王尧悦[1]（2021）在《动物胃肠道微生物源纤维素酶基因的挖掘与功能鉴定》文中研究表明纤维素作为农作物秸秆的主要成分是限制秸秆饲料化利用的关键因素,挖掘高效纤维素酶是提高秸秆利用率的有效方法。植食性动物胃肠道微生物是纤维素酶的重要筛选来源,目前的研究主要集中在反刍动物瘤胃微生物,对其它纤维素降解能力强的动物胃肠道微生物研究较少,而且通过传统的微生物体外培养方法无法获得不可培养微生物所产纤维素酶。因此,本研究避开传统的微生物培养方法,利用宏基因组测序技术研究三种植食性动物胃肠道内容物中纤维素降解相关的微生物群落组成、代谢功能及纤维素酶基因的分布差异,利用宏基因组Fosmid文库挖掘新型、高效的纤维素酶基因,并通过纤维素酶基因的序列分析、异源表达及对秸秆的降解效果研究,验证了利用Fosmid文库筛选新型、高效纤维素酶基因的可行性。获得的主要研究结果如下:1.通过场发射扫描电子显微镜（FE-SEM）观察、X射线衍射仪（XRD）及傅立叶变换红外光谱仪（FTIR）分析发现被圆唇散白蚁和松瘤象蛀食后的木材中纤维素结构被破坏,说明圆唇散白蚁和松瘤象对纤维素生物质具有强降解作用。2.利用宏基因组测序技术比较了5只西藏山羊瘤胃、1,800只圆唇散白蚁后肠及24只松瘤象肠道微生物,结果表明西藏山羊瘤胃中的Prevotella sp.FD3004和Ruminococcus flavefaciens丰度显着高于圆唇散白蚁和松瘤象肠道中的菌种丰度（P<0.05）;圆唇散白蚁后肠中Treponema primitia,Treponema azotonutricium,Treponema endosymbiont of Eucomonympha sp.和Treponema brennaborense含量显着高于松瘤象肠道和西藏山羊瘤胃中对应微生物的含量（P<0.05）;松瘤象肠道中Lactococcus lactis,Dysgonomonas capnocytophagoides和Lactobacillus fabifermentans的含量显着高于其它两种植食性动物胃肠道中的相应菌种（P<0.05）。这些差异菌种多数都具有纤维素类物质降解功能。3.比较不同植食性动物胃肠道内容物的纤维素酶和半纤维素酶活性发现西藏山羊瘤胃中β-葡萄糖苷酶活性显着低于圆唇散白蚁和松瘤象肠道中的活性（P<0.05）,松瘤象肠道中内切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶和外切葡聚糖酶活力均高于其它两种植食性动物胃肠道中的纤维素酶活力（P<0.05）。4.将宏基因组直接测序预测的基因进行功能注释,比较西藏山羊瘤胃、圆唇散白蚁后肠及松瘤象肠道微生物在“碳水化合物代谢”分类下三级通路的丰度,在西藏山羊瘤胃中ko00520、ko00500和ko00052丰度显着高于其它两种植食性昆虫（P<0.05）,ko00620在圆唇散白蚁后肠中丰度最高（P<0.05）,ko00640在松瘤象肠道中丰度最高（P<0.05）。糖苷水解酶（GH）家族中GH5、GH45、GH124、GH3和GH10在西藏山羊瘤胃中的丰度显着高于其它两种植食性动物（P<0.05）,GH51和GH116在圆唇散白蚁后肠中的丰度最高（P<0.05）,GH8、GH9和GH1在松瘤象肠道中的丰度显着高于其它两种植食性动物（P<0.05）。此外,西藏山羊瘤胃中的EC3.2.1.40、3.2.1.21和3.2.1.80丰度显着高于另外两种植食性动物（P<0.05）。上述结果表明,可将这三种植食性动物胃肠道微生物作为纤维素酶基因的筛选来源。5.利用宏基因组测序技术无法获得新型纤维素酶基因序列,所以本试验构建了西藏山羊瘤胃（1,700个克隆子,覆盖率大约为68 Mb）、圆唇散白蚁后肠（1,900个克隆子,覆盖率大约为76 Mb）以及松瘤象肠道（2,112个克隆子,覆盖率大约为84.48 Mb）的宏基因组Fosmid文库。从西藏山羊瘤胃、圆唇散白蚁和松瘤象肠道宏基因组Fosmid文库中通过功能筛选的方法分别鉴定到阳性克隆子98、244和153个。通过比较不同功能水解圈的大小,最终以能同时产内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的克隆子R-A2、RE1和T-B4开展后续基因筛选试验。6.从构建的阳性Fosmid质粒R-A2、R-E1和T-B4的亚克隆文库中筛选到3个同时产内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的双功能基因,分别命名为A2-Y12-2,Rbs A及Y14。经序列比对发现,A2-Y12-2和Rbs A与NCBI数据库中的两个已知蛋白序列相似（>99%）,但与已报道纤维素酶的氨基酸序列均同源性较低。此外,Y14对应的氨基酸序列与NCBI数据库中的已知序列均同源性较低（相似性为53%）,表明其为新型的纤维素酶基因,且通过蛋白质三级结构预测到Y14催化活性位点为Ser385和Asn388。7.将上述筛选到的3个双功能基因A2-Y12-2,Rbs A及Y14分别通过无缝克隆连接至p ET-28a（+）载体上,并将其转至Escherichia coli（E.coli）BL21（DE3）中成功诱导表达。通过酶学特性分析发现新型基因Y14所表达的内切葡聚糖酶在最适反应条件（50℃,p H5.5）时,比活力可达11.79 U/mg,高于双功能酶A2-Y12-2（50℃,p H 5.5）和Rbs A（37℃,p H 5.5）在最适反应条件下所产酶的比活力;基因Y14所表达的β-葡萄糖苷酶在最适反应条件（37℃,p H 8.5）时,比活力为0.41 U/mg,高于双功能酶A2-Y12-2（50℃,p H 8.5）和Rbs A（50℃,p H 8.5）在最适反应条件下所产酶的比活力。8.小麦秸秆和稻草被双功能酶Rbs A、A2-Y12-2和Y14在50℃从第0 d降解至第7 d时,粗纤维含量均有所降低,这表明本研究中的3个双功能酶在50℃均具有热稳定性。截至第7 d,双功能酶Y14对稻草的降解效果最好,CF降解率为18.16%;A2-Y12-2对小麦秸秆的降解效果最好,CF降解率为17.53%。通过FE-SEM、XRD和FTIR分析结果也表明双功能纤维素酶对秸秆中的纤维素均有降解作用,其中双功能酶A2-Y12-2和Y14对稻草和小麦秸秆中纤维素的降解效果优于Rbs A。综上所述,西藏山羊瘤胃、圆唇散白蚁后肠及松瘤象肠道中的宏基因组可作为筛选纤维素酶基因的来源;从构建的不同植食性动物胃肠道宏基因组Fosmid文库中筛选的新型纤维素酶基因丰富了现有的纤维素酶基因资源库,为提高秸秆类农副产品的畜禽饲料化利用效率提供参考依据。
李静[2]（2019）在《白蚁漆酶相关基因表达的影响》文中研究说明在自然界中,白蚁和真菌之间存在密切的关系,如共生关系、寄生关系和致病关系。我们的前期研究发现圆唇散白蚁Reticulitermes labralis和黑胸散白蚁Reticulitermes chinensis工蚁会搬运真菌Fibulorhizoctonia sp.放到巢内,而尖唇散白蚁Reticulitermes aculabialis即使发现了菌核也不会将其搬到巢中。为了探究工蚁收集真菌Fibulorhizoctonia sp.的目的,本研究揭示了菌核在白蚁巢中的发育及工蚁取食菌丝的行为;完成了圆唇散白蚁、黑胸散白蚁和尖唇散白蚁工蚁及其肠道微生物的转录组测序,分析这三种散白蚁工蚁降解木质素的酶相关基因的表达;比较巢中有菌核和无菌核存在时,工蚁降解木质素的酶相关基因表达水平的变化,探讨影响白蚁搬运菌核的原因。本研究得到的主要结果和结论包括:1.菌核在白蚁巢中的发育研究发现真菌Fibulorhizoctonia sp.在白蚁巢内不产生新菌核。我们通过观察发现圆唇散白蚁和黑胸散白蚁将真菌Fibulorhizoctonia sp.菌核搬入白蚁巢中,与卵放在一起。我们发现菌核萌发出菌丝,但是菌丝很快消失。表明菌核在白蚁巢中可以萌发菌丝,菌丝被白蚁取食。7个月之后,我们发现菌核被工蚁丢弃在巢中各处,并被工蚁用排泄物包裹起来。菌核只剩棕色的外壳,内部的菌丝完全消失,菌核整体呈现中空的状态。2.白蚁取食菌丝的实验表明工蚁将菌核搬入巢中是为了取食菌核萌发的菌丝。将萌发菌丝的菌核放在黑胸散白蚁巢中,24h后菌核萌发的菌丝数量减少。在圆唇散白蚁巢中同时放入萌发菌丝的菌核和由菌丝组成的菌丝球,发现工蚁大多数时间都围着菌丝球,很少去菌核所在的地方。将萌发菌丝的菌核使用刚果红溶液进行染色之后,将其放入圆唇散白蚁巢中。24h后,工蚁的腹部肠道内出现明显的红色。这些实验结果表明白蚁会取食菌丝,取食菌丝可能是白蚁将菌核从巢外搬去巢中的原因。3.对这三种散白蚁工蚁及其肠道微生物进行转录组测序,每个转录组的数据量都超过了11G。尖唇散白蚁工蚁（R.aculabialis worker,RAW）组装出208,242个Unigene,黑胸散白蚁工蚁（R.chinensis worker,RCW）组装出242,801个Unigene,圆唇散白蚁工蚁（R.labralis worker,RLW）组装出274,060个Unigene。三种散白蚁工蚁转录组通过BLASTX程序比对四大数据库（Nr、Swissprot、KEGG和KOG）,RAW注释到71,838个Unigene,RCW注释到97,257个Unigene,RLW注释到83,709个Unigene。转录组分析发现这三种散白蚁降解木质素的酶都仅有漆酶。在RAW中,我们发现4个漆酶相关基因表达;在RCW中有9个漆酶相关基因表达;在RLW中有9个漆酶相关基因表达。4.qRT-PCR分析10个漆酶相关基因在这三种散白蚁工蚁中的差异表达。结果显示,其中8个漆酶基因在尖唇散白蚁中比其他两种散白蚁的表达水平显着高（P<0.05）,尖唇散白蚁漆酶基因的相对表达水平最高是圆唇散白蚁的28倍,是黑胸散白蚁的25倍。仅有2对漆酶相关基因在尖唇散白蚁的表达量介于另外两种散白蚁工蚁表达量之间。因此,尖唇散白蚁体内用于木质素降解的酶基因表达水平高于圆唇散白蚁和黑胸散白蚁。5.巢内有菌核和没有菌核时,工蚁体内12个漆酶基因的表达水平的差异。研究发现圆唇散白蚁巢中有真菌Fibulorhizoctonia sp.存在时工蚁11个漆酶基因的表达水平显着高于巢中没有菌核的工蚁（P<0.05）,其中laccase 1（Unigene 0023066）基因在有菌核时,在工蚁的表达水平是没有菌核时的3.6倍;仅1个漆酶基因的表达水平在巢内有菌核和没有菌核时在工蚁体内没有显着性差异。在黑胸散白蚁中,当巢中有菌核存在时,工蚁10个漆酶基因的表达水平显着高于巢中没有菌核的工蚁（P<0.05）,其中laccase1（Unigene 0041878）基因在有菌核时,在工蚁的表达水平是没有菌核时的5.4倍;有2个漆酶基因在巢内有菌核和没有菌核时在工蚁体内没有显着性差异。综上所述,真菌Fibulorhizoctonia sp.对圆唇散白蚁和黑胸散白蚁是有利的。推测这两种散白蚁由于自身分泌的降解木质素的酶不足以满足需要,才会取食菌核萌发的菌丝来提高降解木质素的效率。而不同种白蚁对真菌Fibulorhizoctonia sp.的利用能力不同。
廖一源[3]（2019）在《六种白蚁线粒体基因组序列及遗传多样性分析》文中提出白蚁作为一种古老的,起源悠久,种类众多且品级分化明显的社会性昆虫,在昆虫分类系统中处于较原始和古老的地位。本论文首次测定了小楹白蚁（Incisitermes minor）,新渡户近扭白蚁（Pericapritermes nitobei）,古田近扭白蚁（Pericapritermes gutianensis）,细颚散白蚁（Reticulitermes leptomandibularis）,近黄胸散白蚁（Reticulitermes periflaviceps）和近圆唇散白蚁（Reticulitermes perilabralis）等六种白蚁的线粒体全基因组,并对每种白蚁序列进行了详细的注释与分析。同时,对6种白蚁的线粒体全基因组的碱基组成、氨基酸组成、密码子使用等方面进行了系统地分析,并对其进行了系统发育树的构建与简单的进化关系分析。另外,本研究对已有的14种散白蚁属白蚁（NCBI数据库中11种,实验测得3种）线粒体全基因组数据进行多重序列比对,以期找到Cytb基因中片段可作为DNA条形码应用于散白蚁属白蚁的分子分类鉴定。本论文研究的主要结果如下:（1）完成小楹白蚁、古田近扭白蚁、新渡户近扭白蚁、细颚散白蚁、近黄胸散白蚁和近圆唇散白蚁线粒体全基因组序列的注释分析,其线粒体全长分别为15970bp、15264bp、15224bp、15920bp、15925bp和15926bp。（2）通过对六种白蚁线粒体基因组中各个组分分析,发现同属的白蚁不论在碱基组成、基因间隔区和重叠区、蛋白编码基因起始密码子和终止密码子、RNA基因和控制区都十分相似,而不同属的白蚁在各个方面都具有较为明显的差异。（3）系统发育分析结果为:细颚散白蚁与尖唇散白蚁亲缘关系最近,近黄胸散白蚁与散白蚁属Reticulitermes kanmonensis亲缘关系最近,之后与近圆唇散白蚁汇为一支;古田近扭白蚁和新渡户近扭白蚁亲缘关系最近,之后与其他近扭白蚁属白蚁汇为一支;小楹白蚁与堆沙白蚁属（Cryptotermes secundus）亲缘关系最近。NJ建树结果与ML建树结果类似,进一步探究六种白蚁在各自属水平下与其他白蚁种类之间的亲缘关系。（4）通过多重比对筛选在Cytb基因中获得一段基因片段,作为DNA条形码,使用遗传距离法和系统发育法对Cytb-2DNA条形码片段进行分析。遗传距离法分析结果中,barcoding gap范围在0.008-0.018;系统发育分析法结果中,系统发育树呈现了明显的种群分离现象,两种方法均证实该DNA条形码的可行性。本研究的Cytb-2DNA条形码能准确完成对10个未知种样品的种类鉴定,通过该应用实例,最终认为该Cytb-2片段可以作为DNA条形码对散白蚁属种类进行分子分类鉴定。
杨晓娟[4]（2018）在《基于转录组测序技术对圆唇散白蚁雌性工蚁向补充繁殖蚁转化过程中的基因表达研究》文中研究指明低等白蚁散白蚁属Reticulitermes的工蚁（worker）品级具有发育的可塑性,既可以终生维持为工蚁品级,也可以根据巢群需求分化成巢群的守卫者兵蚁,或者分化成为巢群的补充繁殖蚁。在圆唇散白蚁R.labralis（Hisa）中,当巢群发生隔离或者繁殖蚁缺失时,雌性老龄工蚁会经过两次蜕皮,历经前补充繁殖蚁（pre-neotenic reproductive,pre-NR）阶段发育成补充繁殖蚁（neotenic reproductives,NR）,接替巢群的繁殖工作。目前关于雌性工蚁向补充繁殖蚁品级的分化调控机理以及功能性基因研究甚少。在本研究中,以圆唇散白蚁原始巢群的雌性老龄工蚁、隔离饲养三周的雌性老龄工蚁（isolated worker,IW）以及由隔离工蚁分化而来的雌性补充繁殖蚁为研究对象,使用RNA-Seq筛选出雌性工蚁向补充繁殖蚁转化调控的关键候选基因及其相关的代谢调控通路,揭示雌性工蚁向补充繁殖蚁转化过程中的基因调控。主要研究结果如下:1.Worker、IW和NR通过转录组测序共获得66.85Gb的Clean reads,每个样品的Q30均高于90.96%且GC含量在43.33%-44.91%之间,组装拼接后共获得112,954个unigenes,通过与数据库比对,其中有17,535个unigenes在四大数据库中均被注释,Nr注释unigene为40,073个,在Swiss-Prot数据库中比对得到29,540个unigenes,在KOG分类中,共获得有25,453个KOG功能注释,KEGG中共注释得到的unigene为20,116个。此次转录组测序首次完成了圆唇散白蚁worker、IW和NR数据库的构建,为散白蚁基因的功能研究、白蚁生长发育和品级分化等提供了丰富的基因数据库资源,并对揭示工蚁繁殖可塑性的机理提供了分子研究依据。2.使用edger软件对样本间的差异表达基因进行筛选,结果表明,worker与IW的差异表达基因为17,405个,IW与NR的差异表达基因为30,332个,worker与NR的差异表达基因为7,016个,此次分析结果为后期基因功能研究提供丰富的资源,也为工蚁转化过程中关键调控基因的筛选提供了参考数据。接下来使用STEM软件对worker、IW和NR的差异表达基因进行趋势聚类分析,结果表明,有38,070个差异表达基因聚类为8个表达模式,通过对差异表达基因聚类分析获得符合工蚁转化调控的显着趋势模块profile5,结合GO以及KEGG富集分析,筛选出Ras信号通路的Ras基因和Ca M基因以及白蚁特有的免疫基因Termicin和Transferrin作为关键的候选基因,通过对候选基因表达量的研究揭示工蚁转化为补充繁殖蚁的基因调控机理。3.使用q RT-PCR对worker、IW和NR的测序结果进行检测,筛选出5个Ras信号通路基因和7个免疫相关基因进行q RT-PCR分析,检测结果在雌性工蚁向补充繁殖蚁转化过程中基因的表达变化趋势与转录组测序的结果相符,表明本次测序获得的数据和分析结果真实可靠,可以用于后期生物学分析比较。4.Ras蛋白作为Ras基因的表达产物,在胞外信号刺激所产生的信号转导通路中处于重要位置。隔离工蚁通过外界环境隔离因子的刺激,使Ras基因的表达量显着升高,Ras基因在IW中的表达量约是worker的130倍（p<0.05）,NR的20倍（p<0.05）,并且测序结果显示Ras富集于profile5中的36条代谢通路,说明Ras基因在工蚁转化过程中对于传递细胞产生的生长分化信号起到重要的开关调控作用。根据Ras在果蝇和家蚕中的功能研究推测Ras在工蚁转化过程中的高表达可能促进蜕皮激素的分泌以及工蚁的生长。钙调蛋白（calmodulin,Ca M）可以启动DNA的合成并且促进细胞进入有丝分裂后期。工蚁在隔离饲养的过程中解除了性信息素对其抑制,通过q RT-PCR验证发现工蚁隔离一周（IW1）以后Ca M基因的表达量明显上调,隔离三周（IW）时达到最高,此时的表达量约是worker的333倍（p<0.05）,NR的47倍（p<0.05）,表明Ca M在工蚁的转化过程中促进细胞的生长。5.Termicin和Transferrin是白蚁特有的免疫基因,在NR中的表达量显着高于worker和IW,表明在圆唇散白蚁中的NR对于病原菌具有很强的抵抗力。实时定量结果验证的免疫相关基因在IW的表达量明显高于worker,表明在工蚁转化为补充繁殖蚁的过程中对于病原菌的抵抗能力增强。6.首次研究促性腺激素释放激素受体（gonadotrophin releasing hormone receptor,Gn RHR）基因在雌性工蚁向补充繁殖蚁转化中的表达动态变化,以工蚁为对照组对q RT-PCR实验数据进行分析,结果表明,在NR中的表达量显着高于worker和Pre-NR,约是worker的12倍（p<0.05）,Pre-NR的5倍（p<0.05）,说明Gn RHR在雌性工蚁转化过程中对性腺发育以及卵母细胞成熟具有重要的调节作用。通过本次转录组测序为工蚁向补充繁殖蚁的分化研究建立了丰富的基因数据库,本次对于雌性工蚁向补充繁殖蚁转化相关基因的研究,不仅揭示了工蚁向补充繁殖转化中基因之间的调控机理,也为后期建立靶标基因RNAi体系以及鉴定新基因的功能奠定了基础。此外,为研发白蚁防治的新型药物提供分子生物学依据。
肖楠[5]（2018）在《阿魏酸乙酯促进痤疮丙酸杆菌极快速生长的过程特征及促生机制初探》文中提出白蚁的肠道微生物一方面参与了木质纤维素生物质的碳生物循环,另一方面也在不断改变土壤生境中微生物的构成上发挥了重要作用。本研究在以阿魏酸乙酯为唯一碳源对白蚁肠道共生微生物的筛选过程中筛选到一株痤疮丙酸杆菌（Propionibacterium acnes）,且惊奇地发现从白蚁肠道所筛的痤疮丙酸杆菌可在以阿魏酸乙酯为唯一碳源时实现极快速生长。痤疮丙酸杆菌以往被认为只能在常规营养丰富的培养基中生长,并且生长非常缓慢,五天左右才能在平板上见到菌落。因此,这一意外发现引起了我们的极大兴趣。在我们前期的预实验中不仅在圆唇散白蚁而且在家白蚁中也筛选到痤疮丙酸杆菌。作为一种宿主广泛的共生菌,痤疮丙酸杆菌不仅存在于人体皮肤上而且还可存在于土壤、昆虫肠道以及牛瘤胃中。同种微生物在不同的生态环境中可能进化出不同的特性和功能。痤疮丙酸杆菌在白蚁肠道共生的以及在人类体表寄生的不同环境,有可能进化出不同的微生物生长特性与特定生物功能。然而,这方面的相互联系和影响,仍然需要进一步的研究与揭示。本研究比较了从圆唇散白蚁肠道中筛选的菌株AYC-1与菌种库中人类皮肤来源的一株典型菌株（ATCC6919）利用阿魏酸乙酯的生长特性,并初步探讨了痤疮丙酸杆菌利用阿魏酸乙酯的代谢机制。本研究的主要结果归纳如下:（1）通过以阿魏酸乙酯为唯一碳源的筛选培养基对圆唇散白蚁肠道的共生微生物进行筛选,筛选到一株优势菌株AYC-1。16S rDNA测序分析表明该菌与痤疮丙酸杆菌（Propionibacterium acnes）多个菌株的16S rDNA的序列相似度都高达99.9%,因此确定分离菌为痤疮丙酸杆菌。（2）阿魏酸乙酯对圆唇散白蚁来源的菌株AYC-1以及人类皮肤来源的典型菌株ATCC 6919的生长均具有相似的刺激作用。菌丝的生长与阿魏酸乙酯的浓度呈正相关。阿魏酸乙酯浓度过低时（≤1.4 g/L）,无刺激生长作用。在含3.6 g/L阿魏酸乙酯的固体培养基中,两种菌株的菌丝的生长速率高达1.01 cm/h。有氧条件以及固体培养基为阿魏酸乙酯促进该菌的极快速生长提供了良好的微环境。此外,圆唇散白蚁来源的菌株AYC-1还具有固氮能力。（3）对阿魏酸乙酯促进痤疮丙酸杆菌快速生长的机制进行了初步探讨。菌株AYC-1的粗酶液中不含阿魏酸乙酯酶活;菌株AYC-1也不能以阿魏酸乙酯水解物（阿魏酸及乙醇）为底物生长。可见阿魏酸乙酯不是被水解利用而很可能是被氧化还原降解。以多种阿魏酸乙酯的结构类似物为底物,两株菌均不生长,这说明两种菌株对阿魏酸乙酯的选择利用具有高度的特异性。
白晰[6]（2017）在《圆唇散白蚁肠道微生物内切β-葡聚糖酶工程菌的构建及其酶学性质研究》文中进行了进一步梳理我国纤维素资源丰富,因其具有水不溶性高结晶结构,很难有效分解,处理方式不当会极大浪费可再生糖类资源。低温内切β-葡聚糖酶（EglC）在较低温度下有效水解纤维素为单糖或寡糖,在我国冷凉期较长的地区有较大的应用优势。食木性白蚁肠道共生微生物具有高效降解纤维素的能力,含有丰富的产内切β-葡聚糖酶微生物资源。然而从白蚁肠道直接分离的EglC野生菌株具有产酶能力低下和分离纯化困难的缺点,限制了其应用。随着分子生物学的迅速发展,基因表达技术已成为实现外源蛋白表达、纯化和生产的有效途径。本研究从我国南方广泛分布的食木性白蚁（圆唇散白蚁）肠道微生物中筛选、分离和鉴定产低温内切β-葡聚糖酶的微生物,并克隆其低温EglC基因,构建大肠杆菌和毕赤酵母表达载体,实现异源表达;分析低温EglC基因密码子结构,对其进行优化,提高该基因在毕赤酵母中的表达水平;并系统研究了重组低温内切β-葡聚糖酶性质,为其应用奠定基础。试验分为六部分:1圆唇散白蚁肠道产低温内切β-葡聚糖酶（EglC）共生菌筛选及酶的分离纯化利用低温诱导培养法,以圆唇散白蚁肠道悬浮液为样本,对白蚁悬液进行低温内切β-葡聚糖酶细菌的分离纯化。结果表明,从圆唇散白蚁肠道微生物中筛选了一株产低温内切β-葡聚糖酶的细菌A1,粗酶活性为0.8U/mL。利用PCR成功扩增菌株16S rRNA条带（1402 bp）。同源分析结果表明,该菌株16S rRNA与Citrobacter farmeri W17-1和Citrobacter farmeri17.7KSS同源性达99%。进化树分析结果表明,A1菌株与Citrobacter farmeri17.7KSS菌株亲缘关系最近（同源性99%）,表明A1菌株属于Citrobacter farmeri,命名为Citrobacter farmeri A1。将所得 16S rRNA 序列提交至 NCBI的GeneBank数据库,GeneBank登陆号为:KT313001。通过层析技术分离纯化低温EglC,SDS-PAGE结果表明获得单一特异性条带（分子量为38kDa左右）,纯化效果较好（电泳级纯度）。该低温酶最适pH为7.0,在pH 6.5-8.0之间保持较高的酶活;并具有良好的pH稳定性,在pH 3.5-pH 6.5孵育30 min,该酶仍能保持相对酶活的60%以上。低温EglC最适温度为30-40℃,当温度超过70℃时,相对酶活显着降低。然而,温度为5℃时,仍能保持较高的相对酶活（50%以上）,说明EglC属于低温酶。2 Citrobacter farmeri A1低温内切β-葡聚糖酶（EglC）基因的扩增、克隆及其序列分析通过设计简并引物从圆唇散白蚁肠道细菌Citrobacter farmeriA1中扩增了低温内切β-葡聚糖酶（EglC）基因的保守片段（约600 bp）,进一步利用染色体步移技术扩增低温EglC基因的全长。EglC基因全长为1107 bp,编码368个氨基酸,GC含量58.08%。该基因序列已提交至NCBI GeneBank数据库,GeneBank登陆号为:KT313000。Citrobacter farmeri A1 EglC 氨基酸序列与E.coli CFT073、Burkholderiasp.CCGE1002、Cupriavidus taiwanensis、Pseudomonas fluorescens SBW25和X n homonas campestris pv.vesicatoria strain 85-10 的内切 β-葡聚糖酶同源性分别为 86.4%、43.4%、44.7%、39.7%和44.3%。序列分析显示Citrobacterfarmeri A1低温EglC基因具有典型的内切β-葡聚糖酶序列特征,属于糖苷水解酶第8超家族（glycoside hydrolase 8 superfamily）。利用SignalP4.1 Server软件在线分析EglC信号肽,该蛋白信号肽为1-21个氨基酸,符合常规分泌型蛋白酶信号肽位点规律。3 Citrobacter farmeriA1低温内切β-葡聚糖酶（EglC）基因在大肠杆菌中的表达及重组酶酶学性质分析根据试验二EglC基因全长序列及表达载体pET-22b的特点,设计去除信号肽序列和添加相对应酶切位点的原核表达引物,以试验二含有全长基因的T克隆质粒为模板,扩增原核表达EglC基因,连接进入原核表达载体pET-22b中,转化大肠杆菌BL21得到能够分泌重组低温内切β-葡聚糖酶（EglC22b）的基因工程菌E.coli pET22b-EglC。超声波破碎重组菌获得粗酶液,活性为9.5 U/mL,相比原始菌株内切葡聚糖酶活力（0.8 U/mL）提高了 11.9倍;通过Ni亲合层析柱进行纯化,SDS-PAGE结果表明,重组菌分子量大小为42 kDa,比活力为8.7 U/mg。重组酶EglC22b最适pH为7.0,在pH 6.5-8.0范围内,保持85%以上酶活;其具有较宽的pH稳定性范围,在pH 3.5-6.5区间内仍保持最高酶活的60%以上。重组酶最适反应温度为30～40℃,且在5℃仍保持50%以上酶活;40℃和50℃时保温30 min,EglC22b相对酶活能保持90%以上,具有较好的稳定性,而温度高于60℃时稳定性较差。EglC22b活性被Co2+激活,Zn2+、Li+、DMSO、Tween 80、EDTA和SDS对重组酶活力有不同程度的抑制作用。以上结果表明,Citrobacter farmeriA1低温EglC基因成功在大肠杆菌中进行表达,重组基因工程菌表达水平得到提高,并且重组酶EglC22b仍属于低温酶。4Citrobacter farmeri A1低温内切β-葡聚糖酶（EglC）基因与新型标签Protein S tag的融合表达将来自于Myxococcus xanthus的新型融合标签Protein S（ProS）tag与目标蛋白EglC的N端融合,共同转入E.coliBL21中进行共表达,增强靶蛋白的积累速度和溶解度,提高生产水平。此外,在EglC基因C端加入His-tag,方便靶蛋白的纯化,并对重组酶酶学性质进行测定分析。蛋白表达基因工程菌命名为E.coli BL21-pET（ProS-EglC）,通过IPTG对重组菌进行诱导,利用超声波破碎细胞,离心收集重组酶,命名为ProS-EglC。SDS-PAGE结果显示通过Ni-AgaroseHis标签蛋白纯化试剂盒纯化后,在电泳图大约60 kDa处出现了较为清晰的特异性条带。酶活测定结果表明,重组菌粗酶液活力为12.4U/mL,均比亲本酶（0.8U/mL）和EglC22b（9.5 U/mL）活性要高。重组酶ProS-EglC最适反应pH为7.0,在pH6.5-8.0之间活性较高,并具有良好的pH稳定性。ProS-EglC最适温度为30-40℃,当温度低于5℃时,酶活还保持最高酶活的50%以上,与亲本酶和EglC22b的温度性质一致。Co2+可增强重组酶活性,而Zn2+、Li+、DMSO、Tween80、SDS和EDTA会抑制重组酶活性。5Citrobacter farmeri A1低温内切β-葡聚糖酶（EglC）基因在毕赤酵母中的表达及重组酶酶学性质分析根据EglC基因全长序列及真核表达质粒pPICZαA的特点设计真核表达引物PEglC-F和PEglC-R,以试验三含有T克隆质粒pMD20-T-EglC为模板,扩增得到真核表达基因PEglC,将该基因的正确开放阅读框融合于新一代真核表达质粒pPICZαA上,再整合进入P.pastoris X-33染色体,可望高效表达靶基因的编码产物。重组菌P.pastorispPICZαA-PEglC,经0.8%的甲醇诱导96 h后,粗酶液酶活达21.6 U/mL。SDS-PAGE电泳分析显示分子量约38 kDa。重组酶最适pH是7.0,在pH 6.0-8.0内保持85%以上残余酶活。该酶最适温度为30-40℃,5-20℃仍具50%以上酶活,在40-50℃具有良好的稳定性,说明该酶属于低温酶。不同化学试剂和金属离子对重组酶P-FglC的影响结果表明Co2+可增强重组酶活性;Zn2+、Li+、DMSO、Tween80、EDTA和SDS会抑制其活力。6低温内切β-葡聚糖酶（ElgC）基因的密码子优化设计及其在毕赤酵母中的表达虽然基因工程菌Pichia astoris pPICZaA-PEglC既是分泌表达,又显着提高了表达水平,但是其表达水平还有进一步的提升空间。利用全基因合成技术,对基因进行密码子优化,提高重组内切β-葡聚糖酶的表达水平。在不改变原基因氨基酸的基础上,优先采用Pichia pastoris频率最高的同义密码子,少数采用次偏爱密码子,尽量平衡AT与GC含量,降低mRNA二级结构的稳定性,设计并全基因合成优化后的低温内切β-葡聚糖酶基因。优化基因SEglC与原基因核苷酸序列比较结果表明两者同源性约为70.89%,G+C含量从58.4%降到41.1%。运用GeneQuest软件对原基因和优化基因的RAN二级结构折叠情况进行预测,自由能由-296.03 kJ/mol（EglC）变为-184.08 kJ/mol（SEglC）。将分泌型真核表达质粒pPICZaA-SEglC电转化至Pichia pastoris X-33染色体中得到阳性转化子,优化后的SEglC表达水平明显高于原EglC基因的表达。重组菌Pichia pastoris pPICZaA-PEglC经甲醇诱导96 h后,发酵表达量可达633μg/mL,粗酶液活性达到36.2U/mL。重组菌经十代连续培养诱导,染色体仍含有SEglC基因,具有良好的遗传稳定性。综上所述,本研究成功从白蚁肠道内筛选出产低温内切β-葡聚糖酶的菌株Citrobacter farmeriA1,并纯化该低温EglC,酶学性质表明该酶属于低温酶。为了进一步提高产酶水平,经过宿主和密码子的双重优化,最终构建了高产低温内切β-葡聚糖酶基因工程Pichia pastoris pPICZaA-SEglC,其产量高于原基因在E.coli和Pichia pastoris中的表达水平,更是天然菌株Citrobacter farmeri A1产酶水平的45.3倍。因此,本研究结果丰富了白蚁肠道内切β-葡聚糖酶的基因库资源,为开展低温内切β-葡聚糖酶的外源表达及活性功能研究提供了借鉴,并为其今后在生产中的应用奠定基础。
陈娇玲[7]（2017）在《Fibulorhizoctonia sp.真菌转录组及其与圆唇散白蚁的关系研究》文中进行了进一步梳理昆虫与真菌之间的关系十分密切。我们首次在圆唇散白蚁Reticulitermes labralis（Hsia）蚁巢的卵堆中发现了一种真菌菌核,经过分子鉴定为Fibulorhizoctonia sp.。该菌核是一种球形或近球形的棕褐色颗粒,直径为0.30-0.40 mm,质地坚硬饱满,能萌发密集的白色菌丝,菌丝的生长方式为蔓延发射状。目前关于该真菌的研究报道非常少。本研究通过观察四种散白蚁搬运Fibulorhizoctonia sp.菌核、菌核在圆唇散白蚁R./abralis巢内的发育、圆唇散白蚁 R.labralis识别卵和菌核的行为观察实验、Fibulorhizoctoniasp.真菌转录组测序以及该真菌纤维素酶基因表达研究,揭示了圆唇散白蚁R.labralis与菌核之间的关系,即工蚁可以通过取食菌丝获取额外的纤维素酶和能量。研究得到以下结果和结论:1.在圆唇散白蚁R.labralis、尖唇散白蚁R.aculabialis、黄胸散白蚁 R.flavicep和黑胸散白蚁 R.chinensi 的巢中放入菌核,我们发现除了尖唇散白蚁 R.aculabialis之外,其他三种散白蚁都会将Fibulurhizoctonia sp.菌核搬进蚁巢内并和白蚁卵放在一起照料;将菌核和卵放在一起时,工蚁先搬卵后搬运菌核,表明圆唇散白蚁R.labralis工蚁能够准确辨别白蚁卵和真菌菌核。2.在没有白蚁的培养皿或木屑内,菌核能够不断萌发密集的菌丝,但在圆唇散白蚁R.labralis 巢内,我们从未观察到菌核萌发出菌丝,而且蚁巢内的菌核颜色由浅褐色变成深色甚至变成黑色,数量也越来越少。我们推测是工蚁取食了菌核萌发的菌丝,最终菌核老化。3.对Fibulorhizoctonia sp.真菌进行转录组测序分析,一共得到31,412,704 clean reads,样本产生了超过6G的数据量。基于总的clean data,得到了 28,026个Unigenes,通过Trinity程序组装的片段范围是201 bp到13,121 bp,平均长度为998 bp,N50长度为1,647 bp,Q20为96.9%,GC含量为53.57%。注释到NR的基因有17,291个,8,959个基因匹配到Swiss-Prot数据库中,有7,407个基因在KOG中匹配,4,990个基因在KEGG中匹配,在四个数据库中都有注释的基因数量是3,976个。本研究首次完成了Fibulorhizoctonia sp.真菌的转录组测序,在28,026个总Unigenes中,有17,399个有注释的功能基因,还有10,627个Unigenes不能根据已知基因信息对它们进行功能注释,其中可能存在该真菌特有的基因。4.通过实时定量PCR分析,我们在Fibulorhizoctonia sp.真菌中验证了 12个纤维素酶基因,其中包括3个外切葡聚糖酶,4个内切酶和5个β-葡糖苷酶。通过对尖唇散白蚁R.aculabialis 和圆唇散白蚁R.labralis体内3个纤维素酶基因相对表达水平的比较,发现在两种散白蚁中,β-葡糖苷酶（1）表达水平没有显着性差异;β-葡糖苷酶（2）在圆唇散白蚁R.labralis中的表达量约是尖唇散白蚁 R.aculabialis的1.4倍（P<0.05）;内切酶在圆唇散白蚁R.labralis中的表达量约是尖唇散白蚁R.aculabialis的1.9倍（P<0.05）。这3个纤维素酶基因表达量的差异,可能是因为两种散白蚁降解纤维素的效率不同,推测圆唇散白蚁R.labralis在纤维素酶合成与利用方面比尖唇散白蚁R.aculabialis更进化,这可能直接影响它们在个体发育及生殖能力方面的差异。
汪萍,朱金龙,张有森,王俊,朱艳燕,尹若春,张萍萍[8]（2016）在《基于线粒体COⅡ基因的安徽白蚁的分子鉴定及系统进化分析》文中进行了进一步梳理利用同源克隆技术分离了安徽省40个不同地理种群白蚁样品的线粒体XOⅡ基因,并进行了序列分析,结合GenBank中的数据,构建系统进化树并进行了遗传变异分析。序列比对分析表明,40个白蚁样品分属3个属（土白蚁属、散白蚁属、乳白蚁属）的6个种,3个属COⅡ全长基因中多态性位点分别占0.1%、9.2%和7.4%;基因序列中A+T含量为61.8%,显着高于C+G含量,碱基变异的主要形式为转换。同种白蚁个体间的碱基差异明显小于不同种间的差异,种内个体间的差异为0.1%1.3%,种间个体间的差异为5.5%7.6%。分子系统树表明,乳白蚁属和散白蚁属构成姐妹关系聚成一支,亲缘关系较近,而土白蚁属关系较远,分子鉴定及系统进化分析的结果与传统形态学结果相一致,是对形态分类的有力支持。
叶芸,杜丹尼,徐雪,杨晓军,王琴,王振华,黄求应[9]（2016）在《北美散白蚁与其他五种散白蚁兵蚁形态特征的比较》文中认为本研究利用兵蚁的形态特征量度比较了北美散白蚁（Reticulitermes flavipes）与常见黑胸散白蚁（R.chinensis）、黄胸散白蚁（R.flaviceps）、栖北散白蚁（R.speratus）、圆唇散白蚁（R.labralis）、尖唇散白蚁（R.aculabialis）的整体观、头部侧面观、头部正面观和上颚4个外部形态。结果表明,兵蚁头部、上颚、前胸背板的颜色及形状、触角节数、腹部颜色等体部特征都十分相似。将6种散白蚁兵蚁的全虫体长、头长至颚基、头长连上颚、头宽、前胸背板长、前胸背板宽、后足胫节长的量度进行比较,仅在全虫体长这一项量度上存在差异,其余部位的量度之间存在相互重叠的现象。由此表明北美散白蚁从兵蚁的形态特征与量度上很难与常见5种散白蚁进行准确区分,需通过兵蚁和有翅成虫的形态特征共同进行鉴定或通过分子生物学的方法进行鉴定。
张小晶[10]（2016）在《圆唇散白蚁生殖蚁转录组及表皮蛋白基因表达的研究》文中研究说明白蚁品级分化具有典型的非遗传多型性。在许多白蚁的种类中,尤其在散白蚁属Reticulitermes中,生殖品级表现出灵活的可塑性。在圆唇散白蚁R. labralis （Hisa）中,由若蚁可以分化为三种生殖蚁,翅芽型补充生殖蚁（brachypterous neotenics, BN）、拟成虫型补充生殖蚁（adultoid neotenics, AN）和长翅成虫（alate reproductives, AR）,三者之间在形态及生殖行为上有显着差异。目前关于生殖蚁品级分化以及功能性基因的研究非常少。本文通过对由若蚁分化而来的长翅成虫、翅芽型补充生殖蚁和拟成虫型补充生殖蚁进行了转录组测序研究,并揭示三种生殖蚁在表皮蛋白基因表达,以及其不同的形态特征与各自的生活习性和繁殖方式之间的关系。分析比较得到以下结果和结论：1.长翅成虫的色素沉积和角质化程度比翅芽型补充生殖蚁和拟成虫型补充生殖蚁显着的高。经测量三种生殖蚁的体长无显着性差异,而翅的长度,翅芽型补充生殖蚁的翅长显着短与拟成虫型补充生殖蚁和长翅成虫,而后两者翅长无显着性差异。2.三种生殖蚁分化当天,卵母细胞发育处于相同水平,即处于生长期；长翅成虫在婚飞前,卵母细胞已经发育成熟,出现卵黄颗粒,在建立新巢之前,可以尽快产卵,在短时间内孵化后代,减轻长翅成虫繁重的工作量,提高存活率。3.AN,BN和AR经过转录组测序分析,共测得404,152,188 clean reads,组装61,953个unigenes,片段范围从201bp到17,328bp,平均长度为905bp。通过与四大数据库比对,其中有17,444个unigenes在Nr数据库中匹配,13,178unigenes在Swiss-prot中匹配,5,901 unigenes在COG数据库中匹配,6,784个unigenes在KEGG数据库中匹配。通过AN与BN阶段的转录组数据相比,38个unigenes发生改变,有26个unigenes呈现上调趋势,有12个unigenes呈现下调趋势；AN与AR阶段的数据相比较,4613个unigenes发生改变,其中有3358个unigenes呈现上调趋势,有1255个unigenes呈现下调趋势；BN和AR发育阶段的数据比较显示,3933个unigenes发生变化,其中有2269个基因呈现上调趋势,有1664个基因呈现下调趋势。本研究首次完成了圆唇散白蚁的转录组测序,发现了许多已知的保守序列,即已有的注释的功能基因,还发现44,320个未知基因,可能是圆唇散白蚁中特有的功能性基因。4.通过实时定量PCR,我们在BN、AN和AR中验证了7个有显着差异的表皮蛋白基因。通过验证可知,RR-2 motif 67 precursor在AR中表达水平显着高于BN和AN,约是BN的2064倍（p<0.05）,AN的166倍。RR-2 famliy member 15 precursor在AR中表达水平显着高于AN和BN,约是BN的74倍（p<0.05）,AN的312倍;BN和AN的基因表达水平无显着性差异。RR-1 famliy member 16 precursor相对于RR-2家族和CPG家族的基因,表达水平较低,在AN和AR中的表达量显着高于BN中的基因表达量,而AN和AR基因表达无显着性差异。在CPG家族中,CPG12-like precursor和PpolCPG24基因在AR中表达水平显着高于AN和BN,而且在AN和BN中基因表达水平无显着性差异。另外,两个未分类的表皮蛋白基因在AR中表达显着高于AN和BN。在三种生殖蚁中,同一个表皮蛋白在不同的发育阶段所表达的含量高低不同,说明表皮蛋白基因的表达,具有品级分化特异性。
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本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要符号对照表 |
| 文献综述部分 |
| 第一章 纤维素生物质降解酶概述及宏基因组学研究进展 |
| 前言 |
| 1.1 木质纤维素酶的组成及降解作用 |
| 1.1.1 木质纤维素的组成 |
| 1.1.2 木质纤维素的降解方法 |
| 1.1.3 纤维素酶的组成及降解作用 |
| 1.1.4 半纤维素酶的组成及降解作用 |
| 1.2 产纤维素酶和半纤维素酶的微生物来源 |
| 1.2.1 植食性动物胃肠道微生物来源 |
| 1.2.2 其他微生物来源 |
| 1.3 利用宏基因组学技术挖掘纤维素降解酶基因 |
| 1.3.1 宏基因组学概述 |
| 1.3.2 胃肠道微生物来源纤维素酶基因的宏基因组筛选 |
| 1.4 纤维素酶在畜牧业中的应用 |
| 1.4.1 在反刍动物的应用 |
| 1.4.2 在单胃动物的应用 |
| 1.5 研究的目的及意义 |
| 1.6 技术路线 |
| 试验研究部分 |
| 第二章 不同植食性动物胃肠道微生物差异性分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 样品收集 |
| 2.1.2 主要仪器与试剂 |
| 2.1.3 木材表面形态结构、纤维素结晶度及基团测定 |
| 2.1.4 微生物基因组DNA的提取及检测 |
| 2.1.5 文库构建及宏基因组测序 |
| 2.1.6 序列质量控制和基因组的拼接组装 |
| 2.1.7 基因预测 |
| 2.1.8 非冗余基因集的构建及基因丰度的计算 |
| 2.1.9 物种注释 |
| 2.1.10 统计学分析 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 木材被蛀食后的表面形态结构、纤维素结晶度以及基团变化 |
| 2.2.2 植食性动物胃肠道宏基因组直接测序数据统计 |
| 2.2.3 植食性动物胃肠道微生物的结构组成 |
| 2.2.4 宏基因组学比较不同植食性动物胃肠道微生物的组成差异 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 被蛀食后的木材表面形态结构、纤维素结晶度及基团变化 |
| 2.3.2 植食性动物胃肠道微生物的组成及差异分析 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 胃肠道中纤维素酶/半纤维素酶基因丰度的差异比较 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 样品来源 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 纤维素酶和半纤维素酶活性测定方法 |
| 3.1.4 功能注释 |
| 3.1.5 统计学分析 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 三种植食性动物胃肠道中纤维素酶和半纤维素酶的活性比较 |
| 3.2.2 植食性动物胃肠道微生物碳水化合物代谢通路差异分析 |
| 3.2.3 胃肠道宏基因组中与纤维素/半纤维素降解相关的GHs丰度差异 |
| 3.2.4 不同胃肠道中主要纤维素和半纤维素降解酶的基因丰度差异 |
| 3.2.5 西藏山羊瘤胃差异菌种及酶类在碳水化合物代谢中的作用 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 宏基因组Fosmid文库的构建及纤维素酶基因的挖掘 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 样品来源 |
| 4.1.2 主要仪器与试剂 |
| 4.1.3 分子生物学操作试剂盒及工具酶 |
| 4.1.4 高分子量基因组DNA提取 |
| 4.1.5 Fosmid文库构建 |
| 4.1.6 从宏基因组Fosmid文库功能性筛选阳性克隆子 |
| 4.1.7 Fosmid质粒的提取 |
| 4.1.8 亚克隆文库的构建与功能基因的筛选 |
| 4.1.9 序列分析及蛋白质三级结构预测 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 利用植食性动物胃肠道宏基因组构建Fosmid文库 |
| 4.2.2 Fosmid文库中产纤维素酶和木聚糖酶的克隆子筛选 |
| 4.2.3 亚克隆文库的构建 |
| 4.2.4 功能酶基因序列分析 |
| 4.2.5 Y14的序列分析及蛋白质三级结构预测 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 基因异源表达及双功能纤维素酶对秸秆降解效果研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 菌株和质粒 |
| 5.1.2 分子生物学操作试剂盒及工具酶 |
| 5.1.3 引物序列 |
| 5.1.4 主要试剂与仪器 |
| 5.1.5 纤维素酶基因克隆及表达质粒构建 |
| 5.1.6 纤维素酶基因的异源表达及功能验证 |
| 5.1.7 重组工程菌的诱导表达 |
| 5.1.8 SDS-PAGE电泳和蛋白浓度测定 |
| 5.1.9 酶学性质分析 |
| 5.1.10 不同粗酶液对小麦秸秆和稻草的降解效果评估 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 重组质粒的构建及基因工程菌的功能验证 |
| 5.2.2 双功能纤维素酶基因的诱导表达 |
| 5.2.3 双功能蛋白浓度测定 |
| 5.2.4 双功能纤维素酶Rbs A、A2-Y12-2和Y14的酶学性质研究 |
| 5.2.5 双功能酶对小麦秸秆和稻草中粗纤维含量的影响 |
| 5.2.6 稻草和小麦秸秆被双功能纤维素酶分解后表面形态的变化 |
| 5.2.7 稻草和小麦秸秆被双功能酶分解后纤维素结晶度的变化 |
| 5.2.8 稻草和小麦秸秆被双功能酶分解后的基团变化 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 结论 |
| 6.1 总结 |
| 6.2 创新点 |
| 6.3 有待进一步研究的问题 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录A 圆唇散白蚁和松瘤象微生物基因组DNA提取方法 |
| 附录B 构建PE文库 |
| 附录C 不同培养基配制方法 |
| 附录D 瘤胃内容物中微生物高分子量基因组DNA提取方法 |
| 附录E Fosmid质粒提取方法 |
| 附录F 应用滤袋技术测定粗纤维洗涤(CF)的方法 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 白蚁的分类地位 |
| 1.2 白蚁的品级及社会分工 |
| 1.2.1 生殖型白蚁 |
| 1.2.2 非生殖型白蚁 |
| 1.3 白蚁和真菌的关系 |
| 1.4 白蚁降解木质纤维素 |
| 1.4.1 木质纤维素概述 |
| 1.4.2 白蚁及其肠道微生物降解木质纤维素 |
| 1.5 转录组概述及在白蚁中的应用 |
| 1.6 研究目的和意义 |
| 第二章 白蚁巢中菌核的发育及取食菌丝的研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 菌核的培养 |
| 2.1.2 圆唇散白蚁和黑胸散白蚁实验巢群的建立 |
| 2.1.3 散白蚁对菌丝的取食 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 白蚁巢中菌核的发育 |
| 2.2.2 两种散白蚁取食菌丝 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 三种散白蚁转录组的测定及木质素降解酶研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 样品的收集 |
| 3.1.2 总RNA的提取 |
| 3.1.3 RNA测序文库的构建 |
| 3.1.4 转录组序列组装 |
| 3.1.5 进行生物信息学方面分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 转录组序列组装 |
| 3.2.2 四大数据库注释 |
| 3.2.3 功能注释 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 漆酶相关基因在三种散白蚁工蚁中的差异表达 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 样品的收集 |
| 4.1.2 RNA提取 |
| 4.1.3 合成cDNA |
| 4.1.4 引物的设计和筛选 |
| 4.1.5 qRT-PCR差异表达 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 漆酶在三种散白蚁种间的差异表达 |
| 4.2.2 散白蚁巢中有无真菌Fibulorhizoctonia sp.存在时工蚁漆酶的表达 |
| 4.3 讨论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士期间的科研成果 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1.前言 |
| 1.1 线粒体基因组介绍 |
| 1.1.1 线粒体 |
| 1.1.2 线粒体基因组 |
| 1.1.3 线粒体基因组应用方法 |
| 1.2 白蚁简介 |
| 1.2.1 白蚁的分类 |
| 1.2.2 白蚁的种类和分布 |
| 1.2.3 本研究中等翅目三个属概述 |
| 1.3 白蚁线粒体基因组研究现状 |
| 1.3.1 白蚁线粒体全基因组 |
| 1.3.2 白蚁部分线粒体基因组 |
| 1.3.3 白蚁线粒体基因组应用 |
| 1.4 DNA条形码的开发 |
| 1.4.1 DNA条形码简介 |
| 1.4.2 DNA条形码分析方法 |
| 1.4.3 DNA条形码在白蚁上的应用 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 研究材料 |
| 2.1.1 白蚁样本 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验器材 |
| 2.2 研究方法 |
| 2.2.1 DNA提取和保存 |
| 2.2.2 引物设计 |
| 2.2.3 PCR扩增和克隆测序 |
| 2.2.4 序列拼接和注释分析 |
| 2.2.5 系统发育分析 |
| 3.结果与分析 |
| 3.1 六种白蚁线粒体全基因组序列分析 |
| 3.1.1 小楹白蚁线粒体全基因组 |
| 3.1.1.1 基因组概述和结构 |
| 3.1.1.2 碱基组成 |
| 3.1.1.3 基因间隔区和重叠区 |
| 3.1.1.4 蛋白编码基因 |
| 3.1.1.5 核糖体RNA和转运RNA |
| 3.1.1.6 控制区 |
| 3.1.2 新渡户近扭白蚁和古田近扭白蚁线粒体全基因组分析 |
| 3.1.2.1 基因组概述和结构 |
| 3.1.2.2 碱基组成 |
| 3.1.2.3 基因间隔区和重叠区 |
| 3.1.2.4 蛋白编码基因 |
| 3.1.2.5 核糖体RNA和转运RNA |
| 3.1.2.6 控制区 |
| 3.1.3 近黄胸散白蚁,近圆唇散白蚁和细颚散白蚁线粒体全基因组 |
| 3.1.3.1 基因组概述和结构 |
| 3.1.3.2 碱基组成 |
| 3.1.3.3 基因间隔区和重叠区 |
| 3.1.3.4 蛋白编码基因 |
| 3.1.3.5 核糖体RNA和转运RNA |
| 3.1.3.6 控制区 |
| 3.1.4 系统发育分析建树结果 |
| 3.1.4.1 最大似然法(ML)构建的系统发育树 |
| 3.1.4.2 邻位相连法(NJ)构建的系统发育树 |
| 3.1.5 小结和讨论 |
| 3.2 六种等翅目白蚁线粒体基因组成比较 |
| 3.2.1 六种白蚁整体概述 |
| 3.2.2 碱基组成差异分析 |
| 3.2.3 基因间隔区和重叠区差异分析 |
| 3.2.4 蛋白编码基因差异分析 |
| 3.2.5 核糖体RNA和转运RNA差异分析 |
| 3.2.6 控制区差异分析 |
| 3.2.7 小结和讨论 |
| 3.3 散白蚁属白蚁线粒体基因组DNA条形码开发 |
| 3.3.1 分子标记基因筛选及DNA条形码确定 |
| 3.3.2 DNA条形码可行性分析 |
| 3.3.3 DNA条形码功能验证及应用 |
| 3.3.4 小结和讨论 |
| 4.全文总结和讨论 |
| 4.1 全文总结 |
| 4.2 创新点 |
| 4.3 全文讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间发表的文章 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 前言 |
| 1.1 白蚁品级 |
| 1.1.1 非繁殖型品级 |
| 1.1.2 繁殖型品级 |
| 1.2 白蚁的品级分化 |
| 1.2.1 白蚁品级发育路径 |
| 1.2.2 白蚁品级分化的调节机制 |
| 1.3 工蚁向补充生殖蚁的分化 |
| 1.3.1 转化过程中性腺的发育 |
| 1.3.2 转化过程中生殖细胞的发育 |
| 1.4 RNA-Seq技术以及在昆虫中的研究应用 |
| 1.4.1 RNA-Seq技术 |
| 1.4.2 RNA-Seq在昆虫中的应用研究 |
| 1.4.3 RNA-Seq在白蚁中的应用研究 |
| 1.5 研究目的与意义 |
| 第二章 雌性工蚁向补充繁殖蚁转化中不同时期转录组测序分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 样品收集 |
| 2.1.2 转录组denovo测序流程 |
| 2.1.3 RNA-Seq生物信息分析 |
| 2.1.4 差异表达基因的趋势分析 |
| 2.2 转录组测序结果与分析 |
| 2.2.1 测序样品总RNA质检结果 |
| 2.2.2 测序数据的denove组装结果 |
| 2.2.3 Unigene功能注释 |
| 2.2.4 RNA-Seq数据分析结果 |
| 2.2.5 Worker、IW、NR样本间DEGs的趋势分析 |
| 2.2.6 Ras信号通路基因的筛选 |
| 2.2.7 免疫相关基因的筛选 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 转录组测序结果分析 |
| 2.3.2 Worker、IW和NR差异表达基因分析 |
| 2.3.3 关键调控基因的筛选 |
| 第三章 Ras信号通路相关基因及免疫相关基因在雌性工蚁向补充繁殖蚁转化中的表达研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 样品收集 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 差异表达基因引物验证结果 |
| 3.2.2 差异基因荧光定量PCR验证结果 |
| 3.2.3 Ras和CaM在工蚁向补充繁殖转化中的表达 |
| 3.2.4 Transferrin在工蚁向补充繁殖转化中的表达量比较 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 测序结果的qRT-PCR验证 |
| 3.3.2 工蚁隔离过程中关键基因Ras分析 |
| 3.3.3 CaM在工蚁转化过程中的表达规律研究 |
| 3.3.4 CaM对Ras信号通路的调控 |
| 3.3.5 免疫相关基因的表达变化 |
| 第四章 促性腺激素释放激素受体在雌性工蚁向补充繁殖蚁转化中的表达研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 样品收集 |
| 4.1.2 引物设计 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 引物验证结果 |
| 4.3.2 qRT-PCR结果分析 |
| 4.4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 痤疮丙酸杆菌概述 |
| 1.1.1 痤疮丙酸杆菌的特性 |
| 1.1.2 痤疮丙酸杆菌与痤疮等疾病的关系 |
| 1.2 微生物的生长条件因素 |
| 1.2.1 几种常见因素对微生物生长速率的影响 |
| 1.2.2 不同碳源对微生物生长速率的影响 |
| 1.2.3 信号分子对微生物生长的影响 |
| 1.3 阿魏酸乙酯的功能 |
| 1.3.1 阿魏酸乙酯的常见功能 |
| 1.3.2 阿魏酸乙酯作为信号分子的研究 |
| 1.4 白蚁及其肠道共生痤疮丙酸杆菌 |
| 1.4.1 白蚁及其生态学功能 |
| 1.4.2 白蚁共生微生物的种类和功能 |
| 1.5 本课题的研究目的、意义及技术路线 |
| 1.5.1 本课题的研究目的及意义 |
| 1.5.2 本课题的技术路线 |
| 第二章 圆唇散白蚁肠道内痤疮丙酸杆菌的筛选与鉴定 |
| 2.1 实验材料与仪器 |
| 2.1.1 试验用白蚁 |
| 2.1.2 主要培养基及溶液试剂 |
| 2.1.3 主要实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 圆唇散白蚁肠道菌悬液的制备 |
| 2.2.2 圆唇散白蚁肠道内以阿魏酸乙酯为碳源目的菌株的筛选 |
| 2.2.3 菌株AYC-1的保藏 |
| 2.2.4 菌株AYC-1基因组DNA的提取 |
| 2.2.5 引物设计及合成 |
| 2.2.6 PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 以阿魏酸乙酯为唯一碳源的目的菌株筛选结果 |
| 2.3.2 菌株AYC-1目的基因的克隆结果分析 |
| 2.3.3 分离菌株的16S rDNA同源性对比结果 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 不同痤疮丙酸杆菌的生长特性研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 菌株 |
| 3.1.2 实验仪器 |
| 3.1.3 主要实验化学试剂及培养基 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 菌株AYC-1培养条件的优化 |
| 3.2.2 不同阿魏酸乙酯浓度下菌株AYC-1的生长试验 |
| 3.2.3 菌株AYC-1在厌氧无阿魏酸乙酯的固体培养基上的生长试验 |
| 3.2.4 菌株AYC-1在不添加氮源培养基上的生长试验 |
| 3.2.5 P.acne(ATCC6919)真空冷冻干燥菌种恢复培养 |
| 3.2.6 菌株AYC-1与典型菌株ATCC 6919菌丝形态的对比 |
| 3.2.7 菌株AYC-1与典型菌株ATCC 6919在阿魏酸乙酯平板上的菌丝生长速度检测 |
| 3.2.8 阿魏酸乙酯对其它产阿魏酸酯酶细菌生长的影响 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 菌株AYC-1培养条件优化结果分析 |
| 3.3.2 不同阿魏酸乙酯浓度下菌株AYC-1的生长结果分析 |
| 3.3.3 菌株AYC-1在厌氧无阿魏酸乙酯添加的PYG固体培养基上的生长结果 |
| 3.3.4 菌株AYC-1在不添加氮源培养基上的生长试验结果 |
| 3.3.5 菌株AYC-1与典型菌株ATCC 6919菌丝形态的对比结果 |
| 3.3.6 菌株AYC-1与典型菌株ATCC 6919在筛选培养基上的菌丝生长速度检测结果 |
| 3.3.7 阿魏酸乙酯对其它产阿魏酸酯酶细菌生长的影响 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 菌株AYC-1利用阿魏酸乙酯的代谢机制的研究 |
| 4.1 实验材料与仪器 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 主要实验化学试剂 |
| 4.1.3 实验仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 阿魏酸乙酯酶粗酶液制备 |
| 4.2.2 利用高效液相色谱法(HPLC)进行粗酶液酶活测定 |
| 4.2.3 以阿魏酸乙酯的水解产物为底物时菌体AYC-1的生长情况 |
| 4.2.4 利用GC/GC-MS对代谢中间产物的测定 |
| 4.2.5 菌株AYC-1在厌氧和好氧情况下的生长速率比较 |
| 4.2.6 以阿魏酸乙酯结构类似物为底物时痤疮丙酸杆菌的生长情况 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 阿魏酸酯酶粗酶液酶活测定分析 |
| 4.3.2 以阿魏酸乙酯的水解产物为底物时菌株AYC-1的生长结果 |
| 4.3.3 利用GC/GC-MS对代谢中间产物的测定结果分析 |
| 4.3.4 菌株AYC-1在厌氧和好氧情况下的生长速率对比结果分析 |
| 4.3.5 以阿魏酸乙酯结构类似物为底物时菌株AYC-1的生长结果分析 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 总结与展望 |
| 5.1 总结 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 展望 |
| 附录一 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 硕士期间发表的学术论文 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要缩略词中英文对照 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 纤维素与纤维素酶 |
| 1 纤维素 |
| 1.1 纤维素的来源 |
| 1.2 纤维素的结构 |
| 2 纤维素酶 |
| 第二章 内切β-葡聚糖酶概述 |
| 1 内切β-葡聚糖酶来源 |
| 1.1 产内切β-葡聚糖酶的微生物 |
| 1.2 产内切β-葡聚糖酶的植物 |
| 1.3 产内切β-葡聚糖酶的动物 |
| 2 内切β-葡聚糖酶性质 |
| 3 内切β-葡聚糖酶基因工程研究进展 |
| 3.1 内切β-葡聚糖酶在原核生物中表达 |
| 3.2 内切β-葡聚糖酶在真核生物中表达 |
| 4 内切β-葡聚糖酶的应用 |
| 4.1 在动物营养与青贮饲料工业的应用 |
| 4.2 在能源和环境保护的应用 |
| 4.3 在食品工业的应用 |
| 4.4 在洗涤工业的应用 |
| 4.5 在造纸工业的应用 |
| 第三章 白蚁与内切β-葡聚糖酶 |
| 1 白蚁简介 |
| 2 白蚁纤维素酶来源 |
| 2.1 白蚁体内的原生动物 |
| 2.2 白蚁体内的共生细菌 |
| 2.3 白蚁自身分泌产生 |
| 2.4 白蚁体外共生的真菌 |
| 第四章 低温内切β-葡聚糖酶研究进展 |
| 1 低温内切β-葡聚糖酶的来源 |
| 2 低温内切β-葡聚糖酶酶学性质 |
| 3 低温内切β-葡聚糖酶适冷机理的研究 |
| 4 低温内切β-葡聚糖酶基因工程研究 |
| 第五章 研究目的、意义和内容 |
| 1 研究目的 |
| 2 研究意义 |
| 3 研究内容 |
| 第二篇 试验部分 |
| 第一章 圆唇散白蚁肠道产低温内切β-葡聚糖酶(EglC)共生菌筛选及酶的分离纯化 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 低温EglC分泌菌株的筛选 |
| 2.2 低温EglC产酶菌株纤维素酶活性测定 |
| 2.3 菌株的分子生物学鉴定 |
| 2.4 低温EglC纯化结果 |
| 2.5 低温EglC酶学性质分析 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 第二章 Citrobaeter farmeriA1低温内切β-葡聚糖酶(EglC)基因的扩增、克隆及其序列分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 总DNA的提取 |
| 2.2 EglC保守结构序列扩增 |
| 2.3 全长EglC基因序列扩增 |
| 2.4 EglC基因的T克隆 |
| 2.5 EglC基因核苷酸序列分析 |
| 2.6 EglC氨基酸序列及其高级结构分析 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 Citrobacter farmeriA1低温内切β-葡聚糖酶(EglC)基因在大肠杆菌中的表达及重组酶酶学性质分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 原核表达EglC基因的扩增 |
| 2.2 原核表达EglC基因的T克隆 |
| 2.3 原核蛋白表达重组质粒的构建 |
| 2.4 重组表达菌的转化和IPTG诱导结果 |
| 2.5 重组表达菌的产酶活性 |
| 2.6 EglC酶学性质分析 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 Citrobacter farmeri A1低温内切β-葡聚糖酶(EglC)基因与新型标签Protein S tag的融合表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 融合表达设计 |
| 2.2 新型载体pET-ProS载体的构建 |
| 2.3 原核表达质粒pET(ProS-EglC)的构建 |
| 2.4 重组表达菌的转化和IPTG诱导结果 |
| 2.5 重组表达菌的产酶活性 |
| 2.6 ProS-EglC酶学性质分析 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第五章 Citrobacter farmeri A1低温内切β-葡聚糖酶(EglC)基因在毕赤酵母中的表达及重组酶酶学性质分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 真核表达EglC基因的扩增 |
| 2.2 真核表达EglC基因的T克隆 |
| 2.3 真核蛋白表达质粒pPICZαA-PEglC的构建 |
| 2.4 重组载体pPICZaA-PEglC线性化 |
| 2.5 电转和筛选 |
| 2.6 重组毕赤酵母阳性克隆子诱导结果 |
| 2.7 重组酶P-EglC酶学性质分析 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第六章 内切β-葡聚糖酶(ElgC)的密码子优化设计及其在Pichia pastorisi中的表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 密码子优化SEglC基因的设计与合成 |
| 2.2 SEglC基因与EglC基因比较分析 |
| 2.3 重组表达质粒的转换与筛选 |
| 2.4 重组菌P.pastoris pPICZΩA-SEglC的诱导及其重组酶纯化 |
| 2.5 重组菌P.pastoris pPICZαA-SEglC遗传稳定性 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 全文总结 |
| 论文创新之处 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 白蚁生物学 |
| 1.2 白蚁与真菌的关系 |
| 1.3 真菌与白蚁的纤维素酶 |
| 1.3.1 纤维素酶 |
| 1.3.2 真菌产生的纤维素酶 |
| 1.3.3 白蚁肠道中的纤维素酶 |
| 1.3.4 白蚁内源性纤维素酶 |
| 1.4 转录组简介 |
| 1.4.1 转录组概述 |
| 1.4.2 转录组生物信息学分析 |
| 1.4.3 真菌转录组研究进展 |
| 第二章 散白蚁对卵和真菌的识别 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料的准备 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 四种散白蚁的工蚁搬菌核实验 |
| 2.2.2 圆唇散白蚁对卵和菌核识别实验 |
| 2.2.3 不规则形状及破碎菌核搬运实验 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 Fibulorhizoctonia sp.菌核在圆唇散白蚁巢内的发育 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 材料的准备 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 菌核在圆唇散白蚁巢内的外形和数量变化 |
| 3.2.2 菌核组织切片 |
| 3.2.3 菌核在不同条件下的萌发 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 Fibulorhizoctonia sp.真菌转录组的测定 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 材料的准备 |
| 4.1.2 实验方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 Illumina测序数据和组装 |
| 4.2.2 Fibulorhizoctonia sp.真菌转录组的功能性分析 |
| 4.2.3 GO,COG/KOG和KEGG数据库的功能分类 |
| 4.2.4 简单重复序列(Simple sequence repeat,SSR)的发现 |
| 4.2.5 预测蛋白编码框(Protein Coding prediction,CDS) |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 纤维素酶相关基因在散白蚁和菌核中的表达 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.1.1 材料的准备 |
| 5.1.2 实验方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 真菌Fibulorhizoctonia sp.纤维素酶的荧光定量分析 |
| 5.2.2 尖唇散白蚁和圆唇散白蚁体内纤维素酶基因表达 |
| 5.3 讨论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士期间的科研成果 |
| 致谢 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 白蚁基因组DNA的提取 |
| 1.2.2 COⅡ基因的PCR扩增 |
| 1.2.3 目的基因的克隆与鉴定 |
| 1.2.4 序列分析及系统发育分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 COⅡ全长基因的克隆与白蚁的分子鉴定 |
| 2.2 白蚁C0Ⅱ基因的序列组成及变异分析 |
| 2.3 遗传距离分析 |
| 2.4 基于COⅡ基因序列的系统进化分析 |
| 3 结论 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 样品的采集与保存 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 散白蚁兵蚁形态鉴定主要依据 |
| 1.2.2 散白蚁兵蚁分类鉴定特征 |
| 1.2.3 散白蚁兵蚁图像采集 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 散白蚁兵蚁形态特征 |
| 2.1.1 黑胸散白蚁 |
| 2.1.2 黄胸散白蚁 |
| 2.1.3 栖北散白蚁 |
| 2.1.4 尖唇散白蚁 |
| 2.1.5 圆唇散白蚁 |
| 2.1.6 北美散白蚁 |
| 2.2 散白蚁兵蚁形态特征与量度比较 |
| 3 小结与讨论 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 白蚁品级 |
| 1.1.1 生殖型个体 |
| 1.1.2 非繁殖型个体 |
| 1.2 社会性昆虫品级分化的基因调节 |
| 1.3 高通量测序的研究进展 |
| 1.3.1 转录组测序 |
| 1.3.2 白蚁转录组研究进展 |
| 第二章 三种生殖蚁的形态和卵子发生的比较 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 材料的准备 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.2 结果分析 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 不同类型生殖蚁转录组的测定 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 材料的准备 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 Illumina测序数据和组装 |
| 3.2.2 圆唇散白蚁转录组功能性分析 |
| 3.2.3 GO,COG和KEGG数据库的功能分类 |
| 3.2.4 简单重复序列的发现 |
| 3.2.5 预测蛋白编码框 |
| 3.2.6 不同发育阶段基因的差异分析 |
| 3.2.7 表皮蛋白基因的表达 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 三种生殖蚁表皮蛋白基因的表达 |
| 4.1 材料的准备和方法 |
| 4.1.1 材料的准备 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果分析 |
| 4.3 讨论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
