郑晓彤[1]（2020）在《Salsolinol合成酶及其产物导致多巴胺能神经细胞死亡的机制研究》文中研究说明帕金森病（Parkinson’s disease,PD）是人类最常见的第二大神经系统退行性疾病,多发于中老年人群。其主要临床症状为静止性震颤、肌僵直、行动迟缓和姿势异常等。PD的主要病理特征是路易小体的出现和黑质致密部多巴胺能神经元的退行性病变和死亡。PD的具体发病机制尚未明确。病因学研究显示,PD的发病是年龄老化、环境毒素、遗传等因素综合作用的结果,其中环境毒素在PD的后天发展中占据主导地位。自从神经毒素1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（MPTP）被发现能够诱导机体出现帕金森病类似的症状以来,其结构类似物儿茶酚异喹啉类化合物（CTIQs）与PD的相关性引起了学者的广泛关注。CTIQs属于内源性神经毒素,由脑内氧化应激导致的脂质过氧化反应生成的活性醛与多巴胺经生物酶催化生成;CTIQs经过氮甲基化和氧化后生成的产物能够与线粒体复合物I结合,造成能量代谢障碍的同时也加剧了细胞内的氧化应激水平,形成恶性循环,最终导致多巴胺能神经元的变性死亡。在此恶性循环过程中,催化CTIQs生成的生物酶是目前研究的重点和难点,由于含量少、纯化困难等因素,使得内源性神经毒素导致PD发病的机制研究停滞不前。Salsolinol合成酶（Sal合成酶）是CTIQs合成和代谢过程中的首个关键酶,它能够催化多巴胺（DA）和乙醛生成Sal,并加剧后续相关产物的生成和代谢,与PD的致病机制关系密切。迄今为止,国际上关于该酶的研究报道较少,本课题组长期致力于该酶的研究工作,前期已经从鼠脑中对其进行分离、纯化和鉴定,并进行了初步的酶学性质研究,然而该酶的确切生物学功能仍然未知。Sal合成酶生物学功能的实现依赖其催化产物Sal,近年来关于Sal的神经毒性存在争议,其导致多巴胺能神经细胞死亡的机制尚未完全阐明,因此本课题主要围绕Sal合成酶及其产物展开相关研究,具体包括以下几方面:1、采用6-羟基多巴胺（6-OHDA）构建PD细胞模型和动物模型,探究PD模型中Sal合成酶的活性、分布及产物等的生成情况。结果显示Sal合成酶在细胞和大鼠纹状体、中脑、海马、皮层中均有活性分布,且在细胞模型组和动物模型组纹状体中酶的活性升高。成功检测了大鼠脑区中Sal的含量,且模型组中脑区Sal的含量升高。2、构建Sal合成酶过表达的细胞模型和Sal合成酶转基因小鼠,从细胞水平和活体水平揭示Sal合成酶对多巴胺能神经细胞的影响。细胞水平的研究显示,Sal合成酶是一种胞浆蛋白,主要分布于细胞质中。Sal合成酶在细胞内过表达48 h后活性增强,CTIQs类神经毒素Sal和NM-Sal的含量显着上升。流式细胞仪检测发现Sal合成酶过表达后线粒体膜电位下降,提示细胞进入凋亡早期阶段,细胞凋亡情况的检测结果与之相符。对相关细胞凋亡因子的研究显示,Sal合成酶能够抑制抗凋亡蛋白Bcl-2表达并促进促凋亡蛋白Bax的表达,并且这一结果在Sal体外诱导实验中得到验证。在活体水平方面,繁育了Sal合成酶的FVB转基因小鼠,从行为学和病理学检测Sal合成酶的过表达与PD的关系。结果显示,13月龄的Sal合成酶转基因小鼠在爬杆实验中出现运动迟缓的症状,然而黑质致密部的免疫组化染色中没有发现显着差异,由此推测,Sal合成酶在活体中导致的神经毒性需要时间的累积,该酶单独作用不足以直接导致动物机体中PD症状的发生,符合PD发病因素复杂的特点。3、在Sal合成酶导致细胞凋亡发生的进程中,其催化产物Sal发挥了关键作用。为了阐明Sal导致多巴胺能神经细胞死亡的分子机制,本研究利用全转录组测序技术（RNA-seq）筛选出了Sal诱导后发生显着变化的相关基因和信号通路。测序结果发现,与RNA甲基化（FTO/Mettl3/Mettl23）、凋亡（Bad）和转录因子（Foxa3）等相关基因在内的740个基因表达上调,与自噬（Atp264/Atg1611）、DNA甲基化（Dnmt3a/Dnmt1）和转录因子（FoxO1）等相关基因在内的1665个基因表达下调。GO分析结果显示差异表达基因主要定位在线粒体内膜、溶酶体腔、高尔基体等细胞组分中,改变离子结合能力和酶的催化活性等功能。miRNA的调控、自噬和细胞极性的调节等生物过程受到影响。KEGG富集结果显示Sal影响Akt、TOR和FoxO等信号通路,为后续的Sal毒性机制研究提供了依据和靶点。4、基于RNA-seq分析结果,从Akt-mTOR信号通路和自噬的角度揭示Sal诱导多巴胺能神经细胞发生凋亡的分子机制。Sal诱导降低了抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,细胞发生凋亡。通路研究显示,Sal诱导使Akt和mTOR磷酸化水平升高,LC3Ⅱ/Ⅰ下降,说明Sal通过激活Akt-mTOR信号通路抑制细胞内的自噬水平。Sal诱导也降低了细胞内Ca2+浓度、钙通道相关蛋白NMDAR1和多巴胺受体基因Drd3的表达水平,表明Sal诱导后细胞膜上和内部信号传导能力变弱。细胞内去甲基化酶FTO的表达水平在Sal诱导后也降低,导致RNA甲基化修饰6-甲基腺嘌呤（m6A）的水平升高。除此之外,Sal还能够部分逆转6-OHDA引起的FTO和NMDAR1表达的升高,是一种潜在的去甲基化酶和NMDAR1受体拮抗剂,具备一定的临床应用价值。通过上述研究,本课题明确了Sal合成酶及其产物在多巴胺能神经细胞凋亡过程中发挥了重要毒性作用。Sal合成酶通过催化Sal的生成损害线粒体,促进凋亡,最终导致多巴胺能神经细胞死亡。体外诱导试验表明Sal通过激活Akt-mTOR信号通路抑制细胞内自噬流,最终引起细胞的死亡。在该过程中,NMDAR1-Ca2+信号传导途径和RNA甲基化修饰发挥了调节。综上所述,Sal合成酶和Sal是导致多巴胺能神经细胞死亡的关键因子。
吕颖[2]（2020）在《LncRNAs调节hiPSCs向多巴胺能神经元的诱导分化和干细胞移植治疗帕金森大鼠及PTRF转基因小鼠中造血干细胞功能损伤的研究》文中认为目的（1）建立hiPSCs向多巴胺（dopamine,DA）能神经元的诱导分化体系,系统分析诱导分化过程中lncRNAs的表达和功能变化,进一步筛选并探究关键lncRNA MIAT在hiPSCs及诱导分化中的作用。（2）探讨6-OHDA大鼠帕金森（Parkinson’s disease,PD）模型不同脑区基因表达的改变并筛选PD关键基因与通路,为研究PD的分子机制和防治提供新思路。（3）系统比较并评价神经干细胞、间充质干细胞及其诱导细胞、hiPSCs诱导分化细胞移植治疗PD的效果,为移植细胞的选择和时间点的确定提供实验基础。方法（1）单层贴壁培养法建立hiPSCs向DA能神经元的诱导分化体系,RT-qPCR和免疫荧光染色检测神经相关标记物划分细胞所处阶段。将诱导分化中不同阶段细胞进行lncRNAs转录组测序和生物信息学分析,包括基因表达分析、差异基因分析、lncRNAs靶基因预测和功能富集分析。筛选关键lncRNA MIAT进行RT-qPCR表达验证,Cas9转录激活慢病毒构建MIAT过表达稳转细胞系,RT-qPCR、碱性磷酸酶染色、免疫荧光染色检测MIAT在hiPSCs及其向DA能神经元诱导分化中相关标记物的表达。（2）脑立体定位手术构建6-OHDA大鼠PD模型,阿扑吗啡诱导旋转测试筛选成功PD模型,免疫组化检测黑质DA能神经元的含量,高效液相色谱检测纹状体 DA、二羟苯乙酸（dihydroxyphenyl acetic acid,DOPAC）和高香草酸（homovanillic acid,HVA）的含量。分离5个脑区（嗅球、室管膜下区、纹状体、黑质、海马）进行转录组测序、生物信息学分析和RT-qPCR验证。透射电镜观察超微结构改变。（3）移植细胞分组包括:神经干细胞（neural stem cells,NSCs）、绒毛膜间充质干细胞（human placental chorionic-derived mesenchymal stem cells,hpcMSCs）、脐血单个核细胞（cord blood mononuclear cell,CB-MNC）、脂肪干细胞（adipose-derived stem cells,ADSCs）及其诱导6天、12天、24天的细胞、hiPSCs诱导分化11天、18天和25天的细胞。新型氧化铁纳米颗粒（molday ion rhodamine B,MIRB）标记干细胞并通过脑立体定位手术进行细胞移植。阿扑吗啡诱导旋转测试、旷场试验和抓力测试对动物进行行为学评价。核磁观察细胞在活体脑内的情况,免疫荧光染色观察移植细胞的迁移、增殖、分化以及星形胶质细胞的改变。透射电镜观察脑组织超微结构变化。结果（1）建立了 hiPSCs向DA能神经元诱导分化体系。细胞诱导分化至5-7天处于NSCs阶段,至第1 1天开始进入DA能神经元前体细胞阶段,至第25天TH+神经元的比例约为40%左右。诱导分化体系中存在普遍的lncRNAs差异表达和功能调控。在转录本水平和基因水平存在大量的差异表达基因（differentially expressed genes,DEGs）。差异lncRNAs靶基因和差异mRNAs功能富集结果总体相一致,主要参与轴突导向、（Wnt/TGF-β/Hedgehog/MAPK/p53）信号通路、神经退行性疾病（PD/AD/HD）、代谢途径和细胞周期等。iPSCd0 vs iPSCd7前20项显着富集的功能还包括神经元分化调节、中枢神经系统发育、Wnt信号和凋亡等,与诱导分化密切相关。MIAT及其靶基因MAPK10在iPSCd7组的表达量高于iPSCd0组（p<0.05）,与测序结果相一致。hiPSC-MIAT细胞呈克隆状增殖生长,多能性基因的表达水平与hiPSCs无统计学差异,碱性磷酸酶染色阳性且大量表达OCT4阳性细胞。hiPSC-MIAT诱导至第5天即可见大量细胞向外伸展生长呈分化状态,OCT4、EN1、NURR1基因表达水平高于对照组（p＜0.05）,SOX1和PAX6基因表达水平低于对照组（p<0.05）。（2）成功构建了 6-OHDA大鼠PD模型,黑质TH+神经元减少约90%以上,纹状体DA、DOPAC和HVA的含量分别为对照组的4.28%、8.40%、4.96%。模型大鼠5个脑区均发生了基因改变,GO和KEGG功能富集分析显示DEGs主要参与突触、线粒体、炎症免疫、代谢、发育、损伤修复、记忆、氧化应激、凋亡和神经退行性疾病等生物学过程。韦恩分析5个脑区共有DEGs为Ephx2和Faml11a。PPI分析纹状体主要节点基因为Gng2、Npsr1、Bdnf、Penk和Crh。DA能突触和逆行内源性大麻素信号是PD关键通路,其中存在DA能、谷氨酸能和GABA能突触的共有级联结构,即以Gi/o为中心的Gi/o-GIRK、Gi/o-AC-PKA和Gi/o-MAPK。PD模型5个脑区均存在不同程度的线粒体形态异常。（3）阿扑吗啡诱导旋转测试显示,ADSCd12、iPSCd18和iPSCd25有效比例较高且有效时长到达观察终点32周,其中iPCSd18组有效比例最高。与对照组相比,干细胞移植各组大鼠肌力均有所提升（p<0.05）,移植各组之间无统计学差异。与对照组相比,移植大鼠的总活动路程和总运动时间均显着升高（p<0.05）,各移植组之间无统计学差异。与对照组相比,移植组大鼠的跨区域次数增加,其中ADSCd12组高于iPSCd25组（p<0.05）。MIRB标记的移植细胞能够在脑内生长,细胞移植后能够发生迁移,迁移方式包括局部迁移、向胼胝体迁移和跨脑区的远程迁移。细胞移植后8周,部分移植细胞PCNA染色阳性,移植后32周PCNA+细胞较少。iPSCd18组细胞移植后32周,部分分化为DA能神经元表达TH阳性。细胞移植后8周针道周围大量星形胶质细胞被激活,呈纤维束网状或胞体增大增厚,移植后32周表达减少。细胞移植后8周,大鼠5个脑区的线粒体形态异常均有不同程度的改善。结论（1）hiPSCs向DA能神经元诱导分化体系中,细胞诱导5-7天处于NSCs阶段,11天进入DA能神经元前体细胞阶段,25天TH+细胞比例约为40%。（2）hiPSCs向DA能神经元诱导分化过程中存在广泛的lncRNAs表达和功能变化,部分功能调节与诱导分化关系密切。（3）LncRNA MIAT及其靶基因MAPK10在诱导第7天细胞中表达升高。过表达MIAT不影响hiPSCs的多能性,但在诱导分化过程中促进hiPSCs向中脑DA能神经元前体细胞分化。（4）6-OHDA大鼠PD模型在病理生化和基因水平都能够很好地模拟人类PD,5个脑区（嗅球、室管膜下区、纹状体、黑质、海马）均发生了基因改变,DEGs主要参与突触、线粒体、炎症免疫、代谢、发育、损伤修复、记忆、氧化应激、凋亡和神经退行性疾病等生物学过程。（5）5个脑区的共有DEGs（Ephx2和Faml11a）和纹状体的主要节点基因（Gng2、Npsr1、Bdnf、Penk和Crh）可能是PD分子机制和治疗的关键靶点。（6）DA能突触和逆行内源性大麻素信号是PD关键通路,其中存在DA能、谷氨酸能和GABA能突触的以Gi/o为中心的共有级联结构（Gi/o-GIRK、Gi/o-AC-PKA和Gi/o-MAPK）,可能是PD突触损伤的关键分子机制。（7）各类干细胞及其诱导细胞移植治疗PD大鼠均能在一定程度上改善动物行为障碍（转数、肌力、自主活动能力）,ADSCd12组、iPSCd18组和iPSCd25组的治疗效果相对较好且维持时间较长,其中iPSCd18组的行为学评价有效比例最高。（8）移植细胞能够在脑内生长并以不同方式迁移,初期具有增殖能力,促进大量星形胶质细胞的表达,后期有所降低,能够分化为DA能神经元,对脑区内线粒体超微结构损伤有一定的改善作用。干细胞功能的年龄依赖性下降在衰老中起着重要作用,但其分子机制尚不清楚。PTRF（polymerase I and transcript release factor）是胞膜窖形成和发挥功能的重要成分,参与调节细胞增殖、内吞作用、信号转导和衰老等生物学功能。本研究旨在通过PTRF转基因小鼠分析PTRF在造血干细胞（hematopoietic stem cells,HSCs）衰老中的作用。采用流式细胞术检测免疫细胞和造血干/祖细胞的比例;测定HSCs的细胞周期、衰老和ROS表型。采用RT-qPCR和蛋白免疫印迹检测衰老相关基因和蛋白的表达水平。结果表明,PTRF转基因小鼠骨髓中HSCs数量明显增多,并表现出G1期细胞周期停滞、SA-β-Gal阳性率增加和活性氧水平升高的衰老表型。PTRF过表达的HSCs在体内、体外的自我更新和造血重建能力也显着降低。PTRF通过 ROS-p38-p16 和 caveolin-1-p53-p21 途径诱导 HSCs 衰老。
邹昱[3]（2019）在《儿茶酚胺影响β—淀粉样蛋白和α—突触核蛋白聚集的分子机制研究》文中研究指明研究目的:阿尔兹海默病（Alzheimer’s disease,AD）和帕金森病（Parkinson’s disease,PD）是神经退行性疾病中最为常见的两种疾病,在世界范围内影响着数千万人,它们的发病分别与β-淀粉样蛋白（Amyloid-β,Aβ）和α-突触核蛋白（α-synuclein,αS）的聚集密切相关。寻找能够抑制蛋白聚集的抑制剂是目前AD和PD治疗领域最活跃的研究方向之一,有效的抑制剂在药物研发方面扮演着关键的角色。近年来,多种实验（体外实验和体内实验）表明,儿茶酚胺类神经递质能够减缓Aβ和αS纤维化动力学进程,抑制αS和Aβ的聚集,降低聚集体毒性。然而儿茶酚胺抑制αS和Aβ聚集、破坏αS和Aβ类纤维的分子机制尚不清晰。在本文中,我们研究了儿茶酚胺类神经递质对Aβ和αS聚集体结构和聚集动力学的影响,对比不同浓度下儿茶酚胺抑制Aβ和αS聚集的分子机制,为AD和PD的药物设计提供了有用的线索。同时,由于运动作为一种应激,能够影响儿茶酚胺的分泌,而运动作为一种现代社会公认的促进健康的方式,已经证实能够通过减少Aβ和αS聚集体的生成、促进聚集体清除、抑制其神经毒性等预防AD和PD,延缓其发病进程。因此,本文的研究也为进一步揭示运动预防、缓解AD和PD的潜在生物学机制提供了理论依据。研究方法:本文采用全原子分子动力学模拟和增强采样的副本交换分子动力学模拟方法研究了三种儿茶酚胺类神经递质多巴胺（Dopamine,DA）、去甲肾上腺素（Norepinephrine,NE）和肾上腺素（Epinephrine,EP）对全长/关键片段Aβ和αS蛋白聚集的影响。所有的模拟和分析均使用GROMACS软件以及自己编写的程序,蛋白力场使用AMBER力场,小分子力场使用GAFF力场。研究结果:（1）NE极大地降低了Aβ1-42二聚体链间β-sheet和长β-strand的含量,抑制了β-haipin结构的形成。NE与Aβ二聚体的结合减少了链间的平均接触面积和主链间氢键的数目。NE和Aβ1-42二聚体有五个主要的结合位点,其中位于核心疏水区域的K16LVFFA21位点和C端区域的31IIGLMV36疏水位点是两个最重要的结合位点。NE与疏水氨基酸I41、I31和L17以及芳香族氨基酸Y10、F4和F20有着较低的结合能,主要与带负电的氨基酸（E11、E22、D7、E3、D23和D1）形成氢键,与氨基酸R5之间存在着阳离子-π作用。NE降低了Aβ类纤维的β-sheet含量,减少了Aβ类纤维的氢键数目,与氨基酸D1、A2、D23以及A42形成氢键。（2）随着寡聚体尺寸（二聚体到五聚体）的增加,αS44-96（希腊钥匙状核心区域）的Cα-均方根差不断减小,β-sheet几率不断增加。DA/NE均能降低αS44-96三聚体和四聚体的β-sheet几率,NE降低幅度更大。与DA相比,NE形成了更多的主链氢键。未加小分子的三聚体中,半数E46-K80盐桥未受到影响,在四聚体中,大部分盐桥被保存下来,在加入DA/NE后,E46与K80距离变大,距离分布变宽。DA/NE结合αS寡聚体有三个主要的结合位点,其中,两个结合位点非常相似:氨基酸57-70和81-83,不同的位点位于N端区域（氨基酸45-52）,DA更倾向于结合在该区域。DA/NE破坏αS存在两种破坏模式,其中结合在αS寡聚体turn区域破坏相邻β-sheet结构是最主要的破坏模式。（3）DA和NE均能有效降低Aβ1-40三聚体的β-sheet几率,且随着浓度的升高,β-sheet几率在不断降低,EP在三个浓度下对Aβ三聚体β-sheet结构的影响较小。DA破坏Aβ三聚体β-sheet区域主要集中于N端2-10和C端32-37,NE主要降低N端氨基酸1-10和C端34-38的β-sheet几率。DA和NE能够减少Aβ三聚体氢键数目,EP对Aβ三聚体氢键形成无影响。不同浓度下DA分别与氨基酸D7、F20和H14有着最高的接触概率,氨基酸H13、G9和K28在三个不同的浓度下与NE有着最高的结合概率,F4、H14和M35在三个体系中分别和EP有着最高的结合概率。（4）DA、NE和EP均能降低αS68-78（NACore）六聚体β-sheet几率,且随着浓度的增加,β-sheet几率逐渐减少,NE的破坏效果强于DA和EP。具体到氨基酸来看,在所有体系中,αS聚集关键氨基酸A76和V77的β-sheet几率有着较大幅度的减少。加入不同浓度的三个小分子后,六聚体的溶剂可及表面积均有所增加,链间接触数目减少。对小分子和蛋白间的接触概率进行分析发现,DA主要与G73、V77和A78三个氨基酸有着重要接触,NE主要与氨基酸T72、A76、V77和A78有着较高的接触概率,EP结合位点较为分散,三个小分子均与氨基酸V77和A78有着较高的接触。研究结论:（1）作为第一篇研究NE抑制全长Aβ1-42聚集的模拟工作,我们发现NE能够很好地抑制Aβ1-42二聚体β-sheet和β-haipin结构的形成,使Aβ二聚体变得更加无序,同时富含coil结构。NE通过结合两个Aβ聚集关键区域（核心疏水区域和C端疏水区域）来有效地抑制Aβ纤维化。疏水作用、芳香堆积作用、氢键作用和阳离子-π作用协同驱动了NE的结合。同时,NE可以与Aβ类纤维的氨基酸形成氢键来破坏Aβ类纤维的稳定。（2）对于αS44-96纤维形成而言,三聚体是关键核,四聚体是最小稳定核。当DA/NE吸附到αS三聚体和四聚体时,它们通过强烈破坏β-sheet结构和链间E46-K80盐桥来影响αS类纤维的稳定,且NE的破坏效果要强于DA。对于DA/NE而言,两个相同的结合位点被识别出来:氨基酸57-70和81-83。一个不同的位点同样被发现,位点位于N端区域氨基酸45-52。DA/NE与αS的结合主要由疏水作用和静电作用驱使。DA/NE破坏αS主要存在两种破坏模式,其中,结合在αS寡聚体turn区域破坏相邻β-sheet结构是最主要的破坏模式。（3）DA和NE均能通过降低N端和C端氨基酸β-sheet几率来破坏Aβ1-40三聚体β-sheet结构,且随着DA和NE浓度的升高,β-sheet几率在不断降低,而EP对Aβ三聚体β-sheet结构的影响较小。在三个小分子中,DA对Aβ三聚体β-sheet结构有着最好的破坏效果。DA和NE能够阻止主链氢键的形成,诱导Aβ三聚体形成无序的构象,从而影响聚集体的稳定性。DA能够结合在N端氨基酸6-14、核心疏水区域19-20和C端氨基酸38-40上,主要由静电作用和芳香堆积作用驱使;NE主要结合在N端氨基酸4-11、核心疏水区域20-25和C端氨基酸38-40上,而EP结合N端氨基酸3-11和14-16、核心疏水区域17-20以及C端氨基酸32-40上,芳香堆积作用和疏水作用共同作用于EP与蛋白的结合。（4）DA、NE和EP均能通过降低αS68-78（NACore）六聚体β-sheet几率来破坏蛋白的β-sheet结构,NE的破坏效果强于DA和EP。三个小分子与NACore六聚体的相互作用能够阻止NACore六聚体主链上氢键的形成,增加六聚体溶剂可及表面积,减少链间接触数目,从而破坏NACore六聚体的稳定。结合概率分析表明疏水作用主要驱使着小分子与蛋白的相互作用,疏水氨基酸V77和A78在两者结合上发挥了重要作用。
芦娟[4]（2017）在《基于JNK信号通路探讨针刀干预对帕金森病大鼠机制的研究》文中认为目的:观察针刀干预对帕金森病模型大鼠黑质神经炎症、神经细胞凋亡及相关因子的影响,并探讨JNK信号通路在针刀干预帕金森病中的作用机制。方法:雄性SD大鼠72只,分为空白组、假手术组、模型组、药物组、电针组和针刀组。采用单侧纹状体双靶点注射6-OHDA建立PD模型,通过阿朴吗啡（APO）诱发行为学检测验证模型。空白组不做任何处理;假手术组与模型组的注射方法和部位相同,仅注射等量的含0.2%维生素C的生理盐水;造模成功后,药物组美多芭片50mg/kg灌胃,电针组进行针刺治疗,针刀组给予针刀干预。治疗四周后各组取材检测,检测指标包括:（1）行为学检测:记录大鼠60min内旋转圈数;（2）HE染色观察黑质神经细胞形态学;（3）免疫荧光双标法检测黑质COX-2/TH,p-c-Jun/TH的表达;（4）Westernblot检测黑质JNK,P-JNK,p-c-Jun,COX-2及TH表达;（5）免疫组织化学检测黑质TH神经细胞;（6）Real-TimePCR检测黑质DATmRNA含量;（7）TUNEL染色检测凋亡细胞（8）免疫荧光双标法检测黑质Caspase-3/TH的表达（9）Westernblot检测黑质Caspase-3,Bcl-2,Beclin-1 的表达结果:（1）行为学检测:模型组出现旋转行为且治疗前后旋转圈数无差异（P>0.05）;药物组、电针组、针刀组干预后大鼠旋转圈数明显减少,活动增多,干预前后有明显差异（P<0.01）,与模型组相比差异显着（P<0.01）。（2）形态学检测:①HE染色:不同干预方法均可使HE染色黑质神经细胞数目增多,形态结构趋于正常,药物组黑质神经细胞排列有序,数量与模型组比较增多,细胞变性程度减轻,胶质细胞增生不明显;电针组黑质神经细胞数量与模型组比较增多较为明显,细胞变性程度明显减轻;针刀组黑质神经细胞数目与模型组比较明显增多,排列较密集,细胞变性减轻。②黑质TH的免疫组织化学染色:正常组和假手术组的黑质均可见密集的TH免疫反应阳性细胞,呈棕褐色,胞体较大,胞体主要为圆形或卵圆形,少数为多边形。模型组黑质可见少量、稀疏的TH免疫反应阳性神经元,胞体缩小,轮廓不清晰;药物组、电针组及针刀组TH免疫反应阳性神经元数量增多较为明显,胞体轮廓清晰可见,染色强度上亦有增加。③免疫荧光双标记黑质COX-2/TH,p-c-Jun/TH,Caspase-3/TH检测结果:正常组和假手术组的黑质均可见密集的TH免疫反应阳性细胞,呈绿色,胞体较大,胞体主要为圆形或卵圆形,同时,COX-2,p-c-Jun,Caspase-3/TH,呈红色荧光,在数量上和染色强度上表达较弱;模型组黑质可见少量、稀疏的TH免疫反应阳性神经元,呈绿色,细胞肿胀变性,或皱缩,数量较少,染色强度减低,同时,COX-2,p-c-Jun,Caspase-3,呈红色荧光,在数量上和染色强度上表达增加;药物组、电针组及针刀组TH免疫反应阳性神经元呈绿色,排列较有序,数量增多,胞体变性程度减轻,染色强度上亦有增加;同时,COX-2,p-c-Jun,Caspase-3/TH,呈红色荧光,较模型组,在数量上减少,染色强度减低。与电针组和药物组比较,针刀组TH神经元数目更多,胞体变性程度更轻;针刀组COX-2和p-c-Jun在数量上较电针组少,但比药物组多;药物组Caspase-3在数量上比电针组和针刀组少。（3）Western blot 检测结果:①与空白组比较,模型组大鼠黑质内JNK含量无明显差异（P>0.05）;P-JNK,P-JNK/JNK,p-c-Jun表达升高（P<0.05）,COX-2表达显着升高（P<0.01）;与模型组比较,药物组、电针组、针刀组大鼠黑质内JNK含量无明显差异（P>0.05）;与模型组比较,P-JNK和p-c-Jun含量在药物组和电针组中有差异（P<0.05）,针刀组具有显着差异（P<0.01）,与模型组比,P-JNK/JNK在药物组,电针组和针刀组中有差异（P<0.05）,COX-2含量电针组具有差异（P<0.05）,在药物组和针刀组中有显着差异（P<0.01）;②与空白组比较,模型组大鼠黑质内TH表达显着降低（P<0.01）。与模型组比较,药物组、电针组大鼠黑质内TH表达均升高（P<0.05）,针刀组大鼠黑质内TH表达显着升高（P<0.01）;③与空白组比较,模型组大鼠黑质内Caspase-3表达升高（P<0.05）,Beclin-1表达显着升高（P<0.01）,Bcl-2表达显着下降（P<0.01）;与模型组比较,Caspase-3含量在药物组和电针组中降低（P<0.05）,针刀组显着降低（P<0.01）;Beclin-1含量在电针组表达降低（P<0.05）,在药物组和针刀组中表达显着降低（P<0.01）;Bcl-2在三组中表达均升高（P<0.05）。（4）Real time-PCR检测结果:与空白组比较,模型组大鼠黑质内DAT表达显着降低（P<0.01）;与模型组比较,药物组大鼠黑质内DAT表达显着升高（P<0.01）,电针组和针刀组大鼠黑质内DAT表达均升高（P<0.05）。（5）TUNEL染色:与空白组比较,模型组大鼠神经元凋亡数显着增加（P<0.01）;与模型组比较,药物组、电针组及针刀针组大鼠神经元凋亡数显着降低（P<0.01）;结论:（1）针刀干预能有效减轻PD大鼠黑质神经元炎症反应,在JNK通路上,其可能通过降低COX-2/p-c-Jun的活性,降低JNK磷酸化水平,提高TH的抗氧化活性而发挥对神经元细胞保护作用。（2）针刀干预可使TH神经元形态改善、数量增多以及TH阳性细胞的表达增多,提高DAT的表达,从而发挥对神经元的保护作用。（3）针刀干预能有效的减轻PD大鼠黑质神经元的凋亡,其可能通过降低Caspase-3的促凋亡活性,激活Bcl-2的抗凋亡活性,抑制自噬基因Beclin-1活性,提高TH的抗氧化活性而发挥对神经元细胞保护作用。（4）对JNK信号的通路的抑制可能是针刀发挥作用的机制之一。
臧矫[5]（2016）在《BMSCs移植对PD大鼠脑纹状体内DA水平及AADC表达影响的研究》文中进行了进一步梳理多巴胺（DA）作为去甲肾上腺素（NE）的前体物质,是中枢神经系统的关键递质。其通过选择性作用于抑制性神经元,维持机体运动平衡。若多巴胺合成不足,兴奋性胆碱能神经元将会处于相对优势,从而引发帕金森病（PD）。目前在PD的临床治疗方案中,普遍以补充DA类药物或恢复脑内DA水平来控制病情。因此,DA的水平及参与其合成的相关因子的表达在帕金森疾病发病机理及控制研究中起到重要作用。本研究对不同阶段大鼠脑纹状体内多巴胺的含量,以及芳香族氨基酸脱羧酶（AADC）基因、蛋白表达的变化进行检测,通过分析骨髓间充质干细胞（BMSCs）移植治疗PD模型大鼠前后脑纹状体内DA和AADC含量的动态变化,探究外源性细胞移植治疗PD的作用机制,为PD的临床治疗提供实验依据。实验一BMSCs移植对PD模型大鼠脑纹状体DA水平影响的研究采用脑立体定位法单侧单点进针注射6-羟多巴胺（6-OHDA）制备PD大鼠模型,术后以经典的阿扑吗啡（APO）诱导大鼠转圈,筛选成功的PD模型大鼠。以全骨髓贴壁法培养取自正常大鼠股骨的骨髓间充质干细胞（BMSCs）,纯化培养至第三代,原位定点移植到PD模型大鼠损毁侧纹状体内进行细胞治疗。术后APO诱导治疗后的大鼠,检测细胞移植对PD模型大鼠的行为学改善情况,判断细胞移植的治疗效果。通过紫外检测法检测梯度浓度的DA标准品确定标准曲线,建立脑纹状体组织中多巴胺含量的高效液相色谱（HPLC）测定方法。选取正常大鼠（N组）、造模后4周大鼠（M4组）、造模后8周大鼠（M8组）、BMSCs移植治疗后4周PD大鼠（T4组）、BMSCs移植治疗后8周PD大鼠（T8组）脑纹状体匀浆液,以HPLC检测各组动物纹状体内DA含量,探讨BMSCs移植治疗后脑纹状体内DA变化规律。成功PD模型大鼠的转圈数为8.47±1.12r/min。BMSCs移植治疗后,转圈数逐渐减少,8周时降至6.49±0.46r/min,与PD模型对照大鼠存在显着差异（P<0.05）。实验成功建立了HPLC检测色谱条件,即Waters SymmrtryshieldTM RP18柱,流动相为0.05 mol/L磷酸二氢钠-0.02 mol/L柠檬酸-甲醇（74：24：2）,流速为1.0 mL/min,外标法定量,紫外吸收波长λmax为280 nm；通过对标准品的测定,以多巴胺浓度（X）为横坐标,以多巴胺标准品色谱峰峰面积（Y）为纵坐标,进行回归计算,获取标准曲线为y=16.343x.0812,其相关系数R2=0.9996,具有较好的相关性；平均回收率分别为90.4%,91.1%,93.2%；RSD分别为3.4%,8.1%,5%；检测限为0.5 mg/L,定量限为10.8 mg/L,符合生物样品前处理的要求。以建立的HPLC方法对样品的检测结果显示,N组大鼠脑纹状体内DA的含量为15.56±2.16 μg/g；M4组、M8组大鼠损毁侧脑纹状体内DA含量分别为10.67±1.54 μg/g和10.50±2.32 μg/g,M4组与M8之间不存在差异（P>0.05）,而M4组、M8组均极显着低于N组（P<0.01）；T4组与T8组大鼠损毁侧脑纹状体内DA含量分别为12.70±2.91 μg/g和13.71±2.42 μg/g,其中T4组显着高于M4组、M8组（P<0.05）,T8组极显着高于M4组、M8组（P<0.01）,表现出随细胞移植时间的延长DA水平逐渐恢复的趋势。研究显示,BMSCs移植治疗技术对PD模型大鼠的行为改善起明显作用,且能提高脑纹状体内DA的含量。提示移植的外源BMSCs,可能通过分化为多巴胺能神经元或促进其功能恢复、增加DA的分泌,进而改善PD模型的症状。实验二BMSCs对PD模型大鼠脑纹状体AADC表达影响的研究本研究通过检测多巴胺合成途径的限速酶—芳香族氨基酸脱羧酶（AADC）的表达,探究BMSCs移植治疗PD中引起DA含量变化的作用途径。实验分别提取正常大鼠（N组）、PD模型大鼠（M组）和BMSCs移植治疗大鼠（T组）脑纹状体的总RNA、miRNA和总蛋白,以荧光定量PCR、Western Blot和免疫组化等方法检测脑纹状体内AADC的mRNA、 miRNA和蛋白,分析PD模型大鼠治疗前后AADC的mRNA、miRNA表达水平变化与蛋白水平变化的关系,同时结合纹状体内DA水平,分析BMSCs移植治疗PD大鼠的行为学改善与脑纹状体内多巴胺含量及其合成限速酶的关系。结果显示,正常大鼠（N组）、模型4周大鼠（M4组）、模型8周大鼠（M8组）、治疗4大鼠（T4组）和治疗8周大鼠（T8组）损毁侧脑纹状体内AADC mRNA的表达水平均不存在显着差异（P>0.05）。模型大鼠损毁侧脑纹状体内miRNA的表达水平显着高于正常鼠（P<0.01）,AADC蛋白含量极显着降低于正常鼠（P<0.01）;BMSCs移植治疗后,miRNA的表达极显着降低（P<0.01）,AADC蛋白表达却上升。本实验中,AADC蛋白表达与miRNA趋势相反,提示AADC蛋白的表达可能在转录后受到niRNA的调控。免疫组化结果显示,模型组较正常组AADC特异性染色细胞减少,而BMSCs移植治疗后明显增多。本实验中,PD模型大鼠损毁侧脑中AADC蛋白较正常侧明显降低,移植BMSCs治疗后,AADC蛋白含量有所上升,相应的DA含量也同步提高。结果提示,纹状体内DA的合成受AADC的调控；BMSCs移植治疗,通过增加AADC的表达和AADC特异性染色细胞的数量,促进DA合成、提高DA水平,进而改善PD的症状。因此,AADC是保证DA合成的关键物质,其是PD发病与治疗的重要因子。
孟宪月[6]（2016）在《PLGA介导VEGF基因对多巴胺能神经元保护作用的研究》文中进行了进一步梳理目的探讨可缓释包裹血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor）的聚乳酸-羟基乙酸共聚物（（poly（lactic-co-glycolic acid）,PLGA））纳米粒对帕金森大鼠多巴胺能神经元的保护作用及其机制。方法（1）帕金森大鼠模型建立:新购大鼠饲养1周后,颈部皮下注射阿扑吗啡确认无自发性旋转后用于模型制备。大鼠腹腔注射10%水合氯醛深度麻醉,麻醉平稳后将其俯卧位固定于Korf型大鼠立体定向仪上,头部备皮后剪开皮肤分离皮下组织暴露前囟,以前囟为参考点,确定右侧黑质致密部（SNC）:前囟后4.8 mm,矢状缝右1.9 mm,硬膜下7.5 mm和中脑腹侧被盖（VTA）:前囟后4.8 mm,矢状缝右1.1 mm,硬膜下8.0 mm。每点注射4 g/L的6-羟基多巴5μL,注射速度1μL/min,注射完毕后留针10min。3周后颈部皮下注射阿扑吗啡（0.25mg/kg）诱导其向健侧旋转,每周筛选1-2次,连续筛选3周,每次时长30分钟并记录结果,旋转圈数大于210圈者为PD模型大鼠。（2）缓释包裹VEGF基因的PLGA纳米粒的制备:采用复乳溶剂挥发法制备包裹VEGF基因的缓释型PLGA纳米粒,并将其制成冻干粉。扫描电镜下观察纳米颗粒的形态,马尔文粒径仪检测纳米颗粒直径、Zeta电位,紫外分光光度法检测包封率。（3）纳米粒的脑内移植:制模成功的PD大鼠模型随机分为五组,空白对照组、1ng/ml尾静脉组、10ng/ml尾静脉组、100ng/ml尾静脉组、立体定位组。空白对照组尾静脉给予0.1M PBS缓冲溶液,第2-4组尾静脉注射给予相对应浓度的包裹VEGF基因的PLGA纳米粒溶液,立体定位组立体注射1ng/ml的包裹VEGF基因的PLGA纳米粒溶液。（4）检测手段:分别于移植后的第7、14、28天,在大鼠颈部皮下注射阿扑吗啡后计数其向对侧的旋转圈数,于治疗后的第28天应用酶联免疫吸附法（ELISA）测定各组大鼠体内VEGF的含量,高效液相（HPLC）检测纹状体内多巴胺及其代谢产物高香草酸的浓度,免疫组织化学法观察多巴胺能神经元的表达。（5）统计学方法:所有资料应用SPSS 17.0医学统计软件处理,数据以均数±标准差表示,计量资料采用t检验,p<0.05有统计学意义。结果（1）纳米粒的形态及表征:PLGA包裹VEGF质粒制成纳米粒后,经马尔文粒径仪检测,粒径为220.1±23.2nm,Zeta电位为-18.6±4.2mV;制成冻干粉后于扫描电镜下观测微球形态规则,大小均一;紫外分光光度计法检测包封率为91%。（2）移植后PD大鼠的行为学检测:移植载VEGF基因的PLGA纳米粒PD大鼠旋转次数较空白对照组均减少,其中1ng/ml尾静脉组、立体定位组与空白对照组相比有显着性差异,具有统计学意义（p<0.05）。（3）酶联免疫吸附（ELISA）及高效液相色谱（HPLC）:1ng/ml尾静脉组、立体定位组与空白对照组相比有显着性差异,有统计学意义（p<0.05）,10ng/ml尾静脉组及100ng/ml尾静脉组虽有改变,但无统计学意义。（4）免疫组化结果示:除空白对照组外,各组TH阳性细胞的数目与移植前相比均增加,以1ng/ml尾静脉组及立体定位组最为显着,其中1ng/ml尾静脉组、立体定位组与空白对照组相比有显着性差异,具有统计学意义（p<0.05）结论（1）PLGA纳米粒介导的VEGF基因对帕金森大鼠多巴胺能神经元具有保护作用。（2）低浓度载VEGF基因的PLGA纳米粒对帕金森多巴胺神经元的保护作用与高浓度相比,效果更为显着。（3）通过对尾静脉组与立体定位组实验结果的比较,证实包载VEGF基因的PLGA的纳米粒可透过血脑屏障,对多巴胺能神经元产生相应的保护作用。（4）静脉注射包载VEGF基因的PLGA纳米粒与立体定位相比安全有效,简单方便,为帕金森病的治疗开辟新的方法。
赵贝贝[7]（2014）在《帕病2号方对帕金森病大鼠多巴胺能神经元的保护机制》文中提出目的：1.神经毒性物质6-OHDA左侧纹状体两点注射法建立帕金森病（Parkinson disease, PD）大鼠模型,检测术后不同时间点大鼠左侧纹状体组织内多巴胺（dopamine, DA）和乙酰胆碱（acetylcholine, Ach）含量的变化及大鼠行为学变化。术后不同时间点检测大鼠左侧中脑黑质组织转录因子NF-E2（nuclear factor-erythroid2-related factor2, Nrf2）核蛋白、血红加氧酶-1（Heme oxygenase-1, HO-1）蛋白的表达。2.研究帕病2号方对PD大鼠中脑黑质多巴胺能神经元损伤的保护作用及其机制,为帕病2号方的临床应用提供实验研究基础。方法：实验一：雄性SD大鼠,随机分为假手术组和6-OHDA组,每组按时间分为术后6h、24h、48h、1w、2w、4w、8w7个亚组。采用6-OHDA左侧纹状体两点注射法建立PD大鼠模型,假手术组注射0.02%抗坏血酸溶液。术后不同时间点观察阿扑吗啡（R-（-）-Apomorphine hydrochloride hemihydrate, APO）诱发大鼠旋转行为学的变化,ELISA法测定各时间点大鼠左侧纹状体区DA和Ach含量,HE染色观察左侧中脑黑质区多巴胺能神经元病理形态学的改变。实验二：实验一动物取材时留取左侧中脑组织,western blot法检测术后各个时间点Nrf2核蛋白、HO-1蛋白的动态表达。实验三：造模方法同实验一,雄性SD大鼠随机分为正常对照组、假手术组、6-OHDA造模组,将造模成功的PD大鼠随机分为模型组、帕病2号方低剂量组（8.0g生药/Kg）、帕病2号方中剂量组（16.0g生药/Kg）、帕病2号方高剂量组（32.0g生药/Kg）。连续4周灌胃给药。观察APO诱发的行为学变化,ELISA法测定左侧纹状体区DA和Ach含量。FRAP法检测左侧纹状体组织T-AOC含量。Western blot法检测左侧中脑组织Nrf2核蛋白、HO-1蛋白的表达。RT-PCR法检测左侧中脑组织Nrf2、HO-1mRNA表达。实验四：造模方法同实验一,雄性SD大鼠随机分为正常对照组,假手术组,模型组,帕病2号方治疗组（32.0g生药/Kg）。连续4周灌胃给药,比较治疗后各组大鼠体重变化,网格实验观察大鼠移动潜伏期,尼氏染色观察左侧中脑多巴胺能神经元的形态,免疫组织化学技术检测左侧中脑组织TH、Nrf2、HO-1蛋白的表达分布。结果：实验一：1.行为学方面：假手术组各时间点经APO诱发均未出现异常旋转行为。6-OHDA造模成功大鼠经APO诱导出现典型的右侧旋转行为,24h与6h大鼠右侧旋转速度比较无明显差异（P>0.05）,48h、1w、2w、4w大鼠右侧旋转速度逐渐增快,分别与相应前一时间点比较,差异有统计学意义（P<0.05）,4w大鼠右侧旋转速度达到高峰,4w与8w大鼠恒定右侧旋转速度比较,差异无统计学意义（P>0.05）。2.DA和Ach含量变化：假手术组各时间点DA和Ach无显着差异（P均>0.05）。6-OHDA术后6h DA含量降低,与假手术6h比较,差异有统计学意义（P<0.05）,6-OHDA术后1w、2w、4w DA含量明显减少,分别与相应前一时间点比较,差异均有统计学意义（P均<0.05）,6-OHDA术后4w与8w DA含量比较,差异无统计学意义（P>0.05）。与假手术组比较,6-OHDA术后6h、24h Ach无显着变化,差异无统计学意义（P>0.05）。6-OHDA术后48h、1w、2w、4w Ach含量明显升高,分别与相应前一时间点比较,差异有统计学意义（P均<0.05）,6-OHDA术后4w与8w Ach含量比较,差异无统计学意义（P>0.05）。3.HE染色：光镜下观察,假手术组各时间点左侧黑质区组织结构清晰,神经元形态完整,排列整齐,数量多,细胞核清晰,核仁明显,神经纤维排列整齐,结构紧密。6-OHDA造模组6h部分神经元形态正常,可见少量神经元肿胀,细胞边缘突出,胞核稍大。24h、48h、1w可见大量神经元胞体肿胀,细胞核变大,核呈空泡状,部分出现核裂解,胶质细胞增多。1w可见部分神经元周围出现4-6个胶质细胞围绕,形成卫星现象。2w时神经元肿胀减轻,核仁明显偏移或破裂。随着造模时间的延长,神经元数量减少,4w、8w神经元凝固性坏死,核仁不明显,伴有大量胶质细胞弥漫性或局限性增生,可见小胶质细胞进入坏死神经元的胞体或突起中,形成噬神经细胞现象。实验二：假手术组术后各时间点Nrf2核蛋白、HO-1蛋白低表达,不同时间点相比差异无统计学意义（P>0.05）。6-OHDA组术后各时间点相比,6h Nrf2核蛋白表达升高,24hHO-1蛋白表达升高,1w达高峰,2w、4w、8w有所回落,与假手术组相应时间点比较仍表达较高（P<0.01）。实验三：1.行为学变化：正常组、假手术组大鼠活动正常,无异常旋转行为。模型组、帕病2号方低剂量组治疗前后大鼠右侧旋转速度比较,差异无统计学意义（P>0.05）；帕病2号方中、高剂量组治疗前后大鼠右侧旋转速度比较,差异均有统计学意义（P<0.05）；与帕病2号方中剂量组比较,帕病2号方高剂量组大鼠右侧旋转速度明显减慢,差异有统计学意义（P<0.05）2.正常组与假手术组左侧中脑组织Nrf2核蛋白、H0-1蛋白呈低表达,两组间比较,差异无统计学意义（P>0.05）；与正常组大鼠比较,模型组、帕病2号方各治疗组Nrf2核蛋白、HO-1蛋白表达均升高,差异有统计学意义（P<0.01）；与模型组大鼠比较,帕病2号方各治疗组Nrf2核蛋白、HO-1蛋白表达均明显升高,差异有统计学意义（均P<0.01）；与帕病2号方低剂量组比较,帕病2号方中剂量组Nrf2核蛋白、HO-1蛋白表达无明显升高,差异无统计学意义（P>0.05）,与帕病2号方中剂量组比较,帕病2号方高剂量组Nrf2核蛋白、HO-1蛋白表达显着上调,差异有统计学意义（P<0.01）。3.DA和Ach含量：与正常组比较,假手术组左侧纹状体DA、Ach含量无明显变化,差异无统计学意义（均P>0.05）,模型组左侧纹状体DA含量明显减少（P<0.05）,Ach含量明显升高（P<0.05）；与模型组比较,帕病2号方低剂量组DA含量升高不明显（P>0.05）,中、高剂量组DA含量明显升高（P<0.05或P<0.01）；与低剂量比较,高剂量组DA含量明显升高（P<0.05）。与模型组比较,低、中、高剂量组Ach含量均下降（均P<0.05）；与低、中剂量组比较,高剂量组Ach含量下降明显,差异有统计学意义（P<0.05）。4.总抗氧化能力（T-AOC）:与正常组比较,假手术组左侧纹状体T-AOC含量无明显变化（P>0.05）,模型组、帕病2号方各治疗组左侧纹状体T-AOC含量降低,差异有统计学意义（P<0.05）；与模型组比较,帕病2号方各治疗组能够明显提高PD模型鼠左侧纹状体T-AOC含量（P<0.05）,且高剂量组作用明显。实验四：1.体重：造模前各组体重两两比较,差异无统计学意义（P>0.05）,治疗后,正常组与假手术组体重比较,差异无统计学意义（P>0.05）,与正常组比较,模型组和帕病2号方治疗组体重偏轻,差异有统计学意义（P<0.01或P<0.05）,与模型组比较,帕病2号方治疗组体重增加,差异有统计学意义（P<0.01）。2.网格实验：与正常组比较,假手术组移动潜伏期无显着变化（P>0.05）；与正常组比较,模型组与帕病2号方治疗组大鼠移动潜伏期显着延长,差异有统计学意义（P<0.05）；与模型组比较,帕病2号方治疗组大鼠运动能力有所提高,移动潜伏期时间缩短,差异有统计学意义（P<0.05）。3.尼氏染色：正常组、假手术组大鼠黑质致密带神经元结构形态正常,为大中型锥体细胞,细胞核淡染,核仁明显,细胞质呈蓝色,尼氏小体呈均一紫蓝色着色分布于细胞核周围,清晰可见。模型组大鼠黑质致密带神经元数目明显减少,细胞核固缩或偏移,部分核仁可见,细胞质中央尼氏小体溶解消失,胞质呈苍白均质状,完整神经元数目明显减少。帕病2号方治疗组,完整神经元数目较模型组明显增多,尼氏体染色数量相对增多。4.TH免疫组化染色：正常组,假手术TH免疫反应阳性细胞呈棕褐色,密集分布,数量多,神经元突起明显。模型组神经元数目减少,神经元突起不清晰。正常组与假手术组左侧黑质区TH阳性细胞数目比较,差异无统计学意义（P>0.05）。模型组、帕病2号方治疗组左侧黑质区TH免疫反应阳性细胞数目较正常组明显减少,差异有统计学意义（P<0.01）。帕病2号方治疗组左侧黑质区TH阳性细胞数目较模型组增多,差异有统计学意义（P<0.05）。5. Nrf2、HO-1免疫组化染色：正常组、假手术组各大鼠左侧中脑黑质区可见Nrf2细胞浆阳性表达,无明显细胞核阳性表达,模型组各大鼠左侧中脑黑质区Nrf2细胞浆和细胞核均有表达,帕病2号方治疗组Nrf2细胞浆和细胞核内均表达,且以细胞核内表达明显。各组间Nrf2阳性表达IOD值比较：正常组与假手术组两组IOD值比较,差异无统计学意义（P>0.05）,模型组胞浆内表达降低,IOD值下降,细胞核内表达增加,IOD值升高,与正常组比较,差异均有统计学意义（均P<0.01）,帕病2号方治疗组,胞浆内表达明显降低,IOD值降低,细胞核内表达增加,IOD值升高,与模型组比较,差异有统计学意义（P<0.01）。正常组,假手术组黑质神经元HO-1蛋白无明显阳性表达,模型组可见少许阳性表达,帕病2号方治疗组可见明显的阳性表达,各组间阳性细胞IOD值表达比较：正常组与假手术组大鼠左侧中脑黑质区HO-1蛋白IOD值较低,差异无统计学意义（P>0.05）,模型组HO-1蛋白IOD值升高,与正常组比较,差异有统计学意义（P<0.01）,帕病2号方治疗组HO-1蛋白IOD值明显降低,与模型组比较,差异有统计学意义（P<0.01）。结论：1.6-OHDA造模后,随着造模时间延长,大鼠左侧纹状体内DA含量逐渐下降,Ach含量逐渐上升,于术后4w达到稳定状态,与大鼠右侧旋转行为表现一致。2.6-OHDA造模后可以激活Nrf2蛋白,帕病2号方干预后进一步提高Nrf2核蛋白和Nrf2mRNA表达,进而上调下游靶基因HO-1蛋白及HO-1mRNA的表达,且帕病2号方高剂量组作用更为明显。3.帕病2号方灌胃干预PD大鼠,通过调节纹状体区DA, Ach含量,提高中脑黑质区Nrf2核蛋白、HO-1蛋白的表达,抑制6-OHDA对多巴胺能神经元的氧化应激损伤,提高机体抗氧化能力,从而发挥神经元保护作用。
魏小兵[8]（2012）在《SDF-1/CXCR4通路在神经干细胞移植治疗帕金森病中的作用及其分子机制研究》文中提出目的（1）研究胚胎中脑腹侧神经干细胞（Mesencephalic NSCs, mNSCs）移植对帕金森病（Parkinson Disease, PD）的治疗作用。（2）以SDF-1/CXCR4信号转导为切入点,初步探讨MNSCs移植治疗PD的分子机制。方法（1）解剖分离E14d大鼠胚胎中脑腹侧组织,以无血清神经干细胞培养液培养,观察其增殖、分化。对培养的细胞进行神经干细胞特性和分化潜能的免疫细胞化学鉴定。（2）黑质、内侧前脑束立体定向注射6-羟多巴胺（6-OHDA）,建立帕金森病的大鼠模型。（3）将建模成功的PD大鼠随机分为四组：对照组（不移植神经干细胞也不注射AMD3100）；神经干细胞移植组;神经干细胞移植+AMD3100组；AMD3100组。（4）选取培养第3代的神经干细胞,采用立体定向技术移植到神经干细胞移植组和神经干细胞移植+AMD3100组PD大鼠模型的黑质、内侧前脑束。（5）移植后每天给神经干细胞移植+AMD3100组和AMD3100组腹腔注射CXCR4阻断剂AMD3100（1.25mg/kg/天）。（6）移植MNSCs后1W,2W,3W和4W分别腹腔注射lml APO （0.2mg/ml）诱导大鼠旋转,然后对各组PD大鼠进行行为学评分。（7）于细胞移植后的1W,2W和4W分别处死各实验组大鼠,用TRIzol （Invitrogen）抽提患侧脑组织总RNA,进行RT-PCR以检测患侧脑内SDF-1和CXCR4的基因表达。（8）于细胞移植后的1W、2W和4W分别处死各实验组大鼠,通过Western Blot检测患侧脑内SDF-1和CXCR4的蛋白表达。（9）所有计量数据以均数±标准差（x±s）表示,采用SPSS17.0软件对结果进行统计学分析,计量资料采用单因素方差分析,P<0.05表示差异具有统计学意义。结果（1）从E14d胎鼠的中脑腹侧分离得到的神经干细胞具有增殖和形成神经球的能力,体外培养第7天的MNSCs免疫细胞化学表达Nestin阳性,经体外分化培养基培养7d的胚胎中脑腹侧神经干细胞RT-PCR和TH免疫细胞化学结果显示MNSCs分化后可表达多巴胺神经元特异性分子标志物。（2）注射6-OHDA制备PD动物模型成功且具有较长时期的稳定性,行为学评分没有出现自我恢复的现象。（3）与其他各组（对照组；神经干细胞移植+AMD3100组；AMD3100组）相比,神经干细胞移植组PD模型大鼠1W、2W、3W和4W经APO诱导旋转和行为学都有显着改善。AMD3100注射组与神经干细胞移植+AMD3100注射组在1W、2W、3W和4W后经APO诱导旋转行为结果表明,与对照组比较没有显着变化。（4） RT-PCR和Western Blot结果显示基因转录水平与蛋白表达水平发生了一致性变化,表明神经干细胞移植组SDF-1、CXCR4基因与蛋白表达水平升高和其他组间出现了显着差异。结论（1） MNSCs移植可以显着改善PD大鼠模型运动障碍。（2） MNSCs移植治疗PD有效,其机制与上调SDF-1的表达和激活SDF-1/CXCR4通路密切相关。
邹志浩[9]（2011）在《基质细胞衍生因子1α诱导胎源细胞向帕金森病鼠脑内迁移的实验研究》文中研究表明帕金森病（Parkinson’s Disease PD）是一种好发于中老年、以锥体外系黑质（Substantia nigra, SN）多巴胺（Dopamine, DA）能神经元进行性变性、坏死为主要病理表现,是仅次于阿尔茨海默病（Alzheimer’s Disease, AD）最常见的中枢神经系统退行性疾病,也是发病率第一位的运动神经系统退行性疾病。PD的发病机制尚不清楚,目前认为是环境以及遗传等多种因素所共同作用的结果。对于PD患者而言,当DA的含量减少至生理水平的70%以上时,就会出现临床症状,并以进行性加重的运动迟缓、肌强直、静止性震颤以及植物神经紊乱等为主要特征,并可能伴有心理以及精神症状改变。统计资料表明,PD总发病率为0.1%-0.2%,其中55岁以上人群发病率为1.4%,而75岁以上人群这一比率上升至3.4%；数据表明,随着年龄的增长,PD的发病率呈逐渐上升趋势。随着我国乃至世界人口老龄化速度的加快,PD患者的患病人数也在日趋增加,病人因此而饱受痛苦,同时也给社会及家庭带来巨大的负担。目前,PD的治疗手段主要有：内科治疗、外科治疗,以及细胞移植治疗等方法。内科治疗以口服DA制剂,DA受体激动剂,DA增强剂,抗胆碱类药物、单胺氧化酶（MAO-B）抑制剂及儿茶酚胺邻甲基转移酶（COMT）抑制剂等药物为主,虽然服用早期对于PD患者疗效确切,能够起到缓解症状的作用,但是都不能延缓PD的自然病程进展,同时随着口服药物时间的延长,疾病的进展,单次药物的剂量需要不断加大,服用药物的间隔时间不断缩短,并出现药物耐受现象以及“异动”症状等副作用,同时,长期服用DA类药物还可以加重对中脑内残余DA神经元的损伤,而加重病情；外科治疗对于中晚期PD患者的近期疗效具有较好的效果,目前常用的手术方式包括：立体定向下核团毁损术以及丘脑底核（STN）深部脑刺激电极埋植术（DBS）等。核团毁损手术是一种破坏性手术,对于双侧症状明显患者,通常为避免更严重的并发症而以一侧手术为主,由于可能存在毁损灶的自我修复作用,其远期疗效受到限制；而DBS手术疗效确切,并有逐渐取代核团毁损术的趋势,但是,DBS高昂的价格又限制其能够得到广泛的应用,同时,术后仍不能改变PD的自然进程。因此,无论是内科治疗还是外科治疗,都只是缓解症状的手段,属于对症治疗,并不能阻止和逆转PD患者SN区DA能神经元进行性减少的病理进程。随着基因工程技术以及干细胞理论和实验研究的不断深入,为PD的治疗提供了一个全新的理念及可能。目前认为,PD是最适合于给予细胞移植及基因治疗的疾病之一,因此,细胞移植及基因治疗为PD的真正治愈提供了广阔的空间。基质细胞衍生因子-1α（stromal cell derived factor-1, SDF-1α）是一类新近发现的α（CXC）趋化因子家族成员。SDF-1α在神经系统发育以及脑损伤中具有重要的调节和趋化作用。研究发现,SDF-1α大量及选择性地在发育的中枢神经系统中表达,并随着发育过程,表达量呈进行性降低。而其唯一配体CXCR4对于中枢神经系统的发育是非常重要的,CXCR4能使得神经元顺其梯度改变发生迁移。另有研究也证实,CXCR4受体或SDF-1α基因敲除的小鼠出生后表现出器官发育上的缺陷：包括神经系统发育障碍,并于出生前后死亡；而且SDF-1α及其受体CXCR4在小脑、海马和大脑新皮质的发育中发挥重要的作用。对于这一作用,普遍认为SDF-1α在低浓度时刺激神经元轴突延伸,而在高浓度时抑制神经元轴突形成,在部分轴突观察到SDF-1α可以促进轴突分支,这种作用可能与CXCR4在神经元的表达部位有关。在神经元祖细胞,CXCR4大量表达在胞体和轴突前沿,随着细胞分化成熟,CXCR4主要沿着轴突和树突表达,很少在胞体表达。另外,相关研究称,表达CXCR4的骨髓干细胞能够沿着SDF-1α的浓度梯度而定向迁移；在组织及器官损伤的情况下,SDF-1α能促进骨髓干细胞、炎症细胞募集到损伤部位,它既是调节组织、器官损伤修复的关键细胞因子,也是一个调节局部炎症的重要趋化因子。同时也有研究发现,血管内皮生长因子（VEGF）能促进血管内皮细胞SDF-1α的表达,同时通过阻断SDF-1α/CXCR4轴可以起到抑制VEGF依赖的血管形成作用；而且高表达CXCR的肿瘤细胞有更高的转移潜能,伴自分泌SDF-1α的肿瘤细胞株转移潜能更高。因此,SDF-1α的生物学特性也决定了它可能在组织、器官损伤的修复过程中发挥着“诱导”或“召唤”内源或者外源干细胞迁移等重要作用。在PD的细胞移植研究中,种子细胞的选择一直是研究的热点。胎源干细胞（Gestation-derived stem cells, GdSCs）是一群来源于胚胎、胎儿以及胎儿附属器官的干细胞,包括胚胎源性干细胞（Embryo-derived stem cells, EdSCs）、胎儿源性干细胞（Fetal-derived stem cells, FdSCs）以及胎儿附属器官源性干细胞（Fetal appendage-derived stem cells, FAdSCs）,其中FAdSCs包括脐血间充质干细胞（umbilical cord blood mesenchymal stem cells, UCBMSCs）、脐带间充质干细胞（umbilical cord mesenchymal stem cells, UCMSCs）以及胎盘间充质干细胞（placenta mesenchymal stem cells, PMSCs）等。胚胎以及胎儿自身发育成熟的过程,其实就是大量各个阶段的干细胞（全能干细胞、多能干细胞以及成体干细胞等）不断流动更新以及增值分化的过程,在这一过程中,每个细胞、组织乃至器官都存在巨大的发育潜能以及强大的可塑性。此前的研究已经证实,EdSCs在体外环境下能够像DA能神经元分化；近期也有研究显示,在神经元条件培养基、音猬蛋白（sonhedgehog, SHH）（?）（?）成纤维细胞生长因子-8 （Fibroblast growth factor 8, FGF-8）共同作用下,UCMSCs能够被成功诱导为表达酪氨酸羟化酶（Tyrosine Hydroxylase,TH）、并能够分泌DA的DA能神经元。然而,在成体干细胞（Adult stem cells, ASCs）的研究中,即使ASCs具有横向诱导分化能力已经被普遍承认,但是,将其定向诱导分化分为特定神经元或DA能神经元依然是研究中的“瓶颈”；虽然在2006年,日本科学家Takahashi和Yamanaka将4种转录因子（Oct4, Sox2, Klf4和c-Myc）在体外同时转导小鼠的皮肤成纤维体细胞,使之成为具有像EdSCs一样有多发育潜能的诱导多能干细胞（induced pluripoten tstem cells, iPS）,但是iPS的研究依然存在着定向分化不稳定以及较强的致瘤性重要缺陷。因此,在PD的干细胞移植以及基因的目前治疗中,仍以中脑来源的FdSCs移植疗效最为肯定。但是,这种治疗方法受到移植时机选择以及伦理问题、胎源细胞来源少等限制,难以得到广泛应用。因此,如果能够能够利用胎儿发育过程中巨大的种子细胞来源,通过某种“自然召唤”的诱导方式使GdSCs达到特定损伤部位,在其微环境的诱导下向特定细胞分化,最终起到修复、治疗的目的,而又不损伤胎儿,则可能根本解决供体来源以及伦理等问题。因此,本研究的目的旨于观察胎源细胞在PD动物模型体内的迁移,评价其对PD模型的治疗作用,同时,探讨胎源细胞在体内的迁移机制,以及为进一步可迁移胎源细胞生物学特性的鉴定以及筛选提供前提条件,为胎源细胞以及SDF-1α的临床应用提供实验依据。因此,本研究共分为三个部分：第一部分帕金森病MPTP小鼠的建立及评价本部分研究中,采用小剂量间隔多次的方法,共计16天分6次皮下注射MPTP成功制作了C57BL/6j小鼠PD模型。在每次注射MPTP药物后以及制模后每日上午9时连续1小时观察小鼠行为变化情况及持续时间；并在制模开始后第0、4、7、13、16天局部注射MPTP后30分钟,给予行爬杆实验,并记录所用时间爬杆实验检测小鼠协调运动能力；分别于制模开始后第16天局部注射MPTP后,以及制模后第30天,采用免疫组化方法统计并比较各组小鼠中脑黑质TH+神经元数量的改变；分别于制模开始后第10、16天局部注射MPTP后,以及制模后第30天,应用高效液相色谱-荧光检测器检测各组小鼠黑质DA含量的变化,并综合评价小鼠PD模型。结果提示,MPTP组小鼠注射药物后在行为学上出现了肢体震颤、弓背、竖尾、竖毛、后肢张开、运动迟缓、步态不稳等改变,较好地模拟PD的症状；同时在爬杆实验上,MPTP组小鼠爬杆时间呈逐渐延长趋势（F=39.532,P<0.001）,同时较对照组延长（F=234.896,P<0.001）,其中制模后第16天所用爬杆时间（19.36±1.68）秒较对照组（12.31±7.52）秒延长约3倍；病理学检查方面,MPTP组小鼠中脑黑质TH+神经元数量较对照组显着减少（F=712.128,P<0.001）,同时呈逐渐下降（t=7.387,P<0.001）,制模开始后30天（54.40±5.77）个/高倍视野,仍较对照组（313.20±25.13）个/高倍视野减少约82.6%,与PD的病理改变相符；在中脑DA神经递质检测方面,MPTP组小鼠DA含量较对照组显着减少（F=1655.877,P<0.001）,并呈进行性下降（F=433.320,P<0.001）,制模开始后30天,仍较对照组减少约81.3%,较好的模拟了PD的神经递质改变。以上结果表明,MPTP小剂量、多次皮下注射建立的C57BL/6j小鼠亚急性PD模型成功率高,死亡率低,在行为学、病理以及脑内神经递质改变等方面较好的模拟了PD的变化,是一种较为理想的PD动物模型,为本实验下一步进展提供了前提条件。第二部分小鼠SDF-1α基因真核表达质粒的构建及鉴定在本部分研究中,采用分子生物学技术,在构建SDF-1α目的基因引物后,应用PCR方法,在小鼠cDNA中成功提取了目的基因SDF-1α基因,在限制性性内切酶XhoI及EcoRI酶切以及连接酶作用下,将小鼠SDF-1α基因克隆至载体pDsRed2-N1的多克隆位点上,构建了新的质粒pDsRed2-N1-SDF-1α;经过限制性性内切酶XhoI及EcoRI酶切产物凝胶电泳及测序后,证实在载体质粒pDsRed2-N1的多克隆位点内,XhoI及EcoRI酶之间成功插入了小鼠SDF-1α基因,成功构建了小鼠真核表达质粒pDsRed2-N1 SDF-1α;将质粒pDsRed2-N1-SDF-1α在脂质体LP2000的辅助下转染至人肝癌SMMC7721细胞系,转染后12小时,在荧光显微镜下可见早表达红色荧光；培养24小时后,荧光显微镜下可见荧光表达逐渐增多；流式细胞仪检测转染后人肝癌细胞红色荧光蛋白表达率为：转染后3天（26.48±4.77）%,5天后为（40.00±4.97）%,较第3天转染率显着增高（t=-4.394,P=0.002）,同时在转染后第5天,荧光免疫细胞化学SDF-1α-FITC染色后,经流式细胞仪双标细胞计数检测,红、绿荧光蛋白共表达率为（28.40±1.30）%,其中共表达细胞占红色荧光蛋白表达细胞的71.0%；结果表明,质粒pDsRed2-N1-SDF1α能够转染真核细胞,并同时表达指示蛋白RFP及小鼠SDF1a因子,其共表达率为71%。在引入RFP的表达后,使目的因子SDF-1α的表达在观察中更加直观化,为进一步活体实验中目的因子表达的检测以及追踪提供了便利条件。第三部分SDF-1α诱导胎源干细胞在PD鼠模型脑内的迁移本章研究中,将此前构建质粒pDsRed2-1-SDF-lα在立体定向技术下局部注射至PD模型小鼠脑内右侧尾状核头部,并使之与GFP基因工程雄性小鼠交配,并受孕、分娩。通过观察模型小鼠行为学改变、检测SN区DA含量,以及荧光显微镜/共聚焦显微镜下观察GFP细胞的表达,并通过流式细胞仪检测血液中GFP细胞数量,Western blots检测不同组织中SDF-1α的表达来综合评价PD模型小鼠症状的改善。结果表明：两组模型小鼠随着制模时间的延长,部分运动症状均有所改善,但是两组中成功模型小鼠症状改善更为明显,但两组成功PD模型小鼠间症状无明显差异；两组成功模型PD小鼠DA含量（45.32±7.35）ng/g显着高于未成功模型PD小鼠（33.35±3.88）ng/g（F=28.386,P<0.001）,而且SDF-1α组提高更为显着（t=3.246,P=0.018）,但是,两组未成功PD小鼠间DA含量无显着差异（t=0.041,P=0.969）。两组成功模型PD小鼠血液中均可检测到GFP细胞的表达,但是SDF-1α组GFP细胞的表达量显着高于假手术组（t=18.155,P<0.001）,是假手术组的7倍。各组SDF-1α因子表达的检测结果可见,SDF-1α组针道附近脑组织中处于高表达状态,其次为其附近脑组织中,再次为在肝脏及血液的表达,而在假手术组脑组织中未见有明确表达；在GFP观察中可见,SDF-1α组经产小鼠嗅球内出现明显表达GFP的细胞,并且细胞形态已经出不具备了神经元样结构；同时在质粒pDsRed2-N1-SDF-1α移植局部脑组织中,可同时观察到RFP及GFP的表达,同时可以观察到GFP细胞在肝脏及脾脏血管及窦的壁上的表达；但是在假手术组却没有出现上述表现。同时在Y染色体特异表达基因Sry检测中可见,各组及部位之间交互效应显着（F=18.108,P=0.003）即不同分组间Sry基因含量有显着差异,SDF-1α组Sry基因含量显着高于假手术组（F=135.706,P<0.001）；SDF-1α组脑组织中Sry基因含量（16.36±1.98）%。显着高于同组肝脏组织（10.70±1.37）‰（t=4.076,P=0.015）；而在假手术组中,肝脏内Sry基因含量虽然高于同组脑组织,但是两者间无显着统计学差异（t=1.548,P=0.197）。结果表明：SDF-1α通过浓度的梯度改变,诱导了胎源干细胞向PD模型小鼠体内迁移,并PD模型小鼠起到了治疗作用。总之,胎源细胞能够在SDF-1α的诱导下向PD小鼠体内迁移,并能够通过血脑屏障迁移至小鼠脑内,并部分改善了PD小鼠的症状,提高了脑内DA的含量,达到治疗的目的。因此同时,SDF-1α是促使胎源细胞迁移的机制之一,而血液迁移是胎源细胞的主要移植途径。为进一步可迁移胎源细胞生物学特性的鉴定以及筛选提供前提条件,为胎源细胞以及SDF-1α的临床应用提供了实验依据。
王焕明[10]（2007）在《大鼠骨髓基质细胞源性神经干细胞诱导分化及自体移植治疗颞叶癫痫实验研究》文中进行了进一步梳理神经干细胞是指具有分化为神经元、星型胶质细胞、少突胶质细胞的能力，能自我更新并提供大量脑组织细胞的细胞。它主要存在于胚胎和成年中枢神经系统脑室周围的广泛区域，但最近的研究显示骨髓基质细胞在一定条件下能诱导分化成神经干细胞，从而为神经干细胞的应用提供了无限制的来源。骨髓基质细胞源性神经干细胞的开发和应用，既克服了从脑组织获取神经干细胞的危险性和局限性，也避免了胎儿组织移植中存在的伦理、免疫排斥、来源有限等问题，其在治疗中枢神经系统损伤和神经退行性疾病领域将会有广阔的应用前景。癫痫为神经系统常见病之一，其患病率占人群的5‰左右，国内统计约占全部居民的7‰。癫痫为一非特异性慢性脑疾病，它是由先天的或后天的不同原因导致的慢性脑功能失调所引起的一种临床症候群，其特征是由于大脑某些神经元突然过度高频放电所引起的具有各种临床（或实验室）表现的反复发作。颞叶癫痫为局灶性癫痫的主要类型之一，常有较特殊的嗅觉异常，意识障碍和醉梦状表现。其常见的病理学改变是海马硬化，即海马结构的一些区域神经元丢失和胶质增生。尽管前颞叶切除或选择性海马杏仁核切除可使部分颞叶癫痫病人得以痊愈，但手术本身有一定的危险性，可能会引起偏瘫、偏盲、记忆损害等，且对双侧颞叶的致痫灶不宜作双侧切除。因此，通过神经干细胞移植进行海马功能的修复重建实验研究，可以从一个新的角度来探索治疗、改善颞叶癫痫发作频率和程度的途径，具有潜在的临床意义。第一部分大鼠骨髓基质细胞体外诱导分化为神经干细胞实验研究一、目的探讨大鼠骨髓基质细胞在体外培养并诱导分化为神经干细胞的可行性，并确立骨髓基质细胞诱导分化为神经干细胞的适当培养方法及条件，为其在组织工程学研究和临床医学中的广泛应用奠定基础。二、材料与方法以SD大鼠为实验对象，无菌穿刺大鼠股骨骨髓腔抽取骨髓，梯度密度离心获得有核细胞，粘附法提取骨髓基质细胞。向提取的骨髓基质细胞悬液加入神经干细胞培养液，调整细胞浓度到106个／ml后，接种于多孔培养板中，再分别加胎牛血清（1％终浓度）、LIF（10ng／ml）及bFGF（10ng／ml）。在37℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养骨髓基质细胞，48h后换液以去除非黏附细胞，以后每周换液2次。原代培养一周后进行细胞传代培养，传代培养的细胞加入胎牛血清以及RA（0.5ug／ml），以诱导骨髓基质细胞向神经干细胞分化。然后在CK2型倒置光学显微镜下追踪观察培养的活细胞生长情况并拍照。采用SABC法进行免疫细胞化学检测，将不同阶段培养细胞经4％多聚甲醛固定，0.01MPBS冲洗，一抗37℃，孵育60min，生物素化二抗室温孵育10min，最后在链霉亲和素-生物素-过氧化酶复合物室温孵育10min，经DAB显色5～15 min，并在OLYMPUS光学显微镜下观察拍照。三、结果贴壁细胞培养48h后有分裂增殖，然后逐渐形成岛屿状细胞克隆团，给予适当的分化条件10～20d后，这些细胞能分化成具有细长突起、多种形态的细胞。经免疫细胞化学鉴定发现早期的培养细胞在没有给予诱导分化时可阳性表达Nestin，表明其具有神经干细胞的特性；培养细胞经诱导后有NeuN、NSE和GFAP阳性表达的细胞出现，且随着诱导时间的延长阳性表达的细胞逐渐增强，提示有分化为神经元样或神经胶质细胞样细胞的趋向。四、结论SD大鼠骨髓基质细胞在合适的体外培养条件下能够转化为神经干细胞，并保持增殖分化的能力。骨髓基质细胞源性神经干细胞能分化成具有神经系细胞特征的细胞，且能阳性表达NeuN、NSE和GFAP。第二部分大鼠骨髓源性神经干细胞自体移植治疗颞叶癫痫实验研究一、目的探讨骨髓源性神经干细胞自体移植至KA大鼠海马后与宿主细胞的整合及其对损伤宿主的修复作用，从而为神经干细胞移植治疗颞叶癫痫提供理论依据。二、材料与方法首先分离大鼠骨髓基质细胞，并在特定的条件下培养使其诱导分化为神经干细胞，使用Feridex对干细胞进行标记。将60只雄性SD大鼠随机分为三组：对照组、移植组及未移植组，每组20只。然后建立大鼠颞叶癫痫模型，将Feridex标记的神经干细胞自体移植到癫痫模型鼠的右侧海马CA3区，对KA未移植和对照组大鼠在相同的靶点注入等量的生理盐水。观察移植后1周、2周、4周、8周和16周大鼠海马的脑电图、MRI和病理学改变情况。三、结果KA注射大鼠均出现典型癫痫发作症状，且经过一段静止时间后大鼠均再次出现反复的自发性癫痫发作，发作类似杏仁核点燃；与KA未移植组相比，移植组大鼠海马脑电图的波幅明显降低，至移植8周后最高降低达40％以上；MRI检查发现在神经干细胞移植后1周和2周时低信号改变区比较局限，但移植4周、8周和16周后低信号改变明显增大，且随着时间的推移低信号改变区逐渐增大；病理学检查显示，KA移植组的CA3区锥体细胞数与未移植组和对照组相比较有统计学差异（P＜0.01）；在移植组内，各时间段之间相比也有统计学差异（P＜0.01），至移植后8周时细胞数最大，此后又开始下降；在KA未移植组，随着时间的推移，CA3区锥体细胞计数则呈现明显下降趋势；KA移植组海马损伤侧的Timm染色与未移植组和对照组相比有统计学差异（P＜0.01）；在移植组内，各时间段相比也有统计学差异（P＜0.01），至移植后第8周时Timm染色记分最小，但此后又开始增加；电镜超微结构检查显示移植组海马CA3区锥体神经元核仁明显，胞质内可见较多的脂褐素，线粒体肿胀，突触小泡数量较少。而未移植组海马CA3区锥体神经元游离核蛋白体减少，突触膜融合，突触小泡明显增多。四、结论骨髓源性神经干细胞自体移植至KA大鼠海马后对癫痫鼠的癫痫发作有一定的抑制作用，且能与宿主细胞进行整合，并对宿主海马具有显着的修复作用，但其具体的作用机理尚待进一步研究。
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写词 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 帕金森病概述 |
| 1.1.1 PD的临床和病理特征 |
| 1.1.2 PD的病因 |
| 1.1.3 PD的治疗策略 |
| 1.1.4 PD的致病机制 |
| 1.1.5 PD的氧化应激促进儿茶酚异喹啉类神经毒素的生成假说 |
| 1.2 Sal的合成与功能 |
| 1.2.1 Sal的来源和合成 |
| 1.2.2 Sal的生物学功能 |
| 1.2.3 Sal的两面性 |
| 1.3 Sal合成酶的研究进展 |
| 1.3.1 Sal合成酶的发现 |
| 1.3.2 Sal合成酶的研究现状 |
| 1.4 本课题的研究内容及意义 |
| 1.4.1 研究内容 |
| 1.4.2 研究意义 |
| 第2章 PD模型中Sal合成酶活性及其产物含量的检测 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验动物和细胞 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.2.3 实验试剂与材料 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 药品和试剂的配制 |
| 2.3.2 细胞培养 |
| 2.3.3 细胞存活率的检测 |
| 2.3.4 大鼠脑立体定位手术 |
| 2.3.5 阿扑吗啡诱导的旋转行为检测 |
| 2.3.6 鼠脑冰冻切片的制备 |
| 2.3.7 黑质区酪氨酸羟化酶的免疫组织化学实验 |
| 2.3.8 HPLC-MS/MS法检测PD模型中Sal的含量 |
| 2.3.9 PD模型中Sal合成酶活性检测 |
| 2.3.10 数据统计说明 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 PD模型的构建 |
| 2.4.2 PD模型中Sal合成酶活性的检测 |
| 2.4.3 PD模型中Sal含量的检测 |
| 2.5 本章小结 |
| 第3章 Sal合成酶对多巴胺能神经细胞的影响 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 实验细胞和动物 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.2.3 实验试剂和材料 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 药品和试剂的配制 |
| 3.3.2 细胞培养 |
| 3.3.3 Sal合成酶重组质粒的构建 |
| 3.3.4 细胞转染 |
| 3.3.5 HPLC-MS/MS法检测Sal的含量和Sal合成酶的活性 |
| 3.3.6 流式法检测细胞凋亡 |
| 3.3.7 流式法检测线粒体膜电位变化 |
| 3.3.8 蛋白的提取和浓度测定 |
| 3.3.9 免疫印迹 |
| 3.3.10 Sal合成酶转基因小鼠的繁殖与基因型鉴定 |
| 3.3.11 Sal合成酶转基因小鼠的行为学测定 |
| 3.3.12 Sal合成酶转基因小鼠脑冰冻切片的制备 |
| 3.3.13 Sal合成酶转基因小鼠黑质致密部免疫组化 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 Sal合成酶载体的构建 |
| 3.4.2 Sal合成酶的胞内定位 |
| 3.4.3 Sal合成酶过表达后细胞内Sal合成酶的活性变化 |
| 3.4.4 Sal合成酶代谢产物Sal和 NM-Sal的生成情况 |
| 3.4.5 Sal合成酶对细胞凋亡的影响 |
| 3.4.6 Sal合成酶对线粒体的损伤情况 |
| 3.4.7 Sal合成酶产物对细胞凋亡的影响 |
| 3.4.8 Sal合成酶转基因小鼠的基因型鉴定 |
| 3.4.9 Sal合成酶转基因小鼠的行为学检测 |
| 3.4.10 Sal合成酶转基因小鼠的TH染色结果 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 Sal诱导的转录组学变化分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 细胞培养和药物处理 |
| 4.3.2 Trizol法提取总RNA |
| 4.3.3 mRNA的提取 |
| 4.3.4 转录组测序技术 |
| 4.3.5 转录组测序质量控制和数据分析 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 RNA和测序文库质量控制 |
| 4.4.2 表达差异基因筛选结果 |
| 4.4.3 差异表达基因的GO分析 |
| 4.4.4 差异基因的KEGG富集结果 |
| 4.5 本章小结 |
| 第5章 Sal诱导多巴胺能神经细胞凋亡的分子机制 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 实验细胞 |
| 5.2.2 实验仪器 |
| 5.2.3 实验试剂与材料 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 RNA的提取 |
| 5.3.2 RNA的反转录 |
| 5.3.3 定量PCR实验 |
| 5.3.4 点杂交(Dot Blot)实验 |
| 5.3.5 钙离子浓度检测 |
| 5.4 实验结果与讨论 |
| 5.4.1 Sal诱导后PC12细胞的形态变化 |
| 5.4.2 Sal对细胞内Akt/mTOR信号通路的影响 |
| 5.4.3 Sal对自噬的影响 |
| 5.4.4 Sal对细胞内Ca~(2+)浓度和NMDAR1 表达的影响 |
| 5.4.5 Sal对细胞内m6A的含量和去甲基化酶FTO表达的影响 |
| 5.4.6 Sal的相对保护作用 |
| 5.5 本章小结 |
| 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间所发表的学术论文 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 中英文缩略词 |
| 第一部分 LncRNAs调节hiPSCs向多巴胺能神经元的诱导分化和干细胞移植治疗帕金森大鼠模型的研究 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 hiPSCs向多巴胺能神经元诱导分化中lncRNAs的差异表达及lncRNA MIAT的调节作用 |
| 前言 |
| 第一节 hiPSCs向多巴胺能神经元诱导分化体系的建立 |
| 材料和方法 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 统计方法 |
| 结果 |
| 1. hiPSCs的细胞培养与多能性鉴定 |
| 2. hiPSCs向DA能神经元诱导分化过程和细胞形态 |
| 3. hiPSCs向DA能神经元诱导分化过程中相关基因表达 |
| 4. hiPSCs向DA能神经元诱导分化过程中相关标志物的免疫荧光染色 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二节 hiPSCs向多巴胺能神经元诱导分化过程中lncRNAs的表达变化和功能分析 |
| 材料和方法 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 统计方法 |
| 结果 |
| 1. 测序样本总RNA的质量检测 |
| 2. LncRNAs测序数据质量评估 |
| 3. 比对分析结果 |
| 4. 表达量分析结果 |
| 5. 差异基因表达与验证 |
| 6. 差异基因聚类 |
| 7. 差异表达mRNAs的富集分析结果 |
| 8. LncRNAs co-expression靶基因预测与功能分析 |
| 9. LncRNAs co-location靶基因预测与功能分析 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三节 LncRNA MIAT调节hiPSCs的神经分化 |
| 材料和方法 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 统计方法 |
| 结果 |
| 1. LncRNA MIAT与共表达靶基因KEGG通路分析与验证 |
| 2. 成功构建转录激活过表达lncRNA MIAT的hiPSCs细胞系 |
| 3. 过表达lncRNA MIAT对hiPSCs多能性的影响 |
| 4. 过表达lncRNA MIAT对hiPSCs向DA能神经元诱导分化的影响 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二章 6-OHDA大鼠帕金森模型的建立和不同脑区的转录组分析 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 统计方法 |
| 结果 |
| 1. 6-OHDA大鼠PD模型的损伤程度 |
| 2. 测序样本总RNAs的质量检测 |
| 3. mRNAs测序数据质量评估 |
| 4. 比对分析结果 |
| 5. 5个脑区的表达量分析结果 |
| 6. 5个脑区的差异表达基因(DEGs)与验证 |
| 7. 5个脑区的差异基因聚类分析与韦恩分析 |
| 8. 5个脑区的差异基因富集分析 |
| 9. 5个脑区的PPI分析与验证 |
| 10. KEGG分析关键信号通路的验证 |
| 11. 6-OHDA大鼠PD模型5个脑区的线粒体超微结构改变 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 干细胞移植治疗6-OHDA大鼠帕金森模型的效果评价 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 统计方法 |
| 结果 |
| 1. 干细胞鉴定 |
| 2. APO诱导旋转测试不同类型干细胞移植治疗的行为学效果评价 |
| 3. 旷场试验和抓力测试 |
| 4. 移植细胞在脑内的存活、迁移、增殖和分化 |
| 5. 细胞移植后星形胶质细胞的表达 |
| 6. 细胞移植后超微结构改变 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 第二部分 PTRF转基因小鼠中造血干细胞的功能受损 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 统计方法 |
| 结果 |
| 1. PTRF的表达随年龄增长而增加并促进髓系分化 |
| 2. PTRF过表达耗损HSCs |
| 3. PTRF过表达损伤HSCs的功能 |
| 4. PTRF诱导HSCs衰老 |
| 5. PTRF通过Cav-1激活了HSCs的衰老通路 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 长链非编码RNA在神经发育和帕金森病中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附件1 hiPSCs质检报告(赛贝公司) |
| 附件2 表5-1 iPSCd0组与iPSCd7组转录本水平差异显着的lncRNAs |
| 附件3 表5-2 iPSCd0组与iPSCd7组基因水平差异显着的mRNAs |
| 附件4 表5-3模型组与对照组在OB区排名前10的DEGs(含上调和下调) |
| 附件5 表5-4模型组与对照组在SVZ区排名前10的DEGs(含上调和下调) |
| 附件6 表5-5模型组与对照组在Str区排名前10的DEGs(含上调和下调) |
| 附件7 表5-6模型组与对照组在SN区排名前10的DEGs(含上调和下调) |
| 附件8 表5-7模型组与对照组在Hippo区排名前10的DEGs(含上调和下调) |
| 个人简介 |
| 致谢 |
| 主要英文缩写词表 |
| 摘要 |
| abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 研究目的 |
| 1.3 研究意义 |
| 2 文献综述 |
| 2.1 阿尔兹海默病 |
| 2.1.1 阿尔兹海默病概述 |
| 2.1.2 阿尔兹海默病与β-淀粉样蛋白聚集 |
| 2.1.3 β-淀粉样蛋白领域研究基础、热点与前沿分析 |
| 2.2 帕金森病 |
| 2.2.1 帕金森病概述 |
| 2.2.2 帕金森病与α-突触核蛋白聚集 |
| 2.2.3 α-突触核蛋白研究基础、热点与前沿分析 |
| 2.3 儿茶酚胺与蛋白聚集 |
| 2.3.1 儿茶酚胺与β-淀粉样蛋白聚集 |
| 2.3.2 儿茶酚胺与α-突触核蛋白聚集 |
| 2.4 运动与儿茶酚胺 |
| 2.4.1 运动对于人体血浆儿茶酚胺的影响 |
| 2.4.1.1 急性运动对于人体血浆儿茶酚胺的影响 |
| 2.4.1.2 长期训练对于人体血浆儿茶酚胺的影响 |
| 2.4.2 运动对于大鼠脑内儿茶酚胺的影响 |
| 参考文献 |
| 3 研究方案 |
| 4 研究方法 |
| 4.1 文献分析法 |
| 4.2 分子动力学方法 |
| 4.2.1 常规分子动力学模拟 |
| 4.2.2 副本交换分子动力学模拟 |
| 4.2.3 常用软件 |
| 4.2.4 分子力场 |
| 4.2.4.1 分子力学 |
| 4.2.4.2 常用的分子力场 |
| 4.2.4.3 分子力场的相互作用项 |
| 4.2.4.4 小分子力场构建 |
| 4.2.5 参数设置 |
| 4.2.5.1 常规分子动力学模拟 |
| 4.2.5.2 副本交换分子动力学模拟 |
| 4.2.6 分析方法 |
| 参考文献 |
| 5 研究内容 |
| 5.1 去甲肾上腺素抑制阿尔兹海默病β-淀粉样蛋白聚集、破坏β-淀粉样蛋白类纤维的分子机制研究 |
| 5.1.1 前言 |
| 5.1.2 材料和方法 |
| 5.1.3 结果和讨论 |
| 5.1.4 结论 |
| 5.2 α-突触核蛋白希腊钥匙状核心区域关键成核及多巴胺和去甲肾上腺素破坏聚集的研究 |
| 5.2.1 前言 |
| 5.2.2 材料和方法 |
| 5.2.3 结果和讨论 |
| 5.2.4 结论 |
| 5.3 不同浓度儿茶酚胺影响β-淀粉样蛋白聚集的分子机制研究 |
| 5.3.1 前言 |
| 5.3.2 材料和方法 |
| 5.3.3 结果与讨论 |
| 5.3.4 结论 |
| 5.4 不同浓度儿茶酚胺影响α-突触核蛋白NACore聚集的分子机制研究 |
| 5.4.1 前言 |
| 5.4.2 材料和方法 |
| 5.4.3 结果与讨论 |
| 5.4.4 结论 |
| 参考文献 |
| 6 总结和展望 |
| 6.1 总结 |
| 6.2 展望 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
| 攻读学位期间科研成果 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 第一部分 综述 |
| 综述一 帕金森病的现代研究进展 |
| 1 帕金森病的发病机制 |
| 2 帕金森病的临床表现及诊断 |
| 3 帕金森病的动物模型 |
| 4 帕金森病的治疗研究 |
| 5 参考文献 |
| 综述二 JNK信号通路与帕金森病相关性研究 |
| 1 JNK信号通路的概述 |
| 2 JNK信号通路在神经炎症中的作用机制 |
| 3 JNK信号通路在细胞凋亡中的作用机制 |
| 4 JNK信号通路与帕金森病 |
| 5 JNK抑制剂在治疗帕金森病中的积极作用 |
| 6 参考文献 |
| 第二部分 实验部分 |
| 前言 |
| 技术路线图 |
| 实验一 基于JNK信号通路探讨针刀干预对帕金森病大鼠黑质神经炎症的影响 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验二 基于JNK信号通路探讨针刀对帕金森病模型大鼠黑质TH神经元及DAT基因表达的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验三 基于JNK信号通路探讨针刀对帕金森病模型大鼠黑质神经细胞凋亡及相关因子的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验总结 |
| 不足与展望 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 多巴胺的研究进展 |
| 1 DA的来源和研究历史 |
| 2 DA与疾病 |
| 3 生物样品中DA的检测方法 |
| 第二章 DA相关合成限速酶的研究进展 |
| 1 DA合成酶的相关研究 |
| 2 DA合成酶的检测方法 |
| 参考文献 |
| 第二部分 研究论文 |
| 第一章 BMSCs移植对PD模型大鼠脑纹状体内DA含量变化的研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第二章 BMSCs移植对PD模型大鼠脑纹状体内AADC表达影响的研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文小结 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 1.1 现代医学对帕金森病的研究进展 |
| 1.1.1 帕金森病的流行病学资料 |
| 1.1.2 帕金森病的病因及发病机制 |
| 1.1.3 帕金森病的诊断 |
| 1.1.4 帕金森病的治疗 |
| 1.2 中医药治疗帕金森病的研究进展 |
| 1.2.1 各医家对PD病因病机的认识观点 |
| 1.2.2 中药治疗PD的治则治法 |
| 1.3 帕金森病模型的研究现状 |
| 1.3.1 体外模型 |
| 1.3.2 动物模型 |
| 第二章 实验研究 |
| 2.1 实验一 6-OHDA诱导帕金森病模型大鼠纹状体区神经递质含量的动态变化 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.1.3 统计方法 |
| 2.1.4 实验结果 |
| 2.1.5 讨论 |
| 2.2 实验二 6-OHDA诱导帕金森病模型大鼠中脑组织Nrf2、HO-1的动态变化 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.2.3 统计方法 |
| 2.2.4 实验结果 |
| 2.2.5 讨论 |
| 2.3 实验三 帕病2号方不同剂量对帕金森病模型大鼠左侧中脑组织Nrf2、HO-1表达及纹状体神经递质含量的影响 |
| 2.3.1 实验材料 |
| 2.3.2 实验方法 |
| 2.3.3 统计方法 |
| 2.3.4 实验结果 |
| 2.3.5 讨论 |
| 2.4 实验四 帕病2号方对帕金森病模型大鼠黑质多巴胺能神经元形态学的影响 |
| 2.4.1 实验材料 |
| 2.4.2 实验方法 |
| 2.4.3 统计方法 |
| 2.4.4 实验结果 |
| 2.4.5 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 详细摘要 |
| 中英文缩写一览表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要仪器设备 |
| 1.3 主要试剂 |
| 2. 方法 |
| 2.1 神经干细胞的原代培养 |
| 2.2 神经干细胞的传代培养 |
| 2.3 神经干细胞的巢蛋白(Nestin)鉴定 |
| 2.4 大鼠胚胎mNSCs的体外诱导分化 |
| 2.5 大鼠PD模型的建立 |
| 2.6 实验动物分组 |
| 2.7 NSCs移植治疗PD大鼠模型 |
| 2.8 AMD3100注射 |
| 2.9 行为学检测 |
| 2.10 RT-PCR及weston Blod脑组织的取材 |
| 2.11 实时荧光定量PCR |
| 2.12 Western Blot测定SDF-1/CXCR4蛋白水平 |
| 2.13 统计方法 |
| 结果 |
| 1 大鼠胚胎mNSCs的分离培养 |
| 2 神经干细胞的传代培养 |
| 3 神经干细胞Nestin免疫荧光标记 |
| 4 神经干细胞的诱导分化 |
| 5 体外培养的大鼠胚胎中脑神经干细胞分化后多巴胺神经元的鉴定 |
| 6 帕金森病大鼠模型的行为学特征 |
| 7 神经干细胞移植前后PD大鼠旋转行为检测结果 |
| 8 大鼠脑组织总RNA提取 |
| 9 检测cDNA完整性 |
| 10 荧光定量PCR结果 |
| 11 Western-Blot结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 硕士期间发表文章 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 基本材料和方法 |
| 第一章 帕金森病小鼠的建立及评价 |
| 第二章 小鼠SDF-1α基因真核表达质粒的构建及鉴定 |
| 第三章 SDF-1α诱导胎源干细胞在PD鼠模型脑内的迁移 |
| 全文总结 |
| 缩略词对照表 |
| 综述(一) |
| 参考文献 |
| 综述(二) |
| 参考文献 |
| 在学期间已发论文 |
| 致谢 |
| 统计学证明 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一部分 大鼠骨髓基质细胞体外诱导分化为神经干细胞实验研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 大鼠骨髓源性神经干细胞自体移植治疗颞叶癫痫实验研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 全文小结 |
| 文献综述一 中枢神经系统的细胞移植 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 神经干细胞与颞叶癫痫 |
| 参考文献 |
| 中英文名词缩写与对照 |
| 学习期间发表论文及参与编写专着 |
| 致谢 |
