响 |
| 2.3.2 慢性间歇性缺氧对大鼠血清IFN-γ、TNF-α、MCP-1、IL-1β和IL-6水平的影响 |
| 2.3.3 慢性间歇性缺氧对大鼠肾组织病理学变化的影响 |
| 2.3.4 慢性间歇性缺氧对大鼠肾脏组织胶原沉积的影响 |
| 2.3.5 慢性间歇性缺氧对大鼠肾脏组织中Col I、FN、CD3和CD68 蛋白表达的影响 |
| 2.3.6 慢性间歇性缺氧对IL-1β和α-SMA蛋白表达的影响 |
| 2.3.7 慢性间歇性缺氧对MCP-1、MIP-1β、Col I、FN、TNF-α和IL-1βmRNA表达的影响 |
| 2.3.8 慢性间歇性缺氧对MCP-1、MIP-1β、Caspase-1和TNF-α蛋白表达的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 慢性间歇性缺氧大鼠肾脏组织转录组表达谱分析 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 组织准备 |
| 3.2.2 总RNA提取及检测 |
| 3.2.3 RNA的处理与测序 |
| 3.2.4 差异基因分析 |
| 3.2.5 差异基因GO功能和KEGG Pathway分析 |
| 3.2.6 RT-PCR |
| 3.2.7 统计学分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 测序数据整理及质量评估 |
| 3.3.2 转录组测序与参比基因序列比对 |
| 3.3.3 测序数据饱和度检验 |
| 3.3.4 差异表达基因筛选 |
| 3.3.5 差异表达基因GO分析 |
| 3.3.6 差异表达基因KEGG Pathway分析 |
| 3.3.7 差异表达基因的RT-PCR验证 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 Aqp1与肾脏缺氧的关系 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 细胞株 |
| 4.1.2 实验试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 细胞复苏 |
| 4.2.2 细胞传代 |
| 4.2.3 细胞缺氧处理 |
| 4.2.4 Western blot |
| 4.2.5 MTT |
| 4.2.6 免疫组化 |
| 4.2.7 统计学分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 缺氧对HK-2细胞形态的影响 |
| 4.3.2 缺氧对HK-2 细胞HIF-1α和 Aqp1 蛋白表达的影响 |
| 4.3.3 缺氧对HK-2细胞活性的影响 |
| 4.3.4 缺氧对大鼠肾脏组织中Aqp蛋白表达的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 Aqp1在肾小管上皮间质转化中的潜在作用及机制研究 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 细胞株 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 主要仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 Aqp1腺病毒病毒载体构建 |
| 5.2.2 细胞纤维化模型建立 |
| 5.2.3 细胞转染 |
| 5.2.4 MTT |
| 5.2.5 RT-PCR |
| 5.2.6 免疫荧光 |
| 5.2.7 Western blot |
| 5.2.8 统计学分析 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 细胞感染效率 |
| 5.3.2 Aqp1干扰对HK-2细胞增殖的影响 |
| 5.3.3 Aqp1 干扰对HK-2 细胞TNF-α、IL-1β、α-SMA和 FN m RNA表达的影响 |
| 5.3.4 Aqp1 干扰对HK-2 细胞E-Cadherin、Fsp1和Vimentin表达的影响 |
| 5.3.5 ERK/Aqp1 信号抑制对HK-2 细胞Aqp1 表达和EMT的影响 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 结论 |
| 6.1 主要结论 |
| 6.2 研究展望 |
| 参考文献 |
| 在校期间的研究成果 |
| 致谢 |
