高梦茹[1]（2021）在《内皮细胞TRPV4-Nox2复合体在肥胖相关血管功能障碍中的作用及干预研究》文中提出近年来,心血管疾病已经成为威胁人类健康的头号杀手,中国心血管健康与疾病报告表明,目前,我国已经累积有超过3亿的心血管病人,死亡率居高不下,几乎每5例死亡病例中,就有2例死于心血管疾病。心血管疾病严重威胁着人类健康,调查显示,肥胖是一个重要危险因素,美国心脏病学子刊一项涉及19万肥胖病人的研究表明,肥胖会提早心血管疾病的发病时间,增加发病率,增加死亡率[1]。肥胖合并心血管疾病严重威胁着人类健康,探索其发病机制与干预策略具有重要意义。2020年,Nat Rev Cardiol上的一项研究揭示,内皮细胞会响应血流剪切力发挥调节血管功能的作用[2]。以往多项研究工作揭示肥胖引发的ROS和炎症因子产生增加,血脂血糖增加会改变血流动力学。瞬时受体电位香兰素4型（Transient receptor potential vanilloid type 4,TRPV4）通道,于2000年首次被描述,此后,多项关于TRPV4通道的研究表明,该通道是重要的机械敏感通道,可被血流剪切力激活,引发钙内流,内流的钙离子可上调胞内ROS产生,改变炎症因子、血管舒张因子、内皮细胞通透调节因子基因水平,发挥调节血管功能的作用。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸酯氧化酶2（Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase,Nox2）,于1964年首次报道,此后,多篇高水平研究证实,Nox2是关键的ROS产生调节酶,可响应钙离子变化发挥血管功能调节作用。TRPV4和Nox2对血管功能调节具有重要作用,然二者组织分布过广,系统性激活药物具有多种副作用,如何避免这些副作用,研究尚未表明。近年来,随着研究的深入,越来越多的结果证实,相较于单一受体工作,受体与受体间易形成同源异源复合体协同产生功能。2008、2009年Circulation Research上发表的研究强调了TRP通道相关复合体在血管病变中的重要作用[3,4]。本课题组以往的研究,也证实了这一事实[5,6],并确认复合体耦联强度的改变对疾病的发生发展具有重要影响。综上,本研究提出了如下问题:内皮细胞上TRPV4是否能与Nox2形成复合体?肥胖是否通过改变内皮细胞TRPV4-Nox2复合体耦联强度,对血管功能产生不利影响?针对内皮细胞TRPV4-Nox2复合体进行干预,能在血管保护方面发挥怎样的作用?为此,我们运用了原代内皮细胞及经典肥胖小鼠模型,在生理及病理状况下观察了TRPV4和Nox2之间物理及功能耦联的变化,并运用计算机模拟技术以TRPV4-Nox2复合体为靶点进行了干预分子筛选。主要结果如下:1.发现肥胖小鼠内皮细胞中ROS及炎症因子产生增加,内皮细胞及血管通透性增加、血管舒张功能损伤。2.发现内皮细胞TRPV4和Nox2参与调节肥胖小鼠内皮细胞中的ROS和炎症因子产生,内皮细胞及血管通透性,参与调节血管舒张功能,并发现肥胖可增强内皮细胞TRPV4-Nox2复合体的耦联强度。3.找到内皮细胞TRPV4-Nox2复合体结合位点,并确认减弱TRPV4-Nox2复合体物理耦联,可对肥胖相关血管功能障碍发挥调节作用。4.发现靶向内皮细胞TRPV4-Nox2复合体的小分子化合物M12,可通过减弱TRPV4-Nox2复合体的耦联强度,发挥保护血管功能的作用。
段艳茹,杜芸辉,刘慧荣[2]（2021）在《闭合蛋白（occludin）在血管内皮损伤中的研究进展》文中研究指明内皮细胞紧密连接蛋白在维持血管内皮结构和生理功能完整性上具有十分重要的作用。闭合蛋白（occludin）作为紧密连接蛋白中最具代表性的蛋白,主要负责密封细胞间连接、维持细胞通透性、参与维持血管内皮的完整性。近年来的研究显示,许多疾病如脑中风、动脉粥样硬化、肺动脉高压等均出现内皮细胞紧密连接蛋白的表达和功能异常,提示其与血管疾病发生和发展有着千丝万缕的联系。本文从occludin的生物学信息、occludin发挥血管内皮保护作用的信号通路、occludin与血管内皮损伤相关疾病的关系出发,就近年来occludin与血管内皮损伤之间关系的研究进展作一综述。
唐柳欢[3]（2021）在《大米活性肽对高糖诱导的内皮细胞氧化应激的保护作用》文中研究表明我国是水稻种植大国和消费大国,大米是主食之一。除主要食用的精白米部分外,加工形成的大米副产物中含有丰富的营养物质,但在实践中其利用率极低。米糠中含有稻谷64%的营养素,其中蛋白质含量高,且其氨基酸组成合理、过敏性低,具有极高的开发利用价值。现代人饮食结构逐渐发生改变,肥胖人数越来越多,而长期高糖饮食是主要影响因素,血糖浓度偏高会增加患糖尿病、心血管疾病的风险;本课题组前期已对从米糠蛋白中分离筛选出一条具有出色抗氧化能力的活性肽进行了深入研究。前期研究表明该活性肽（Rice-derived bran bioactive peptide,RBAP）能够增强血管抵抗氧化应激的能力。在此基础上,结合高糖对人体的影响,以高糖诱导的内皮细胞氧化应激作为研究对象,挖掘RBAP在高糖氧化损伤中的抗氧化活性及作用机理,为将活性肽应用在为血糖偏高的亚健康人群的营养干预及需要通过饮食强化血糖控制的人群提供指导。本文利用高浓度葡萄糖诱导血管内皮细胞（HUVEC）构建氧化应激模型损伤组,以RBAP为效应物保护HUVEC构建保护组,开展RBAP抗高糖氧化损伤研究。H&E及Hoechst染色结果显示RBAP能维持高糖损伤条件下内皮细胞的正常形态;流式细胞术结果表明RBAP能减少细胞凋亡和维持正常周期;同时,RBAP能维持线粒体膜电位的稳定,显着降低细胞内外氧化指标ROS、MDA的含量,上调细胞内外抗氧化指标SOD、GSH的含量,提高细胞的总抗氧化能力（T-AOC）;对内皮细胞成管能力和通透性的检测结果表明RBAP有助于内皮细胞维持正常的生理功能。综上表明,RBAP提升了内皮细胞抵抗高糖氧化损伤的能力。进一步深入开展RBAP抗氧化作用机制研究,Western Blot结果表明,RBAP能抑制高糖引起的AGEs-RAGE通路的激活,减少NADPH氧化酶通过上调RAC1导致ROS的过量产生,从而抑制炎症通路NF-κB和JNK通路的激活,降低其下游因子EGR-1、PAI-1和VEGF的蛋白表达量,进而实现对高糖引起的内皮细胞氧化应激的保护作用。初步确定RBAP作用机制后,结合高糖情况下会促进典型的心血管疾病动脉粥样硬化的发生及发展,深入探究RBAP对高糖情况下患动脉粥样硬化风险的影响。通过基因表达综合数据库GEO、STRING和人类蛋白质文献数据库HPRD和DAVID对动脉粥样硬化进行生物信息学分析,利用PPI、GO和KEGG等数据模型对风险基因进行分析预测,筛选出与氧化应激相关的关键因子有ICAM1、IL1B、TLR8、CDC23、DTX3L 等;关键通路有 JAK-STAT、PI3K-Akt、MAPK、细胞因子调控、细胞形态调控等,并在高糖情况下验证了 RBAP对关键因子ICAM-1和IL1B表达量的影响,结果表明,RBAP减缓了高糖情况下促进心血管类疾病动脉粥样硬化的发生及发展进程。综上,RBAP能保护内皮细胞免受高糖引起的氧化应激损伤,并可能减少高糖情况下患动脉粥样硬化的风险。
徐冰雪[4]（2021）在《MKP5对棕榈酸诱导的血管内皮细胞损伤的作用及机制研究》文中指出研究背景:血管内皮细胞损伤与动脉粥样硬化、糖尿病大血管病变、高血压、冠心病等心血管疾病的发生发展关系密切,以高脂血症为特征的脂质代谢紊乱是此类心血管疾病的主要危险因素。高脂血症时,脂肪分解加速,血中游离脂肪酸水平明显增加,使血管内皮细胞舒张因子减少,同时引发氧化应激、炎症反应等,诱导细胞凋亡,造成血管功能障碍。丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶 5（Mitogen-activated protein kinase phosphatases5,MKP5）是丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase,MAPK）的负调控磷酸酶,在肥胖相关的糖尿病、肺纤维化及脂肪肝等疾病中发挥调节作用。已有研究表明,MKP5对肥胖及脂肪蓄积引起的巨噬细胞炎症反应和胰岛细胞凋亡具有抑制作用,但是MKP5在血管内皮细胞损伤中的作用及机制尚未见报道。棕榈酸（palmitic acid,PA）作为饱和游离脂肪酸的主要成分,常用来构建脂毒性损伤模型,因此,研究MKP5对棕榈酸介导的血管内皮细胞损伤的调控作用,可为高脂血症相关的心血管疾病的治疗提供新的理论依据及潜在分子靶点。实验目的:在人脐静脉内皮细胞HUVEC中调控MKP5表达,探讨MKP5在PA诱导的血管内皮细胞损伤中的调控作用及其分子机制。实验方法:1.用不同浓度 PA（100、200、300、400、500、600 μM）处理 HUVEC 细胞,CCK8法检测细胞增殖活力变化。PA（400 μM）处理HUVEC细胞不同时间（0、3、6、9、12h）,Western blot 法检测 MKP5 蛋白、凋亡相关蛋白（BAX、Bcl-2、cleaved Caspase 3）及内质网应激激酶pIRE-1α的表达。2.用pcDNA3.1和pcDNA3.1-MKP5质粒分别转染HUVEC细胞,构建MKP5稳定过表达的细胞系（HUVEC-MKP5）及对照细胞系（HUVEC-PC）。HUVEC-MKP5和HUVEC-PC经400 μM PA刺激9 h后,CCK8法检测细胞增殖活力;Western blot 法检测细胞凋亡蛋白（BAX、Bcl-2、cleaved Caspase 3、cleaved Caspase 9）及内质网应激相关蛋白（GRP78、pIRE-1α、pEIF-2α、CHOP、cleaved Caspase 12）表达情况,并使用qPCR法检测转录因子XBP-1s的基因转录水平。采用DCFH-DA活性氧检测试剂盒检测细胞内ROS含量变化,通过相应试剂盒分别测定细胞内一氧化氮（NO）、谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）含量,及超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、总抗氧化能力（T-AOC）水平,使用qPCR法检测氧化应激分子（p22phox、HIF-1α）及炎性细胞因子（IL-6、IL-1β、TNF-α、VCAM-1和ICAM-1）的表达。通过Western blot法检测 MAPK通路中P38、JNK、ERK蛋白的磷酸化表达水平。3.进一步用抑制MKP5表达的慢病毒Lenti-shMKP5及对照病毒Lenti-SC分别感染HUVEC细胞24 h,换DMEM完全培养液继续培养12 h,400 μM PA处理9 h后,通过Western blot法检测细胞凋亡蛋白（BAX、Bcl-2、cleaved Caspase 9、cleaved Caspase 3）及内质网应激相关蛋白（GRP78、IRE-1α、cleaved Caspase 12）的表达。采用DCFH-DA活性氧检测试剂盒检测细胞内ROS含量变化,并经qPCR法检测氧化应激分子（p22phox、HIF-1α）及炎性细胞因子（IL-6、IL-1β、TNF-α）的表达。通过 Western blot 检测 MAPK 通路中 P38、JNK、ERK 的蛋白的磷酸化水平。实验结果:1.PA抑制HUVEC细胞增殖活力,诱导内质网应激和线粒体凋亡CCK8检测结果显示,PA处理后HUVEC细胞增殖活力呈剂量依赖性下降,在400 μMPA处理下,细胞活力降低约52%。Western blot结果显示,随着PA处理时间延长,MKP5蛋白的表达水平呈现先下降后上升的趋势,在处理9 h时对MKP5表达的抑制作用最为明显。进一步检测线粒体凋亡和内质网应激结果显示,PA可引起Bcl-2家族中促凋亡蛋白BAX表达增加,抗凋亡蛋白Bcl-2下降,并增加cleaved Caspase 3的活化,同时上调IRE-1α的磷酸化水平,表明PA刺激HUVEC细胞引发线粒体凋亡和内质网应激。本实验选取PA（400 μM,9 h）进行后续实验。2.MKP5抑制PA诱导的HUVEC细胞线粒体凋亡细胞增殖实验检测结果显示,MKP5过表达明显抑制PA诱导的细胞增殖活力下降。Western blot结果显示,MKP5高表达显着下调PA诱导的cleaved Caspase 3和cleaved Caspase9的蛋白表达,上调Bcl-2/BAX的比值。并且抑制MKP5表达后进一步促进PA诱导的Caspase 3和Caspase 9的剪切活化,Bcl-2/BAX的比值进一步降低,表明MKP5可抑制PA诱导的线粒体凋亡。3.MKP5缓解PA诱导的内质网应激Western blot结果显示,PA可显着提高GRP78、pIRE-1α、pEIF-2α蛋白水平,而MKP5过表达后可抑制PA诱导的上述蛋白的高表达。qPCR结果显示,MKP5明显抑制PA诱导的XBP-1s基因的表达增加。同时PA诱导内质网应激凋亡相关蛋白CHOP和cleaved Caspase 12的表达,而MKP5高表达可显着下调PA诱导的上述凋亡蛋白的高表达。MKP5敲减后可进一步促进GRP78表达和Caspase 12剪接活化,激活IRE-1α,加剧PA诱导的内质网应激损伤。表明MKP5具有抑制PA诱导的内质网应激的作用。4.MKP5缓解PA诱导的氧化应激及炎性因子分泌氧化应激分析结果显示,PA可诱导ROS生成增加,下调NO水平,增加过氧化产物MDA生成,抑制抗氧化酶SOD、CAT及非酶抗氧化物GSH水平,降低细胞T-AOC含量。而MKP5过表达后,显着降低ROS生成,增加NO生物利用度,下调MDA水平,上调HUVEC细胞抗氧化能力。同时qPCR结果显示,PA可提高p22phox和HIF-1α的mRNA水平,而MKP5过表达显着抑制PA对上述氧化应激因子的刺激作用。表明MKP5可抑制细胞氧化应激反应。qPCR进一步证实,PA上调促炎因子IL-6、IL-1β和TNF-α及血管黏附分子VCAM-1和ICAM-1的mRNA水平,而MKP5过表达显着抑制促炎因子及黏附分子的表达水平,抑制PA诱导的炎症反应。MKP5敲减后可进一步促进ROS生成,引起p22phox和HIF-1α的mRNA水平上调。同时加剧PA诱导的促炎因子IL-6、IL-1β和TNF-α表达增加,加剧细胞氧化应激及炎性因子分泌。表明MKP5可抑制PA诱导的氧化应激及炎性因子分泌。5.MKP5调节PA诱导的MAPK通路信号转导Western blot结果显示,随着PA处理时间延长,MAPK通路中的pP38在3 h到达峰值,延长时间至12 h时没有明显改变,pJNK及pERK在3 h到达峰值,之后逐渐下降。而MKP5过表达后,对pP38、pJNK及pERK表达具有不同程度的抑制作用（P<0.05）。进一步干扰MKP5表达后可加剧PA对MAPK通路的激活作用。因此,MKP5可能通过P38、JNK和ERK通路发挥调控PA诱导的HUVEC细胞损伤过程。实验结论:1.MKP5可缓解PA诱导的血管内皮细胞增殖抑制、氧化应激、炎症反应、内质网应激和线粒体凋亡。2.MKP5可能通过负调控P38、JNK及ERK通路抑制脂毒性相关的血管内皮细胞损伤。
赵国梁[5]（2021）在《黄芪复方中药对Hcy诱导RCMECs损伤的作用机制研究》文中研究说明目的:运用网络药理学方法,以黄芪复方中药靶点与冠心病靶点所构成的交集靶点为纽带,探讨黄芪复方中药治疗冠心病的预测靶点与作用机制。通过细胞培养技术,研究对象选择大鼠心肌微血管内皮细胞（RCMECs）,观察黄芪复方中药含药血清对同型半胱氨酸诱导RCMECs损伤的干预作用及炎症反应的机制研究,进一步探讨黄芪复方中药治疗冠脉微循环障碍的作用机制,拓展冠脉微循环障碍治疗途径,也为黄芪复方中药在中医临床运用中提供理论实验依据。材料与方法:（1）基于网络药理学,通过数据库检索黄芪复方中药成分靶点与冠心病靶点,取两者交集靶点,运用PPI网络和DAVID 6.8数据库分析交集靶点体现出关键靶点以及交集靶点所参与的生物学过程等,探讨黄芪复方中药治疗冠心病可能的作用机制;运用Cytoscape 3.6.0软件对“黄芪复方-中药-成分-交集靶点网络”进行网络拓扑分析,明确黄芪复方中药的关键成分。（2）根据实验需要将50只雄性SPF级SD大鼠按照10只为一组的标准,随机分为五组,分别命名为空白组、模型组、黄芪复方中药低剂量组、黄芪复方中药中剂量组、黄芪复方中药高剂量组,空白组和模型组:给予相同体积蒸馏水灌胃处理,黄芪复方中药低剂量组按照1.8 g/kg标准灌胃、黄芪复方中药中剂量组按照3.6 g/kg标准灌胃、黄芪复方中药高剂量组按照7.2 g/kg标准灌胃。五个组别大鼠每日灌胃2次,连续7日。在第7日,灌胃处理1小时后的五组大鼠,先将其麻醉,然后通过腹主动脉方式进行取血,将采集到的血清静置、高速离心、过滤血清杂质和灭活,最终将处理完毕含药血清放于-80℃冰箱中保存。（3）将购买所得的大鼠心肌微血管内皮细胞进行传代培养、冷冻及复苏,倒置显微镜观察形态,CD31免疫荧光法鉴定细胞阳性率大于95%,以备用。将细胞分为空白组、模型组、黄芪复方中药低、中、高剂量组,除空白组外其他各组都给予同型半胱氨酸诱导细胞损伤,黄芪复方中药低、中、高剂量组分别给予对应的低、中、高剂量含药血清与细胞共同培养24小时,收集各组细胞上清液,MTT法检测细胞活性,ELISA法检测TNF-α和IL-6含量。结果:1.本次研究经过前期对数据的检索、筛选、整理、归纳,得出黄芪复方四味中药黄芪、当归、全蝎、蜈蚣共包含39个中药有效成分,其对应326个靶点,冠心病包含1024个靶点。利用网络药理学研究黄芪复方中药与冠心病关系,可知黄芪复方中药30个有效成分对应94个交集靶点。经过对交集靶点PPI网络拓扑分析和富集分析,黄芪复方中药以IL-6、TNF等关键靶点和多条通路为基础起到治疗冠心病的作用。2.通过ELISA法分析检测五组RCMECs上清液中IL-6、TNF-α含量并进行比较:与空白对照组比较,模型组细胞上清液中IL-6、TNF-α含量显着升高（P<0.01）;与模型组比较黄芪复方中药高剂量组、黄芪复方中药中剂量组以及黄芪复方中药低剂量组RCMECs上清液中IL-6、TNF-α含量均显着降低（P<0.01）。结论:1.通过网络药理学分析,黄芪复方中药以IL-6、TNF等关键靶点为基础起到治疗冠心病的作用。2.黄芪复方中药含药血清能够明显降低实验组细胞中IL-6、TNF-α含量,抑制炎症反应,减轻Hcy对大鼠心肌微血管内皮细胞损伤,可能是其治疗冠脉微循环障碍的机制之一,而且黄芪复方中药组之间存在量效关系。
刘冰[6]（2021）在《Wnt1/β-catenin通路在瘦素介导的慢性肾脏病内皮功能障碍中的作用机制研究》文中研究表明背景/目的慢性肾脏病（Chronic kidney disease,CKD）是由各种原因引起的肾损害。由于CKD死亡率排行逐年攀升,目前是世界范围内严重的公共卫生问题。研究表明CKD首要的并发症是心血管疾病（Cardiovascular disease,CVD）,是半数以上CKD患者的死因。CKD患者CVD主要病理改变为动脉粥样硬化,动脉粥样硬化始发于内皮细胞（Endothelial cells,ECs）。内皮功能障碍（Endothelial dysfunction,ED）是动脉粥样硬化的基础。研究表明,ED在CKD患者的早期阶段就很明显,随着疾病向终末期肾病（End stage kidney disease,ESKD）发展,ED程度逐渐加重,CVD死亡的风险也越来越高。目前CKD中ED的机制尚不明确,多种因素包括炎症、氧化应激、低维生素D、高磷血症、以及一氧化氮合成酶上游内源性抑制剂的积聚均参与其中。瘦素（Leptin）是脂肪组织合成和分泌的一种16 kDa蛋白。近年来研究表明,瘦素不仅参与能量代谢,还可促进氧化应激、炎症和脂质紊乱,而这些亦是ED发生的关键因素,因此,瘦素与CVD的风险增高密切有关。瘦素已成为心血管健康状况不佳的生物标志物,也是冠心病/急性冠脉综合征风险的生物标志物。瘦素通过肾小球滤过和肾小管代谢降解被肾脏清除,且有研究证实,CKD患者存在血清瘦素水平的升高,然而瘦素是否参与了 CKD患者ED的发生尚缺乏深入研究。Wnt通路通过控制细胞分化相关基因的表达来调节细胞的增殖和存活。到目前为止,已经发现了三条Wnt途径:一条β-catenin依赖的途径和两条不依赖于β-catenin的途径。Wnt/β-catenin信号通路是细胞粘附、胚胎发育、损伤修复和维持组织器官稳态的进化保守的信号级联。转移相关蛋白1（Metastasis-associated protein 1,MTA1）是核小体重塑和组蛋白去乙酰化复合物的一个组成部分,在人类多种细胞系和癌组织中广泛表达,并在细胞生存、扩散、迁移和入侵中起重要作用。大量研究提示,MTA1是Wnt通路重要的调控分子,在对非小细胞肺癌细胞的研究发现,MTA1表达下调可抑制Wnt/β-catenin通路,MTA1表达上调可激活Wnt/β-catenin通路。近年来研究证实,Wnt/β-catenin通路在ECs损伤中发挥重要作用,在氧化应激条件下辛伐他汀可通过激活Wnt/β-catenin通路诱发ED。而瘦素部分生理作用依赖于Wnt/β-catenin通路,如瘦素通过上调Wnt/β-catenin通路促进乳腺癌细胞的生长。由此,我们推测MTA1/Wnt/β-catenin通路可能在瘦素参与的CKD患者ED中具有重要的作用。因此,本研究收集比较CKD患者与健康对照者（Healthy controls,HCs）临床资料和血清学标本,检测瘦素、ED相关血清学标志物水平,评价瘦素与ED相关血清标志物的相关性;并进一步检测血流介导的血管舒张（Flow-mediated dilatation,FMD）评估血管内皮功能,评价瘦素与内皮功能的关系;并通过体外培养人脐静脉内皮细胞（Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）,深入探讨瘦素在ED中的作用及具体机制。我们的研究将为CKD患者预防和治疗ED提供新的思路和治疗靶点。研究方法本研究分为两部分,第一部分为临床研究,确定CKD患者中瘦素水平的改变,以及瘦素与CKD患者ED的关系。第二部分为体外实验,探索瘦素对ED的作用以及其可能的机制。1.临床研究1.1研究对象:选取2014年1月-2019年12月在山东大学附属省立医院肾内科就诊符合入排标准的160例CKD患者。自山东大学附属省立医院查体中心选取性别、年龄匹配的160例健康成年人作为HCs,其年龄、性别较CKD组无差异。1.2临床资料收集以问卷方式详细记录患者的年龄、性别、吸烟史、发病时间及既往病史,并按标准测量方式完成人体测量,包括血压、身高和体重测量。并计算体重指数（Bodymass index,BMI）。1.3血标本采集和检测1.3.1常规实验室检测检测血肌酐、甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、空腹血糖、血清胰岛素、超敏C反应蛋白。1.3.2 酶联免疫吸附测定（Enzyme-linked immunosorbent assays,ELISA）:检测血清瘦素、白介素-6（Interleukin-6,IL-6）、单核细胞趋化蛋白1（Monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1）及内皮素（Endothelin-1,ET-1）的水平。1.3.3计算稳态模型评估的胰岛素抵抗指数1.4 FMD检测评估血管内皮功能2.体外实验本部分采用HUVECs进行研究。2.1瘦素刺激对HUVECs炎症因子产生的影响根据预实验HUVECs的细胞活力变化,我们将100 ng/ml的瘦素作为最适浓度,并用其在不同时间（0h,6h,12 h,24h）刺激体外培养的HUVECs。采用ELISA检测HUVECs上清液中不同时间点IL-6、MCP-1及ET-1的水平;采用实时定量聚合酶链式反应（Real time polymerase chain reaction,RT-PCR）及蛋白印迹法（Western blot,WB）测定 HUVECs 的 IL-6、MCP-1、ET-1 在基因和蛋白水平的变化。2.2瘦素对HUVECs迁移的作用2.2.1划痕愈合试验HUVECs贴壁长满后划痕,初始划痕宽度记为A;干预组与对照组12 h后划痕宽度记为B;划痕愈合率=（A-B）/A×100%。2.2.2 Transwell细胞迁移实验取100μl对照组与干预组HUVECs单细胞悬液加入Transwell小室上腔中,培养7 h使细胞迁移。2.3瘦素对HUVECs单层通透性的作用利用Transwell上室（滤膜孔径:0.4 μm）培养HUVECs,使其形成内皮细胞单层,进一步检测内皮单层对异硫氰酸荧光素葡聚糖（fluorescein isothiocyanate dextran,FITC-dextran）的通透性,评估瘦素对HUVECs单层通透性的作用。2.4瘦素对HUVECs骨架重排的作用FITC-鬼笔环肽对不同干预条件下的HUVECs的F-actin进行染色,探讨瘦素是否可诱导细胞骨架重组。采用激光共聚焦显微镜免疫荧光检测连接蛋白（vinculin）的变化。2.5瘦素诱导ED的分子机制瘦素处理HUVECs 24h后,应用WB测定MTA1、Wnt1、β-catenin和磷酸化β-catenin（Y654）的蛋白水平变化。为进一步验证MTA1及Wnt1/β-catenin通路在瘦素诱导的ED中的作用,我们构建了 MTA1 短发夹核糖核酸（short hairpin ribonucleic acid,shRNA）及 Wnt1 shRNA慢病毒,并分别转染HUVECs,检测MTA1或Wnt1基因敲除后,瘦素刺激下炎症因子IL-6、MCP-1、ET-1的表达,HUVECs细胞迁移、通透性、细胞骨架重排及β-catenin的变化。结果1.临床研究1.1 CKD患者血清瘦素水平升高CKD患者血清瘦素水平较HCs组明显升高（7.89（3.79-9.33）ng/mlvs 5.49（5.49-7.73）ng/ml;P=0.039）。1.2 CKD患者ED相关炎症标志物水平升高与HCs相比,CKD患者血清IL-6、MCP-1、ET-1水平升高（IL-6:6.18（4.21-7.25）pg/ml vs 4.89（3.89-5.91）pg/ml,P=0.002;MCP-1:213.48（158.33-269.34）pg/ml vs 168.72（117.30-214.62）pg/ml,P<0.001;ET-1:2.27（1.41-3.06）pg/ml vs 1.34（0.97-1.77）pg/ml,P<0.001）。1.3 CKD患者FMD减低CKD 患者 FMD 水平较 HCs 组明显减低（4.49（2.83-5.74）vs 8.29（5.52-9.07）,P<0.05）。1.4 CKD患者血清瘦素水平与其他指标相关性分析CKD患者血清瘦素水平与肾小球滤过率呈负相关（r=-0.122,P=0.030）;与IL-6、MCP-1、ET-1 水平呈正相关（IL-6:r=0.119,P=0.034;MCP-1:r=0.115,P=0.039;ET-1:r=0.144,P=0.010）;与 FMD 呈显负相关（r=-0.294,P=0.006）。2.体外实验2.1瘦素刺激后,HUVECs分泌炎症因子增加应用100 ng/ml瘦素刺激HUVECs发现,瘦素刺激12 h后,ELISA结果显示,IL-6、ET-1和MCP-1水平显着升高,24 h后浓度最高,差异有统计学意义（P<0.01）;RT-PCR与WB结果显示,与对照组相比,瘦素刺激24 h后,HUVECs中IL-6、ET-1和MCP-1的mRNA及蛋白水平显着升高,差异有统计学意义（P<0.01）。2.2瘦素可促进HUVECs迁移与正常对照组相比,瘦素刺激组划痕愈合速度显着增快（P<0.01）,迁移穿过Transwell膜的细胞显着数多（P<0.01）。2.3瘦素可增加HUVECs的单层通透性与正常对照组相比,瘦素刺激组Transwell下室FITC-dextran的荧光强度显着增加（P<0.01）。2.4瘦素可诱导HUVECs的细胞骨架重排瘦素刺激后HUVECs的F-actin重排,分布在细胞边缘的肌动蛋白纤维减少,横跨细胞体的应力纤维明显增多、变粗,且排列紊乱,同时vinculin募集明显增加。2.5瘦素诱导ED的分子机制2.5.1瘦素通过活化MTA1-Wnt1通路诱导EDWB证实,瘦素处理HUVECs 24 h后,Wnt1和MTA1显着升高（P<0.01）;为了进一步确定MTA1及Wnt1是否参与了瘦素诱导的ED,我们分别使用慢病毒转染MTA1 shRNA及Wnt1 shRNA以降低其表达,并验证了敲除效率（P<0.01）。此外,用MTA1 shRNA转染HUVECs后,由瘦素刺激诱导的HUVECs的Wnt1表达增高被显着抑制,差异有统计学意义（P<0.05）;而Wntl shRNA转染HUVECs后,不影响瘦素诱导的MTA1的表达（P>0.05）。WB及RT-PCR结果显示,MTA1基因敲低及Wnt1基因敲低后,可显着降低由瘦素刺激所导致的炎症因子IL-6、MCP-1、ET-1 mRNA与蛋白的表达增高（P<0.05）;划痕愈合试验及Transwell细胞迁移实验发现,MTA1基因敲低及Wnt1基因敲低后,可显着改善由瘦素刺激所导致HUVECs的迁移力增加（P<0.05）;同时,FITC-鬼笔环肽染色显示,MTA1和Wnt1基因敲低可减轻由瘦素所引起的细胞骨架的破坏。2.5.2瘦素通过诱导β-catenin核转位和磷酸化参与EDWB显示,瘦素刺激后HUVECs的β-catenin总蛋白量较对照组无显着变化（P>0.05）,而核 β-catenin 和磷酸化 β-catenin（Y654）水平显着升高（P<0.01）。瘦素刺激MTA1或Wnt1敲低后的HUVECs,其β-catenin总蛋白的表达与瘦素刺激的野生型HUVECs无统计学意义（P>0.05）,核β-catenin和磷酸化β-catenin（Y654）水平较后者显着降低,差异有统计学意义（P<0.05）。结论1.CKD患者血清瘦素水平升高,且与内皮功能障碍密切相关。2.瘦素可通过诱导内皮细胞炎症因子合成、导致F-actin骨架重排以及细胞迁移性和单层通透性增强,介导内皮功能障碍的发生。3.瘦素通过激活MTA1/Wnt1,导致β-catenin发生核迁移和Y654磷酸化,进而介导内皮功能障碍。
周芳[7]（2021）在《基于差异表达的LncRNA TUG1研究小陷胸加味汤治疗冠心病（痰热互结证）的作用机制》文中认为目的:冠状动脉粥样硬化性心脏病（Coronary Atherosclerotic Heart Disease,CHD）是由冠状动脉血管发生动脉粥样硬化病变而引起血管腔狭窄或阻塞,造成心肌缺血、缺氧或坏死而导致的心脏病。一项由国家心血管病中心组织编撰体现我国心血管疾病流行与防治的报告—《中国心血管病报告2018》中分析指出:目前我国约有3亿口人被确诊罹患心血管疾病,其中冠状动脉粥样硬化性心脏病患者人数超过1100万,位列心血管疾病第二,并且死亡率在心血管疾病中位列第一,这给社会和家庭带来了很大的负担。因此,安全有效的防治工作对降低冠心病的病亡率具有重要意义。血管内皮细胞功能障碍在冠心病的发生、发展过程中具有举足轻重的作用,其贯穿冠状动脉粥样硬化的始动、发展及临床事件整个过程。中医作为中华民族的瑰宝,历经时间的沉淀和反复验证,在保护血管内皮、改善血管内皮功能方面治疗冠心病具有独特优势。近年来,随着高通量基因测序技术、基因转录组学的不断革新进步,非编码RNA（noncoding RNA,nc RNA）在各种疑难疾病中揭开神秘面纱,有关其在心血管疾病中研究不在少数,这为心血管疾病的防治提供重要思路,也为疾病的基因治疗夯实基础。牛磺酸上调基因1（Taurine up-regulated1,TUG1）首先是在体外培养的新生小鼠视网膜细胞中被发现,后来被证实在损伤血管内皮细胞中高表达,可以通过介导血管内皮细胞的损伤参与心血管疾病的发病。p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinases,p38MAPK）信号通路的激活在内皮细胞损伤中发挥重要作用,可以通过磷酸化转录因子引起多种相关基因转录,调控活性物质的表达,参与血管内皮细胞氧化应激损伤、凋亡等过程。基于差异表达的LncRNA TUG1与p38MAPK信号通路在冠心病血管内皮损伤中的重要作用,本研究将以保护血管内皮细胞作为切入点深入探讨小陷胸加味汤治疗冠心病作用机制,旨在为小陷胸加味汤的临床应用提供科学依据。方法:1.通过理论研究探索冠心病中医病名、病因病机、中医治疗的历史渊源及进展,揭示小陷胸汤治疗冠心病（痰热互结证）的中医辨证思路。基于中医药改善血管内皮功能治疗冠心病的独特优势,从基因层面及分子生物学层面挖掘小陷胸汤治疗冠心病（痰热互结证）可能潜在的作用机制,为下一步我们临床应用小陷胸加味汤治疗冠心病（痰热互结证）研究夯实理论基础。2.小陷胸加味汤治疗冠心病（痰热互结证）的临床观察及血管内皮功能的影响。选取56例冠心病（痰热互结证）患者,随机分为小陷胸加味汤组和对照组,小陷胸加味汤组在对照组西医常规治疗基础上予以小陷胸加味汤,疗程均为30天,分别观察（1）临床指标:中医临床症状,心绞痛发作次数、持续时间及发作程度;（2）实验室指标:心电图检查记录心绞痛发作时S-T段及T波的变化;血管内皮相关指标一氧化氮（NO）和内皮素（ET）分泌水平;（3）药物不良反应评价指标:血常规、尿常规、肝肾功能等。3.冠心病（痰热互结证）患者外周血LncRNA TUG1与血管内皮损伤相关性研究。随机选取15例冠心病（痰热互结证）患者,另设健康对照组15例。所有入选对象取血6ml,Real-Time PCR法检测外周血单个核细胞中LncRNA TUG1,免疫学方法测定循环内皮细胞计数,硝酸还原酶法测定一氧化氮分泌水平,放射免疫法测定内皮素分泌水平。采用Pearson相关分析,分别将LncRNA TUG1与循环内皮细胞计数、一氧化氮、内皮素做相关分析。4.基于中药血清药理学研究及时效关系研究,探索小陷胸汤加味汤调控差异表达的LncRNA TUG1与p38MAPK信号通路保护血管内皮细胞的作用机制。选用SPF级SD大鼠经灌胃给药制备小陷胸加味汤含药血清及空白对照血清;TNF-α诱导人脐静脉内皮细胞（HUVEC）制备内皮损伤模型,MTT法筛选最佳含药血清浓度及作用时间。实验分为模型组、空白血清组、小陷胸加味汤含药血清组,分别应用运用培养基、空白组血清及最佳小陷胸加味汤含药血清进行干预。采用RT-PCR法检测小陷胸加味汤含药血清对TNF-α诱导的损伤HUVEC中LncRNA TUG1的表达;Western Blot检测TNF-α诱导的损伤HUVEC中p38MAPK信号通路相关蛋白p38、P-p38的表达水平。采用Pearson相关分析来分析差异表达的LncRNA TUG1与内皮细胞p38MAPK信号通路相关蛋白p38、P-p38之间的相关性。结果:1.小陷胸汤源于《伤寒论》,后世医家在遵循原文的基础上不断扩义,明确提出在审明痰热互结病机的条件下,小陷胸汤能从多靶标、多途径、多层次改善血管内皮治疗冠心病。2.小陷胸加味汤治疗冠心病（痰热互结证）的临床疗效及对血管内皮功能的影响。小陷胸加味汤组能明显改善心绞痛症状和中医证候,与对照组比较差异具有统计学意义（P<0.05）,总有效率分别为92.86%和96.43%,心电图疗效总有效率为92.86%,优于对照组（P>0.05）。治疗后,两组NO分泌水平上调（P<0.05）,ET分泌水平降低（P<0.05）。两组治疗前后血常规、尿常规、肝肾功能等均无临床意义,小陷胸加味汤组出现1例胃痛（3.57%）,2例腹胀（7.14%）。对照组出现2例头昏、头痛（7.14%）,2例腹胀（7.14%）。3.冠心病（痰热互结证）患者外周血LncRNA TUG1与血管内皮损伤相关性研究。冠心病（痰热互结证）患者外周血中LncRNA TUG1相对表达量增加;血管内皮损伤相关指标循环内皮细胞、ET的分泌水平、NO的分泌水平与健康对照组比较,差异具有统计学意义（P<0.05）,分别为循环内皮细胞计数增加,ET分泌增加,NO分泌降低。Pearson相关分析显示:冠心病（痰热互结证）患者外周血中LncRNA TUG1与循环内皮细胞计数呈显着正相关（r=0.56,P=0.03）,与NO的分泌（r=-0.58,P=0.02）呈显着负相关,同时与ET的分泌水平呈显着正相关（r=0.62,P=0.01）。4.小陷胸加味汤调控差异表达的lnc RNA TUG1与p38MAPK信号通路保护血管内皮细胞的作用机制。时效关系研究发现小陷胸加味汤含药血清以一定的时间-剂量依赖方式改善TNF-α诱导损伤HUVEC细胞的增值能力。最终选用20%小陷胸加味汤含药血清干预TNF-α诱导损伤HUVEC细胞24小时。Real-Time PCR结果显示,LncRNA TUG1的相对表达水平在模型组的平均值为1.00,在空白血清组中的平均值为0.98,在20%小陷胸加味汤含药血清组中的平均值为0.96,小陷胸加味汤含药血清组与模型组、空白血清组比较,差异具有统计学意义（P<0.05）。Western Blot结果显示,20%小陷胸加味汤含药血清组中p38、P-p38蛋白表达量明显下调,与模型组、空白血清组比较差异均具有显着统计学意义（P<0.05）。Pearson相关分析显示LncRNA TUG1的相对表达量与p38、P-p38蛋白的表达呈显着正相关,分别为（r=0.997,P=0.048）,（r=0.990,P=0.017）。结论:1.小陷胸加味汤联合西医常规治疗能有效改善冠心病（痰热互结证）临床症状和血管内皮功能。2.冠心病（痰热互结证）患者外周血LncRNA TUG1表达具有差异性,差异表达的LncRNA TUG1与血管内皮损伤存在一定相关性。3.小陷胸加味汤含药血清能够通过调控差异表达的LncRNA TUG1进而减少p38MAPK信号通路相关蛋白的表达,减轻内皮细胞损伤。4.在审明病机的前提下,小陷胸加味汤可以从基因层面、分子生物学层面改善血管内皮功能治疗冠心病（痰热互结证）。
张雯雯[8]（2021）在《益气搜风中药对心肌缺血再灌注损伤大鼠内皮功能影响与机制的研究》文中指出目的:缺血再灌注损伤可见于心、脑、肺、肾等人体多个重要器官,探究其病理机制,最大程度降低损伤,提高临床疗效越来越成为医学界的研究热点。缺血心肌再灌注（MIRI）后无复流、慢复流致使心律失常甚至再梗死等并发症严重影响血运重建治疗的临床预后,其机制涉及冠脉微循环病变。西医治疗方案尚缺乏安全有效防治冠脉微循环障碍的药物,特别是血运重建后期治疗方面,中医药能够发挥未病先防、既病防变的特色优势,临床疗效明显,较西药治疗费用更低。目前国内关于中药单体及复方防治MIRI的研究虽有一定进展,但缺乏对多靶点作用机制的深入探究。宫丽鸿教授以“风扰心络为病”理论为基础,提出益气搜风、养血解痉、通络止痛之治法,总结自身多年临床经验结合前人古方,形成益气搜风中药组方黄芪复方,寓意补养心络亏虚之气血、搜剔内扰之毒风,以助心脉气血调和、脉道息风通络,改善心肌细胞因缺血缺氧形成的组织结构与功能损伤。此法以补为通,寓通于补,通补兼施,相辅相成,补气而不留邪,剔邪而不伤正,针对本虚标实的病理特点,可谓标本兼治。本研究通过冠脉结扎法复制建立心肌缺血再灌注损伤大鼠模型,以模型大鼠为研究对象,观察益气搜风中药黄芪复方对实验大鼠内皮功能影响与炎症反应、细胞凋亡相关因子蛋白与基因的表达,从对血管内皮功能的保护作用角度,探讨益气搜风中药对缺血再灌注损伤中微循环障碍的影响,并进一步揭示其产生作用可能相关的机制途径,丰富风扰心络为病之理论内涵,并为临床推广应用提供实验依据。材料与方法:1.心肌缺血再灌注损伤模型建立与益气搜风中药对模型大鼠内皮功能影响:将120只（240±20）g SD大鼠随机分为假手术组、模型组、培哚普利组、益气搜风中药黄芪复方低中高剂量组,共6组,每组20只。根据成人（按体重60kg计算）常用剂量与实验动物用药剂量换算公式,折算出大鼠剂量,每组给予不同预处理。假手术组、模型组大鼠均予生理盐水10 mL·kg-1灌胃;益气搜风中药低、中、高剂量组分别予含黄芪复方1.8g·kg-1、3.6 g·kg-1、7.2 g·kg-1药液灌胃;培哚普利组予以含有培哚普利浓度为0.4mg·kg-1溶液灌胃。上述操作各组日1次,持续7d。第7d灌胃完毕1h采用冠脉结扎法建立心肌缺血再灌注模型;其中假手术组术中不结扎冠脉,余操作同其它各组;分别记录结扎30 min时与再灌注120 min时大鼠ECG情况;选取Ⅱ导联为实验中主要观察目标,以ST段变化作为心肌缺血标志;以ST段显着抬高判定结扎成功,以抬高的ST段回落幅度达1/2判定再灌注造模成功。造模成功后进行取材,取材前夜（即第6d）大鼠禁食不禁水。取腹主动脉取血,静置后离心,上清液-20℃保存,用于后续实验;采血后即刻处死大鼠,无菌条件下取出心脏,经灭菌生理盐水清洗以10%甲醛固定,-20℃冻存用于后续实验。采用ELISA法检测各组血清中TXA2、PGI2、s TM、s EPCR的含量,比较各组TXA2/PGI2比值。2.益气搜风中药对心肌缺血再灌注损伤模型大鼠血管内皮炎症因子的影响:取已采集的各组大鼠血清,采用ELISA法检测各组血清中IL-8、IL-6、TNF-α含量。3.益气搜风中药对心肌缺血再灌注损伤模型大鼠血管内皮细胞凋亡的影响:取已采集的各组大鼠心脏组织,电子天平称取左心室心尖部位100mg,高通量组织研磨仪研磨组织,研磨好的心肌组织置于预先配制好的500ul裂解液,以12000 rpm速度离心10 min后取上清液,经处理后采用Western Blot法测定各组Akt、P-Akt、Bax、Bcl-2蛋白表达水平,采用蛋白质定量（BCA）法测定蛋白浓度,采用ECL化学发光检测法检测,实验结果通过成像系统显示;采用RT-PCR法测定Aktm RNA、eNOS m RNA、Baxm RNA、Bcl-2 m RNA表达水平,采用引物设计软件Primer Premier 5.0设计引物,采用2-ΔΔct法对各样品中基因的表达差异进行相对定量分析。统计学处理均采用SPSS 26.0统计软件进行数据分析,Graphpad Prism 9.0.0版统计软件绘制数据分析图,计量资料以（?）表示,组间比较采用单因素方差分析,两两比较方差齐采用LSD检验。P<0.05表示存在统计学差异,P<0.01表示差异显着,P>0.05为差异不具有统计学意义。结果:1.心肌缺血再灌注损伤模型建立与益气搜风中药对模型大鼠内皮功能影响:1.1复制大鼠心肌缺血再灌注损伤模型:模型建立过程中各组大鼠存活情况:麻醉操作后,死亡1只大鼠;气管插管与术中行结扎、再灌注等操作时,因呼吸停止、大出血和室颤共造成37只大鼠死亡,其中假手术组5只、其他造模组32只。各组存活大鼠数量满足后续实验需求。造模情况:经心电图监测观察结扎时与再灌注后大鼠Ⅱ导联心电变化,筛除未符合ST段改变标准大鼠8只,成功造模总数59只,各组造模成功大鼠数量满足指标检测需求。1.2各组大鼠血清TXA2、PGI2水平及TXA2/PGI2比值:相较假手术组,模型组TXA2水平显着升高,PGI2水平显着降低,TXA2/PGI2明显升高（P<0.01）;相较模型组,培哚普利组和益气搜风中药黄芪复方各剂量组TXA2含量均显着降低,PGI2含量显着升高,TXA2/PGI2显着下降（P<0.01）;相较于培哚普利组,益气搜风中药中剂量组TXA2、PGI2含量与TXA2/PGI2均无明显差异（P>0.05）。1.3各组大鼠血清s TM、s EPCR水平:相较于假手术组,模型组s TM、s EPCR含量显着升高（P<0.01）;相较于模型组,培哚普利组和益气搜风中药各剂量组s TM、s EPCR含量均显着降低（P<0.01）;相较于培哚普利组,中药各剂量组s TM、s EPCR含量升高（P<0.05）。2.益气搜风中药对心肌缺血再灌注损伤模型大鼠血管内皮炎症因子的影响:2.1各组大鼠血清IL-6、IL-8水平:相较假手术组,模型组IL-6、IL-8含量显着升高（P<0.01）;相较模型组,培哚普利组和中药各剂量组IL-6、IL-8含量均显着降低（P<0.01）;相较于培哚普利组,中药中剂量组IL-6、IL-8含量无明显差异（P>0.05）。2.2各组大鼠血清TNF-a水平:相较假手术组,模型组TNF-a含量显着升高（P<0.01）;相较于模型组,培哚普利组和中药各剂量组TNF-a含量均显着降低（P<0.01）;相较于培哚普利组,中剂量组TNF-a含量无明显差异（P>0.05）。3.益气搜风中药对心肌缺血再灌注损伤模型大鼠血管内皮细胞凋亡的影响:3.1各组大鼠Akt、eNOS m RNA的表达:相较假手术组,模型组Akt m RNA、eNOS m RNA表达显着降低（P<0.01）;相较模型组,培哚普利组与益气搜风中药各剂量组Akt mRNA、eNOS m RNA表达均增加（P<0.05）;相较于培哚普利组,益气搜风中药中剂量组Akt mRNA、eNOS mRNA表达无明显差异（P>0.05）。3.2各组大鼠Akt、P-Akt蛋白表达与P-Akt/Akt 比值:相较假手术组,模型组Akt、P-Akt蛋白表达显着降低（P<0.01）;相较模型组,培哚普利组、益气搜风中药各剂量组Akt、P-Akt蛋白表达显着增加（P<0.01）;相较于培哚普利组,益气搜风中药中剂量组Akt蛋白表达、P-Akt/Akt 比值无明显差异（P>0.05）,高剂量组P-Akt蛋白表达无明显差异（P>0.05）。3.3各组大鼠Bcl-2、Bax mRNA的表达:相较假手术组,模型组Bcl-2 mRNA、Bax mRNA表达均升高（P<0.05）;相较模型组,培哚普利组与益气搜风中药各组Bcl-2mRNA表达均升高,Bax mRNA表达降低（P<0.05）;与培哚普利组相比,益气搜风中药中剂量组Bcl-2 mRNA、Bax mRNA表达无明显差异（P>0.05）。3.4各组大鼠Bcl-2、Bax蛋白表达与Bcl-2/Bax比值:相较假手术组,模型组Bcl-2、Bax蛋白表达均显着升高,Bcl-2/Bax比值显着降低（P<0.01）;相较模型组,培哚普利组、益气搜风中药中剂量组Bcl-2蛋白表达与Bcl-2/Bax比值均显着升高,Bax蛋白表达显着降低（P<0.01）;相较于培哚普利组,益气搜风中药中剂量组Bcl-2蛋白表达无明显差异（P>0.05）。结论:1.益气搜风中药黄芪复方能够调控血管内皮功能损伤因子的表达,提示益气搜风中药复方对MIRI大鼠血管内皮功能可能具有保护作用。2.益气搜风中药复方能够下调大鼠IL-8、IL-6、TNF-α等炎症因子的表达,提示益气搜风中药复方对MIRI大鼠心肌的保护作用可能与抑制炎性反应有关。3.益气搜风中药复方能够上调PI3K/Akt信号通路中关键靶蛋白Akt及其下游eNOS mRNA表达水平;干预Akt及P-Akt蛋白表达水平,调控P-Akt/Akt平衡;同时调控凋亡因子Bcl-2、Bax基因与蛋白的表达。提示益气搜风中药复方改善MIRI血管内皮功能的机制可能与激活PI3K/Akt信号通路活性从而调控细胞凋亡有关。
罗义[9]（2021）在《miR-140-5p靶向调节ROBO4基因表达在血管平滑肌细胞中的作用机制研究》文中研究说明背景:MicroRNAs已被证实为动脉粥样硬化发展的重要调节因子。虽然以前的研究表明miR-140-5p在血管生成过程和胶质瘤细胞的增殖和侵袭中发挥了致病作用,但是miR-140-5p在动脉粥样硬化发生发展中的作用却知之甚少。目的:本研究旨在探讨miR-140-5p在动脉粥样硬化发展中的作用及其分子生物调节机制。方法:采用qRT-PCR方法检测动脉粥样硬化斑块组织及非血管疾病患者血管组织中miR-140-5p和ROBO4 mRNA的表达,同时采用western blotting方法检测动脉粥样硬化斑块组织中ROBO4蛋白质水平,评估miR-140-5p及ROBO4在两者中的表达差异。在体外实验中,平滑肌细胞经ox-LDL处理后,并分别将miR-140-5p inhibitor、ROBO4过表达载体转染细胞,随后应用CCK8方法、Transwell小室实验、流式细胞术对血管平滑肌细胞增殖、迁移侵袭能力及凋亡水平进行检测。采用双荧光素酶报告基因检测方法,检测了miR-140-5p与ROBO4之间的相互作用。最后,涉及挽救实验,对细胞增殖、凋亡及迁移侵袭能力进行检测,评估miR-140-5p/ROBO4对平滑肌细胞表型的改变。实验中,对NLRP3炎性小体进行检测;并对平滑肌细胞中NLRP3表达进行干预,评估miR-140-5p/ROBO4与NLRP3的调控关系。结果:miR-140-5p在动脉粥样硬化患者的动脉斑块组织中为高表达;而ROBO4蛋白的表达水平与miR-140-5p的表达趋势呈相反趋势。Ox-LDL作用可促进人血管平滑肌细胞miR-140-5p的表达,抑制ROBO4的表达,促进平滑肌细胞增殖、迁移、侵袭和抑制细胞凋亡。进一步的结果显示,miR-140-5p inhibitor对Ox-LDL的血管平滑肌细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡调控作用具有逆转作用。而ROBO4在平滑肌细胞的作用与miR-140-5p inhibitor作用相同。双荧光素酶结果显示,miR-140-5p可与ROBO4基因的3’-UTR序列结合。最后,挽救实验结果显示,ROBO4 siRNA和NLRP3过表达均可阻断miR-140-5p inhibitor对ox-LDL处理后的人血管平滑肌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的调控作用。结论:miR-140-5p通过靶向调节ROBO4基因表达促进血管平滑肌细胞增殖、迁移和侵袭,抑制血管平滑肌细胞凋亡,并促进平滑肌细胞因ox-LDL诱发的NLRP3炎性小体机制,从而促进动脉粥样硬化的发展,为动脉粥样硬化的防治提供了新的思路。
李小雪[10]（2020）在《阿卡波糖通过抑制NLRP3炎性小体改善糖尿病大鼠血管内皮功能损伤》文中认为背景心血管疾病（Cardiovascular diseases,CVD）是主要的非传染性致死疾病,糖尿病患者心血管疾病风险增加,并且较非糖尿病患者发病时间提前14.6年,而2型糖尿病（T2DM）的患病率正在逐年提高,成为威胁人类健康的主要疾病之一。动脉粥样硬化性心血管疾病（ASCVD）是T2DM患者致死和致残的主要原因,其中包括冠心病、缺血性卒中及外周动脉疾病。加强T2DM患者的综合管理能够最大限度降低心血管事件和死亡风险,改善预后,提高患者生活质量。此外,针对T2DM合并ASCVD患者使用具有明确心血管获益的降糖药干预也具有至关重要的作用[1]。阿卡波糖（Acarbose）是一种α-葡萄糖苷酶抑制剂,作为临床常见降糖药用于控制餐后血糖。研究发现阿卡波糖可不通过降低血糖的方式靶向Ras信号途径抑制血管平滑肌细胞的迁移和增殖,从而减少ASCVD相关危险事件的发生[2]。此外,阿卡波糖可通过调节血清游离脂肪酸和胰岛素样生长因子-1的水平间接改善糖耐量减低时的大血管病变[3]。其对T2DM小鼠创面愈合和血管生成有促进作用,并对内皮祖细胞功能有一定改善作用[4]。这些体内外实验均提示阿卡波糖具有独立于降糖功能的直接血管保护作用。目前有关临床研究观察阿卡波糖的心血管保护作用尚存在争议。因此,本课题旨在研究阿卡波糖对血管内皮细胞功能的影响,并进一步探讨其中潜在的作用机制。炎症可导致血管内皮功能障碍和动脉粥样硬化的形成和发展[5],NLRP3炎性小体是近年来炎症研究中的新发现。NLRP3炎性小体作为一种蛋白质复合物,由三种蛋白寡聚化形成,它们分别是Nod样受体蛋白（NLRP3）和凋亡相关斑点样蛋白（ASC）以及半胱天冬氨酸酶（Caspase-1）[6]。在无激活物质存在时,NLRP3的LRR结构域与NOD结构域结合,抑制自身的寡聚化而处于无活性状态[7]。活性氧（ROS）被认为是由ATP和颗粒物质触发NLRP3炎性小体激活的上游共同细胞信号,NLRP3炎性小体的激活能被ROS清除剂和NADPH oxidase抑制剂阻断[8]。活化的Caspase-1参与IL-1β的加工和成熟[6,9,10],IL-1β作为一种炎症介质,能够作用于血管内皮细胞,降低血管内皮细胞间紧密连接和黏附连接的粘附强度,促进了细胞收缩和血管内皮细胞间裂隙的形成,导致血管通透性增加[11,12]。已有既往研究发现,阿卡波糖能降低T2DM患者外周血单核细胞转录因子核因子κB（NF-κB）的活性[13]。另外,阿卡波糖还可通过AMPK-NO-RAS信号通路抑制高胆固醇导致的血管炎症[14]。同时,本课题前期实验结果提示阿卡波糖能抑制高糖导致的NLRP3炎性小体形成和激活,其中,Western blot及ELISA结果显示阿卡波糖能显着抑制高糖导致NLRP3蛋白表达增多、IL-1β活性增高,然而,阿卡波糖能否通过抑制NLRP3炎性小体的形成来改善糖尿病导致的血管内皮功能障碍仍需进一步明确。因此,我们假设NLRP3炎性小体的激活能够破坏血管内皮细胞通透性,而阿卡波糖通过抑制NLRP3炎性小体降低血管内皮细胞高通透性,从而改善糖尿病血管功能;而阿卡波糖抑制NLRP3炎性小体的机制与抑制NADPH oxidase依赖的活性氧产生有关。本研究为临床上选择具有明确心血管获益证据的降糖药物提供实验理论依据,同时也为糖尿病心血管并发症的防治提供新的药物靶点。目的由于2型糖尿病（T2DM）常合并心血管事件,寻找具有明确心血管获益的降糖药就显得尤为重要。阿卡波糖是一种抑制餐后高血糖的α-葡萄糖苷酶抑制剂,目前研究结果显示其具有潜在的抗炎作用,通过这种作用能否对心血管起保护作用仍存在争议。NLRP3炎性小体激活介导的血管内皮细胞间紧密连接断裂,是导致糖尿病内皮屏障功能障碍的标志性事件。本研究拟探究阿卡波糖通过抑制T2DM血管内皮细胞NLRP3炎性小体激活,对血管内皮屏障功能障碍的保护作用及具体机制。研究方法1.用高糖（HG,30m M）体外分别培养大鼠主动脉内皮细胞（RAECs）24、48、72h,同时,选用不同浓度（1、3、9μM）阿卡波糖分别处理正常培养的RAECs,采用MTT法检测不同时间高糖和不同浓度阿卡波糖对细胞增殖及生存率的影响;用ELISA法筛选出高糖和阿卡波糖处理细胞的最适作用时间与浓度;通过Western blot、ELISA、共聚焦荧光显微镜观察高糖及阿卡波糖对细胞NLRP3炎性小体激活的影响。2.采用高糖、阿卡波糖、NADPH氧化酶抑制剂apocynin（Apo 10μM）、Nox4 si RNA处理RAECs,通过荧光探针DHE荧光光谱法检测细胞内超氧阴离子生成;Western blot分别检测Nox1、Nox2以及Nox4的蛋白表达水平;Nox4 si RNA转染RAECs后,应用RT-PCR技术检测其中可能参与作用的Nox4 m RNA水平。3.采用高糖、Nox4 si RNA处理RAECs,运用Western Blot分析细胞裂解液中NLRP3和p20/pro-Caspase-1的蛋白表达,ELISA试剂盒检测细胞培养上清液中Caspase-1活性和IL-1β的产生,共聚焦荧光显微镜观察胞质区NLRP3和ASC的共定位。4.采用高糖、阿卡波糖、NLRP3 si RNA、NLRP3炎性小体特异性抑制剂（MCC950）10μM处理RAECs,通过Western Blot分析其中紧密连接蛋白ZO-1和粘附连接蛋白VE-Cadherin的表达;流式细胞术检测细胞膜ZO-1蛋白表达水平;运用Transwell小室法检测单层内皮FITC葡聚糖漏出的荧光强度。5.建立T2DM大鼠模型,采用阿卡波糖（30mg/kg/d,i.g）、MCC950（3mg/kg/d,i.p）干预5周后,检测大鼠血清中FBG、HOMA-IR及OGTT血糖值;ELISA法测定大鼠血清中丙二醛（MDA）和IL-1β的含量;采用静脉注射伊文思蓝染料法,定量观察伊文思蓝染料从血浆中向间质渗漏的情况;分离大鼠完整的胸主动脉,血管张力实验分别检测Ach(1×10-9-10-5M)和SNP(1×10-9-10-5M)对血管的舒张反应;同时,体外用葡萄糖（50m M,3.5h）孵育大鼠胸主动脉,应用新型特异性Nox4抑制剂GKT137831处理大鼠主动脉环,检测Ach(1×10-9-10-5M)和SNP(1×10-9-10-5M)对血管的舒张反应;应用免疫组织化学法检测血管ZO-1和VE-Cadherin的荧光表达;使用激光共聚焦显微镜观察大鼠主动脉内皮Nox4/v WF、NLRP3/ASC、NLRP3/v WF、Caspase-1/v WF的荧光共定位。研究结果1.MTT实验结果显示,相比于正常对照组,高糖24、48h,阿卡波糖1、3μM处理RAECs对细胞增殖及生存率的影响无统计学差异（P>0.05）;ELISA结果提示,相较于正常组,高糖处理RAECs 24h显着增加IL-1β的产生（P<0.05）,且高于48h刺激结果,3μM阿卡波糖干预高糖处理的RAECs后,与高糖组相比能明显降低IL-1β的产生（P<0.05）;选用阿卡波糖3μM和高糖处理24h进行后续的实验,Western blot、ELISA、共聚焦荧光显微镜检测结果提示高糖组相比于正常组明显促进NLRP3、p20的蛋白表达（P<0.05）,增加Caspase-1的活性和IL-1β的产生（P<0.05）,明显提高NLRP3/ASC的荧光共聚焦效率（P<0.05）,而相对于高糖组,阿卡波糖干预组能显着逆转以上高糖刺激的影响（P<0.05）。2.DHE荧光光谱法检测结果显示,高糖组相比于正常对照组红色荧光光密度值明显增高,阿卡波糖干预组显着降低了高糖对荧光强度的影响（P<0.05）,此作用与Apo干预效果一致;Western blot及RT-PCR实验结果提示,与正常对照组相比,高糖组显着增加Nox4蛋白和m RNA水平（P<0.05）,相对于高糖组,阿卡波糖干预组明显降低Nox4表达（P<0.05）,而针对Nox1和Nox2蛋白表达并没有显着的抑制作用（P>0.05）。Nox4 si RNA转染RAECs后,RT-PCR结果提示其转染效率相比于正常对照组有统计学意义（P<0.05）;DHE荧光法结果显示Nox4 si RNA转染能明显降低高糖所致的红色荧光光密度值增高（P<0.05）。3.Western Blot结果显示,Nox4 si RNA转染能明显抑制高糖导致的NLRP3和p20蛋白表达增加（P<0.05）;相对于高糖组,ELISA结果提示Nox4 si RNA组显着降低Caspase-1的活性和IL-1β的产生,共聚焦荧光显示Nox4 si RNA转染明显降低NLRP3/ASC的荧光共聚焦效率（P<0.05）。4.Western Blot结果显示,与正常对照组相比,高糖显着降低细胞ZO-1和VE-Cadherin的蛋白表达水平,而阿卡波糖、MCC950或NLRP3 si RNA可明显逆转高糖的此种作用（P<0.05）;流式细胞术结果提示阿卡波糖显着改善高糖导致的细胞膜ZO-1蛋白降低（P<0.05）;Transwell小室法检测结果提示高糖显着增加了内皮细胞单层的相对通透性,阿卡波糖、MCC950或NLRP3 si RNA明显降低高糖所致的通透性（P<0.05）。5.体内实验中,相比于T2DM大鼠,阿卡波糖干预5周后,FBG、HOMA-IR及OGTT血糖值均明显下降（P<0.05）;ELISA结果显示阿卡波糖和MCC950处理可显着减轻T2DM大鼠体内MDA和IL-1β的升高（P<0.05）;定量观察伊文思蓝染料渗漏结果提示,阿卡波糖和MCC950能显着降低T2DM大鼠模型组的染料渗漏吸光值（P<0.05）;血管张力实验显示,与正常对照组相比,Ach针对T2DM大鼠内皮依赖性血管舒张反应明显受损,阿卡波糖和MCC950治疗5周后能显着改善这种现象（P<0.05）,SNP导致的血管舒张反应在各组间无明显差异（P>0.05）;体外实验GKT137831处理能有效改善高糖环境下大鼠主动脉针对Ach的血管舒张功能（P<0.05）,SNP导致的血管舒张反应在各组间无明显差异（P>0.05）。T2DM大鼠主动脉内皮Nox4/v WF、NLRP3/ASC、NLRP3/v WF、Caspase-1/v WF的荧光共定位效率明显增加,阿卡波糖能显着抑制这种变化（P<0.05）。结论1.阿卡波糖抑制高糖诱导的大鼠主动脉内皮细胞NLRP3炎性小体活化。2.阿卡波糖通过降低Nox4依赖性活性氧抑制NLRP3炎性小体激活。3.阿卡波糖通过抑制Nox4/NLRP3炎性小体通路逆转高糖导致的大鼠主动脉内皮细胞屏障功能障碍。4.阿卡波糖通过抑制NLRP3炎性小体改善T2DM大鼠血管通透性,增强内皮依赖性血管舒张功能。
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本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 肥胖 |
| 1.1.1 肥胖症概述 |
| 1.1.2 肥胖与炎症 |
| 1.1.3 肥胖与氧化应激 |
| 1.2 瞬时感受器电位离子通道香草素受体4 |
| 1.2.1 TRPV4通道概述 |
| 1.2.2 TRPV4与炎症 |
| 1.2.3 TRPV4与氧化应激 |
| 1.3 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶(Nox) |
| 1.3.1 gp91 phox(Nox2)概述 |
| 1.3.2 Nox2与炎症 |
| 1.3.3 Nox2与氧化应激 |
| 1.3.4 Nox2相关抑制剂概述 |
| 1.4 血管内皮细胞功能 |
| 1.4.1 血管内皮细胞概述 |
| 1.4.2 血管内皮细胞功能障碍 |
| 1.5 本论文的主要研究内容 |
| 1.5.1 研究背景及立题依据 |
| 1.5.2 研究内容 |
| 第二章 肥胖对炎症、氧化应激、内皮细胞及血管功能的影响 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 动物 |
| 2.2.2 实验试剂和仪器 |
| 2.2.3 试剂和溶液的配制 |
| 2.2.4 饮食诱导的肥胖模型小鼠造模 |
| 2.2.5 胸主动脉原代内皮细胞的分离与培养 |
| 2.2.6 实时荧光定量PCR (RT-PCR)分析 |
| 2.2.7 细胞水平ROS检测 |
| 2.2.8 组织水平ROS检测 |
| 2.2.9 细胞骨架结构F-atcin示踪 |
| 2.2.10 血管通透性检测 |
| 2.2.11 肠系膜动脉血管张力评估 |
| 2.2.12 统计分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 饮食诱导的肥胖小鼠模型构建 |
| 2.3.2 内皮细胞鉴定 |
| 2.3.3 肥胖增加胸主动脉及肠系膜动脉内皮细胞及血管组织中ROS产生 |
| 2.3.4 肥胖增加胸主动脉及肠系膜动脉内皮细胞中炎症因子的产生 |
| 2.3.5 肥胖增加胸主动脉内皮细胞及血管通透性 |
| 2.3.6 肥胖引发小鼠肠系膜动脉血管舒张功能障碍 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 肥胖症中炎症与ROS产生增加,血管通透增加,血管舒张功能障碍的发生机制研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 动物 |
| 3.2.2 实验试剂和仪器 |
| 3.2.3 试剂和溶液的配制 |
| 3.2.4 实时荧光定量PCR (RT-PCR)分析 |
| 3.2.5 细胞水平ROS检测 |
| 3.2.6 组织水平ROS检测 |
| 3.2.7 血管通透性检测 |
| 3.2.8 免疫荧光共振能量转移 |
| 3.2.9 免疫共沉淀 |
| 3.2.10 细胞骨架结构F-atcin示踪 |
| 3.2.11 GST拉下实验分析 |
| 3.2.12 Western Blot分析 |
| 3.2.13 统计分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 TRPV4和Nox2参与调节肥胖小鼠内皮细胞及血管组织中的ROS产生 |
| 3.3.2 TRPV4和Nox2参与调节肥胖小鼠内皮细胞中炎症因子的产生 |
| 3.3.3 TRPV4和Nox2参与调控肥胖症中血管通透性增加 |
| 3.3.4 肥胖增强TRPV4-Nox2复合体物理相互作用强度 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 减弱TRPV4-Nox2耦联对肥胖症中病理问题的作用分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 细胞株 |
| 4.2.2 实验试剂和仪器 |
| 4.2.3 试剂和溶液的配制 |
| 4.2.4 缺失突变 |
| 4.2.5 免疫荧光共振能量转移 |
| 4.2.6 免疫荧光 |
| 4.2.7 实时荧光定量PCR (RT-PCR)分析 |
| 4.2.8 细胞水平ROS检测 |
| 4.2.9 细胞骨架结构F-atcin示踪 |
| 4.2.10 血管通透性检测 |
| 4.2.11 Wire myograph血管张力检测 |
| 4.2.12 GST拉下实验分析 |
| 4.2.13 统计分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 TRPV4-Nox2复合体耦联位点寻找 |
| 4.3.2 调控TRPV4-Nox2复合体耦联强度的腺相关病毒构建 |
| 4.3.3 Nox2-Δ4的表达及功能正常 |
| 4.3.4 减弱TRPV4-Nox2耦联强度可帮助改善肥胖引发的ROS稳态失衡 |
| 4.3.5 减弱TRPV4-Nox2耦联强度可帮助改善肥胖引发的炎症因子产生增加 |
| 4.3.6 减弱TRPV4-Nox2耦联强度可帮助改善肥胖引发的内皮及血管通透性增加 |
| 4.3.7 减弱TRPV4-Nox2耦联强度可帮助改善肥胖引发的血管舒张功能障碍 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 减弱TRPV4-Nox2复合体耦联强度的药物寻找 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 动物 |
| 5.2.2 实验试剂和仪器 |
| 5.2.3 试剂和溶液的配制 |
| 5.2.4 免疫荧光共振能量转移 |
| 5.2.5 细胞存活检测(MTT 比色法) |
| 5.2.6 实时荧光定量PCR (RT-PCR)分析 |
| 5.2.7 细胞水平ROS检测 |
| 5.2.8 细胞骨架结构F-atcin示踪 |
| 5.2.9 FITC-葡聚糖通透实验 |
| 5.2.10 Wire myograph血管张力检测 |
| 5.2.11 分子对接 |
| 5.2.12 统计分析 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 寻找靶向TRPV4-Nox2复合物的小分子化合物 |
| 5.3.2 M12最适浓度选择 |
| 5.3.3 M12对TRPV4和Nox2表达及功能的影响 |
| 5.3.4 M12减少肥胖小鼠内皮细胞中的ROS产生 |
| 5.3.5 M12减少肥胖小鼠内皮细胞中的炎症因子产生 |
| 5.3.6 M12降低肥胖小鼠主动脉内皮细胞通透性 |
| 5.3.7 M12增强肥胖小鼠肠系膜二级动脉血管舒张功能 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 论文主要创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录: 作者在攻读博士学位期间发表的论文 |
| 1 Occludin的生物学信息 |
| 1.1 Occludin的结构 |
| 1.2 Occludin的组织分布和表达调控 |
| 2 Occludin发挥血管内皮保护作用的信号通路 |
| 2.1 Occludin与m TOR通路 |
| 2.2 Occludin与VEGF通路 |
| 2.3 Occludin与PKC通路 |
| 2.4 Occludin与PKA通路 |
| 2.5 Occludin与AMP激活的蛋白激酶(AMP activated protein kinase,AMPK)通路 |
| 2.6 Occludin与MAPKs通路 |
| 3 Occludin与血管内皮损伤相关疾病的关系 |
| 3.1 Occludin与动脉血管疾病 |
| 3.1.1 Occludin与脑血管损伤相关疾病 |
| 3.1.2 Occludin与冠状动脉血管损伤疾病 |
| 3.1.3 Occludin与肺血管损伤疾病 |
| 3.1.4 Occludin与肾血管损伤疾病 |
| 3.1.5 Occludin与其他动脉血管疾病 |
| 3.2 Occludin与静脉血管疾病 |
| 4 挑战与展望 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词及中英文对照 |
| 1 绪论 |
| 1.1 氧化应激 |
| 1.1.1 氧化应激的产生 |
| 1.1.2 氧化应激与健康 |
| 1.2 生物活性肽与抗氧化 |
| 1.2.1 植物源活性肽 |
| 1.2.2 动物活性肽 |
| 1.3 高糖饮食与糖尿病 |
| 1.3.1 高糖饮食 |
| 1.3.2 糖尿病 |
| 1.3.3 糖尿病与氧化应激 |
| 1.3.4 糖尿病与动脉粥样硬化 |
| 1.4 氧化应激细胞研究模型的构建 |
| 1.4.1 氧化模型种类 |
| 1.4.2 高糖氧化损伤模型研究进展与构建意义 |
| 1.5 本课题研究内容及意义 |
| 1.5.1 研究目的和意义 |
| 1.5.2 研究内容 |
| 2 大米活性肽对高糖诱导的血管内皮细胞形态和增殖能力的影响 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与设备 |
| 2.2.1 试验材料 |
| 2.2.2 试验试剂 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.3.1 主要试剂配制 |
| 2.3.2 HUVEC细胞培养 |
| 2.3.3 HUVEC细胞鉴定 |
| 2.3.4 高糖氧化损伤模型的构建 |
| 2.3.5 大米活性肽对HUVEC细胞活力的影响 |
| 2.3.6 大米活性肽保护浓度测定 |
| 2.3.7 H&E染色 |
| 2.3.8 Hoechst染色 |
| 2.3.9 流式细胞仪检测细胞凋亡 |
| 2.3.10 流式细胞仪检测细胞周期 |
| 2.3.11 数据处理分析 |
| 2.4 结果分析 |
| 2.4.1 HUVEC细胞的鉴定 |
| 2.4.2 HG对内皮细胞生存活力的影响 |
| 2.4.3 不同浓度RBAP对内皮细胞生存活力的影响 |
| 2.4.4 不同浓度RBAP对氧化损伤内皮细胞生存活力的影响 |
| 2.4.5 RBAP对氧化损伤内皮细胞生长形态的影响 |
| 2.4.6 RBAP对氧化损伤内皮细胞凋亡形态的影响 |
| 2.4.7 RBAP对氧化损伤内皮细胞凋亡程度的影响 |
| 2.4.8 RBAP对氧化损伤内皮细胞周期的影响 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 本章小结 |
| 3 大米活性肽对高糖损伤的内皮细胞抗氧化能力的影响 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与设备 |
| 3.2.1 试验材料 |
| 3.2.2 试验试剂 |
| 3.2.3 试验仪器 |
| 3.3 试验方法 |
| 3.3.1 主要试剂配制 |
| 3.3.2 ROS测定 |
| 3.3.3 MDA水平测定 |
| 3.3.4 SOD酶活力测定 |
| 3.3.5 GSH测定 |
| 3.3.6 T-AOC测定 |
| 3.3.7 线粒体膜电位检测 |
| 3.3.8 成管能力检测 |
| 3.3.9 HUVEC细胞膜通透性检测 |
| 3.3.10 数据处理分析 |
| 3.4 结果分析 |
| 3.4.1 RBAP对氧化损伤内皮细胞ROS水平的影响 |
| 3.4.2 RBAP对氧化损伤内皮细胞MDA水平的影响 |
| 3.4.3 RBAP对氧化损伤内皮细胞SOD水平的影响 |
| 3.4.4 RBAP对氧化损伤内皮细胞GSH水平的影响 |
| 3.4.5 RBAP对氧化损伤内皮细胞T-AOC水平的影响 |
| 3.4.6 RBAP对氧化损伤内皮细胞线粒体膜电位的影响 |
| 3.4.7 RBAP对氧化损伤内皮细胞成管能力的影响 |
| 3.4.8 RBAP对氧化损伤内皮细胞膜通透性的影响 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 4 大米活性肽对高糖引起的内皮细胞氧化应激的保护作用机理 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与设备 |
| 4.2.1 试验试剂 |
| 4.2.2 试验仪器 |
| 4.2.3 数据库及计算机语言的使用 |
| 4.3 试验方法 |
| 4.3.1 主要试剂配制 |
| 4.3.2 细胞蛋白提取 |
| 4.3.3 Western Blot试验 |
| 4.3.4 生物信息学分析 |
| 4.3.5 数据处理分析 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 大米活性肽对高糖氧化产物受体RAGE的影响 |
| 4.4.2 大米活性肽对氧化应激相关蛋白的影响 |
| 4.4.3 大米活性肽对NF-κB活化状态的影响 |
| 4.4.4 动脉粥样硬化相关通路的生物信息学分析及相关因子的验证 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 本章小结 |
| 5 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 6 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 攻读硕士学位期间的主要学术成果 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 高脂血症 |
| 1.1.1 高脂血症分类 |
| 1.1.2 高脂血症同游离脂肪酸的关联 |
| 1.1.3 高脂血症的预防和治疗 |
| 1.2 血管内皮细胞研究进展 |
| 1.2.1 血管内皮细胞 |
| 1.2.2 血脂异常对内皮功能的影响 |
| 1.2.3 内皮功能障碍所参与的心血管疾病 |
| 1.3 MKP家族的相关研究进展 |
| 1.3.1 MAPK通路的研究进展 |
| 1.3.2 MKPs家族蛋白研究进展 |
| 1.3.3 MKP5 研究进展 |
| 第2章 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验细胞 |
| 2.1.2 主要试剂及材料 |
| 2.1.3 主要仪器与实验耗材 |
| 2.1.4 主要试剂配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 构建MKP5 稳定过表达HUVEC细胞系 |
| 2.2.3 干扰MKP5 表达慢病毒的包装 |
| 2.2.4 细胞增殖实验 |
| 2.2.5 实时荧光定量PCR实验 |
| 2.2.6 蛋白质免疫印迹实验 |
| 2.2.7 细胞中ROS水平的检测 |
| 2.2.8 硝酸还原法检测细胞中NO水平 |
| 2.2.9 TBA法检测细胞中MDA水平 |
| 2.2.10 细胞中SOD水平的检测 |
| 2.2.11 钼酸铵法检测细胞中CAT水平 |
| 2.2.12 ABTS法检测细胞中T-AOC水平 |
| 2.2.13 细胞中GSH水平的检测 |
| 2.3 统计学分析 |
| 第3章 结果与分析 |
| 3.1 PA诱导HUVEC细胞发生凋亡 |
| 3.1.1 PA抑制HUVEC细胞增殖 |
| 3.1.2 PA抑制HUVEC细胞中MKP5 蛋白表达 |
| 3.1.3 PA诱导线粒体凋亡途径中相关蛋白表达 |
| 3.1.4 PA刺激HUVEC细胞引发内质网应激反应 |
| 3.2 MKP5 过表达抑制PA诱导的HUVEC细胞凋亡 |
| 3.2.1 HUVEC-MKP5 稳定过表达细胞系的鉴定 |
| 3.2.2 MKP5 过表达缓解PA处理所致的细胞增殖活力下降 |
| 3.2.3 MKP5 过表达抑制PA诱导的HUVEC细胞线粒体凋亡 |
| 3.2.4 MKP5 过表达抑制PA诱导的内质网应激 |
| 3.3 MKP5 过表达抑制PA诱导的氧化应激 |
| 3.3.1 MKP5 过表达缓解PA诱导的ROS生成 |
| 3.3.2 MKP5 缓解PA所致的NO水平下降 |
| 3.3.3 MKP5 高表达下调HUVEC中 MDA水平 |
| 3.3.4 MKP5 过表达上调HUVEC细胞中抗氧化能力 |
| 3.3.5 MKP5 下调PA诱导的氧化应激相关因子的表达 |
| 3.4 MKP5 过表达抑制PA诱导的炎性因子分泌 |
| 3.5 抑制MKP5 表达加剧PA诱导的细胞凋亡 |
| 3.5.1 干扰MKP5 表达慢病毒鉴定 |
| 3.5.2 MKP5 干扰加剧PA诱导的线粒体凋亡 |
| 3.5.3 MKP5 干扰加剧PA诱导的内质网应激 |
| 3.5.4 MKP5 沉默加剧PA诱导的ROS生成 |
| 3.5.5 MKP5 沉默增强PA诱导的氧化应激相关因子的表达 |
| 3.5.6 MKP5 干扰加剧PA诱导的炎性因子分泌 |
| 3.6 MKP5 调节PA诱导的MAPK通路信号转导 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 结论和创新点 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 论文一 基于网络药理学探讨黄芪复方治疗冠心病的机制研究 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 论文二 黄芪复方中药对Hcy诱导RCMECs损伤的干预作用及炎症反应的研究 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 冠脉微循环障碍中西医研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 在学期间科研成绩 |
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一部分 CKD患者血清瘦素水平与ED的关系 |
| 背景介绍 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 瘦素促进ED的分子机制研究 |
| 背景介绍 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 本研究的创新性与不足 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 慢性肾脏病内皮功能障碍的研宄现状：从基础到临床 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的文章 |
| 外文论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 理论研究 |
| 第一章 冠心病中医病名溯源 |
| 第二章 冠心病中医发病机理 |
| 1.因虚致病 |
| 2.因实致病 |
| 3.虚实夹杂 |
| 第三章 冠心病中医治疗 |
| 1.中医辨证论治 |
| 2.中成药 |
| 3.静脉注射中药 |
| 4.中医外治法 |
| 第四章 小陷胸汤治疗冠心病的历史渊源及以小陷胸汤为基础方治疗冠心病的现代研究 |
| 1.《伤寒论》对小陷胸汤的认识 |
| 2.以小陷胸汤为基础方治疗冠心病的现代研究 |
| 第五章 现代医学对冠心病的认识 |
| 1.现代医学对冠心病的发病机制认识 |
| 2.冠心病疾病的诊断与分类 |
| 3.现代医学对冠心病的治疗 |
| 4.冠心病的预防 |
| 第六章 血管内皮功能障碍与冠心病发病的研究 |
| 1.血管内皮功能障碍参与冠状动脉粥样硬化的形成 |
| 2.血管内皮功能障碍加速冠状动脉粥样硬化的进程 |
| 3.保护血管内皮细胞,改善内皮细胞功能是防治冠心病的重要途径 |
| 第七章 血管内皮功能障碍与p38MAPK信号通路的初探 |
| 1.p38MAPK信号通路的介绍 |
| 2.p38MAPK信号通路与血管内皮功能障碍初探 |
| 第八章 LncRNA TUG1 与冠心病发病的研究 |
| 1.LncRNA TUG1 与血管内皮细胞 |
| 2.LncRNA TUG1 与血管平滑肌细胞 |
| 3.LncRNA TUG1 与免疫炎症 |
| 参考文献 |
| 第二部分 临床研究 |
| 临床研究一 小陷胸加味汤治疗冠心病(痰热互结证)的临床观察及血管内皮功能的影响 |
| 1.资料与方法 |
| 2.试验结果 |
| 3.讨论 |
| 4.结论 |
| 参考文献 |
| 临床研究二 冠心病(痰热互结证)患者外周血 LncRNA TUG1与血管内皮损伤相关性研究 |
| 1.资料与方法 |
| 2.试验结果 |
| 3.讨论 |
| 4.结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 实验研究 |
| 1.主要仪器 |
| 2.实验动物、细胞、主要试剂、试剂盒及引物设计 |
| 实验一 含药血清制备、细胞模型建立及小陷胸加味汤含药血清浓度和干预时间选择 |
| 1.含药血清的制备 |
| 2.细胞模型制备 |
| 3.小陷胸加味汤含药血清浓度和干预时间选择 |
| 4.实验分组及干预方法 |
| 实验二 RT-PCR法检测小陷胸加味汤含药血清对TNF-α诱导损伤HUVEC中 LncRNA TUG1 的影响 |
| 1.实验方法 |
| 2.统计分析 |
| 3.实验结果 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 参考文献 |
| 实验三 Western Blot检测小陷胸加味汤含药血清对TNF-α诱导损伤HUVEC中 p38MAPK信号通路相关蛋白的影响 |
| 1.实验方法 |
| 2.统计分析 |
| 3.实验结果 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 参考文献 |
| 实验四 差异表达的LncRNA TUG1与p38MAPK信号通路相关蛋白表达相关性分析 |
| 1.统计方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.结论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 综合讨论 |
| 1.本研究以小陷胸汤为基础方加味治疗冠心病(痰热互结证)的立方依据 |
| 2.对本研究细胞模型及观察指标的讨论 |
| 3.本研究结果初探 |
| 4.本研究创新性分析 |
| 5.对本研究的总体思考与展望 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 附录 |
| 附录一 |
| 综述一 中医药改善血管内皮功能治疗冠心病的研究进展 |
| 1.中药或中药提取物 |
| 2.中药复方 |
| 3.中成药 |
| 4.结语和展望 |
| 参考文献 |
| 综述二 长链非编码RNA与冠心病的研究进展 |
| 1.LncRNA的概述 |
| 2.LncRNA的生物功能 |
| 3.LncRNA在冠心病发病中的作用 |
| 4.结语和展望 |
| 参考文献 |
| 附录二 附图 |
| 附录三 博士期间发表论文情况 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 论文一 心肌缺血再灌注损伤模型建立与益气搜风中药对模型大鼠内皮功能影响 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 论文二 益气搜风中药对心肌缺血再灌注损伤模型大鼠血管内皮炎症因子的影响 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 论文三 益气搜风中药对心肌缺血再灌注损伤模型大鼠血管内皮细胞凋亡的影响 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述一 现代医学对心肌缺血再灌注损伤认识与研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 中医学对心肌缺血再灌注损伤的认识与研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 在学期间科研成绩 |
| 致谢 |
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 miR-140-5p在血管平滑肌细胞中的表达及作用 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 miR-140-5p靶向调节ROBO4 基因表达对血管平滑肌细胞的调节 |
| 前言 |
| 1 实验材料与设备 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 小结 |
| 第三部分 miR-140/ROBO4 通过NLRP3 炎性小体调控血管平滑肌细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 文献综述:miRNA在心血管疾病中的作用及机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在校期间发表论文 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略表 |
| 前言 |
| 文献综述 NLRP3 炎性小体激活对血管相关疾病影响的研究进展 |
| 第一章 高糖通过激活NLRP3 炎性小体通路损伤大鼠主动脉内皮细胞屏障功能 |
| 1 实验材料和仪器 |
| 2 实验方法 |
| 3 统计分析 |
| 4 实验结果 |
| 第二章 T2DM大鼠模型的建立及阿卡波糖对血管内皮功能损伤的改善作用 |
| 1 主要材料和仪器 |
| 2 实验方法 |
| 3 统计分析 |
| 4 实验结果 |
| 第三章:讨论 |
| 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
