刘青武[1]（2021）在《回阳生肌汤和鸡血藤对慢性皮肤溃疡愈合过程中MSCs趋化和迁移功能的调节作用研究》文中提出背景:慢性皮肤溃疡是糖尿病、放化疗、周围血管病等常见的并发症,是外科常见病及多发病,迁延难愈,愈后常复发。尤其是长期不愈合,呈现疮面清冷,脓液稀薄,疮周紫黯不温的症状,在中医属于阴证疮疡的疮面,治疗难度最大。近年来,以间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells,MSCs）为主的细胞治疗在慢性创面修复中取得较大进展,但植入MSCs修复溃疡的治疗方法,存在细胞来源不稳定、操作复杂、不良反应及费用昂贵等不足,临床使用和推广困难。慢性皮肤溃疡属于中医“疮疡”的范畴,其中慢性皮肤溃疡阴证具有“肾精虚衰”的特点。北京中医医院皮外科奠基人赵炳南教授及其传人王玉章、吕培文教授以益肾填精、活血通络的回阳生肌汤治疗慢性皮肤溃疡阴证安全有效。鸡血藤作为回阳生肌汤活血通络的主要成分,其促进骨髓造血功能的作用受到广泛报道,但鸡血藤用于创面修复的研究较少。干细胞具有中医“肾精”的属性,因此提出回阳生肌汤通过益肾填精、活血通络促进内源性骨髓MSCs的增殖,提升其趋化和迁移能力,达到化生气血、生肌长肉,而促进慢性皮肤溃疡创面愈合的假说。研究将通过体内和体外实验加以验证,探索回阳生肌汤及其主要成分鸡血藤治疗慢性皮肤溃疡阴证的作用和靶点。目的:研究回阳生肌汤及其主要成分鸡血藤促进慢性皮肤溃疡愈合过程中,对MSCs增殖、趋化和迁移功能的调节作用及其机制,为临床中医血管外科防治慢性皮肤溃疡阴证提供实验基础和理论依据。方法:1.回阳生肌汤和鸡血藤水提物入血成分分析:BALB/C小鼠灌胃给药,制备含药血清,采用高效液相色谱串联质谱技术（Ultra-performance liquid chromatography combined with tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS）对回阳生肌汤和鸡血藤水提物的入血成分进行分析;2.体内实验:（1）db/db糖尿病小鼠伤口模型:采用db/db糖尿病小鼠背部正中部位全厚层皮肤打孔的方法制备糖尿病伤口模型,并使用回阳生肌汤干预;采用数码相机拍照记录创面大小,分析创面愈合率;采用苏木精-伊红染色（Hematoxylin-Eosin staining,HE）染色观察创面组织学形态;提取小鼠全骨髓细胞,采用显微镜下计数方法观察骨髓细胞数量;流式细胞术检测骨髓中干细胞标志物CD29、CD44、干细胞表面抗原（Stem cell antigen 1,Sca-1）、CD117阳性细胞比例;免疫荧光染色检测创面中MSCs标志物CD29、CD271阳性细胞数量;炎症因子芯片检测创面中白介素3（Interleukin 3,IL-3）、IL-6、IL-13等炎症因子表达;（2）骨髓抑制大鼠伤口模型:采用尾静脉注射（8mg/kg）的多柔比星联合背部正中部位全厚层皮肤打孔的方法,制备骨髓抑制大鼠伤口模型,并使用回阳生肌汤和鸡血藤水提物进行干预;采用数码相机拍照记录创面大小,分析创面愈合率;称量胸腺及脾脏重量,计算胸腺指数和脾指数;采用血常规检测观察外周血白细胞数量;酶联免疫吸附法（ELISA）检测了大鼠血清中基质细胞衍生因子-1（Stromal cell-derived factor-1,SDF-1）和粒细胞集落刺激因子（Granulocyte-Colony Stimulating Factor,G-CSF）的浓度;HE及Masson染色并观察创面组织学形态和胶原含量;免疫荧光染色检测创面中CD34、CD133阳性细胞数量;流式细胞术检测骨髓及外周血中CD29、CD90、CD34、CD133阳性细胞比例;采用骨髓细胞贴壁培养法提取和纯化各组药物干预后大鼠的BMSCs;EdU染色检测BMSCs的增殖能力;划痕和Transwell试验检测BMSCs的迁移和趋化能力;Western Blot法检测SDF-1和趋化因子受体4（CXC chemokine receptor 4,CXCR4）蛋白的相对表达量。3.体外实验:采用全骨髓细胞贴壁培养法纯化大鼠BMSCs;流式细胞术、成脂和成骨分化鉴定BMSCs;使用H2O2刺激BMSCs制作氧化应激BMSCs模型,并使用回阳生肌汤提取物和鸡血藤水提物干预;采用细胞增殖毒性检测试剂盒-8（Cell Counting Kit-8,CCK-8）检测BMSCs的增殖活力;划痕试验检测BMSCs的迁移能力;Transwell趋化试验检测BMSCs的趋化能力;Western Blot法检测BMSCs中SDF-1和CXCR4蛋白表达水平。结果:1.回阳生肌汤和鸡血藤水提物入血成分分析:（1）对回阳生肌汤的入血成分进行分析,共得到19个化合物,包括黄酮类,萜类,皂苷类及糖类,含量较高者分别为刺芒柄花苷、汉黄芩素、马钱素、（6αR,11αR）-10-羟基-3,9-二甲氧基紫檀烷、16-氧乙酰茯苓酸甲酯、莫诺苷、核黄素、β-谷甾醇、奥刀拉亭-7-O-β-D-葡萄糖苷、芒柄花黄素、毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷,主要来自鸡血藤、牛膝、苍术、山茱萸、黄芪、茯苓;（2）对鸡血藤水提物的入血成分分析,共得到8个化合物,均为黄酮类化合物,含量由高到低分别为芒柄花黄素、阿夫罗摩辛、异甘草素、大豆素、3,7-二羟基-6-甲氧基二氢黄酮醇、密花豆素、樱黄素、卡亚宁。2.体内实验（1）db/db糖尿病小鼠伤口模型:整体药效观察显示,与模型组比较,回阳生肌汤组小鼠创面愈合率升高;在创面中,与模型组相比,创面肉芽组织新生增多,MSCs 标志物 CD29、CD271 阳性细胞数量增多,IL-3、IL-6、IL-15、Fas 配体（Fas ligand,Fas L）表达升高,IL-13、肿瘤坏死因子-α（Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α）、细胞间黏附分子-1（Intercellular Cell Adhesion Molecule-1,ICAM-1）、嗜酸性粒细胞趋化因子（Eotaxin）、趋化因子LIX/CXCL5表达降低;在骨髓中,与模型组比较,回阳生肌汤组小鼠骨髓细胞数量增加,骨髓中MSCs标志物CD29、CD44、Sca-1阳性细胞比例升高。（2）骨髓抑制大鼠伤口模型:整体药效观察显示,与模型组比较,回阳生肌汤组和鸡血藤水提物可提高模型大鼠的创面愈合率,升高胸腺指数和脾指数;在创面中,与模型组比较,可见回阳生肌汤组和鸡血藤水提物组大鼠中创面炎性细胞数量减少,胶原合成增加,干细胞标志物CD34、CD133阳性细胞数量增多;在骨髓中,CD29、CD90、CD34、CD133阳性细胞比例增加;在外周血中,与模型组比较,回阳生肌汤和鸡血藤水提物组血清中SDF-1和G-CSF的浓度升高,白细胞数量增加,CD29、CD90、CD34、CD133阳性细胞比例增多;分离提取药物干预后的原代大鼠BMSCs,与模型组比较,可见回阳生肌汤和鸡血藤水提物组BMSCs增殖细胞数量增加,迁移能力和趋化能力增强,SDF-1和CXCR4蛋白表达增多。3.体外实验:大鼠BMSCs细胞呈梭形,呈旋涡状、席纹状排列,折光性良好;第三代细胞MSCs标志物CD29、CD44阳性细胞比例分别99.9%和97.8%,造血干细胞表面标志物CD45表达率为0.47%。氧化应激状态下的原代大鼠BMSCs的增殖活力降低,趋化和迁移能力下降;与模型组比较,回阳生肌汤和鸡血藤水提物组BMSCs增殖活力升高,迁移和趋化能力增强,SDF-1和CXCR4蛋白表达升高。结论:1.回阳生肌汤和鸡血藤入血成分主要为黄酮类化合物,提示黄酮类化合物在回阳生肌汤和鸡血藤的药效中发挥了重要作用;2.回阳生肌汤干预db/db糖尿病小鼠伤口模型,能够加速创面愈合,并促进小鼠骨髓BMSCs的增殖,增加创面干细胞的数量,调控创面的炎症反应,促进肉芽组织新生;3.回阳生肌汤和鸡血藤水提物干预骨髓抑制大鼠伤口模型,能够促进大鼠血清SDF-1和G-CSF的分泌,且激活模型大鼠BMSCs SDF-1/CXCR4信号轴,促进骨髓干细胞的增殖、迁移和趋化能力,并动员干细胞进入外周血中,增加创面干细胞的数量,促进胶原合成,加速创面的修复;4.回阳生肌汤和鸡血藤水提物在体外作用于大鼠BMSCs,能够激活SDF-1/CXCR4信号轴,保护氧化损伤的BMSCs的活性,提升氧化损伤状态下BMSCs的迁移和趋化能力。
陈李[2]（2021）在《载茶多酚丝素蛋白/纤维素/聚丙烯酸复合水凝胶敷料的制备及性能研究》文中提出创伤愈合一直是医学领域的研究热点。在伤口愈合治疗方面,载药水凝胶可以保持创面湿润,控制药物缓释,对伤口恢复具有很好的促进作用。丝素蛋白、纤维素等天然高分子具有优异的生物相容性和生物可降解性,广泛应用于生物材料领域。但单一组分的天然高分子水凝胶存在力学性能不佳,溶胀性能差,药物承载率低等缺点,而合成高分子水凝胶往往生物相容性不佳,可降解性能差。因此,开发天然高分子和合成高分子复合水凝胶可以弥补彼此性能的缺陷,提升其应用价值。茶多酚是一种天然提取物,具有良好的抗菌、抗氧化及抗炎症性能,可以针对创伤愈合的多个阶段发挥作用,促进伤口恢复。本研究以生物相容性较好的天然高分子丝素、纤维素及成胶性能较好的合成高分子聚丙烯酸为原料,引入具有广谱抗菌、抗氧化及抗炎症性能的茶多酚作为活性物质,开发制备出载茶多酚丝素蛋白/纤维素/聚丙烯酸复合水凝胶,并对其理化性能及生物学性能进行评价,探究其在创伤愈合中的作用。本研究的主要结果如下:（1）丝素蛋白/纤维素/聚丙烯酸复合水凝胶（SF-OC-PAA）的制备及性能研究将纤维素通过高碘酸钠选择性氧化后,通过席夫碱反应使丝素蛋白和纤维素产生交联,引入丙烯酸,通过自由基聚合反应成胶,制备出9组具有不同成分比的水凝胶SF-OC-PAA-1-9。丝素蛋白/纤维素/聚丙烯酸复合水凝胶具有三维孔状结构,展现出较好的凝胶体行为,其中SF-OC-PAA-9力学性能最佳,压缩强度最佳可达7 MPa,SF-OC-PAA-8拉伸应变最高可达640%。制备的水凝胶还具有较好的亲水性及优异溶胀性能,去离子水中的溶胀率可达279.4 g/g,且具有p H响应性,在不同p H溶液中,其溶胀率有所不同。丝素蛋白/纤维素/聚丙烯酸复合水凝胶经过40天体外降解,降解率最高可达69.87%,且还具有良好的细胞相容性。（2）茶多酚作用浓度测试对茶多酚的抗菌测试表明其对大肠杆菌,黄色葡萄球菌,白色链球菌,沙门氏菌,蜡样芽胞杆菌的最小抑菌浓度分别为250 mg/L,31.25 mg/L,31.25 mg/L,125 mg/L,62.5 mg/L;采用DPPH自由基清除法对茶多酚进行抗氧化性能测试,结果表明IC50达26.14 mg/L;茶多酚的抗炎症性能测试结果表明,100 mg/L茶多酚的NO抑制率可达50%。茶多酚具备抑制癌细胞作用,200 mg/L茶多酚水溶液对人肝癌细胞HEPG2表现出一定的抑制作用,抑制率可达50%,而100 mg/L茶多酚溶液对人肝癌细胞SMMC7721表现出显着抑制作用,抑制率达60%。此外,细胞测试实验表明茶多酚具有很好的细胞相容性。综上,茶多酚具有良好的抗菌、抗氧化、抗炎症及抗癌性能,可应用于创伤愈合和癌症治疗等领域。（3）载茶多酚水凝胶（SF-OC-PAA-TP）性能测试将茶多酚水溶液通过物理吸附负载到丝素蛋白/纤维素/聚丙烯酸复合水凝胶中。经过48 h缓释后,载茶多酚水凝胶的茶多酚缓释浓度最高达82.82 mg/L,可达到茶多酚水溶液的抗菌,抗氧化及抑制癌细胞的作用浓度。在对9组水凝胶的测试表明,SF-OC-PAA-9水凝胶组具有较好的力学性能和缓释性能,因此,选用SF-OC-PAA-9-TP比例组用于后续测试。抗菌测试表明SF-OC-PAA-9-TP对大肠杆菌、沙门氏杆菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌和白色链珠菌均具有较好的抑制作用。SF-OC-PAA-9-TP对DPPH自由基的清除率可达78.798%,展现出良好的抗氧化性能。SF-OC-PAA-9-TP还具有良好的血液相容性和细胞相容性。通过小鼠全层皮肤切除模型评价SF-OC-PAA-9-TP的创伤愈合能力,结果表明,经过15天处理后,SF-OC-PAA-9-TP组伤口愈合达到96.7%,高于不载药组SF-OC-PAA-9和空白对照组。且较空白组和SF-OC-PAA-9相比,SF-OC-PAA-9-TP组在创伤愈合的过程中炎症细胞较少,在同一时间内能生成更多的毛细血管和胶原组织,新生表皮较均匀,毛囊组织更完整。进一步的研究表明,SF-OC-PAA-9-TP在创伤愈合的过程中对生长因子VEGF、EGF、b FGF、TGF-β的表达有促进作用,且可以调控炎症因子TNF-α、IL-10、IL-1β在创伤愈合不同时期的表达量,有效促进伤口愈合。总体而言,通过本研究制备出具有良好的理化性能、抗菌及抗炎症性能的载茶多酚丝素蛋白/纤维素/聚丙烯酸复合水凝胶SF-OC-PAA-9-TP,能有效促进创伤愈合,在创伤敷料领域具有很好的应用前景。
杨环毓[3]（2020）在《肽与植物提取物复配乳霜的抗衰老研究》文中研究指明皮肤衰老是机体整体老化的一部分,主要表现有皱纹、色斑的产生,皮肤弹性减退等。随着天然化和多功能化抗皮肤衰老产品的市场需求日益增加,肽和植物提取物的抗衰老活性研究成为热点。但目前多数研究停留在单一组分的活性评价,因此系统筛选出抗皮肤衰老功效较优的食源性肽和植物提取物,并将其制成复配乳霜,探究二者是否具有协同效应,对开发安全高效的抗衰老活性产品具有重要意义。本文以三种食源性肽（小麦肽、大豆肽、海参肽）和九种食源性的植物提取物（玫瑰茄粉、荷叶碱粉、菊花粉、决明子粉、芹菜素粉、玫瑰花粉、凉茶粉、红茶粉、绿茶粉）为研究对象,利用体外酪氨酸酶抑制试验、抑菌试验、体外细胞模型试验,筛选出防晒及抗氧化功能最强的活性肽和植物提取物,并将其制成复合乳霜,利用小鼠D-半乳糖诱导衰老模型验证复配乳霜的抗皮肤衰老功能。主要研究结果如下:（1）体外生物化学方法初步筛选具有抗衰老相关功能的肽和植物提取物:用紫外扫描法和紫外吸光度法比较肽和植物提取物的防晒功能,发现仅有红茶粉和绿茶粉在270 nm左右有明显吸收峰,1 mg/m L的红茶粉和绿茶粉可达到完全防护紫外线和高效防护紫外线效果,而三种活性肽对220-420 nm波段的紫外线吸收能力均比较差,均无防护紫外光效果;用DPPH自由基清除试验、总铁离子还原试验（FRAP法）、ABTS自由基清除试验比较肽和植物提取物的抗氧化功能,发现绿茶粉的抗氧化功能最强,DPPH自由基清除率IC50仅为（5.60±0.48）μg/m L,FRAP法测得总抗氧能力值为（8.69±0.17）mmol/g,ABTS法测得总抗氧化能力为（1.91±0.0046）mmol/g,红茶粉次之,而三种活性肽中,海参肽的抗氧化性最强,大豆肽次之,小麦肽最差。根据上述结果,初步筛选出小麦肽、大豆肽、海参肽、红茶粉及绿茶粉进入下一步研究。（2）细胞水平分析比较肽与植物提取物的抗皮肤衰老相关功能:用L929成纤维细胞周期检测试验、细胞凋亡试验、B16黑色素瘤细胞抑制增殖试验,发现当200μg/m L的海参肽作用于L929成纤维细胞和B16黑色素瘤细胞时,L929成纤维细胞的细胞增殖指数和细胞凋亡率由分别提高至（28.7±1.0）%和降至（1.89±0.085）%,B16黑色素瘤细胞的增殖率降至（72.7±2.1）%,对比空白对照组均有显着性差异（p<0.05）,且均优于同浓度的其他活性肽。红茶粉和绿茶粉对L929细胞周期和细胞凋亡率均无显着性影响（p>0.05）;与空白对照组相比,10μg/m L的红茶粉、绿茶粉能使B16黑色素瘤细胞的增殖率分别降至（79.2±0.94）%和（71.6±1.0）%。因此最终筛选结果为海参肽和绿茶粉。（3）动物试验评价复合乳霜的抗皮肤衰老功效:制备海参肽乳霜、绿茶粉乳霜及二者等比例混合的复合乳霜,作用于D-半乳糖诱导衰老模型小鼠的脱毛后背上,连续作用7周。实验结果显示,复合组的皮肤匀浆过氧化氢酶活力、超氧化物歧化酶活力及皮肤羟脯氨酸含量分别为（10.1±0.50）U/mgprot、（189±15）U/mgprot、（6.81±0.95）μg/m L比模型组分别提高了1.08 U/mgprot、33.9 U/mgprot、0.134μg/m L,优于海参肽乳霜和绿茶粉乳霜。以上研究结果表明海参肽和绿茶粉联合应用具有协同效应,值得进一步深入研究。
王明月[4]（2020）在《潞党参通过IL-15及其受体调控光老化小鼠皮肤炎症反应作用机制》文中进行了进一步梳理目的:本研究通过观察中药潞党参对小鼠皮肤组织IL-6、TNF-α、IL-15及其受体、MAPK/ERK1/2信号通路、PI3K/Akt信号通路的影响。探讨潞党参调控小鼠皮肤光老化过程中的作用机制,为医美领域研发新的中药抗衰老产品提供新的实验依据。材料与方法:将90只SPF级昆明小鼠随机分为空白对照组、模型对照组、潞党参高剂量组、潞党参中剂量组、潞党参低剂量组、VE对照组、Anti-IL-15组、MAPK抑制剂组、PI3K抑制剂组。除了空白对照组之外,其余8组均需进行光老化造模。造模采用UVA+UVB光源,即40w UVA灯管2根,40w UVB灯管2根,将4根灯管并列穿插安装到自制模拟日光箱中,照射小鼠背部皮肤制备光老化模型。用剃毛器将小鼠背部约为1.5×1.5cm2的长毛及绒毛剔除,每隔两至三日剃毛一次,将剃毛后的小鼠放入笼中,同时照射UVA、UVB。每周照射3次,共计14周。造模成功后,采用灌胃给药途径,连续给药4周,每日一次。空白对照组和模型对照组均灌注生理盐水,潞党参的各个组中（包括高剂量组、中剂量组和低剂量组）灌服不同浓度的潞党参,VE组灌服维生素E作为阳性对照物,Anti-IL-15组、MAPK抑制剂组、PI3K抑制剂组三组灌服相应的制剂。于第19周断颈处死全部小鼠,取下小鼠背部正中全层皮肤,置于冰箱内冷冻（-70℃）保存待测。酶联免疫吸附法（ELISA）检测小鼠皮肤组织中IL-6、TNF-α、IL-15水平;免疫荧光法（IF）检测小鼠皮肤组织中IL-15、IL-15R水平以及IL-15与IL-15R共表达的情况;Western-blot法和免疫组化法（IHC）检测小鼠皮肤组织中IL-15、IL-15R、MAPK、P-MAPK、PI3K、P-PI3K、ERK1/2、P-ERK1/2、Akt、P-Akt的蛋白表达水平。结果:1光老化模型制备UVA辐照强度累计为261.79J/cm2,UVB辐照强度累计为6.54J/cm2,照射强度值均符合皮肤光老化动物实验的紫外线照射强度要求。照射14周后小鼠出现身体疲乏倦怠、经常收缩一团、运动量降低、皮肤干枯、表皮粗糙、纹理加粗加深、皮肤颜色出现暗红,偶有瘀斑等现象,比照光老化模型标准已经完全符合,造模成功。2 ELISA法检测结果:空白对照组中IL-6、TNF-α、IL-15呈现低水平表达。（1）IL-6水平:与空白对照组比较,模型对照组的小鼠皮肤组织中IL-6的表达显着升高（P<0.01）;与模型对照组比较,潞党参的各个组中（包括高剂量组、中剂量组和低剂量组）小鼠皮肤组织中IL-6的表达显着降低（P<0.01）。与VE组比较,潞党参低剂量组IL-6的表达显着升高（P<0.01）;潞党参中剂量组IL-6的表达变大（P<0.05）;而潞党参高剂量组与其差异不具有统计学意义。（2）TNF-α水平:与空白对照组比较,模型对照组的小鼠皮肤组织中TNF-α的表达显着升高（P<0.01）;与模型对照组比较,潞党参的各个组中（包括高剂量组、中剂量组和低剂量组）小鼠皮肤组织中TNF-α的表达显着降低（P<0.01）。与VE组比较,潞党参低剂量组TNF-α的表达显着升高（P<0.01）;潞党参中剂量组TNF-α的表达升高（P<0.05）;而潞党参高剂量组与其差异不具有统计学意义。（3）IL-15水平:与空白对照组比较,模型对照组的小鼠皮肤组织中IL-15的表达显着升高（P<0.01）;与模型对照组比较,潞党参的各个组中（包括高剂量组、中剂量组和低剂量组）小鼠皮肤组织中IL-15的表达显着降低（P<0.01）。与VE组比较,潞党参低剂量组IL-15的表达显着升高（P<0.01）;潞党参中剂量组IL-15的表达升高（P<0.05）;而潞党参高剂量组与其差异不具有统计学意义。3 IF法检测结果（1）IL-15、IL-15R、IL-15与IL-15R共表达在各组内均有阳性表达。（2）IL-15水平:小鼠皮肤组织中IL-15在空白对照组的表达水平较低;与空白对照组比较,模型对照组的小鼠皮肤组织中IL-15表达显着升高（P<0.01）;与模型对照组比较,潞党参的各个组中（包括高剂量组、中剂量组和低剂量组）小鼠皮肤组织中IL-15的表达显着降低（P<0.01）。与VE组比较,潞党参低剂量组、潞党参中剂量组IL-15的表达显着升高（P<0.01）;而潞党参高剂量组与其差异不具有统计学意义。（3）IL-15R水平:小鼠皮肤组织中IL-15R在空白对照组的表达水平较低;与空白对照组比较,模型对照组的小鼠皮肤组织中IL-15R表达显着升高（P<0.01）;与模型对照组比较,潞党参的各个组中（包括高剂量组、中剂量组和低剂量组）小鼠皮肤组织中IL-15R的表达显着降低（P<0.01）。与VE组比较,潞党参低剂量组、潞党参中剂量组IL-15R的表达显着升高（P<0.01）;而潞党参高剂量组与其差异不具有统计学意义。（4）IL-15与IL-15R共表达水平:小鼠皮肤组织中IL-15与IL-15R共表达在空白对照组的表达水平较低;与空白对照组比较,模型对照组的小鼠皮肤组织中IL-15与IL-15R共表达水平显着升高（P<0.01）;与模型对照组比较,潞党参的各个组中（包括高剂量组、中剂量组和低剂量组）小鼠皮肤组织中IL-15与IL-15R共表达的水平显着降低（P<0.01）。与VE组比较,潞党参低剂量组、潞党参中剂量组IL-15与IL-15R共表达的水平显着升高（P<0.01）;而潞党参高剂量组与其差异不具有统计学意义。4 Western-blot法检测结果（1）IL-15、IL-15R蛋白表达（1）IL-15蛋白表达:与空白对照组比较,模型对照组IL-15的蛋白表达显着升高（P<0.01）;而与模型对照组比较,中药剂量组IL-15的蛋白表达显着降低（P<0.01）;与抗IL-15抗体对照组比较,中药剂量组IL-15的蛋白表达升高（P<0.05）。（2）IL-15R蛋白表达:与空白对照组比较,模型对照组IL-15R的蛋白表达显着升高（P<0.01）;而与模型对照组比较,中药剂量组IL-15R的蛋白表达显着降低（P<0.01）;与抗IL-15抗体对照组比较,中药剂量组IL-15R的蛋白表达升高（P<0.05）。（2）MAPK、P-MAPK蛋白表达（1）MAPK蛋白表达:与空白对照组比较,模型对照组MAPK的蛋白表达显着升高（P<0.01）;而与模型对照组比较,中药剂量组MAPK的蛋白表达显着下降（P<0.01）;与抗IL-15抗体对照组比较,中药剂量组MAPK的蛋白表达显着升高（P<0.01）。（2）P-MAPK蛋白表达:与空白对照组比较,模型对照组P-MAPK的蛋白表达显着升高（P<0.01）;而与模型对照组比较,中药剂量组P-MAPK的蛋白表达显着下降（P<0.01）;与抗IL-15抗体对照组比较,中药剂量组P-MAPK的蛋白表达显着升高（P<0.01）。（3）PI3K、P-PI3K蛋白表达（1）PI3K蛋白表达:与空白对照组比较,模型对照组PI3K的蛋白表达显着升高（P<0.01）;而与模型对照组比较,中药剂量组PI3K蛋白表达显着下降（P<0.01）;与抗IL-15抗体对照组比较,中药剂量组PI3K的蛋白表达显着升高（P<0.01）。（2）P-PI3K蛋白表达:与空白对照组比较,模型对照组P-PI3K的蛋白表达显着升高（P<0.01）;而与模型对照组比较,中药剂量组P-PI3K蛋白表达显着下降（P<0.01）;与抗IL-15抗体对照组比较,中药剂量组P-PI3K的蛋白表达显着升高（P<0.01）。（4）ERK1/2、P-ERK1/2蛋白表达（1）ERK1/2蛋白表达:与空白对照组比较,模型对照组中ERK1/2的蛋白表达水平显着升高（P<0.01）;与模型对照组比较,中药剂量组小鼠皮肤组织中ERK1/2蛋白表达水平显着降低（P<0.01）;与MAPK抑制剂组比较,中药剂量组小鼠皮肤组织中ERK1/2的蛋白含量的表达水平显着升高（P<0.01）。（2）P-ERK1/2蛋白表达:与空白对照组比较,模型对照组中P-ERK1/2的蛋白表达水平显着升高（P<0.01）;与模型对照组比较,中药剂量组小鼠皮肤组织中P-ERK1/2蛋白表达水平显着降低（P<0.01）;与MAPK抑制剂组比较,中药剂量组小鼠皮肤组织中P-ERK1/2的蛋白含量的表达水平显着升高（P<0.01）。（5）Akt、P-Akt蛋白表达（1）Akt蛋白表达:与空白对照组比较,模型对照组中Akt的蛋白表达水平显着升高（P<0.01）;与模型对照组比较,中药剂量组小鼠皮肤组织中Akt蛋白表达水平显着降低（P<0.01）;与MAPK抑制剂组比较,中药剂量组小鼠皮肤组织中Akt的蛋白含量的表达水平显着升高（P<0.01）。（2）P-Akt蛋白表达:与空白对照组比较,模型对照组中P-Akt的蛋白表达水平显着升高（P<0.01）;与模型对照组比较,中药剂量组小鼠皮肤组织中P-Akt蛋白表达水平显着降低（P<0.01）;与MAPK抑制剂组比较,中药剂量组小鼠皮肤组织中P-Akt的蛋白含量的表达水平显着升高（P<0.01）。5 IHC法检测结果（1）IL-15、IL-15R蛋白表达（1）IL-15蛋白表达:与空白对照组比较,模型对照组IL-15的平均光密度值显着升高（P<0.01）;与模型对照组比较,中药剂量组IL-15的平均光密度值显着降低（P<0.01）;与抗IL-15抗体对照组比较,中药剂量组IL-15的平均光密度值升高（P<0.05）。（2）IL-15R蛋白表达:与空白对照组比较,模型对照组IL-15R的平均光密度值显着升高（P<0.01）;与模型对照组比较,中药剂量组IL-15R的平均光密度值显着降低（P<0.01）;与抗IL-15抗体对照组比较,中药剂量组IL-15R的平均光密度值升高（P<0.05）。（2）MAPK、P-MAPK蛋白表达（1）MAPK蛋白表达:与空白对照组比较,模型对照组MAPK的平均光密度值显着升高（P<0.01）;与模型对照组比较,中药剂量组MAPK的平均光密度值显着降低（P<0.01）;与抗IL-15抗体对照组比较,中药剂量组MAPK的平均光密度值显着升高（P<0.01）。（2）P-MAPK蛋白表达:与空白对照组比较,模型对照组P-MAPK的平均光密度值显着升高（P<0.01）;与模型对照组比较,中药剂量组P-MAPK的平均光密度值显着降低（P<0.01）;与抗IL-15抗体对照组比较,中药剂量组P-MAPK的平均光密度值显着升高（P<0.01）。（3）PI3K、P-PI3K蛋白表达（1）PI3K蛋白表达:与空白对照组比较,模型对照组PI3K的平均光密度值显着升高（P<0.01）;与模型对照组比较,中药剂量组PI3K的平均光密度值显着降低（P<0.01）;与抗IL-15抗体对照组比较,中药剂量组PI3K的平均光密度值显着升高（P<0.01）。（2）P-PI3K蛋白表达:与空白对照组比较,模型对照组P-PI3K的平均光密度值显着升高（P<0.01）;与模型对照组比较,中药剂量组P-PI3K的平均光密度值显着降低（P<0.01）;与抗IL-15抗体对照组比较,中药剂量组P-PI3K的平均光密度值显着升高（P<0.01）。（4）ERK1/2、P-ERK1/2蛋白表达（1）ERK1/2蛋白表达:与空白对照组比较,模型对照组ERK1/2的平均光密度值显着升高（P<0.01）;与模型对照组比较,中药剂量组ERK1/2、的平均光密度值显着降低（P<0.01）;与MAPK抑制剂组比较,中药剂量组ERK1/2的平均光密度值显着升高（P<0.01）。（2）P-ERK1/2蛋白表达:与空白对照组比较,模型对照组P-ERK1/2的平均光密度值显着升高（P<0.01）;与模型对照组比较,中药剂量组P-ERK1/2的平均光密度值显着降低（P<0.01）;与MAPK抑制剂组比较,中药剂量组P-ERK1/2的平均光密度值显着升高（P<0.01）。（5）Akt、P-Akt蛋白表达（1）Akt蛋白表达:与空白对照组比较,模型对照组Akt的平均光密度值显着升高（P<0.01）;与模型对照组比较,中药剂量组Akt的平均光密度值显着降低（P<0.01）;与PI3K抑制剂组比较,中药剂量组Akt的平均光密度值显着升高（P<0.01）。（2）P-Akt蛋白表达:与空白对照组比较,模型对照组P-Akt的平均光密度值显着升高（P<0.01）;与模型对照组比较,中药剂量组P-Akt的平均光密度值显着降低（P<0.01）;与PI3K抑制剂组比较,中药剂量组P-Akt的平均光密度值显着升高（P<0.01）。结论:1皮肤光老化过程中有较多炎症因子产生,其中IL-15及其受体通过MAPK和PI3K信号转导通路分别激活蛋白激酶ERK1/2、Akt,导致MMPs表达增加,同时下调转化生长因子β/smad传导通路,可能是导致皮肤发生光老化的主要机制。2中药潞党参具有抗皮肤光老化的作用,其可能的作用机制之一是潞党参可以降低光老化小鼠皮肤组织中相关炎症因子的表达,直接或间接降低炎症因子及其受体对MAPK和PI3K信号转导通路相关基因和蛋白的影响。
佘金铭[5]（2020）在《真皮成纤维细胞体外培养优化方案及其促进创面愈合的研究》文中研究指明目的:探讨皮肤组织体外消化培养的优化方案,分析不同体外消化培养方案对获取原代细胞的数量及活性的影响,并在动物模型中分析皮肤细胞活性对创面愈合的影响。方法:取人体皮肤组织,采用胶原酶+胰酶（A组）、单一胰酶（B组）、组织贴壁（C组）三种方法进行体外消化,并贴壁培养,通过以下方法评估不同组织消化方法对细胞获取数量及细胞活性的影响。评估方法:1)观察细胞从组织游离出的时间,第一次传代后细胞数量,绘制生长曲线;2)通过免疫荧光检测细胞Vimentin表达鉴定皮肤细胞的主体成份;3)采用CCK8法检测细胞活性,分析不同组织消化方法对细胞活性的影响;4)采用流式细胞术检测细胞表面标记物CD34、CD45、CD44的表达,以评估不同组织消化方法对皮肤细胞中干细胞比例及成纤维细胞老化的影响;5)建立nu/nu裸鼠局部急性创面模型,创面每天涂抹皮肤细胞、老化的皮肤细胞及生理盐水,通过对创面愈合时间、愈合速度及愈合组织胶原数量的比较,验证不同的状态的皮肤细胞对创面的影响。结果:1)通过胶原酶+胰酶（A组）、单一胰酶（B组）、组织贴壁（C组）三种方法消化皮肤组织,均可成功培养出以成纤维细胞为主的皮肤细胞群,多次传代培养后成纤维细胞呈优势生长,细胞伸展呈梭形或多边形。相比于传统的胰酶及组织贴壁法,采用胰酶+胶原酶消化法,细胞从组织块游离出效率最高,36 h即可观察有成纤维细胞呈放射状从组织块游离出,培养48 h细胞后,融合度达90%以上,且所得细胞产量最多,差异具有统计学意义（P<0.01）。2)通过免疫荧光检测皮肤细胞Vimentin表达,发现几乎所有的细胞均表达波形丝蛋白,HE染色后光镜观察细胞呈长梭形或多边形,胞核为深蓝色,胞浆为嗜碱性染色,说明所得皮肤细胞以成纤维细胞为主。3)通过CCK-8法分析不同消化组皮肤细胞的活性,发现A组细胞增殖活性明显高于B、C两组,差异具有统计学意义（P<0.05）。4)流式细胞术检测细胞表面标志分子CD44以评估皮肤细胞活性,发现胰酶+胶原酶体外消化法（A组）获得细胞CD44阳性表达率最高（100%）,胰酶体外消化法（B组）次之（98.6%）,而贴壁法（C组）CD44表达率最低（91.5%）,三种方法所得细胞CD34、CD45表达均呈阴性,该结果说明不同方法获得体外细胞活性存在差异,胰酶+胶原酶消化法细胞活性最强,胰酶次之,贴壁法获得细胞活性最低。5)成功建立裸鼠急性创面模型,将正常培养的原代皮肤细胞,老化的皮肤细胞细胞及PBS对照每日涂抹创面,记录不同治疗组创面愈合时间,发现复合酶消化法获得细胞可在4天实现创面愈合,生理盐水对照组则需要7天完成创面愈合,老化的成纤维细胞组则需要10天完成创面愈合,差异具有统计学意义（P<0.05或P<0.01）;取创面愈合14天的创面瘢痕组织进行HE染色,结果显示正常皮肤细胞治疗组,创面愈合组织胶原含量较高,胶原纤维增长增粗,排列整齐,更接近于非创面的正常皮肤组织,而老化皮肤细胞治疗组创面组织较薄,真皮层胶原最少,胶原排列稀疏无序。正常细胞治疗组瘢痕皮肤的胶原含量高于生理盐水组和老化细胞治疗组,差异具有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。结论:1)本实验成功验证了此复合酶（胰酶+胶原酶）体外消化法,可以高效的获得皮肤原生代细胞。2)经免疫荧光鉴定,皮肤细胞以成纤维细胞为主,含有少量干细胞样的间充质细胞。3)复合酶消化法获得原代皮肤细胞数量及活性优于传统胰酶消化法及细胞贴壁法,但本实验的三种组织消化法获得的原代细胞的活性均在第4、5代时达到高峰,然后随体外传代的增加,细胞活性逐渐减低,体外培养的第4代、第5代活性较强,可能是细胞治疗较佳的窗口期。4)通过小鼠创面愈合模型证明成纤维细胞的细胞活性是细胞治疗的重要因素,老化的成纤维细胞可能无益于伤口愈合。
龙丹,江和源,张建勇,王伟伟,薛金金[6]（2013）在《EGCG及全乙酰化EGCG（AcEGCG）对UVB致伤人永生化角质形成层细胞过程中的保护作用》文中研究说明目的:研究EGCG和全乙酰化EGCG（AcEGCG）是否能保护人永生化表皮角质形成层细胞（HaCaT）抵御中波紫外线（UVB）诱导细胞生存率下降及氧化损伤。方法:本文分别检测EGCG及AcEGCG保护下的细胞生存率、胞内超氧化物岐化酶（SOD）水平、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）水平、丙二醛（MDA）水平等指标。通过UVB照射后施药修复和UVB辐射前施药预防两种不同的施药方式。结果:EGCG和AcEGCG均可以有效逆转UVB导致的细胞生存率下降,胞内抗氧化酶SOD及GSH-Px活力下降,脂质过氧化产物MDA含量增高。AcEGCG减轻UVB致使细胞氧化应激的效果优于同浓度的EGCG。UVB照射前施加药物的预防模式比修复模式更有效。
张黎[7]（2007）在《玉米幼芽提取物对皮肤氧化损伤的保护作用及其机制研究》文中研究说明目的:研究玉米幼芽提取物（Extracts of Maize Plumule, EMP）对皮肤细胞生长发育、对氧化损伤的真皮肤细胞结构和蛋白表达的影响。评价EMP抗皮肤氧化损伤和抗衰老的效果并探讨其相关机制,初步探讨EMP对间充质干细胞生长的影响。方法:（1）原代分离获得生长稳定的小鼠皮肤成纤维细胞,通过形态观察、MTT和结构相关蛋白基因表达测定,分析EMP对其生长的影响。（2）小鼠皮肤成纤维细胞预先用EMP保护后,复制小鼠皮肤成纤维细胞体外H2O2氧化损伤模型,通过H.E染色、扫描电镜、透射电镜、Hoechst凋亡率检测、NADPH分布等手段,观察EMP对小鼠皮肤成纤维细胞的抗氧化作用;通过细胞微丝、微管的间接免疫荧光检测,观察抗氧化损伤过程中EMP对细胞骨架的影响;同时通过半定量RT-PCR法检测氧化损伤后细胞内β-Actin、Tubulin-α、I型前胶原、III型前胶原基因的表达量,从而全面分析EMP对小鼠皮肤成纤维细胞体外抗氧化作用的影响。（3）对小鼠局部皮肤脱毛后,用EMP进行保护,并对局部皮肤组织用30%的H2O2持续涂抹进行损伤,通过大体观察、病理切片和透射电镜等手段观察其病理学变化,同时检测局部皮肤组织中SOD、CAT、GSH-PX活性和MDA、羟脯氨酸含量,从而分析EMP对小鼠局部皮肤氧化损伤的影响。（4）通过给幼龄家蚕服用EMP,观察其生长和抗逆能力等相关各项生命指标,分析其抗衰老机制;并通过复制5龄家蚕局部氧化损伤模型,通过对其生长、抗逆能力、血淋巴中抗氧化酶活性和局部损伤皮肤中微管蛋白、家蚕胶原蛋白基因表达量的变化进行检测,从而分析EMP对局部皮肤氧化损伤所引起的全身抗氧化应答的影响。（5）分离获得小鼠骨髓间充质干细胞,并在培养体系中添加EMP,通过观察其生长情况、细胞周期和胶原相关基因表达情况,从而初步探索EMP对间充质干细胞生长的影响。结果:（1）在小鼠皮肤成纤维细胞培养体系中添加20 mg/L EMP经过120 h后,MTT的OD值达到1.097±0.021,显着高于其它各组（0.360±0.010～1.023±0.031）（p<0.01）;其96h单视野细胞数为279.333±15.308个,显着高于对照组的133.000±32.527个（p<0.01）。（2）在细胞体外氧化损伤过程中,EMP保护组细胞骨架和亚细胞结构与损伤对照组相比更加完整,细胞凋亡率为（38.38±3.544）%,显着低于损伤对照组的（70.98±3.045）%（p<0.01）;EMP保护组Tubulin-α、I型前胶原、III型前胶原基因表达产物相对灰度值分别为0.811±0.067、0.659±0.026和0.549±0.078均显着高于损伤对照组的0.628±0.055、0.237±0.035和0.217±0.040（p<0.05）。（3）在皮肤组织的体内氧化损伤过程中,EMP保护组和EMP+Vc保护组与损伤对照组相比皮肤组织结构更加完整,皮肤组织各层结构连接紧密,试验各组SOD、CAT、GSH-PX活性均显着高于损伤对照组（p<0.05或p<0.01）,其中EMP保护组和EMP+Vc保护组GSH-PX活性分别为116.793±5.544和117.187±4.482,均显着高于损伤对照组的44.515±4.629（p<0.01）;此外EMP保护组和EMP+Vc保护组羟脯氨酸含量分别为23.848±2.721和26.970±1.571,均高于损伤对照组的6.827±1.901（p<0.01）;而MDA含量分别为10.108±1.836和7.258±1.002均显着低于损伤对照组的11.866±1.666（p<0.01）。（4）在EMP对家蚕抗衰老作用的研究中,用20mg/kg和40 mg/kg EMP饲喂家蚕时,家蚕幼虫寿命（617.793±2.4506 h和23.793±1.378 h）与对照组（613.997±4.289 h）相比分别延长了约4h和10h（p<0.01）,此外其幼虫的抗逆能力与对照组相比也有所提高;在家蚕皮肤氧化损伤模型中,EMP各保护组幼虫体重均显着高于损伤对照组,20mg/kg EMP保护组家蚕血中SOD、CAT活性分别为1656.908±108.461和26.404±0.068,均显着高于损伤对照组的1411.539±79.444和17.268±0.136（p<0.01）;此外EMP保护组家蚕皮肤细胞胶原的基因表达量也显着高于损伤对照组。（5）在EMP对间充质干细胞生长的影响试验中,EMP组细胞增殖指数为（61.00±0.72）%,显着高于空白对照组的（52.73±0.87）%（p<0.01）,同时该组I、III型前胶原基因均有表达。结论:EMP具有明显的抗氧化损伤作用,能够促进小鼠皮肤成纤维细胞增殖,有效抑制了细胞凋亡的发生,维持了氧化损伤中细胞膜、细胞骨架等亚细胞结构完整性和前胶原等基因的表达量;有效保护全层皮肤结构的完整性和紧密性,促进了氧化损伤后皮肤组织的修复,提高皮肤组织中抗氧化酶活性,并有效的清除活性氧自由基。EMP还具有明显的抗衰老作用,它不但能延长家蚕衰老模型的寿命,提高其抗逆能力,而且能有效激活全身抗氧化系统对家蚕局部皮肤损伤的应答作用。而EMP对骨髓间充质干细胞的生长则具有一定的干扰作用,在促进细胞增殖的同时,使得部分细胞发生了分化。
罗海水[8]（2007）在《人角朊干细胞的免疫磁珠分选及siRNA干扰其CCL20表达的初步研究》文中指出目的1.从人包皮组织获得角朊细胞,将其进行体外无血清培养,探索其体外培养的生长特点。利于免疫磁珠细胞分选法（Magnetic Activated Cell Sorting,MACS）结合人胎盘Ⅳ型胶原粘附法从角朊细胞中分离出角朊干细胞后进行无血清培养,寻求一种理想有效的人角朊干细胞体外分离培养技术。2.在本课题组前期已经成功构建两种人CCL20基因特异性小干扰RNA （small interference RNA,siRNA）重组慢病毒表达载体的基础上,补充测序鉴定出一种人CCL20基因特异性siRNA重组慢病毒阴性对照载体。同时,将构建的重组慢病毒载体以包装细胞293FT包装生产,最后以慢病毒颗粒感染人角朊细胞株HaCaT细胞和角朊干细胞,并初步检测siRNA对于角朊细胞表达CCL20的干扰效果。方法1.按照Dispase酶-胰酶两步消化法从人包皮组织获得角朊细胞（Keratinocyte,KC）,以人胎盘Ⅳ型胶原按照5μg/cm2的密度包被培养瓶,将角朊细胞以无血清培养基（defined keratinocyte-serum free medium,DK-SFM）进行体外原代及传代培养,并观察其生长形态变化、克隆形成,并对原代培养的KC中的KSC以细胞表面分子CD49f（整合素α6）、CD71（转铁蛋白受体）、CD29 （整合素β1）做表型检测。2.以免疫磁珠法对KC细胞中的角朊干细胞（keratinocyte stem cells,KSC）进行分选,分析其分选的纯度和比例,再结合人胎盘Ⅳ型胶原粘附法将分选所得的细胞进行体外无血清培养,观察其生长情况及克隆形成。3.将含有CCCL20-siRNA慢病毒载体重组质粒的大肠杆菌（escherichia coli, E.coli）的菌液以划线法接种于含有Amp 60μg/ml的LB平板上,筛选出阳性菌落、扩增后提取质粒,进行DNA测序鉴定。4.重组慢病毒表达载体质粒pHSER-CCL20-siRNA-GFP-SIN、慢病毒包装质粒Lentipack和慢病毒包膜蛋白质粒Lentienv按照一定比例混合,与转染试剂jetPEI一同转染包装细胞293FT,24h后观察其荧光表达情况,并分别在48h、72h、96h后,收集含有慢病毒颗粒的培养基上清液,并保存在-80℃。5.分别将慢病毒颗粒加入至培养至50-60%融合的HaCaT和人角朊干细胞,并设立空白对照组。24 h后,并在所有细胞中加入刺激因子TNF-α、IL-1β和DK-SFM的混合液,使TNF-α和IL-1β的终浓度均为100ng/ml。48h后收集细胞上清液,进行人CCL20的酶联免疫吸附测定（Enzyme linked-immuno-sorbent assay ,ELISA）,在酶标仪上检测其OD450值。根据试剂盒中标准品的浓度-OD450值,求出其拟合曲线和方程,将样品OD450值代入方程,得到样品中CCL20的蛋白浓度。比较几种慢病毒颗粒和对照组的CCL20浓度,初步评价siRNA干扰对于TNF-α和IL-1β共同刺激下的人角朊细胞株HaCaT和角朊干细胞表达CCL20的下调作用。结果1.角朊细胞以无血清培养基可在体外稳定培养35.13±7.59天,传3.87±0.83代,原代细胞克隆形成时间为5.75±0.90天。原代与传代细胞的克隆形成时间和传代时间差异不明显（P>0.05）,细胞经传代培养后细胞数无明显增加。2. CD49f、CD71直接免疫荧光双重标记的原代培养角朊细胞中CD49fbriCD71dim细胞的比例为46.6±2.1%,CD29直接免疫荧光标记原代培养角朊细胞的阳性率为65.8±2.3%。3.新鲜的人角朊细胞悬液经MACS法分选后所得的CD49fbriCD71dim细胞比率达（12.2±7.1）%。CD49fbriCD71dim细胞经培养可见细胞为典型的上皮样特征,呈铺路石样形态,高核浆比例,细胞紧密排列,轮廓清楚,折光性好,并可在5-7天左右可形成全克隆,符合角朊干细胞的特点。4.构建的1种重组慢病毒阴性对照载体通过测序验证载体构建成功。5.成功利用293FT细胞包装已经构建成功的重组载体质粒,生产出慢病毒颗粒,观察到其有较高的感染效应。慢病毒颗粒感染HaCaT和角朊干细胞后通过人CCL20酶联免疫吸附测定实验,初步观察到两种人CCL20基因特异性siRNA重组慢病毒表达载体对于人角朊细胞表达CCL20有一定的下调作用。结论1.对人KC的体外无血清培养方法进行了观察,探索出了其体外无血清培养的生长特性和规律。2.将MACS分选法与人胎盘Ⅳ型胶原粘附法相结合从皮肤组织的表皮细胞悬液中直接分离出较高比例的干细胞,在如何对KSC进行大量纯化的方法学上做了一次新的探索,为后续研究提供了新的备选技术路线。3.补充测序验证成功了1种人CCL20基因特异性siRNA重组慢病毒阴性对照载体。4.以TNF-α和IL-1β共同刺激感染了CCL20-siRNA慢病毒颗粒的人角朊细胞株HaCaT和人角朊干细胞,并利用ELISA实验,测定两种细胞表达CCL20的变化情况,初步观察到siRNA对其表达CCL20的有一定的下调作用,从而为下一步筛选相应的阳性克隆和进一步评价其siRNA干扰效果奠定了基础。
史明艳[9]（2006）在《山羊毛囊干细胞及组织工程皮肤构建研究》文中指出组织工程皮肤自发展20多年来取得了很大的进展,目前已有数种组织工程皮肤应用于临床,为大面积烧伤以及和各种原因引起的皮肤大面积溃烂患者带来了福音。但是,已有的组织工程皮肤只是在结构上具有了皮肤的屏障功能,而不能形成毛囊、汗腺和皮脂腺等皮肤附属器官。临床移植后发现,创面干燥、皴裂、缺乏韧性和弹性等,给患者造成一定的痛苦。因此,构建具有毛囊、汗腺等皮肤附属器官的组织工程皮肤是未来组织工程发展的方向。研究发现,皮肤中的干细胞主要位于毛囊外根鞘隆突部位,毛囊干细胞具有多能性,它们在相关信号的作用下,可向上迁移参与皮脂腺和表皮的形成,向下迁移参与毛囊的形成。因此,以毛囊干细胞为种子细胞构建具有毛囊的组织工程皮肤,是一个理想的方案。但是由于毛囊干细胞存在部位隐蔽,缺乏特异性表面标志,从而限制了毛囊干细胞的体外研究和应用。本研究从山羊毛囊干细胞分离、培养、生物学特性以及分化潜能等方面进行了研究,并以毛囊干细胞和毛囊真皮细胞为种子细胞构建组织工程皮肤。主要内容包括:1.山羊毛囊干细胞分离培养体系的建立（1）将关中奶山羊耳部皮肤样本清洗干净剪碎后,用0.5%的胶原酶I,37℃消化1.5～2h,在体视显微镜下分离、挑选出完整毛囊,用0.25 %胰酶消化毛囊,37℃消化20～30min,获得单个细胞。将细胞以5×105/mL的密度分别接种与20μg/mL IV胶原包被的6孔板中,20min后,吸出未贴附细胞,加入无血清培养液培养（DMEM/F12 +2%BSA+5μg/mLInsulin+0.5μg/mLHydrocortisone+10ng/mLEGF+10 ng/mL IGF +10%条件培养基）,5d后消化传代。（2）对比了DMEM/F12和F12基础培养体系以及不同浓度的EGF、IGF-1以及条件培养液对山羊毛囊干细胞增殖的影响,筛选出以DMEM/F12 +2%BSA +5μg/mLInsulin+0.5μg/mLHydrocortison+15ng/mLEGF+10ng/mLIGF-1+20%条件培养液为山羊毛囊干细胞的优化培养体系。在此培养体系中,山羊毛囊干细胞可连续传至19代。2.山羊毛囊干细胞生物学特性研究（1）本研究所分离的毛囊干细胞为上皮细胞形态,在体外呈克隆性生长;电镜观察显示,细胞表现出原始细胞特征:细胞体积小,直径≤10μm;细胞表面微绒毛发达;核质比高;核内以常染色质为主,异染色质少,细胞器不发达等。（2）细胞生长曲线显示,前13代细胞生长良好,至16代,增值能力有所下降。这可能是随着细胞传代的增加,体外培养条件不能维持其未分化状态。分离的山羊毛囊干细胞液氮冷冻保存2×108,解冻成活率≥95%。
屈雷[10]（2004）在《组织工程化角膜上皮与内皮的构建和移植》文中指出角膜作为眼球光学系统的重要组成部分，其上皮的完整性和透明度是良好视力的基本要求，临床上常见各种原因所引起的角膜缘干细胞及角膜上皮的损伤和缺失，使患者视力下降或致盲。上世纪九十年代以来，随着细胞培养技术和组织工程技术的兴起，组织工程化人工角膜、角膜上皮、内皮：基质细胞植片的构建与移植研究也正在兴起。为探索从根本上解决角膜疾患的新方法与途径，本研究用人流产儿、家兔和山羊角膜体外分离角膜缘干细胞、角膜基质细胞和内皮细胞；采用无饲养层细胞培养体系和冻存的角膜缘干细胞构建家兔和山羊角膜上皮组织，并自体移植到角膜缘干细胞完全缺失的动物模型角膜表面，恢复病损角膜上皮；同时，探索来源于自体的表皮干细胞替代角膜缘干细胞用于角膜上皮重建的可行性；利用体外快速扩增获得角膜内皮细胞，以羊膜和角膜基质为载体构建组织工程化角膜内皮组织，为组织工程角膜内皮层移植实验奠定基础。实验研究主要取得以下六个方面成果和进展： 1．流产儿角膜细胞经体外分离培养可甩于组织工程化角膜组织构建，并且认为移植时同种异体免疫反应更弱。但是，就人胎儿角膜细胞体外分离培养的条件和各类细胞的生长特性未见系统报道，资料相对缺乏。为了充分利用好胎儿角膜组织这一资源，本研究对30例人流产胎儿角膜上皮细胞，基质细胞和内皮细胞进行体外分离培养。发现胎儿角膜上皮细胞采用dispase消化法和完整的全层角膜组织贴壁法可获得纯化的角膜上皮细胞，传至10代冷冻保存；胎儿角膜基质细胞无论采用消化法还是组织块法都可得到纯化培养的目的，传至20代冷冻保存；而角膜内皮细胞体外纯化培养比较困难。 2．山羊或家兔角膜缘上皮组织用1．2 IU／ml dispase酶和0．25％胰蛋白酶4℃冷消化，认为1．2 IU／ml dispase酶是分离角膜缘干细胞较理想的消化酶，其作用时间以冷消化14h～16h为宜。比较DMEM／F12，RPMll640和EpilifeTM三种培养液培养原代山羊和家兔角膜缘干细胞用DMEM／F12培养液可提高细胞的传代次数。山羊角膜缘干细胞传至20代，家兔角膜缘干细胞己传至14代，于一196℃液态氮冷冻保存，获得稳定增殖的角膜缘干细胞。将角膜缘干细胞分别保存在4℃、一20℃、一80℃冰箱和一196℃液态氮中，分别在12～48 h，l～7 d、1～6周和1～6月解冻，经体外培养扩增，细胞在形态上和增殖能力上与冻存前基本相似。可以满足不同的实验条件下，对角膜缘干细胞的运输、保存和增殖的要求，为组织工程技术构建角膜上皮提供丰富的细胞来源。 3．为了制作角膜缘干细胞完全缺失，用于移植角膜缘干细胞的动物模型，将角膜缘上皮板层切除，中央角膜用1 N NaOH擦除上皮层的方法，成功制作实验性角膜缘干 <WP=7>细胞移植的病理模型。 4．本研究首次采用冻存的角膜缘干细胞和无饲养层细胞培养体系构建家兔角膜上皮组织，自体移植后观察对角膜缘干细胞缺失的治疗效果。结果7例移植羊膜角膜上皮的家兔，有2例有效，移植后角膜的透明度增加，新生血管和结膜组织明显减少，4例部分有效，1例无效；仅移植羊膜的4只家兔有3例无效，l例部分有效；未移植的3只家兔全部无效。认为构建的角膜上皮组织自体移植后可以修复角膜缘干细胞缺失的角膜上皮，为临床上角膜缘干细胞缺失所致的角膜疾患治疗提供新的措施。（该方法己申请了发明专利，申请专利号：200410026154．4）。 5．为了探索利用自体来源的表皮干细胞替代角膜缘干细胞用于角膜表面的重建的可行性，本文设计一种羊膜负载山羊表皮干细胞构建角膜上皮的新方法，进行移植治疗角膜缘干细胞完全缺损。通过与角膜缘上皮细胞构建的角膜上皮比较发现，表皮干细胞与角膜缘上皮细胞一样都可以在羊膜上培养形成复层上皮结构，细胞间形成致密连接，细胞在羊膜上形成半桥粒，重建了上皮基底膜。构建羊膜植片移植到角膜缘完全缺失的病理模型，在观察期内，表皮干细胞的异体移植组，观察期6～10个月，4只中有3只部分有效1只无效；表皮干细胞的自体移植组，观察期3～6个月，5只中有3只部分有效2只有待于进一步观察；角膜缘干细胞的自体移植组，观察期3～5个月，4只中有2只部分有效2只有待于进一步观察。3组移植效果未见明显不同，与仅移植羊膜组和对照组比较效果明显，恢复或部分恢复角膜上皮功能。但是，表皮干细胞替代角膜缘上皮细胞用于角膜表面的重建的机制和长期作用有待于进一步深入研究。（该方法已申请了发明专利，申请专利号：200410026031．0）。 6．体外扩增角膜内皮细胞时，在原代培养，以浓度为l×10-5×105个细胞／孔（即5×104个细胞／cm2）的细胞悬液并添加消化后的．Descemt膜，96小时后细胞形成与在体细胞相似的密集单层，快速获取纯化的角膜内皮细胞。传代培养时，以1×10-5×10个细膨孔的浓度传代，72小时生长成密集单层并可继续传代，现已传至第10代。用2～4代的角膜内皮细胞，以1×105个细胞／mI 的浓度接种分别到去上皮的人羊膜和去除Descemt膜的角膜基质上，体外培养构建角膜内皮。结果以羊膜和角膜基质为载体培养角膜内皮细胞，可体外形成?
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词(表) |
| 综述 |
| 综述一 干细胞在创面修复中的研究进展 |
| 1 表皮干细胞 |
| 2 间充质干细胞 |
| 3 毛囊干细胞 |
| 4 细胞外囊泡 |
| 5 小结与展望 |
| 参考文献 |
| 综述二 回阳生肌法治疗慢性皮肤溃疡的研究进展 |
| 1 疮疡的阴阳辨证 |
| 2 回阳生肌法的现代理论体系 |
| 3 回阳生肌法促进慢性皮肤溃疡愈合的机制 |
| 4 小结与展望 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 实验研究 |
| 实验一 回阳生肌汤和鸡血藤水提物入血成分分析 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 实验二 回阳生肌汤对db/db糖尿病小鼠伤口愈合及BMSCs增殖能力的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 实验三 回阳生肌汤对骨髓抑制大鼠伤口愈合及BMSCs增殖、趋化和迁移能力的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 实验四 鸡血藤水提物对骨髓抑制大鼠伤口愈合及BMSCs增殖、趋化和迁移能力的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 实验五 回阳生肌汤和鸡血藤水提物体外对氧化损伤大鼠BMSCs增殖、趋化和迁移能力的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 创新点 |
| 存在的问题与不足 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
| 个人简历 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 水凝胶 |
| 1.1.1 水凝胶形成机制 |
| 1.1.2 水凝胶的性能及应用 |
| 1.2 水凝胶在创伤愈合中的应用研究 |
| 1.2.1 创伤愈合的过程 |
| 1.2.2 水凝胶应用于创伤敷料的研究 |
| 1.3 丝素蛋白 |
| 1.3.1 丝素蛋白概述 |
| 1.3.2 丝素蛋白水凝胶的制备方法与机制 |
| 1.3.3 丝素蛋白水凝胶的应用 |
| 1.4 纤维素 |
| 1.4.1 纤维素的氧化 |
| 1.4.2 纤维素的溶解体系 |
| 1.4.3 纤维素水凝胶的成胶方法与机理 |
| 1.4.4 纤维素水凝胶的应用 |
| 1.5 丙烯酸 |
| 1.6 茶多酚 |
| 1.6.1 茶多酚的来源与种类 |
| 1.6.2 茶多酚的性能研究 |
| 第2章 引言 |
| 2.1 研究目的与意义 |
| 2.2 研究内容 |
| 2.3 技术路线 |
| 第3章 丝素蛋白/纤维素/聚丙烯酸复合水凝胶的制备及其性能探究 |
| 3.1 实验药品及及仪器 |
| 3.1.1 实验药品 |
| 3.1.2 实验仪器 |
| 3.2 实验方法与步骤 |
| 3.2.1 丝素蛋白/纤维素/聚丙烯酸复合水凝胶的制备 |
| 3.2.2 扫描电子显微镜(SEM)测试 |
| 3.2.3 傅里叶红外(FTIR)光谱测试 |
| 3.2.4 X射线衍射测试 |
| 3.2.5 水接触角测试 |
| 3.2.6 热重(TG)分析测试 |
| 3.2.7 生物降解性测试 |
| 3.2.8 压缩性能测试 |
| 3.2.9 拉伸性能测试 |
| 3.2.10 流变性能测试 |
| 3.2.11 溶胀率测试 |
| 3.2.12 水蒸气透过率测试(WVTR) |
| 3.2.13 细胞实验 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 丝素蛋白/纤维素/聚丙烯酸复合水凝胶的微观形貌及孔径大小分析 |
| 3.3.2 丝素蛋白/纤维素/聚丙烯酸复合水凝胶水接触角分析 |
| 3.3.3 丝素蛋白/纤维素/聚丙烯酸复合水凝胶流变性能分析 |
| 3.3.4 丝素蛋白/纤维素/聚丙烯酸复合水凝胶压缩性能分析 |
| 3.3.5 丝素蛋白/纤维素/聚丙烯酸复合水凝胶拉伸性能分析 |
| 3.3.6 丝素蛋白/纤维素/聚丙烯酸复合水凝胶热稳定性分析 |
| 3.3.7 丝素蛋白/纤维素/聚丙烯酸复合水凝胶傅里叶红外(FTIR)光谱分析 |
| 3.3.8 丝素蛋白/纤维素/聚丙烯酸复合水凝胶X射线衍射分析 |
| 3.3.9 丝素蛋白/纤维素/聚丙烯酸复合水凝胶溶胀性能分析 |
| 3.3.10 丝素蛋白/纤维素/聚丙烯酸复合水凝胶水蒸气透过率分析 |
| 3.3.11 丝素蛋白/纤维素/聚丙烯酸复合水凝胶生物降解性分析 |
| 3.3.12 丝素蛋白/纤维素/聚丙烯酸复合水凝胶对细胞活力影响 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 茶多酚的作用浓度探究 |
| 4.1 实验药品及仪器 |
| 4.1.1 实验药品 |
| 4.1.2 实验仪器 |
| 4.2 实验方法及测试 |
| 4.2.1 茶多酚水溶液的最小抑菌浓度测试(MIC) |
| 4.2.2 茶多酚水溶液的抗氧化性能测试 |
| 4.2.3 茶多酚水溶液的抗炎症性能测试 |
| 4.2.4 茶多酚水溶液的体外抗肿瘤性能测试 |
| 4.2.5 茶多酚水溶液的细胞相容性测试 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 茶多酚的抗菌性能 |
| 4.3.2 茶多酚的抗氧化性能 |
| 4.3.3 茶多酚水溶液的抗炎症性能 |
| 4.3.4 茶多酚水溶液的抗肿瘤性能 |
| 4.3.5 茶多酚水溶液的细胞相容性 |
| 4.4 本章小结 |
| 第5章 载茶多酚复合水凝胶的制备及性能研究 |
| 5.1 实验药品及仪器 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 实验药品 |
| 5.1.3 实验仪器 |
| 5.2 实验方法与测试 |
| 5.2.1 载茶多酚丝素蛋白/纤维素/聚丙烯酸水凝胶的制备 |
| 5.2.2 载茶多酚丝素蛋白/纤维素/聚丙烯酸水凝胶的缓释性能研究 |
| 5.2.3 载茶多酚丝素蛋白/纤维素/聚丙烯酸水凝胶的抗菌性能测试 |
| 5.2.4 载茶多酚丝素蛋白/纤维素/聚丙烯酸水凝胶的抗氧化性能测试 |
| 5.2.5 载茶多酚丝素蛋白/纤维素/聚丙烯酸水凝胶的溶血测试 |
| 5.2.6 载茶多酚丝素蛋白/纤维素/聚丙烯酸水凝胶的细胞相容性测试 |
| 5.2.7 动物创伤模型的建立 |
| 5.2.8 RT-PCR测试 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 载茶多酚丝素蛋白/纤维素/聚丙烯酸水凝胶的缓释性能分析 |
| 5.3.2 载茶多酚丝素蛋白/纤维素/聚丙烯酸水凝胶的傅里叶红外光谱和溶胀性能分析 |
| 5.3.3 载茶多酚丝素蛋白/纤维素/聚丙烯酸水凝胶的抗菌性能分析 |
| 5.3.4 载茶多酚丝素蛋白/纤维素/聚丙烯酸水凝胶的抗氧化性能分析 |
| 5.3.5 载茶多酚丝素蛋白/纤维素/聚丙烯酸水凝胶的溶血性分析 |
| 5.3.6 载茶多酚丝素蛋白/纤维素/聚丙烯酸水凝胶的细胞相容性测试 |
| 5.3.7 创伤愈合的观察分析 |
| 5.3.8 H&E染色切片的分析 |
| 5.3.9 再生皮肤中相关基因的表达量分析 |
| 5.4 本章小结 |
| 第6章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间发表论文及参研课题情况 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 皮肤的衰老 |
| 1.1.1 皮肤衰老的概述 |
| 1.1.2 皮肤衰老的内在因素 |
| 1.1.3 皮肤衰老的外在因素 |
| 1.2 肽和植物提取物抗衰老相关功能研究进展 |
| 1.2.1 防晒功能 |
| 1.2.2 抗氧化功能 |
| 1.2.3 抗皱功能 |
| 1.2.4 美白功能 |
| 1.2.5 保湿功能 |
| 1.2.6 抑菌功能 |
| 1.3 抗衰老功效评价方法 |
| 1.3.1 生物化学方法 |
| 1.3.2 细胞模型评价方法 |
| 1.3.3 动物及人体评价方法 |
| 1.4 肽与植物提取物的联合应用进展 |
| 1.5 本课题选题依据和研究内容 |
| 1.5.1 选题依据 |
| 1.5.2 研究内容 |
| 第二章 体外生物化学方法初步筛选具有抗衰老相关功能的肽和植物提取物 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料、试剂与设备 |
| 2.2.1 材料与试剂 |
| 2.2.2 试验设备 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.3.1 防晒功能研究 |
| 2.3.2 抗氧化功能研究 |
| 2.3.3 美白功能研究 |
| 2.3.4 抑菌功能研究 |
| 2.3.5 数据统计分析 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 紫外扫描法测定防晒功能 |
| 2.4.2 紫外吸光度法测定防晒功能 |
| 2.4.3 DPPH自由基清除能力 |
| 2.4.4 FRAP还原能力 |
| 2.4.5 ABTS法自由基清除能力 |
| 2.4.6 酪氨酸酶的抑制率 |
| 2.4.7 抑菌圈 |
| 2.4.8 最小抑菌浓度 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 细胞水平分析比较肽与植物提取物的抗皮肤衰老相关功能 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料、试剂与设备 |
| 3.2.1 材料与试剂 |
| 3.2.2 试验设备 |
| 3.3 试验方法 |
| 3.3.1 样品的处理 |
| 3.3.2 L929成纤维细胞的培养 |
| 3.3.3 L929成纤维细胞增殖率的测定 |
| 3.3.4 L929成纤维细胞过氧化氢损伤模型 |
| 3.3.5 L929成纤维细胞周期检测 |
| 3.3.6 L929成纤维细胞凋亡率检测 |
| 3.3.7 B16黑色素瘤细胞培养 |
| 3.3.9 B16黑色素瘤细胞增殖率测定 |
| 3.3.10 B16黑色素瘤细胞内酪氨酸酶抑制率测定 |
| 3.3.11 B16黑色素瘤细胞内黑色素含量测定 |
| 3.3.12 数据统计分析 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 L929成纤维细胞增殖率 |
| 3.4.2 L929成纤维细胞过氧化氢损伤模型的建立 |
| 3.4.3 L929成纤维细胞氧化损伤预保护能力 |
| 3.4.4 L929成纤维细胞氧化损伤同时保护能力 |
| 3.4.5 L929成纤维细胞氧化损伤修复能力 |
| 3.4.6 L929成纤维细胞周期 |
| 3.4.7 L929成纤维细胞凋亡率 |
| 3.4.8 B16黑色素瘤细胞增殖率 |
| 3.4.9 B16黑色素瘤细胞内酪氨酸酶活性抑制率 |
| 3.4.10 B16黑色素瘤细胞内黑色素含量 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 动物试验评价复合乳霜的抗皮肤衰老功效 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料、试剂与设备 |
| 4.2.1 材料与试剂 |
| 4.2.2 试验设备 |
| 4.3 试验方法 |
| 4.3.1 乳霜的制备 |
| 4.3.2 产品感官与理化性质测试 |
| 4.3.3 安全性能测定 |
| 4.3.4 D-半乳糖诱导衰老模型小鼠试验 |
| 4.3.5 数据统计分析 |
| 4.4 结果与谈论 |
| 4.4.1 产品感官与理化性质 |
| 4.4.2 产品安全性能 |
| 4.4.3 小鼠皮肤切片H&E染色 |
| 4.4.4 小鼠皮肤切片Evg染色 |
| 4.4.5 小鼠皮肤匀浆超氧化物歧化酶活力 |
| 4.4.6 小鼠皮肤匀浆丙二醛含量 |
| 4.4.7 小鼠皮肤匀浆过氧化氢酶活力 |
| 4.4.8 小鼠皮肤匀浆总抗氧化能力 |
| 4.4.9 小鼠皮肤羟脯氨酸含量 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 主要结论 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 展望 |
| 参考文献 |
| 作者简历及在学期间所取得的科研成果 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 论文一 建立实验动物模型及潞党参对光老化小鼠皮肤组织中炎症因子的影响 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 论文二 潞党参对光老化小鼠皮肤组织中MAPK以及PI3K表达的实验研究 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 论文三 潞党参对光老化小鼠皮肤组织中ERK1/2、Akt表达的实验研究 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述1 紫外线引起皮肤光老化机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述2 中草药防治皮肤光老化的现代研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 在学期间科研成绩 |
| 致谢 |
| 内容摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计学方法 |
| 结果 |
| 第一部分 皮肤组织体外原代细胞培养、鉴定及活性分析 |
| 1.1 皮肤原代细胞的生长状态的观察 |
| 1.2 成纤维细胞免疫荧光鉴定及HE染色形态学观察 |
| 1.3 皮肤组织体外原代培养细胞数量分析及活性检测 |
| 1.4 原代培养皮肤细胞表面标记物检测 |
| 第二部分 体外培养皮肤细胞对创面愈合的影响 |
| 2.1 小鼠创面模型的建立 |
| 2.2 动物分组及光老化模型皮肤细胞模型的建立 |
| 2.3 创面愈合时间分析 |
| 2.4 创面愈合处皮肤形态学观察及胶原含量比较 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 紫外线致皮肤光老化及光癌变机制的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录:攻读硕士学位期间发表的部分学术论着 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 综述部分 |
| 第一章 氧化损伤与皮肤衰老研究进展 |
| 1.1 氧化损伤的自由基理论概况 |
| 1.1.1 自由基的化学性质 |
| 1.1.2 生物体内自由基的主要来源 |
| 1.2 氧化应激及其细胞损伤途径 |
| 1.2.1 脂质过氧化损伤途径 |
| 1.2.2 DNA 分子损伤途径 |
| 1.2.3 蛋白质的破坏途径 |
| 1.3 氧化应激与细胞凋亡 |
| 1.3.1 ROS 与凋亡基因的关系 |
| 1.3.2 NO 在ROS 诱导凋亡中的作用 |
| 1.3.3 ROS 活化NF-KB 而促进细胞凋亡 |
| 1.3.4 氧化应激的PARP 调节作用与细胞凋亡 |
| 1.3.5 线粒体通路介导的细胞凋亡 |
| 1.4 机体的抗氧化防御系统 |
| 1.4.1 抗氧化酶系统 |
| 1.4.2 抗氧化非酶系统 |
| 1.5 皮肤的氧化损伤与衰老 |
| 1.5.1 皮肤的氧化损伤与衰老的关系 |
| 1.5.2 皮肤衰老的表现与特征 |
| 1.6 与皮肤氧化损伤及衰老研究相关模型的建立 |
| 1.6.1 H_2O_2 介导的细胞氧化模型 |
| 1.6.2 皮肤的紫外线损伤模型 |
| 1.6.3 皮肤组织及细胞的化学氧化模型 |
| 1.6.4 D-半乳糖衰老模型 |
| 1.6.5 果蝇衰老模型 |
| 1.6.6 家蚕衰老模型 |
| 第二章 抗氧化活性物质研究概况 |
| 2.1 抗氧化活性物质的主要种类与其抗氧化机理 |
| 2.1.1 维生素类抗氧化物质 |
| 2.1.2 微量元素类抗氧化活性物质 |
| 2.1.3 黄酮类抗氧化活性物质 |
| 2.1.4 皂甙类抗氧化活性物质 |
| 2.1.5 多糖类抗氧化活性物质 |
| 2.1.6 多肽类抗氧化活性物质 |
| 2.1.7 其它抗氧化活性物质 |
| 2.2 影响抗氧化物质活性的因素 |
| 2.2.1 抗氧化活性物质的体内浓度与抗氧化作用 |
| 2.2.2 抗氧化活性物质与介质为环境的关系 |
| 2.2.3 抗氧化活性物质的化学构型与其抗氧化活性的关系 |
| 2.3 抗氧化活性物质的其他相关作用 |
| 2.3.1 抗氧化活性物质的抗肿瘤作用 |
| 2.3.2 抗氧化活性物质的干细胞诱导作用 |
| 2.4 激动素与氧化损伤修复 |
| 2.4.1 KT 的来源及化学性质 |
| 2.4.2 KT 在抗氧化损伤中的作用概况 |
| 2.5 玉米幼芽提取物及其研究展望 |
| 试验部分 |
| 第三章 小鼠皮肤成纤维细胞的获得及EMP 对其生长的影响 |
| 第一节 小鼠皮肤成纤维细胞的获得 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.1.3 结果 |
| 3.1.4 讨论 |
| 3.1.5 小结 |
| 第二节 EMP 对小鼠皮肤成纤维细胞生长的影响 |
| 3.2.1 材料 |
| 3.2.2 方法 |
| 3.2.3 结果 |
| 3.2.4 讨论 |
| 3.2.5 小结 |
| 第四章 EMP 对小鼠皮肤成纤维细胞体外抗氧化作用的影响 |
| 第一节 EMP 对小鼠皮肤成纤维细胞抗氧化作用的病理学分析 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.1.3 结果 |
| 4.1.4 讨论 |
| 4.1.5 小结 |
| 第二节 EMP 在抗氧化作用中对小鼠皮肤成纤维细胞骨架的影响 |
| 4.2.1 材料 |
| 4.2.2 方法 |
| 4.2.3 结果 |
| 4.2.4 讨论 |
| 4.2.5 小结 |
| 第三节 EMP 在抗氧化作用中对结构相关蛋白基因表达量的影响 |
| 4.3.1 材料 |
| 4.3.2 方法 |
| 4.3.3 结果 |
| 4.3.4 讨论 |
| 4.3.5 小结 |
| 第五章 EMP 对小鼠皮肤氧化损伤的影响 |
| 第一节 EMP 对小鼠局部皮肤氧化损伤的保护作用观察 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 方法 |
| 5.1.3 结果 |
| 5.1.4 讨论 |
| 5.1.5 小结 |
| 第二节 EMP 对小鼠局部皮肤氧化损伤抗氧化活性物质的影响 |
| 5.2.1 材料 |
| 5.2.2 方法 |
| 5.2.3 结果 |
| 5.2.4 讨论 |
| 5.2.5 小结 |
| 第六章 EMP 对家蚕抗衰老和抗氧化模型的影响 |
| 第一节 EMP 对家蚕抗衰老作用的影响 |
| 6.1.1 材料 |
| 6.1.2 方法 |
| 6.1.3 结果 |
| 6.1.4 讨论 |
| 6.1.5 小结 |
| 第二节 EMP 对家蚕抗氧化损伤作用的影响 |
| 6.2.1 材料 |
| 6.2.2 方法 |
| 第七章 EMP 对小鼠骨髓间充质干细胞生长影响的初步探索 |
| 第一节 小鼠骨髓间充质干细胞的分离与鉴定 |
| 7.1.1 材料 |
| 7.1.2 方法 |
| 7.1.3 结果 |
| 第二节 EMP 对小鼠骨髓间充质干细胞生长的影响 |
| 7.2.1 材料 |
| 7.2.2 方法 |
| 7.2.3 结果 |
| 7.2.4 讨论 |
| 7.2.5 小结 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 英文缩略词索引 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 论文正文 人角朊干细胞的免疫磁珠分选及siRNA 干扰其CCL20 表达的初步研究 |
| 前言 |
| 第一部分 人角朊细胞的无血清培养及角朊干细胞的免疫磁珠分选 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分siRNA 干扰人角朊细胞株和人角朊干细胞表达CCL20 的初步观察.. |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 全文结论 |
| 致谢 |
| 照片 |
| 参考文献 |
| 文献综述 基因修饰角朊细胞及角朊干细胞的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的文章 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 文献综述 |
| 第一章 皮肤结构与皮肤干细胞 |
| 1.1 皮肤的组成结构 |
| 1.2 毛囊、汗腺、皮脂腺关系 |
| 1.3 皮肤干细胞 |
| 1.4 表皮干细胞和毛囊干细胞 |
| 第二章 表皮干细胞研究概况 |
| 2.1 表皮干细胞分布模式学说 |
| 2.1.1 表皮增殖单位（Epidermal Proliferation unit. EPU）学说 |
| 2.1.2 网状嵴分布模式 |
| 2.2 表皮干细胞的特点 |
| 2.3 表皮干细胞表面标志 |
| 2.3.1 整合素家族 |
| 2.3.2 角蛋白（keratin） |
| 2.3.3 P63 转录因子 |
| 2.3.4 Connexi1143（Cx43）连接蛋白 |
| 2.4 表皮干细胞应用前景 |
| 第三章 毛囊及毛囊干细胞 |
| 3.1 毛囊的胚胎发生 |
| 3.2 毛囊组成结构 |
| 3.3 毛囊的生长周期 |
| 3.4 毛囊各种细胞生物学特性研究 |
| 3.4.1 毛乳头细胞 |
| 3.4.2 毛囊真皮鞘成纤维细胞 |
| 3.4.3 毛囊真皮细胞成分在皮肤创伤修复中的应用 |
| 3.4.4 毛囊干细胞研究 |
| 第四章 成体干细胞可塑性研究 |
| 4.1 成体干细胞可塑性概念的提出 |
| 4.2 成体干细胞可塑性研究概况 |
| 4.2.1 骨髓干细胞可塑性研究 |
| 4.2.2 神经干细胞可塑性研究 |
| 4.2.3 肝脏干细胞可塑性研究 |
| 4.2.4 皮肤干细胞可塑性 |
| 4.2.5 其他组织干细胞可塑性 |
| 4.3 成体干细胞可塑性分化机制 |
| 4.4 成体干细胞可塑性引发的争议 |
| 4.5 成体干细胞可塑性引发的思考 |
| 4.5.1 在不同组织中是否存在一种统一的干细胞（Universal Stem Cell） |
| 4.5.2 建立评价成体干细胞可塑性的标准 |
| 4.6 结论和前景 |
| 第五章 组织工程皮肤研究进展 |
| 5.1 组织工程学概念及原理 |
| 5.2 组织工程皮肤种类 |
| 5.2.1 表皮替代物 |
| 5.2.2 真皮替代物 |
| 5.2.3 人工全层皮肤 |
| 5.3 组织工程皮肤临床应用 |
| 5.3.1 Integra |
| 5.3.2 Apligraft |
| 5.3.3 Dermagraft |
| 5.3.4 AlloDerm |
| 5.4 存在问题及展望 |
| 5.4.1 种子细胞问题 |
| 5.4.2 支架材料 |
| 实验研究 |
| 第六章 山羊毛囊干细胞分离培养方法研究 |
| 6.1 材料和方法 |
| 6.1.1 材料 |
| 6.1.2 方法 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 不同浓度的IV 胶原对毛囊干细胞富集的影响 |
| 6.2.2 不同粘附时间对毛囊干细胞富集的影响 |
| 6.2.3 粘附法对毛囊干细胞富集的影响 |
| 6.2.4 毛囊干细胞在不同培养液中增殖特征 |
| 6.2.5 不同浓度的EGF 对毛囊干细胞克隆形成率的影响 |
| 6.2.6 不同浓度的IGF-1 对毛囊干细胞克隆形成率的影响 |
| 6.2.7 不同浓度的条件培养液对毛囊干细胞克隆形成率的影响 |
| 6.3 讨论 |
| 6.3.1 山羊毛囊干细胞分离方法探讨 |
| 6.3.2 山羊毛囊干细胞培养体系的筛选 |
| 6.4 小结 |
| 第七章 山羊毛囊干细胞生物学特性 |
| 7.1 材料和方法 |
| 7.1.1 材料 |
| 7.1.2 方法 |
| 7.2 结果与分析 |
| 7.2.1 山羊毛囊干细胞形态特征 |
| 7.2.2 山羊毛囊干细胞扫描电镜（scanning electron microscope，SEM）分析 |
| 7.2.3 山羊毛囊干细胞透射电镜（transmission electron microscope，TEM）分析 |
| 7.2.4 山羊毛囊干细胞生长曲线分析 |
| 7.2.5 山羊毛囊干细胞冷冻解冻效果 |
| 7.2.6 山羊毛囊干细胞表面标志的免疫组化检测 |
| 7.3 讨论 |
| 7.3.1 山羊毛囊干细胞形态特征 |
| 7.3.2 山羊毛囊干细胞生长曲线分析 |
| 7.3.3 山羊毛囊干细胞的细胞的冷冻与复苏 |
| 7.3.4 山羊毛囊干细胞表面标志检测 |
| 7.4 小结 |
| 第八章 山羊毛囊干细胞诱导分化 |
| 8.1 材料和方法 |
| 8.1.1 材料 |
| 8.1.2 方法 |
| 8.2 结果与分析 |
| 8.2.1 山羊毛囊干细胞向心肌细胞分化 |
| 8.2.2 山羊毛囊干细胞向成骨细胞分化 |
| 8.2.4 山羊毛囊干细胞向神经细胞分化 |
| 8.3 讨论 |
| 8.3.1 山羊毛囊干细胞向心肌诱导分化 |
| 8.3.2 山羊毛囊干细胞向成骨诱导分化 |
| 8.3.3 山羊毛囊干细胞向脂肪诱导分化 |
| 8.3.4 山羊毛囊干细胞向神经诱导分化 |
| 8.4 小结 |
| 第九章 山羊组织工程皮肤构建及移植效果检测 |
| 9.1 材料和方法 |
| 9.1.1 材料 |
| 9.1.2 方法 |
| 9.2 结果与分析 |
| 9.2.1 羊膜可有效地降低胶原凝胶的收缩 |
| 9.2.2 组织工程皮肤检测 |
| 9.2.3 组织工程皮肤移植及观察 |
| 9.3 讨论 |
| 9.3.1 真皮支架的制作 |
| 9.3.2 毛囊干细胞、毛囊真皮细胞在毛囊形成中的作用 |
| 9.4 小结 |
| 结论 |
| 本研究创新点 |
| 下一步工作设想 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 中文摘要I |
| 英文摘要V |
| 文献综述部分 |
| 第一章 角膜的解剖组织结构和早期形态发生 |
| 1.1 角膜的大体解剖学 |
| 1.2 角膜缘的组织解剖 |
| 1.3 泪膜 |
| 1.4 角膜的组织学 |
| 1.4.1 角膜上皮层 |
| 1.4.2 前弹力层 |
| 1.4.3 基质层 |
| 1.4.4 后弹力层 |
| 1.4.5 内皮层 |
| 1.4.6 角膜的神经支配和血液供应 |
| 1.5 角膜的早期形态发生 |
| 第二章 角膜缘干细胞 |
| 2.1 角膜缘干细胞概念与定位 |
| 2.2 角膜缘干细胞在其微环境中生物学特性研究 |
| 2.2.1 角膜缘干细胞生存微环境的研究 |
| 2.2.2 微环境中调节干细胞凋亡的因素 |
| 2.3 角膜缘干细胞培养与体外生长特性 |
| 2.3.1 获取和培养原代角膜缘干细胞的一般方法 |
| 2.3.2 角膜缘干细胞的培养条件的选择 |
| 2.3.3 角膜缘干细胞体外培养的载体 |
| 2.3.4 体外培养的角膜缘干细胞的鉴别方法 |
| 2.3.5 角膜缘干细胞体外培养的动力学及形态学研究方法 |
| 2.3.6 角膜缘干细胞增殖分化的机制 |
| 2.3.7 角膜缘干细胞体外培养表现功能性神经元特性 |
| 2.3.8 角膜上皮细胞的可塑性研究 |
| 2.4 展望 |
| 第三章 角膜缘干细胞移植及人工角膜的研究 |
| 3.1 角膜移植发展简史 |
| 3.2 角膜缘干细胞移植 |
| 3.2.1 自体角膜缘干细胞移植 |
| 3.2.2 异体角膜缘干细胞移植 |
| 3.2.3 角膜缘干细胞体外培养后移植 |
| 3.2.4 展望 |
| 3.3 角膜缘干细胞移植免疫生物学 |
| 3.3.1 角膜的免疫生物学特性 |
| 3.3.2 角膜免疫赦免机制 |
| 3.3.3 角膜缘干细胞移植排斥反应的机制及防治策略 |
| 3.4 人工角膜的研究 |
| 3.4.1 人工角膜材料 |
| 3.4.2 人工角膜的分类 |
| 3.4.3 人工角膜的生物学反应 |
| 3.4.4 人工角膜移植手术的适应症及理想的人工角膜 |
| 3.4.5 人工角膜研究的展望 |
| 第四章 组织工程化角膜的研究 |
| 4.1 组织工程的研究概述 |
| 4.1.1 组织工程学概念的提出及其研究意义 |
| 4.1.2 组织工程学研究的核心问题 |
| 4.1.3 组织工程技术的临床应用研究展望 |
| 4.2 组织工程化角膜组织的研究 |
| 4.2.1 种子细胞的来源 |
| 4.2.2 载体及三维角膜构建 |
| 4.2.3 工程化角膜的特征 |
| 4.3 组织工程化羊膜角膜上皮植片的构建 |
| 4.3.1 羊膜作为构建角膜上皮移植片载体的基础研究 |
| 4.3.2 羊膜负载角膜缘干细胞植片的构建 |
| 4.3.3 角膜缘干细胞在羊膜上的生物学特性 |
| 4.3.4 移植羊膜角膜植片手术和术后护理与观察 |
| 4.3.5 问题与展望 |
| 4.4 组织工程角膜内皮细胞增殖培养与移植 |
| 4.4.1 角膜内皮细胞的增殖 |
| 4.4.2 角膜内皮细胞移植的进展 |
| 4.4.3 角膜内皮移植的长处与不足 |
| 4.5 应用与展望 |
| 实验研究部分 |
| 第五章 人胎儿角膜细胞成分的分离与培养 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 细胞培养液 |
| 5.1.2 人胎儿角膜的处理 |
| 5.1.3 角膜上皮细胞的分离与培养 |
| 5.1.4 角膜内皮细胞的分离与培养 |
| 5.1.5 角膜基质细胞分离与培养 |
| 5.1.6 观察 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 角膜上皮细胞 |
| 5.2.2 角膜内皮细胞 |
| 5.2.3 角膜基质细胞 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 角膜缘干细胞的分离与体外保存 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 材料 |
| 6.1.2 方法 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 角膜缘干细胞分离优化的结果 |
| 6.2.2 不同培养液对角膜缘干细胞培养的生长曲线分析 |
| 6.2.3 角膜缘干细胞在体外不同温度下保存的结果 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 小结 |
| 第七章 角膜缘干细胞完全缺失病理模型的制作 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.1.1 主要仪器与药品 |
| 7.1.2 试验动物及各组处理方法 |
| 7.1.3 手术过程 |
| 7.1.4 术后观察与评分标准 |
| 7.1.5 细胞印迹学检查 |
| 7.1.6 病理学检查 |
| 7.2 结果 |
| 7.2.1 术后观察 |
| 7.2.2 病理学检查 |
| 7.3 讨论 |
| 7.4 小结 |
| 第八章 家兔角膜上皮植片无饲养层构建与自体移植 |
| 8.1 材料与方法 |
| 8.1.1 实验动物及角膜缘干细胞缺失病理模型的制作 |
| 8.1.2 角膜缘干细胞的解冻与培养 |
| 8.1.3 羊膜的制备 |
| 8.1.4 羊膜角膜上皮植片的构建 |
| 8.1.5 羊膜角膜植片的移植手术 |
| 8.1.6 移植效果观察 |
| 8.2 结果 |
| 8.2.1 角膜缘干细胞缺失病理模型的制作 |
| 8.2.2 羊膜角膜上皮植片的构建 |
| 8.2.3 羊膜角膜上皮植片移植后观察与结果 |
| 8.3 讨论 |
| 8.4 小结 |
| 第九章 羊膜负载表皮干细胞重建角膜上皮的研究 |
| 9.1 材料与方法 |
| 9.1.1 实验动物与分组 |
| 9.1.2 角膜缘干细胞缺失模型制作 |
| 9.1.3 人羊膜的制备 |
| 9.1.4 山羊表皮干细胞 |
| 9.1.5 山羊角膜缘干细胞的分离培养与鉴定 |
| 9.1.6 表皮干细胞与角膜缘干细胞羊膜植片构建 |
| 9.1.7 移植 |
| 9.2 结果 |
| 9.2.1 表皮干细胞与角膜缘干细胞羊膜植片培养 |
| 9.2.2 超微结构特征 |
| 9.2.3 移植效果 |
| 9.3 讨论 |
| 9.4 小结 |
| 第十章 组织工程角膜内皮的体外构建 |
| 10.1 材料和方法 |
| 10.1.1 材料 |
| 10.1.2 方法 |
| 10.2 结果 |
| 10.2.1 家兔角膜内皮细胞原代培养 |
| 10.2.2 内皮细胞传代培养的特性 |
| 10.2.3 不同接种浓度对角膜内皮细胞传代的影响 |
| 10.2.4 角膜内皮在羊膜和角膜基质上的体外构建 |
| 10.3 讨论 |
| 10.4 小结 |
| 结论 |
| 进一步研究的设想 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 致 谢 |
| 作者简介 |
