李华[1]（2021）在《川芎嗪对结肠癌细胞的抑瘤效应及改变线粒体活性氧代谢介导凋亡通路的机制研究》文中研究指明背景结肠癌是消化道中常见的恶性肿瘤之一,在我国,其发病率及死亡率呈逐年上升趋势,多数患者就诊时已属于中晚期。针对晚期及复发患者,化疗是主要的治疗手段,但化疗药物存在较强的毒副反应以及药物耐药的出现严重影响结肠癌患者的治疗效果及预后。因此,亟待寻找新型的抗肿瘤药物为结肠癌患者提供新的治疗手段。传统中药是抗癌药物的宝库,川芎嗪是从川芎中提取的一种生物碱单体,川芎嗪作为川芎的主要活性成分,多项研究证实川芎嗪可对肝癌、胃癌、前列腺癌、宫颈癌和乳腺癌等多种肿瘤具有良好的抗肿瘤作用。然而,关于川芎嗪是否能抑制结肠癌细胞生长及其作用机制的研究较少。目的探讨川芎嗪对结肠癌的抗肿瘤作用,并探讨其抗结肠癌的作用机制。川芎嗪对不同结肠癌细胞的杀伤作用分析;明确川芎嗪抗结肠癌细胞增殖以及促进结肠癌细胞凋亡的作用;进一步探讨川穹嗪改变线粒体活性氧代谢介导结肠癌细胞凋亡通路的调控机制;在结肠癌荷瘤小鼠中验证川芎嗪的抗肿瘤效果。方法采用结晶紫染色法观察川芎嗪对结肠癌细胞的杀伤作用;采用Cell Counting Kit-8（CCK-8）法检测细胞增殖率,观察川芎嗪作用的浓度依赖性和时间依赖性并计算IC50;通过流式细胞术检测细胞凋亡率及对细胞周期的影响;运用Annexin-V/PI双染的方法检测细胞凋亡的类型和比例;细胞内活性氧含量用DCFH-DA探针来检测;用活性氧抑制剂（NAC）和Caspase泛抑制剂（Z-VAD-FMK）联合川芎嗪作用于结肠癌细胞,观察清除活性氧及阻断凋亡相关靶蛋白后对结肠癌细胞凋亡的影响;建立结肠癌荷瘤动物模型,通过检测肿瘤组织中丙二醛和分析移植肿瘤内活性氧含量,采用Caspase 3和Caspase 9活性检测试剂盒检测移植肿瘤内Caspase 3和Caspase 9蛋白含量。结果1.川芎嗪对6种结肠癌细胞均有杀伤效果,并且随着川芎嗪药物浓度升高,结肠癌细胞存活量逐渐减少,杀伤效果在HCT116和SW480两株细胞中最为敏感。HCT116和SW480两种细胞系的IC50最低;2.随着川芎嗪浓度的增加和作用时间的延长,显微镜下细胞数减少。与对照组相比,3.川芎嗪浓度达到600μg/ml时,HCT116和SW480细胞数目显着减少,细胞收缩和圆,分裂和漂浮。随着川芎嗪浓度的增加和作用时间的延长,HCT116和SW480细胞的增殖活性逐渐降低;4.随着川芎嗪浓度的增加,G1期的细胞比例逐渐增多,S期的细胞比例逐渐减少。与对照组相比,在600μg/ml以上浓度的川芎嗪作用下,细胞周期中S期的比例与对照组相比差异有统计学意义;5.随着川芎嗪浓度的增加,细胞凋亡率逐渐增加,呈浓度依赖性。600μg/ml处理组细胞凋亡率具有统计学意义。SW480细胞中以早期凋亡增加（annexin+/pi-,右下象限）增加为着,HCT116细胞呈现晚期凋亡（annexin+/pi+,右上象限）增加为着;6.与DMSO对照组相比,川芎嗪组的HCT116和SW480细胞数目显着减少,细胞收缩变圆、破碎并漂浮。川芎嗪+NAC和川芎嗪+Z-VAD-FMK组与川芎嗪组相比,细胞数目明显增多。川芎嗪组相比DMSO对照组细胞凋亡率明显升高,川芎嗪+NAC和川芎嗪+Z-VAD-FMK组与川芎嗪组相比,两组凋亡率显着降低。NAC组细胞存活率高于Z-VAD-FMK 组;7.川芎嗪组活性氧含量明显增加,与DMSO组相比有显着性差异。川芎嗪+NAC组与川芎嗪处理组相比,活性氧含量显着下降。川芎嗪+Z-VAD-FMK组活性氧含量与川芎嗪处理组在SW480结肠癌细胞中无明显变化。在HCT116结肠癌细胞中川芎嗪+Z-VAD-FMK组与川芎嗪处理组相比活性氧含量有所下降;8.川芎嗪组与对照组相比,Caspase 3,9和PARP均发生明显的剪切活化,蛋白表达明显增高。川芎嗪+Z-VAD-FMK组和川芎嗪+NAC组,与川芎嗪组相比,Caspase 3,9和PARP这种活化可以被Z-VAD-FMK和NAC显着抑制;川芎嗪+NAC组Caspase 3,9和PARP表达与川芎嗪+Z-VAD-FMK组相比,表达抑制更为显着,蛋白表达降低;9.动物实验中,高浓度川芎嗪组移植瘤生长明显抑制,且呈浓度依赖性,移植瘤的重量分布为:1.62±0.48 g（浓度 0 mg/kg）、0.92±0.21 g（浓度 50 mg/kg）和 0.58±0.19 g（浓度100 mg/kg）,差异有显着性和浓度依赖性;10.川芎嗪高浓度组（100 mg/kg）的动物模型移植肿瘤中的丙二醛和Caspase3,9蛋白含量显着高于低浓度组（50 mg/kg）和对照组（0 mg/kg）,具有显着统计学差异,且有浓度依赖性。结论1.川芎嗪对结肠癌细胞有明显的抑制增殖、促进凋亡作用,并呈现时间与浓度依赖性;2.结肠癌细胞在川芎嗪作用下能够将凋亡细胞增殖阻止在G1期,进而抑制细胞周期S期的合成,从而抑制细胞增殖;3.川芎嗪诱导结肠癌细胞凋亡与产生大量活性氧从而激活Caspase依赖性细胞凋亡通路密切相关,活性氧抑制剂可以更有效抑制川芎嗪诱导的细胞凋亡;4.川芎嗪诱导结肠癌细胞内活性氧含量增高在Caspase依赖性凋亡通路的上游发挥诱导细胞凋亡的调控作用;5.川芎嗪在结肠癌裸鼠移植瘤中能显着抑制肿瘤增殖,增加裸鼠体内的活性氧和Caspase3,9的含量并诱导肿瘤细胞凋亡。
朱安娜[2]（2021）在《基于网络药理学探究麻黄附子细辛汤治疗病态窦房结综合征的显效成分和作用机制》文中指出目的:基于网络药理学研究方法,探究麻黄附子细辛汤治疗病态窦房结综合征的显效成分和作用机制。方法:（1）通过TCMSP数据库及查阅文献搜集整理麻黄附子细辛汤化学成分及相关潜在靶点信息,对未搜集到靶点的成分应用Swiss Target Prediction数据库预测补充,综合得到麻黄附子细辛汤化学成分及潜在靶点数据集;（2）于Gene Cards数据库筛选得到病态窦房结综合征相关靶点,整理得到病态窦房结综合征相关的疾病靶点数据集;（3）利用Cytoscape软件展示中药、化学成分和疾病靶点间的关系,构建“麻黄附子细辛汤药物-化学成分-靶点-病态窦房结综合征”生物网络,通过Cyto NCA拓扑分析,得到麻黄附子细辛汤治疗病态窦房结综合征的显效成分及相关靶点;（4）应用Ledock软件进行分子对接验证关键化学成分与核心靶点结合的可靠性;（5）利用DAVID、Metascape数据库,分别对作用靶点进行GO功能注释和KEGG通路富集分析,预测麻黄附子细辛汤治疗病态窦房结综合征的作用机制。结果:（1）通过对麻黄附子细辛汤作用于病态窦房结综合征相关靶点的生物网络进行分析,预测得到麻黄附子细辛汤治疗病态窦房结综合征的199个显效成分,包括芦丁、去甲乌药碱、β-细辛醚等;（2）由拓扑分析得到网络中木犀草素、准葛尔乌头碱、山奈酚等10个关键化学成分及ADRB2、SCN5A、AR等10个核心靶点;（3）经分子对接证实了除外KCNH2的9个核心靶点与关键化学成分都具有较强结合活性,佐证了关键化学成分与核心靶点的可靠性;（4）通过GO功能注释和KEGG通路富集分析,推测麻黄附子细辛汤治疗SSS的作用机制可能为:（1）调节细胞因子活性,抑制甚逆转心肌纤维化,改善SSS发生的病理基础;（2）调节细胞对炎性刺激、缺氧、老化的反应,保护心肌细胞,减轻窦房结及其周围组织的功能单位损伤;（3）调控蛋白质活力和细胞对机械刺激的反应,诱导质膜受体表达,增强窦房结细胞“钙钟”“膜钟”活性,扩张血管,促进窦房结细胞电生理活动正常,改善心律失常和组织器官血流灌注不足症状;（4）影响可能导致SSS发生的相关疾病,限制多疾病对SSS发生的诱导、加重。结论:本研究通过对麻黄附子细辛汤治疗病态窦房结综合征的网络药理学分析及分子对接验证,初步预测了麻黄附子细辛汤治疗病态窦房结综合征的显效成分和作用机制,为麻黄附子细辛汤的临床应用提供了分子生物学层面的理论支持,为其治疗SSS作用机制的深入研究和复方的二次开发提供了一定量的参考信息。
杨宝瑜[3]（2021）在《基于网络分析的肾结石关键基因和信号通路的鉴定及其分子机制研究》文中提出本文使用生物信息学组学整合方法以及细胞分子生物学方法对肾结石形成与发展的分子机制进行研究。首先,使用蛋白质相互作用网络分析方法,分析肾结石相关蛋白质组学研究数据,预测发现肾结石相关核心蛋白富集于与内质网应激及内质网应激相关的降解等生物学事件上。细胞分子生物学实验证明,草酸钙刺激肾小管上皮细胞以及大鼠肾结石模型,大鼠肾脏组织通过三条通路（包括PERK,IRE1和ATF6）发生了内质网应激,并且使用内质网应激诱导剂和抑制剂证明了内质网应激影响细胞凋亡以及结晶——细胞黏着。然后,肾结石相关基因组及转录组数据整合分析中进一步发现,细胞窖蛋白1（Caveolin-1,CAV1）和表皮细胞生长因子（Epidermal Growth Factor,EGFR）是两个肾结石相关核心蛋白,而细胞黏着斑信号通路（Focal adhesion）为关键的细胞信号转导通路。实验证明草酸钙刺激肾小管上皮细胞及肾结石动物模型中,细胞及大鼠动物组织CAV1,EGFR,AKT蛋白表达下调,m RNA水平不变。过表达CAV1后草酸钙刺激导致的细胞凋亡和细胞表面钙离子黏着水平增加的情况被逆转。添加蛋白酶体抑制剂后草酸钙下调CAV1及EGFR蛋白的情况被逆转,暗示这两个核心蛋白在草酸钙刺激下可能通过内质网应激相关的泛素——蛋白酶体途径降解。综上,本论文首次发现,肾脏草酸钙结晶诱导内质网应激并通过翻译后调控影响CAV1-EGFR-AKT黏着斑信号通路,进而导致细胞凋亡和结晶——细胞相互作用增强。该研究为肾脏中结晶——细胞相互作用的分子机制提供了崭新的解释,为肾结石防治新靶点的研发提供了参考。
翟雨晴[4]（2021）在《大豆苷元诱导肺癌A549细胞凋亡及其相关机制的研究》文中提出肺癌是一种对全世界人类健康都具有极大威胁的恶性肿瘤疾病,癌症数据分析表明,每年死于肺癌的肿瘤患者约有176万人。大豆苷元（daidzein,DAI）是一种广泛存在于大豆产品中的天然异黄酮类化合物,因其具有良好的药效药理机制而受到各国学者关注,但其对于肺癌的防癌抗癌作用机制尚不清晰。因此,本实验以肺癌细胞作为体外研究模型,从细胞及分子水平上对DAI的抗癌机制进行研究。本研究通过研究DAI对3种肺癌细胞的杀伤效应以及3种正常细胞的毒副作用,利用Cell Counting Kit-8（CCK-8）法进行了检测;采用荧光显微镜观察法和流式细胞术（FCM）对DAI的诱导凋亡进行检测;通过FCM对DAI在肺癌细胞内的周期阻滞作用进行检测;通过FCM对DAI在肺癌细胞内活性氧（ROS）水平的调控作用进行检测;通过细胞划痕实验对DAI在肺癌细胞的抑制迁移作用进行检测;通过蛋白质免疫印迹法（western blot）对细胞凋亡、ROS水平、周期阻滞、迁移抑制以及相关信号通路蛋白表达量情况进行检测。结果显示,与阳性对照5-FU组相比,DAI对3种肺癌细胞具有杀伤作用,且对3种正常细胞表现出的毒副作用并不显着;随着DAI处理A549细胞时间的不断增加,细胞出现明显的皱缩变圆的凋亡形态、早晚期凋亡数量的总和不断增加并显着降低了A549细胞内线粒体膜电位,此外,DAI还能够显着降低凋亡相关蛋白Bcl-2/Bad的比例,释放细胞色素C（Cytochrome C,cyto-c）,介导caspase-3和PARP被活化,最终使细胞发生线粒体依赖性凋亡;DAI可通过促进周期蛋白p21、p27的表达,抑制周期蛋白p-AKT、CDK2/4/6和cyclin D1/E的表达,使细胞在G0/G1期发生周期阻滞;DAI能够上调肺癌A549细胞中ROS水平,进而激活JNK、p38信号通路,抑制ERK,STAT3和NF-κB信号通路,使A549细胞发生凋亡;DAI在处理A549细胞后,其迁移作用明显地受到了抑制,且呈时间依赖性,并通过TGF-β信号通路有效抑制肺癌A549细胞发生迁移。综合以上结果,DAI对3种肺癌细胞具有杀伤作用,且能够使肺癌A549细胞内ROS水平升高,进而调控MAPK,STAT3和NF-κB信号通路,使肺癌A549细胞发生线粒体依赖性凋亡和细胞周期阻滞,并通过调控TGF-β信号通路抑制细胞迁移和侵袭。本研究为研制出一种安全有效的防治肿瘤功能因子提供新的思路和理论依据。
陈庆春[5]（2021）在《类胰酶TPSD1和糖苷酶UNG系统调控肝癌网络计算比较》文中研究表明类胰蛋白酶δ1（tryptase delta 1,TPSD1）和尿嘧啶DNA糖苷酶（uracil DNAglycosylase,UNG）是本文从 GSE10140-10141 中相对于肝炎（HBV或HCV感染）计算筛选出的肝癌高表达分子,而且TPSD1和UNG的知识与分子网络都非常丰富,是肝癌中非常活跃的分子。本文通过整合SAM、Pearson、GRNInfer和DAVID,分别构建了肝癌（HBV或HCV感染）高表达TPSD1和UNG反馈/上/下游激活和抑制知识与分子网络。横向提出并验证TPSD1有丝分裂和神经内分泌抑制、炎症反应激活机制,UNG有丝分裂激活、先天性免疫和炎症反应抑制机制,分别通过计算含其任一分子的共同知识和亚网。纵向提出并验证TPSD1有丝分裂抑制但UNG激活、TPSD1神经内分泌和UNG先天性免疫反应抑制、TPSD1炎症反应激活但UNG抑制机制,通过计算与其相互激活不同分子的知识和共同亚网。负向验证TPSD1和UNG有丝分裂、神经内分泌和先天性免疫、炎症反应,通过提出其不同游的相同知识的机制和共同亚网。1.肝癌TPSD1有丝分裂抑制但UNG激活机制TPSD1反馈抑制BUB1B和CDC2的核有丝分裂,横向通过基因表达正调控|有丝分裂细胞周期G2/M转变| DNA复制,和纵向通过转录因子活性序列特异性DNA结合|细胞周期G1到S控制反应物,共同存在于 BUB1B、CDC2、E2F1、LAPTM4B、MCM4、MYBL2、NCAPH亚网。为了负向验证TPSD1反馈抑制核有丝分裂,提出TPSD1反馈激活转录因子活性序列特异性DNA结合诱导DNA损伤|正趋化性|核小体组装存在于共同DDX10、GML、HMGB2、PRSS1、SORT1、TNFRSF9、TP53I11亚网,比较 TPSD1反馈抑制转录因子活性序列特异性DNA结合诱导细胞周期通路存在于共同 BUB1B、CDC2、CDKN3、E2F1、LAPTM4B、MCM4、MYBL2、NCAPH 亚网。TPSD1上游抑制BIRC5和CCNA2的核有丝分裂,横向通过泛素蛋白转移酶活性|锌离子结合,和纵向通过细胞骨架结构组成|细胞增殖,共同存在于 ACTG2、CCNA2、ESM1、TUBG1、UBE2C亚网。为了负向验证TPSD1上游抑制核有丝分裂,提出TPSD1上游激活细胞增殖通过FcεRI信号通路|碳水化合物结合存在于共同CHRNA4、GDPD5、KCTD2、KLRC3、MAP2K6、MS4A2、NFKBIB、REG3A亚网,比较TPSD1上游抑制细胞增殖通过胚胎干细胞存在于共同 ACTG2、CCNA2、ESM1、GPSM2、TUBG1、UBE2C 亚网。UNG反馈激活CCNB1和TUBG1的M期,横向通过细胞缺氧反应| G2/M检查点|蛋白复合物装配| p53信号通路|细胞骨架结构组成,和纵向通过前列腺和小细胞肺癌|转录因子活性序列特异性DNA结合| DNA复制起始|病毒癌变|核染色质,共同存在于 ACTG2、BIRC5、CCNB1、E2F1、MCM4 亚网。为了负向验证UNG反馈激活M期,提出UNG上游激活DNA转录正调控诱导核有丝分裂|肝脏发育存在于共同UBE2C亚网,比较UNG反馈激活转录因子活性序列特异性DNA结合诱导成纤维细胞增殖正调节| DNA损伤应答内在凋亡信号转导通路存在于共同ACTG2、BIRC5、CCNB1、E2F1、LOX、MCM4 亚网。UNG上游激活NCAPH和NUSAP1的有丝分裂相关染色体凝聚,横向通过微管结合|聚（A）RNA结合,和纵向通过蛋白异源二聚化活性,细胞蛋白质代谢过程|细胞对DNA损伤刺激的反应|跨损伤合成,共同存在于GPSM2、HIST1H3H、NCAPH、RFC4亚网。为了负向验证UNG上游激活有丝分裂相关染色体凝聚,提出UNG反馈激活蛋白异源二聚化活性诱导蛋白质泛素化和sumo化|细胞凋亡负调控存在于共同BIRC5、E2F1亚网,比较UNG上游激活蛋白异源二聚化活性诱导凋亡过程正调控|细胞对DNA损伤刺激的反应|酶结合存在于共同GPSM2、RFC4亚网。2.肝癌TPSD1神经内分泌和UNG先天性免疫反应抑制机制TPSD1反馈抑制CDKN3和SPINK1的内分泌和中枢神经系统,横向通过没有直接相关知识,和纵向通过基因表达正调控|转录因子活性序列特异性DNA结合|细胞周期G1到S控制反应物,共同存在于 CDC2、CDKN3、E2F1、LAPTM4B、MCM4 亚网。为了负向验证TPSD1反馈抑制内分泌和中枢神经系统,提出TPSD1 下游激活内分泌和中枢神经系统通过细胞-细胞信号转导存在于共同FGF9、FOLR1、NINJ2、STX1A、TBL3、TSHB亚网。UNG反馈抑制LGALS3和NFKBIB的先天性免疫反应,横向通过细胞外基质组织|甲型流感,和纵向通过认知|突触传递|神经发生|小分子代谢过程,共同存在于CHL1、CHRNA4、FOLR1、PRSS1、TPST2亚网。为了负向验证UNG反馈抑制先天性免疫反应,提出UNG上游抑制突触传递通过钾离子运输|信号转导存在于共同ARHGDIG、EIF1AX、SSTR5亚网,比较UNG反馈抑制突触传递通过膜电位调节|分泌通路存在于共同CHL1、CHRNA4、FOLR1、KIAA0513、PRSS1、RIMS3、TPST2 亚网。UNG下游抑制HMGB2和MS4A2的先天性免疫反应,横向通过内源性刺激响应|蛋白结构域特异性结合|脂多糖反应|炎症反应,和纵向通过突触传递,共同存在于HMGB2、RNF185、TNFRSF9亚网。为了负向验证UNG下游抑制先天性免疫反应,提出UNG反馈抑制突触传递通过神经活性配体受体相互作用|分泌通路存在于共同CHL1、CHRNA4、FOLR1、KIAA0513、PRSS1、RIMS3、TPST2亚网,比较UNG下游抑制突触传递通过蛋白结构域特异性结合存在于共同HMGB2、MS4A2、RNF185、TNFRSF9亚网。3.肝癌TPSD1炎症反应激活但UNG抑制机制TPSD1反馈激活CHST1和TNFRSF9的炎症反应,横向通过多细胞体发育|脂多糖反应,和纵向通过丝氨酸内肽酶活性|轴突导向|同源蛋白质结合|蛋白质自磷酸化|胰腺分泌|血液凝固,共同存在于 CHST1、EPHA4、ISG20、LGALS3、PRSS1 亚网。为了负向验证TPSD1反馈激活炎症反应,提出TPSD1下游抑制蛋白质自磷酸化诱导锌离子结合|肝脏发育|细胞周期的M期存在于共同FOXM1、HIST1H2BJ、STMN1亚网,比较TPSD1反馈激活蛋白质自磷酸化诱导轴突导向|血液凝固|钙信号转导通路存在于共同 CHL1、CHST1、EPHA4、PRSS1 亚网。TPSD1上游激活MS4A2和REG3A的炎症反应,横向通过FcεRI信号通路|碳水化合物结合,和纵向通过toll样受体信号通路|胆碱能突触,共同存在于CHRNA4、KLRC3、MAP2K6、NFKBIB、REG3A亚网。为了负向验证TPSD1上游激活炎症反应,提出TPSD1反馈激活谷氨酸能突触通过神经冲动传递|蛋白激酶活性存在于共同CHST1、PRSS1、SSTR5亚网,比较TPSD1上游激活胆碱能突触通过钾和电压门控离子通道活性存在于共同AMELY、KCNQ3、KLRC3、MAP2K6、REG3A、RNF185、SYN2、TPST2亚网。UNG下游抑制MS4A2和TNFRSF9的炎症反应,横向通过先天性免疫反应|细胞增殖负调节,和纵向通过神经递质分泌|蛋白结构域特异性结合,共同存在于HMGB2、RNF185、TNFRSF9亚网。为了负向验证UNG下游抑制炎症反应,提出UNG下游激活轴突导向通过锌离子结合存在于共同CCNB2、DLG7、ESM1、IGF2BP3、MMP9亚网,比较UNG下游抑制神经递质分泌通过蛋白结构域特异性结合存在于共同HMGB2、MS4A2、RNF185、TNFRSF9亚网。本文首次全面系统地通过大数据计算阐述了类胰酶TPSD1调控肝癌的有丝分裂和神经内分泌抑制、炎症反应激活机制,填补了当前研究领域的空白,为早期肝癌的诊断和治疗奠定基础。糖苷酶UNG调控肝癌的有丝分裂激活、先天性免疫和炎症反应抑制机制,为肝癌理论和应用研究增加了新的内容,对晚期肝癌的诊断和治疗具有重大意义。TPSD1有丝分裂抑制但UNG激活、TPSD1神经内分泌和UNG先天性免疫反应抑制、TPSD1炎症反应激活但UNG抑制的新系统比较研究为肝癌的诊断和治疗提供了重要的理论基础和应用价值。
张圆圆[6]（2021）在《山核桃萜类醌的生物合成途径及其成分胡桃醌抑制Ishikawa癌细胞增殖的分子机理》文中研究说明山核桃,胡桃科,是一种广泛栽培的木本油料树种。山核桃仁因富含油脂、蛋白质、纤维、酚酸和萜类等生物活性成分而受到人们亲睐。子宫内膜癌是女性生殖道最常见的恶性肿瘤之一,膳食干预是预防疾病的重要措施。本论文首先调查了山核桃授粉后萜类醌的合成,联合转录组学与代谢组学方法明确了山核桃发育期萜类合成与代谢的机制;接着考察了山核桃青皮中胡桃醌对子宫内膜癌Ishikawa细胞增殖抑制效果,利用mRNA-miRNA组学从整体水平明确了胡桃醌对子宫内膜癌Ishikawa细胞的增殖抑制的机制;最后,明确了胡桃醌抑制子宫内膜癌Ishikawa细胞增殖和迁袭的机制。本学位论文的研究结果为山核桃萜类化合物胡桃醌开发成特殊医学用途的功能性食品提供了理论的支持。（1）山核桃授粉后发育期萜类物质代谢机制。山核桃授粉后90-105天（P1-P2）是次级代谢物形成的关键时期。从P1至P2阶段,山核桃中的萜类化合物大量累积,而山核桃授粉后120-165天（P2-P6）萜类化合物含量急剧下降,此外,MENB和C4H基因在山核桃胚胎中高表达,最高的转录组表达量分别为671和1469,其中MENB的高表达水平可能是山核桃胚胎中萜类醌（萘醌）含量高的重要原因。通过网络共表达分析,6种萜烯醌代谢物与86个差异表达基因之间存在显着的正负相关性（r>0.8或<0.8,p<0.05）,且次级代谢产物的表达水平在早期是最高的,这与调控其差异表达基因水平基本一致。（2）山核桃青皮提取物胡桃醌抑制子宫内膜癌Ishikawa细胞的增殖作用。利用超声波辅助提取山核桃青皮提取物的工艺条件为:85%乙醇浸泡8 h、料液比为1:8、超声提取30 min,40℃减压浓缩,在此条件下得到的山核桃青皮粗提取物经大孔树脂与硅胶柱联合纯化后,化合物含量为3.31 mg/kg,纯度为98%,经二次质谱和离子碎片数据数据库比对后该组分鉴定为胡桃醌。胡桃醌处理Ishikawa细胞24 h的半增殖抑制率(IC50)为20.81μmol/L。用不同浓度的胡桃醌（0、10、15、20μM）处理24 h后,Ishikawa细胞的形态变化呈剂量依赖性。（3）转录组学和miRNA组学联合分析胡桃醌抑制Ishikawa细胞增殖。子宫内膜癌Ishikawa细胞经胡桃醌（20μM）处理24 h后,942个mRNA的表达量差异显着。差异表达的mRNA中,789个上调、153个下调,其富集分析在与细胞周期和凋亡相关的通路上。通过Cytoscape的Cytohubba插件分析String数据库构建的差异表达mRNA间蛋白质-蛋白质互作关系（PPI）,发现筛选出的16个特征（Hub）基因主要参与细胞周期G1/S期和铁死亡相关HIF-1信号通路。胡桃醌处理Ishikawa细胞后50个miRNA的表达量显着变化,其中24个上调、26个下调。通过构建miRNA共表达网络,鉴定出4个关键的miRNA（hsa-let-7i-5p,hsa-let-7g-5p,hsa-mir-148b-3p和hsa-mir-148a-3p）,其靶基因富集分析在与凋亡相关通路中。miRNA-mRNA调控网络分析表明,胡桃醌诱导子宫内膜癌Ishikawa细胞增殖抑制与铁死亡和细胞凋亡、周期机制密切相关,且为进一步探究成为功能性食品成分提供线索。（4）胡桃醌诱导Ishikawa细胞凋亡及其机理。胡桃醌通过Cdc25A/CDK2/Cyclin A信号途径将Ishikawa细胞阻滞在S期,显着促进子宫内膜癌Ishikawa细胞的晚期凋亡的发生。胡桃醌诱导Ishikawa细胞凋亡,线粒体途径和死亡受体途径都参与其中。在线粒体途径中,抑凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-x L的表达显着下调,而促凋亡蛋白Bad和Bak表达上调。Caspase 3抑制剂与胡桃醌的联合作用在一定程度上减弱了这种抑制作用,表明线粒体途径中的Caspase3在胡桃醌诱导的Ishikawa细胞凋亡中起关键作用,进一步证实了线粒体途径参与胡桃醌诱导的细胞凋亡。同时在死亡受体途径中,TNF-α、TNF-R1、TRADD、FAS、FADD、Caspase 8、Caspase 10和DR3/5的mRNA和蛋白表达显着上调。当用Caspase-8抑制剂（Z-IETD-FMK）处理时,Caspase 8的表达水平显着降低;而胡桃醌的添加在一定程度上减弱了这种抑制作用,进一步说明了死亡受体通路参与了胡桃醌诱导的Ishikawa细胞凋亡。（5）胡桃醌诱导的子宫内膜癌Ishikawa细胞铁死亡及其机理。胡桃醌处理子宫内膜癌Ishikawa细胞24 h后,出现了Fe2+的积累、脂质过氧化、GSH消耗、HMOX1上调等现象,说明铁死亡可能参与了胡桃醌诱导的细胞死亡。在胡桃醌处理的Ishikawa细胞中,Beclin 1呈剂量依赖性下调。此外,胡桃醌和铁死亡抑制剂Fer-1联合处理24 h后,Ishikawa细胞中Beclin 1的表达增加,表明胡桃醌诱导细胞发生铁自噬。在胡桃醌处理的Ishikawa细胞中,E-cadherin、MMP 9和MMP 2蛋白发生显着变化。结果表明胡桃醌可能通过抑制上皮-间充质转化（EMT）来抑制Ishikawa细胞的迁移。同时,通过用Fer-1抑制剂和胡桃醌处理,进一步说明了胡桃醌诱导的Ishikawa细胞死亡与铁死亡有关。此外,胡桃醌诱导子宫内膜癌Ishikawa细胞发生内质网应激。
马雪洁[7]（2021）在《异叶青兰总黄酮体外抗氧化及对H9c2心肌细胞的抗炎抗凋亡作用研究》文中研究说明目的:本研究主要通过对异叶青兰总黄酮体外抗氧化活性的考察,以及异叶青兰总黄酮（DHBF）对LPS及H2O2诱导的H9c2心肌细胞的影响及作用机制研究,以期为该药材的开发利用提供参考依据。方法:1.采用70%乙醇回流提取,AB-8大孔吸附树脂纯化制备DHBF,通过硝酸铝比色法测定DHBF含量,并建立方法学考察。2.以维生素C作为阳性对照,通过考察DHBF对DPPH自由基、ABTS自由基的清除能力,以及总抗氧化能力（T-AOC）,评价其体外抗氧化活性。3.以10μg/m L的脂多糖（LPS）诱导H9c2细胞建立炎症模型,以300μM过氧化氢（H2O2）诱导H9c2细胞,建立H9c2细胞损伤模型。4.采用细胞增殖-毒性检测法（CCK-8）检测不同浓度DHBF对H9c2心肌细胞活性的影响,以及DHBF对H2O2诱导H9c2细胞存活率的影响。5.利用ELISA法检测IL-6、IL-1β、IL-10以及TNF-α等炎症因子的分泌。6.采用细胞凋亡-Hoechst染色试剂盒检测细胞凋亡情况。7.采用激光共聚焦显微镜检测细胞线粒体膜电位（JC-1）。8.采用Western blot法检测TLR4,My D88,NF-κB,Bax、Caspase-3的蛋白表达水平。结果:1.DHBF平均含量为48.6%,其对DPPH和ABTS自由基清除率可高达82.94%和98.47%,IC50值分别为0.063 mg/m L和0.079 mg/m L。总抗氧化能力（T-AOC）达5.81μmol/m L。2.CCK-8结果表明,当浓度≦50μg/m L时,其对H9c2细胞的活性无抑制现象。与正常组相比,H2O2模型组H9c2细胞存活率显着下降（P<0.05）,不同浓度的DHBF均可以提高H2O2诱导的H9c2细胞存活率,其中25、50μg/m L的DHBF可以显着提高H2O2诱导的H9c2细胞存活率（P<0.05）。3.与正常对照组相比,LPS模型组细胞上清液中IL-6、IL-1β及TNF-α表达显着提高（P<0.01）,IL-10的表达显着降低（P<0.01）。给予不同浓度DHBF的H9c2细胞组,均能够降低IL-6、IL-1β以及TNF-α的表达。其中25、50μg/m L的DHBF能够显着降低IL-6、IL-1β以及TNF-α的表达（P<0.05,P<0.01）。给予50μg/m L的DHBF的H9c2细胞组,能够提高IL-10的表达（P<0.05）。4.与正常组相比较,模型组TLR4蛋白表达水平显着提高（P<0.05）,My D88以及NF-κB的蛋白表达水平也显着升高（P<0.01）。给予不同浓度DHBF的H9c2细胞组,均能够降低TLR4蛋白的表达（P<0.05,P<0.01）。给予不同浓度DHBF的H9c2细胞组,均能够降低My D88蛋白的表达,其中25、50μg/m L的DHBF能够显着降低My D88蛋白的表达水平（P<0.05）。给予不同浓度DHBF的H9c2细胞组,均能够降低NF-κB蛋白的表达（P<0.01）。5.与正常对照组相比较,H2O2模型组细胞形态损伤明显,线粒体膜电位下降,不同浓度DHBF能够改善细胞损伤,使线粒体膜电位上升。6.与正常对照组相比较,模型组Caspase-3及Bax的蛋白表达显着升高（P<0.05,P<0.01）,50μg/m L的DHBF能够显着降低Caspase-3及Bax的蛋白表达（P<0.05）。结论:1.DHBF具有良好的体外抗氧化活性。2.DHBF可以有效抑制LPS诱导的H9c2细胞相关炎症因子与蛋白的表达,其机制可能与抑制TLR4/My D88/NF-κB信号通路有关。3.DHBF能够抑制H2O2诱导的H9c2细胞凋亡。提示DHBF可以通过抑制炎症反应以及氧化应激反应保护心肌细胞。
马晓丽[8]（2021）在《ILK对食管鳞癌恶性表型的影响及其功能研究》文中研究指明目的:本研究目的是探讨整合素连接激酶（ILK）基因对食管癌细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移的影响,研究其在食管癌中功能,为食管癌的精准诊疗奠定理论基础和临床参考。方法:1)采用meta分析评价ILK在消化系统肿瘤组织中的表达,及与消化系统肿瘤临床表型及预后间的相关性;2)筛选ILK高表达的人食管鳞癌细胞系,建立ILK慢病毒干扰序列。将ILK慢病毒干扰序列转染食管鳞癌细胞系TE-1和KYSE-150,用q RT-PCR检测干扰载体转染后ILK的表达。在细胞水平上,利用MTT增殖、克隆检测、流式细胞仪凋亡检测、Transwell小室侵袭及划痕愈合等技术,研究ILK基因消减对食管鳞癌细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移的影响;3)建立ILK慢病毒干扰载体,转染KYSE-150细胞。在裸鼠皮下分别接种sh ILK及对照细胞株,建立KYSE-150细胞裸鼠皮下移植瘤模型,通过观察肿瘤生长,测量肿瘤大小和体积。在动物水平上,研究ILK基因消减对食管鳞癌细胞生长的影响。基于RNA-seq技术筛选食管癌的差异表达基因,通过GO功能富集和KEGG通路分析预测其可能的发病机制,筛选可能参与食管癌发生发展的关键调控基因及相关信号通路。结果:第一部分:meta分析结果显示ILK在消化系统肿瘤组中高表达,ILK表达与肿瘤分化程度、TNM分期、淋巴结转移、肿瘤浸润程度及生存预后呈相关性,与年龄及性别无明显相关性。第二部分:在体外ESCC细胞水平,沉默ILK基因后,可显着抑制TE-1、KYSE-150细胞增殖和集落形成,促进TE-1、KYSE-150细胞凋亡。ILK基因消减后,TE-1、KYSE-150细胞侵袭及迁移能力明显减弱。第三部分:裸鼠移植瘤动物模型结果发现,ILK干扰组裸鼠肿瘤生长缓慢,相比较于对照组,肿瘤的重量及体积均偏小,ILK基因消减后影响了裸鼠成瘤的能力。基于RNA-seq技术,ILK基因干扰后挖掘到5540个食管癌差异表达基因,其中上调基因为2839个,下调基因为2601个。上调的基因有SOD2、IRF6、PER1、PHLDB2、TNFAIP3等,下调的基因有RPL21、HYOU1、WARS、SUPT16H、DHCR24等。可能参与TNF信号通路、AMPK信号通路、Fox O信号通路、P53信号通路、NF-k B信号通路等。结论:ILK在消化系统肿瘤中高表达,与肿瘤分化程度、TNM分期、淋巴结转移、肿瘤浸润程度及生存预后呈相关性,与年龄及性别无明显相关性。ILK基因消减抑制ESCC细胞增殖、克隆形成、侵袭及转移,促进细胞凋亡。体内致瘤研究证实,ILK基因消减会阻碍KYSE-150移植瘤的生长。基于RNA-seq技术筛选出食管癌的差异表达基因,通过GO功能富集和KEGG通路分析预测差异表达基因,可能相关的信号传导通路。
杨兵[9]（2020）在《拐枣多糖的分离纯化和结构解析及其降血糖活性研究》文中进行了进一步梳理糖尿病是一种慢性内分泌代谢疾病,是由于机体胰岛素分泌相对不足或绝对不足而引起机体糖、脂肪、蛋白质代谢紊乱,并以持续高血糖为典型特征的一种综合症。世界卫生组织将糖尿病分为以下四类:1型糖尿病（Type 1 Diabetes mellitue,T1DM）、2型糖尿病（Type 2Diabetes mellitue,T2DM）、妊娠糖尿病（Gestational Diabetes mellitus,GDM）和其他糖尿病。根据国际糖尿病联盟最新统计,2019年全球约有4.63亿糖尿病患者,而我国糖尿病患者约为1.16亿,居全球首位。以目前趋势推测,到2045年全球糖尿病患者将达到7亿。目前,糖尿病最有效的治疗途径为注射胰岛素和口服降血糖药,但大多数口服降糖药具有一定的副作用。因此,寻找方便易行、疗效确切、无副作用或副作用很小的预防和治疗糖尿病的天然药物显得十分重要。拐枣（Hovenia dulcis）是一种鼠李科枳椇属植物,其可食部分为拐枣果梗。拐枣中富含植物多糖、黄酮类、三萜皂苷类和生物碱等活性成分。近年来,拐枣在营养和保健功效方面的功效越来越受到人们的重视。目前有关拐枣资源的研究主要集中在拐枣种子（枳椇子）方面,对其可食部分（拐枣果梗）的研究较少,一般为利用拐枣果梗开发拐枣果醋、果酒和果汁等产品。同时,也有少量研究报道了拐枣果梗中小分子活性物质（如黄酮类物质）的提取、分离纯化和功能方面的研究。可见,由于对拐枣果梗活性成分研究的不深入,造成其工业化产品附加值低,进而导致资源浪费等问题依然存在。因此,提高拐枣资源开发的附加值,减少资源浪费已成为拐枣产业的重中之重。基于此,本实验以拐枣（果梗）为研究对象,瞄准其活性成分拐枣多糖,采用三种提取工艺提取拐枣多糖,筛选出体外降血糖活性最高的拐枣多糖样品;并对拐枣多糖样品进行分离纯化和结构解析;以及探讨拐枣多糖纯化组分对1型糖尿病和2型糖尿病的降糖效果及机制。主要研究结果如下:（1）三种提取工艺对拐枣多糖的理化性质和结构特性及生物活性的影响采用热水提取（Hot water extraction,HWE）、快速溶剂萃取（Accelerated solvent extraction,ASE）和超声辅助提取（Ultrasonic-assisted extraction,UAE）三种提取工艺提取拐枣多糖,分别命名为:HWE-HDPs、ASE-HDPs和UAE-HDPs,探讨三种提取工艺对拐枣多糖的理化性质和结构特性以及生物活性的影响。结果显示:三种提取工艺的拐枣多糖基本化学组成成分具有显着性差异;拐枣多糖HWE-HDPs的平均分子量显着高于拐枣多糖ASE-HDPs和UAE-HDPs;拐枣多糖HWE-HDPs的单糖组成以鼠李糖、半乳糖醛酸、半乳糖和阿拉伯糖为主,拐枣多糖ASE-HDPs和UAE-HDPs的单糖组成以鼠李糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖为主;三种提取工艺的拐枣多糖均具有一定的潜在降血糖活性,其中拐枣多糖HWE-HDPs对α-葡萄糖苷酶的抑制能力和Hep-G2细胞胰岛素抵抗的改善效果均显着高于拐枣多糖ASE-HDPs和UAE-HDPs。（2）拐枣多糖的分离纯化和结构解析采用DEAE-52阴离子交换柱层析法和Sephadex G-100柱层析法对拐枣多糖进行分离纯化,得到拐枣多糖的纯化组分,对其进行纯度鉴定并测定其分子量分布,最后结合化学分析法和现代仪器分析法对多糖的纯化组分进行结构解析。结果显示:采用DEAE-52阴离子交换柱层析法分离纯化得到三个拐枣多糖组分（HDPs-1,HDPs-2和HDPs-3）,其中HDPs-2的纯化得率和α-葡萄糖苷酶的抑制能力最高;进而对HDPs-2进行Sephadex G-100柱层析,得到单一多糖组分HDPs-2A,其得率为粗多糖HDPs的19.63%;HDPs-2A平均分子量为372.91 k Da,其总糖含量为84.22%,糖醛酸含量为5.35%,不含蛋白质;HDPs-2A的单糖组成主要包括甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖等,摩尔百分比分别为:3.64%、1.41%、4.67%、5.16%、3.01%、60.02%和22.09%;高碘酸氧化、Smith降解、甲基化和核磁共振分析结果表明,HDPs-2A是由α-L-Araf-（1→、→3,5）-α-L-Araf-（1→、→3）-α-L-Araf-（1→、→3,6）-β-D-Manp-（1→、→3）-β-D-Galp A-（1→、→6）-β-D-Galp-（1→、α-D-Glcp A-（1→和→6）-α-D-Glcp-（1→等8种糖苷键组成;原子力显微镜结果表明,HDPs-2A在水中呈不规则的聚合物颗粒形态;X-RD结果表明,HDPs-2A呈单晶体结构存在。（3）拐枣多糖HDPs-2A对1型糖尿病的降糖效果及机制研究以拐枣多糖HDPs-2A为研究材料,采用链脲佐菌素（STZ）诱导构建T1DM大鼠模型,将实验大鼠随机分为6组（每组8只）:空白对照组（NG）、模型组（DM）、阳性对照组（MET）、拐枣多糖HDPs-2A低（L-PA）、中（M-PA）、高（H-PA）剂量组,分别灌胃干预4周。结果显示:中、高剂量的拐枣多糖HDPs-2A可提高T1DM大鼠的体重、血清胰岛素水平和肝糖原水平,降低T1DM大鼠的空腹血糖水平,并改善其口服葡萄糖耐量能力;此外,中、高剂量的拐枣多糖HDPs-2A还能部分修复胰岛β-细胞损伤,减轻胰腺氧化应激反应,降低血清促炎因子水平;高剂量的拐枣多糖HDPs-2A对T1DM大鼠的降糖效果与MET组无显着性差异;实时荧光定量PCR和Western Blotting结果表明,1）中、高剂量的拐枣多糖HDPs-2A可显着上调胰腺中PDX-1的表达,激活并上调IRS2的表达,以调控胰岛β-细胞的凋亡和再生,达到恢复胰岛β-细胞功能损伤的作用,此外,中、高剂量的拐枣多糖HDPs-2A也可上调胰腺GK和GLUT2的表达,以提高胰岛β-细胞的胰岛素分泌能力,最终改善T1DM大鼠的糖代谢紊乱;2）中、高剂量的拐枣多糖HDPs-2A可显着上调肝脏中GK的表达,显着下调G6Pase的表达,以提高肝糖原合成能力,抑制肝脏糖异生作用,最终改善T1DM大鼠的肝脏糖代谢紊乱。综上,拐枣多糖HDPs-2A对T1DM的降糖机制可能为:通过上调胰腺PDX-1、IRS2、GK和GLUT2等信号分子的表达,以调控胰岛β-细胞的凋亡和再生,促进胰岛素分泌,同时也可通过上调肝脏GK的表达和下调G6Pase的表达,来改善肝脏糖代谢紊乱,最终达到改善T1DM的作用。（4）拐枣多糖HDPs-2A对2型糖尿病的降糖效果及机制研究以拐枣多糖HDPs-2A为研究材料,采用高脂高糖结合小剂量STZ诱导构建T2DM大鼠模型,分组与T1DM的降血糖实验一致,灌胃干预4周。结果显示:中、高剂量的拐枣多糖HDPs-2A可提高T2DM大鼠的体重和肝糖原水平,降低T2DM大鼠的空腹血糖水平,并改善其口服葡萄糖耐量能力,提高胰岛素的利用和降低胰岛素抵抗,此外,中、高剂量的拐枣多糖HDPs-2A还可部分修复肝脏组织损伤,减轻肝脏氧化应激反应,并提高T1DM大鼠粪便中的短链脂肪酸（SCFAs）水平;高剂量的拐枣多糖HDPs-2A对T2DM大鼠的降糖效果与MET组无显着性差异;实时荧光定量PCR和Western Blotting结果表明,1)中、高剂量的拐枣多糖HDPs-2A可显着上调T2DM大鼠肝脏中Ins R和IRS2的表达,激活PI3K,进一步激活并上调PI3K下游关键信号分子Akt的表达,从而上调肝脏中GLUT4的表达,以促进T2DM大鼠肝脏对葡萄糖的吸收和利用,同时提高肝脏的胰岛素敏感性,最终降低肝脏胰岛素抵抗;2)中、高剂量的拐枣多糖HDPs-2A可显着上调T2DM大鼠肝脏p-AMPK的表达,激活AMPK途径,进而下调AMPK途径介导的糖异生关键酶G6Pase与PEPCK的表达,以抑制肝脏糖异生作用,最终改善肝脏糖代谢紊乱;3)中、高剂量的拐枣多糖HDPs-2A可显着下调T2DM大鼠肝脏中糖原合成酶激酶GSK-3β的表达,并上调糖原合成酶GS的表达,以促进肝糖原合成,还可显着下调肝脏糖异生关键调控因子Fox O1的表达,以抑制肝脏糖异生作用,减少肝糖输出,最终改善肝脏糖代谢紊乱并降低肝脏胰岛素抵抗;4)中、高剂量的拐枣多糖HDPs-2A可显着上调T2DM大鼠肝脏中PPARγ和PGC-1α的表达,激活PPARγ/PGC-1α信号通路,进而上调PI3K-p85和GLUT4的表达,以及激活AMPK途径和调控与糖代谢相关激酶的表达,以提高葡萄糖的转运,促进肝糖原合成,最终改善肝脏糖代谢紊乱并降低肝脏胰岛素抵抗。综上,拐枣多糖HDPs-2A对T2DM的降糖机制可能为:通过激活胰岛素PI3K/Akt信号转导通路的上下游相关信号分子,降低肝脏胰岛素抵抗;另外,通过激活AMPK途径和糖代谢相关酶,改善肝脏糖代谢紊乱;同时,也可通过调控GS/SGK-3β信号通路和下调Fox O1的表达,改善肝脏糖代谢紊乱并降低胰岛素抵抗;还可通过调控PPARγ/PGC-1α信号通路,进而调控其他相关信号分子的表达,改善肝脏糖代谢紊乱并降低胰岛素抵抗。因此,拐枣多糖HDPs-2A可改善肝脏糖代谢紊乱并降低肝脏胰岛素抵抗,且两种机制相互调节,共同改善T2DM。结论:本实验以拐枣多糖的降血糖活性为出发点,首先对拐枣多糖进行提取、分离纯化和结构解析,然后探讨拐枣多糖HDPs-2A对1型/2型糖尿病的降糖效果及机制。实验结论为:采用三种提取工艺提取拐枣多糖,其中HWE-HDPs具有较强的α-葡萄糖苷酶抑制活性和Hep-G2胰岛素抵抗细胞改善作用;以HWE-HDPs为研究材料,经分离纯化得到拐枣多糖纯化组分HDPs-2A,其主要含α-L-Araf-（1→、→3,5）-α-L-Araf-（1→、→3）-α-L-Araf-（1→、→3,6）-β-D-Manp-（1→、→3）-β-D-Galp A-（1→、→6）-β-D-Galp-(1→、α-D-Glcp A-（1→和→6）-α-D-Glcp-(1→等8种糖苷键;然后以拐枣多糖HDPs-2A为研究材料,发现拐枣多糖HDPs-2A对T1DM的降糖机制可能为:通过调控T1DM大鼠胰腺相关基因的表达,来调控胰岛β-细胞的凋亡和再生以及促进胰岛素分泌,还可通过调控肝脏糖代谢相关酶的表达,以改善T1DM大鼠肝脏糖代谢紊乱,最终达到改善T1DM的作用;拐枣多糖HDPs-2A对T2DM的降糖机制可能为:通过激活胰岛素PI3K/Akt信号转导通路以及肝脏糖代谢相关的通路和信号分子的表达,以改善肝脏糖代谢紊乱并降低肝脏胰岛素抵抗,最终改善T2DM。
闫欢[10]（2020）在《基因修饰卵巢癌细胞株的构建及PTK2对卵巢癌细胞生物学行为影响的研究》文中进行了进一步梳理研究背景卵巢癌（ovarian cancer）是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一,世界范围内,其发病率在发达国家为9.1/10万,在发展中国家为5.0/10万,死亡率居妇科恶性肿瘤之首。卵巢上皮性癌（ovarian epithelial cancer）占卵巢癌的85～90%,在早期诊断时,卵巢癌患者可以采用手术联合化疗药物治疗,5年生存率接近90%,由于卵巢癌的频繁复发和转移,晚期患者5年生存率降至30%左右。肿瘤的起始和进展与多种抑癌基因失活或者促癌“诱导”基因的过度激活密切相关。近年来,分子靶向治疗发展迅猛,以分子靶向药物治疗为代表的生物治疗模式可以从分子水平调控肿瘤进展,为改善卵巢癌患者预后带来希望。因此,迫切需要探索卵巢癌发生和转移相关的分子机制,探究卵巢癌分子靶向治疗的潜在靶点,提高卵巢癌患者早期诊断率。抑癌基因p53位于17号染色体17p13.1的位置,p53是人类癌细胞中突变率最高的基因。以往的研究发现,p53功能缺陷(p53-/-)在诱导小鼠卵巢上皮细胞发生转化,使其获得肿瘤细胞的形态和功能中发挥重要作用。促癌基因c-Myc位于8号染色体8q24.21位点,在早期应答中发挥重要作用。c-Myc过表达可使细胞出现无限增殖、分化以及恶性转化。研究发现,约30%的卵巢肿瘤存在c-Myc扩增。蛋白酪氨酸激酶（protein tyrosine kinase,PTK2）,又称局灶性粘附激酶（focal adhesion kinase,FAK）,位于染色体8q24.3位点。PTK2在人类多种实体瘤中表达上调,发挥着促癌的作用。研究发现,PTK2过表达与p53突变在人乳腺癌中高度相关,PTK2 N端结构域与p53 N端反式激活结构域可相互作用。PTK2和c-Myc协同调控肿瘤细胞侵袭,抑制整合素/PTK2信号轴和c-Myc可以协同调控卵巢癌恶性生物学行为。有趣的是,我们分析了癌症基因组图谱（the cancer genome atlas,TCGA）,发现在同一组卵巢浆液性癌患者中,包括PTK2、c-Myc和p53在内的三种基因同时发生异常改变,其中88%的卵巢癌患者p53基因发生突变,45%的卵巢癌患者c-Myc基因上调或扩增,同时,超过60%的卵巢癌患者PTK2上调或扩增。因此,我们提出猜想,在p53功能缺陷(p53-/-)的小鼠卵巢上皮细胞中,将癌基因c-Myc和PTK2同时过表达（p53敲除+c-Myc过表达+PTK2过表达）,是否可以促使卵巢上皮细胞发生转化,使其获得卵巢癌恶性生物学功能,是否可以模拟卵巢癌的发生和进展过程,形成卵巢癌细胞?如果该细胞株构建成功,希望能广泛应用于人类卵巢上皮性癌起始和转移的分子机制研究。本研究试图通过基因修饰构建一种小鼠卵巢癌细胞株。课题组利用CRISPR/Cas9系统敲除p53基因,构建了p53敲除质粒,同时构建了c-Myc和PTK2过表达质粒,本研究利用慢病毒载体系统包装质粒并将修饰后的目的基因,以单个或组合方式转染小鼠卵巢上皮细胞,观察其细胞功能性改变,将具有潜在肿瘤生成作用的细胞株种植到小鼠卵巢组织内,建立小鼠卵巢癌模型,进一步观察其在小鼠体内的成瘤效果和肿瘤转移情况。卵巢癌的分子靶向治疗近年来引起人们的广泛关注以及深入研究。基于本课题以上研究,我们看到PTK2在卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭中发挥重要作用,那么,以PTK2为治疗靶点的研究将指导我们更好地理解卵巢癌发生和发展的过程,为卵巢癌的分子靶向治疗带来新的思路。GSK2256098是一种靶向抑制PTK2激酶活性以及Y397位点磷酸化的小分子抑制剂。本研究利用CRISPR/Cas9系统敲除PTK2基因,同时选用GSK2256098靶向抑制PTK2 Y397位点的磷酸化,首次评估敲除和靶向抑制PTK2对卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭等细胞生物学行为的影响及可能机制,以及对卵巢癌小鼠原位移植瘤形成和转移的作用。通过以上研究,希望为卵巢癌的分子靶向治疗及分子机制研究提供研究基础和理论支持。本课题分为三个部分,对以上内容进行探讨。第一部分基因修饰小鼠卵巢癌细胞株的构建目的本部分旨在构建小鼠卵巢癌细胞株,并利用该细胞株建立小鼠卵巢原位移植瘤模型进行功能验证。材料与方法1.材料1.1细胞株:C57BL/6小鼠卵巢上皮细胞,购自美国Cell Biologics公司。1.2质粒:在实验前期,课题组成功构建了p53基因敲除质粒、c-Myc基因过表达质粒以及PTK2基因过表达质粒。1.3动物:选用4周大小的NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/Sz J（NSG）免疫缺陷雌性小鼠,购自Jackson实验室。2.方法2.1将成功构建的质粒进行转化和提取,利用慢病毒载体系统包装p53敲除质粒、c-Myc过表达质粒以及PTK2过表达质粒。2.2建立稳定转染细胞株及分组将包装后的质粒以单个、两两组合、三者组合的形式分别转染正常小鼠卵巢上皮细胞,共分为8组:p53敲除组(p53-/-组)、c-Myc过表达组（c-Myc组）、PTK2过表达组（PTK2组）、p53敲除+c-Myc过表达组(p53-/-+c-Myc组)、p53敲除+PTK2过表达组(p53-/-+PTK2组)、PTK2过表达+c-Myc过表达组（PTK2+c-Myc组）、p53敲除+c-Myc过表达+PTK2过表达组(p53-/-+c-Myc+PTK2组)以及空质粒载体转染组（对照组）。Western blot方法检测8组细胞p53、c-Myc以及PTK2蛋白水平。2.3 MTT方法、单层细胞克隆形成试验和软琼脂细胞克隆形成试验检测8组基因修饰小鼠卵巢上皮细胞增殖能力和细胞克隆形成能力。细胞迁移和侵袭实验检测8组基因修饰细胞迁移和侵袭能力。2.4筛选出具有潜在肿瘤生成能力的基因修饰细胞株,将该组细胞种植到免疫缺陷NSG小鼠卵巢组织,观察其成瘤效果及转移情况。2.5采用SPSS 22.0进行统计分析,结果统计采用（x±s）表示,进行正态性检验,两组比较采用独立样本t检验,超过两组采用单因素方差分析。以α=0.05为检验水准。结果1 PTK2、c-Myc和p53蛋白在基因修饰小鼠卵巢上皮细胞株的表达与对照组（0.06±0.02）相比,PTK2蛋白在PTK2组（1.22±0.11）、PTK2+c-Myc组（1.11±0.11）、p53-/-+PTK2组（0.86±0.09）及p53-/-+c-Myc+PTK2组（1.34±0.16）基因修饰细胞株表达水平升高,差异均具有统计学意义（P<0.001）。与对照组（0.08±0.02）相比,c-Myc蛋白在c-Myc组（0.56±0.04）、PTK2+c-Myc组（1.01±0.12）、p53-/-+c-Myc组（0.76±0.09）及p53-/-+c-Myc+PTK2组（1.23±0.15）基因修饰细胞株表达水平升高,差异均具有统计学意义（P<0.001）。与对照组（0.45±0.05）相比,p53蛋白在p53-/-组（0.01±0.01）、p53-/-+c-Myc组（0.02±0.01）、p53-/-+PTK2组（0.03±0.01）及p53-/-+c-Myc+PTK2组（0.04±0.01）基因修饰细胞株表达水平下降,差异均具有统计学意义（P<0.001）。2基因修饰小鼠卵巢上皮细胞增殖能力与对照组及其他6组基因修饰细胞相比,p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞增殖能力显着上升,差异具有统计学意义（P<0.01）。与对照组相比,p53-/-+PTK2组、p53-/-+c-Myc组及PTK2+c-Myc组细胞增殖能力上升（P<0.01）。与对照组相比,p53-/-组、c-Myc组及PTK2组细胞增殖能力在整个测定期内均无统计学差异（P>0.05）。3基因修饰小鼠卵巢上皮细胞克隆形成结果与对照组（4.33±1.53）及其他6组基因修饰细胞相比,p53-/-+c-Myc+PTK2组单层细胞克隆形成数量（93.67±6.11）显着增加（P<0.001）。与对照组（4.33±1.53）相比,p53-/-组（15.00±0.07）、p53-/-+PTK2组（23.33±3.06）及p53-/-+c-Myc组（36.00±2.65）单层细胞克隆形成数量增加,差异有统计学意义（P<0.01）。与对照组相比,PTK2+c-Myc组、PTK2组及c-Myc组单层细胞克隆形成数量无明显增加,差异无统计学意义（P>0.05）。与对照组（6.67±1.53）及其他6组基因修饰细胞相比,p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞软琼脂中克隆形成数量显着增加（82.67±6.81）,差异有统计学意义（P<0.001）。与对照组相比,其他6组基因修饰细胞软琼脂中克隆形成数量无明显增加,差异无统计学意义（P>0.05）。4基因修饰小鼠卵巢上皮细胞迁移和侵袭结果与对照组（16.00±1.00）及其他6组基因修饰细胞相比,p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞迁移数量（85.33±5.03）显着增加,差异有统计学意义（P<0.001）。与对照组（16.00±1.00）相比,p53-/-+PTK2组（26.00±2.00）和p53-/-+c-Myc组（34.00±3.60）细胞迁移数量增加（P<0.01）。与对照组（16.00±1.00）相比,p53-/-组（15.33±1.53）、PTK2组（14.00±2.00）、c-Myc组（18.67±2.08）及PTK2+c-Myc组（17.33±1.53）细胞迁移数量无明显增加,差异无统计学意义（P>0.05）。与对照组（11.00±1.00）及其他6组基因修饰小鼠卵巢上皮细胞株相比,p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞侵袭数量（60.30±6.11）显着增加,差异有统计学意义（P<0.001）。与对照组（11.00±1.00）相比,p53-/-组（20.33±2.52）、PTK2+c-Myc组（21.00±3.46）、p53-/-+PTK2组（20.67±3.06）及p53-/-+c-Myc组（21.00±2.65）细胞侵袭数量增加（P<0.05）。与对照组（11.00±1.00）相比,PTK2组（12.33±0.58）和c-Myc组（14.00±1.00）细胞侵袭数量无明显增加,差异无统计学意义（P>0.05）。5基因修饰小鼠卵巢上皮细胞株的筛选诱发小鼠原代细胞发生转化,使其获得肿瘤细胞特征,能在悬浮状态下成簇生长是本研究能否成功的关键。p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞增殖能力、细胞克隆形成能力、迁移能力、侵袭能力显着高于对照组和其他6组基因修饰细胞株（P<0.01）。虽然p53-/-+PTK2组和p53-/-+c-Myc组单层细胞克隆形成、细胞侵袭和迁移数量高于对照组（P<0.05）,然而p53-/-+PTK2和p53-/-+c-Myc组软琼脂细胞克隆形成数量与单基因修饰组相比,无统计学差异（P>0.05）,而p53-/-+c-Myc+PTK2组软琼脂细胞克隆形成数量显着多于其他各组（P<0.001）。软琼脂中克隆形成试验结果可以反应细胞锚定非依赖性生长能力,即悬浮状态下细胞成簇生长能力,可以作为评判细胞是否具有肿瘤生长特性的金标准。结果说明只有p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞获得了肿瘤细胞锚定非依赖性生长的特性。因此,我们认为在8组基因修饰组合细胞中,p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞具有潜在成瘤能力,本课题筛选出p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞株进行小鼠卵巢原位移植瘤模型构建。6荧光素酶基因标记小鼠卵巢上皮细胞利用慢病毒载体包装荧光素酶基因,分别转染正常小鼠卵巢上皮细胞和p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞株,传代培养后测定细胞荧光强度值,结果显示两组细胞的荧光值均大于106,说明荧光素酶基因已经整合到小鼠细胞DNA中,可以进行后续移植瘤模型的构建。7基因修饰p53-/-+c-Myc+PTK2细胞在NSG小鼠成瘤将p53-/-+c-Myc+PTK2细胞在显微镜下种植到NSG小鼠单侧卵巢组织,构建小鼠卵巢原位移植瘤模型。每周进行荧光强度值监测,12周后可以观察到基因修饰p53-/-+c-Myc+PTK2小鼠卵巢组织形成肿瘤。处死小鼠,发现基因修饰p53-/-+c-Myc+PTK2小鼠出现血性腹水。剥离卵巢,发现卵巢组织周围出现肿瘤组织。查看肿瘤转移情况,发现p53-/-+c-Myc+PTK2组小鼠出现广泛腹腔转移,转移的脏器包括肝脏、脾脏和肠等。结论本部分成功构建了p53-/-+c-Myc+PTK2细胞株,并应用p53-/-+c-Myc+PTK2细胞株成功建立了小鼠卵巢癌模型,模拟了卵巢癌体内形成和转移的过程,该细胞株有望用于卵巢癌发生和发展的分子机制研究。第二部分PTK2在卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭中的作用研究目的研究PTK2在卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭等生物学行为中的作用。材料与方法1材料1.1细胞株:SKOV3、OVCAR8细胞购于美国菌种中心。1.2质粒:PTK2基因敲除质粒。2方法2.1统计分析Kaplan Meir Plot数据库PTK2在卵巢癌组织中的表达情况及与预后的关系;采用免疫荧光方法检测卵巢癌组织及癌旁组织中PTK2的表达。2.2利用慢病毒载体包装PTK2基因敲除质粒。建立PTK2基因敲除质粒稳定转染细胞株,对照组为空质粒转染组。同时采用小分子抑制剂GSK2256098抑制PTK2关键激活位点（p-FAK）Y397,进行靶向抑制PTK2活化,对照组为DMSO对照。2.3敲除PTK2或使用GSK2256098抑制PTK2活性后,MTT方法、细胞克隆形成实验检测细胞增殖、克隆形成能力变化情况。Transwell迁移/侵袭实验检测细胞迁移和侵袭能力变化情况。2.4统计方法见第一部分。结果1 PTK2在卵巢癌组织中高表达且与卵巢癌患者预后相关PTK2高表达组患者生存期显着低于PTK2低表达组（P<0.05）。PTK2在肿瘤细胞胞浆中强染色,与癌旁组织相比,PTK2在卵巢癌组织中高表达。2敲除PTK2或使用GSK2256098抑制PTK2活性后,降低卵巢癌细胞中PTK2蛋白及磷酸化水平敲除PTK2基因,在SKOV3和OVCAR8细胞系中均检测不到PTK2的表达。检测GSK2256098对PTK2的主要激活位点Y397的抑制效果,GSK2256098给药浓度分别为0、5、10、20、40μmol/L,作用时间24 h。与对照组相比,当GSK2256098浓度为40μmol/L时对卵巢癌细胞中p-FAK抑制效果显着,差异具有统计学意义（P<0.001）。3敲除PTK2或使用GSK2256098抑制PTK2活性后,降低卵巢癌细胞的增殖能力与敲除对照组相比,卵巢癌SKOV3和OVCAR8细胞的增殖能力在PTK2敲除组显着降低（P<0.05）。与加药对照组相比,卵巢癌SKOV3和OVCAR8细胞的增殖能力在GSK2256098组显着降低（P<0.05）。4敲除PTK2或使用GSK2256098抑制PTK2活性后,降低卵巢癌细胞的克隆形成能力与敲除对照组（75.67±5.50）、（46.33±6.50）相比,PTK2敲除组SKOV3和OVCAR8细胞单层克隆形成数量（18.67±4.50）、（11.00±4.60）显着降低（P<0.05）。与加药对照组（53.67±4.16）、（34.00±4.00）相比,GSK2256098组SKOV3和OVCAR8细胞单层克隆形成数量（17.00±4.00）、（13.7±4.04）显着降低（P<0.05）。5敲除PTK2或使用GSK2256098抑制PTK2活性后,降低卵巢癌细胞的迁移和侵袭能力与敲除对照组（106.30±8.50）、（39.67±8.08）相比,PTK2敲除组SKOV3和OVCAR8细胞迁移数量（43.70±8.50）、（20.67±4.51）显着降低（P<0.05）。与加药对照组（73.33±8.02）、（55.00±7.21）相比,GSK2256098组SKOV3和OVCAR8细胞迁移数量（27.67±3.51）、（28.00±7.00）显着降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。细胞侵袭实验结果表明,与敲除对照组（79.33±6.03）、（42.00±4.58）相比,PTK2敲除组SKOV3和OVCAR8细胞侵袭数量（19.00±2.00）、（23.00±3.00）显着降低（P<0.05）。与加药对照组（80.30±8.96）、（36.33±5.69）相比,GSK2256098组SKOV3和OVCAR8细胞侵袭数量（22.67±2.52）、（18.33±2.52）显着降低（P<0.05）。结论PTK2在卵巢癌中发挥促癌作用;PTK2敲除或靶向抑制降低了卵巢癌细胞的增殖、克隆形成、迁移和侵袭能力;PTK2有望成为卵巢癌的早期治疗靶点。第三部分PTK2在卵巢癌小鼠原位移植瘤形成和转移中的作用研究目的研究PTK2在卵巢癌小鼠原位移植瘤形成和转移中的作用。材料与方法1材料动物:实验选用4周大小的NSG免疫缺陷雌性小鼠。2方法2.1敲除PTK2基因后,构建人卵巢癌SKOV3细胞NSG免疫缺陷小鼠原位移植瘤模型,每周使用Xenogen在体成像系统监测肿瘤生长和转移情况。2.2将人卵巢癌细胞OVCAR8种植到小鼠卵巢组织,随机分成两组,一组采用GSK2256098治疗（灌胃,75 mg/kg/d,每周治疗5天,共4周）,另一组采用DMSO进行对照治疗,每周使用Xenogen在体成像系统监测肿瘤生长和转移情况。2.3统计方法同第一部分。结果1 PTK2敲除后抑制卵巢癌小鼠原位移植瘤形成和转移与敲除对照组相比,PTK2敲除组卵巢肿瘤组织平均最大荧光强度值显着降低（P<0.001）。分离肿瘤组织,与敲除对照组相比,PTK2敲除组小鼠卵巢肿瘤组织重量显着降低（P<0.001）。对照组小鼠肝脏、脾脏和肠等多个器官均出现肿瘤组织转移,而PTK2敲除组小鼠未发现肿瘤组织转移情况。2抑制PTK2活性后降低卵巢癌小鼠原位移植瘤形成和转移与治疗对照组相比,GSK2256098治疗组小鼠卵巢肿瘤组织平均最大荧光强度值显着降低（P<0.001）。分离小鼠肿瘤组织,与治疗对照组相比,GSK2256098治疗组小鼠原位卵巢肿瘤组织重量显着降低（P<0.001）。治疗对照组出现肝脏、脾脏及肠肿瘤组织转移,而GSK2256098治疗组未发现肿瘤组织转移现象。结论PTK2敲除或靶向抑制降低卵巢癌小鼠原位移植瘤的形成和转移能力
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本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 文献研究 |
| 第一章 中医对结直肠癌病因病机及治疗的认识 |
| 1. 引言 |
| 2. 病症名称的历史沿革 |
| 3. 结直肠癌病因病机 |
| 4. 结直肠癌中医证候研究现状 |
| 5. 结直肠癌中医药治疗 |
| 6. 单味中药及其主要成分治疗结直肠癌的实验研究 |
| 7. 展望 |
| 参考文献 |
| 第二章 川芎研究概述 |
| 1. 引言 |
| 2. 川芎的历史沿革 |
| 3. 川芎的功效与应用 |
| 4. 川芎主要有效成分川芎嗪的药理作用及临床外科应用 |
| 5. 展望 |
| 参考文献 |
| 第三章 川芎嗪在消化系统肿瘤中的抗癌机制研究进展 |
| 1. 引言 |
| 2. 抑制肿瘤细胞增殖 |
| 3. 促进肿瘤细胞凋亡和自噬 |
| 4. 诱导肿瘤细胞活性氧的生成 |
| 5. 抑制肿瘤细胞侵袭与转移 |
| 6. 抑制肿瘤组织血管生成 |
| 7. 逆转肿瘤细胞多药耐药 |
| 8. 展望 |
| 参考文献 |
| 第四章 活性氧信号通路与肿瘤的研究进展 |
| 1. 引言 |
| 2. ROS的来源与调节 |
| 2.1 ROS的来源 |
| 2.2 ROS的调节 |
| 3. ROS相关信号通路 |
| 3.1 ROS促进细胞增殖 |
| 3.2 DNA损伤和遗传不稳定 |
| 3.3 适应性 |
| 3.4 细胞死亡 |
| 3.5 自噬 |
| 3.6 抗药性 |
| 4. ROS在肿瘤治疗中的作用 |
| 4.1 诱导肿瘤细胞死亡 |
| 4.2 抑制肿瘤细胞增殖 |
| 5. 展望 |
| 参考文献 |
| 第二部分 川芎嗪对结肠癌细胞增殖及凋亡的影响 |
| 引言 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验细胞 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要试剂配制 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 细胞形态学实验 |
| 2.3 结晶紫染色测定细胞活性 |
| 2.4 CCK-8法检测细胞增殖 |
| 2.5 细胞周期检测 |
| 2.6 Annexin V/PI凋亡检测 |
| 2.7 统计学分析 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1 TMP显着抑制结肠癌细胞增殖 |
| 3.2 TMP对结肠癌细胞的抑制作用具有浓度和时间依赖性 |
| 3.3 TMP通过抑制结肠癌细胞周期S期合成抑制细胞增殖 |
| 3.4 TMP诱导结肠癌细胞发生凋亡 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 活性氧对川芎嗪诱导的结肠癌细胞凋亡的调控机制研究 |
| 引言 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验细胞 |
| 1.2 主要实验试剂 |
| 1.3 主要试剂配制 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 DCFH-DA探针细胞内ROS检测 |
| 2.2 蛋白印迹实验（Western blot) |
| 2.3 统计学分析 |
| 3. 结果 |
| 3.1 TMP通过促进细胞内ROS产生来诱导结肠癌细胞发生凋亡 |
| 3.2 使用DCFH-DA探针检测结肠癌细胞内ROS的变化情况 |
| 3.3 TMP通过ROS介导结肠癌细胞发生线粒体途径凋亡 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 参考文献 |
| 第四部分 川芎嗪在裸鼠移植肿瘤中诱导凋亡作用 |
| 引言 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 主要材料 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 裸鼠移植肿瘤模型 |
| 2.2 丙二醛(MDA)检测 |
| 2.3 Caspase 3和Caspase 9蛋白活性检测 |
| 2.4 统计学分析 |
| 3. 结果 |
| 3.1 TMP在裸鼠移植肿瘤中具有抑制肿瘤增殖的效果 |
| 3.2 TMP增加裸鼠移植肿瘤内ROS积累并诱导凋亡 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 总结与展望 |
| 附录 |
| 攻读博士期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 综述 |
| 1.1 病态窦房结综合征研究现状 |
| 1.1.1 病态窦房结综合征的发病机制研究 |
| 1.1.2 SSS的分型与临床表现 |
| 1.1.3 SSS的西医治疗 |
| 1.1.4 SSS的中医学研究现状 |
| 1.2 麻黄附子细辛汤研究现状 |
| 1.2.1 麻黄附子细辛汤的现代药理作用研究 |
| 1.2.2 麻黄附子细辛汤在SSS治疗中的应用 |
| 1.3 网络药理学简介及其在中医药研究中的应用 |
| 1.3.1 网络药理学概述 |
| 1.3.2 网络药理学常用数据库及研究方法 |
| 1.3.3 网络药理学与中医药研究 |
| 第二章 基于网络药理学探究麻黄附子细辛汤治疗病态窦房结综合征的显效成分和作用机制 |
| 2.1 数据收集与研究方法 |
| 2.1.1 流程图 |
| 2.1.2 数据收集 |
| 2.1.3 网络构建与分析 |
| 2.1.4 分子对接验证 |
| 2.1.5 靶点通路注释分析 |
| 2.2 研究结果 |
| 2.2.1 构建麻黄附子细辛汤化学成分及潜在靶点数据集 |
| 2.2.2 构建SSS相关的疾病靶点数据集 |
| 2.2.3 麻黄附子细辛汤化学成分潜在靶点与SSS相关靶点的交集基因 |
| 2.2.4 麻黄附子细辛汤-化学成分-靶点-SSS网络及显效成分 |
| 2.2.5 麻黄附子细辛汤治疗SSS的关键化学成分和核心靶点 |
| 2.2.6 分子对接结果 |
| 2.2.7 靶点通路注释分析 |
| 2.3 分析与结论 |
| 2.3.1 麻黄附子细辛汤治疗SSS的显效成分分析 |
| 2.3.2 麻黄附子细辛汤治疗SSS的关键成分和核心靶点分析 |
| 2.3.3 靶点通路注释分析 |
| 2.3.4 结论 |
| 2.3.5 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 内容提要 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 选题背景及研究意义 |
| 1.1.1 选题背景 |
| 1.1.2 研究意义 |
| 1.2 研究思路与主要内容 |
| 1.3 研究创新点和尚待解决的问题 |
| 1.3.1 主要创新点 |
| 1.3.2 尚待解决的问题 |
| 第2章 国内外文献综述 |
| 2.1 肾结石疾病的概述 |
| 2.1.1 肾结石疾病的统计分析 |
| 2.1.2 肾结石疾病的遗传特征研究进展 |
| 2.1.3 肾结石形成发展的分子机制研究进展 |
| 2.2 肾结石多组学整合研究 |
| 2.2.1 肾结石基因组学研究进展 |
| 2.2.2 肾结石转录组学研究进展 |
| 2.2.3 肾结石蛋白质组学研究进展 |
| 2.3 内质网应激和CAV1-EGFR-AKT信号通路 |
| 2.3.1 内质网应激介导泛素化-蛋白酶体降解引起细胞凋亡 |
| 2.3.2 CAV1-EGFR-AKT信号通路对细胞凋亡的调控作用 |
| 第3章 肾结石蛋白质组学网络分析揭示内质网应激在肾结石发生中的作用 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与方法 |
| 3.2.1 数据来源 |
| 3.2.2 肾结石相关蛋白相互作用网络构建及关键蛋白的获取 |
| 3.2.3 肾结石相关核心蛋白聚类分析 |
| 3.3 实验结果与讨论 |
| 3.3.1 肾结石相关蛋白质数据集的构建 |
| 3.3.2 含有31个关键蛋白的340个肾结石相关蛋白参与直接相互作用网络 |
| 3.3.3 内质网应激是结晶——细胞相互作用中的关键生物学进程 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 草酸钙肾结石引起内质网应激导致晶体细胞黏着的分子机制研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 细胞实验材料 |
| 4.2.2 动物实验材料 |
| 4.3 试剂配制 |
| 4.3.1 细胞培养基的配制 |
| 4.3.2 细胞冻存液 |
| 4.3.3 PBS的配制 |
| 4.3.4 一水草酸钙母液及工作液的配制 |
| 4.3.5 0.75%乙二醇(Ethylene glycol,EG)的配制 |
| 4.4 实验方法 |
| 4.4.1 HK2细胞复苏、传代及冻存 |
| 4.4.2 HK2细胞计数 |
| 4.4.3 动物实验 |
| 4.4.4 总RNA提取及逆转录 |
| 4.4.5 半定量PCR反应 |
| 4.4.6 Western Blot检测蛋白表达量 |
| 4.4.7 TUNEL实验检测细胞凋亡 |
| 4.4.8 MMT实验检测细胞活力 |
| 4.4.9 原子吸收实验检测细胞表面钙离子残留浓度 |
| 4.4.10 统计学分析 |
| 4.5 实验结果与讨论 |
| 4.5.1 草酸钙刺激诱导HK2细胞发生内质网应激 |
| 4.5.2 草酸钙结晶通过三条信号通路激活内质网应激 |
| 4.5.3 草酸钙刺激通过激活内质网应激特异性Caspase蛋白Caspase12诱导细胞凋亡 |
| 4.5.4 内质网应激作用影响结晶——细胞黏着 |
| 4.5.5 结晶形成的大鼠肾组织发生内质网应激 |
| 4.6 讨论 |
| 第5章 肾结石基因组和转录组学联合分析揭示CAV1-EGFR-AKT信号通路的损伤促进肾结石形成 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料与方法 |
| 5.2.1 肾结石多组学数据的获取 |
| 5.2.2 肾结石多组学数据的处理 |
| 5.2.3 肾结石基因组学及转录组学相互作用网络构建及关键蛋白的获取 |
| 5.2.4 肾结石基因组学转录组学关键细胞信号转导通路的获取 |
| 5.2.5 肾结石基因组学和转录组学关键蛋白及关键细胞信号转导通路整合分析 |
| 5.3 实验结果与讨论 |
| 5.3.1 获得基因组水平肾结石相关基因 |
| 5.3.2 VSE显示肾结石相关SNP未富集到基因转录调控等功能区段 |
| 5.3.3 转录组水平肾结石相关差异基因的获取 |
| 5.3.4 基因组水平肾结石网络分析 |
| 5.3.5 转录组水平肾结石网络分析 |
| 5.3.6 基因组水平肾结石风险基因的核心蛋白KEGG pathway分析 |
| 5.3.7 转录组水平肾结石差异基因的核心蛋白KEGG pathway分析 |
| 5.3.8 基因组、转录组肾结石网络整合分析 |
| 5.4 讨论 |
| 第6章 草酸钙肾结石通过CAV1-EGFR-AKT信号通路诱导细胞凋亡促进肾结石形成的分子机制研究 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 实验材料 |
| 6.2.1 细胞实验材料 |
| 6.2.2 动物实验材料 |
| 6.3 试剂配制 |
| 6.3.1 细胞培养基、冻存液及PBS等的配制 |
| 6.3.2 台盼蓝溶液配制 |
| 6.3.3 MG132的配制 |
| 6.4 实验方法 |
| 6.4.1 HK2细胞复苏、传代及冻存 |
| 6.4.2 HK2细胞计数 |
| 6.4.3 台盼蓝染色 |
| 6.4.4 TUNEL实验检测细胞凋亡 |
| 6.4.5 细胞免疫荧光检测蛋白表达 |
| 6.4.6 总RNA提取及逆转录 |
| 6.4.7 实时定量荧光PCR反应(RT-PCR) |
| 6.4.8 Western blot检测蛋白表达量 |
| 6.4.9 CAV1腺病毒过表达 |
| 6.4.10 原子吸收实验检测钙离子浓度 |
| 6.4.11 动物实验 |
| 6.4.12 统计学分析 |
| 6.5 实验结果与讨论 |
| 6.5.1 草酸钙刺激导致HK2细胞凋亡 |
| 6.5.2 草酸钙刺激后HK2细胞CAV1-EGFR-AKT生存信号通路受损 |
| 6.5.3 过表达CAV1 逆转细胞凋亡并降低结晶——细胞黏着 |
| 6.5.4 结晶形成的大鼠肾组织CAV1-EGFR-AKT信号通路受损 |
| 6.5.5 草酸钙刺激导致内质网应激引起泛素-蛋白酶体降解CAV1,EGFR |
| 6.5.6 结晶形成的大鼠肾组织炎症发生 |
| 6.6 讨论 |
| 第7章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1 肾结石相关蛋白质数据集 |
| 附录2 SNP映射基因表 |
| 附录3 肾结石Microarray N&C组上调差异基因表 |
| 附录4 肾结石Microarray N&C组下调差异基因表 |
| 附录5 肾结石Microarray P&C组上调差异基因表 |
| 附录6 肾结石Microarray P&C组下调差异基因表 |
| 攻读学位期间发表的学术论文及取得的科研成果 |
| 致谢 |
| 符号说明 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 文献综述 |
| 1.1 肺癌的研究进展 |
| 1.2 肺癌的发病机制 |
| 1.2.1 性别因素 |
| 1.2.2 吸烟 |
| 1.2.3 环境污染因素 |
| 1.2.4 饮食习惯因素 |
| 1.3 肺癌的治疗方法 |
| 1.3.1 手术治疗 |
| 1.3.2 化学治疗 |
| 1.3.3 放射治疗 |
| 1.3.4 分子靶向治疗 |
| 1.4 细胞凋亡和相关信号通路 |
| 1.4.1 细胞凋亡 |
| 1.4.2 活性氧簇 |
| 1.4.3 MAPK信号通路 |
| 1.4.4 STAT3 信号通路 |
| 1.4.5 NF-κB信号通路 |
| 1.5 大豆苷元(DAI)及其药理活性 |
| 1.5.1 抗骨质疏松 |
| 1.5.2 心脑血管保护作用 |
| 1.5.3 降血脂作用 |
| 1.5.4 抗癌作用 |
| 1.5.5 雌激素样作用 |
| 1.6 目的及意义 |
| 1.7 技术路线 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 肺癌细胞系及正常细胞系 |
| 2.1.2 主要实验试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.2 细胞的传代培养及体外扩增 |
| 2.3 CCK-8 实验 |
| 2.4 Hoechst33342 染色法 |
| 2.5 流式细胞术(FCM) |
| 2.6 线粒体膜电位(JC-1)检测法 |
| 2.7 活性氧(ROS)水平检测 |
| 2.8 蛋白质免疫印迹法(western blot) |
| 2.9 细胞划痕实验 |
| 2.10 统计学分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 细胞存活率结果分析 |
| 3.2 DAI对A549 细胞的凋亡作用的分析 |
| 3.2.1 Hoechst33342/PI染色法观察细胞凋亡情况 |
| 3.2.2 AnnexinⅤ-FITC/PI双染法检测细胞凋亡数量 |
| 3.2.3 JC-1 染色法检测细胞线粒体膜电位变化 |
| 3.2.4 DAI对细胞凋亡蛋白表达量的影响 |
| 3.3 DAI对人肺癌A549 细胞周期调控机制 |
| 3.4 DAI对人肺癌A549 细胞内MAPK/NF-κB/STAT3 凋亡相关信号通路的调控机制 |
| 3.5 DAI调控ROS水平诱导人肺癌A549 细胞凋亡 |
| 3.5.1 FCM检测DAI对 A549 细胞内ROS水平的影响 |
| 3.5.2 FCM检测DAI对人正常肝L-02 细胞内ROS水平的影响 |
| 3.5.3 FCM检测ROS积累对A549 细胞凋亡的影响 |
| 3.6 DAI抑制人肺癌A549 细胞迁移作用 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 研究现状 |
| 1.1.1 TPSD1研究现状 |
| 1.1.2 UNG研究现状 |
| 1.2 研究方法和原始结果 |
| 1.2.1 数据来源和方法 |
| 1.2.2 TPSD1网络构建 |
| 1.2.3 UNG网络构建 |
| 1.3 问题提出和解决方案 |
| 1.3.1 TPSD1和UNG有丝分裂差异 |
| 1.3.2 TPSD1和UNG神经内分泌和先天性免疫反应差异 |
| 1.3.3 TPSD1和UNG炎症反应差异 |
| 1.4 论文的课题来源和创新点 |
| 1.5 论文的主要内容和结构安排 |
| 第二章 TPSD1知识和分子网络 |
| 2.1 TPSD1反馈激活网络 |
| 2.2 TPSD1上游激活网络 |
| 2.3 TPSD1下游激活网络 |
| 2.4 TPSD1反馈抑制网络 |
| 2.5 TPSD1上游抑制网络 |
| 2.6 TPSD1下游抑制网络 |
| 2.7 本章小结 |
| 第三章 UNG知识和分子网络 |
| 3.1 UNG反馈激活网络 |
| 3.2 UNG上游激活网络 |
| 3.3 UNG下游激活网络 |
| 3.4 UNG反馈抑制网络 |
| 3.5 UNG上游抑制网络 |
| 3.6 UNG下游抑制网络 |
| 3.7 本章小结 |
| 第四章 TPSD1与UNG网络比较 |
| 4.1 有丝分裂 |
| 4.1.1 TPSD1与有丝分裂抑制 |
| 4.1.2 UNG与有丝分裂激活 |
| 4.2 神经内分泌和先天性免疫反应 |
| 4.2.1 TPSD1与神经内分泌抑制 |
| 4.2.2 UNG与先天性免疫反应抑制 |
| 4.3 炎症反应 |
| 4.3.1 TPSD1与炎症反应激活 |
| 4.3.2 UNG与炎症反应抑制 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 总结与展望 |
| 5.1 总结 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 山核桃 |
| 1.1.1 山核桃概述 |
| 1.1.2 山核桃主要成分及功能 |
| 1.1.3 山核桃青皮中主要活性成分的抗癌机制 |
| 1.2 多组学探究植物生长机制 |
| 1.2.1 转录组学与植物生长 |
| 1.2.2 代谢组学与植物生长 |
| 1.3 子宫内膜癌 |
| 1.3.1 子宫内膜癌的现状 |
| 1.3.2 子宫内膜癌的发展机制 |
| 1.3.3 子宫内膜癌的治疗措施 |
| 1.3.4 子宫内膜癌细胞系研究的选择 |
| 1.4 多组学探究癌症机制 |
| 1.4.1 miRNA组学探究癌症机制 |
| 1.4.2 mRNA组学探究癌症机制 |
| 1.5 课题研究背景、意义及主要内容 |
| 1.5.1 课题研究背景、意义 |
| 1.5.2 课题研究主要内容 |
| 1.5.3 研究技术路线 |
| 第二章 不同发育期山核桃的转录组与代谢组分析 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 样本采集 |
| 2.1.2 实验试剂和仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 不同发育期山核桃仁总RNA的提取 |
| 2.2.2 RNA纯度及浓度检测 |
| 2.2.3 山核桃仁文库的制备和测序建立 |
| 2.2.4 生物信息学分析 |
| 2.2.5 基因功能注释和分类 |
| 2.2.6 基因总体表达水平分析 |
| 2.2.7 差异基因表达分析 |
| 2.2.8 代谢组学实验流程分析 |
| 2.2.9 代谢物提取 |
| 2.2.10 液相参数 |
| 2.2.11 质谱参数 |
| 2.2.12 代谢组学信息分析流程 |
| 2.2.13 代谢组学信息分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 山核桃仁转录组测序质控分析 |
| 2.3.2 不同发育期山核桃仁基因组装结果分析 |
| 2.3.3 基因功能注释和分类 |
| 2.3.4 基因总体表达水平分析 |
| 2.3.5 不同发育期差异基因表达分析 |
| 2.3.6 代谢物检测 |
| 2.3.7 代谢物检测质控 |
| 2.3.8 代谢物鉴定 |
| 2.3.9 不同发育期山核桃仁代谢物定量分析 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 基于转录组学与代谢组联合分析山核桃萜类化合物合成规律 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.1.3 实验仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 萜类化合物的提取 |
| 3.2.2 RNA提取和Illumine测序 |
| 3.2.3 山核桃基因组装,基因注释以及功能分析 |
| 3.2.4 脂质代谢差异表达基因的KEGG和GO分析 |
| 3.2.5 RNA提取 |
| 3.2.6 反转录 |
| 3.2.7 定量PCR实验 |
| 3.2.8 代谢物提取与分析 |
| 3.2.9 关键萜类代谢组学的靶向测定 |
| 3.2.10 代谢物和转录物的综合分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 萜类化合物含量的动态变化 |
| 3.3.2 萜类化合物代谢差异表达基因的KEGG和GO分析 |
| 3.3.3 萜类化合物生成 |
| 3.3.4 山核桃发育过程中的关键萜类代谢产物 |
| 3.3.5 代谢组与转录组共表达网络分析 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 山核桃青皮胡桃醌的制备及其Ishikawa细胞增殖的抑制作用 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 细胞株 |
| 4.1.2 实验试剂 |
| 4.1.3 实验仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 山核桃青皮提取 |
| 4.2.2 纯化样品检测鉴定 |
| 4.2.3 细胞培养 |
| 4.2.4 MTT细胞实验 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 胡桃醌的提取 |
| 4.3.2 胡桃醌纯化及检测 |
| 4.3.3 胡桃醌对Ishikawa细胞增殖的抑制作用 |
| 4.3.4 胡桃醌对Ishikawa细胞形态的影响 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 转录组学与miRNA联合分析胡桃醌对Ishikawa细胞抑制作用的机制 |
| 5.1 实验材料与方法 |
| 5.1.1 实验材料与试剂 |
| 5.1.2 细胞处理 |
| 5.1.3 制备文库和测序 |
| 5.1.4 测序信息分析 |
| 5.1.5 mRNA和 miRNA的提取 |
| 5.1.6 mRNA和 miRNA的反转录 |
| 5.1.7 mRNA和 miRNA的荧光定量PCR检测 |
| 5.1.8 功能和途径富集分析 |
| 5.1.9 PPI网络建立及模块分析 |
| 5.1.10 差异表达miRNA靶基因预测 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 总RNA质检分析 |
| 5.2.2 差异表达miRNA和mRNA分析 |
| 5.2.3 qRT-PCR检测差异表达miRNAs和差异表达基因的表达 |
| 5.2.4 差异表达基因的GO与 KEGG富集分析 |
| 5.2.5 PPI网络构建及模块分析 |
| 5.2.6 差异表达miRNA的靶基因预测 |
| 5.3 本章小结 |
| 第六章 胡桃醌诱导Ishikawa细胞凋亡及其机制 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.1.1 实验试剂 |
| 6.1.2 实验仪器 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 细胞培养 |
| 6.2.2 胡桃醌处理Ishikawa细胞 |
| 6.2.3 细胞周期检测 |
| 6.2.4 细胞凋亡荧光 Hoechst 33342/PI 双染 |
| 6.2.5 Annexin V-Alexa Fluor 488/PI 凋亡检测 |
| 6.2.6 活性氧检测 |
| 6.2.7 mRNA提取和定量PCR |
| 6.2.8 蛋白提取和 Western blot |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 胡桃醌对Ishikawa细胞周期的影响 |
| 6.3.2 胡桃醌对细胞凋亡形态学的影响 |
| 6.3.3 胡桃醌对Ishikawa细胞凋亡的影响 |
| 6.3.4 胡桃醌对线粒体途径影响 |
| 6.3.5 胡桃醌对死亡受体通路相关基因表达的影响 |
| 6.3.6 胡桃醌对细胞凋亡相关基因表达的影响 |
| 6.3.7 胡桃醌诱导ROS介导的Ishikawa细胞凋亡 |
| 6.4 本章小结 |
| 第七章 胡桃醌作为诱导剂诱导Ishikawa细胞铁自噬 |
| 7.1 实验材料 |
| 7.1.1 实验试剂 |
| 7.1.2 实验仪器 |
| 7.2 实验方法 |
| 7.2.1 细胞培养 |
| 7.2.2 细胞死亡检测 |
| 7.2.3 铁含量测定 |
| 7.2.4 丙二醛(MDA)测定 |
| 7.2.5 谷胱甘肽的测定 |
| 7.2.6 透射电镜观察 |
| 7.2.7 免疫荧光检测 |
| 7.2.8 细胞集落形成实验 |
| 7.2.9 细胞迁袭 |
| 7.2.10 转录组学分析 |
| 7.2.11 RNA提取和定量PCR实验 |
| 7.2.12 Western Blot实验 |
| 7.3 结果与分析 |
| 7.3.1 胡桃醌诱导Ishikawa细胞死亡 |
| 7.3.2 胡桃醌诱导Ishikawa细胞铁死亡 |
| 7.3.3 透射电镜显示胡桃醌诱导的铁自噬 |
| 7.3.4 胡桃醌诱导Ishikawa细胞铁自噬机制 |
| 7.3.5 胡桃醌抑制Ishikawa细胞的迁移和侵袭 |
| 7.3.6 胡桃醌诱导Ishikawa细胞内质网应激 |
| 7.4 本章小结 |
| 第八章 结论与展望 |
| 8.1 结论 |
| 8.2 创新点 |
| 8.3 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间的学术活动及成果情况 |
| 中英文缩略词对照表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 异叶青兰总黄酮体外抗氧化及对H9c2 心肌细胞的抗炎抗凋亡作用研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 主要试剂与仪器 |
| 1.3 实验方法与内容 |
| 1.4 统计方法 |
| 1.5 技术路线图 |
| 2 结果 |
| 2.1 总黄酮含量测定及方法学考察 |
| 2.2 异叶青兰总黄酮体外抗氧化活性测定 |
| 3 讨论 |
| 第二部分 异叶青兰总黄酮对LPS诱导的H9c2 细胞的影响及作用机制研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 主要试剂与仪器 |
| 1.3 实验内容与方法 |
| 1.4 统计分析 |
| 1.5 技术路线 |
| 2 结果 |
| 2.1 不同浓度异叶青兰总黄酮对H9c2 细胞细胞活力的影响 |
| 2.2 异叶青兰总黄酮对LPS诱导的H9c2 细胞炎症因子表达的影响 |
| 2.3 异叶青兰总黄酮对TLR4/My D88/NF-κB信号通路的影响 |
| 3 讨论 |
| 第三部分 异叶青兰总黄酮对H_2O_2诱导的H9c2 的影响的实验研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 试剂与仪器 |
| 1.3 实验内容与方法 |
| 1.4 统计分析 |
| 1.5 技术路线 |
| 2 结果 |
| 2.1 H_2O_2对H9c2 细胞存活率的影响 |
| 2.2 异叶青兰总黄酮对H_2O_2诱导的H9c2 细胞存活率的影响 |
| 2.3 异叶青兰总黄酮对H_2O_2诱导的H9c2 细胞形态的影响 |
| 2.4 细胞凋亡-Hoechst染色 |
| 2.5 线粒体膜电位(JC-1)检测 |
| 2.6 异叶青兰总黄酮对H_2O_2诱导的H9c2 凋亡蛋白的影响 |
| 3 讨论 |
| 小结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 心肌肥厚的分子机制及中药干预治疗的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
| 导师评阅表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 ILK表达与消化系统恶性肿瘤临床表型及预后相关性的Meta分析 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 检索数据库 |
| 1.2 文献纳入和排除标准 |
| 1.3 文献筛选和资料提取 |
| 1.4 研究方法学质量评价 |
| 1.5 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 ILK对食管鳞癌细胞恶性表型的功能影响 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 细胞系及来源 |
| 1.2 主要试剂和仪器 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 ILK对食管鳞癌体内成瘤性的影响及生物信息学分析 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 实验动物来源 |
| 1.2 主要试剂和仪器 |
| 1.3 实验方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 整合素连接激酶在肿瘤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间取得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 新疆医科大学博士研究生学位论文 导师评阅表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 拐枣概述 |
| 1.1.1 拐枣资源概况 |
| 1.1.2 拐枣的营养与药用价值 |
| 1.1.3 拐枣资源的利用现状及存在的问题 |
| 1.2 拐枣多糖研究进展 |
| 1.2.1 拐枣多糖的提取与分离纯化 |
| 1.2.2 拐枣多糖的结构解析 |
| 1.2.3 拐枣多糖的生物活性 |
| 1.3 植物多糖研究进展 |
| 1.3.1 植物多糖简介 |
| 1.3.2 植物多糖的提取与分离纯化 |
| 1.3.3 植物多糖的结构解析 |
| 1.4 糖尿病概述 |
| 1.4.1 糖尿病的分类 |
| 1.4.2 糖尿病并发症 |
| 1.4.3 糖尿病的治疗现状 |
| 1.4.4 植物多糖在糖尿病治疗中的作用 |
| 1.5 糖尿病发病机制的研究进展 |
| 1.5.1 糖尿病的研究模型 |
| 1.5.2 1型糖尿病的发病机制 |
| 1.5.3 2型糖尿病的发病机制 |
| 1.6 立题背景和意义 |
| 1.7 研究内容和技术路线 |
| 1.7.1 研究内容 |
| 1.7.2 技术路线 |
| 参考文献 |
| 第2章 三种提取工艺对拐枣多糖的理化性质和结构特性及生物活性的影响 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验仪器与设备 |
| 2.1.4 实验方法 |
| 2.2 分析方法 |
| 2.2.1 拐枣多糖样品总糖含量的测定 |
| 2.2.2 拐枣多糖样品蛋白质含量的测定 |
| 2.2.3 拐枣多糖样品糖醛酸含量的测定 |
| 2.2.4 拐枣多糖样品结构性质的测定 |
| 2.2.5 拐枣多糖样品对α-葡萄糖苷酶抑制率测定 |
| 2.2.6 拐枣多糖样品对Hep-G2胰岛素抵抗细胞葡萄糖摄取的测定 |
| 2.2.7 数据处理 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 三种提取工艺对拐枣多糖提取得率的影响 |
| 2.3.2 三种提取工艺对拐枣多糖化学成分组成的影响 |
| 2.3.3 三种提取工艺对拐枣多糖的单糖组成的影响 |
| 2.3.4 三种提取工艺对拐枣多糖分子量分布的影响 |
| 2.3.5 三种提取工艺对拐枣多糖红外光谱的影响 |
| 2.3.6 三种提取工艺对拐枣多糖热稳定性的影响 |
| 2.3.7 三种提取工艺对拐枣多糖的α-葡萄糖苷酶抑制活性的影响 |
| 2.3.8 三种提取工艺对拐枣多糖的Hep-G2细胞胰岛素抵抗模型葡萄糖摄取的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小节 |
| 参考文献 |
| 第3章 拐枣多糖的分离纯化和结构解析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.1.3 实验仪器与设备 |
| 3.1.4 实验方法 |
| 3.2 分析方法 |
| 3.2.1 拐枣多糖纯化组分的纯度鉴定及分子量测定 |
| 3.2.2 理化性质分析 |
| 3.2.3 单糖组成分析 |
| 3.2.4 傅里叶红外光谱(FT-IR)分析 |
| 3.2.5 紫外光谱分析 |
| 3.2.6 高碘酸氧化和Smith降解 |
| 3.2.7 甲基化分析 |
| 3.2.8 核磁共振波谱(NMR)分析 |
| 3.2.9 原子力显微镜(AFM)分析 |
| 3.2.10 X衍射(XRD)分析 |
| 3.2.11 数据处理 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 拐枣多糖的分离纯化 |
| 3.3.2 拐枣多糖纯化组分HDPs-2A的纯度鉴定及其分子量测定 |
| 3.3.3 拐枣多糖纯化组分HDPs-2A的化学组成分析 |
| 3.3.4 拐枣多糖纯化组分HDPs-2A的溶解性分析 |
| 3.3.5 拐枣多糖纯化组分HDPs-2A的单糖组成分析 |
| 3.3.6 拐枣多糖纯化组分HDPs-2A的红外光谱分析 |
| 3.3.7 拐枣多糖纯化组分HDPs-2A的紫外光谱分析 |
| 3.3.8 拐枣多糖纯化组分HDPs-2A的高碘酸氧化 |
| 3.3.9 拐枣多糖纯化组分HDPs-2A的 Smith降解 |
| 3.3.10 拐枣多糖纯化组分HDPs-2A的甲基化分析 |
| 3.3.11 拐枣多糖纯化组分HDPs-2A的核磁共振分析 |
| 3.3.12 拐枣多糖纯化组分HDPs-2A的原子力显微镜分析 |
| 3.3.13 拐枣多糖纯化组分HDPs-2A的 X衍射分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小节 |
| 参考文献 |
| 第4章 拐枣多糖HDPs-2A对1型糖尿病的降糖效果及机制研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料与动物 |
| 4.1.2 实验试剂 |
| 4.1.3 实验设备与仪器 |
| 4.1.4 实验方法 |
| 4.2 分析方法 |
| 4.2.1 糖尿病大鼠血清指标测定 |
| 4.2.2 口服葡萄糖耐量试验(Oral glucose tolerance test,OGTT) |
| 4.2.3 肝糖原水平的测定 |
| 4.2.4 胰腺组织相关指标的测定 |
| 4.2.5 RNA提取和实时荧光定量分析 |
| 4.2.6 Western blotting实验 |
| 4.2.7 数据处理 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 拐枣多糖HDPs-2A对1型糖尿病大鼠体重的影响 |
| 4.3.2 拐枣多糖HDPs-2A对1型糖尿病大鼠血糖的调节作用 |
| 4.3.3 拐枣多糖HDPs-2A对1型糖尿病大鼠血清血脂水平的影响 |
| 4.3.4 拐枣多糖HDPs-2A对1型糖尿病大鼠胰腺相关指标的影响 |
| 4.3.5 拐枣多糖HDPs-2A对1型糖尿病大鼠血清炎症因子水平的影响 |
| 4.3.6 拐枣多糖HDPs-2A对1型糖尿病大鼠胰腺相关基因及蛋白的影响 |
| 4.3.7 拐枣多糖HDPs-2A对1型糖尿病大鼠肝脏糖代谢相关基因及蛋白的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章小节 |
| 参考文献 |
| 第5章 拐枣多糖HDPs-2A对2型糖尿病的降糖效果及机制研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 实验材料与动物 |
| 5.1.2 实验试剂 |
| 5.1.3 实验设备与仪器 |
| 5.1.4 实验方法 |
| 5.2 分析方法 |
| 5.2.1 糖尿病大鼠血清指标测定 |
| 5.2.2 口服葡萄糖耐量试验(Oral glucose tolerance test,OGTT) |
| 5.2.3 肝脏相关指标的测定 |
| 5.2.4 粪便短链脂肪酸(Short chain fatty acid,SCFA)水平的测定 |
| 5.2.5 RNA提取和实时荧光定量分析 |
| 5.2.6 Western blotting实验 |
| 5.2.7 数据处理 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 拐枣多糖HDPs-2A对2型糖尿病大鼠体重的影响 |
| 5.3.2 拐枣多糖HDPs-2A对2型糖尿病大鼠血糖的调节作用 |
| 5.3.3 拐枣多糖HDPs-2A对2型糖尿病大鼠血清血脂水平的调节 |
| 5.3.4 拐枣多糖HDPs-2A对2 型糖尿病大鼠血清胰岛素和相关指数及血清GLP-1 的影响 |
| 5.3.5 拐枣多糖HDPs-2A对2型糖尿病大鼠肝脏相关指标的影响 |
| 5.3.6 拐枣多糖HDPs-2A对2 型糖尿病大鼠粪便短链脂肪酸(SCFAs)的影响 |
| 5.3.7 拐枣多糖HDPs-2A对2 型糖尿病大鼠肝脏PI3K/Akt胰岛素信号通路的影响 |
| 5.3.8 拐枣多糖HDPs-2A对2 型糖尿病大鼠肝脏AMPK介导相关信号通路的影响 |
| 5.3.9 拐枣多糖HDPs-2A对2 型糖尿病大鼠肝脏GS/GSK-3β信号通路的影响 |
| 5.3.10 拐枣多糖HDPs-2A对2 型糖尿病大鼠肝脏Fox O1 基因和蛋白表达的影响 |
| 5.3.11 拐枣多糖HDPs-2A对2 型糖尿病大鼠肝脏PPARγ/PGC-1α信号通路的影响 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 本章小节 |
| 参考文献 |
| 第6章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 论文创新点 |
| 6.3 展望 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 |
| 攻读博士学位期间退修文章 |
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 基因修饰小鼠卵巢癌细胞株的构建 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二部分 PTK2在卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭中的作用研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三部分 PTK2 在卵巢癌小鼠原位移植瘤形成和转移中的作用 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 全文结论 |
| 本课题创新点 |
| 参考文献 |
| 综述 PTK2在肿瘤中的研究新进展 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 攻读博士学位期间发表的文章 |
| 致谢 |
