miRNA——一类新的调节性微小RNA

一、miRNA—一类新的调控微小RNA（论文文献综述）

焦凯^[1]（2021）在《基于核酸构象调控的生物电路》文中指出生物体内遗传信息的传递遵循中心法则,由DNA转录为RNA最终翻译为蛋白质,从而支撑生物体的整个生命活动,同时,遗传信息的异常传递也会造成多种疾病。生物体内遗传信息的传递由多种生物分子的相互作用调控,例如,负载遗传信息的基因组核酸序列可经由蛋白质凝缩为染色质,而染色质在相关蛋白的调控下产生拓扑重构,从而调控对应基因的转录活性;一些非编码RNA,如miRNA,可以以RNA诱导沉默复合体（RISC）的形式在转录后水平上抑制mRNA的翻译活性。基于对天然遗传信息调控机制的理解,工程化组装生物分子构建的人工生物电路近年来发展的如火如荼,其在生物制造、计算及治疗中有广泛应用。然而,现有的人工生物电路体系中缺少功能精确可控的通用模块。DNA作为遗传信息的载体同时也是DNA纳米结构的构成基础。严格的碱基互补配对原则使得DNA纳米结构具有精确的可编程能力和响应性的构象转换能力。因此,可将DNA的功能性和结构性结合在一起,利用可精确调控构象的核酸自组装结构开发通用模块,实现对人工生物电路的精确调控。本文将主要介绍两种利用DNA纳米结构构建的通用模块:基于DNA构象调控的基因转录开关;及基于DNA构象调控的微小RNA捕获与肿瘤抑制。具体内容如下:（1）将包含T7启动子序列和Spinach编码序列的线性DNA与其他抑制链自组装为TO-DNA,并通过输入链序列特异性的调控其转录活性。TO-DNA的转录活性高度依赖于T7启动子的拓扑结构（完整平直的双链结构）,因此,通过输入钥匙链调整TO-DNA上T7启动子的拓扑结构,进而实现对其转录活性的序列特异性调控。同时,基于该转录开关我们实现了布尔逻辑门运算、多个TO-DNA间的次序性级联调控及基于同一TO-DNA同一种启动子的多基因正交性调控。最后,我们利用TO-DNA实现了活细菌中的生物计算。总之,TO-DNA的成功构建为形状特异性基因载体的开发提供了一种可能,同时也丰富了合成生物学的工作元件,有望在生物制造、智能诊疗中有更广泛的应用。（2）利用含polyA序列和anti-miRNA序列的二嵌段DNA与纳米金球自组装构建了具有polyA长度编程的侧向间隔的球型核酸（polyA-SNA）。我们发现polyA的长度可以程序性调控polyA-SNAs表面anti-miRNA链间的侧向间隔。侧向间隔的大小会影响polyA-SNA与靶标结合时的位阻,进而影响其捕获效率。PolyA-SNA侧向间隔的可调性可支持其优化出相较于传统密修饰SNA更有利于靶标捕获的构象,同时又保证拥有与传统SNA相当的高效细胞摄取。随后我们验证了polyA-SNAs在细胞内对原癌miRNA的捕获及抗癌基因表达的拯救,基于此我们实现了对小鼠皮下瘤的生长抑制。综上所述,我们利用DNA纳米结构的构象可编程性及其信息负载能力,构建了基于核酸纳米结构构象调控的精确人工生物电路元件。提出了外源功能性核酸构象设计的新方法,同时也为合成生物学提供新的工作元件。

任颖聪,陈淼,刘鑫鑫,冯帮海^[2]（2021）在《胞外囊泡微小RNA在急性肺损伤中的相关研究进展》文中研究指明急性肺损伤（ALI）和急性呼吸窘迫综合征（ARDS）的特点是肺泡上皮细胞、毛细血管内皮细胞屏障功能破坏以及炎性细胞募集,并导致肺泡及间质水肿、透明膜形成和肺部炎性浸润等,其机制尚未完全明确。目前的治疗方案以呼吸机支持治疗、液体管理、营养支持等综合性治疗为主,但预后仍较差。研究显示,不同来源的胞外囊泡微小RNA（miRNA）以不同方式参与调节上皮细胞、内皮细胞、吞噬细胞的功能,从而加重或改善ALI,并具有诊断、鉴别诊断及治疗价值。本文就相关ALI模型中不同来源的胞外囊泡miRNA在ALI中的调节机制、诊断与鉴别价值及干细胞胞外囊泡miRNA在治疗中的应用进行综述。

翟震宇^[3]（2021）在《基于生物信息学筛选持续性心房颤动相关circRNA并构建circRNA-miRNA-mRNA综合调节网络》文中指出心房颤动（atrial fibrillation,AF）是临床上最常见的快速性心律失常,致残、致死率高,也是脑卒中发生的主要危险因素之一。十年内阵发性心房颤动患者超过50%人群将进展为持续性心房颤动或者死亡。导管射频消融治疗（radiofrequency catheter ablation,RFCA）是目前根治心房颤动的一种有效介入治疗策略,能显着降低患者脑卒中和死亡风险,明显提高心房颤动患者远期生活质量。但持续性心房颤动患者首次行导管射频消融术后仍有20%-40%的心房颤动复发风险,增加了患者的医疗负担。心房颤动发病机制包含众多病理生理过程、不同个体间发病机制存在异质性以及心房颤动发病机制尚未完全阐明等众多因素是导致心房颤动患者导管射频消融术后复发的重要因素,因此,进一步研究心房颤动发病机制能够帮助改进目前心房颤动治疗策略,甚至有望提出新的治疗方式。最新研究指出非编码RNA（non-coding RNA,ncRNA）参与多种疾病的病理生理过程,因而成为近年来众多学者关注的焦点。众所周知,心房结构重构及心房电重构是导致心房颤动发生及病程进展的重要环节。然而目前导致心房结构重构及心房电重构的分子机制仍不清楚。最新研究表明:非编码RNA（ncRNA）与心房颤动患者心房结构重构及心房电重构联系紧密,心房组织中非编码RNA水平异常能够显着增加患者心房颤动的易感性并与心房颤动患者行导管消融术后远期心房颤动的复发风险相关。环状RNA（circular RNA,circRNA）是近年来新发现的一类非编码RNA,呈现封闭且稳定的环状结构与心脏功能的维持密切相关,从而为心房颤动发病分子机制的进一步深入研究开辟了一个崭新的研究思路。环状RNA是微小RNA（microRNA,miRNA）功能的重要调控因子,二者相互作用可以促进心房颤动疾病进展。此外,研究表明circRNA-miRNA-mRNA调节网络与心肌梗死、心力衰竭、心肌病等其他心血管疾病相关,突出了其在心脏疾病治疗方面的潜力。环状RNA因存在多种微小RNA（microRNA,miRNAs）的结合位点,可以通过海绵样吸附微小RNA,进而调控miRNA及下游靶基因的表达,即通过竞争性内源性RNA机制（competing endogenous RNAs,ceRNA）影响疾病进程。然而目前环状RNA与心房颤动的研究目前较少,且环状RNA（circRNA）在心房颤动发生、发展中所发挥的功能尚未被完全阐明,因此需要继续进一步深入研究,从而为心房颤动的分子机制研究开辟新的研究领域,并为未来心房颤动的诊断及治疗提供新的诊断标记物及新的治疗靶点。因此,我们收集了于本院心脏外科行心脏二尖瓣置换手术的风湿性瓣膜病患者的右心耳组织样本,其中持续性心房颤动患者或窦性心律患者右心耳组织样本各5例,对心房组织样本进行高通量环状RNA测序分析,同时利用GEO数据库中持续性心房颤动患者右心耳组织微小RNA（miRNA）芯片（样本数量21例）表达谱数据进行联合数据分析,基于生物信息学筛选出持续性心房颤动相关的环状RNAs（circRNA）,并对显着差异表达的环状RNAs亲本基因进行GO功能富集及KEGG生物信号通路分析,评估了它们的细胞功能、富集的信号通路,以进一步了解环状RNAs在持续性心房颤动病理机制中可能发挥的作用。此外,我们采用生物信息学技术预测了环状RNAs及微小RNAs可能调控的下游靶基因并运用Cytoscape软件（版本3.4.0）构建了持续性心房颤动circRNA-miRNA-mRNA综合调节网络。最后利用实时荧光定量（qRT-PCR）及双荧光素酶报告基因检测进行实验验证,有助于阐明circRNA-miRNA-mRNA综合调节网络在持续性心房颤动发病机制中发挥的重要作用。第一部分 筛选持续性心房颤动相关环状RNA目的:采用高通量测序技术分别对持续性心房颤动患者或窦性心律患者右心耳组织样本进行环状RNA测序,筛选出持续性心房颤动相关的环状RNA进行下一步研究。方法:1.临床组织样本获取:收集于本院心脏大血管外科行心脏二尖瓣置换手术的风湿性瓣膜病患者的右心耳组织样本,同时收集患者人口统计学特征、既往病史、冠脉造影结果、心电图及心脏彩超等临床资料;根据心电图检查结果将组织样本分为持续性心房颤动（atrial fibrillation,AF）组和窦性心律（sinus rhythm,SR）组,分别对两组右心耳组织样本采用高通量测序技术进行环状RNA测序。2.组织样本质检:Agilent 2200 Bioanalyzer精确检测RNA的完整度,根据RNA峰图计算RNA完整性指数（RIN值）,要求RIN值>7.0。3.文库构建:采用Total RNA起始,经探针去除rRNA,RNase R去除线性RNA后,构建环状RNA文库。4.高通量环状RNA测序:首先对Raw Data过滤、去接头序列及低质量reads,获得高质量数据。然后通过与核糖体数据库进行比对,去除核糖体RNA序列,获得effective reads。将effective reads与参考基因组进行比对,比对结果用于下一步环状RNA的鉴定,采用2款软件综合鉴定环状RNA,得到高可信环状RNA。并进一步对鉴定到的环状RNA进行序列预测、表达值计算和表达差异分析。5.组织样品间相关性分析:采用Pearson相关系数r来衡量两个变量间线性相关的关系,r的绝对值越接近1表明样品之间表达模式的相似度越高。建议重复性样品的r至少要大于0.8。6.环状RNA组间表达差异分析:采用DESeq2方法计算差异环状RNA。并使用p-value<0.05及|log2FoldChange|>1作为差异环状RNA的界定标准。结果:1.共收集10例患者右心耳组织样本,其中持续性AF组及SR组各5例。2.根据RNA峰图计算得出RNA完整性指数（RIN值）为8.5,组织样本质检结果满足高通量测序要求。3.Pearson相关系数r为0.847,表明两组内样品之间表达模式的相似度较高,在一定程度上衡量测序结果的可靠性。4.与窦性心律组相比,持续性心房颤动组右心耳组织样本中共筛选出600个显着差异表达的环状RNA,其中340个环状RNA高表达,260个环状RNA低表达。结论:1.10例患者右心耳组织样本质检合格能够满足进行高通量环状RNA测序的要求;2.持续性心房颤动组及窦性心律组,各组整体样本间差异较小,反应测序结果真实可靠;3.采用高通量测序技术对两组组织样本进行环状RNA测序分析,共筛选出600个与持续性房颤密切相关的环状RNA,其中340个环状RNA表达上调,260个环状RNA表达下调。第二部分 构建持续性AF环状RNA,微小RNA及信使RNA综合调节网络目的:构建持续性心房颤动环状RNA,微小RNA及信使RNA综合调节网络,并探讨持续性心房颤动相关环状RNA下游调节靶基因的功能和富集的生物信号通路。方法:1.GEO数据库下载持续性心房颤动右心耳组织样本miRNA表达谱芯片数据GSE68475（样本量较大、且测序数据质量较高的测序数据）,对数据进行归一化分析评估数据质量。2.使用 p-value<0.05 及|log2FoldChange|>1 作为差异 miRNA 的界定标准,筛选显着差异表达的miRNA。3.应用Targetscan,miRanda,and RNAhybrid三款在线预测工具,预测持续性心房颤动相关环状RNA可能调节的miRNA,并采用GEO数据库miRNA表达谱芯片数据筛选的显着差异表达的miRNA进行交叉验证,获得环状RNA调节的miRNA。4.运用DIANA-TarBase v8在线预测工具,预测持续性心房颤动相关环状RNA调节的miRNA下游作用的靶基因。5.采用Cytoscape软件构建持续性心房颤动环状RNA,微小RNA及信使RNA综合调节网络,并运用CentiScaPe app进行网络拓扑学分析。6.运用 DAVID（http://david.abcc.ncif-crf.gov/）在线数据库对持续性心房颤动相关环状RNA下游调节靶基因进行GO（Gene Ontology）功能富集及KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）生物信号通路分析。结果:1.箱线图显示:通过对GEO数据库中持续性心房颤动及窦性心律患者右心耳组织样本miRNA芯片表达谱数据进行背景校正和分位数归一化后,不同样本的miRNA表达量中位数几乎在同一直线上,反应GSE68475 miRNA表达谱数据质量较高,满足数据挖掘的要求。2.对GEO数据库中持续性心房颤动及窦性心律患者右心耳组织样本miRNA芯片表达谱数据进行组间差异表达分析（差异miRNA的界定标准:p-value<0.05及|log2FoldChange|>1）,与窦性心律组患者相比,持续性心房颤动右心耳组织样本中共筛选出60个显着差异表达的miRNA,其中31个miRNA表达上调,29个miRNA表达下调,并用火山图进行可视化分析。3.运用三款在线预测工具（Targetscan,miRanda,and RNAhybrid）共得到持续性心房颤动相关环状RNA可能调节的2403个miRNA;采用GEO数据库持续性心房颤动miRNA表达谱芯片数据筛选的显着差异表达的60个miRNA进行交叉验证,获得持续性心房颤动相关环状RNA调节的31个miRNA,并用韦恩图进行数据可视化。4.运用DIANA-TarBase v8在线预测工具,共预测出31个miRNA下游可能调控的278个靶基因;其中130个靶基因的预测分数>0.4（预测可信度较高）,其上游共9个miRNA;运用上述9个miRNA的上游30个circRNA及其下游130个靶基因进行后续进一步分析。5.对上述30个持续性心房颤动相关的circRNA,9个miRNA及130个靶基因采用Cytoscape软件（版本3.4.0）构建circRNA-miRNA-mRNA综合调节网络,并对该调节网络进行网络拓扑学分析显示hsa-miR339-5p为该综合调节网络核心miRNA。6.运用DAVID（http://david.abcc.ncif-crf.gov/）在线数据库对持续性心房颤动相关环状RNA下游130个调节靶基因进行GO（Gene Ontology）功能富集及KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）信号通路分析,其中 GO 功能富集分析包括基因参与的生物学过程（Biological Processess,BP）、分子功能（Molecular Function,MF）及细胞定位（Cellular Components,CC）三部分内容。根据富集分数log（p value）列出排列前10位的GO富集及前19位的KEGG生物信号通路富集结果,分别用柱状图及气泡图进行数据的可视化。结论:基于生物学信息技术对持续性心房颤动患者及正常窦性心律患者右心耳组织样本高通量测序数据及GEO数据库中持续性心房颤动患者及正常窦性心律患者右心耳组织miRNA芯片表达谱测序数据进行联合分析,构建了持续性心房颤动circRNA-miRNA-mRNA综合调节网络;对综合调节网络中mRNA进行GO功能富集及KEGG生物信号通路分析显示:持续性心房颤动内源性竞争性RNA调节机制（ceRNA网络）可能在持续性心房颤动的发病机制中发挥重要作用。第三部分 细胞水平验证持续性AF circRNA-miRNA-mRNA上下游靶向调节轴目的:运用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术及双荧光素酶报告基因检测验证持续性AF circRNA-miRNA-mRNA靶向调节轴的上下游相关作用关系。方法:1.根据持续性心房颤动相关环状RNA |log2FoldChange|及丰度值,在综合调节网络中分别挑选前5个（top 5）差异表达的上调环状RNA及下调环状RNA,同时挑选上述10个环状RNA及其调节的miRNA进行下一步实验验证。2.运用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术在组织样本中检测上述10个环状RNA及其调节的miRNA的mRNA相对表达量,筛选靶向调节轴进行后续进一步实验验证。3.采用双荧光素酶报告基因检测验证circRNA-miRNA-mRNA靶向调节轴的上下游相关作用关系。结果:1.根据持续性心房颤动相关circRNA |log2FoldChange|及丰度值,在持续性心房颤动综合调节网络中分别挑选前5个显着差异表达的上调环状RNA:hsacirc0004255、hsacirc0005637、hsacirc0003777、hsacirc0087564、hsacirc0082689 及前 5 个显着下调的 circRNA:hsacirc0001850、hsacirc0086414、hsacirc0008900、hsacirc0000666、hsacirc0085362;和上述 10 个 circRNA 可能调节的下游 miRNA:hsa-miR-339-5p、hsa-miR-3667-5p、hsa-miR-3176、hsa-miR-331-5p、hsa-miR-4279采用实时荧光定量 PCR（qRT-PCR）及双荧光素酶报告基因检测进行后续实验验证。2.qRT-PCR结果显示:与窦性心律组（SR组）相比,持续性心房颤动组（AF组）hsacirc86414、hsacirc0000666*、hsacirc0082689、hsacirc0001850、hsacirc0003777、hsa-miR-3176**、hsa-miR-331-5p**、hsa-miR-339-5p、hsa-miR-4279高表达;与窦性心律组（SR组）相比,持续性心房颤动组（AF组）hsacirc0008900*、hsacirc0004255、hsacirc0005637、hsacirc0085362、hsacirc0087564、hsa-miR-3667-5p**低表达。*代表 SR 组 vs AF 组p<0.05;**代表 SR 组 vs AF 组p<0.01。3.双荧光素酶报告基因检测结果显示:（1）hsacirc8900荧光素酶质粒（psiCHECK2-8900）与hsa-miR-3176共转染发现:在工具细胞293T中相比较共转染miRNA-NC mimics,miR-3176显着性抑制hsacirc8900调控的荧光素酶活性,说明 miR-3176 是 hsacirc8900 的一个新的靶向 miRNA。（2）BCL2L2荧光素酶质粒（psiCHECK2-BCL2L2）与hsa-miR-3176的mimics共转染到到通用工具细胞系293T发现:在工具细胞293T中相比较共转染miRNA-NC mimics,miR-3176显着性降低BCL2L2调控的荧光素酶活性,说明BCL2L2是miR-3176调控的靶向mRNA。结论:1.实时荧光定量PCR（qRT-PCR）验证结果显示:与正常窦性心律组（SR组）相比,持续性心房颤动组（AF组）hsacirc0008900、hsa-miR-339-5p及hsa-miR-3176 mRNA相对表达量与生物信息技术预测结果相符且组间差异有统计学意义。hsacirc0008900、hsa-miR-3176及下游靶基因可采用双荧光素酶报告基因检测进行进一步验证。2.采用双荧光素酶报告基因检测对hsacirc0008900、hsa-miR-3176及BCL2L2上下游调控关系进行验证,检测结果表明:心肌细胞中存在hsacirc0008900-hsa-miR-3176/BCL2L2上下游靶向调节轴。

张爽^[4]（2021）在《小鼠子宫内膜胚胎着床相关环状RNA的筛选及作用研究》文中研究表明目的:胚胎着床是生殖的关键步骤,决定妊娠成功与否,研究其机制将有助于解决诸多问题,如不孕症诊断和治疗、提高辅助生殖成功率以及寻求新生殖调控手段等。环状RNA（circular RNA,circRNA）是一类新发现的呈共价闭合环状的内源性非编码RNA（non-coding RNA,ncRNA）。作为竞争性内源RNA（competing endogenous RNA,ce RNA）,circRNA可以通过互补碱基配对海绵吸附微小RNA（micro RNA,miRNA）,减弱miRNA对靶基因抑制,从而提高靶基因表达。研究表明circRNA在病理、生理过程中扮演着重要的角色,然而它们在胚胎着床中的具体的作用尚不清楚。本研究旨在揭示小鼠妊娠第5天（Day5,D5）胚胎着床点和着床旁的子宫内膜组织circRNA表达谱,筛选出差异表达circRNA,并通过探讨其功能及可能的调控机制,为探寻胚胎着床的机制提供新思路。方法:1.circRNA芯片分析与验证（1）采用Arraystar circRNA芯片分析小鼠妊娠D5胚胎着床点和着床旁子宫内膜组织circRNA的表达。（2）运用RT-qPCR对随机挑选的4个差异表达circRNA进行验证。2.差异表达circRNA的生物信息学分析（1）circRNA芯片分析数据结合课题组前期同一时间点子宫内膜组织RNA-Seq数据,获得差异表达的circRNA、miRNA和mRNA,运用生物信息学方法构建circRNA—miRNA—mRNA负调控网络。（2）差异表达circRNA的亲本基因进行GO（Gene Ontology）功能分析和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路分析。（3）circRNA—miRNA—mRNA负调控网络中的基因进行GO功能分析和KEGG通路分析。3.circFoxo3在早孕小鼠子宫内膜蜕膜化中的作用研究（1）以circFoxo3为研究对象,构建小鼠早期妊娠模型、体内人工诱导蜕膜化模型以及子宫内膜基质细胞体外诱导蜕膜化模型,利用RT-qPCR分析circFoxo3的表达规律。（2）circFoxo3在子宫内膜基质细胞蜕膜化中的作用:利用过表达质粒载体转染基质细胞上调circFoxo3表达,体外诱导蜕膜化后,应用RT-qPCR和F-actin染色检测细胞中蜕膜化标志分子Hoxa10表达以及细胞形态变化。（3）circFoxo3与下游miRNA—mRNA的预测与验证:采用Target Scan和miRanda数据库预测与circFoxo3具有结合位点的miRNA;采用micro T、Pictar、miRmap、Target Scan数据库预测与miR-138-5p具有结合位点的mRNA,与课题组前期同一时间点子宫内膜组织RNA-Seq数据分析获得的表达显着下调的mRNA取交集,筛选出与miR-138-5p可能具有调控关系的mRNA,利用双荧光素酶报告基因方法验证两者之间的靶向结合。（4）利用过表达质粒载体转染基质细胞上调circFoxo3表达,体外诱导蜕膜化后,利用RT-qPCR和western blot检测细胞中miR-138-5p、Klf11蛋白表达。（5）利用miR-138-5p mimic转染基质细胞上调miR-138-5p表达,体外诱导蜕膜化后,利用western blot检测细胞中Klf11蛋白表达。（6）Klf11在子宫内膜基质细胞蜕膜化中的作用:利用western blot检测子宫内膜基质细胞体外诱导蜕膜化后Klf11蛋白的表达;利用过表达质粒载体转染基质细胞上调Klf11表达,体外诱导蜕膜化,应用RT-qPCR和F-actin染色检测细胞中蜕膜化标志分子Hoxa10的表达以及细胞形态变化。结果:1.circRNA芯片分析及验证（1）通过Array circRNA芯片检测,在小鼠妊娠D5胚胎着床点和着床旁子宫内膜组织中共发现176个差异表达的circRNA,其中在着床点组织表达显着上调的circRNA 101个,表达显着下调的circRNA 75个（FC≥1.5,P<0.05）。（2）对4个差异表达的circRNA进行RT-qPCR检测,结果显示circRNA＿008885和circRNA＿013924在着床点组织表达上调而circRNA＿21887和circRNA＿004122在着床点组织表达下调,RT-qPCR结果与芯片结果一致,证实了芯片结果的可靠性。2.差异表达circRNA的生物信息学分析（1）构建的circRNA—miRNA—mRNA负调控网络,包含了21个表达显着下调的circRNA（circRNA＿22444、circRNA＿19529、circRNA＿27282等）、14个表达显着上调的miRNA（miR-17-5p、miR-20a-5p、miR-361-5p等）和79表达显着下调的mRNA（actr8、lad1、sv2b等）。（2）对差异表达circRNA亲本基因进行GO分析和KEGG通路分析。GO功能分析包括生物学过程（Biological process,BP）、分子功能（Molecular fuction,MF）和细胞组成（Cellular component,CC）三个亚组分析,BP最显着富集GO条目包括磷酸化、组蛋白H4脱氧乙酸化、组蛋白H3脱氧等;MF包括蛋白质结合、核苷酸结合、ATP结合等;CC包括细胞质、细胞核、复制叉等。最显着富集的KEGG信号通路包括子宫内膜癌、甲状腺激素信号通路、致心律失常性右室心肌病等。（3）对构建的circRNA—miRNA—mRNA负调控网络中79个基因进行GO分析和KEGG通路分析。BP最显着富集GO条目包括蛋白激酶B活化、线粒体细胞色素C释放的正调节、高密度脂蛋白颗粒应答等;MF包括跨膜受体蛋白酪氨酸激酶活性、磷脂酰肌醇2激酶结合、磷脂转运活性等;CC包括细胞膜整体成分、细胞膜、细胞内膜结合细胞器等。最显着富集的KEGG信号通路包括Rap1信号通路、醛固酮调节的钠再吸收、PI3K-Akt信号通路等。3.circFoxo3在早孕小鼠子宫内膜蜕膜化中的作用研究（1）在小鼠早期妊娠模型中,circFoxo3在妊娠D5、D6、D7子宫内膜着床点的表达显着低于着床旁;在小鼠体内人工诱导蜕膜化模型中,蜕膜诱导侧circFoxo3表达显着低于对照侧;在子宫内膜基质细胞体外诱导蜕膜化模型中,诱导蜕膜化后基质细胞中circFoxo3表达显着降低。（2）circFoxo3表达上调抑制子宫内膜基质细胞蜕膜化:利用过表达质粒载体转染上调基质细胞circFoxo3表达,体外诱导蜕膜化后,RT-qPCR检测显示蜕膜化标志分子Hoxa10表达显着降低,F-actin染色观察细胞形态发现细胞蜕膜化受损。（3）circFoxo3与下游miRNA—mRNA的预测与验证:生物信息学预测circFoxo3与miR-138-5p存在结合位点。miR-138-5p与Klf11存在结合位点,双荧光素酶报告基因方法证实两者之间具有靶向结合。（4）利用过表达载体转染基质细胞上调circFoxo3表达,RT-qPCR和western blot结果显示蜕膜化后细胞中miR-138-5p的表达显着降低,而Klf11蛋白表达显着升高。（5）利用miR-138-5p mimic转染基质细胞上调miR-138-5p表达,western blot结果显示蜕膜化后细胞中Klf11蛋白表达显着降低。（6）Klf11表达上调抑制子宫内膜基质细胞蜕膜化:基质细胞体外诱导蜕膜化后,Western blot检测发现细胞中Klf11蛋白表达显着降低。利用过表达质粒载体转染上调基质细胞Klf11表达,体外诱导蜕膜化后,RT-qPCR检测显示细胞中蜕膜化标志分子Hoxa10表达显着降低,F-actin染色观察细胞形态发现细胞蜕膜化受损。结论:小鼠妊娠D5胚胎着床点与着床旁子宫内膜组织呈现差异的circRNA表达谱;circFoxo3参与子宫内膜基质细胞蜕膜化,其机制有待于进一步探讨。

李曾莉^[5]（2021）在《循环中MicroRNA对儿童急性淋巴细胞白血病复发预测价值的Meta分析》文中研究表明目的:急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia,ALL）最常见的儿童恶性肿瘤。虽然儿童ALL的5年无事件生存率（eventfree survival,EFS）达到80%,但是仍有10%～20%患儿因为复发而影响预后。近年来有多项研究表明micro RNA（miRNA）异常表达与儿童ALL复发可能具有一定的相关性,本文应用meta分析系统评价循环中miRNA对ALL复发预测的价值,为临床评估ALL化疗后复发提供相关依据。方法:计算机检索各数据库Web of Science、Pub Med、Embase,中国期刊全文数据库（CNKI）、中国生物医学文献数据库（CBM）、维普（VIP DATA）数据库和万方数据库（WANFANG DATA）筛选自建库之日至2019年12月公开发表的关于miRNA用于ALL预后评估的临床研究文献作为研究对象。根据排除和纳入标准进行文献的筛选、资料的提取和文献质量的评估,然后运用Rev-man和Endnote等软件对最终的纳入研究进行Meta分析。结果:1.共有17篇符合条件的文献被收集用于系统性回顾,累计928例ALL复发患者和497例对照者被纳入用于Meta分析。2.Meta分析结果显示:（1）有miRNA表达的ALL复发组与对照组相比,OR值为3.06,95%CI[1.85,5.15],Chi2126.93 P<0.05,I2=87%,表示miRNA与ALL的复发具有相关性,且分析异质性及敏感性后提示具有统计学意义（P<0.05）;（2）根据ALL复发患儿来自中国还是来自其他国家进行分组。分析发现中国ALL患儿OR=2.56,95%CI[2.04,3.20],Chi259.22,P<0.05,I2=83%,其他国家ALL患儿OR=5.08,95%CI[3.89,6.62],Chi254.64,P<0.05,I2=91%,结果显示miRNA预测复发的价值,其他国家ALL患儿优于中国ALL患儿;（3）根据ALL复发患儿血清miRNA的数量（单个miRNA、多个miRNA）进行分组。分析结果提示单个miRNA:OR=1.09,95%CI[0.82,1.45],Chi29.63,P>0.05,I2=38%,多个（联合）miRNA:OR=6.50,95%CI[5.18,8.16],Chi245.14,P<0.05,I2=80%,表明血清多个miRNA联合的预测价值优于单个miRNA;（4）根据ALL复发患儿血清中miRNA表达上调还是miRNA表达下调进行分组。分析结果提示miRNA表达上调OR=4.49,95%CI[3.65,5.52],Chi288.12,P<0.05,I2=89%,miRNA表达下调OR=3.33,95%CI[2.74,4.03],Chi295.44,P<0.05,I2=86%,表明miRNA表达上调对ALL治疗后复发的预测价值优于miRNA表达下调;（5）由于ALL复发患儿血清中呈上调表达的miRNA种类较多,包括miR-155、miR-399、miR-142-3p、miR-222、miR-7、miR-let-7i、miR-20a等。本研究选取miR-155作为代表,通过分析显示OR值为3.17,95%CI[2.23,4.50],Chi216.15,P=0.001,I2=81%,表明miR-155的表达越高,ALL患儿复发的可能性越大。结论:1.循环中miRNA表达对ALL复发预测具有较大的临床价值,尤其是联合miRNA;2.miRNA预测ALL复发的价值,其他国家ALL患儿优于中国ALL患儿;3.miRNA表达上调对ALL复发的预测价值优于miRNA表达下调;且miR-155的高表达与ALL的复发之间呈正相关;

罗可迪^[6]（2021）在《PHA介导下日本七鳃鳗微小RNA表达谱及关键信号分子靶向miRNA的预测与验证》文中研究指明七鳃鳗是最古老的无颌类脊椎动物代表,是研究脊椎动物起源进化的最佳模式动物。近些年,关于七鳃鳗免疫系统的组成及其调控机制引起了越来越多研究者们的关注。微小RNA（micro RNAs,miRNAs）已经被证明在多种生物中能够调控与代谢有关基因的转录后表达,但是目前关于miRNA的研究较多的集中在高等脊椎动物,而对七鳃鳗中miRNAs的研究少之又少。本研究以日本七鳃鳗（Lethenteron japonicum）为研究对象,利用高通量测序技术,对植物凝集素（phytohemagglutinin,PHA）刺激后的日本七鳃鳗髓样小体进行小RNA测序,对七鳃鳗物种特异性miRNA前体进行识别、芯片预测与鉴定,用生物信息学方法预测了七鳃鳗中与高等脊椎动物TCR信号通路中关键信号分子相同源的分子的靶向miRNA,挖掘七鳃鳗中可能存在的miRNA-m RNA靶向调控机制,为后续研究在PHA刺激下miRNA调控七鳃鳗免疫应答反应所发挥的作用提供依据。本研究的主要结果如下:1.利用高通量测序技术,获得了PHA刺激后日本七鳃鳗髓样小体的小RNA测序数据。通过建立小RNA数据库,对测序数据进行质量控制,与参考序列进行比对,miRNA分类注释等方法分析处理,最终共获得5 974 734个小RNA读数（Read）。经过统计发现,少数miRNA家族经PHA刺激后在日本七鳃鳗髓样小体中呈现极高丰度的表达。2.针对未在miRBase注释的小RNA片段,用华大基因自主构建的miRNA及其前体预测模型进行预测,并且与海七鳃鳗数据库进行比对,筛选并预测得到56个七鳃鳗物种特异性的miRNA的成熟序列及其前体。3.通过定制的基因芯片微阵列分析检测,发现并验证了35个物种特异性的miRNA成熟序列在PHA刺激后七鳃鳗髓样小体中表达,说明这35个具有物种特异性的miRNA为新发现的七鳃鳗特有的全新miRNA家族。4.利用miRDB网站在线预测人、鼠和鸡靶向七鳃鳗中与TCR、BCR信号通路关键信号分子相同源的分子的miRNA。再利用本地程序Clustal X将上述预测结果在所测得的七鳃鳗所有成熟miRNA数据库中比对,找到与人、鼠和鸡同源的七鳃鳗的miRNA。然后使用RNA22.v2软件验证同源信号分子cDNA的3’UTR区与所预测的靶向miRNAs的结合位点。最终我们预测Lja-miR-182-5p可能靶向作用于Lyn分子,Lja-miR-301a-3p可能靶向作用于Vav2分子。5.通过实时荧光定量PCR在核酸水平上分别检测在PHA刺激后它们在七鳃鳗髓样小体中的表达情况,结果表明:与对照组相比,Lja-miR-182-5p的表达量极显着下调,P﹤0.01,Lyn的表达量显着上调,P﹤0.05,具有统计学意义;Vav2表达量上调;Lja-miR-301a-3p的表达量极其显着下调,P﹤0.01,具有统计学意义。综上所述,在七鳃鳗髓样小体中,由于经过PHA刺激后Lja-miR-182-5p与Lyn以及Lja-miR-301a-3p与Vav2的表达水平呈负相关,我们推测Lja-miR-182-5p与Lyn以及Lja-miR-301a-3p与Vav2可能存在靶向调控关系,他们之间的靶向机制,还需要后续进行体外的双荧光素酶报告基因分析实验、体内的敲降和过表达实验进行验证。

马维江^[7]（2021）在《NSCLC差异表达miRNA的筛选及其靶基因生物信息学分析》文中提出[目的]筛选非小细胞肺癌（NSCLC）中差异表达的微小RNA（miRNA）,并对这些差异表达miRNA所调控的靶基因进行生物信息学分析,拟为揭示NSCLC发病机制提供一定理论依据,为肺癌早诊早治疗、预后评估等方面提供新型生物标志物,为肺癌药物研发提供潜在参考靶点。[方法]利用GEO数据库进行分析,进入数据库后检索有关NSCLC中miRNA差异表达的数据集（GSE）,限定物种为人,通过阅读“Title,Summary,Overall design,Platforms”等内容,提取目标数据集并下载原始数据。用R语言及affy包进行质量控制,用limma包进行差异表达计算,并将结果可视化,绘制火山图。选取差异表达变化最为显着的miRNA为研究对象,用miRDB数据库分别预测其靶基因,对表达上调最显着的miRNA靶基因用Venny 2.1.0取交集,绘制Venn图,表达下调的同样方法进行,对两个交集结果取并集作为靶基因进一步研究。应用DAVID数据库对得到的靶基因进行富集分析,包括GO分析和KEGG信号通路分析,GO分析主要包含三个层次,即分子功能（MF）、细胞组成（CC）和生物过程（BP）,用ggplot2包绘制气泡图将结果可视化。为了筛选出中枢基因,应用STRING数据库对靶基因表达产生的蛋白质相互作用进行分析,得到初步PPI网络,将该结果映射至Cytoscape3.8.0软件,应用cytohubba插件计算各节点连通度（degree）,根据degree值整理PPI网络,选取前5的基因作为中枢基因。应用Kaplan Meier plotter数据库分析中枢基因对NSCLC总生存期（OS）预后的影响,采用Kaplan-Meier和log-rank检验,并绘制生存曲线。利用GEPIA2数据库对上述获得的能显着影响NSCLC预后的中枢基因进行表达分析,初步预测其在NSCLC中的表达情况。[结果]通过筛选获得关于NSCLC患者miRNA表达谱的两个数据集GSE17681和GSE135918,共包含46例样本,GSE17681标本来源于外周血,GSE135918标本来源于癌组织和癌旁正常组织。结果显示NSCLC患者外周血中表达上调的miRNA共有216个,下调的167个,癌组织中相表达上调的miRNA共有366个,下调的308个,外周血和癌组织上调最明显的分别为miR-199b-3p和 miR-20a-5p,下调最明显的分别为 miR-19a-5p 和 miR-4471。miR-199b-3p 与miR-20a-5p的共同靶基因有88个,miR-19a-5p与miR-4471的共同靶基因有32个,对两交集取并集得到120个靶基因,以此120个靶基因作为后续研究对象。GO分析结果显示在BP层面中,靶基因主要富集在基因转录的调控、神经细胞树突的形成等条目中（P<0.05）;CC层面主要富集在细胞质、细胞骨架等条目（P<0.05）;MF层面主要富集在蛋白质激活、转录阻遏、mRNA3’-UTR结合等条目中（P<0.05）。KEGG信号通路分析显示,靶基因主要参与MAPK信号通路、神经营养因子信号通路等（P<0.05）。绘制出PPI网络后,选择degree值前5的基因作为中枢基因,分别为BDNF、IRS1、FBXO32、SORL1、NTRK2,其中BDNF的degree值最高。生存分析显示,IRS1和FBXO32高表达的肺腺癌患者有更差的OS预后（P<0.05）;高表达BDNF的肺鳞癌患者有更好的OS预后（P<0.05）;高表达SORL1和NTRK2的NSCLC患者,无论腺癌还是鳞癌,均有更好的OS预后（P<0.05）。中枢基因表达水平分析显示,FBXO32在腺癌和鳞癌两种病理类型中,肿瘤组织表达较正常组织升高,差异有统计学意义（P<0.05）。NTRK2在腺癌中,肿瘤组织表达明显下调,鳞癌中明显上调,差异有统计学意义（P<0.05）,其余基因表达较正常组织均无明显差异。[结论]miR-199b-3p、miR-20a-5p、miR-19a-5p和miR-4471 在 NSCLC差异表达变化最显着,可能参与NSCLC的发病,它们所共同作用的靶基因主要参与基因转录的调控与MAPK信号通路,这可能是它们参与NSCLC发病的潜在机制。基因BDNF、IRS1、FBXO32、SORL1、NTRK2的表达水平能对NSCLC总生存期预后产生影响,可能在NSCLC发病中扮演者癌基因或抑癌基因等角色,但具体影响效应与它们在NSCLC中的表达水平存在一定矛盾,有待于进一步进行实验验证,也有望成为治疗药物研发、寻找新型生物标志物的潜在靶点。

胡博^[8]（2021）在《长链非编码RNA CYTOR通过调节miR-125b-5p/KIAA1522轴影响肝细胞癌增殖、凋亡和细胞周期的机制研究》文中研究说明背景:肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是一种原发性肝脏恶性肿瘤,在世界范围内发病率高、治疗效果欠佳。随着靶向治疗药物如索拉非尼、伦伐替尼,以及免疫治疗药物如免疫检查点抑制剂的出现,其预后得到一定的改善,但5年生存率仍旧不高。竞争性内源性RNA（competing endogenous RNA,ceRNA）揭示了RNA间相互作用的新机制,即以长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）为主的非编码RNA通过竞争性共享微小RNA（microRNA,miRNA）来调节mRNA（messenger RNA,信使RNA）的表达,这种调节机制在癌症的发病机理中扮演了重要的角色。但是,ceRNA在HCC中的功能作用及调节机制仍未被完全解释,新的ceRNA调控轴亟待探究。lncRNA CYTOR是一种已被证实在多种肿瘤中发挥促进细胞增殖、迁移等作用的非编码基因,并可作为多种miRNA的内源性海绵。然而,lncRNACYTOR作为ceRNA在HCC发生、发展中的作用及调控网络目前仍不十分清楚。因此,本研究以lncRNACYTOR为起点,探索ceRNA调节机制在HCC中的应用。材料与方法:通过检索癌症基因组图谱数据库（The Cancer Genome Atlas,TCGA）,获得人类HCC的lncRNA、mRNA和miRNA数据集表达数据和相应临床信息。下载基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus database,GEO）数据库中GSE62232和GSE84402的HCC相关RNA数据用于后续验证。借助在线数据分析工具,分析lncRNA CYTOR在多种肿瘤类型及HCC相关数据集中的表达情况。借助R语言分析lncRNA CYTOR在TCGA数据库中HCC肿瘤组织及癌旁正常肝组织中的差异表达情况,以及其表达水平与TCGA数据库HCC患者总生存期（overall survival,OS）之间的关系。分析lncRNA CYTOR与常用临床病理参数,如性别、年龄、肿瘤分级、临床分期和T、N、M分期之间的关联性,并进一步整合这些参数,通过单因素及多因素Cox回归分析探究lncRNA CYTOR独立预测患者预后的能力。之后,识别TCGA数据库HCC样品中差异表达的miRNA,同时使用ENCORI软件（starbase3.0）预测目标lncRNA的靶向的miRNA,选择差异分析中表达下调的miRNA与预测的miRNA做交集后得出候选miRNA。同理,基于TCGA数据库分析HCC样品中差异表达的mRNA,并基于ENCORI软件使用6个数据库（PITA、miRNAmap、DIANA-microT、miRanda、PicTar 和 TargetScan）预测候选 miRNA 靶向的mRNA,选择差异分析中表达上调的mRNA与预测的mRNA做交集后得出候选的mRNA。使用基因集富分析（Gene Set Enrichment Analysis,GSEA）来识别与所筛选出的mRNA高表达相关的基因集和通路途径,探索其潜在的功能。结果:lncRNACYTOR在多种癌症的肿瘤组织（如结肠癌、肾透明细胞癌、膀胱尿路上皮癌等）及多个HCC相关数据集中（如GSE54236、GSE64041、GSE36376等）相较于癌旁组织表达上调。在TCGA数据库中,与癌旁正常组织相比,HCC组织中的lncRNACYTOR表达水平显着增高（P<0.001）;且高表达患者组的OS较低表达患者组显着缩短（P<0.001）。临床病理参数关联性分析显示,lncRNACYTOR的表达水平与病理分级（Grade）显着相关,且G2与G1（P<0.01）、G3与G2（P<0.05）、G3与G1（P<0.001）和G4与G1（P<0.05）之间存在显着性差异;该基因在临床Ⅱ期（StageⅡ）的表达水平较临床Ⅰ期（StageⅠ）显着上调（P<0.001）,在T2期及T4期的表达水平较T1期显着上调（P<0.001;P<0.05）。独立预后分析表明lncRNA可独立于上述临床参数来预测HCC患者的预后（P<0.05）。ENCORI软件分析得出miR-125b-5p可作为lncRNA CYTOR的靶向miRNA,后续6个数据库综合分析得出KIAA1522及PODXL可作为miR-125b-5p的候选靶向mRNA。对二者进行差异分析、生存分析及与miR-125b-5p的相关分析后,选择KIAA1522作为目标靶向mRNA。相较于癌旁组织,KIAA1522在GSE62232和GSE84402的HCC组织中表达显着上调（P<0.001）。GSEA富集分析结果表明,cell cycle信号通路、adherens junction信号通路、Notch信号通路、mTOR信号通路、Wnt信号通路、MAPK信号通路、VEGF信号通路、apoptosis信号通路和tight junction信号通路相关的基因集在高KIAA1522表达的表型中显着富集。结论:探究lncRNA的表达情况、生物学功能,构建新的lncRNA/miRNA/mRNA调控轴是研究HCC发病机制的有效手段。lncRNA在HCC组织中表达水平显着上调,与多种临床病理参数相关,且可作为HCC患者潜在的预后生物标志物。此外,lncRNA CYTOR可通过靶向miR-125b-5p进而调节KIAA1522的表达参与HCC的发生发展。背景:肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是一种由多种病因引起肿瘤,目前仍是人类最常见、最致命的恶性肿瘤之一。因此,寻找新的、临床上有效的HCC诊断及预后生物标志物至关重要。本实验的主要目的是基于第一部分生物信息学分析的结果,探索长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）CYTOR、微小RNA（microRNA,miRNA）miR-125b-5p 以及蛋白编码信使 RNA（messenger RNA,mRNA）KIAA1522的靶向调控作用及该调控轴在HCC发生、发展中的作用。材料与方法:通过脂质体将目的基因相关载体转染至正常肝细胞（HHL-5）及几种HCC细胞（SK-Hep-1、Hep3b和Huh-7）后,采用实时荧光定量聚合酶链式反应（real time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR）检测 HCC 细胞中 lncRNA CYTOR、miR-125b-5p和KIAA1522的表达,并筛选实验细胞。免疫组化检测KIAA1522在HCC组织及癌旁正常组织中的表达情况。采用双荧光素酶报告基因检测试验证实lncRNA CYTOR、miR-125b-5p和KIAA1522间的调控关系。之后,利用CCK-8细胞增殖毒性检测试剂盒（Cell Counting Kit-8,CCK-8）检测不同转染条件下HCC细胞的增殖情况,采用流式细胞仪分析转染后HCC细胞周期的变化,使用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal-deoxynucleotidy l transferase mediated nick end labeling,TUNEL）观察转染后 HCC 细胞的凋亡情况;并通过蛋白免疫印迹实验（western blot,WB）分析检测细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡等相关蛋白的表达。结果:转染后,相较于HHL-5细胞,Hep3b细胞中上述基因的表达均是最为显着的,故选择Hep3b细胞进行下一步实验。双荧光素酶报告基因检测实验的结果显示miR-125b-5p mimic+CYTOR-wt 共转染组和miR-125b-5p mimic+KIAA1522-wt 共转染组Hep3b细胞的荧光素酶活性显着降低;lncRNA CYTOR可直接作用于miR-125b-5p,而miR-125b-5p可直接靶向KIAA1522。CCK-8实验结合WB检测结果显示敲低lncRNACYTOR抑制了 HCC细胞的增殖,并下调了 Ki-67和PCNA的蛋白表达;抑制miR-125b-5p或KIAA1522的过度表达则促进了细胞的增殖并上调了 Ki-67和PCNA的蛋白表达。流式细胞仪分析结合WB检测结果显示敲低lncRNA CYTOR 降低了 S期及G2/M期比值,下调了 cyclin D1及cyclin E等蛋白的表达而上调了 p21表达;抑制miR-125b-5p或KIAA1522的过度表达则升高了 S期及G2/M期比值,并上调了 cyclin D1等蛋白的表达并下调了 p21表达。TUNEL细胞凋亡检测结合WB检测提示敲低lncRNA CYTOR可促进Hep3b细胞凋亡,下调Bcl-2的表达同时上调 Bax 的表达及 cleaved caspase3/caspase 3、cleaved caspase9/caspase 9;而抑制miR-125b-5p或KIAA1522的过表达则抑制Hep3b细胞凋亡,上调Bcl-2的表达并下调 Bax 的表达及 cleaved caspase 3/caspase 3、cleaved caspase 9/caspase 9。结论:综上所述,HCC中过表达的lncRNA CYTOR可通过靶向抑制miR-125b-5p进而上调KIAA1522的表达水平,促进HCC细胞增殖、影响细胞周期并抑制细胞凋亡。本研究为肝细胞癌的发生机制注入了新的见解。

岳炳霖^[9]（2021）在《牛circRNA的ceRNA网络构建及调控牛骨骼肌细胞发育的功能机制研究》文中研究表明脊椎动物的骨骼肌大部分来源于轴旁中胚层体节,先后经历增生和肥大过程,出生前骨骼肌细胞的数目经增殖分化途径大致已经恒定,出生后主要是肌纤维的肥大增粗以及肌肉卫星细胞响应刺激重新进入细胞周期修复受损肌纤维。骨骼肌发育是一个极其复杂的过程,受到包括生肌调节因子（MRF）和肌细胞增强因子2（MEF2）家族在内的转录因子的精确调控。研究表明非编码RNA也广泛参与骨骼肌的发育,其中涉及微小RNA（miRNA）及长链非编码RNA（lncRNA）的相关研究较为深入。近年来环状RNA（circRNA）作为一类环状闭合的新型非编码RNA因其高稳定性的特征引起高度关注。非编码RNA调控骨骼肌发育的具体分子机制目前知之甚少,涉及转录、转录后及翻译调控,其中研究最为广泛的是竞争性内源RNA（ceRNA）,即非编码RNA通过自身miRNA反应元件（MRE）与miRNA的靶分子竞争性地结合miRNA,从而间接调控miRNA靶分子的机制。本论文基于ceRNA理论,通过分析处理实验室积累的秦川牛两个不同发育时期（胎牛90天,成年牛24月龄）骨骼肌circRNA测序数据,构建秦川牛骨骼肌circRNA-miRNA-mRNA共表达网络,用于挖掘秦川牛骨骼肌发育中重要的circRNA并进行后续的鉴定及功能机制研究。主要研究结果如下:1、牛骨骼肌circRNA-miRNA-mRNA网络构建及功能富集分析为了筛选通过ceRNA途径发挥功能的circRNA,利用生物信息学手段分析了秦川牛两个不同发育时期（胎牛90天,成年牛24月龄）骨骼肌circRNA高通量测序数据,成功构建了circRNA-miRNA-mRNA三元互作网络。随后,对该网络进行了GO和KEGG分析,用以注释共表达circRNA潜在的功能与涉及的通路,并且对共表达的circRNA进行了生物学鉴定及组织表达谱分析。结果显示三元互作网络由17个circRNA、18个miRNA以及462个mRNA组成。功能富集分析表明,这些circRNA主要参与细胞发育过程,暗示其在牛骨骼肌发育过程中可能发挥着重要作用。通过实验手段总共鉴定出6个circRNA:circRNA47、circRNA126、circRNA962、circRNA2121、circRNA4394和circRNA4490。对鉴定出来的这6个circRNA在秦川牛两个不同发育时期进行了组织表达谱分析,发现这些circRNA在胎牛骨骼肌组织中高表达,暗示它们可能调控早期骨骼肌发育。2、circHUWE1调控牛肌原代细胞增殖分化的ceRNA机制研究从构建好的三元互作网络中筛选出circHUWE1-miR-29b-AKT3信号轴,通过一系列的实验探究circHUWE1-miR-29b-AKT3调控牛肌原代细胞发育的具体过程。首先通过生物学手段鉴定circHUWE1（circRNA47）是circRNA,核质分离实验显示circHUWE1主要定位于细胞质,暗示其参与转录后调控。通过构建circHUWE1过表达载体及干扰片段转染牛肌原代细胞分别进行功能获得性及缺失性实验,利用CCK-8、Ed U、流式细胞术、q RT-PCR及WB手段检测细胞增殖、凋亡和分化表型。结果显示circHUWE1促进牛肌原代细胞增殖,并抑制细胞凋亡和分化。接着,借助生物信息学手段、双荧光素酶报告基因测定法和AGO2RNA免疫沉淀（RIP）方法来验证circHUWE1、miR-29b和AKT3之间的互作关系,结果表明circHUWE1可以通过竞争性结合miR-29b解除其对AKT3的抑制,从而最终激活AKT信号通路调控牛肌原代细胞的增殖凋亡及分化。3、circSVIL通过抑制STAT1磷酸化来调节牛肌原代细胞的发育从牛骨骼肌circRNA-miRNA-mRNA共表达网络中筛选出circSVIL（circRNA126）并成功进行生物学鉴定,核质分离及FISH结果显示circSVIL在细胞核和细胞质中都有表达。借助CCK-8、Ed U、流式细胞术、q RT-PCR及WB实验方法,证实了circSVIL能够促进牛肌原代细胞增殖,抑制细胞凋亡。然而,后续机制探究显示circSVIL并不通过ceRNA途径发挥调控功能。生物信息学预测到circSVIL有STAT1转录因子结合位点,通过进一步的细胞核质分离、RIP及挽救实验,证实了circSVIL可以通过与STAT1相互作用抑制STAT1磷酸化,抑制STAT1核易位影响STAT1的下游信号级联,从而促进肌原代细胞增殖并抑制细胞凋亡。本研究通过利用秦川牛两个不同发育时期骨骼肌circRNA高通量测序数据构建了circRNA-miRNA-mRNA三元网络模型,筛选出具有潜在调控骨骼肌发育的circHUWE1及circSVIL,并且在牛肌原代细胞水平上进行了一系列功能机制研究,阐明了circHUWE1及circSVIL调控牛肌原代细胞发育的功能及作用机制,这些发现提供了牛骨骼肌发育的新的调控途径,也为后续肉牛育种提供了潜在的候选分子。

李伟^[10]（2021）在《整合素α2基因多态性及微小RNA作用于川崎病冠状动脉病变机制研究》文中指出研究背景川崎病（Kawasaki Disease,KD）是一种原因未明的全身性中、小血管炎反应综合征,其主要临床特点包括发热、皮肤粘膜损害、颈部淋巴结肿大等,本病是日本的儿科医生川崎富作在1967年首次报道,其主要损害是冠状动脉病变,早期表现为冠状动脉扩张、冠状动脉动脉瘤,恢复期可形成冠状动脉狭窄、血栓形成以及心肌梗死等,严重可导致死亡。未经治疗的患儿约20%～25%可导致冠状动脉病变。此病多发于5岁以下儿童,发病人群主要为亚裔人群。2012年日本流行病学报告小于5岁的儿童KD发病率为264.8/10万,国内流行病学资料表明,北京市2000年至2004年5岁以下儿童发病率为（40.9～55.1）/10万,上海市2013至2017年5岁以下儿童发病率68.8～107.3/10万,呈逐年升高趋势,而且近些年来发病率越来越高,当前KD已是儿童最常见后天性心脏病主要病因之一。KD的发病病因及机制尚不明确。当前的研究认为KD在遗传易感性基础上,由外源性抗原触发,引起机体免疫机制紊乱所致全身中小血管炎。流行病学研究显示KD的发病率存在明显的种族之间差异,以亚裔的人群发病率较高以及同胞之间发病率高,提示KD的发病机制有一定的遗传易感性因素参与。整合素α2（Integrinα2,ITGA2）是重要的胶原蛋白受体,在上皮细胞和血小板中表达较高,在血小板以及纤维胶原的粘附过程中具有非常重要的作用,粘附过程会导致血小板的激活和血栓的形成,在冠心病、动脉粥样硬化、脑卒中、肿瘤及免疫性炎症反应等中发病中发挥着重要作用。单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms,SNP）指基因组内DNA中某一特定核苷酸位置上存在转换、颠换、插入、缺失等不同类型且其中发生率大于1%的变异。然而ITGA2基因SNP与KD冠状动脉病变相关的关系,查阅国内外文献,我国汉族人群中尚无该基因多态性与KD相关报道,本研究探讨ITGA2在我国汉族人群中的KD分布情况以及研究ITGA2的基因单核苷酸多态性与KD冠状动脉病变相关性,为进一步改善KD患儿预后提供理论依据。微小RNA（microRNAs,miRNA）是一组约20个左右核苷酸高度保守的非编码RNA,广泛存在于自然界中。研究发现miRNA在心血管疾病、免疫性疾病及肿瘤等多种疾病的发生发展中,通过与靶基因的3’端（非翻译区）区域部分序列相结合,互补后降解已转录的靶基因mRNA,或者抑制靶基因编码蛋白进而对疾病发生发展起到作用。血浆miRNA作为生物标志物以及用于诊治疾病是目前研究的热点。因miRNA在组织和血液的表达相对稳定,不容易被核酸酶消化,且miRNA的表达在不同种类疾病、组织和细胞中具有特异性。所以导致血浆miRNA在各种疾病早期诊断以及药物开发等临床基础方面的研究全面开展。对于血浆miRNA在KD作用机制尚未完全清楚,因此,本研究以筛选出KD的明显差异表达血浆miRNA的差异表达为切入点,通过茎-环的RT-PCR方法检测和验证明显差异表达miRNA,分析其生物学功能,为进一步研究发病机制和发现新的生物学标志物是KD早期诊断、治疗重要内容,最终为KD合并冠状动脉损伤的患儿早期诊断和基因靶向的治疗并改善预后提供理论依据。KD的诊断主要是依靠临床的表现,尚未特异性诊断指标,能否早期诊断及治疗KD是影响KD冠状动脉病变预后的关键。KD治疗方案主要为静脉输注丙种球蛋白（Intravenous Immune Globulin,IVIG）及口服阿司匹林治疗,经规范治疗后KD冠状动脉病变发生率可下降至5%左右。阿司匹林具有抗炎作用,可缩短发热时间和抗血小板作用,因此是最初治疗KD的疗法之一。meta分析表明,阿司匹林治疗不影响冠状动脉瘤形成。自从KD患儿应用IVIG治疗在1983年首次报道,之后的研究证实IVIG能够降低KD合并冠状动脉病变发生风险,在KD病程第7～10天内治疗可得到最好效果。但第10天后仍存在持续发热、炎症指标升高和/或冠状动脉病变的患儿也应给予大剂量IVIG治疗。也有日本研究显示病程4天内时早期开始治疗者更容易出现IVIG无反应。2017年AHA发布的《川崎病诊断、治疗与长期管理的新科学声明》建议诊断者明确尽早使用IVIG,诊断时间最早可提前到发病第3天。虽然IVIG作用的机制仍不明确,但IVIG具有全身性抗炎作用,能够减轻发热并减少急性反应物,其可能机制包括:调节细胞因子的水平和生成、增加T细胞抑制因子活性、下调抗体合成、对补体系统的作用、以及提供抗独特型抗体。虽然使用大剂量IVIG可预防KD冠状动脉病变,但IVIG的时机和有效性对中期KD冠状动脉结局影响仍需进一步确定。目的1.探讨我国汉族儿童整合素α2的基因单核苷酸多态性与KD冠状动脉病变相关关系。2.探讨miRNAs与KD冠状动脉病变发病机制相关关系。3.分析大剂量IVIG治疗时机对KD冠状动脉病变结局的影响及影响KD冠状动脉病变的高危因素。方法1.应用病例-对照研究的方法,我们选择对ITGA2基因位点,利用NCBI dbSNP数据库和SNP info信息,筛选符合以下标准的研究SNPs:（1）在HapMap数据中报道的中国汉族后代中等位基因频率≥5%并且不包含于已有的KD全基因组范围关联研究中;（2）位于基因调控区或影响转录因子结合位点活性或启动子中的微小RNA结合位点活性或改变外显子中的氨基酸。采用卡方检验比较一般资料以及SNP基因型在KD研究组及对照组中的分布差异。采用单因素及多因素logistic回归分析来计算比值比（OR）、校正OR及95%置信区间（CI）用来评估关联的程度。2.通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测KD患儿在IVIG治疗前、后及正常健康儿童血浆中的miRNA差异表达的建立。筛选出选择明显差异表达的miRNA在更大的样本临床资料中进一步验证。关键miRNA在KD冠状动脉病变的作用机制研究。3.本研究回顾性分析在2015年1月至2017年12月期间诊断为KD患儿,随访终点2018年12月。该项研究已在中国临床试验注册中心登记。本研究主要指标是入院时超声诊断冠状动脉病变及12月内随访心脏超声结果。次要指标是IVIG治疗前后炎症指标。以ROC曲线下面积、敏感性和特异性为指标筛选出评价IVIG治疗KD的预防冠状动脉病变（coronary artery lesions,CALs）最佳时机,采用t检验和卡方检验比较各组别人口学特征、炎症指标以及冠状动脉病变构成比,应用单因素及多因素logistic回归分析KD冠状动脉病变因素。结果1.ITGA2基因SNP与KD冠状动脉病变的相关性。本研究随机选择KD组818例,选择同时期的年龄、性别想匹配1401例健康儿童作为对照组,符合标准所选择血小板活化通路核心基因ITGA2基因C807T（rs1126643）。该基因型在KD组及对照组中性别、年龄存在着差异无统计学意义。818例KD根据有无并发冠状动脉瘤（coronary artery aneurysms,CAAs）,分为两个亚组,其中CAAs组116例（14.18%）,702例（85.82%）患儿为无CAAs组。研究人群中ITGA2基因型的HWE=0.9626>0.05,说明本次研究对整个群体具有一定的代表性。多因素logistic回归分析ITGA2基因C807T（rs1126643）在KD组及对照组差异有统计学意义。与健康对照组相比,相对于我们发现ITGA2基因C807T（rs1126643）T等位基因低于对照组,差异有统计学意义（p<0.05）。OR值<1为保护因子。相对于rs1126643野生型CC基因型,经过年龄、性别校正后,TT基因型携带者患儿患病的风险降低了 38%（校正 OR=0.62,95%CI=0.43-0.88,p=0.0078）,TTvsCT+CC（校正 OR=0.63,95%CI=0.44-0.889,p=0.0093）。我们发现 ITGA2 基因C807T（rs1126643）TT基因型对KD具有保护作用。进一步分层分析表明,当ITGA2基因C807T（rs1126643）CC/CT作为对照基因型,TT基因型者在年龄≤60月龄,女性患儿及KD无CAAs更具显着保护作用。2.miRNA与KD冠状动脉病变的相关性研究,选择5例KD合并冠状动脉病变在IVIG治疗前、后患儿血浆的具有明显的差异miRNA,芯片结果显示miR-126在KD患儿治疗前明显降低,IVIG治疗升高（大于2倍以上）。选择进一步扩大样本到10例KD合并冠状动脉病变接受大剂量IVIG治疗治疗前、后患儿及5例健康儿童作为对照组采用实时荧光定量PCR研究方法进行检测验证差异表达miR-126。定量PCR显示差异表达miRNAs在KD治疗前患儿中明显低表达但在健康儿童、接受IVIG治疗的KD合并冠状动脉病变患儿检测到表达的候选miRNAs,统计结果显示,在所验证的差异miRNA分子中,miR-126在KD IVIG治疗中明显差异表达,具有统计学差异（p<0.05）,说明筛选结果可靠。前期研究结果显示治疗过后的KD患儿血浆miR-126表达量增高,上述资料表明miR-126是对于血管内皮有积极作用的。使用较为权威的数据库Target Scan在线软件对的miRNA-126的靶基因进行预测miR-126,双荧光素酶报告基因实验明确miR-126与靶基因SPRED1相结合（p<0.05）,差异有统计学意义。说明miR-126能通过结合SPRED1基因3’UTR影响其荧光活性改变。用Western-Blot实验方法,验证与SPRED1因子相关的细胞信号通路蛋白,miR-126 mimics 其靶基因 SPRED1 表达量下调,增强了 VEGF,FGF-1,Ras-p21,MAPK-p38蛋白水平依次增加为1.67倍,1.93倍,1.76倍和1.86倍,加入miR-126 Inhibitor后,miR-126 inhibitor组的SPRED1蛋白水平是Cell组的1.51倍,同时受到负调控因子的SPRED1的调控,VEGF,FGF-1,Ras-p21及MAPK-p38的蛋白水平依次减少为0.54,0.64,0.59和0.63,实验证实miR-126有利于促进血管内皮细胞生长。将miR-126 mimic及inhibitor的小分子转染HCAEC,结果表明,miR-126 mimic导致HCAEC细胞活力上调,细胞周期发生变化,处在G2期的细胞比例显着增高,而处在S期的细胞比例显着降低（p<0.05）。而转染miR-126 inhibitor后HCAEC的反应则相反。其细胞活力显着下降,G2期细胞比例显着降低,而S期细胞比例无变化（p<0.05）。表明KD患儿miR-126的确能够对HCAEC起积极作用,通过治疗后KD患儿血液内miR-126表达量上升,病情好转。本研究结果证实miR-126在KD合并冠状动脉病变的通过关键靶基因SPRED1的调控血管生成因子VEGF,FGF-1作用的分子机制。3.IVIG治疗时间对KD冠状动脉病变结局的影响。研究3年时间符合入选标准并随访12月1281例KD患儿。ROC曲线显示IVIG治疗时间预测KD冠状动脉病变的最佳天数为7.5天,ROC曲线下面积为0.80（95%CI=0.76-0.84,p<0.001）。本研究中816例（56.9%）为男性,465例为女性患儿（43.1%）。患儿中位年龄为12个月（11-36个月）,141例（11%）为IVIG无反应KD患者。患儿接受IVIG治疗的中位数时间为6天,诊断时339例（26.5%）有CALs,94 例（7.3%）有 CAAs。随访 12 个月,39 例（3.0%）仍存在 CALs,23 例（1.8%）持续存在CAAs。根据IVIG治疗时间将所有病人分为4组:第1组为发病第4天内接受IVIG治疗,第2组为发病第5-7天内接受IVIG治疗,第3组为发病第8-10天内接受IVIG治疗,第4组为发病后10天以后接受IVIG治疗。第1组77例、第2组817例、第3组249例和第4组138例。第4组IVIG无反应率高于其他3组,差异有显着性（p=0.001）。入院诊断KD时,心脏彩超CALs在第1至4组分别 14.1%,19.5%,35.3%和 58.7%;CAAs 在第 1 至 4 组分别 2.6%,3.5%,8.4%和30.4%。随访12个月,第3、4组CALs和CAAs发生率均高于第1、2组,差异有显着统计学意义（p<0.001）。CALs和CAAs在第1、2组构成比不同,但差异无统计学意义。第2组与第3组相比,两组之间比较存在差异并统计学意义（p<0.05）,1 月时 KD 患 CALs 及 CAAs 相对风险分别为 OR 2.1（95%CI 1.4-3.0）,OR 3.9（95%CI 1.9-8.2）,12个月时KD患CALs及CAAs相对风险分别为OR 5.3（95%CI 2.0-13.9）,OR 13.5（95%CI 2.9-14.1）。根据12月随访结果影响KD合并CALs多因素logistic回归分析,将患儿的年龄、性别、发热持续天数、IVIG使用病程天数、IVIG无反应、白细胞、中性粒细胞百分比以及C-反应蛋白8个因素做单因素分析,筛选有意义自变量进行多因素logistic回归分析,结果显示IVIG使用病程天数、丙球无反应与是KD合并CALs独立危险因素（p<0.001）。结论1.血小板活化通路核心基因位点ITGA2 C807T（rs1126643）基因多态性改变可能与中国人群的KD发病以及KD合并冠状动脉病变遗传易感性有关,此结果尚需要更大规模前瞻性研究进一步验证。2.差异表达的miR-126在KD治疗前表达明显下降,IVIG治疗后明显升高,通过直接下调控靶基因SPRED1,导致VEGF,FGF-1,Ras-p21及MAPK-p38的表达量增加,从而促进血管生成的活化。提示miR-126及其靶基因SPRED1可能与KD冠状动脉病变的发生、发展过程有关,可能成为KD合并冠状动脉病变潜在的早期诊断标志物和治疗新靶点。3.本研究表明IVIG治疗在KD病程7天内可更好有效预防冠状动脉病变。IVIG治疗在病程4天内并不会增加冠状动脉病变发生率和IVIG无反应的发生率。IVIG使用天数、IVIG无反应是KD合并CALs高危因素,因此建议大剂量IVIG对急性期KD治疗越早越好。

二、miRNA—一类新的调控微小RNA（论文开题报告）

（1）论文研究背景及目的

此处内容要求：

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例：

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

（2）本文研究方法

调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、miRNA—一类新的调控微小RNA（论文提纲范文）

（1）基于核酸构象调控的生物电路（论文提纲范文）

（3）基于生物信息学筛选持续性心房颤动相关circRNA并构建circRNA-miRNA-mRNA综合调节网络（论文提纲范文）

（4）小鼠子宫内膜胚胎着床相关环状RNA的筛选及作用研究（论文提纲范文）

（5）循环中MicroRNA对儿童急性淋巴细胞白血病复发预测价值的Meta分析（论文提纲范文）

（6）PHA介导下日本七鳃鳗微小RNA表达谱及关键信号分子靶向miRNA的预测与验证（论文提纲范文）

（7）NSCLC差异表达miRNA的筛选及其靶基因生物信息学分析（论文提纲范文）

（8）长链非编码RNA CYTOR通过调节miR-125b-5p/KIAA1522轴影响肝细胞癌增殖、凋亡和细胞周期的机制研究（论文提纲范文）

（9）牛circRNA的ceRNA网络构建及调控牛骨骼肌细胞发育的功能机制研究（论文提纲范文）

（10）整合素α2基因多态性及微小RNA作用于川崎病冠状动脉病变机制研究（论文提纲范文）

四、miRNA—一类新的调控微小RNA（论文参考文献）

• [1]基于核酸构象调控的生物电路[D]. 焦凯. 中国科学院大学(中国科学院上海应用物理研究所), 2021(01)
• [2]胞外囊泡微小RNA在急性肺损伤中的相关研究进展[J]. 任颖聪,陈淼,刘鑫鑫,冯帮海. 中华危重病急救医学, 2021(05)
• [3]基于生物信息学筛选持续性心房颤动相关circRNA并构建circRNA-miRNA-mRNA综合调节网络[D]. 翟震宇. 南昌大学, 2021(01)
• [4]小鼠子宫内膜胚胎着床相关环状RNA的筛选及作用研究[D]. 张爽. 重庆医科大学, 2021(01)
• [5]循环中MicroRNA对儿童急性淋巴细胞白血病复发预测价值的Meta分析[D]. 李曾莉. 西南医科大学, 2021(01)
• [6]PHA介导下日本七鳃鳗微小RNA表达谱及关键信号分子靶向miRNA的预测与验证[D]. 罗可迪. 辽宁师范大学, 2021(08)
• [7]NSCLC差异表达miRNA的筛选及其靶基因生物信息学分析[D]. 马维江. 昆明医科大学, 2021(01)
• [8]长链非编码RNA CYTOR通过调节miR-125b-5p/KIAA1522轴影响肝细胞癌增殖、凋亡和细胞周期的机制研究[D]. 胡博. 北京协和医学院, 2021(02)
• [9]牛circRNA的ceRNA网络构建及调控牛骨骼肌细胞发育的功能机制研究[D]. 岳炳霖. 西北农林科技大学, 2021
• [10]整合素α2基因多态性及微小RNA作用于川崎病冠状动脉病变机制研究[D]. 李伟. 南方医科大学, 2021(02)