杨婷[1]（2021）在《Bacillus subtilis JD-014好氧反硝化脱氮与调控机理研究》文中指出含氮物质的大量排放是导致水环境持续恶化的原因之一,目前氮素污染物的日益积累已经严重破坏了生态平衡,并进一步威胁到人类的健康安全。因此,如何有效控制水体中的氮素污染已成为当前环境治理领域所面临的一个重要挑战。生物脱氮技术已被证实是处理含氮污染物最经济高效且绿色环保的方法,并已得到广泛应用。伴随好氧反硝化菌的发现,生物脱氮技术有望被进一步的优化。而针对该类功能菌株开展好氧反硝化代谢途径和调控机制的系统解析,可为进一步提高脱氮效率以及促进其实际应用提供重要的参考依据。因此,本研究在筛选出好氧反硝化芽孢杆菌的基础上,综合利用基因组和转录组分析技术,通过借助分子生物学操作手段,对脱氮代谢途径中的关键基因进行挖掘和功能验证,探究其调控机制。主要研究结果如下:1.从不同环境来源的样本中分离筛选出4株具有好氧反硝化功能的芽孢杆菌,通过16S r DNA序列比对及系统发育分析,初步鉴定为Bacillus pumilus JD-005,Bacillus subtilis JD-014,Bacillus paralicheniformis JD-016和Bacillus subtilis JD-017;以上菌株对硝态氮、亚硝态氮和氨氮等不同形式的氮源都有很好的降解效果。同时,在多种含氮物质共存的条件下,上述菌株均能表现出良好的好氧反硝化特性。根据脱氮性能,以菌株JD-014为目标菌株,分别从气态氮物质的产生、氮平衡估算以及功能基因的分析等方面初步证实JD-014具备好氧反硝化代谢途径。2.通过Pac Bio RS II测序平台成功完成了菌株JD-014的基因组测序,全长数据已上传NCBI,登录号为CP045478-CP045479。JD-014基因组上包括了一个4,215,417 bp的环状染色体和84,215 bp的质粒,GC含量分别为43.51%和35.11%。共有4324个编码基因,其中染色体上有4223个,质粒上存在101个。通过注释及比对分析,发现JD-014基因组上共有43个基因参与到氮代谢通路,其中与好氧反硝化途径相关的潜在基因有9个。通过将JD-014与近缘菌株B.subtilis 168相比,二者反硝化功能基因同源性为100%,但脱氮能力完全不同。菌株JD-014与168在脱氮过程中的细胞形态以及基因组上成分的差异可能是影响其脱氮性能不同的重要原因。3.利用温敏型质粒p NZT和FLP/FRT位点重组系统的同源重组方法对JD-014好氧反硝化代谢途径中相关的候选功能基因敲除,并对其功能进行回补验证。发现当编码硝酸盐还原酶的4个候选基因被敲除后,突变菌株脱氮率降低了12.72-31.64%;而在将编码一氧化氮还原酶的2个候选基因以及编码氧化二氮还原酶的2个候选基因敲除后,对比原始菌株JD-014的N2生成量,除1株突变株无明显差异外,其余3株突变株的生成量分别降低了14.32-18.42%。此外,在JD-014基因组上还发现了氮代谢过程中一个新型编码亚硝酸盐还原酶的关键基因nirsir,敲除后的突变体无法降解NO2--N,而回补后菌株脱氮性能再次恢复,也能通过好氧反硝化过程生成N2;在进一步对其过表达后,菌株降解NO2--N以及N2生成量又有所提高,表明nirsir是JD-014上参与氮代谢过程中一个重要的功能基因。4.对JD-014在好氧反硝化过程中的转录组进行测序分析后发现,低浓度硝酸盐诱导下的好氧反硝化过程共有567个基因发生差异表达,其中349个上调表达,218个下调表达;而在高浓度硝酸盐脱氮组中,则产生更多的差异表达基因（1046个）,其中上调599个,下调447个。通过对脱氮过程相关的差异表达基因进行分析,发现参与电子传递链与碳代谢相关的差异基因表达上调会为好氧反硝化的进行提供更多的电子和能量;与细胞运动相关的差异基因表达上调使得菌株JD-014在对氮素污染物的降解过程中具有更好的环境适应性;好氧反硝化的进行也受与编码膜转运、转录调控相关差异基因的表达水平影响。5.菌株JD-014在丁二酸钠和柠檬酸钠为碳源,C/N为10-25,温度为37℃,转速为150-200 r/min,盐度为1%以下时具备最佳的好氧反硝化性能。此外,JD-014还具有较好的亚硝酸盐耐受性,在NO2--N高达200 mg/L时脱氮率仍可达到50%左右。利用连续式反应器考察了菌株JD-014处理人工模拟废水的性能,发现JD-014在不断连续循环的反应器体系下,对NO3--N和NO2--N的最大去除率可以高达98.91%和81.99%,上述结果表明JD-014具备在大规模脱氮处理过程中的应用潜能。
赵吉臣[2]（2021）在《基于多组学分析的日本囊对虾生长调控机制初步研究》文中研究说明甲壳动物作为无脊椎动物中最大的类群之一,具有潜在的巨大经济价值。生长性状是经济类甲壳动物最重要的性状之一,直接影响养殖品种的产量与经济效益。然而,迄今为止甲壳动物生长性状的生物学机理研究并不充分,尤其是在日本囊对虾等十足目动物中。本文以日本囊对虾为研究对象,构建日本囊对虾零换水养殖模式,基于形态学分析研究该模式下日本囊对虾生长规律。在此基础上,进一步借助多种技术手段对同一家系不同生长阶段体质量显着差异的日本囊对虾从生理生化、肠道菌群、基因层面、蛋白层面和代谢物层面进行研究,旨在解析日本囊对虾生长调控机制。以期为完善甲壳动物生长性状基础理论提供参考资料,为对虾乃至其它经济类甲壳动物育种和养殖提供理论支撑。主要结果如下:本研究以构建的日本囊对虾全同胞家系为实验材料,采用零换水养殖模式养殖日本囊对虾,日本囊对虾在无底质、不换水的情况下,存活90 d以上并且活力良好。试验期间水体理化因子稳定,pH 为（8.13±0.07）～（8.61±0.01）,NH4+-N 为 0～（0.769±0.124）mg/L,NO2--N为0～（0.167±0.034） mg/L,NO3--N为0～（1.267±0.120） mg/L。该模式下日本囊对虾的生长大致分为两个生长阶段:30～50日龄为快速生长期,特定生长率和相对增长率最大,分别为4.28～9.51 %/day和53.46%～158.83%;50～100日龄为稳定生长期,特定生长率为2.15～2.37 %/day,相对增长率为24.00%～26.7 1%。本研究构建日本囊对虾零换水养殖模式并证实其具有可行性,得到该养殖模式下日本囊对虾生长规律,为后续研究取样时间的选择提供了依据,为日本囊对虾生产实践提供了理论参考。通过对不同生长阶段体质量显着差异的日本囊对虾生理生化指标和肠道菌群进行分析,来研究动态变化的生理指标与日本囊对虾生长之间的关系。快速生长组（FG）α-淀粉酶（α-Amylase,AMS）活性在40和100日龄高于缓慢生长组（SG）,FG组脂肪酶（Lipase,LPS）活性在每个生长阶段均高于SG组,胰蛋白酶（Trypsin,TRS）活性刚好与LPS相反。FG组溶菌酶（Lysozyme,LZM）活性在每个生长阶段均高于SG组。FG组过氧化氢酶（Catalase,CAT）和总超氧化物歧化酶（Total Superoxide Dismutase,T-SOD）活性在40日龄高于SG组,在100日龄时刚好相反。12个肠道菌群样品的Q20均在73.63%以上,Clean Reads均在90.29%以上。注释到2,771个OTUs,FG组OTUs数量高于SG组,1,484个OTUs为两组共有。FG和SG组Alpha Diversity指数无统计学差异（p>0.05）。在门分类水平上,FG组厚壁菌门（Firmicutes）丰度高于SG组（p>0.05）;在属分类水平上,FG组弧菌属（Vibrio）丰度低于SG组（p>0.05）。FG组碳水化合物代谢（Carbohydrate Metabolism）功能高于SG组（p<0.05）。对全虾体成分分析,FG组水分含量比SG组低（p<0.05）,粗蛋白含量比SG组高（p>0.05）。上述结果表明,FG组日本囊对虾可能通过增强对碳水化合物和脂肪的吸收、利用能力,以及减少一些不必要能量的消耗,来合成更多蛋白质,实现生长优势。通过对来自同一家系不同生长阶段体质量显着差异的日本囊对虾进行转录组学分析,获得111.64 Gb Clean Data,鉴定到10,194个基因。日本囊对虾全长转录组相比二代组装转录组,得到的基因平均长度更长,基因注释率更高。在特定生长率大的快速生长期（40日龄）相比特定生长率小的稳定生长期（70日龄）,鉴定到更多差异表达基因（DEGs）。215个DEGs为快速生长期和稳定生长期共有,其中106个DEGs在两个生长阶段表达趋势一致,其余109个趋势相反。通过qPCR对在两个生长阶段表达趋势一致的DEGs进行验证,实验结果与转录组一致,证实转录组数据可靠。快速生长期和稳定生长期得到的DEGs功能相对保守,包括糖酵解（Glycolysis）通路在内的12条显着富集通路为两个生长阶段共有。首次报道Hippo信号通路（Hippo signaling pathway-fly）直接参与甲壳动物生长,克隆得到该通路中的关键基因Mj14-3-3-like。其ORF为741 bp,编码246 个 AA。 Mj14-3-3-like在快速生长组对虾高表达,在蜕皮间期表达量最低,这些结果表明Mj14-3-3-like可能负调控日本囊对虾生长。通过对来自同一家系不同生长阶段体质量显着差异的日本囊对虾进行蛋白质组学分析,鉴定得到1,720个蛋白质。在日本囊对虾快速生长期和稳定生长期,分别鉴定到52和70个差异表达蛋白（DEPs）。10个DEPs为快速生长期和稳定生长期共有,并且每个DEP在两个生长阶段表达趋势一致,提示它们可能是日本囊对虾潜在的生长标志物。对蛋白质组和转录组做联合分析,在快速生长期和稳定生长期分别筛选到10和7个DEPs/DEGs,大多数基因表达趋势一致。蛋白质组、转录组和qPCR均证实MHC-1a和MHC-1b在快速生长组对虾中低表达,提示它们可能负调控日本囊对虾生长。克隆得到Mj14-3-3-epsilon-like、MjGPI和MjGPD1,它们的ORF分别为822、1,671 和 1,098 bp,编码 273、556 和 365 个 AA。Mj14-3-3-epsilon-like 在快速生长组中低表达,在蜕皮间期表达量较低;MjGPI和MjGPD1在快速生长组中高表达,在蜕皮间期表达量较高;这些结果表明它们可能调节日本囊对虾生长。快速生长组对虾可能通过Hippo信号通路促进细胞增殖和抑制细胞凋亡,实现生长优势;快速生长组对虾还可能通过激活包括糖酵解途径在内的多种代谢途径,实现生长优势。通过对来自同一家系不同生长阶段体质量显着差异的日本囊对虾进行代谢组学分析,在正、负离子模式下分别鉴定到2,342和1,811种代谢物。在正离子模式下的快速生长期和稳定生长期,分别鉴定到229和275种差异代谢物;在负离子模式下的快速生长期和稳定生长期,分别鉴定到149和85种差异代谢物。在正、负离子模式下,分别有75和30种差异代谢物为快速生长期和稳定生长期共有,并且每种差异代谢物在两个生长阶段表达趋势一致,提示它们可能在日本囊对虾生长中起重要作用。通过ELISA试剂盒,对鉴定到的共有差异代谢物丙酮酸等进行检测,实验结果与代谢组一致,证实代谢组数据可信。在100日龄的快速生长组对虾中,丙酮酸含量同样低于缓慢生长组。这些结果表明丙酮酸是日本囊对虾一种潜在的生长标志物。快速生长组对虾可能通过激活包括糖酵解途径在内的多种代谢途径,实现生长优势。此外,本团队前期构建了一种地膜池养殖日本囊对虾模式,这种养殖模式以塘底铺设“地膜”取代传统养殖模式塘底铺设的“沙子”。该养殖模式下日本囊对虾可以存活5个月以上,不过相比传统养殖模式养殖的日本囊对虾生长缓慢,体色由黄变蓝。本研究通过对传统养殖模式和地膜池养殖模式养殖日本囊对虾鳃和肝胰腺进行比较转录组学分析,得到60,780个基因。在鳃中鉴定到1,005个DEGs （427个上调,578个下调）,在肝胰腺中鉴定到115个DEGs （41个上调,74个下调）。这些结果表明鳃相比肝胰腺对外部环境变化更敏感。包括肌动蛋白和淀粉酶在内的多个必需基因受到抑制,可能是导致地膜池养殖日本囊对虾生长缓慢的原因。虾青蛋白（Crustacyanin subunit A和C）在地膜池养殖日本囊对虾中高表达,可能是导致地膜池养殖日本囊对虾体色变蓝的原因。本研究初步解析了地膜池养殖日本囊对虾生长缓慢和体色变蓝的分子机制,为完善地膜池养殖模式提供了理论依据。
于泽洋[3]（2021）在《棘孢木霉T46的筛选、生产及诱导山新杨抗性机理研究》文中认为木霉菌（Trichoderma spp.）生长能力强,不仅能抑制多种病原真菌繁殖,同时具有促进植物生长和提升植物抗病性的作用。目前应用于农林业生产的商业化木霉产品当以哈茨木霉制剂为主,鲜有其他种的木霉。本文从东北林业大学哈尔滨实验林场人工林（126.63°E,45.72°N）及帽儿山实验林场天然林（127.57°E,45.29°N）中,采集白桦（Betula platyphylla）、水曲柳（Fraxinus mandshurica）、胡桃楸（Juglans mandshurica）和黄檗（Phellodendron amurense）4 树种根围5-15cm层土样,并从土样中分离木霉菌株。依据形态学和ITS序列分子生物学鉴定,共得到木霉71株、8种:棘孢木霉（T.asperellum）,哈茨木霉（T.harzianum）,钩状木霉（T.hamatum）,深绿木霉（T.atroviride）,侧耳木霉（T.pleuroticola）,绿木霉（T.virens）,脐孢木霉（T.brevicompactum）和拟康氏木霉（T.koningiopsis）。其中分离菌株数最多的3种木霉分别为深绿木霉33株、钩状木霉10株、棘孢木霉9株。树种与木霉菌株数量分布关系为:白桦根围分布37株、水曲柳根围分布15株、胡桃楸根围分布10株、黄檗根围分布9株。以每种木霉生长速度最快菌株为目标菌株（8种8株）,分别测定其抗逆境能力和抑菌能力。结果显示,哈茨木霉T61、棘孢木霉T46和侧耳木霉T53对盐、碱胁迫和营养差异具有较强的抵抗能力和适应能力;哈茨木霉T61、棘孢木霉T46和钩状木霉T35对钟状镰刀菌（Fusarium camptosorus）、尖孢镰刀菌（F.oxysporum）、链格孢菌（Alternaria alternata）、腐皮镰刀菌（F.solani）、胶胞炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）、树舌（Ganoderma applanatum）、灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）、金黄壳囊孢菌（Cytospora chrysosperma）均具一定抑菌能力。经综合对比分析,棘孢木霉T46在抗逆境和抑菌能力等方面比较好,经棘孢木霉T46处理后山新杨幼苗叶片的过氧化氢酶与硝酸还原酶活性、可溶性糖与可溶性蛋白含量均显着提高,接种链格孢菌后病斑也明显小于对照组,表明在棘孢木霉T46诱导下山新杨提高了自身的抗性。以13种农林业废弃物为发酵底料,测定棘孢木霉T46发酵质量。结果发现,蒙古栎木屑为底料时棘孢木霉孢子产量不佳,以蒙古栎、白桦、水曲柳、胡桃楸、小黑杨的树叶为底料时棘孢木霉T46孢子产量高于木屑和秸秆（P<0.05）,其中以蒙古栎叶（初始含水率200%）和小黑杨叶（初始含水率500%）为底物棘孢木霉T46产孢量最高。以原料的数量、来源和成本等指标综合考量,以玉米秸秆为底料,通过单因素筛选实、Plackett-Burman、最陡爬坡和中心组合设计等实验,确定了棘孢木霉T46发酵的最优配方:初始含水率300%（v/w,mL/g）,可溶性淀粉含量0.4%（w/w）,硝酸铵含量0.5%（w/w）,磷酸二氢钠含量0.46%（w/w）,经该配方发酵其棘孢木霉T46产孢量最大,为5.9×109个/g。利用棘孢木霉T46孢子悬浮液处理山新杨,并从转录水平上研究棘孢木霉T46对山新杨影响的分子机制。对比不同时间点的转录组数据,挖掘到差异基因18165条,其在3个时间点的表达模式基于热图聚类可分为6个,基于H-cluster软件分为4个。对差异基因进行GO功能富集分析,发现处理7h的样本中,差异基因富集到的蛋白相关功能涉及氨基酸代谢、氨基酸分解、氨基酸糖代谢、蛋白复合物和蛋白核心复合物;处理28h的样本中,差异基因显着富集到的蛋白相关功能则为氨基酸转运、蛋白质转运、蛋白质定位到细胞器等功能。KEGG富集分析发现在不同的时间点的样本中α-亚麻酸代谢、氨基酸生物合成、酪氨酸代谢、糖酵解/糖异生和异喹啉生物碱合成等通路均被差异基因富集,确定了棘孢木霉T46诱导山新杨后其抗性提升的途径及机制,为后续研究和关键基因发掘奠定了理论基础。利用棘孢木霉T46孢子悬浮液处理山新杨后取样构建代谢组,从代谢水平上研究了棘孢木霉T46对山新杨诱导的分子机制。研究结果表明,18个样本在正负离子模式下共计得到2470个代谢物,这些代谢物基于LIPID MAPS的注释多数为多聚乙烯类、孕烯醇酮酯类和脂肪酸类化合物。比对不同组别数据发现两种离子模式下发掘到585个差异代谢物,基于热图聚类,正、负离子模式下得到的差异代谢物表达模式均有7种。KEGG通路富集分析发现,这些代谢物显着富集到氨基酸合成与降解以及蛋白的合成通路上,反映山新杨经棘孢木霉T46处理后,基于这些代谢物的变化最终实现抗性的提升。基于代谢组与转录组的综合分析,得到245条关键基因,其中244条得到了氨基酸序列,并被注释到109个保守结构域中,GST（Glutathione S-transferase）保守结构域、ADH（alcohol dehydrogenase）保守结构域和FrsA（Fermentation-respiration switch protein FrsA）保守结构域最多的氨基酸序列注释,可能是参与棘孢木霉T46诱导山新杨抗病性提升的关键蛋白家族。对转录组中所有基因进行筛选比对,去除identity大于95%的冗余基因,获得GST家族基因64个（其中31个为联合分析得到的关键基因）,ADH家族基因10个（8个为关键基因）,FrsA家族基因18个（8个为关键基因）。山新杨接种链格孢菌后,对基因PdPap-ADH-7（ADH家族）以及基因AT1进行转录分析发现这两个基因均持续显着上调,且在有棘孢木霉T46诱导的情况下,上调水平更加明显,具有深入研究的价值。转录分析显示,棘孢木霉T46通过诱导茉莉酸途径的JAR1基因、MYC2基因和水杨酸途径的NPR1基因表达提升山新杨抗性。构建了植物过表达载体pROK2-ADH-7,以农杆菌介导的方式构建能够过量表达PdPap-ADH-7基因的山新杨转化子,获得转化子PdPap-ADH-7.1和PdPap-ADH-7.2,它们的PdPap-ADH-7基因表达量分别为对照的24.26和25.91倍。受到链格孢菌的胁迫后,转化子PdPap-ADH-7.1和PdPap-ADH-7.2的水杨酸途径相关基因NPR1较对照上调更加显着,在28h处达到最大,表达量分别为对照的25.43倍和24.8倍;野生型NPR1基因的表达则为先下调后上调,表达量在28h处达到最大,上调23.18倍。但是过量表达PdPap-ADH-7基因对茉莉酸途径相关基因JAR1基因和MYC2基因的影响并不明确。综上所述,本研究从4种东北常见林木的根围获得一株生防能力较强的棘孢木霉T46,并初步研究了针对该木霉的固态发酵配方,为该株棘孢木霉的应用和生产提供了基础数据。将棘孢木霉T46接种至山新杨,测定了转录组和代谢组,对这两组数据进行了关联分析,并对挖掘到的PdPap-ADH-7基因进行了验证,为从分子层面揭示棘孢木霉诱导植物抗病机理提供依据。
李敏[4]（2020）在《鸳鸯茉莉花瓣褪色分子机理及光温调控技术的研究》文中指出鸳鸯茉莉（Brunfelsia acuminata）,为茄科（Solanaceae）鸳鸯茉莉属（Brunfelsia）多年生常绿灌木。因为体内存在降解酶的作用致使花瓣花青素发生降解,花瓣开放后由蓝紫色变为纯白色,其褪色的分子机理尚未清楚。本研究主要对鸳鸯茉莉不同时期的花瓣进行转录组学和广泛靶向代谢组学联合分析,以探讨鸳鸯茉莉花瓣褪色的分子机制,并通过光质及温度处理探索其花色与环境因子的关系,为花色变化的深入研究奠定基础。同时,为生产实践上通过设施调控花色及其它园艺产品品质等提供数据参考。本试验主要研究结果如下:1鸳鸯茉莉花瓣生长发育过程中形态及生理指标的变化通过对鸳鸯茉莉花瓣各种形态及生理指标的测定,结果表明:鸳鸯茉莉花瓣由深紫色变为白色开放的过程中,花瓣的色素主要分布上表皮,并且随着天数的增加,花瓣色素随之减少。通过高效液相色谱仪（HPLC）检测到鸳鸯茉莉花瓣花青素的类型是锦葵色素-3-O-葡萄糖苷（Mv）、飞燕草素葡萄糖苷（Dp）和矮牵牛素葡萄糖苷（Pt）,且主要成分为Mv型,其为鸳鸯茉莉花瓣呈蓝紫色的主要原因。2鸳鸯茉莉花瓣转录组测序分析本试验以三个时期（1d,3d,5d）的花瓣为试验材料,使用BGISEQ-500平台进行转录组测序分析,组装并去冗余后得到117,253个Unigene,预测出2,026个编码转录因子的Unigene。通过差异基因分析,在1d VS 3d对比中获得的差异基因（DEGs）总数为9823个,其中上调表达的基因个数为4334,下调表达的基因个数为5489。1d VS 5d对比中获得的差异基因（DEGs）总数22855个,上调表达的基因个数为11299,下调表达的基因个数为11556。在3d VS 5d对比中获得的差异基因（DEGs）总数16607个,上调表达的基因个数为8024,下调表达的基因个数为8583。根据差异基因KEGG富集分析结果表明,黄酮和黄酮醇生物合成（ko00944）是富集结果最明显的途径。基于转录组测序分析的结果,找出了类黄酮（ko00941）和花青素生物合成（ko00942）中所有差异结构基因（DEG）及有关的转录因子,并分析了10个花青素合成关键结构基因（CHS、CHI、F3H、F3’H、F3’5’H、DFR、ANS、UGT、GT1、OMT）和2个转录因子（MYB75、b HLH）在三个不同花瓣时期（1d、3d、5d）的表达水平。除了F3H、GT1和F3’H外,其它基因均下调表达。其中,CHS、F3’5’H、DFR、UGT、OMT和MYB75显着低表达,它们可能是花瓣从紫色到白色的主要原因。此外,通过q RT-PCR还对与花色有关的其它途径中的12个相关基因进行表达量分析。结果表明:在三个不同花色时期中,COMT、C4H、FLS、PAL、4CL、SAMT、C3’H、CCo AOMT、LAR、HCT、POD基因及转录因子MYB4均显着上调表达。F3’5’H、DFR基因作为花青素生物合成途径中后期的关键结构基因,其在白色花瓣中（5d）表达水平显着低于紫色花瓣（1d）并且MYB可能调控这些基因变化主要转录因子。因此,根据转录组测序分析得到的结果为F3’5’H、DFR基因及MYB转录因子是引起花瓣褪色的候选基因。3鸳鸯茉莉花瓣的广泛靶向代谢组学分析本试验通过广泛靶向代谢组学对不同花色的三个时期（1d,3d,5d）进行代谢物的检测,共检测到724种代谢物,其中第1天（1d）有644种,第3天（3d）710种,第5天（5d）708种。其中黄酮类物质有132种（包括48种黄酮,15种黄烷酮,10种花青素,20种类黄酮,32种黄酮醇和7种异黄酮）。经过差异代谢物分析后,1d和3d对比之间检测到292种差异代谢产物,1d和5d对比之间检测到331种代谢物,3d和5d对比之间检测到130种差异代谢物。并且差异代谢物种类较多为苯丙烷类,有机酸类及其衍生物和氨基酸及其衍生物。通过差异代谢物KEGG功能富集分析结果显示,除次生代谢途径外,代谢物发生差异最多的主要途径为类黄酮合成途径和苯丙烷代谢途径（ko00940）。这说明花瓣的褪色与这两个途径存在关系,为接下来的组学联合分析奠定基础。4鸳鸯茉莉转录组与广泛靶向代谢组学联合分析通过差异代谢物和基因KEGG富集分析结果表明,花瓣褪色过程中差异基因及差异代谢物最多的途径为类黄酮生物合成和苯丙烷生物合成途径。将与花瓣颜色变化有关的差异代谢物（DEM）及差异基因和转录因子,建立了差异的代谢物和基因网络图。在构建的网络图中发现花青素合成途径中的基因及代谢物下调表达,但与此途径拥有共同前体物质的其它途径中基因及相应差异代谢物均上调表达。尤其是在花青素生物合成下游部分（MYB4,FLS及LAR显着上调表达,MYB75,DFR及ANS基因显着下调表达）它们之间可能是产生竞争共同物质前体作用,致使花青素合成酶基因的表达水平受到了抑制,其合成的前体物质流向其它途径并促进黄酮醇和其它物质的增加,从而导致花瓣的颜色由紫色变为白色。因此,综合联合分析的结果得出,花青素合成下游中的起始基因DFR及ANS可能是花瓣发生褪色的关键结构基因,且MYB75及MYB4是调控这些基因下调的转录因子。5光质和温度调控鸳鸯茉莉花瓣花色变化以鸳鸯茉莉离体花瓣和植株上的花瓣为试验材料,使用光照智能控制系统调制红光、绿光、蓝光不同比例的配比,比率分别为:（白光,W,1:1:1）,（暗处理,An,0:0:0）,（红光,R,10:0:0）,（绿光,G,0:10:0）,（蓝光,B,0:0:10）,（Y,8:2:0）,（P,7:0:3）,（F,3:0:7）,（L,5:5:0）,温度保持在25℃,光照强度均为100μmol·m-2·s-1的条件下设置了三组处理方法进行探索光质及温度对鸳鸯茉莉花瓣褪色的影响。结果表明,不管是离体花瓣还是植株上花瓣,进行不同光质的处理后,花青素含量随着处理时间的增加而逐渐减少。在光质的对比中,红光（R）处理后的花青素含量最高,降解速度最慢;蓝光（B）处理后的花青素含量最低,降解速度最快。同时,光质处理后花瓣中的酶和基因也发生相应的变化。从整体上看,CHI,DFR及ANS酶活性在红光处理中显着高于其它处理。并且,CHI、F3’5’H、ANS、UGT和AOMT基因的表达水平均显着高于其它处理。其中,ANS和UGT基因在红光处理下48h和96h的表达水平尤为显着。这说明红光延缓了花青素的降解,可能是由于ANS、UGT等基因在花瓣开放后期中都有表达。并且,LAR和POD基因及负调控转录因子MYB4在蓝光处理48h时,突然上调表达,且表达水平均显着高于其它两组,这可能是加速了花青素降解的原因。此外,白光、红光、蓝光三种不同光质在三种温度（15℃,25℃,35℃）处理后结果表明,温度越低,花青素含量越高,且红光处理中花青素的含量最高,蓝光处理中花青素含量最低。因此认为,红光处理（R）有利于延缓花青素的降解,且温度越低能更有效的延缓其降解速度。综上所述,鸳鸯茉莉花瓣褪色原因主要是花青素合成途径与其它途径发生竞争作用,花青素合成关键基因（DFR,ANS）和转录因子MYB75的下调表达及MYB4的上调表达,导致合成花青素的前体物质流向挥发物质及黄酮类物质途径（PAL、4CL、C3’H、CCo AOMT、FLS、LAR等基因色上调表达和相关代谢物的增加）。因此,DFR和ANS基因作为花青素生物合成后期关键的基因,最有可能是直接引起花瓣褪色的目标结构基因,并且MYB75及MYB4是调控其变化的转录因子。同时,这些基因的表达与光质有关,且红光低温可有效的延缓花青素降解速度,影响其花色的变化。
柳颖[5]（2020）在《杂交瘤细胞中百菌清特异性抗体基因的表达及调控机制》文中研究说明目前,农药残留问题仍然是食品安全领域的焦点问题,迫切需要建立快速、可靠的残留分析方法。免疫分析方法以其灵敏度高、检测迅速、易操作等特点,在快速诊断领域占有巨大市场。杂交瘤细胞作为制备免疫分析法的核心元件单抗的主要工程细胞,具有制备技术成熟、抗体表达量多、抗体特异性高等优势。本研究对体外培养条件下,杂交瘤细胞表达农药特异性抗体及其调控机制进行探究,为提高杂交瘤细胞的稳定性以及抗体表达量提供理论基础。研究内容与结果:（1）以百菌清（BJQ）特异性杂交瘤细胞为研究对象,表征了培养过程中出现不分泌特异性抗体的转阴现象,表现为增殖加快、不表达抗体轻链和/或重链蛋白,并对抗体基因及其转录表达进行比对分析,发现阴性细胞特异性抗体基因序列丢失或未丢失但表达量显着下调。（2）选择BJQ抗体基因表达量显着下调的对数生长期的D4细胞株与阳性细胞株E2进行转录组比较分析,发现D4癌基因Pet2上调,抑癌基因Lrig1下调;RNAi验证发现与囊泡转运相关基因Vapa、浆细胞分化关键因子Prdm1以及转录因子Foxb1与抗体表达显着相关。（3）利用CRISPR library对百菌清杂交瘤细胞进行全基因组基因编辑,利用农药压力筛选和流式分选方式对CRISPR敲除细胞文库进行抗体表达升高和降低的全生长周期细胞筛选,对富集的功能基因进行分析和归纳:调控杂交瘤细胞抗体表达的主要“油门”基因为抑癌基因Hivep3、Lrig1,MAPK通路基因Grap、Kras,转录调控因子Cebpb、Foxb1、Prdm1、Prdm2、Pax5,囊泡转运相关蛋白Rab12、Vapa、Vapb;主要“刹车”基因为促癌基因Pet2、Rad51、Rad50、Wnt2、Relb,抑制凋亡的基因Ucp2、Perp,促进周期进程的基因cdc25b、Id1、Plk2、Cdkl2,细胞周期进程中的周期蛋白和激酶,胞间信号传导相关的基因Rabgef1,MAPK及上游受体通路基因Rgs4、Gapt、Ralb、Rasef,PI3k/Akt通路中的基因Akt3。其中Foxb1、Prdm1、Vapa为si RNA干扰验证基因,与抗体表达成显着正向关,Pet2、Ccnd2为sh RNA干扰验证基因,与抗体表达呈显着负相关;并通过Erk/MAPK信号通路调控细胞周期和抗体基因表达。（4）对百菌清免疫各阶段的小鼠脾脏细胞进行转录组分析,发现百菌清刺激后,B细胞激活、增殖和分化为浆细胞的过程主要通过BCR级联的Ras-Erk/MAPK信号通路,启动细胞生长及抗体基因表达,与杂交瘤细胞主要通路一致。（5）对杂交瘤细胞抗体表达及调控机制进行归纳:杂交瘤细胞融合了B细胞表达特异性抗体的基因功能及SP2/0细胞不断增殖分裂的功能,在体外培养阶段两者同步进行并互相制约,通过Erk/MAPK通路及上下游相关调控因子进行细胞生长及抗体表达的调控;平台生长期细胞增殖的抑制可以促进抗体的表达,而因基因突变导致的细胞增殖异常加快会抑制抗体的表达。本研究表征了杂交瘤细胞抗体基因及其表达的多样性,探讨了百菌清特异性杂交瘤细胞抗体的表达及调控机制,明确了主要关键调控因子和信号通路,该研究为进一步提高杂交瘤细胞特异性抗体表达的稳定性及产量提供一定的理论基础。
马晓楠[6]（2020）在《用于CHO细胞转录组学分析的内参基因研究及影响Fc融合蛋白产量的潜在基因筛选》文中研究说明生物药从出现至今凭借卓越的疗效、生物科技的快速发展以及研发投入的不断增加,已成为制药行业近年来发展最快的子行业。2019年生物药的全球市场规模已超过3000亿美元,其中抗体类相关药物（完整抗体、Fc融合蛋白、双特异性抗体等）占据了大部分。中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）因具有较理想的翻译后修饰功能,一直是生物药制备的主要表达载体。在已经上市的抗体类药物中约7成都是在CHO细胞中生产的。虽然利用CHO细胞进行抗体类药物制备的产量在过去的几十年有了很大提升,但面对市场规模的不断加大,其产能仍难满足需求,所以提高CHO细胞株的产量具有重要的现实意义。Fc融合蛋白与完整抗体相比,没有轻重链之间的相互作用,在表达机制上必然有所不同,为了了解CHO细胞中与Fc重组蛋白产量相关的部分机制,本研究首先对CHO-K1贴壁细胞进行了无血清全悬浮驯化,然后利用编码有G1p1-Fc融合蛋白的质粒进行转染,通过单克隆筛选获得了 5株具有不同重组蛋白表达水平的CHO细胞,各细胞株的产能经过ELISA及免疫荧光观察的双重确认后对各细胞株进行RNA-seq转录组学测序分析。为使后续的试验结果能够尽量客观地反应胞内的相关机制,对该研究条件下的内参基因进行了鉴定,候选基因的三个来源分别是:（一）常用的管家基因:（二）已报道的表达完整抗体的CHO细胞中的内参基因;及（三）我们转录组测序结果中选出的基因。从中选择了 20个候选基因在多个试验条件下进行分析鉴定,利用geNorm,NormFinder,BestKeeper和ACt四种不同的程序与算法,最终确定了在75天长期培养中基因Akrlal、Gpxl和Aprt及加料培养中的基因Akrlal和Rps16分别显示出了最高的表达稳定性,适宜用作内参基因进行校正。上述基因均是未报道过的适用于表达Fc融合蛋白的CHO细胞中的内参基因。基因Pabpn1,Hirip3和Actb在两种培养过程中的表达稳定性均最低。通过比较利用不同表达稳定性的内参基因对目的基因作校正时,基因相对表达量会有明显不同甚至完全相反的结果显示出选择适宜内参基因的重要性。该工作为表达Fc融合蛋白的CHO细胞中相关研究提供了更为稳定的可选择的内参基因。通过分别比较高产、中产、与低产细胞株的转录组数据,分析差异表达基因、差异表达基因GO功能分析、差异表达基因通路功能分析以及差异表达基因蛋白互作分析等,获得20个可能与Fc融合蛋白产量相关的潜在目标基因,然后利用鉴定出的内参基因对上述20个潜在目标基因进行RT-qPCR验证,其中12个基因得到与转录组分析相似趋势的结果并作为RNA干扰试验的初筛对象。经过mRNA水平与重组蛋白表达水平的复证,确定基因thbd和medag的下调对GLP1-Fc融合蛋白的产量分别具有降低和提高的作用。最后利用shRNA载体对高产株CHO-12构建沉默medag基因的稳定细胞株,进一步验证该基因对重组蛋白表达的影响及初步作用机制,通过逐级扩大的筛选最终获得基因medag表达下调的稳定细胞株CHO-12-medag-2E9。对该细胞株进行生长参数的检测发现与对照细胞株相比,Fc融合蛋白的表达量增加了 13%,倍增时间缩短1.6小时（7%）,推测蛋白产量的增加可能是由于生长速度加快所引起。为后续该基因的相关作用机制的研究,弥补该基因极其有限的生物学信息提供了试验基础。
陈嘉琪[7]（2020）在《基于基因组学及乳清蛋白水解特性的德式乳杆菌保加利亚亚种差异性分析》文中认为德式乳杆菌保加利亚亚种是广泛应用于发酵乳制品生产的乳酸菌之一,具有高效的蛋白水解系统。研究表明德式乳杆菌保加利亚亚种的蛋白水解特性存在差异性,但是德式乳杆菌保加利亚亚种菌株的蛋白水解基因型差异性、乳清蛋白的利用能力仍有待进一步研究。本文以采集自青海、四川和新疆的发酵牦牛乳和曲拉等样品的24株德式乳杆菌保加利亚亚种菌株为研究对象,进行了基因草图测序;结合NCBI公布全基因组、染色体组及基因草图测序的39株德式乳杆菌的基因序列,进行包括同源进化分析、核心基因与泛基因分析和蛋白水解体系关键基因的分布等比较基因组学的研究。结果表明德式乳杆菌的泛基因组呈现开放型,仍在进行菌株的进化。COG功能注释结果表明菌株的附属&特有基因组与核心基因组相比具有更多的功能基因,蛋白水解体系关键基因分析结果表明菌株编码寡肽转运系统的OppA最具菌株多样性,编码部分肽酶的PepD、PepQ、PepO和PepI在菌株之间存在多样性,而编码胞壁蛋白酶的基因高度保守。依据基因组学的分析结果,选择了处于不同进化分支且蛋白水解相关基因差异较大的8株德式乳杆菌保加利亚亚种菌株,对其在乳清蛋白培养基中的肽酶活力和主要乳清蛋白的利用情况进行测定。在12 h的发酵过程中,3种肽酶活力均表现出先升高后降低的变化趋势,但不同菌株的肽酶活力之间存在差异性。8株菌株均表现出对α-乳白蛋白较强的水解能力（26.93%31.33%）,但对于β-乳球蛋白的水解能力存在菌株差异性,β-乳球蛋白的变异体A和B的水解率分别是10.56%22.82%和9.04%23.83%。菌株的氨肽酶活力与β-乳球蛋白的水解能力之间存在一定相关性,菌株DQHXNS8L6和DQHXNS15M2在3 h内即能达到最高的氨肽酶活力并有效水解β-乳球蛋白;PepD、OppA和OppB的基因数量与菌株的三种肽酶活力以及β-乳球蛋白的水解能力之间也表现出一定的相关性。对8株德式乳杆菌保加利亚亚种菌株进行乳清蛋白-乳糖体系发酵实验,结果表明菌株产肽能力（相对分子质量<2000）存在差异性,选取了产肽能力较强的菌株DQHXNS1L2和DQHXNS8L6,对其在4种不同初始pH值条件下（7.0、6.5、6.0和5.5）的产肽能力进行测定,结果表明初始pH值6.0条件下2株菌株具有最高的产肽能力。初始pH为6.0和6.5时,半胱氨酸肽酶和脯氨酸特异性肽酶活力较高且具有菌株差异性,而胞壁蛋白酶、金属肽酶活力在选取的pH范围内基本不受影响。对2株菌株水解产物中的多肽进行鉴定,发现菌株DQHXNS8L6比DQHXNS1L2拥有更多的切割位点。在菌株DQHXNS8L6的水解物中鉴定出5种来自β-乳球蛋白的生物活性肽,分别是LDAQSAPLR、DAQSAPLRVY、ILAEKTKIPAVF、IDALNENK和LSFNPTQ,其中4种含有Pro残基。综上所述,德式乳杆菌保加利亚亚种菌株在蛋白水解系统上存在基因型和表型的差异性,菌株的产肽能力与半胱氨酸肽酶和脯氨酸肽酶活力具有一定的相关性,且其均受到体系pH值的影响。
姜紫薇[8]（2020）在《有机废弃物堆肥降解土壤PAHs的作用机制研究》文中研究表明多环芳烃（Polycyclic aromatic hydrocarbon,PAHs）是一类具有两个及两个以上芳香环结构的持久性有机污染物。PAHs易在土壤中滞留,并可能通过食物链的传递和逐级放大作用对人类健康和生态系统造成不利影响。本研究以睾丸酮丛毛单胞菌（Comamonas Testosteroni）作为外接菌剂,设置4个处理组:牛粪与田园土堆肥组（CK）、牛粪与PAHs污染土堆肥组（PAH）、外接菌剂—牛粪与田园土堆肥组（CK+）及外接菌剂—牛粪与PAHs污染土堆肥组（PAH+）,建立牛粪-PAHs污染土壤模拟联合堆肥体系。测定了堆肥腐殖化进程中萘（Naphthalene,Nap）、菲（Phenanthrene,Phe）、苯并[a]芘（Benzo[a]pyrene,BaP）含量、理化参数、酶活性变化,通过qPCR和高通量测序分析该过程中微生物群落结构的动态变化,并探究了该牛粪堆肥过程中产生的腐熟肥料施用于PAHs污染老化土中对PAHs的降解作用。研究的主要结果如下:（1）牛粪和PAHs污染土壤按干重比6:4进行联合堆肥实验65d的过程中,体系内有机质含量由51.00%～59.02%下降至27.57%～31.06%,降解速率随时间的延长而减缓,PAHs的存在能够显着提高堆肥升温期有机质降解率,但PAHs和外接菌剂的双重作用则与之相反,高温期过后,二者均不影响堆肥进程中有机物质的转化。PAHs污染土壤在堆肥后期可溶性糖和可溶性氨基酸等易降解小分子物质含量显着低于非PAHs污染土壤,引起该变化的主要原因是PAHs对微生物存在胁迫作用使微生物提高自身代谢以抵抗不良环境。4个处理组中胡敏酸与富里酸的比值均逐渐上升,并在第65d时大于1.9,符合堆肥腐熟标准,且PAH+组中腐殖酸类物质和胡敏酸含量显着高于其他处理组。（2）通过GC-MS对牛粪-土壤联合堆肥体系中PAHs的动态变化进行了测定,堆肥结束时,Nap、Phe、BaP的降解率分别为81.97%～82.16%、79.44%～82.89%、59.63%～61.55%,三种PAHs均有显着降解;外接菌剂在堆肥初期快速起效,显着提高了Phe和BaP在初始7d内的降解效率。堆肥前期1～12d内,PAHs和外接菌剂均使样品中脱氢酶（Dehydrogenases,DHA）活性显着高于CK,因此PAHs的存在和外源菌剂的接入可以从不同角度强化整体微生物的代谢活性。PAH+组中多酚氧化酶（Polyphenol oxidase,PPO）和漆酶（Laccase,Lac）均表现出较高的活性,能够在PAHs的生物修复中起重要作用。（3）通过qPCR分析16S rRNA、3α-HSD/CR、PAH-RHDαGNF在联合堆肥进程中拷贝数的变化,发现外接菌剂能够提高体系内细菌的生物量,与此同时使堆肥结束时PAH-RHDαGNF基因拷贝数上升,而由于PAHs对体系内细菌有胁迫作用,3α-HSD/CR基因的拷贝数小幅降低。对细菌16S rRNA进行高通量测序分析表明,PAHs和外接菌剂均对堆肥过程中物种丰富度和多样性产生影响。堆肥内细菌主要来源于21个菌门,其中优势菌门为变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）、放线菌门（Actinobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）。统计分析属水平上的物种丰度,并与理化指标、酶活性、功能基因及PAHs含量进行皮尔森相关性分析、冗余分析和网络分析发现,外接菌剂能够显着提高土着微生物对Phe和BaP的降解能力,同时提高了微生物群落结构对PAHs的适应性和微生物类群与PAHs的响应关系。（4）以20%的比例向PAHs污染老化土中施入牛粪-土壤联合堆肥过程中产生的腐熟肥料,对培养30d过程中PAHs含量进行测定,发现腐熟肥料的施入能够显着提高老化土PAHs的降解效率,30d内LMW-PAHs和HMW-PAHs降解率分别是58%～79.93%和31.15%～36.58%;除个别处理组外,∑13 PAHs降解率可达45%以上,降解效果良好。同时腐熟肥料的施入能够显着提高PPO、DHA和脲酶活性,说明牛粪-土壤联合堆肥产生的腐熟肥料能够有效提高老化土中微生物生物量及其代谢活性,有利于PAHs的降解。综上所述,本文构建了有机废弃物和PAHs污染土壤联合堆肥体系,探究了堆肥及接菌堆肥对PAHs的降解作用,及堆肥过程中微生物群落结构动态变化,上述实验表明,堆肥和接菌堆肥均能在一定程度上提高PAHs污染土壤中PAHs的降解效率并提高影响堆肥体系内的理化指标和酶活性;同时堆肥过程能够显着提高PAHs降解功能基因拷贝数;虽不改变微生物群落结构组成,但对堆肥体系内门水平和属水平的细菌相对丰度和属间相关性及菌属与各指标间相关性有影响。将牛粪-土壤联合堆肥过程产生的腐熟肥料与PAHs污染土壤联合培养,实验证实腐熟肥料能够作为土壤改良剂对该老化土进行生物修复。因此本文在探究利用堆肥过程降解土壤中PAHs的作用机制的同时,对有机废弃物的处理及土壤PAHs的“原位堆肥修复”提供理论依据及应用基础。
段应策[9]（2020）在《香菇草酸代谢响应环境pH的研究》文中研究指明香菇作为中国食用菌中主要的栽培种类,产量长期位于各类食用菌中首位。近年来,香菇菌棒的生产工厂越来越多,但工厂化制作的菌棒经常出现发菌异常的问题,主要表现为菌丝生长缓慢,甚至不萌发,但具体的原因尚不清楚。调研时发现木屑在大规模的露天存放过程中,发酵使木屑pH下降,栽培时工厂利用石灰或碳酸钙将培养料pH调节至正常水平的6-7,但仍然出现抑制香菇菌丝生长的问题,猜想可能与环境pH调节有关。针对这一问题,本论文通过研究培养基pH与香菇菌丝生长代谢的关系,明确环境pH影响香菇菌丝生长的机制,本论文的研究结果如下:1、环境pH影响香菇菌丝的正常生长。酸化木屑中含有高浓度的柠檬酸和乳酸会抑制香菇菌丝生长。在PDA培养基上试验发现,无缓冲作用时香菇菌丝能在pH 3-7正常生长;有缓冲作用时香菇菌丝只能在pH 3-4正常生长。酸化木屑添加石灰后形成的柠檬酸钙和乳酸钙具有缓冲作用,缓冲作用显着抑制香菇菌丝的生长,随有机酸浓度增加缓冲作用影响越为明显。当pH调节至最适4时香菇菌丝生长正常,可以消除缓冲作用和有机酸浓度的影响。2、香菇分泌草酸降低环境pH。当生长的培养基pH高于4时,香菇菌丝随生长的变化将培养基pH逐渐降至3-4。草酸分泌量随培养基pH增加而增加,生长速度也随p H增加而降低。外源添加碳酸钙时培养基pH会升高,在碳酸钙培养基上会形成由草酸钙晶体构成的透明圈。香菇菌丝对可溶性草酸盐耐受度较低（2.5 mM以内）,不溶性草酸钙耐受度很高可达到50 mM。3、转录组分析草酸在香菇中的代谢途径。选择四种不同p H条件下生长的香菇菌丝进行转录组分析,共鉴定差异基因9073个。差异基因分析中发现不同pH可能会影响到香菇菌丝中多糖、海藻糖、糖原含量的变化,并利用RT-PCR验证了草酸代谢途径与柠檬酸循环和乙醛酸循环之间的重要关系,绘制出草酸代谢的基本路径。对草酸合成的关键基因LeOAH1进行基因克隆及原核表达,发现调控LeOAH1基因表达的主要是响应pH的转录因子PacC。综上所述,本文通过研究环境pH与香菇生长的关系,揭示了香菇的草酸代谢途径,阐明了环境pH对香菇菌丝生长的重要作用,这为香菇菌棒生产提供了理论指导。
杨雁霞[10]（2020）在《胃肠道微生物宏基因组中耐盐酶类、基因及6-磷酸海藻糖水解酶的研究》文中研究指明耐盐酶类及基因对于高盐环境中微生物的生长代谢具有重要作用,并在海产品加工、洗涤等生物技术领域广泛应用。相对高渗的胃肠道腔（0.3 mol/L NaCl）及饮食变化可导致动物胃肠道中渗透压的产生,因此胃肠道微生物中可能蕴藏着丰富的耐盐酶类及基因资源。本文以倭蜂猴及大额牛胃肠道微生物为研究对象,从已构建的宏基因组文库中筛选耐盐克隆并测序,分析潜在的耐盐酶类及基因,并进一步对6-磷酸海藻糖水解酶进行异源表达及鉴定,以挖掘胃肠道微生物宏基因组中的耐盐酶类及基因,为探究胃肠道微生物的耐盐机理及该环境中耐盐酶类和基因的开发利用奠定理论基础。研究结果总结如下:1.胃肠道微生物宏基因组文库中耐盐克隆的筛选、测序及分析以7%NaCl（w/v）为筛选因子,从倭蜂猴和大额牛胃肠道微生物宏基因组文库中分别获得4个（1A、3-1、511、515）和6个（219A、247H、162E、162D、168H、、12G）耐盐性较强的克隆。对其进行高通量测序及生物信息学分析,结果从耐盐克隆中共获得1285个基因及酶类,其中91个为潜在的耐盐基因及酶类。2.耐盐克隆基因的功能注释GO富集分析表明,大多数耐盐克隆基因都与生物过程（biological process）和分子功能（molecular function）有关。基于COG的功能分类表明,耐盐克隆的基因主要涉及碳水化合物的输送和代谢（carbohydrate transport and metabolism）、转录（transcription）、复制、重组和修复（replication,recombination and repair）、无机离子转运和代谢（inorganic ion transport and metabolism）、防御机制（defense mechanism）和移动元件:原噬菌体,转座子（mobilome:prophages,transponsons）。KEGG代谢途径注释表明,耐盐克隆基因主要与碳水化合物代谢（carbohydrate metabolism）、膜转运（membrane transport）、耐药性（drug resistance）和核苷酸代谢（nucleotide metabolism）有关。3.6-磷酸海藻糖水解酶的异源表达、纯化及鉴定对测序分析获得的6-磷酸海藻糖水解酶进一步异源表达和纯化,获得两个重组6-磷酸海藻糖水解酶rTREP2和rTREP3。酶学性质研究结果表明,rTREP2和rTREP3的最适反应pH为7.5,最适反应温度为30℃。两者均具有良好的耐盐性,酶活性随NaCl浓度的增加而增强。在0.5-5 mol/L NaCl条件下处理1 h或24 h,酶活性与NaCl浓度呈正相关,其中,rTREP2在5 mol/L NaCl条件下处理24 h,酶活性提高约43倍。两者活性均被1mmol/L PbCl2、CTAB、AgNO3、CuSO4、HgCl2和ZnSO4完全抑制。重组rTREP2和rTREP3均能有效分解对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（pNPG）和6-磷酸海藻糖,以pNPG为底物时Km值分别为15.63 mmol/L和12.51 mmol/L,Kcat值分别为10.04 s-1和10.71 s-1。
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 水体环境氮素污染概述 |
| 1.1.1 水体环境氮素污染现状 |
| 1.1.2 水体中氮素污染的排放标准 |
| 1.1.3 氮素污染去除的主要方法 |
| 1.2 生物脱氮技术的发展 |
| 1.2.1 传统生物脱氮技术 |
| 1.2.2 新型生物脱氮技术 |
| 1.3 好氧反硝化的研究进展 |
| 1.3.1 好氧反硝化菌株的筛选与分类 |
| 1.3.2 好氧反硝化作用的酶系 |
| 1.3.3 好氧反硝化的分子机制 |
| 1.3.4 好氧反硝化的影响因素 |
| 1.4 芽孢杆菌的好氧反硝化研究进展 |
| 1.4.1 芽孢杆菌的特点 |
| 1.4.2 芽孢杆菌在好氧反硝化过程中的研究进展 |
| 1.5 生物组学技术在好氧反硝化研究中的应用 |
| 1.5.1 生物组学技术在好氧反硝化菌群上的研究 |
| 1.5.2 生物组学技术在单一好氧反硝化菌株上的研究 |
| 1.6 论文的立题依据和研究内容 |
| 1.6.1 立题依据及研究意义 |
| 1.6.2 研究内容 |
| 第二章 好氧反硝化Bacillus sp.的筛选、鉴定及特性研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 样品来源 |
| 2.2.2 实验试剂与仪器 |
| 2.2.3 培养基 |
| 2.2.4 引物 |
| 2.2.5 实验方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 好氧反硝化菌株的分离与筛选 |
| 2.3.2 好氧反硝化菌株的鉴定 |
| 2.3.3 好氧反硝化菌株对硝态氮降解特性分析 |
| 2.3.4 好氧反硝化菌株对亚硝态氮降解特性分析 |
| 2.3.5 好氧反硝化菌株对氨氮降解特性分析 |
| 2.3.6 好氧反硝化菌株在5 L生物反应器中的脱氮特性分析 |
| 2.3.7 菌株JD-014 好氧反硝化途径的初步分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 Bacillus subtilis JD-014 的基因组测序及功能基因挖掘 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 菌株 |
| 3.2.2 实验试剂与仪器 |
| 3.2.3 培养基 |
| 3.2.4 引物 |
| 3.2.5 实验方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 菌株JD-014 基因组DNA的提取 |
| 3.3.2 菌株JD-014 基因组组分分析 |
| 3.3.3 菌株JD-014 基因组功能注释 |
| 3.3.4 菌株JD-014 基因组中参与氮代谢相关功能基因分析 |
| 3.3.5 比较基因组分析 |
| 3.3.6 菌株JD-014 与菌株168 的比较分析 |
| 3.3.7 菌株JD-014 与菌株LMG9581 的比较分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 Bacillus subtilis JD-014 好氧反硝化关键基因的功能验证 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 菌株和质粒 |
| 4.2.2 实验试剂与仪器 |
| 4.2.3 培养基 |
| 4.2.4 引物 |
| 4.2.5 实验方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 好氧反硝化候选基因的敲除 |
| 4.3.2 敲除菌株的发酵性能验证 |
| 4.3.3 好氧反硝化候选基因的回补及功能验证 |
| 4.3.4 好氧反硝化候选基因的过表达及功能验证 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 Bacillus subtilis JD-014 好氧反硝化通路调控的研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 菌株 |
| 5.2.2 实验试剂与仪器 |
| 5.2.3 培养基 |
| 5.2.4 引物 |
| 5.2.5 实验方法 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 不同NO_3~--N浓度对菌株JD-014 反硝化性能的影响 |
| 5.3.2 转录组测序数据质量分析 |
| 5.3.3 基于转录组的差异基因表达分析 |
| 5.3.4 参与好氧反硝化相关的差异基因表达分析 |
| 5.3.5 差异表达基因的q RT-PCR验证 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 第六章 Bacillus subtilis JD-014 生物脱氮的模拟环境研究 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 菌株 |
| 6.2.2 实验试剂与仪器 |
| 6.2.3 培养基 |
| 6.2.4 实验方法 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 不同环境因子对菌株JD-014 好氧反硝化性能的影响 |
| 6.3.2 菌株JD-014 耐亚硝酸盐的特性研究 |
| 6.3.3 连续式反应器下菌株JD-014 对硝态氮的降解特性 |
| 6.3.4 连续式反应器下菌株JD-014 对亚硝态氮的降解特性 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 本章小结 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 论文主要创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 I:作者在攻读博士学位期间发表的论文 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 对虾生长发育与蜕壳 |
| 1.1.1 胚胎发育 |
| 1.1.2 幼体变态发育 |
| 1.1.3 蜕壳与生长 |
| 1.2 影响甲壳动物生长的关键因子 |
| 1.2.1 年龄因素 |
| 1.2.2 性别因素 |
| 1.2.3 遗传背景 |
| 1.2.4 其它因素 |
| 1.3 生长性状相关候选基因 |
| 1.3.1 与蜕壳过程相关基因 |
| 1.3.2 肌肉生长抑制蛋白 |
| 1.3.3 Hippo信号通路及相关基因 |
| 1.3.4 α-淀粉酶 |
| 1.3.5 肌球蛋白重链 |
| 1.4 组学技术及其在甲壳动物生长性状研究中的应用前景 |
| 1.4.1 转录组学 |
| 1.4.2 蛋白质组学 |
| 1.4.3 代谢组学 |
| 1.4.4 多组学联合分析 |
| 1.5 本研究的目的、意义和主要研究内容 |
| 1.5.1 研究目的和意义 |
| 1.5.2 研究主要内容和技术路线 |
| 2 日本囊对虾零换水养殖试验及生长规律分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 全同胞家系的构建及育苗管理 |
| 2.1.2 零换水养殖试验及饲养管理 |
| 2.1.3 水质指标的测定 |
| 2.1.4 生长指标测量 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 不同发育时期育苗水体理化因子分析 |
| 2.2.2 育苗成活率统计 |
| 2.2.3 养殖水体理化因子变化情况分析 |
| 2.2.4 零换水养殖模式下日本囊对虾生长规律分析 |
| 2.3 讨论 |
| 3 生理生化指标和肠道菌群对日本囊对虾生长的影响 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验用虾及饲养管理 |
| 3.1.2 肝胰腺生理指标的测定 |
| 3.1.3 肠道菌群分析 |
| 3.1.4 体成分分析 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 三种消化酶活性比较分析 |
| 3.2.2 三种免疫相关酶活性比较分析 |
| 3.2.3 肠道菌群分析 |
| 3.2.4 体成分分析 |
| 3.3 讨论 |
| 4 转录组学解析日本囊对虾生长调控机制 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验用虾 |
| 4.1.2 肌肉总RNA提取 |
| 4.1.3 SMRT文库构建和测序 |
| 4.1.4 Illumina文库构建和测序 |
| 4.1.5 SMRT测序数据处理 |
| 4.1.6 功能注释 |
| 4.1.7 差异表达基因分析 |
| 4.1.8 Simple Sequence Repeats(SSR)预测 |
| 4.1.9 编码区序列(Coding Sequence,CDS)预测 |
| 4.1.10 lncRNA预测 |
| 4.1.11 转录因子分析 |
| 4.1.12 Quantitative Real Time PCR(qPCR) |
| 4.1.13 Mj14-3-3-like基因克隆与表达分析 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 SMRT和NGS测序数据统计 |
| 4.2.2 功能注释 |
| 4.2.3 快速生长组和缓慢生长组差异表达基因分析 |
| 4.2.4 与生长相关的通路和基因 |
| 4.2.5 差异表达基因验证 |
| 4.2.6 Mj14-3-3-like克隆和表达分析 |
| 4.2.7 SSR预测 |
| 4.2.8 CDS分析 |
| 4.2.9 LncRNA预测 |
| 4.2.10 转录因子分析 |
| 4.3 讨论 |
| 5 蛋白质组学解析日本囊对虾生长调控机制 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 实验用虾 |
| 5.1.2 iTRAQ技术原理 |
| 5.1.3 iTRAQ实验流程 |
| 5.1.4 qPCR验证 |
| 5.1.5 Mj14-3-3-epsilon-like、MjGPI和MjGPD1克隆与表达分析 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 蛋白质鉴定及注释 |
| 5.2.2 差异表达蛋白(DEPs)分析 |
| 5.2.3 蛋白质组(DEPs)与转录组(DEGs)联合分析 |
| 5.2.4 qPCR验证 |
| 5.2.5 Mj14-3-3-epsilon-like、MjGPI和MjGPD1克隆与表达分析 |
| 5.2.6 与日本囊对虾生长相关的通路解析 |
| 5.3 讨论 |
| 6 代谢组学解析日本囊对虾生长调控机制 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 实验用虾 |
| 6.1.2 代谢物提取 |
| 6.1.3 上机检测 |
| 6.1.4 数据处理 |
| 6.1.5 差异代谢物检测 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 过程质控与数据质控 |
| 6.2.2 各分组主成分分析 |
| 6.2.3 差异分组的正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA) |
| 6.2.4 代谢物鉴定和差异分析 |
| 6.2.5 SG40 vs FG40和SG70 vs FG70差异代谢物比较分析 |
| 6.2.6 差异代谢物检测 |
| 6.3 讨论 |
| 7 转录组学解析地膜替代沙底对日本囊对虾生长和体色的影响 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.1.1 实验用虾 |
| 7.1.2 RNA提取、文库构建和测序 |
| 7.1.3 转录组组装和功能注释 |
| 7.1.4 差异表达基因分析和功能富集 |
| 7.1.5 qPCR验证 |
| 7.2 结果和分析 |
| 7.2.1 转录组组装和功能注释 |
| 7.2.2 差异表达基因分析 |
| 7.2.3 qPCR验证 |
| 7.3 讨论 |
| 8 全文结论、创新点及研究展望 |
| 8.1 全文结论 |
| 8.2 创新点 |
| 8.3 研究展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 导师简介 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 木霉资源的分离与收集 |
| 1.2 木霉的生物防治机理 |
| 1.2.1 木霉菌与病原菌互作研究 |
| 1.2.2 木霉菌与植物互作研究 |
| 1.3 木霉固态发酵研究动态 |
| 1.4 植物抗逆转录组学研究 |
| 1.5 植物抗逆代谢组学研究 |
| 1.6 研究目的意义 |
| 2 4种林木根围木霉菌株的分离与鉴定 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 供试菌株 |
| 2.1.2 供试试剂 |
| 2.1.3 仪器设备和材料 |
| 2.1.4 培养基 |
| 2.2 研究方法 |
| 2.2.1 土样采集 |
| 2.2.2 菌种分离与纯化 |
| 2.2.3 木霉形态学鉴定 |
| 2.2.4 木霉的分子生物学鉴定 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 木霉菌株的分离及形态学鉴定 |
| 2.3.2 木霉菌的分子生物学鉴定 |
| 2.3.3 木霉菌的分布 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 3 木霉分离株生物活性测定与分析 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 供试菌株及植株 |
| 3.1.2 供试试剂 |
| 3.1.3 仪器设备和材料 |
| 3.1.4 培养基 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 木霉分离株生长速度的筛选 |
| 3.2.2 木霉及病原菌培养 |
| 3.2.3 木霉分离株生物活性测定 |
| 3.2.4 木霉对山新杨抗病性的影响 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 木霉分离株生长速率测定 |
| 3.3.2 非生物逆境胁迫 |
| 3.3.3 木霉菌株与8株病原真菌对峙培养 |
| 3.3.4 木霉分离株生防潜力综合分析 |
| 3.3.5 棘孢木霉T46诱导山新杨抗性 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 4 棘孢木霉T46菌株的固态发酵 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 供试菌株 |
| 4.1.2 供试试剂 |
| 4.1.3 仪器设备和材料 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 孢子悬浮液制备 |
| 4.2.2 发酵底物及含水率设置 |
| 4.2.3 单因素实验 |
| 4.2.4 营养配比优化实验 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 发酵底物及含水率的优化 |
| 4.3.2 单纯以底物为营养的木霉发酵 |
| 4.3.3 单因素实验 |
| 4.3.4 营养配比优化 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 5 棘孢木霉T46诱导后山新杨幼苗转录组构建及分析 |
| 5.1 试验材料 |
| 5.1.1 供试菌株和植株 |
| 5.1.2 供试试剂 |
| 5.1.3 仪器设备和材料 |
| 5.1.4 培养基 |
| 5.2 试验方法 |
| 5.2.1样本准备与处理 |
| 5.2.2 提取样本RNA及clean reads的获得 |
| 5.2.3 测序结果初步校验和分析 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 转录组测序质量分析 |
| 5.3.2 转录本组装及注释 |
| 5.3.3 基因表达定量分析 |
| 5.3.4 差异表达基因分析 |
| 5.3.5 表达模式聚类分析 |
| 5.3.6 差异基因的功能富集分析 |
| 5.3.7 可变剪接分析 |
| 5.4 关于棘孢木霉T46诱导山新杨后转录组分析的讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 6 棘孢木霉T46诱导山新杨幼苗代谢组构建及分析 |
| 6.1 试验材料 |
| 6.1.1 供试菌株和植株 |
| 6.1.2 供试试剂 |
| 6.1.3 仪器设备 |
| 6.1.4 培养基 |
| 6.2 试验方法 |
| 6.2.1 样本准备与处理 |
| 6.2.2 山新杨幼苗代谢物提取 |
| 6.2.3 山新杨幼苗代谢物检测 |
| 6.2.4 检测结果初步校验 |
| 6.2.5 数据分析 |
| 6.3 研究结果与分析 |
| 6.3.1 棘孢木霉T46诱导后山新杨幼苗代谢物测定 |
| 6.3.2 棘孢木霉T46诱导后山新杨幼苗代谢组测序质量 |
| 6.3.3 棘孢木霉T46诱导后山新杨幼苗代谢物功能注释 |
| 6.3.4 差异显着代谢物的筛选 |
| 6.3.5 差异显着代谢物分析 |
| 6.3.6 差异显着代谢物KEGG富集分析 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 本章小结 |
| 7 转录组和代谢组联合分析及关键基因挖掘 |
| 7.1 试验材料 |
| 7.1.1 供试菌株和植株 |
| 7.1.2 供试试剂和数据 |
| 7.1.3 仪器设备 |
| 7.1.4 培养基 |
| 7.2 试验方法 |
| 7.2.1 转录组代谢组联合分析 |
| 7.2.2 联合分析所得到的关键基因生物信息学分析 |
| 7.2.3 GST、ADH和FrsA家族基因生物信息学分析 |
| 7.2.4 接种链格孢菌后山新杨相关基因表达分析 |
| 7.3 试验结果 |
| 7.3.1 棘孢木霉T46诱导后山新杨幼苗代谢物测定 |
| 7.3.2 联合分析后得到的基因生物信息学分析 |
| 7.3.3 GST、ADH和FrsA家族基因生物信息学分析 |
| 7.3.4 接种链格孢菌后山新杨幼苗部分基因表达分析 |
| 7.4 讨论 |
| 7.5 本章小结 |
| 8 山新杨转化子PdPap-ADH-7的获得及抗病性检测 |
| 8.1 试验材料 |
| 8.1.1 供试菌株和植株 |
| 8.1.2 供试试剂和数据 |
| 8.1.3 仪器设备 |
| 8.1.4 培养基 |
| 8.2 试验方法 |
| 8.2.1 目标基因的克隆 |
| 8.2.2 重组载体pROK2-ADH-7的构建 |
| 8.2.3 重组大肠杆菌TOP10-ADH-7的构建 |
| 8.2.4 重组根癌农杆菌EHA105-ADH-7的构建 |
| 8.2.5 转化子的获得 |
| 8.2.6 转化子的抗病性检测 |
| 8.3 试验结果 |
| 8.3.1 基因PdPap-ADH-7的克隆 |
| 8.3.2 重组大肠杆菌TOP10-pROK2-ADH的构建 |
| 8.3.3 山新杨转化子PdPap-ADH-7的获得 |
| 8.3.4 山新杨转化子PdPap-ADH-7抗病性检测 |
| 8.4 讨论 |
| 8.5 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
| 附件 |
| 缩略词 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1 鸳鸯茉莉的研究现状 |
| 1.1 鸳鸯茉莉属概况 |
| 1.2 鸳鸯茉莉花色及花香的研究 |
| 1.2.1 鸳鸯茉莉花色的研究 |
| 1.2.2 鸳鸯茉莉花香的研究 |
| 2 影响花色呈现的因素 |
| 2.1 色素种类 |
| 2.2 pH值 |
| 2.3 光照 |
| 2.3.1 光强 |
| 2.3.2 光质 |
| 2.4 温度 |
| 2.5 水分 |
| 2.6 其它 |
| 3 花青素研究进展 |
| 3.1 花青素生物合成途径的研究 |
| 3.2 花青素降解的研究 |
| 3.3 花青素的鉴定技术 |
| 4 组学联合分析在园艺植物上的应用 |
| 4.1 转录组在园艺植物上的应用 |
| 4.2 代谢组学在植物花色中应用 |
| 4.3 转录组和代谢组联合分析 |
| 5 本研究内容、意义及技术路线 |
| 5.1 本项研究的主要内容 |
| 5.2 本项研究目的及意义 |
| 5.3 技术路线 |
| 第二章 鸳鸯茉莉花色的变化 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 花瓣颜色表型的测定 |
| 1.3 花瓣表皮细胞结构与超微结构的观察 |
| 1.4 花瓣pH值与含水量的测定 |
| 1.5 花瓣花青素含量的测定与HPLC分析 |
| 1.5.1 花瓣花青素含量的测定 |
| 1.5.2 花瓣HPLC分析 |
| 1.6 花瓣总黄酮含量的测定 |
| 1.7 花瓣总酚含量的测定 |
| 1.8 花瓣花青素相关酶的提取与测定 |
| 1.9 数据统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 鸳鸯茉莉花瓣褪色过程形态特征及表型的测定 |
| 2.2 鸳鸯茉莉花瓣褪色过程色素的分布 |
| 2.3 鸯茉莉花瓣褪色过程含水量,花冠直径及pH值的变化 |
| 2.4 鸳鸯茉莉花瓣褪色过程的生理特征 |
| 2.4.1 鸳鸯茉莉花瓣褪色过程花青素,类黄酮及总酚含量的变化 |
| 2.4.2 花瓣褪色过程花色苷的组分分析 |
| 2.4.3 鸳鸯茉莉花瓣褪色过程花青素合成途径中关键酶的变化 |
| 2.4.4 鸳鸯茉莉花瓣褪色过程花青素含量与其关键酶活性的相关性分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 鸳鸯茉莉花瓣褪色过程形态指标的变化 |
| 第三章 鸳鸯茉莉花色变化的转录组分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 RNA提取和质量评估 |
| 1.3 cDNA文库构建与高通量测序 |
| 1.4 测序数据的生物信息学分析 |
| 1.5 实时荧光定量(qRT-PCR)验证与分析 |
| 1.6 数据分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 RNA质量及浓度检测 |
| 2.2 转录组测序基础数据的分析 |
| 2.3 功能分类和富集分析 |
| 2.4 Unigene的 CDS预测 |
| 2.5 基因表达水平及PCA分析 |
| 2.6 差异基因(DEGs)的识别和功能注释 |
| 2.7 花青素相关差异基因DEG和转录因子的分析 |
| 2.8 花青素相关基因的qRT-PCR验证及其表达水平 |
| 3 讨论 |
| 第四章 鸳鸯茉莉花色变化的代谢组分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 代谢物数据分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 样本质控分析 |
| 2.2 重复相关性评估及总体样本主成分分析 |
| 2.3 花瓣不同时期的广泛靶向代谢组学分析 |
| 2.4 OPLS–DA的差异代谢物分析 |
| 2.5 差异代谢物筛选 |
| 2.6 差异代谢物功能分类与富集分析 |
| 2.7 花青素相关生物合成途径中的DEMs分析 |
| 3 讨论 |
| 第五章 鸳鸯茉莉花瓣转录组与代谢组联合分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 联合分析主成分分析(PCA) |
| 2.2 KEGG通路分析 |
| 2.3 相关性分析 |
| 2.4 相关性网络图 |
| 2.5 代谢组和转录组的联合分析 |
| 2.6 类黄酮生物合成途径调控网络图的建立 |
| 3 讨论 |
| 第六章 光质及温度调节鸳鸯茉莉花色变化 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 LED光温控制系统 |
| 1.3 光质条件 |
| 1.4 花瓣花青素含量和HPLC的测定 |
| 1.5 花瓣总黄酮含量的测定 |
| 1.6 花瓣总酚含量的测定 |
| 1.7 花瓣花青素相关酶的提取与测定 |
| 1.8 实时荧光定量qRT-PCR分析 |
| 1.9 温度处理 |
| 1.10 统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 光质处理的筛选 |
| 2.2 光质处理下离体花瓣中花青素含量的相关性分析 |
| 2.3 光质处理下离体花瓣中花青素,类黄酮及总酚含量的变化 |
| 2.4 光质处理下植物花瓣中花青素,类黄酮和总酚含量的变化 |
| 2.5 光质调节花色苷种类 |
| 2.6 光质调节花瓣花青素代谢酶活性 |
| 2.7 光质调节花瓣花青素相关基因的表达 |
| 2.8 温度处理对花瓣的影响 |
| 2.8.1 相同的光照不同温度处理总花青素含量的变化 |
| 2.8.2 相同温度不同光照处理总花青素含量的变化 |
| 2.8.3 不同光照不同温度处理总花青素含量的变化 |
| 3 讨论 |
| 3.1 光质调节鸳鸯茉莉的花色 |
| 3.2 温度调节鸳鸯茉莉的花色 |
| 第七章 结论与展望 |
| 1 主要结论 |
| 1.1 鸳鸯茉莉花瓣在开放过程中其形态指标及生理指标的变化 |
| 1.2 鸳鸯茉莉花瓣的转录组及代谢组联合分析 |
| 1.3 光质及温度调节鸳鸯茉莉花瓣花色的变化 |
| 2 本研究的创新点 |
| 3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 1 附录图 |
| 2 附录表 |
| 攻读学位期间的学术论文与研究成果 |
| 致谢 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 术语与缩略语表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 农药残留及免疫检测技术发展现状 |
| 1.2 农药小分子特异性单克隆抗体研究进展 |
| 1.3 杂交瘤细胞技术 |
| 1.4 杂交瘤细胞识别特异性基础——B淋巴细胞 |
| 1.5 CRISPR/Cas基因编辑在杂交瘤细胞生物学研究中的应用 |
| 1.5.1 基因编辑技术概况 |
| 1.5.2 CRISPR/Cas系统结构 |
| 1.5.3 CRISPR/Cas系统机制 |
| 1.5.4 CRISPR/Cas9基因编辑原理 |
| 1.5.5 CRISPR/Cas9基因编辑文库 |
| 1.5.6 CRISPR/Cas9系统及文库在抗体基因编辑上的应用 |
| 1.6 研究内容及预期目标 |
| 1.6.1 主要研究内容 |
| 1.6.2 预期目标 |
| 1.6.3 研究技术路线 |
| 第2章 杂交瘤细胞株及抗百菌清单抗表型的多样性分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 材料与设备 |
| 2.2.1.1 试剂材料 |
| 2.2.1.2 试剂盒 |
| 2.2.1.3 仪器设备 |
| 2.2.1.4 培养液及缓冲液配方 |
| 2.2.1.5 试验动物 |
| 2.2.2 农药特异性杂交瘤细胞筛选及单克隆抗体制备 |
| 2.2.2.1 动物免疫 |
| 2.2.2.2 小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)及饲养细胞的准备 |
| 2.2.2.3 细胞融合 |
| 2.2.2.4 阳性杂交瘤单克隆细胞株筛选 |
| 2.2.3 腹水单抗制备与表征 |
| 2.2.3.1 小鼠腹水单抗制备 |
| 2.2.3.2 腹水单抗灵敏度测定 |
| 2.2.3.3 腹水单抗轻重链类型测定 |
| 2.2.4 不同农药特异性杂交瘤细胞株不同处理后阴性率统计 |
| 2.2.5 杂交瘤细胞株抗体分泌FACS分析 |
| 2.2.6 阴阳性单克隆杂交瘤细胞株抗体轻重链类型检测 |
| 2.2.7 BJQ单克隆杂交瘤细胞株抗体产生情况表征 |
| 2.2.7.1 BJQ杂交瘤细胞增殖速率表征 |
| 2.2.7.2 BJQ杂交瘤细胞不同生长阶段Ig G分泌表征 |
| 2.2.7.3 杂交瘤细胞胞内总蛋白提取及浓度测定 |
| 2.2.7.4 胞内蛋白抗体亲和特异性检测 |
| 2.2.7.5 胞内蛋白Ig G定量 |
| 2.2.7.6 胞内蛋白抗体轻重链类型鉴定 |
| 2.2.7.7 胞内蛋白抗体WB表征 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 阳性单克隆杂交瘤细胞株筛选及腹水单抗表征 |
| 2.3.2 单克隆杂交瘤细胞株阴性率测定 |
| 2.3.3 抗体分泌情况FACS分析 |
| 2.3.4 各农药阴阳性细胞株抗体轻重链类型检测 |
| 2.3.5 BJQ单克隆细胞周期及抗体表达表征 |
| 2.3.5.1 BJQ杂交瘤细胞增殖速率表征 |
| 2.3.5.2 BJQ阳性细胞株E2生长阶段与Ig G分泌 |
| 2.3.5.3 胞内蛋白的抗体特异性鉴定 |
| 2.3.5.4 胞内蛋白IgG定量 |
| 2.3.5.5 胞内蛋白抗体轻重链类型表征 |
| 2.3.5.6 胞内蛋白抗体WB表征 |
| 2.4 讨论与小结 |
| 第3章 杂交瘤细胞株抗体基因及转录水平比较分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 材料与设备 |
| 3.2.1.1 试剂材料 |
| 3.2.1.2 仪器设备 |
| 3.2.1.3 主要缓冲液 |
| 3.2.1.4 实验材料 |
| 3.2.2 杂交瘤细胞测序 |
| 3.2.2.1 杂交瘤细胞总RNA提取 |
| 3.2.2.2 5’RACE反转录及PCR扩增抗体轻重链可变区序列 |
| 3.2.2.3 抗体基因克隆及Sanger测序 |
| 3.2.3 HEK293(F)重组全抗体瞬时表达 |
| 3.2.3.1 质粒提取 |
| 3.2.3.2 瞬时表达质粒构建及验证 |
| 3.2.3.3 重组全抗体瞬时表达及纯化 |
| 3.2.3.4 瞬时表达重组抗体表征 |
| 3.2.4 HEK293重组全抗体稳定表达 |
| 3.2.4.1 构建慢病毒表达载体 |
| 3.2.4.2 慢病毒包装及滴度测定 |
| 3.2.4.3 重组全抗体稳定表达 |
| 3.2.4.4 稳定表达重组抗体表征 |
| 3.2.5 杂交瘤细胞株免疫组库测序及分析 |
| 3.2.6 杂交瘤细胞转录组测序及生物信息分析 |
| 3.2.6.1 转录组测序 |
| 3.2.6.2 转录组数据生物信息分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 杂交瘤细胞测序 |
| 3.3.1.1 总RNA的提取 |
| 3.3.1.2 特异性PCR产物分析 |
| 3.3.2 百菌清重组抗体瞬时表达 |
| 3.3.2.1 瞬时表达载体构建及验证 |
| 3.3.2.2 重组抗体瞬时表达及纯化表征 |
| 3.3.3 百菌清重组抗体稳定表达 |
| 3.3.3.1 不同表达质粒和表达体系稳定表达重组抗体效果表征 |
| 3.3.3.2 腹水抗体以及瞬时/稳定表达的重组抗体亲和性表征 |
| 3.3.4 BJQ杂交瘤细胞株免疫组库测序 |
| 3.3.5 BJQ阴阳性细胞转录组学测序及分析 |
| 3.3.5.1 RNA样品检测结果 |
| 3.3.5.2 测序数据过滤及测序质量分析 |
| 3.3.5.3 参考基因组比对 |
| 3.3.5.4 样品组间相关性 |
| 3.3.5.5 杂交瘤细胞株抗体基因表达分析 |
| 3.4 讨论与小结 |
| 第4章 抗百菌清单抗表达差异的杂交瘤细胞株转录组分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 材料与设备 |
| 4.2.1.1 试剂材料 |
| 4.2.1.2 仪器设备 |
| 4.2.1.3 实验材料 |
| 4.2.2 转录组差异表达基因筛选及GO/KEGG富集 |
| 4.2.3 qPCR验证转录组差异表达基因 |
| 4.2.3.1 RNA提取 |
| 4.2.3.2 cDNA合成 |
| 4.2.3.3 qPCR反应 |
| 4.2.4 RNA干扰 |
| 4.2.4.1 基因siRNA片段设计 |
| 4.2.4.2 siRNA转染条件优化 |
| 4.2.4.3 RNA基因干扰 |
| 4.2.4.4 qPCR验证RNAi效果 |
| 4.2.4.5 流式分析RNAi杂交瘤细胞抗体分泌情况 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 差异表达基因分析 |
| 4.3.2 差异基因GO富集分析 |
| 4.3.3 差异基因KEGG富集分析 |
| 4.3.4 显着差异表达基因分析 |
| 4.3.5 qPCR验证转录组数据 |
| 4.3.6 RNAi验证基因功能 |
| 4.3.6.1 siRNA转染效率优化 |
| 4.3.6.2 RNA干扰功能基因表达及抗体分泌 |
| 4.3.7 杂交瘤细胞抗体表达途径及转阴可能因素 |
| 4.4 讨论与小结 |
| 第5章 CRISPR/Cas9文库筛选杂交瘤细胞抗体表达的功能基因 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 试剂与材料 |
| 5.2.2 仪器与设备 |
| 5.2.3 文库质粒扩增 |
| 5.2.4 慢病毒包装 |
| 5.2.4.1 去内毒素质粒中提 |
| 5.2.4.2 慢病毒包装 |
| 5.2.4.3 慢病毒滴度测定 |
| 5.2.5 杂交瘤细胞慢病毒文库感染 |
| 5.2.5.1 细胞准备 |
| 5.2.5.2 嘌呤霉素筛选浓度优化 |
| 5.2.5.3 慢病毒感染效率测定 |
| 5.2.6 GeCKO慢病毒文库感染E2细胞株 |
| 5.2.7 农药压力筛选 |
| 5.2.7.1 筛选原理 |
| 5.2.7.2 百菌清农药对杂交瘤细胞致死效应及抗体“中和作用” |
| 5.2.7.3 百菌清农药筛选浓度优化 |
| 5.2.7.4 百菌清农药筛选GeCKOv2E2细胞文库 |
| 5.2.8 流式细胞分选 |
| 5.2.8.1 分选原理 |
| 5.2.8.2 流式细胞分选 |
| 5.2.9 NGS扩增子测序 |
| 5.2.9.1 基因组DNA提取 |
| 5.2.9.2 特异性PCR |
| 5.2.9.3 NGS扩增子测序及数据分析 |
| 5.2.10 sh RNA功能基因验证 |
| 5.2.10.1 shRNA慢病毒质粒构建及慢病毒包装 |
| 5.2.10.2 shRNA慢病毒感染 |
| 5.2.10.3 qPCR验证基因功能 |
| 5.2.10.4 FACS检测杂交瘤细胞抗体表达情况 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 GeCKOv2 library质粒扩增 |
| 5.3.2 GeCKO library慢病毒包装与检测 |
| 5.3.3 杂交瘤细胞慢病毒文库构建 |
| 5.3.3.1 puro筛选浓度优化 |
| 5.3.3.2 慢病毒感染效率测定 |
| 5.3.3.3 GeCKOv2 E2 library慢病毒敲除文库构建 |
| 5.3.4 百菌清农药压力筛选 |
| 5.3.4.1 百菌清农药对杂交瘤细胞的毒性作用 |
| 5.3.4.2 特异性单抗对百菌清农药的“中和作用” |
| 5.3.4.3 百菌清农药筛选时间及浓度优化 |
| 5.3.4.4 百菌清农药筛选GeCKO v2 E2细胞文库 |
| 5.3.5 流式细胞分选 |
| 5.3.6 农药压力筛选NGS扩增子测序分析 |
| 5.3.6.1 核酸样品质控 |
| 5.3.6.2 测序数据质控 |
| 5.3.6.3 gRNA比对与统计结果 |
| 5.3.6.4 阳性基因筛选与注释 |
| 5.3.6.5 样品间相似性分析 |
| 5.3.6.6 显着富集基因分析 |
| 5.3.6.7 GO功能富集分析 |
| 5.3.6.8 KEGG富集分析 |
| 5.3.6.9 药筛富集的功能基因、通路与转录组比对分析 |
| 5.3.7 流式细胞分选测序结果分析 |
| 5.3.7.1 核酸样品质控 |
| 5.3.7.2 测序数据质控 |
| 5.3.7.3 gRNA比对与统计结果 |
| 5.3.7.4 阳性基因筛选与注释 |
| 5.3.7.5 样本间相似性分析 |
| 5.3.7.6 显着差异基因分析 |
| 5.3.7.7 GO功能富集分析 |
| 5.3.7.8 KEGG富集分析 |
| 5.3.7.9 CRISPR library流式筛选及药物筛选功能基因通路与RNA-seq比对分析 |
| 5.3.8 shRNA干扰验证功能基因 |
| 5.3.8.1 shRNA慢病毒感染效率优化 |
| 5.3.8.2 qPCR验证干扰基因及抗体基因表达情况 |
| 5.3.8.3 FACS检测抗体表达情况 |
| 5.4 讨论与小结 |
| 第6章 百菌清抗原免疫小鼠脾脏细胞转录组学分析 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 实验材料 |
| 6.2.2 转录组测序与生物信息分析 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 脾脏转录组RNA样品检测结果 |
| 6.3.2 脾脏转录组测序数据过滤及测序质量分析 |
| 6.3.3 脾脏转录组数据参考基因组比对 |
| 6.3.4 基因表达分析及显着性DEG筛选 |
| 6.3.5 差异基因GO富集分析 |
| 6.3.6 差异基因KEGG富集分析 |
| 6.3.7 显着差异基因分析 |
| 6.4 讨论与小结 |
| 第7章 抗百菌清杂交瘤细胞抗体表达的调控途径及分子机制探究 |
| 7.1 引言 |
| 7.2 BJQ特异性杂交瘤细胞株及其单抗的多样性分析 |
| 7.2.1 杂交瘤细胞株及其单抗表型的多样性分析 |
| 7.2.1.1 阴阳性单克隆杂交瘤细胞的定义 |
| 7.2.1.2 不同处理方式测定杂交瘤细胞株阴性率 |
| 7.2.1.3 杂交瘤细胞增殖及抗体分泌情况 |
| 7.2.1.4 流式分析杂交瘤细胞抗体分泌情况及抗体亚型检测 |
| 7.2.1.5 BJQ杂交瘤细胞株抗体产生情况分析 |
| 7.2.2 杂交瘤细胞株抗体基因及转录水平比较分析 |
| 7.2.2.1 BJQ特异性杂交瘤细胞抗体序列测定及验证 |
| 7.2.2.2 BJQ阴阳性细胞及SP2/0 细胞免疫组库测序 |
| 7.2.2.3 BJQ五株阴阳性细胞及SP2/0 细胞抗体基因表达情况 |
| 7.3 BJQ特异性抗体表达差异的杂交瘤细胞株转录组学分析 |
| 7.3.1 DEG筛选及RNA-seq可靠性验证 |
| 7.3.2 GO功能及KEGG通路富集分析 |
| 7.3.3 差异表达基因分析 |
| 7.3.4 RNAi相关功能基因分析 |
| 7.4 CRISPR文库筛选杂交瘤细胞抗体表达相关基因及通路分析 |
| 7.4.1 GeCKO文库质粒扩增及慢病毒包装 |
| 7.4.2 慢病毒文库感染杂交瘤细胞 |
| 7.4.3 农药压力筛选与流式细胞分选 |
| 7.4.4 NGS扩增子测序数据分析 |
| 7.4.5 差异基因与功能通路富集分析 |
| 7.4.6 shRNA验证Pet2基因和Ccnd2基因功能 |
| 7.5 BJQ杂交瘤细胞转录组与CRISPR library筛选综合分析 |
| 7.5.1 转录组与CRISPR library筛选方法比较 |
| 7.5.2 两种筛选方式共同富集的基因功能及信号通路 |
| 7.5.3 两种筛选方式共同富集的差异基因分析 |
| 7.5.4 杂交瘤细胞抗体表达 |
| 7.6 骨髓瘤细胞SP2/0 与杂交瘤细胞功能基因表达差异分析 |
| 7.7 百菌清农药抗原免疫小鼠脾细胞各阶段转录组分析 |
| 7.7.1 研究对象的选择 |
| 7.7.2 转录组基因表达分析及差异基因筛选 |
| 7.7.3 脾脏转录组显着差异基因GO/KEGG富集分析 |
| 7.7.4 小鼠机体产生抗BJQ特异性抗体的过程 |
| 7.7.5 杂交瘤细胞与机体B细胞抗体合成途径异同 |
| 7.8 抗百菌清特异性单抗合成及分泌途径及调控机制 |
| 7.8.1 杂交瘤细胞的融合与体外培养 |
| 7.8.2 杂交瘤细胞抗体基因编码与表达 |
| 7.8.2.1 DNA编码水平 |
| 7.8.2.2 表观遗传学编码水平 |
| 7.8.2.3 杂交瘤细胞抗体基因表达调控 |
| 7.8.3 杂交瘤细胞周期进程调控 |
| 7.8.4 信号通路与转录因子调控杂交瘤细胞抗体表达 |
| 7.8.5 杂交瘤细胞抗体基因转录后调控 |
| 7.8.6 杂交瘤细胞抗体装配与修饰 |
| 7.8.7 杂交瘤细胞抗体运输及分泌 |
| 7.8.8 杂交瘤细胞调控抗体合成及分泌的相关机制 |
| 第8章 总结与展望 |
| 8.1 全文总结 |
| 8.2 全文创新点 |
| 8.3 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间主要研究成果 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语表 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞) |
| 1.1.1 CHO细胞与抗体类药物的生产 |
| 1.1.2 CHO细胞的基因工程改造 |
| 1.2 GLP1-Fc融合蛋白 |
| 1.3 转录组学 |
| 1.4 内参基因 |
| 1.5 RNA干扰(RNAi)技术 |
| 1.6 medag基因 |
| 1.7 本试验的研究目的 |
| 第二章 表达GLP1-Fc融合蛋白的CHO-K1细胞株构建 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 细胞株 |
| 2.1.2 培养基 |
| 2.1.3 试剂及耗材 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 细胞复苏 |
| 2.2.2 贴壁细胞传代 |
| 2.2.3 悬浮细胞传代 |
| 2.2.4 无血清悬浮驯化 |
| 2.2.5 P3.1-GLP1-Fc-GS载体构建 |
| 2.2.6 CHO-K1宿主细胞的转染及单克隆筛选 |
| 2.2.7 ELISA检测Fc融合蛋白浓度 |
| 2.2.8 细胞冻存 |
| 2.2.9 细胞比生产速率的计算 |
| 2.2.10 RNA提取 |
| 2.2.11 反转录 |
| 2.2.12 RT-qPCR |
| 2.2.13 免疫荧光观察 |
| 2.3 试验结果 |
| 2.3.1 CHO-K1细胞的无血清全悬浮驯化 |
| 2.3.2 P3.1-GLP-1 Fc-GS质粒提取验证结果 |
| 2.3.3 具有不同GLP1-Fc表达量的CHO-K1细胞株筛选 |
| 2.3.3.1 96孔板细胞株产量 |
| 2.3.3.2 24孔板细胞株产量 |
| 2.3.3.3 不同重组蛋白生产率的CHO细胞株的确定及75天传代培养稳定性检测 |
| 2.3.3.4 GLP1-Fc融合蛋白产率及基因拷贝数的测定 |
| 2.3.3.5 免疫荧光法观察重组蛋白分布 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 表达GLP1-Fc融合蛋白的CHO-K1细胞株的转录组测序分析 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 细胞株 |
| 3.1.2 培养基 |
| 3.1.3 试剂及耗材 |
| 3.1.4 主要仪器 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 RNA提取 |
| 3.2.2 RNA-seq转录组测序分析 |
| 3.3 试验结果 |
| 3.3.1 RNA提取 |
| 3.3.2 转录组测序结果分析 |
| 3.3.2.1 转录组测序质量及基因表达量结果 |
| 3.3.2.2 差异表达基因分析 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 表达GLP1-Fc融合蛋白的CHO-K1细胞中内参基因的确认 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 细胞株 |
| 4.1.2 培养基 |
| 4.1.3 试剂及耗材 |
| 4.1.4 主要仪器 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 细胞培养 |
| 4.2.2 候选内参基因的确定 |
| 4.2.3 引物设计 |
| 4.2.4 RNA提取及cDNA合成 |
| 4.2.5 RT-qPCR |
| 4.2.6 内参基因检测结果的统计学分析 |
| 4.3 试验结果 |
| 4.3.1 75天稳定性生长及加料培养生长结果 |
| 4.3.2 候选内参基因的确定 |
| 4.3.3 候选内参基因的引物设计 |
| 4.3.4 候选内参基因的表达水平检测 |
| 4.3.5 geNorm分析 |
| 4.3.6 NormFinder分析 |
| 4.3.7 ACt法分析 |
| 4.3.8 BestKeeper分析 |
| 4.3.9 RefFinder分析 |
| 4.3.10 内参基因的验证 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 RNA干扰法筛选影响Fc融合蛋白产量的潜在基因 |
| 5.1 试验材料 |
| 5.1.1 细胞株 |
| 5.1.2 培养基 |
| 5.1.3 试剂及耗材 |
| 5.1.4 主要仪器 |
| 5.2 试验方法 |
| 5.2.1 待测基因的RT-qPCR验证及引物设计 |
| 5.2.2 RNA提取及cDNA合成 |
| 5.2.3 RT-qPCR |
| 5.2.4 siRNA的设计 |
| 5.2.5 siRNA干扰试验 |
| 5.2.6 ELISA产量检测 |
| 5.2.7 shRNA质粒的合成 |
| 5.2.8 shRNA质粒的提取、验证及线性化 |
| 5.2.9 转染及稳定株筛选 |
| 5.2.10 稳定株生长参数考察 |
| 5.3 试验结果 |
| 5.3.1 目标基因的RT-qPCR验证 |
| 5.3.2 目标基因的siRNA分子序列 |
| 5.3.3 siRNA干扰试验初筛结果 |
| 5.3.4 siRNA干扰试验结果的复证 |
| 5.3.5 shRNA质粒提取及酶切线性化结果 |
| 5.3.6 稳定株筛选结果 |
| 5.3.7 稳定株生长及生产参数的考察 |
| 5.4 小结 |
| 总结 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 德式乳杆菌概述 |
| 1.2 德式乳杆菌基因组学概述 |
| 1.3 德式乳杆菌蛋白水解体系概述 |
| 1.3.1 胞壁蛋白酶 |
| 1.3.2 肽转运系统 |
| 1.3.3 胞内肽酶 |
| 1.3.4 蛋白水解体系研究现状 |
| 1.4 乳清蛋白肽及其制备概述 |
| 1.4.1 乳清蛋白的组成和性质 |
| 1.4.2 乳清蛋白肽研究进展 |
| 1.4.3 乳酸菌发酵乳清蛋白研究现状 |
| 1.5 本课题研究意义及主要内容 |
| 1.5.1 立题背景及意义 |
| 1.5.2 本课题的主要内容 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料和试剂 |
| 2.1.1 实验样品 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 培养基 |
| 2.1.4 实验菌株 |
| 2.2 实验仪器和设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 德式乳杆菌保加利亚亚种分离纯化与鉴定 |
| 2.3.2 基因组测序及分析方法 |
| 2.3.3 乳清蛋白培养基中生长特性评价 |
| 2.3.4 乳清蛋白培养基中蛋白酶活力的测定 |
| 2.3.5 乳清蛋白培养基中乳清蛋白利用情况的测定 |
| 2.3.6 乳清蛋白-乳糖体系中的生长特性评价 |
| 2.3.7 乳清蛋白-乳糖体系中的肽含量的测定 |
| 2.3.8 乳清蛋白-乳糖体系中菌株蛋白酶活力的测定 |
| 2.3.9 乳清蛋白水解产物肽谱的测定 |
| 2.3.10 数据统计和分析 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 德式乳杆菌保加利亚亚种的分离、纯化与鉴定结果 |
| 3.2 德式乳杆菌的基因组分析 |
| 3.2.1 德式乳杆菌基因组基本特征 |
| 3.2.2 德式乳杆菌基因组同源进化分析 |
| 3.2.3 德式乳杆菌泛基因组和核心基因组分析 |
| 3.2.4 德式乳杆菌功能基因分析 |
| 3.3 德式乳杆菌保加利亚亚种乳清蛋白利用特性分析 |
| 3.3.1 生长特性分析 |
| 3.3.2 产酸特性分析 |
| 3.3.3 三种胞内肽酶的活力分析 |
| 3.3.4 芳族转氨酶的活力分析 |
| 3.3.5 乳清蛋白利用能力分析 |
| 3.4 德式乳杆菌保加利亚亚种在乳清蛋白-乳糖体系的应用 |
| 3.4.1 发酵特性分析 |
| 3.4.2 多肽产量分析 |
| 3.4.3 不同初始pH下菌株的发酵特性分析 |
| 3.4.4 不同初始pH下菌株的多肽产量分析 |
| 3.4.5 不同初始pH下的蛋白酶活力特性分析 |
| 3.4.6 不同菌株的多肽鉴定结果分析 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 :作者在攻读硕士学位期间发表的论文 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 土壤PAHs研究现状 |
| 1.1.1 土壤PAHs的来源及危害 |
| 1.1.2 土壤PAHs污染现状 |
| 1.2 土壤PAHs的微生物修复手段和策略 |
| 1.2.1 PAHs降解微生物 |
| 1.2.2 PAHs的细菌降解机制 |
| 1.3 PAHs污染土壤的堆肥腐殖化修复 |
| 1.3.1 堆肥修复PAHs污染土壤的研究现状 |
| 1.3.2 堆肥腐殖化对土壤PAHs的修复作用 |
| 1.4 论文研究的内容、目的和意义 |
| 1.4.1 研究内容 |
| 1.4.2 研究目的和意义 |
| 1.4.3 技术路线 |
| 第2章 联合堆肥体系的建立及理化指标测定 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验样品 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.1.4 分析软件 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 联合堆肥体系的建立 |
| 2.2.2 堆肥体系基本理化指标测定 |
| 2.2.3 腐殖酸类物质测定 |
| 2.3 结果分析 |
| 2.3.1 堆肥体系基本理化性质分析 |
| 2.3.2 腐殖酸含量及腐殖化程度分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 污染土混合堆肥及接种堆肥对PAHs降解与酶活性分析 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验样品 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 实验仪器设备 |
| 3.1.4 分析软件 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 PAHs的 GC-MS检测 |
| 3.2.2 堆肥过程中的酶活性测定 |
| 3.3 结果分析 |
| 3.3.1 PAHs的含量变化分析 |
| 3.3.2 堆肥过程中的酶活性变化分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 堆肥过程中微生物多样性及功能基因分析 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验样品 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器设备 |
| 4.1.4 数据分析 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 关键微生物功能基因的qPCR分析 |
| 4.2.2 微生物群落结构的高通量测序分析 |
| 4.3 结果分析 |
| 4.3.1 关键微生物功能基因分析 |
| 4.3.2 微生物群落结构分析 |
| 4.3.3 堆肥过程中理化因子、微生物与PAHs降解的相关性分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 堆肥体系内的功能基因分析 |
| 4.4.2 堆肥体系内微生物群落结构动态变化分析 |
| 4.5 小结 |
| 第5章 腐熟肥料对PAHs污染土壤的修复研究 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 土壤样品及腐熟肥料 |
| 5.1.2 主要用品和试剂 |
| 5.1.3 主要仪器设备 |
| 5.1.4 数据分析 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 腐熟堆肥与PAHs土壤联合培养实验体系建立 |
| 5.2.2 PAHs含量测定 |
| 5.2.3 理化指标及酶活性测定 |
| 5.3 结果分析 |
| 5.3.1 PAHs的降解效率分析 |
| 5.3.2 理化指标及酶活性分析 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 香菇概述 |
| 1.1.1 香菇的保健和营养价值 |
| 1.1.2 香菇的栽培分布 |
| 1.1.3 香菇生长发育的环境条件 |
| 1.1.4 香菇生产中的木屑酸化问题 |
| 1.2 真菌对环境pH调控的研究 |
| 1.2.1 真菌分泌氨类物质升高环境pH |
| 1.2.2 真菌分泌有机酸降低环境pH |
| 1.3 草酸代谢及作用的研究 |
| 1.3.1 草酸代谢在植物中的研究 |
| 1.3.2 草酸代谢在动物中的研究 |
| 1.3.3 草酸代谢在真菌中的研究 |
| 1.3.4 草酸在动植物中的作用 |
| 1.3.5 草酸在真菌中的作用 |
| 1.3.6 食用菌中环境pH调节和草酸的相关研究 |
| 1.4 研究的目的、内容及意义 |
| 1.5 技术路线 |
| 第二章 环境pH对香菇菌丝影响的研究 |
| 2.1 试验材料及仪器 |
| 2.1.1 试验菌株及培养基 |
| 2.1.2 试验试剂和材料 |
| 2.1.3 试验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 菌丝培养 |
| 2.2.2 pH梯度的设计 |
| 2.2.3 GC-MS分析 |
| 2.2.4 HPLC分析 |
| 2.2.5 生长照片 |
| 2.2.6 菌丝生长速度的测定 |
| 2.2.7 固体培养基pH测定 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 酸化木屑中有机酸的定性定量 |
| 2.3.2 外源添加有机酸对香菇菌丝生长的影响 |
| 2.3.3 外源添加钙盐对香菇菌丝生长的影响 |
| 2.3.4 香菇最适pH和缓冲作用 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 香菇对环境pH调控的研究 |
| 3.1 试验材料及仪器 |
| 3.1.1 试验菌株及培养基 |
| 3.1.2 试验试剂 |
| 3.1.3 试验仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 菌丝培养 |
| 3.2.2 生长照片和显微镜观察 |
| 3.2.3 菌丝生长速度的测定 |
| 3.2.4 固体培养基pH测定 |
| 3.2.5 固体培养基有机酸的测定 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 香菇菌丝胞外有机酸的定性定量 |
| 3.3.2 柠檬酸钙和碳酸钙培养基中透明圈现象 |
| 3.3.3 透明圈的内外培养基pH测定 |
| 3.3.4 不同浓度碳酸钙的草酸分泌量 |
| 3.3.5 透明圈内外部位的显微观察 |
| 3.3.6 草酸在不同钙盐培养基上形成的透明圈现象 |
| 3.3.7 不同pH条件下香菇菌丝的草酸分泌量 |
| 3.3.8 外源添加草酸盐对香菇菌丝的影响 |
| 3.3.9 添加碳酸钙后栽培基质和PDA培养基pH对比 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 草酸代谢路径及转录组分析 |
| 4.1 试验材料及仪器 |
| 4.1.1 试验菌株及培养基 |
| 4.1.2 试验试剂 |
| 4.1.3 试验仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 菌丝培养 |
| 4.2.2 总DNA、RNA提取及cDNA合成 |
| 4.2.3 RNA文库构建与转录组测序 |
| 4.2.4 差异基因的功能注释及差异分析 |
| 4.2.5 实时荧光定量PCR差异基因验证 |
| 4.2.6 LeOAH1的基因克隆 |
| 4.2.7 LeOAH1的生物信息学分析 |
| 4.2.8 蛋白的原核表达及SDS-PAGE分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 转录组测序分析 |
| 4.3.2 转录组中差异基因分析 |
| 4.3.3 差异表达基因的GO功能注释 |
| 4.3.4 差异表达基因的KEGG通路富集分析 |
| 4.3.5 关键的差异基因的分析 |
| 4.3.6 关键基因RT-PCR验证 |
| 4.3.7 绘制香菇草酸合成代谢通路 |
| 4.3.8 LeOAH1基因克隆及基因结构分析 |
| 4.3.9 LeOAH1基因的同源性分析 |
| 4.3.10 蛋白结构预测及分析 |
| 4.3.11 不同pH条件下LeOAH1 和转录因子PacC基因表达分析 |
| 4.3.12 LeOAH1 表达受转录因子PacC的调控 |
| 4.3.13 LeOAH1原核表达分析 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 全文结论 |
| 5.1 本研究的主要结论 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 有待进一步研究的问题 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 耐盐酶类及耐盐基因的应用 |
| 1.1.1 微生物耐盐酶的种类 |
| 1.1.2 微生物耐盐基因的种类 |
| 1.1.3 耐盐酶类的应用 |
| 1.1.4 耐盐基因的应用 |
| 1.2 利用宏基因组学获取耐盐酶类及基因的策略 |
| 1.2.1 宏基因组文库筛选法 |
| 1.2.2 同源克隆法 |
| 1.2.3 宏基因组直接测序 |
| 1.3 宏基因组学在不同环境样品中获取耐盐酶类及耐盐基因的研究 |
| 1.3.1 宏基因组学用于海洋微生物中耐盐酶类及耐盐基因的研究 |
| 1.3.2 宏基因组学用于土壤微生物中耐盐酶类及耐盐基因的研究 |
| 1.3.3 宏基因组学用于胃肠道微生物中耐盐酶类及耐盐基因的研究 |
| 1.3.4 宏基因组学用于其它生境耐盐酶类及耐盐基因的研究 |
| 1.4 6-磷酸海藻糖(T6P)水解酶研究概况 |
| 1.4.1 海藻糖 |
| 1.4.2 T6P水解酶(EC3.2.1.93) |
| 1.4.3 耐盐T6P水解酶的应用 |
| 1.5 研究目的及意义 |
| 1.6 研究内容 |
| 1.7 技术路线 |
| 第二章 胃肠道微生物宏基因组耐盐克隆的筛选、测序及潜在耐盐酶类及基因分析 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 样品、菌株和载体 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 主要培养基 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 耐盐克隆的筛选 |
| 2.2.2 耐盐克隆对不同盐浓度的耐受性分析 |
| 2.2.3 Fosmid DNA提取 |
| 2.2.4 高通量测序及生物信息学分析 |
| 2.3 实验结果与分析 |
| 2.3.1 耐盐克隆的筛选 |
| 2.3.2 耐盐克隆对不同盐浓度的耐受性分析 |
| 2.3.3 高通量测序和基因功能分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 耐盐六磷酸海藻糖水解酶的异源表达及酶学性质鉴定 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 样品、菌株和载体 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 主要培养基 |
| 3.1.5 主要溶液 |
| 3.1.6 DNA测序与引物合成 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 序列分析 |
| 3.2.2 PCR扩增目的基因 |
| 3.2.3 胶回收纯化PCR扩增产物 |
| 3.2.4 感受态细胞的制备 |
| 3.2.5 pEASY-E2 质粒的提取 |
| 3.2.6 pEASY-E2 质粒的双酶切 |
| 3.2.7 连接 |
| 3.2.8 重组质粒的转化 |
| 3.2.9 重组质粒的鉴定 |
| 3.2.10 重组酶在大肠杆菌中的诱导表达 |
| 3.2.11 重组酶的纯化 |
| 3.2.12 重组酶的鉴定 |
| 3.2.13 重组酶的定量 |
| 3.2.14 酶活测定方法 |
| 3.2.15 酶学性质分析 |
| 3.3 实验结果与分析 |
| 3.3.1 T6P水解酶基因的PCR扩增及序列分析 |
| 3.3.2 重组T6P水解酶r TRE_P2和rTRE_P3 的异源表达、纯化及鉴定 |
| 3.3.3 重组T6P水解酶r TRE_P2和r TRE_P3 的定量 |
| 3.3.4 重组T6P水解酶r TRE_P2和rTRE_P3 的酶学性质研究 |
| 3.3.5 重组T6P水解酶r TRE_P2和rTRE_P3 的最适pH及 pH稳定性 |
| 3.3.6 重组T6P水解酶r TRE_P2和rTRE_P3 的最适温度及温度稳定性 |
| 3.3.7 NaCl浓度对重组T6P水解酶r TRE_P2和rTRE_P3 的影响和Na Cl稳定性 |
| 3.3.8 不同金属离子及化学试剂对重组T6P水解酶r TRE_P2和rTRE_P3 活力的影响 |
| 3.3.9 重组T6P水解酶r TRE_P2和rTRE_P3 的底物专一性 |
| 3.3.10 重组T6P水解酶rTRE_P2和rTRE_P3 的动力学参数 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 总结、创新与展望 |
| 4.1 总结 |
| 4.2 创新 |
| 4.3 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文和研究成果 |
| 附录 |
| 附录A 实验室常用溶液配制 |
| 附录B T6P水解酶基因序列 |
| 附录C T6P水解酶氨基酸序列 |
| 附录D 氨基酸中英文对照及缩写 |
| 致谢 |
