张栋[1]（2021）在《不同微观结构钙磷陶瓷颗粒材料成骨及Notch信号通路表达差异的研究》文中研究指明背景骨再生和组织工程学近年来是颌面外科骨缺损和骨修复的热点,随着人们对各种修复材料研究的逐步加深,基于生物相容性、骨传导性、骨诱导性等多维度的骨缺损修复材料指标,发现双相钙磷陶瓷（biphasic calcium phosphate,BCP）具备强大的临床应用潜能,BCP是将羟基磷灰石（hydroxyapatite,HA）和β-磷酸三钙（β-tricalciumphosphate,β-TCP）按照适宜的比例搭配混合后烧结的一种特殊材料,利用化学共沉淀法制备两种组分的粉末材料,固态机械混合法将两者充分混匀后,过氧化氢发泡法制备合适孔隙率,在适宜温度下烧结的BCP材料,可以很好的结合两种组分的优点,在可降解性、机械强度等方面避免了单一材料的不足,具备更优异的成骨效果。作为一种生物相容性材料,其组分的配比、宏观和微观的结构都会对性能产生巨大的影响,进一步的探索优化宏观和微观结构等各种参数和标准的方式,具备重要的科研价值。骨组织的再生功能呈现一种动态平衡状态,其功能的实现,需要多条信号通路的介导,包括了 Notch信号通路、Wnt/β-catenin、BMP等。其中,Notch信号通路对生物材料介导的骨组织修复活动和骨骼发育尤为关键。因此我们在前期研究的基础上提出假说:“不同微观结构的BCP材料可能产生不同的成骨效果,其成骨效果的差异可能是通过增强或者抑制Notch信号通路的表达实现的”。本研究拟从信号通路水平探讨不同微观结构的BCP材料的成骨差异产生的原因,通过不同物种的原位成骨和异位成骨模型予以多方验证,为优化材料性能提供理论基础和实验证据,从而探讨在骨缺损和骨修复的临床治疗中BCP材料的应用前景。目的将HA及β-TCP以8:2的比例混合后在不同温度下烧结制备3种不同介孔直径的BCP,通过体外实验与体内实验检测不同介孔直径的BCP材料原位成骨和异位成骨能力的差异,为筛选具备最佳临床应用参数的BCP材料提供依据和思路。方法化学共沉淀法制备HA和β-TCP后,采用机械混合法和发泡法制备BCP材料,将HA及β-TCP以8:2的比例在1050℃,1150℃,1250℃条件下烧结,获得3种仅在材料介孔直径上存在差异的双相钙磷陶瓷,并通过X线衍射评估材料组成成分,压汞仪、扫描电镜、比表面积测试法（Brunauer-Emmett-Teller test,BET）测3种材料的基本参数。体外将SD大鼠骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cell,BMSC）分别与3种BCP材料共培养7天后,用扫描电镜和激光共聚焦显微镜观察细胞的黏附和形态,用CCK8法评估细胞增殖活性。qRT-PCR检测3种BCP材料Notch信号通路相关基因和成骨相关基因的表达水平。Western Blot检测3种BCP材料Notch信号通路相关通路蛋白和成骨相关蛋白的表达水平。体内将3种BCP分别植于SD大鼠股骨缺损内,于6w、12w取样后进行观察和组织学检测,测算新骨生成率,评估3种不同BCP的原位成骨能力,qRT-PCR检测3种BCP材料Notch信号通路相关基因和成骨相关基因的表达水平。同时,体内将3种BCP分别植于比格犬竖脊肌肌袋内,于1、2、3个月取样后进行观察和组织学检测,测算新骨生成率,评估3种不同BCP的异位成骨能力。qRT-PCR检测3种BCP材料Notch信号通路相关基因和成骨相关基因的表达水平。结果1.通过调整烧结温度,成功制备介孔直径分别为12.57nm（BCP1050）,9.56nm（BCP1150）,6.72nm（BCP1250）,孔隙率在 60%以上,HA/β-TCP 为 8:2 的 3种BCP材料。2.BMSCs在3种材料表面黏附、增殖存在明显差异,介孔直径较大的BCP1050的生物相容性较差。qRT-PCR和WB结果示:BCP1050可提前上调Nothc1,Hes-1,Col-I的表达。3.在SD大鼠的原位成骨模型中:与BCP1150和BCP1250相比较,介孔直径为12.57nm的BCP1050在术后6周的Tb.N和术后12周的BV/TV均显着升高。组织学检查结果示三种BCP材料的成骨面积均随时间而增加,BCP1050均高于BCP1150及BCP1250。qRT-PCR检测证实3种材料对Notch信号通路的上调能力存在差异,BCP1050对Notch信号的上调能力最强,并持续高表达。4.在比格犬竖脊肌异位成骨模型中,术后2个月开始3种材料颗粒孔隙内即可见明显的骨样组织沉积,随时间延长成骨量持续上升,术后3个月3种材料间隙成骨比例分别为 1050:48.75±4.20%,1150:29.48±1.55%,1250:26.58±3.86%。qRT-PCR检测证实BCP1050成骨相关基因的表达在2个月时出现峰值,其余两种材料成骨相关基因的表达状况随时间稳步上升。3种材料对Notch信号通路的上调能力存在差异,BCP1050对Notch信号的上调能力最强,并持续高表达,其余两组Notch信号通路相关基因和成骨相关基因的上调水平均呈现平稳上升趋势。结论1.BCP是一类生物相容性良好,具备优良原位成骨和异位成骨性能的生物材料。2.烧结温度降低能生成平均介孔直径较大的BCP材料,不同介孔直径的BCP具有不同的原位成骨、异位成骨和激活Notch信号通路的能力。3.原位成骨和异位成骨模型中,在较低温度下烧结的,具备较大介孔直径的BCP1050表现出更早激活Notch信号通路和更快成骨的能力。
刘宁[2]（2020）在《miR-181a-5p在后纵韧带骨化中的作用和机制研究》文中提出研究背景及目的后纵韧带骨化（ossification of the posterior longitudinal ligament,简称 OPLL）是一种常见的脊柱韧带异位骨化（heterotopicossification,简称HO）疾病。由于椎管内的空间有限,随着骨化物的生长,易造成相应水平的脊髓或神经根受压损伤,导致肢体感觉、运动功能障碍,严重影响人类的健康与生活质量。流行病学调查发现,OPLL主要发生在颈椎和胸椎,该部位所对应的脊髓功能一旦受损,所造成的神经功能障碍往往是广泛的,且对患者生活质量甚至生存时间造成严重的影响。目前有效的治疗方式是通过手术切除骨化物直接减压或通过扩大椎管容积间接减压解除骨化物对脊髓的直接压迫,但该部位手术风险高,手术过成中由于骨化物与硬脊膜往往存在不同程度的黏连,术者往往选择不切除或部分切除骨化物的手术方式,这也对术者的经验和技术提出了很高的要求。术后还存在骨化物继续生长甚至生长加速的情况,使得患者承受二次手术的风险。相关的病因学研究显示,年龄、肥胖、饮食、糖尿病、运动或脊柱的异常活动所造成的机械刺激、某些内分泌疾病,如甲状旁腺功能减退、肢端肥大症等都可以增加OPLL的患病风险,说明OPLL存在多种可能的致病因素。不论何种因素致病,最终都表现为后纵韧带局部异位骨化的形成以及逐渐增大的病理过程。因此,寻找OPLL中骨化物生成及生长的机制一直是该领域的研究热点之一。既往的研究显示许多成骨相关通路在后纵韧带骨化形成的过程中均被激活,包括 TGF-β/BMP 细胞通路、Wnt/β-catenin 通路、JAK-STAT 通路、PI3K/AKT 通路等。这些通过在骨折愈合、骨骼发育过程中也同样发挥作用。因此我们推测这些通路的激活可能存在更上游、更特异的调控因素。miRNA在人体发育、疾病、肿瘤中广泛发挥调控作用。体内正常的成骨过程也受到多种miRNA的调控。我所在的课题组通过比较PLL和OPLL细胞后发现,两者miRNA表达谱存在明显的差异,并初步发现miR-10a在后纵韧带骨化过程中发挥重要作用。miRNA对细胞功能的调控是一个复杂的网络,因此进一步深入研究miRNA在OPLL中发挥的调控作用及其机制,有助于进一步理解OPLL的发病机制,同时miRNA作为一种小分子也具有临床转化的潜力。基于以上理解,我所在的课题组通过测序发现OPLL与非OPLL患者后纵韧带miRNA表达谱存在明显差异,并且发现了 miR-10a-3p在后纵热带成骨过程中发挥重要作用。因此我们假设后纵韧带骨化过程中存在miRNA调控网络的异常。通过对之前测序数据的进一步分析,发现miR-181a-5p在OPLL患者后纵韧带组织中的表达量明显升高,同时也是表达量前十的miRNA之一,并且对其预测靶标进行GO通路分析显示与成骨相关通路关系密切,因此我们miR-181a-5p可能在后纵韧带骨化过程中发挥重要作用。本研究通过探索miR-181a-5p在原代后纵韧带细胞中的生物学特性,应用分子生物学方法分析并验证miR-181a-5p的靶基因,进而阐明miR-181a-5p在后纵韧带骨化过程中的调控机制,为后纵韧带骨化的治疗提供可能的分子靶点。第一部分:miR-181a在后纵韧带骨化中的表达及功能研究方法:（1）对PLL与OPLL miRNA、mRNA测序数据（GSE69787）进行生物信息学分析,构建成骨相关miRNA/mRNA相互作用网络,结合OPLL测序结果中表达量排序表筛选可能在OPLL成骨过程发挥关键调控作用的miRNA。收集临床后纵韧带组织标本,通过RT-qPCR验证miR-181a在OPLL与非OPLL（以下简称PLL）患者之间的表达差异。（2）收集临床后纵韧带组织标本进行后纵韧带原代细胞培养,成骨诱导培养后检测成骨相关基因表达变化及miR-181a表达变化。（3）通过转染miR-181a-5p及-3p mimics或inhibitors,在PLL细胞中过表达miR-181a,在OPLL细胞中抑制miR-181a表达,成骨诱导21天后通过茜素红及ALP染色评价其成骨能力,通过RT-qPCR和western-blot检测成骨相关基因在mRNA水平及蛋白水平的表达变化。结果:（1）miRNA/mRNA成骨相关作用网络中,miR-181a-5p在OPLL细胞中表达量最高,位于所有差异表达miRNA中的第7位,为所有上调miRNA中的第4位。通过对10例OPLL来源及PLL来源韧带组织进行RT-qPCR检测发现:OPLL韧带中miR-181a-5p及-3p表达量均明显高于PLL来源韧带组织。（2）后纵韧带原代细胞在成骨诱导培养下,RT-qPCR检测证实成骨相关基因（RUNX2、OSX、OPN、ALP）表达量逐渐升高,RT-qPCR检测发现miR-181a-5p及-3p表达水平升高。（3）分组处理后,过表达miR-181a-5p的PLL细胞钙结节形成、碱性磷酸酶活性增加,成骨相关基因在mRNA水平及蛋白水平表达量明显高于对照组及阴性对照组,过表达miR-181a-3p的PLL各指标未见明显改变。与之相反,抑制miR-181a-5p表达的OPLL细胞成骨能力下降,而抑制miR-181a-3p的OPLL细胞成骨能力未见明显改变。结论:生信分析表明OPLL中miR-181a-5p与成骨相关通路关系密切,且在OPLL细胞中表达量较高,后纵韧带患者的颈椎后纵韧带组织中miR-181a-5p和-3p表达量升高。由颈椎后纵韧带培养的原代细胞也具有这一表达差异。过表达/抑制miR-181a-5p会明显影响颈椎韧带细胞成骨诱导后成骨相关基因的表达。以上结果表明miR-181a-5p及-3p可能参与后纵韧带细胞骨化的调控过程。第二部分:miR-181a-5p靶基因的筛选与验证方法:（1）根据此前生信分析结果,通过RT-qPCR检测miR-181a成骨相关靶基因在PLL和OPLL细胞间的差异表达。（2）在PLL细胞中过表达miR-181a-5p和-3p,通过RT-qPCR检测预测靶基因的表达变化;（3）在pMir-Reporter载体中插入包含待检测靶基因3‘UTR结合位点野生型（wildtype,WT）及突变型（mutation,MUT）序列,通过双荧光素酶报告基因系统验证miR-181a-5p和-3p与靶基因的关系。（4）通过RT-qPCR、Western-blot检测过表达、抑制miRNA后靶基因在后纵韧带细胞中的表达变化,分析其与miR-181a-5p及-3p表达的相关性。结果:（1）RT-qPCR 结果显示:8 个（PBX1、ACAN、S1PR1、GLI2、HAND2、TLL1、HOXA11、RPS6KA3）可能的靶基因中有 4 个（PBX1、ACAN、S1PR1、HOXA11、RPS6KA3）在OPLL细胞中表达量下降。（2）RT-qPCR结果显示:PLL细胞过表达miR-181a-5p可以使8个候选靶基因中PBX1及ACAN的mRNA表达水平下降,过表达miR-181a-3p对8个候选靶基因表达量无明显影响。（3）通过TargetScan网站预测miR-181a-5p与PBX1、ACAN结合位点,构建双荧光素酶报告基因实验载体,通过293T细胞共转染后检测荧光强度,过表达miR-181a-5p 可以降低 PBX1 WT 和 ACAN WTFirefly luciferase/Renialla luciferase 比值,而过表达 miR-181a-3p 后 Fireflyluciferase/Reniallaluciferase 比值未见明显改变。（4）RT-qPCR、Western-blot检测结果显示:PLL细胞过表达miR-181a-5p后PBX1、ACAN表达量在mRNA水平及蛋白水平均明显下降,过表达miR-181a-3p未见表达量明显改变。OPLL细胞抑制miR-181a-5p表达后PBX1、ACAN表达量在mRNA水平及蛋白水平均明显上升,抑制miR-181a-3p表达后未见PBX1、ACAN表达量出现明显变化。结论:PBX1 及 ACAN 为 miR-181a-5p 的靶基因,miR-181a-3p对PBX1 及ACNA不具有靶向调控作用。第三部分:miR-181a-5p调控后纵韧带细胞成骨机制的研究方法:（1）收集颈椎骨化和非骨化后纵韧带临床标本,通过原位杂交组织化学结束检测PBX1、AC AN在组织中mRNA表达量。（2）下调OPLL细胞中PBX1、ACAN表达,观察成骨相关基因表达量变化。（3）回复实验（rescue assay）进一步验证miR-181a-5p靶向PBX1对后纵韧带细胞成骨的调控。（4）通过免疫共沉淀方法研究PBX1对成骨相关基因启动子区域组蛋白表观遗传修饰水平的调控作用。结果:（1）原位杂交组织化学结果显示,在未发生钙化的颈椎后纵韧带组织中PBX1及ACAN的表达量明显高于发生钙化的后纵韧带组织。（2）RT-qPCR及western-blot结果显示,siPBX1显着上调PLL及OPLL细胞内骨化相关基因的表达,而siACAN对PLL细胞内骨化相关基因表达无影响,对OPLL细胞内ALP及OCN具有上调作用,而对RUNX2及OSX无影响。（3）在OPLL细胞中抑制分别干扰PBX1、ACAN表达后,茜素红、ALP染色显示OPLL细胞成骨诱导后钙沉积增加,ALP活性增加,而抑制miR-181a-5p表达后,OPLL细胞经成骨诱导后钙沉积减少,ALP活性降低。在抑制miR-181a-5p表达的同时干扰PBX1表达,OPLL经成骨诱导后钙沉积及ALP活性回复。而抑制miR-181a-5p表达同时干扰ACAN表达并不能完全回复OPLL细胞的钙沉积效果及ALP活性。RT-qPCR及western-blot结果显示,转入miR-181a-5p抑制体后的OPLL细胞在成骨诱导培养后RUNX2、OSX、ALP、OCN表达降低。同时干扰PBX1表达可以回复RUNX2、OSX、ALP、OCN的调控效果。而同时干扰ACAN表达并不能回复RUNX2、OSX的表达变化。（4）PLL细胞转染miR-181a-5p模拟物后,ChIP结果显示,结合于OCN及OSX启动子区域的PBX1减少,RUNX2的结合增加,HOXA10结合未见明显改变,组蛋白H3K9乙酰化水平增加,2-甲基化水平降低,转录活性升高。而OPLL转染miR-181a-5p抑制物后结果相反。结论:miR-181a-5p可以在后纵韧带细胞中靶向PBX1及ACAN,但主要通过靶向PBX1调控后纵韧带细胞的成骨能力。miR-181a-5p靶向抑制PBX1表达,进而通过调控下游骨化相关基因组蛋白表观遗传修饰影响转录表达。第四部分:miR-181a-5p对后纵韧带细胞成骨分化及OPLL疾病作用的在体验证方法:通过慢病毒构建稳定表达miR-181 a-5p mimic、miR-181 a-5p inhibitor、siPBX1,及siNC的PLL细胞,4天后与Bio-Oss Collagen支架共培养2天。将带细胞支架植入裸鼠背部皮下构建异位骨化模型,6周后行micro-CT观察体内成骨效果,并通过免疫组化检测移植材料中骨化相关基因及miR-181a-5p靶基因PBX1的表达变化构建miR-181a-5p agomir及antagomir,分别注入OPLL工具鼠（ttw小鼠）的鼠尾静脉,18周后通过micro-CT检测各组ttw小鼠后纵韧带骨化情况,评估miR-181a-5p对OPLL病程的在体影响;并通过免疫组化方法检测后纵韧带组织中骨化相关基因及miR-181a-5p靶基因PBX1的表达变化,对miR-181a-5p调控OPLL的机制作进一步验证。结果:裸鼠皮下异位骨化标本micro-CT数据显示过表达miR-181a-5p或干扰PBX1均可导致移植材料内BV/TV值及BMD值显着增加,而抑制miR-181a-5p表达后,上述参数显着降低;此外,免疫组化结果显示过表达miR-181a-5p显着上调移植材料内骨化相关基因OCN的表达,而下调PBX1表达,抑制miR-181a-5p时结果相反,说明miR-181a-5p在裸鼠异位骨化模型中促进后纵韧带细胞成骨分化进程。结论:miR-181a-5p在体内可下调靶基因PBX1的表达,促进骨化相关基因表达,进而促进后纵韧带骨化的发生。
李创坤[3]（2020）在《基于骨组织工程构建人源性乳腺癌骨转移小鼠模型》文中进行了进一步梳理背景乳腺癌是全球最常见的肿瘤之一,并且能扩散到其他器官。而骨转移在乳腺癌转移病例中的发生频率最高,并且会给患者带来许多并发症。目前乳腺癌骨转移的分子机制尚未清楚,治疗方法效果不佳。一直以来,人们致力于解决这个问题,而目前较为迫切的是需要合适的乳腺癌骨转移动物模型来研究乳腺癌向骨骼转移的相关分子机制和进行抗肿瘤药物筛选。然而,用于模拟人癌组织与骨组织之间相互作用的乳腺癌骨转移的人源化动物模型的构建仍然是一个挑战。目的通过组织工程手段构建一种可标准化的人源化乳腺癌骨转移动物模型,用于研究乳腺癌骨转移的分子机制以及进行药物筛选。方法1.制备掺杂二氧化硅纳米颗粒的人脱钙骨基质复合材料。对所制备的二氧化硅纳米颗粒和复合材料的表征、性能以及对细胞的作用等进行研究。2.将人成骨肉瘤细胞与掺杂二氧化硅纳米颗粒的人脱钙骨基质复合材料复合形成组织工程骨,进一步研究该复合材料在体内和体外的成骨诱导能力。3.在移植了组织工程骨的裸鼠腋下原位注射人乳腺癌细胞,构建人源化的乳腺癌骨转移小鼠模型。结果1.制备的二氧化硅纳米颗粒粒径大小为100nm-150nm,呈规则球形,与人脱钙骨基质复合后,可在支架上均匀分布。掺杂二氧化硅纳米颗粒的人脱钙骨基质复合材料具有较好的生物相容性。2.与单纯的人脱钙骨基质相比,掺杂二氧化硅纳米颗粒的人脱钙骨基质复合材料有较强的诱导成骨能力,可明显上调成骨相关标志蛋白的表达,在裸鼠体内形成了更多的新生骨组织。3.在移植了组织工程骨的裸鼠的腋下原位注射人乳腺癌细胞2周后,在组织工程骨中观察到人乳腺癌细胞的转移。结论通过组织工程手段制备了复合人成骨肉瘤细胞的组织工程骨,并成功构建人源化的乳腺癌骨转移小鼠模型。
李志鲲[4]（2020）在《改良交叉穿刺椎体成形术治疗骨质疏松性椎体压缩骨折的生物力学分析及临床应用研究》文中研究表明研究背景经皮椎体成形术因止痛效果好、能迅速改善老年人生活质量,被广泛应用于治疗骨质疏松性椎体压缩骨折（OVCF）,但随访中发现术后椎体塌陷的发生率极高,并且有可能出现更为严重的并发症,严重影响患者的健康,越来越受到脊柱外科医师的关注。椎体塌陷的影响因素有很多,近期研究发现骨水泥分布与椎体塌陷关系密切,临床中我们使用改良交叉穿刺技术控制骨水泥分布,获得良好的骨水泥分布以降低术后椎体塌陷的发生,但缺乏相关的研究依据及经验总结。本研究从生物力学和临床应用两方面对改良交叉穿刺技术进行分析,探究这种改良穿刺方法的可行性及疗效,以及在改善椎体成形术后椎体塌陷中的作用,为临床工作提供新思路及理论依据。第一部分低骨量椎体压缩骨折的猪脊柱离体模型建立目的对传统的乙二胺四乙酸（EDTA）化学脱钙法进行改良,建立低骨量椎体压缩骨折的体外动物模型（猪）并进行多维度低骨量验证,为后期的生物力学研究提供低骨量动物模型。材料与方法获得24节单节段成熟家猪的胸腰椎,随机非均等分为实验组（20节）和对照组（4节）。采用改良体外EDTA溶液脱钙法降低猪椎骨的骨密度（BMD）。采用双能X线吸收法测定区域BMD,通过QCT扫描评估体积BMD,使用Micro-CT评估骨小梁的形态。对脱钙前后的组织使用HE染色和钙盐染色观察组织学特性。对低骨量标本使用材料试验机进行单轴压缩测试并记录杨氏模量、屈服应变、最终应变、屈服压力和最终压力。最终将椎体破坏建立低骨量椎体压缩骨折模型,使用X线进行骨折模型验证。统计学方式选用描述性分析、t检验和Pearson相关分析。结果（1）实验组脱钙后4周时所有椎体骨密度均小于0.75g/cm2,均处于低骨量状态。脱钙前后骨密度存在显着性差异（1.18±0.12g/cm2,0.58±0.06 g/cm2）（P<0.05）。（2）QCT扫描显示标本脱钙4周后实验组骨皮质BMD（189.2±41.2mg/cm3）和骨松质BMD（66.3±13.5mg/cm3）均小于对照组骨皮质BMD（611.8±31.5mg/cm3）（P<0.01）和骨松质BMD（329.1±53.1mg/cm3）（P<0.01）。（3）Micro-CT显示脱钙处理后实验组猪椎骨的骨小梁变细、稀疏,间隙增宽。（4）HE染色组织切片显示与对照组相比实验组中骨小梁体积不同,骨小梁间连接存在差异,von Kossa钙染色显示实验组中染成黑色的骨小梁密度与对照组相比钙密度明显降低。（5）实验组中脱钙椎体的单轴压缩试验与对照组相比,弹性模量下降79.1%,屈服应力下降73.2%,极限应力下降72.2%,三者差异均具有显着性差异（P<0.001）。猪椎骨模型的弹性模量（R2=0.749,P<0.001）,屈服应力（R2=0.808,P<0.001）,极限应力（R2=0.753,P<0.001）与BMD呈强正相关。（6）经过压缩破坏后所有椎体呈骨折状态,X线显示椎体前缘压缩,骨皮质不连续。结论（1）在猪椎骨开始脱钙后4周,标本表现出显着的骨质减少且达到目标低骨量状态（小于0.75g/cm2）。（2）使用改良EDTA脱钙法可均一化制备出符合低骨量椎体压缩骨折实验的离体动物模型,模型表现为显着性的骨密度降低、骨形态特征减弱和骨强度下降。（3）改良EDTA脱钙法是一种合适的低骨量建模方法,从影像学、组织学、生物力学方面可以达到实验所需。第二部分改良交叉穿刺椎体成形术在低骨量椎体压缩骨折模型中的生物力学分析目的对比不同穿刺方法形成的骨水泥分布形态和生物力学的差异,分析改良交叉穿刺技术在抗压缩能力的优势,探究理想的骨水泥分布形态及穿刺方法,为明确最佳骨水泥分布形态提供生物力学的理论支持。材料与方法选取第一部分已建立的低骨量猪椎体压缩骨折模型为研究对象,模拟椎体成形术对模型进行定量5ml骨水泥注射,使用4种不同的穿刺方法:实验1组为交叉穿刺形成全椎体的骨水泥分布,实验2组为传统穿刺形成椎体下缘的骨水泥分布,实验3组为传统穿刺形成椎体上缘的骨水泥分布,实验4组为传统穿刺形成椎体中央的骨水泥分布,建立4种骨水泥分布图形后使用X线进行确认,另选4个低骨量猪椎体压缩骨折模型为对照组不注射骨水泥,对所有标本使用材料试验机进行单轴压缩测试并记录屈服载荷、极限载荷、应力和刚度,并建立载荷-位移曲线,使用CT三维重建测量骨水泥弥散体积并计算弥散系数。对比不同骨水泥分布下的生物力学,观察并分析不同骨水泥分布的CT三维重建形态,研究骨水泥分布的不同指标与生物力学之间的相关性。统计学方法选用描述性分析、独立样本非参数检验（Mann-Whitney检验）和Pearson相关分析。结果（1）骨水泥注射前实验组与对照组的椎体重量无显着性差异。（2）实验1组的骨水泥弥散体积和弥散系数均高于其他3组。（3）不同的骨水泥分布下椎体的载荷和应力均存在差异,极限载荷、屈服载荷和应力从大到小排序均为:全分布型>上分布型>中分布型>下分布型。对照组屈服载荷1.75±0.37KN,极限载荷1.90±0.36KN,应力3.14±0.55Mpa。实验1组屈服载荷4.97±0.79KN,极限载荷5.24±0.66KN,应力9.43±1.59Mpa。实验2组屈服载荷2.28±0.27KN,极限载荷2.39±0.26KN,应力3.94±0.64Mpa。实验3组屈服载荷4.46±0.39KN,极限载荷4.69±0.43KN,应力7.9±1.36Mpa。实验4组屈服载荷2.91±0.42KN,极限载荷3.08±0.39KN,应力5.17±0.61Mpa。（4）实验组中少数模型在骨水泥注射后刚度高于骨水泥注射前,但实验组中所有模型骨水泥注射后的刚度均没有恢复到未骨折前的椎体刚度。实验1组骨水泥注射前后的刚度分别为2.28±0.62KN/mm,2.55±0.36KN/mm。实验2组骨水泥注射前后的刚度分别为2.70±0.42KN/mm,2.68±0.45KN/mm。实验3组骨水泥注射前后的刚度分别为2.49±0.48KN/mm,1.77±0.59KN/mm,实验4组骨水泥注射前后的刚度分别为2.12±0.20KN/mm,1.88±0.41KN/mm。（5）组间对比显示交叉穿刺形成的骨水泥高度更高,P=0.004<0.05,总弥散体积更大,P=0.029<0.05,这可能是由于交叉穿刺两个骨水泥流出通道建立在不同的位置,导致骨水泥的弥散方向不同。（6）组间对比显示交叉穿刺组可获得更高的骨水泥高度占比,P=0.004<0.05,但上终板距离组间没有显着性差异,P=0.058>0.05。（7）相关性分析显示骨水泥高度和骨水泥高度占比与极限载荷和应力成正相关,上终板距离与极限载荷和应力成负相关,骨水泥弥散体积与生物力学无显着性相关,即骨水泥需要分布越高、高度占比越大、上终板距离越小,极限载荷和应力越大,另外骨水泥分布差异对刚度无显着影响。结论（1）低骨量猪椎体压缩骨折模型注射骨水泥后,所有类型的骨水泥分布模型均增加了骨折椎体的载荷力及应力,但所有骨水泥分布类型均未恢复椎体初始刚度。（2）骨水泥高度和骨水泥高度占比与极限载荷和应力成正相关,上终板距离与极限载荷和应力成负相关,骨水泥弥散体积与生物力学无显着性相关,即骨水泥需要分布越高、高度占比越大、上终板的距离越小,极限载荷和应力越大。（3）骨水泥分布差异与椎体刚度不存在显着相关。（4）交叉穿刺形成的骨水泥分布在生物力学方面具有显着优势,形成的全分布骨水泥具有高载荷力和应力。第三部分改良交叉穿刺椎体成形术治疗骨质疏松性椎体压缩骨折的临床疗效分析目的对比交叉穿刺技术与传统穿刺技术在治疗骨质疏松性椎体压缩骨折的临床疗效,分析不同穿刺法形成骨水泥分布图形的差异,探究椎体成形术后椎体塌陷的高危影响因素。材料与方法前瞻性研究获得70例交叉穿刺椎体成形术病例,随访时间大于1年且骨水泥注射量4-6ml,回顾性随机选取70例使用传统穿刺椎体成形术的病例作为对照组。对比两组之间的一般数据:性别、年龄、骨折节段、骨密度、骨水泥注射量、术后卧床时间、手术时间、随访时间。影像学:伤椎高度、楔形角、后凸角、骨水泥弥散体积、弥散系数。功能评分:VAS、ODI、奥多姆标准。并发症:骨水泥渗漏、椎体塌陷、临椎骨折等。观察不同穿刺下骨水泥分布的CT三维重建图像差异,分析弥散系数与椎体塌陷高度的相关性,探究椎体塌陷对患者满意度的影响,并进行椎体塌陷的高危因素分析。统计学分析使用t检验、卡方检验及LSD检验进行对比分析,以及Pearson相关分析和Logistic回归分析。结果（1）一般数据a.组间对比显示年龄,性别,骨密度,骨折节段,骨水泥注射量,术后卧床时间和高度压缩比不存在显着性差异（P>0.05）。b.组间手术时间和随访时间存在显着性差异（P<0.01）。手术时间交叉穿刺组和传统穿刺组分别为29.0±8.6min和20.7±10.2min。随访时间交叉穿刺组和传统穿刺组分别为15.37±3.9月和23.5±10.6月。（2）影像数据a.组内对比:交叉穿刺组和传统穿刺组中脊柱后凸角、伤椎楔形角、椎体前缘高度,椎体中段高度在术前与术后1天的数据间存在显着性差异,P<0.05。椎体后缘高度在术前与术后的数据间不存在显着性差异,P>0.05。交叉穿刺组中后凸角、楔形角、前缘高度、中段高度及后缘高度在术后1天、术后3月、术后6月及术后12月之间均无显着性差异（P>0.05）,但从数据可以看出后凸角、楔形角在随访时逐渐缓慢增大,前缘高度、中段高度及后缘高度在随访时逐渐缓慢减小。传统穿刺组中后凸角、楔形角、前缘高度、中段高度及后缘高度在术后1天、术后3月之间均无显着性差异（P>0.05）,但后凸角、楔形角、前缘高度、中段高度及后缘高度在术后3月、术后6月及术后12月之间存在显着性差异（P<0.05）,椎体后缘高度在随访期间均无显着性差异（P>0.05）。b.组间对比:交叉穿刺组和传统穿刺组在术前脊柱后凸角、脊柱楔形角、伤椎的前缘、中段、后缘高度均不存在显着性差异（P>0.05）。交叉穿刺组和传统穿刺组在术后1天、术后3月脊柱后凸角、脊柱楔形角、伤椎的前缘、中段、后缘高度也不存在显着性差异（P>0.05）,两组间在术后6月和12月间脊柱后凸角、脊柱楔形角、伤椎的前缘、中段高度存在显着性差异（P<0.05）。c.两组间骨水泥弥散体积及弥散系数存在显着性差异（P<0.05）,交叉穿刺法获得的骨水泥分布区域要大于传统穿刺法。（3）功能评分:两种手术方式在疼痛缓解和功能改善方面类似,两组在术前与术后1天VAS评分和ODI评分有显着性差异（P<0.05）。术后3月、6月及12月组间VAS评分和ODI评分无显着性差异（P>0.05）。末次随访的总体疗效奥多姆标准方面存在差异,交叉穿刺组优于传统组,交叉穿刺组末次随访奥多姆标准中优和良的评分高于传统穿刺组。（4）并发症:交叉穿刺组在术后并发症方面优于传统穿刺组,其中椎体塌陷和后凸畸形的发生率明显低于传统穿刺组。两组间椎体塌陷发生率存在显着性差异,分别为18.6%（13人）和78.6%（55人）,P<0.05。两组间后凸畸形也存在显着性差异,分布为17.1%（12人）和78.6%（55人）,P<0.05。（5）骨水泥三维CT重建显示交叉穿刺组形成的骨水泥高度比传统穿刺更高,交叉穿刺组骨水泥中的孔隙比传统穿刺组更多,弥散体积更大,传统穿刺与交叉穿刺形成的骨水泥分布图形存在差异。（6）弥散系数能客观的反应骨水泥分布情况,弥散系数与椎体高度丢失率成反比,既弥散系数越大椎体高度丢失率越低,r=-0.713,R2=0.508。（7）塌陷组与非塌陷组在术后3月、6月及12月的VAS和ODI存在显着性差异（P<0.05）,末次随访Odom标准在塌陷组80.9%为满意,19.1%为差。末次随访Odom标准在非塌陷组79.1%为优,18.1%为良。说明椎体是否塌陷将影响患者的满意度,发生塌陷后患者满意度显着降低。（8）回归分析显示使用传统穿刺方法、骨密度≤-3、弥散体积<7.5、弥散系数<1.5、高度恢复比≥100%、楔形角恢复比≥50%的患者更容易发生椎体塌陷。（9）交叉穿刺法和传统穿刺法形成的全分布骨水泥病例对比发现,骨水泥全分布形成率分别占97.1%（68/70）,12.8%（9/70）,两组间骨水泥注射量、弥散系数存在显着性差异,P<0.05,弥散体积无显着性差异,P>0.05。交叉穿刺组椎体塌陷发生率（更高）和临椎骨折发生率（更低）均有显着性差异,P<0.05。结论（1）对比传统穿刺,交叉穿刺注射骨水泥形成弥散系数更大,骨水泥分布图形存在差异。交叉穿刺组形成的骨水泥高度比传统穿刺更高,孔隙比传统穿刺组更多。（2）交叉穿刺PVP治疗OVCF术后3月内疗效与传统穿刺类似,术后6月时交叉穿刺组表现出良好的椎体抗压缩能力,传统穿刺组椎体塌陷发生率远高于交叉穿刺组。（3）弥散系数能客观的反应骨水泥分布情况,在一定的骨水泥注射量下,弥散系数与椎体高度丢失率成反比,既弥散系数越大椎体高度丢失率越低。（4）传统穿刺方法、骨密度≤-3、弥散体积<7.5、弥散系数<1.5、高度恢复比≥100%及楔形角恢复比≥50%的患者更容易发生椎体塌陷。（5）交叉穿刺方法的骨水泥全分布图形形成率明显优于传统穿刺方法,传统穿刺组需要注入更多的骨水泥,椎体塌陷率更低,但显着增加了临椎骨折发生率。
李磊[5]（2020）在《骨关节炎成骨细胞异常的甲状腺激素受体信号调控软骨下骨微血管形成的机制研究》文中指出研究背景骨关节炎（Osteoarthritis,OA）是全球范围内中老年人关节致残率逐年增长的首位病因,也是影响这一群体生存生活质量的主要慢性关节疾病。传统观点认为机械压力所致的软骨退变是OA启动的主要致病因素。但随着对OA发病机制的深入了解,滑膜炎性反应、软骨下骨硬化、异常骨重塑及骨髓丢失、骨赘形成等病理变化同样是OA典型表现。迄今,临床OA治疗策略较为局限,主要为疼痛管理和外科手术进行关节置换,且大部分患者就诊时OA已处于晚期保守治疗的可能性较小,这就对OA发病机制的研究更加迫切。实际上,早在20世纪70年代学者们便开始对OA软骨下骨的病理变化进行研究,这一过程涉及多种细胞代谢和骨微结构的变化。近些年来,研究发现骨和软骨组成的功能单元复合体在OA发生发展中充当至关重要的角色,大量微血管及神经侵入这一界面后明显加速软骨退变进程。这些血管神经的形成转化为物质转运渠道,一方面转运自软骨下骨合成释放的小分子物质至关节软骨,另一方面破坏软骨下骨与关节软骨的正常代合成谢微环境从而形成恶性循环促进OA发展。故而对骨-软骨界面微血管形成机制的研究将为OA提供新的治疗思路。研究目的先前的研究表明,T3（3’3’5-三碘甲腺原氨酸）局部生物利用度的提高促进骨关节炎的发生,但机制尚不明确。基于上述研究背我们旨在调查OA成骨细胞中甲状腺激素受体（THRs）信号对软骨下骨微血管形成的作用并为OA治疗提供可能的新靶点。研究方法1.检测OA组与正常组参与者血清TT3、TT4水平的差异;2.自人OA软骨下骨组织标本中分离培养成骨细胞,通过免疫组织化学、免疫荧光染色、Western blot（总蛋白和核蛋白）和RT-q PCR检测软骨下骨组织和成骨细胞中THRα、THRβ的表达并与正常组比较差异;3.T3浓度依赖性和时间依赖性刺激OA成骨细胞后通过ELISA和Western blot检测血管形成相关因子表达水平（VEGF、HIF-1α）,并探讨PI3K/AKT信号传导通路在T3刺激血管形成中的作用;4.建立成骨细胞缺氧模型,PX-478抑制HIF-1α表达验证其在VEGF表达中的中介调节作用;5.利用小干扰RNA（small interfering RNA,si RNA）敲低成骨细胞THRα和THRβ基因表达后通过ELISA和Western blot检测VEGF、HIF-1α的表达,荧光原位杂交实验确定THRα、THRβ与VEGF在细胞内的共定位情况;6.建立成骨细胞和软骨细胞共培养模型,IL-1β刺激软骨细胞模拟体内骨关节炎微环境,经过si RNA敲低成骨细胞THR m RNA表达后检测软骨细胞VEGF表达水平;7.DMM法小鼠OA造模验证体外实验结果,小鼠膝关节腔注射si THRα后利用免疫组化检测软骨下骨血管形成活性及关节软骨MMPs（金属基质蛋白酶）的表达水平,并对膝关节软骨进行OARSI评分及HE、番红固绿染色,micro CT对软骨下骨进行扫描并选取矢状位内侧软骨下骨区域三维重建采集骨微结构参数进行分析。研究结果1.OA组血清甲状腺激素水平与正常组无差异且人OA软骨下骨组织及成骨细胞中THRα、THRβ表达上调,Western blot实验及免疫荧光染色示二者细胞内核转位增强;2.T3刺激OA成骨细胞培养24h和48h后能够通过PI3K/AKT通路上调VEGF、HIF-1α的表达且THRα核转位增强,而高浓度T3（10-5 M）则抑制VEGF、HIF-1α的表达;3.缺氧环境下PX-478抑制HIF-1α后OA成骨细胞VEGF表达减少;4.敲低OA成骨细胞THRα后VEGF和HIF-1α表达明显下降,而敲低THRβ后二者表达无变化,荧光原位杂交实验示THRα与VEGF在OA成骨细胞中共定位;5.在OA小鼠膝关节腔注射si THRα后膝关节组织OARSI评分降低、软骨下骨血管形成减少、软骨蛋白多糖丢失减少、软骨细胞MMP9和MMP13表达减少、硬化的软骨下骨板变薄且micro CT扫描提示骨矿物质密度和骨体积分数升高。研究结论1.局部T3生物利用度的提高在OA软骨下骨中由THRα和THRβ表达升高所致;2.T3通过PI3K/AKT信号传导通路上调OA成骨细胞血管形成相关因子表达,THRα核转位增强参与此过程;3.软骨下骨缺氧环境中HIF-1α调节OA成骨细胞VEGF的表达;4.OA成骨细胞中异常的THRα信号调控软骨下骨微血管形成,抑制THRα可缓解OA进展。
杨爽[6]（2019）在《基于反向旋转挤出技术构建的取向性胶原纤维及其在肌腱修复中的应用》文中研究说明因疾病、交通事故或不当的体育运动造成的肌腱损伤是常见的临床问题。肌腱组织因具有少细胞、寡供血以及低代谢的结构特征,使受损肌腱,包括受损腱体和肌腱止点损伤的腱-骨区域,难以自愈。将干细胞与仿生支架复合的组织工程策略为有效修复损伤肌腱带来了希望。从全面仿生天然肌腱胞外基质（ECM）的组成、拓扑结构和力学性质的策略出发,我们认为,高取向性胶原纤维支架是肌腱腱体修复的理想支架,而分级取向的胶原纤维支架是腱-骨连接处修复的理想支架。由于难溶性胶原纤维（ICFs）拥有更多天然分子交联和分子排列,其自组装程度和力学性能更接近天然肌腱ECM,因此,我们进一步认为,ICFs比可溶性胶原更适合于肌腱修复支架的加工。但遗憾的是,目前以ICFs为原料的取向性纤维的加工技术较为缺乏。反向旋转挤出（CRE）技术适用于ICFs支架的加工,具有纤维取向性可调、加工速度快、可控性好等优点,但迄今为止却鲜有将其应用于肌腱修复支架的加工。据此,本文在探索了ICFs的提取条件和理化性能的基础上,以ICFs为原料,创新性地采用CRE技术制备出了不同取向的胶原纤维支架,并从理化性能、体外生物学性能和体内修复效果等方面系统地评估了各胶原纤维支架用于肌腱腱体/腱-骨缺损修复的可行性并分析了相关机制。主要研究内容和结论如下:（1）基于CRE技术构建不同取向性的胶原纤维膜（CMs）以牛皮为原料分离提取并纯化得到ICFs,以酶溶性胶原（PSC）为对照,通过凯氏定氮、高效液相色谱（HPLC）、十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、傅里叶红外光谱（FTIR）和圆二色光谱（CD）对胶原蛋白的组成和结构进行了表征。结果表明:提取的ICFs和PSC为典型的I型胶原蛋白,具有完整的三股螺旋结构,其纯度和羟脯氨酸满足我国胶原蛋白海绵的行业标准（YY/T1511–2017）。理化性能测试发现:ICFs比PSC具有更高的交联度、热稳定性、酶解稳定性以及拉伸力学强度,更适合于胶原纤维支架的制备。进一步,以ICFs为原料,通过调节同轴内外旋转锥体的旋转速率调控ICFs取向,成功制得三种不同取向的CMs,即高取向性（CMa,取向分布为0°-15°）、中度取向性（CMm,取向分布为-15°–30°）和随机取向性（CMr,取向分布为-60°-60°）。热收缩率纵横比（S纵/S横）和热收缩力纵横比（F纵/F横）检测结果进一步验证了各CMs的取向程度。力学拉伸测试表明:三种CMs均具有优良的纵向拉伸性能,呈现CMa（18.45±0.91 MPa）>CMm（16.35±0.75 MPa）>CMr（13.81±0.39MPa）。以上结果提示,CRE技术加工的不同取向性CMs可以有效地仿生肌腱的化学组成、拓扑结构和力学性能。（2）取向性CMs对rBMSCs形态及分化行为的影响为了探究CMs纤维取向对干细胞行为的影响,以rBMSCs为模型细胞,采用SEM和免疫荧光染色技术观察了rBMSCs在CMs上的早期细胞形态,并进一步通过荧光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白质印迹法（WB）系统地探究了在正常和诱导培养基条件下各CMs对rBMSCs向肌腱系、成骨系和软骨系分化的影响。结果显示:高取向性CMa可以诱导rBMSCs呈纺锤状的伸长形态,促进rBMSCs向肌腱系分化并抑制其向成骨和软骨系分化,甚至具有一定的抵抗成骨/软骨诱导培养基的能力,提示CMa适合作为肌腱腱体的修复支架;相反,随着CMa、CMm和CMr取向程度依次降低,它们诱导rBMSCs向肌腱系分化的能力减弱而向成骨/软骨系分化能力增强,提示它们组合的分级取向结构有望作为腱-骨修复支架。（3）高取向性CMa-BMSCs支架对损伤跟腱腱体的原位修复为了考察CMa作为缺损腱体修复支架的可行性,我们将CMa作为支架材料,与种子细胞rBMSCs复合培养制得组织工程肌腱（CMa-BMSCs）。将CM-BMSCs植入裸鼠皮下2周后发现rBMSCs仍然存活,且CMa可以诱导细胞和沉积胶原纤维的取向。进一步,采用大鼠跟腱缺损模型,以自体肌腱缝合作为阳性对照,空缺作为阴性对照,CMr-BMSCs为实验对照,检测了CMa-BMSCs对损伤腱体的原位修复效果。宏观评分、跟腱功能指数（AFI）测定、核磁共振成像（MRI）、常规病理分析、生物力学评价、以及肌腱相关基因和蛋白的表达情况表明,CMa-BMSCs可以促进体内肌腱系分化,对缺损腱体的修复质量明显优于CMr-BMSCs,与自体肌腱修复质量基本相当,证明CRE构建的基于ICFs的高取性CMa是修复损伤肌腱腱体的良好支架。（4）分级取向CMar-BMSCs支架对腱-骨连接处原位修复的初探将CMa和CMr复合制得分级取向支架(CMar),以考察CMar对腱-骨区域的修复效果。力学拉伸测试、免疫荧光染色和ALP染色结果表明,CMar具有良好的力学稳定性且能够诱导rBMSCs呈现分级的细胞形态和分化倾向。在此基础之上,进一步采用大鼠跟腱-跟骨缺损模型初步评估了CMar-BMSCs对腱-骨缺损的原位修复能力。X光检测和micro-CT结果显示:在跟骨区域,CMar-BMSCs与CMr-BMSCs的新骨生成量相当,而在肌腱腱体区域,CMar-BMSCs没有出现CMr-BMSCs所呈现的明显钙化影。HE和MT结果显示:在肌腱腱体区域,CMar-BMSCs与CMa-BMSCs胶原纤维均组装成熟且趋于有序化,而在腱-骨界面区域,只有CMar-BMSCs出现了纤维软骨移行带而CMa-BMSCs没有。以上结果表明:CMar-BMSCs在腱端具有与CMa-BMSCs相似的促肌腱修复并抑制异位成骨的能力,在骨端具有与CMr-BMSCs相似的促骨修复能力,以及良好的促腱-骨界面修复能力,证明CRE构建的基于ICFs的分级取向CMar是修复损伤腱-骨区域的良好支架。综上所述,本论文运用CRE技术成功构建了三种不同取向（CMa、CMm、CMr）的难溶性胶原纤维支架,并证实高取向性CMa和分级取向CMar通过仿生化学组成、拓扑结构和力学性能而可以实现肌腱腱体和腱-骨缺损的有效修复。相关研究结果为肌腱腱体/腱-骨组织工程理想支架的制备提供了一条新的途径,对于推进肌腱组织工程的应用进程有重要意义。
郑捷,方庆全,涂金花[7]（2019）在《骨髓活检组织EBER原位杂交检测影响因素分析》文中提出目的探讨骨髓活检组织行EBV encoded RNA（EBER）原位杂交检测的影响因素,优化检测条件以期提高骨髓活检组织中EB病毒的检出率。方法收集35例EB病毒相关疾病的骨髓活检标本,通过对比实验,比较不同脱钙方法、不同蛋白酶K消化条件、不同抗体孵育温度下的骨髓活检组织行EBER原位杂交检测的切片质量、脱片率及染色质量情况。结果脱钙以运用改良EDTA脱钙液脱钙20～24h后流水冲洗30min～1h最佳;蛋白酶K消化时间为9min的组织切片脱片率低,杂交效果最好,阳性细胞着色深,定位准确;在37℃条件下进行抗体孵育杂交染色质量为佳。结论选取合适的脱钙方式,延长蛋白酶K消化时间,选择最佳抗体孵育温度,可降低脱片率,显着提高骨髓活检组织行EBER原位杂交检测的染色质量,为EBV相关疾病的诊断和鉴别诊断提供重要依据。
韦亦泠[8]（2019）在《Shh和Ihh在小鼠器官发生中的功能替代》文中指出刺猬蛋白家族（Hedgehog,Hh）与细胞增殖、分化及细胞间沟通关系密切,在胚胎发育、成熟组织的稳态和肿瘤发生发展过程中有至关重要的作用。哺乳动物Hh有Sonic Hedgehog（Shh）,Indian Hedgehog（Ihh）,Desert Hedgehog（Dhh）三个同源基因,它们编码的蛋白质都具有Hh-N端、Hh-C端两个结构域。Shh基因作为重要的形态发生素,其与神经管、体节、消化道、颅面部、骨骼轴向、前后肢芽的发生发育以及肿瘤的形成等有密切联系。Shh基因在小鼠发育过程中首先表达于中、内胚层轴上,其发生突变会导致颅颌面形态产生异常,包括颅中线融合,独眼,小脑畸形等缺陷,这表明Shh在颅颌面形态发生及发育过程中具有极其重要的作用。Ihh主要与骨骼发育相关,尤其是与软骨的发育紧密相关,是软骨细胞增殖、分化和造骨细胞分化等骨发育过程所必需的。在蛋白质结构上,IHH与SHH的Hh-C末端有明显的区别,而Hh-N端结构有93%的一致性,Hh-N端主要参与Hh信号通路的激活与调节,故两者可能具有相似的生物学功能。但是,尚无相关研究证实,在小鼠的器官发生中,Ihh是否具有与Shh相同的生理功能,即Ihh是否能完全替代Shh发挥相应的功能作用。为探究这一问题,本研究首先利用Shh-Cre小鼠与Shhf/f小鼠交配,获得组织特异性敲除Shh基因的ShhCre/-小鼠,结果显示Shh基因敲除后导致小鼠个体变小,独眼畸形,轴向模式缺陷,神经管畸形等发育异常。pMes-Ihh转基因小鼠在正常情况下在组织细胞中不过表达Ihh基因,只有当特定的组织细胞中存在Cre重组酶时,Cre重组酶特异性识别并切割Loxp位点,β-actin启动子后面的Stop终止序列元件被切除、原序列同源重组后,可在特定的组织细胞中特异性过表达Ihh基因。然后利用pMes-Ihh;Shhf/f鼠和Shh-Cre小鼠进行交配,最终获得ShhCre/-;pMes-Ihh转基因小鼠,该小鼠在Shh基因被敲除的同时,让Ihh基因条件性过表达于敲除位置。结果显示,Shh敲除小鼠的表型可以部分被Ihh挽救,ShhCre/-;pMes-Ihh转基因小鼠出现了颅颌面中线结构,其四肢发育恢复正常,但过表达Ihh后神经管发育的异常并未得到挽救。为进一步探究其无法挽救神经管畸形的机制,我们将Shh-Cre小鼠与R26R-mTmG小鼠进行交配,获得在Shh表达的位置表达绿色荧光蛋白,用以示踪Shh的表达模式。结果显示,在ShhCre/-;pMes-Ihh转基因小鼠中,其神经底板区域没有Shh的表达,这说明Shh基因被敲除后,脊索处微弱表达SHH蛋白,因而无法诱导神经底板表达Shh,因此不能在神经底板异位过表达Ihh。此外,我们利用鸡胚体外移植技术进一步探究SHH与IHH对于神经管发育的影响。在鸡胚HH13期中,在其尾部的神经管未完全闭合时剥离脊索,在神经管两侧分别放置SHH、IHH蛋白,结果显示SHH蛋白能使神经管进一步闭合,但IHH蛋白则不能。另外,在鸡胚HH13期中其尾部的神经管未完全闭合时,在神经管周围两侧分别放置SHH、IHH蛋白后继续体内培养,结果显示SHH蛋白能使神经管管壁出现异常弯曲,弯曲处变薄,可能形成新的神经底板,但IHH蛋白则不能。神经底板的形成对于神经管的正常发育起着至关重要的作用,说明在神经管的发育过程中,Ihh不能替代Shh的功能。本研究为揭示Shh和Ihh在小鼠器官发生中的功能替代机理,以及对神经管的发育缺陷机制提供参考。神经管正常的闭合发育受多基因网络综合调控,对其深入的研究将可能对神经系统发育异常的机理提供有用资料和为临床治疗提供新的靶点。
白什尔（Basheer Hamed Hamood Al-Shameri）[9]（2019）在《SDF-1/CXCR4轴在再生性牙髓治疗中的作用及机制研究》文中研究指明牙髓根尖周疾病是人类最常见的口腔疾病之一,常规的根管治疗可以保存患牙,但牙齿在丧失了牙髓之后其抗力降低,脆性增加,并丧失感觉功能,尤其是未发育完成的年轻恒牙,更容易发生牙齿的折裂。牙髓再生是患牙获得生物学治疗效果的最佳途径。间充质干细胞（MSCs）被证实可向机体受损部位迁移,在机体器官和组织的再生修复过程中发挥重要的作用,MSCs的迁移与多种趋化因子密切相关,基质细胞衍生因子-1（SDF-1）是其中最重要的一员。由于牙髓具有独特的组织学结构和环境,牙髓组织的再生修复面临更大的挑战。本研究以促进内源性干细胞归巢参与牙髓再生为目的,评价SDF-1/CXCR4生物轴趋化体内干细胞归巢,以及在内源性牙髓再生过程中所发挥的生物学作用,为牙髓根尖周病的生物学治疗提供新思路。研究主要分为以下4个部分:第一章SDF-1对大鼠BMSCs的体外趋化作用目的:分离、培养、鉴定大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）,检测BMSCs的CXCR4表达,体外评价SDF-1对BMSCs的趋化作用,为下一步研究奠定基础。方法:通过骨髓贴壁法体外分离、培养大鼠BMSCs,通过形态学观察、流式细胞仪检测细胞表面标记物、多向分化潜能鉴定,免疫组化检测BMSCs CXCR4的表达情况。Transwell小室体外评价SDF-1趋化BMSCs迁移的作用。结果:细胞形态呈梭形,形态均一,呈放射状排列,分裂增殖速度较快,倍增时间为3d,可连续稳定传代至10代。生长曲线显示生长活跃。流式细胞仪检测第3代细胞CD29,CD44呈阳性表达,CD34,CD45呈阴性表达。多向分化潜能诱导显示具有成脂、成骨能力,免疫组织化学染色显示BMSCs表达CXCR4。SDF-1趋化BMSCs迁移的体外结果显示:SDF-1明显促进BMSCs的迁移,迁移作用的强度与SDF-1的浓度有关,以50 ng/ml条件下细胞的迁移数最多,CXCR4受体阻断剂AMD3100明显抑制SDF-1的趋化作用,但不能完全阻断。小结:本研究所采用的分离培养方法可以获得具有干细胞特性标志和多向分化潜能的BMSCs,BMSCs表达CXCR4阳性。体外验证SDF-1对BMSCs的迁移有明显促进作用,趋化作用的强度与SDF-1的浓度有关,以50 ng/ml条件下作用最强,CXCR4的阻断剂AMD3100可以明显抑制BMSCs的迁移,但不能完全阻断细胞的迁移。第二章根尖周损伤对骨髓细胞表达CXCR4的影响目的:通过评价根尖周损伤刺激出血所触发的骨髓中细胞表达CXCR4的变化,探讨局部损伤与全身系统动员干细胞反应之间的关系。方法:72只大鼠随机分为实验组（n=56）、模型组（n=8）和对照组（n=8）。模型组去除牙髓,根管封药一周后处死动物。实验组去除牙髓,根管内封药一周后进行根尖周损伤诱导出血,在根尖损伤后12h、1d、2d、4d、7d、14d及21d全麻下处死动物,采集股骨,免疫组化检测骨髓中CXCR4的表达,以阳性细胞表达面积的百分比计量。结果:股骨中CXCR4阳性表达的细胞主要分布在股骨近端的红髓内,所有的组别及时间点在骨髓中均有CXCR4阳性表达的细胞,它们主要分布在血管中。与空白对照组相比,模型组和实验组在7个不同的时间里骨髓中的血管均有不同程度的扩张,而在扩张的血管中聚集了大量的CXCR4阳性表达的细胞。以CXCR4阳性表达的细胞在视野中所占面积的百分比计,与正常组和模型组比较,实验组在12h、1d、4d、7d、14d及21d表达均有明显增强,2d时的表达虽然有所增强,但与空白对照组和模型组相比无明显差异。实验组内7个时间点相比较,4d及21d时CXCR4阳性表达明显高于2d。空白组和模型组两组之间的表达差异无统计学意义。小结:CXCR4阳性表达的细胞主要分布在股骨的红髓中,并主要位于血管内。根尖周损伤后骨髓中的血管扩张,血管中CXCR4阳性表达的细胞明显增多。结果提示根尖周组织的损伤,可以触发骨髓发生一系列的变化,为内源性干细胞的储备和释放,参与组织的再生和修复提供基础。第三章CXCR4+/-表达骨髓间充质干细胞的示踪与归巢目的:采用基因技术对BMSCs CXCR4的表达水平进行干预和示踪。通过根尖局部组织损伤与根管内植入SDF-1两种不同的处理方法,体内评价SDF-1/CXCR4生物轴对外周血中CXCR4沉默或过表达BMSCs趋化归巢的生物学效应及影响因素。方法:1、对BMSCs CXCR4表达水平的干预和示踪大鼠CXCR4基因过表达的慢病毒载体及CXCR4基因沉默shCXCR4慢病毒载体分别用GFP绿色荧光和Mcherry红色荧光进行标记,转染第3代雄性BMSCs,倒置显微镜观察细胞荧光表达情况,分别采用qPCR和免疫组化检测BMSCs转染后CXCR4 mRNA和CXCR4蛋白的表达水平。2、BMSCs的归巢及影响因素1)自身左右对照:4只雌性大鼠左右侧下颌第一磨牙均纳入研究。左侧根管内植入SDF-1凝胶,右侧根尖周刺激出血后,将大鼠分为两组,每组2只,过表达CXCR4-BMSCs组（CXCR4-BMSCs）通过尾静脉注射CXCR4-BMSCs悬液,CXCR4基因沉默BMSCs组（shCXCR4-BMSCs）注射shCXCR4-BMSCs悬液,24h后处死大鼠,收集下颌骨,心,肺,肝,脾,肾。样本处理后进行原位杂交检测雄性SRY染色体,观察在同一个体内不同的处理方法对CXCR4-BMSCs和shCXCR4-BMSCs在体内迁移的影响。2)异体对照:10只雌性大鼠仅右下颌第一磨牙纳入研究。（1）CXCR4-BMSCs的归巢:6只大鼠分为根管内植入SDF-1组和牙髓血运重建组,每组3只大鼠,根管及根尖周处理后通过尾静脉注射CXCR4-BMSCs。（2）正常表达CXCR4的BMSCs归巢:4只大鼠分为两组,每组2只大鼠,分别进行根管内植入SDF-1和牙髓血运重建行根尖周损伤刺激出血,处理后通过尾静脉注射BMSCs。24h后处死大鼠收集下颌骨。样本处理后进行原位杂交检测SRY染色体,并且对所有大鼠下颌骨样本进行HE染色观察组织学改变。结果:1、对BMSCs CXCR4表达水平的干预和示踪重组GFP-NC、GFP-shCXCR4、Mcherry-NC和Mcherry-CXCR4慢病毒分别转染BMSCs,四天后在荧光显微镜下均可见有荧光,说明带有荧光蛋白（Mcherry或GFP）及CXCR4基因的慢病毒转染细胞后可成功表达荧光蛋白（Mcherry或GFP）,即病毒成功转染入BMSCs中。qPCR与免疫组化结果显示:与阴性对照和正常组相比较,过表达CXCR4组的CXCR4-mRNA表达水平明显上调（P<0.01）,沉默组下调（P<0.05）,单独携带荧光蛋白的阴性对照组与正常组比较无明显改变（P>0.05）。同样的,过表达组CXCR4蛋白表达水平明显上调（P≤0.01）,沉默组CXCR4表达下调明显（P<0.01）,两个阴性对照组与正常组无明显改变（P>0.05）。2、BMSCs的归巢及影响因素2.1自身左右对照2.1.1 HE染色组织学表现:根尖周损伤组在根尖周组织损伤24h后,根管及根尖周组织有大量炎症细胞浸润,SDF-1组在根管内植入SDF-1水凝胶胶原支架24h后,根尖周组织末见炎症细胞浸润,根管内见少数炎症细胞附着于凝胶支架上。2.1.2原位杂交检测雄性SRY染色体尾静脉注射CXCR4-BMSCs后,无论是根尖周局部损伤还是根管内植入SDF-1,在根尖周和根管内均可见携带SRY基因的CXCR4-BMSCs的存在,但根尖周损伤侧CXCR4-BMSCs的细胞数明显多于对侧根管内植入SDF-1的细胞数。尾静脉注射shCXCR4-BMSCs大鼠的根尖周和根管内均没有见到携带SRY基因的BMSCs。2.2异体对照通过原位杂交检测雄性SRY染色体追踪CXCR4-BMSCs和BMSCs在根尖周和根管内的分布,结果显示:不同个体的右下颌第一磨牙,无论是进行根尖损伤还是根管内植入SDF-1处理,两组在根管内和根尖周组织内均可见大量呈棕褐色的CXCR4-BMSCs,根尖周组织归巢的细胞多于根管内。而正常表达CXCR4的BMSCs在根尖周和根管内的数量明显较注射CXCR4-BMSCs少。3、CXCR4-BMSCs和shCXCR4-BMSCs在全身器官中的分布通过尾静脉注射CXCR4-BMSCs,肺、肾脏中有较多表达SRY基因的CXCR4-BMSCs聚集,而在心脏、肝脏和脾脏组织中仅见少量SRY基因阳性的CXCR4-BMSCs。通过尾静脉注射shCXCR4-BMSCs,可见表达SRY基因的shCXCR4-BMSCs主要存在于脾脏,其次是肾脏和肺,而心脏和肝脏组织中末见有SRY基因阳性的shCXCR4-BMSCs。小结:1、本研究成功构建慢病毒载体CXCR4基因过表达雄性BMSCs及CXCR4基因沉默雄性BMSCs,并成功使用荧光蛋白进行标记,采用原位杂交技术检测雄性SRY染色体对细胞的迁移进行追踪。2、无论是根尖周损伤还是人为的在根管内植入SDF-1均可促使外周血中的CXCR4表达阳性的细胞归巢至根管内和根尖周组织。3、同一个体内如果存在多种原因导致的多处局部SDF-1浓度的升高,则相互之间可能存在干扰,以SDF-1局部浓度最高处的趋化作用最强。4、炎症反应有可能增强CXCR4阳性表达的细胞对SDF-1的敏感性,使趋化作用增强。5、SDF-1的趋化作用受趋化细胞CXCR4表达水平的影响,表达水平越高,归巢能力越高,SDF-1对不表达CXCR4的细胞不具有趋化归巢的作用。6、CXCR4-BMSCs和shCXCR4-BMSCs在全身器官中的分布不同,CXCR4-BMSCs以肺、肾脏为主,shCXCR4-BMSCs以肺、脾脏为主。第四章组织学评价SDF-1在牙髓再生中的作用目的:比较根尖周刺激出血和根管内植入SDF-1两种方法诱导无髓根管内新生组织的组织学表现,探讨SDF-1在牙髓再生过程中所发挥的作用和机制。方法:48只8周龄雌性大鼠随机分4组,双侧下颌第一磨牙去髓封药一周后,左侧植入SDF-1凝胶,右侧根尖周刺激出血后进行随机分组（每组12只大鼠）,BMSCs组经大鼠尾静脉注射BMSCs单细胞悬液1mL,AMD3100组注射经CXCR4阻断剂AMD3100预处理的BMSCs单细胞悬液1mL,F12组单独注射DMEM-F12培养液1mL,第4组为空白对照,不注射。各组分别在15天（n=6）和30天（n=6）处死大鼠,收集下颌骨。HE染色观察根管内新生组织的组织学特征,SRYmRNA原位杂交检测经尾静脉注入的细胞在组织中的分布。结果:HE染色右侧根尖周刺激出血后15天,除空白对照组外,其余三组根尖周组织均可见程度不一的炎症细胞浸润,BMSCs组、F12组和空白组的根管内可见骨样细胞,AMD3100组根管内可见牙本质/骨样组织的蓝染色基质。左侧根管内植入SDF-1凝胶后15天,BMSCs组、AMD3100组和空白组的根尖周可见炎症细胞浸润,BMSCs组和AMD3100组的根管内见含有血管样的新生组织,空白组的根管内见有血管样的网状样的结构。根尖周刺激出血后30天,右侧根尖周组织均可见有不同程度的炎症细胞浸润。BMSCs组的根管内可见含有血管的结缔组织样结构。AMD3100组的根管内可见骨组织以及牙本质组织样结构。F12组根管内见似骨组织的蓝色基质。空白组的根管内可见牙本质样组织结构。左侧植入SDF-1凝胶后30天,BMSCs组的根管内可见含有血管样的疏松结缔组织样结构。AMD3100组的根管内可见含有骨样组织结构。F12组根管充满疏松基质结构。空白组的根管内可见含有血管样的疏松基质结构。原位杂交从尾静脉注射CXCR4+表达的BMSCs后15天,损伤侧和根管内植入SDF-1侧下颌磨牙均可见携带SRY染色体的雄性BMSCs迁移至根管和根尖周组织,其它组在根管和根尖周组织内末见有携带SRY染色体的细胞。尾静脉注射CXCR4+表达的BMSCs后30天,双侧下颌第一磨牙均可见携带SRY染色体的BMSCs细胞归巢至根尖周损伤区以及根管内。右侧损伤侧牙周组织和根管内可见数量较多的携带雄性大鼠特征基因的BMSCs,植入SDF-1侧下颌第一磨牙的根管内雄性大鼠BMSCs的数量相对较少。其它组根管内以及根尖周末见携带SRY染色体的细胞。小结:1、SDF-1/CXCR4生物轴可以趋化体内远位的干细胞归巢到根管内并参与组织再生修复。2、SDF-1/CXCR4生物轴可能更有利于在根管内形成血管化的结缔组织。全文结论:1、骨髓间充质干细胞表达CXCR4,SDF-1对表达CXCR4+的骨髓间充质干细胞具有趋化作用,趋化作用的强度与SDF-1的浓度有关。2、根尖周局部刺激损伤可以使股骨红髓中血管扩张,血管中表达CXCR4的细胞数量增加。3、利用慢病毒转染可以成功构建CXCR4过表达和表达沉默的BMSCs,并成功示踪其归巢到根尖周和根管内。4、无论是通过根尖周刺激出血或根管内植入SDF-1,外周血中CXCR4+表达的骨髓间充质干细胞均可以归巢到根管内参与牙髓再生,但根管内植入SDF-1更利于血管化的新生组织再生。5、SDF-1的趋化作用受多种因素的影响:（1）细胞CXCR4的表达水平;（2）炎症反应;（3）是否存在多处损伤或炎症情况。6、CXCR4-BMSCs和shCXCR4-BMSCs在全身器官中的分布不同,CXCR4-BMSCs以肺、肾脏为主,shCXCR4-BMSCs以肺、脾脏为主。7、SDF-1/CXCR4生物轴在牙髓再生过程中可发挥趋化体内干细胞归巢到根管内的作用,但归巢干细胞的增殖和分化方面的作用机制尚待进一步的深入研究。
匡明杰[10]（2019）在《CircUSP45通过miR-127-5p/PTEN/AKT信号通路在激素性股骨头坏死中的机制研究》文中研究表明目的研究circRNA在人激素性股骨头坏死标本中的表达情况,明确差异表达circRNA的表达谱,并验证差异表达的circRNA,筛选出目标分子;研究circUSP45对细胞功能如细胞增殖、细胞凋亡和成骨分化的调控作用,从细胞和分子生物学水平验证circUSP45调控细胞功能的机制;深入研究circUSP45/miR-127-5p/PTEN/AKT信号轴在激素性股骨头坏死中的调控机制,并通过大鼠激素性股骨头坏死模型进行验证。方法第一部分:收集临床激素性股骨头坏死的股骨头和股骨颈骨折股骨头样本,通过倾向值匹配的方法进一步筛选出个体差异较小的样本,并通过circRNA二代测序和生信分析筛选出差异表达的circRNA并构建circRNA表达谱,最后通过q-PCR验证差异表达的circRNA,并选定最终深入研究的circRNA。第二部分:在细胞水平使用地塞米松处理细胞,通过q-PCR验证circUSP45在细胞水平和临床样本是否一致;通过CCK-8、EdU染色验证circUSP45对细胞增殖能力的影响;通过TUNEL染色、western blotting和Annexin V FITC-PI凋亡双染验证circUSP45对细胞凋亡的影响;通过成骨诱导、western blotting检测成骨指标和茜素红染色明确circUSP45对成骨分化能力的影响;使用RNA FISH明确circUSP45的细胞定位;通过生信分析预测结合位点、q-PCR、RNA-pull down实验、荧光素酶报告实验和RNA FISH明确circUSP45与miR-127-5p存在直接作用靶点;通过生信分析预测结合位点、q-PCR、荧光素酶报告实验和western blotting明确miR-127-5p和PTEN的作用关系,并通过western blotting检测是否对下游的AKT信号通路存在影响。第三部分:构建大鼠激素性股骨头坏死动物模型,并在大鼠体内敲低circUSP45的表达验证circUSP45对大鼠激素性股骨头坏死的调控作用;通过HE染色、masson染色和microCT检测评价大鼠股骨头骨小梁的结构变化;通过免疫组化染色、western blotting和q-PCR验证大鼠股骨头成骨指标的变化和AKT信号通路在激素性股骨头坏死中的作用。结果第一部分:（1）倾向值匹配结果显示:实验组与对照组的年龄（P=0.437）、性别（P=0.1165）、BMI（P=0.8747）的差异均无统计学意义。（2）从筛选出的样本中挑选三对进行circRNA二代测序,RNA测序结果显示样本1测得的circRNA有2503个,样本2测得的circRNA有3220个,样本3测得的circRNA有2497个,样本4测得的circRNA有3137个,样本5测得的circRNA有2081个,样本6测得的circRNA有1204个。我们将差异表达倍数为2,P<0.05定义为差异有统计学意义,与正常对照组相比SONFH组表达上调的circRNA有58个,表达下调的circRNA有21个。（3）激素性股骨头坏死组circUSP45的表达量比对照组高5.42倍;我们通过RNA酶耐受实验发现RNA酶可以有效降低USP45 mRNA的表达,但是circUSP45可以有效耐受RNA酶（P<0.05）。（4）Western blotting结果显示,与Fracture组相比SONFH组的成骨指标BMP2、OPG表达显着受到抑制,而破骨指标RANKL表达显着提高（P<0.05）。第二部分:（1）与正常对照组相比,使用10μM的地塞米松处理骨髓间充质干细胞24h可以有效促进circUSP45的表达,地塞米松处理组circUSP45的表达量较正常对照组高3.1倍（P<0.05）;敲低circUSP45的表达可以显着促进细胞的增殖;在骨髓间充质干细胞中过表达circUSP45显着抑制Runx2和BMP2的表达,与正常对照组和地塞米松组相比差异有统计学意义（P<0.05）;过表达circUSP45同样可以显着抑制骨髓间充质干细胞成骨分化。（2）TUNEL结果显示,过表达circUSP45组TUNEL阳性细胞与正常对照组相比也显着增加（P<0.05）;Dex+敲减circUSP45组TUNEL阳性细胞较正常组差异无统计学意义;Annexin V FITC-PI结果显示:在正常对照组处于早期凋亡的细胞占14.76%,晚期凋亡的细胞占0.16%,死亡的细胞占0.02%;地塞米松处理组处于早期凋亡的细胞占58.27%,处于晚期凋亡的细胞占1.25%,死亡的细胞占0.05%;Dex+si-circUSP45处理组中凋亡早期的细胞占15.48%,凋亡晚期的细胞占0.13%,死亡的细胞占0.05%;过表达circUSP45的处理组早期凋亡的细胞占30.98%,晚期凋亡的细胞占0.3%,死亡的细胞占0.03%;我们通过western blotting检测凋亡相关蛋白的表达来进一步确定circUSP45对细胞凋亡的影响,Dex+si-circUSP45可以显着抑制cleaved-caspase-3的表达,Dex+si-circUSP45可以显着促进Bcl-2的表达,Dex+si-circUSP45可以显着抑制Bax蛋白的表达。（3）RNA FISH显示circUSP45的荧光主要定位于细胞质;q-PCR显示过表达circUSP45时miR-127-5p的表达量降低,敲减circUSP45时miR-127-5p的表达量升高;荧光素酶报告实验显示转染pGL3-circUSP45和miR-127 mimics组荧光强度显着降低;通过RNA-pull down实验发现生物素标记的miR-127-5p组的circUSP45表达量显着增高;RNA FISH显示circUSP45与miR-127-5p均定位于细胞质。（4）LV-circUSP45+miR-127-5p mimics组成骨能力显着得到改善但仍然比scramble组和miR-127-5p mimics组差,miR-127-5p mimics组的成骨能力是最强;CCK-8结果显示过表达circUSP45显着抑制细胞的增殖能力,过表达circUSP45的基础上转染miR-127-5p mimics可以有效的促进细胞增殖,EdU染色结果显示scramble组处于增殖期的细胞为31.01%,LV-circUSP45组处于增殖期的细胞为14.99%;LV-circUSP45+miR-127-5p mimics组处于增殖期的细胞为28.67%;miR-127-5p mimics组处于增殖期的细胞为40.23%,与CCK-8结果基本一致;LV-circUSP45组的细胞显着发生凋亡,但是在过表达circUSP45的基础上转染miR-127-5p mimics可以有效的抑制细胞凋亡。（5）转染miR-127-5p mimics可以显着降低PTEN组的荧光强度（P<0.05）;转染miR-127-5p inhibitor可以显着提高PTEN组的荧光强度（P<0.05）;地塞米松显着降低miR-127-5p的表达（P<0.05）;Dex+bpV（phen）组的miR-127-5p的表达显着提高;Dex可以显着抑制p-AKT的表达,Dex+miR-127-5p mimics可以显着的促进AKT和p-AKT的表达;Dex显着抑制细胞的增殖能力（P<0.05）;Dex+miR-127-5p mimics可以显着的促进细胞增殖（P<0.05）,Dex+bpV（phen）可以显着的促进细胞增殖（P<0.05）;Dex组显着抑制成骨;Dex+miR-127-5p mimics组或Dex+bpV（phen）组可以显着的促进成骨。第三部分:（1）正常对照组股骨头内的骨小梁排列规则且完整无破坏,仅有少量的空泡状组织;SONFH组可以显着观察到股骨头坏死,其骨小梁结构显着遭到破坏,坏死股骨头小梁结构大部分被纤维组织替代,空泡状的坏死组织显着增多;SONFH+si-circRNA组股骨头内的骨小梁排列规则且完整无破坏,仅有少量的空泡状组织;SONFH+scramble组的骨小梁结构显着遭到破坏,坏死股骨头小梁结构大部分被纤维组织替代,空泡状的坏死组织显着增多。（2）正常对照组骨小梁清晰且排列紧密,成熟的骨组织较多,新生骨较少;SONFH组骨小梁结构基本消失,空泡状组织显着增多,仅有少量新生骨着色;SONFH+si-circRNA组的骨小梁清晰且排列良好,仅有少量的空泡状组织,成熟骨较少,有大量新生骨生成,说明骨代谢处于活跃状态;SONFH+scramble组的骨小梁结构基本消失,被空泡状的纤维组织代替,成熟骨组织基本消失,仅有少量新生骨着色。（3）正常对照组股骨头的p-AKT显着高表达;SONFH组和SONFH+scramble组中股骨头p-AKT的表达量显着降低;在SONFH中抑制circUSP45的表达可以显着促进AKT的表达。（4）SONFH组和SONFH+scramble组的Runx2和BMP2的表达量显着降低（P<0.05）;而SONFH+si-circRNA组的表达量显着增加（P<0.05）。（5）SONFH组和SONFH+scramble组的caspase-3和cleaved-caspase-3的表达量较正常对照组显着升高（P<0.05）;而SONFH+si-circRNA组caspase-3和cleaved-caspase-3的表达量显着降低（P<0.05）;SONFH组和SONFH+scramble组的AKT和p-AKT的表达量较正常对照组显着降低（P<0.05）;而SONFH+si-circRNA组的总AKT和p-AKT的表达量显着增高（P<0.05）。（6）与正常对照组相比,SONFH组的BV/TV、Tb.Th、Tb.N显着降低,Tb.Sp显着高于正常对照组（P<0.05）;与SONFH+scramble组相比,SONFH+si-circRNA组的BV/TV、Tb.Th、Tb.N显着升高,Tb.Sp显着低于SONFH+scramble组（P<0.05）。结论（1）circUSP45在人激素性股骨头坏死标本中显着高表达,circUSP45通过抑制骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化、促进髓间充质干细胞凋亡调控激素性股骨头坏死。（2）circUSP45在细胞中的表达水平与人SONFH标本中的表达水平一致;且circUSP45调控细胞增殖、凋亡和成骨分化是通过吸附miR-127-5p进行调控的。（3）miR-127-5p通过PTEN/AKT信号通路调细胞增殖、细胞凋亡和成骨分化;circUSP45通过miR-127-5p/PTEN/AKT信号级联调控激素性股骨头坏死。
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 不同介孔直径的双相钙磷陶瓷制备及大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的体外培养和鉴定 |
| 一、研究背景 |
| 二、材料和方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 第二部分 不同微结构的双相钙磷陶瓷动物实验原位成骨能力差异及原位成骨现象中Notch信号通路的表达差异 |
| 一、研究背景 |
| 二、材料和方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 第三部分 不同微结构的双相钙磷陶瓷动物实验异位成骨能力差异及异位成骨现象中Notch信号通路的表达差异 |
| 一、研究背景 |
| 二、材料和方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 一、Notch信号通路的基本构成 |
| 二、骨代谢中Notch信号通路对成骨相关细胞的调节 |
| 三、骨代谢中Notch信号通路对破骨细胞的调节 |
| 四、Notch信号通路与相关疾病 |
| 五、总结与展望 |
| 参考文献 |
| 中英文缩略语对照表 |
| 学术成果 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 miR-181a在后纵韧带骨化中的表达及功能研究 |
| 一、前言 |
| 二、材料与方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 第二部分 miR-181a-5p靶基因筛选与验证 |
| 一、前言 |
| 二、材料与方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 第三部分 miR-181a-5p靶向PBX1调控后纵韧带骨化的机制研究 |
| 一、前言 |
| 二、材料与方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 第四部分 miR-181a-5p的体内功能验证 |
| 一、前言 |
| 二、材料与方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 miRNA对成骨过程的调控作用 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研工作情况 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一章 掺杂二氧化硅纳米颗粒的人脱钙骨基质的制备与表征 |
| 1 实验准备 |
| 1.1 主要仪器设备 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 基本用液的配制 |
| 2 实验方法和步骤 |
| 2.1 二氧化硅纳米颗粒(SiNPs)的制备 |
| 2.2 掺杂Si NPs的人脱钙骨基质(DBM)复合材料(Si/DBM)的制备 |
| 2.3 Si NPs以及Si/DBM的表征 |
| 3 实验结果与讨论 |
| 4 结论 |
| 第二章 掺杂二氧化硅纳米颗粒的人脱钙骨基质的生物相容性以及成骨性能研究 |
| 1 实验准备 |
| 1.1 主要仪器及设备 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 基本用液的配制 |
| 1.4 实验动物 |
| 2 实验方法和步骤 |
| 2.1 Si/DBM的制备 |
| 2.2 人成骨肉瘤细胞系(SaOS-2 cells)的培养 |
| 2.3 Si/DBM的生物相容性检测 |
| 2.4 成骨相关指标检测 |
| 2.5 组织工程骨皮下移植 |
| 2.6 组织学评价 |
| 2.7 数据处理方法 |
| 3 实验结果与讨论 |
| 3.1 Si/DBM支架的生物相容性检测 |
| 3.2 Si/DBM支架体外成骨能力的检测 |
| 3.3 Si/DBM支架体内成骨能力的检测 |
| 4 结论 |
| 第三章 乳腺癌骨转移小鼠模型的构建与验证 |
| 1 实验准备 |
| 1.1 主要仪器设备 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 基本用液的配制 |
| 1.4 实验动物 |
| 2 实验方法和步骤 |
| 2.1 Si/DBM的制备 |
| 2.2 人乳腺癌细胞系MDA-MB-231 cells的培养 |
| 2.3 人成骨肉瘤细胞的培养 |
| 2.4 构建乳腺癌骨转移小鼠模型 |
| 2.5 小动物活体成像验证 |
| 2.6 组织学评价 |
| 2.7 数据处理方法 |
| 3 实验结果与讨论 |
| 3.1 人乳腺癌骨转移小鼠模型的构建 |
| 3.2 人乳腺癌骨转移小鼠模型的验证与分析 |
| 4 结论 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 中英文对照缩略词表 |
| 成果 |
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 低骨量椎体压缩骨折的猪脊柱离体模型建立 |
| 研究对象与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 改良交叉穿刺椎体成形术在低骨量椎体压缩骨折模型中的生物力学分析 |
| 研究对象与方法 |
| 结果 |
| 数据分析 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 改良交叉穿刺椎体成形术治疗骨质疏松性椎体压缩骨折的临床疗效分析 |
| 研究对象与方法 |
| 结果 |
| 数据分析 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 典型病例 |
| 典型病例-传统穿刺 |
| 典型病例-交叉穿刺 |
| 全文总结 |
| 创新点 |
| 综述 |
| 综述一 椎体成形术中骨水泥材料的研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 经皮椎体成形术中骨水泥弥散的研究进展 |
| 参考文献 |
| 英文缩写词表 |
| 攻读博士学位期间科研成果 |
| 致谢 |
| 中英文对照词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 血清甲状腺激素测定 |
| 2.2.2 人原代成骨细胞和软骨细胞的分离和培养 |
| 2.2.3 细胞传代 |
| 2.2.4 细胞冻存与复苏 |
| 2.2.5 细胞计数 |
| 2.2.6 成骨细胞及软骨细胞鉴定 |
| 2.2.7 细胞药物处理、制造缺氧模型和siRNA转染 |
| 2.2.8 实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR) |
| 2.2.9 细胞总蛋白和核蛋白的提取 |
| 2.2.10 蛋白质免疫印迹实验(Western Blot) |
| 2.2.11 细胞免疫荧光染色 |
| 2.2.12 成骨细胞与软骨细胞共培养模型 |
| 2.2.13 酶联免疫吸附实验(ELISA) |
| 2.2.14 荧光原位杂交实验 |
| 2.2.15 免疫组织化学实验 |
| 2.2.16 组织HE染色实验 |
| 2.2.17 体内实验(小鼠骨关节炎模型建立及治疗) |
| 2.2.18 动物活体成像实验 |
| 2.2.19 小鼠软骨下骨Micro-CT扫描 |
| 2.2.20 统计学处理方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 成骨细胞和软骨细胞的鉴定 |
| 3.2 OA患者与正常健康人血清甲状腺激素水平无差异及OA软骨下骨THRα、THRβ表达上调 |
| 3.3 T3 通过PI3K/AKT通路促进OA成骨细胞血管形成相关因子的表达且诱导THRα核转位增强 |
| 3.4 HIF-1α在T3 和缺氧刺激促进成骨细胞VEGF表达中的调节作用 |
| 3.5 阻断OA成骨细胞THR信号抑制软骨下骨血管形成相关因子表达 |
| 3.6 成骨细胞与软骨细胞共培养抑制MMPs的表达 |
| 3.7 OA小鼠模型膝关节腔注射siTHRα抑制软骨下骨血管形成 |
| 4 讨论 |
| 4.1 软骨下骨的解剖及在OA发生发展中的变化 |
| 4.2 成骨细胞在骨关节炎中的作用 |
| 4.3 甲状腺激素在骨关节炎中的作用 |
| 4.4 缺氧在骨关节炎中的作用 |
| 4.5 THR信号在OA软骨下骨微血管形成中的调控作用 |
| 4.6 抑制THR信号在体内实验中的作用 |
| 4.7 本研究的局限及未来研究思路 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 个人简历 |
| 致谢 |
| 综述 受体与骨关节炎发病机制的研究进展 |
| 参考文献 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 主要缩略词 |
| 1 绪论 |
| 1.1 问题的提出及研究意义 |
| 1.2 肌腱的生物学和生理学特性 |
| 1.2.1 细胞组成 |
| 1.2.2 细胞外基质 |
| 1.2.3 肌腱愈合机制 |
| 1.3 肌腱组织工程中支架仿生策略的研究进展 |
| 1.3.1 支架的拓扑结构对干细胞向肌腱和骨系分化行为的影响 |
| 1.3.2 支架的表面化学对干细胞向肌腱和骨系分化行为的影响 |
| 1.3.3 取向性胶原纤维支架在肌腱修复中的应用 |
| 1.4 研究思路及主要研究内容 |
| 1.4.1 研究思路 |
| 1.4.2 主要研究内容 |
| 1.5 本论文的创新点 |
| 2 取向性胶原纤维薄膜的制备及表征 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 主要仪器设备、耗材及试剂 |
| 2.2.1 仪器设备 |
| 2.2.2 试剂及耗材 |
| 2.2.3 相关试液的配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 牛皮的前处理 |
| 2.3.2 难溶性胶原纤维(ICFs)的提取 |
| 2.3.3 酶溶性胶原(PSC)的提取 |
| 2.3.4 胶原的结构和组成分析 |
| 2.3.5 相关性能的比较 |
| 2.3.6 取向性胶原纤维薄膜(CMs)的制备 |
| 2.3.7 CMs表面拓扑结构观察 |
| 2.3.8 CMs纤维取向的验证 |
| 2.3.9 CMs力学拉伸性能测定 |
| 2.3.10 伯氨基含量的测定 |
| 2.3.11 统计分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 前处理后牛皮和粗提胶原纤维的理化性质分析 |
| 2.4.2 ICFs提取条件的优化 |
| 2.4.3 PSC和 ICFs的组成分析 |
| 2.4.4 PSC和 ICFs的结构分析 |
| 2.4.5 PSC与 ICFs相关性能的比较 |
| 2.4.6 CMs的纤维取向和表面拓扑结构 |
| 2.4.7 CMs纤维取向的验证分析 |
| 2.4.8 CMs力学拉伸性能分析 |
| 2.4.9 CMs的化学性质分析 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 本章小结 |
| 3 取向性CMs对 rBMSCs早期行为及后期分化的影响 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 主要仪器设备、耗材及试剂 |
| 3.2.1 仪器设备 |
| 3.2.2 试剂及耗材 |
| 3.2.3 相关试剂的配制 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 rBMSCs的分离(全骨髓贴壁法)和培养 |
| 3.3.2 rBMSCs的冻存和复苏 |
| 3.3.3 rBMSCs表面标志物流式细胞术检测 |
| 3.3.4 rBMSCs三系分化潜能检测 |
| 3.3.5 取向性CMs的细胞相容性评价 |
| 3.3.6 取向性CMs对 rBMSCs早期形态的影响 |
| 3.3.7 取向性CMs对 rBMSCs分化的影响 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 rBMSCs的鉴定 |
| 3.4.2 取向性CMs的细胞相容性评价 |
| 3.4.3 取向性CMs对 rBMSCs早期形态的影响 |
| 3.4.4 在生长培养基中CMs纤维取向对rBMSCs分化的影响 |
| 3.4.5 在成骨诱导培养基中CMs纤维取向对rBMSCs分化的影响 |
| 3.4.6 在软骨诱导培养基中CMs纤维取向对rBMSCs分化的影响 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 4 高取向性CM_a-BMSCs支架对损伤腱体的原位修复 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 主要仪器设备、耗材及试剂 |
| 4.2.1 仪器设备 |
| 4.2.2 试剂及耗材 |
| 4.2.3 相关试液的配制 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 组织工程肌腱的构建 |
| 4.3.2 裸鼠异位模型 |
| 4.3.3大鼠跟腱缺损模型的构建及体内植入实验 |
| 4.3.4 直观形态评分系统及其评测 |
| 4.3.5 功能指数(AFI)测定 |
| 4.3.6 核磁共振成像(MRI) |
| 4.3.7 组织学分析 |
| 4.3.8 组织的基因和蛋白分析 |
| 4.3.9 力学拉伸测试 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 裸鼠异位模型 |
| 4.4.2 CM-BMSCs组织工程肌腱力学拉伸性能测试 |
| 4.4.3 再生腱体的直观形态评价 |
| 4.4.4 再生腱体的功能性评价 |
| 4.4.5 再生腱体的核磁共振成像 |
| 4.4.6 肌腱相关的基因和蛋白的表达 |
| 4.4.7 再生腱体的组织学评价 |
| 4.4.8 再生腱体的异位骨化评价 |
| 4.4.9 植入物的体内安全性评价 |
| 4.4.10 再生腱体的力学拉伸性能 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 本章小结 |
| 5 分级取向CM_(ar)-BMSCs支架对腱-骨连接处原位修复的初探 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 主要仪器设备、耗材及试剂 |
| 5.2.1 仪器设备 |
| 5.2.2 耗材及试剂 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 分级复合支架的制备及力学拉伸测试 |
| 5.3.2 免疫荧光和化学法染色 |
| 5.3.3大鼠跟腱-跟骨连接处模型的构建及体内植入实验 |
| 5.3.4 X光成像 |
| 5.3.5 Micro-CT成像 |
| 5.3.6 组织学分析 |
| 5.3.7 力学拉伸测试 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.4.1 分级取向支架(CM_(ar))的力学拉伸性能稳定性 |
| 5.4.2 分级取向支架(CM_(ar))对rBMSCs早期形态和分化的影响 |
| 5.4.3 跟腱-跟骨的直观形态 |
| 5.4.4 跟腱-跟骨的影像学成像分析 |
| 5.4.5 跟腱-跟骨的组织学评价 |
| 5.4.6 跟腱-跟骨的力学拉伸性能 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 本章小结 |
| 6 主要结论与后续建议 |
| 6.1 主要结论 |
| 6.2 后续工作建议 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| A.作者在攻读学位期间发表的论文目录 |
| B.作者在攻读学位期间取得的科研成果目录 |
| C.作者在攻读学位期间参加的科研项目 |
| D.学位论文数据集 |
| 致谢 |
| 材料与方法 |
| 1 标本来源 |
| 2 设备与试剂 |
| 3 方法 |
| 3.1 脱钙方法及脱钙终点的判定 |
| 3.2 不同脱钙液脱钙后的骨髓活检组织行EBER原位杂交检测 |
| 3.3 不同蛋白酶K消化时间的骨髓活检组织行EBER原位杂交检测 |
| 3.4 不同抗体孵育温度下的骨髓活检组织行EBER原位杂交检测 |
| 4 EBER原位杂交的判读与染色质量评估标准 |
| 5 统计学分析 |
| 结果 |
| 1不同脱钙方式对骨髓活检组织行原位杂交检测的影响 |
| 2不同蛋白酶K消化时间对骨髓活检组织行原位杂交检测的影响 |
| 3不同抗体孵育温度对骨髓活检组织行原位杂交检测的影响 |
| 讨论 |
| 中文摘要 |
| abstract |
| 绪论 |
| 第一章 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1. 实验动物 |
| 1.1.2 .菌株、质粒、载体与种蛋 |
| 1.1.3 .主要实验仪器与设备 |
| 1.1.4 主要实验试剂 |
| 1.1.5 实验试剂配制 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 目的基因片段扩增 |
| 1.2.2 重组质粒构建 |
| 1.2.3 小鼠胚胎的收集与整理 |
| 1.2.4 转基因小鼠基因型鉴定 |
| 1.2.5 组织石蜡包埋与切片 |
| 1.2.6 组织冰冻切片 |
| 1.2.7 组织整体形态观察 |
| 1.2.8 组织HE(苏木精-伊红)染色 |
| 1.2.9 免疫荧光染色 |
| 1.2.10 整骨染色 |
| 1.2.11 整体原位杂交 |
| 1.2.12 鸡胚组织的培养 |
| 第二章 实验结果 |
| 2.1 Shh组织特异性敲除小鼠有效性的验证 |
| 2.2 Shh组织特异性敲除导致小鼠畸形 |
| 2.3 pMes-Ihh转基因小鼠的构建 |
| 2.3.1 pMes-Ihh-IRES-eGFP质粒的构建 |
| 2.3.2 pMes-Ihh-IRES-eGFP质粒酶切线性化 |
| 2.3.3 原核显微注射制备pMes-Ihh转基因小鼠 |
| 2.3.4 条件性过表达Ihh转基因小鼠的有效性验证 |
| 2.4 过表达Ihh可部分挽救Shh敲除型小鼠畸形 |
| 2.4.1 Shh~(Cre/-);pMes-Ihh转基因小鼠中过表达Ihh的验证 |
| 2.4.2 Shh~(Cre/-);pMes-Ihh转基因小鼠的整体形态观察 |
| 2.4.3 过表达Ihh可部分挽救Shh敲除小鼠缺失的口面部中线结构 |
| 2.4.4 过表达Ihh可完全挽救Shh敲除小鼠畸形的肢芽结构 |
| 2.4.5 过表达Ihh无法挽救Shh敲除小鼠神经管的缺陷 |
| 2.5 过表达Ihh无法挽救Shh敲除小鼠神经管发育缺陷的机制 |
| 2.5.1 Shh敲除后导致SHH无法分泌至神经管底板 |
| 2.5.2 Ihh在神经管发育过程中,无法替代Shh的功能 |
| 第三章 分析与讨论 |
| 第四章 结论 |
| 附录1 |
| 附录2 |
| 附录3 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间承担的科研任务与主要成果 |
| 致谢 |
| 索引 |
| 个人简历 |
| 个人简历 |
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一章 SDF-1 对大鼠骨髓间充质干细胞的体外趋化作用 |
| 实验一 大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）的分离及鉴定 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 实验二 SDF-1 对大鼠骨髓间充质干细胞的体外趋化作用 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 第二章 根尖周损伤对骨髓细胞表达CXCR4 的影响 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 第三章 CXCR4~(+/-)表达骨髓间充质干细胞的示踪与归巢 |
| 实验一 过表达CXCR4及CXCR4 基因沉默大鼠BMSCs的构建 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 实验二 SDF-1 趋化 CXCR4~(+/-)表达 BMSCs 归巢的体内研究 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 第四章 组织学评价SDF-1 在牙髓再生中的作用 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新与不足之处 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的论文 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、激素性股骨头坏死circRNA差异表达网络的构建 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 临床样本与试剂耗材 |
| 1.1.2 倾向值匹配筛选股骨头样本 |
| 1.1.3 股骨头RNA提取与RNA酶耐受实验 |
| 1.1.4 环状RNA二代测序 |
| 1.1.5 RT-PCR检测 |
| 1.1.6 Western blot检测 |
| 1.1.7 统计分析 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 倾向值匹配筛选年龄、性别、BMI无差异的组织样本 |
| 1.2.2 circRNA二代测序与circRNA表达网络的构建 |
| 1.2.3 差异表达circRNA的验证与骨代谢相关指标的检测 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 临床样本的筛选与circRNA二代测序 |
| 1.3.2 骨代谢与激素性股骨头坏死的关系 |
| 1.3.3 非编码RNA在激素性股骨头坏死中的作用 |
| 1.4 小结 |
| 二、CircUSP45 通过miR-127-5p/PTEN/AKT信号通路调控激素性股骨头坏死 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 细胞培养以及试剂耗材 |
| 2.1.2 细胞增殖能力检测 |
| 2.1.3 细胞凋亡检测 |
| 2.1.4 成骨能力检测 |
| 2.1.5 RNA的提取、反转录和RT-PCR |
| 2.1.6 Western blotting检测 |
| 2.1.7 RNA荧光原位杂交实验 |
| 2.1.8 RNA pull down实验 |
| 2.1.9 荧光素酶报告实验 |
| 2.1.10 统计分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 CircUSP45 抑制骨髓间充质干细胞的增殖、促进其凋亡并抑制成骨分化 |
| 2.2.2 circUSP45 通过吸附miR-127-5p调控细胞增殖、凋亡和成骨分化 |
| 2.2.3 miR-127-5p通过PTEN/AKT信号通路发挥作用 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 PTEN/AKT信号通路在激素性股骨头坏死中的作用 |
| 2.3.2 miRNA对调控激素性股骨头坏死起到关键作用 |
| 2.3.3 circRNA对调控激素性股骨头坏死的作用机制尚待挖掘 |
| 2.4 小结 |
| 三、circUSP45 对大鼠激素性股骨头坏死模型的影响 |
| 3.1 对象和方法 |
| 3.1.1 实验动物以及试剂耗材 |
| 3.1.2 动物分组、干预与取材 |
| 3.1.3 大鼠股骨头RNA的提取、反转录与q-PCR |
| 3.1.4 大鼠股骨头的western blotting实验 |
| 3.1.5 大鼠股骨头的HE染色 |
| 3.1.6 大鼠股骨头的免疫组化染色 |
| 3.1.7 大鼠股骨头的masson染色 |
| 3.1.8 大鼠股骨头的microCT检测 |
| 3.1.9 统计分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 大鼠股骨头HE、免疫组化和masson染色的结果 |
| 3.2.2 大鼠股骨头成骨指标、凋亡指标以及AKT信号通路表达的检测 |
| 3.2.3 大鼠股骨头microCT的扫描结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 激素性股骨头坏死动物模型的选择与构建 |
| 3.3.2 circUSP45 对大鼠激素性股骨头坏死起到重要调节作用 |
| 3.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 非编码RNA调控骨代谢治疗股骨头坏死的研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
