HLA-G突变分子对NK细胞抑制作用的研究

一、HLA-G突变分子对NK细胞抑制作用的研究（论文文献综述）

孙琳^[1]（2021）在《1型糖尿病患者免疫细胞表面SLAMF分子异常表达与机制研究》文中研究指明研究目的:1型糖尿病（type 1 diabetes mellitus,T1DM）是一种由遗传因素和环境因素共同诱导,细胞免疫及体液免疫共同介导胰岛β细胞损伤的自身免疫性疾病,在儿童和青少年中更为常见。近年来,流行病学研究表明,我国T1DM发病率明显增加,而患者进行性的胰岛功能下降导致其需要终身应用胰岛素治疗,鉴于其逐年增长的发病率和随之出现的多系统并发症,T1DM已成为重大的公共卫生挑战。目前,T1DM的发病机制尚未完全明确,T细胞相关的研究一直是1型糖尿病的研究热点,而近年来除了CD4+T细胞,越来越多的研究表明CD8+T细胞在1型糖尿病的发病进程中有着重要作用。淋巴细胞活化信号分子家族（signaling lymphocyte activated molecular family,SLAMF）被报道在多种免疫异常疾病中表达异常,并显着影响包括CD8+T细胞在内的免疫细胞分化及功能。然而对T1DM免疫细胞表面SLAMF分子的表达情况未被报道,且对于T1DM中SLAMF分子如何通过影响CD8+T细胞功能仍不明确。为探讨这一问题,本课题通过对T1DM患者及非肥胖的糖尿病小鼠模型（non-obese diabetic,NOD）免疫细胞分化情况及SLAMF分子表达情况进行分析,并进行mRNA测序及相关的体外细胞实验,以期探讨T1DM免疫系统异常分化及SLAMF分子表达对T1DM免疫微环境下CD8+T细胞功能和命运的影响。研究方法:（1）对T1DM患者及健康对照组（health control,HC）的一般临床资料进行统计,利用流式细胞分析法对外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC）中T细胞及其亚群、NK细胞及其亚群、B细胞等免疫细胞比例进行分析,并检测T细胞、B细胞和NK细胞表面SLAM分子家族的表达情况;（2）利用流式细胞分析法对T1DM患者外周血中T细胞SLAMF4分子表达及促炎性细胞因子IFN-γ和TNF-a的分泌情况进行检测,分析SLAMF4分子与细胞活化状态和细胞因子分泌能力之间的相关性;分析SLAMF4分子表达与1型糖尿病一般临床资料的相关性;（3）对自发性1型糖尿病小鼠模型NOD小鼠进行体重、随机血糖监测及小鼠尾静脉采血,对小鼠胰腺组织留取病理,进行苏木精-伊红（hematoxylin-eosi,HE）染色,观察其组织细胞形态、炎细胞浸润情况;用流式细胞分析法检测小鼠外周血免疫细胞分化及外周血、胰腺引流淋巴结CD8+T细胞表面SLAMF4分子表达情况;（4）采用流式细胞分选技术得到纯化的T1DM患者的SLAMF4+CD8+T细胞和SLAMF4-CD8+T细胞,并进行mRNA转录组测序,分析差异表达基因的分布及临床意义;（5）应用免疫磁珠分选技术分选脐带血细胞中CD8+T细胞,在体外给予抗CD3/CD28单克隆抗体刺激下进行培养,检测作用不同时间CD8+T细胞表面SLAMF4分子表达情况;（6）采用磁珠分选联合流式细胞分选技术正常健康人SLAMF4阳性CD8 T细胞和SLAMF4阴性CD 8 T细胞分别进行分选,在体外给予抗CD3/CD28单克隆抗体的刺激下进行体外扩增,用CFSE标记细胞,检测细胞增殖情况,并于Day6检测两种细胞的凋亡情况。研究结果:（1）T1DM患者外周血PBMC中免疫细胞比例与HCs比较存在异常,表现为CD4+T细胞和B细胞比例增多,Treg细胞的比例降低,总NK细胞及其CD56dim亚群的NK细胞比例减低,CD56bright亚群的NK细胞比例升高。与HCs相比,T1DM患者外周血PBMC中SLAMF4阳性的总T细胞百分比降低,且SLAMF4阳性的CD8+T细胞明显降低;SLAMF3分子表达在B淋巴细胞比例有所降低,SLAMF5在NK细胞表面表达升高,差异均有统计学意义。（2）T1DM患者T细胞表面SLAMF4分子表达与细胞活化的状态有关,且与SLAMF4阴性CD8+T细胞相比,SLAMF4阳性CD8+T细胞具备更强的分泌促炎因子IFN-γ和TNF-a的能力;在与T1DM相关的一般临床指标的分析中,发现SLAMF4阳性CD8+T细胞百分比与糖化血红蛋白水平及T1DM病程呈负相关。（3）与同周龄的Balb/c小鼠相比,NOD小鼠CD4+T细胞及CD4+CD25+的调节性T细胞百分比明显降低,随着NOD小鼠1型糖尿病的发生发展,SLAMF4阳性CD8+T细胞百分比逐渐下降,且明显低于对照Balb/c小鼠。（4）mRNA转录组测序结果表明,1型糖尿病中SLAMF4作用后的CD8+T细胞表现出多个信号通路的异常改变,包括T细胞受体信号相关的信号通路、细胞因子分泌及细胞凋亡通路,差异表达的基因中也有多个与凋亡相关的基因,说明SLAFM4在1型糖尿病中调控CD8+T细胞的活性与命运。（5）通过体外培养人脐带血CD8+T淋巴细胞发现,一定程度的抗原刺激可促进SLAMF4在脐带血na?ve CD8+T细胞表面上调表达,随着免疫活化的时间延长,SLAMF4阳性CD8+T细胞百分比逐渐下调。（6）通过SLAMF4阳性CD8+T细胞和SLAMF4阴性CD8+T细胞经CFSE标记后体外培养,发现SLAMF4阴性CD8+T细胞对抗CD3/CD28单克隆抗体的TCR刺激更敏感、更易扩增,增殖能力强,而SLAMF4阳性CD8+T细胞更容易凋亡。研究结论:（1）T1DM患者外周血PBMC中免疫细胞分化比例与HCs相比存在异常,且外周血T细胞及B细胞表面多种SLAM分子表达水平发生变化,结合课题组前期结果,这在T1DM及T2DM之间存在一定共性和不同之处。（2）与HCs相比,T1DM患者SLAMF4阳性CD8 T细胞百分比显着下降,且SLAMF4分子表达与细胞活化的状态及促炎性细胞因子IFN-γ和TNF-a的分泌有关。在T1DM患者中,SLAMF4+CD8+T细胞百分比与患者的糖化血红蛋白水平和1型糖尿病病程呈负相关。（3）在动物模型中我们发现NOD小鼠也存在外周血T细胞异常分化状态。且随着NOD小鼠1型糖尿病的发生发展,SLAMF4阳性CD8+T百分比逐渐下降,明显低于对照Balb/c小鼠。（4）SLAMF4分子表达与1型糖尿病患者CD8+T细胞功能调控及凋亡显着相关,SLAMF4阳性的CD8+T细胞增殖能力较差且更容易凋亡,故体内持续抗原刺激会导致表达SLAMF4的CD8+T细胞的百分比降低,使其发挥类似调定点作用。综上所述,本课题首次分析了T1DM疾病模型中的SLAMF分子家族的表达谱,为SLAMF分子与T1DM免疫细胞的调控提供了实验证据,证实了在1型糖尿病免疫微环境中SLAMF4表达对CD8+T细胞的功能影响和命运的调控及SLAMF4阳性CD8+T细胞比例变化的具体机制,提示SLAMF4分子可能为T1DM的早期诊断,临床分期或免疫干预提供新靶点。

宫文静^[2]（2021）在《ILT4调控非小细胞肺癌血管生成的作用和机制研究》文中研究说明研究背景在所有恶性肿瘤中,肺癌的发病率和死亡率均位居首位。非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）是肺癌最主要的类型,占全部肺癌的80-85%。NSCLC起病隐匿,多数患者就诊时已处于疾病中晚期。近年来随着手术、化疗、放疗、靶向治疗及免疫治疗等多种治疗手段的发展,NSCLC的预后有了很大改善,但其整体5年生存率仍仅有20%,而复发和转移是NSCLC治疗失败的最主要因素。众所周知,肿瘤的生长和转移依赖新生血管的形成来提供能量及转移路径,因此抗血管生成治疗成为NSCLC整体治疗重要组成部分。目前临床中抗肿瘤血管生成的治疗策略主要包括:针对VEGF/VEGFR通路的大分子单克隆抗体、多靶点小分子酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitor,TKI）类药物和血管内皮抑制素等。但由于肿瘤微环境中促血管生成旁路信号的激活、抗体结合力降低等原因,导致现有的抗血管生成药物的临床获益普遍较为短暂;此外,多靶点抗血管生成药物因其作用机制复杂,毒性反应较重,也在某种程度上限制了其临床应用。因此,探索NSCLC血管生成的分子机制,寻找新的有效治疗靶点,开发更具特异性的高效低毒的抗血管生成药物,是克服肿瘤血行转移、提高临床获益的重要研究方向,对提高NSCLC的治疗水平、改善患者预后具有重要意义。免疫球蛋白样转录子（immunoglobulin-like transcripts,ILTs）,也被称为白细胞免疫球蛋白样受体（leukocyte immunoglobulin-like receptors,LIR or LILR）,或单核细胞/巨噬细胞免疫球蛋白样受体（monocyte/macrophage immunoglobulin-like receptors,MIR）。根据胞内基序的作用不同分别将ILTs（LILRs）分为激活性受体LILRA（白细胞免疫球蛋白样受体亚型A,leucocyte immunoglobulin-like receptor subfamily A）和抑制性受体 LILRB（白细胞免疫球蛋白样受体亚型 B,leucocyte immunoglobulin-like receptor subfamily B）。激活性受体LILRA包括LILRA1-LILRA6这6种受体;而抑制性受体LILRB包括LILRB1-5这5种受体。ILT4又被称为LILRB2、LIR2,单核细胞/巨噬细胞免疫球蛋白样受体10（monocyte/macrophage immunoglobulin-like 10,MIR-10）或 CD85d,是经典的免疫抑制性受体。作为I型跨膜蛋白,ILT4与不同的配体结合,通过胞内3个酪氨酸激酶抑制基序（immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motifs,ITIMs）传递抑制信号至胞内。ILT4起初发现主要表达于髓系细胞包括树突状细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和血小板。最近研究显示它也表达于活化的CD4+T细胞中。ILT4通过抑制树突状细胞的成熟和抗原提呈、诱导巨噬细胞和髓源性抑制细胞（myeloid-derived suppressor cells,MDSCs）M2 样极化、抑制中性粒细胞的吞噬功能、促进CD4+Th2分化等方式,诱导免疫抑制的微环境。除免疫细胞外,近年来研究发现ILT4在乳腺癌、结直肠癌、子宫内膜癌、原发性肝癌和非小细胞肺癌等多种恶性肿瘤细胞也高表达,通过多种机制促进肿瘤细胞的增殖和侵袭,诱导M2样肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）募集及T细胞老化和免疫浸润。课题组前期通过基因芯片发现ILT4可以上调血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A,VEGF-A）和基质金属蛋白酶 9（matrix metalloproteinase 9,MMP9）这两种促血管生成因子的表达。VEGF-A是血管内皮细胞强有力的促细胞分裂剂,是调控血管生成的经典因子;MMP9也被证实能够促进血管基底膜的分解,诱导内皮细胞迁移,促进新生血管形成。因此我们推测ILT4可能与调控肿瘤新生血管密切相关。由于目前国内外针对ILT4在肿瘤新生血管形成方面的研究尚属空白,考虑到目前NSCLC抗血管生成治疗的局限性,以及我们课题组前期基因芯片的发现,本研究拟从组织水平、细胞水平以及大数据分析进行一系列研究检测ILT4对NSCLC血管生成的作用,并通过体外和体内干预性研究对可能的分子机制进行进一步的探索。该研究结果可能会为ILT4在NSCLC抗血管生成方面的研究带来新的突破。研究目的1.通过免疫组化、qPCR和Western blot检测NSCLC组织和细胞株中ILT4的表达,结合生存随访和GEO（Gene Expression Omnibus）数据库的生存信息,明确ILT4在NSCLC中的表达及预后意义;2.通过检测NSCLC组织中微血管密度（microvascular density,MVD）以及体外研究通过上调和沉默ILT4表达检测ILT4对血管内皮细胞迁移和小管生成的影响,结合数据库分析,明确ILT4对血管生成的作用;3.通过转染过表达、敲低ILT4,检测ILT4调控的促血管生成因子的变化、信号通路蛋白的变化及应用相应的促血管生成因子中和抗体、信号通路抑制剂进行干预,探究ILT4调控血管生成的分子机制;4.利用ILT4过表达/敲除肺癌细胞系建立裸鼠体内移植瘤模型,进一步体内验证ILT4对血管生成的影响及可能的分子机制。研究方法1.通过qPCR和Western blot方法检测NSCLC细胞和正常支气管上皮细胞中ILT4表达,明确ILT4在NSCLC细胞和正常支气管上皮细胞表达的差异,并筛选出内源性低表达ILT4的细胞系H1650、A549和内源性高表达ILT4的细胞系H1299、H1975。2.通过免疫组织化学方法检测ILT4在NSCLC组织和癌旁组织表达的差异,分析ILT4的表达与NSCLC临床病理指标的相关性;随访病人的生存状况,应用Kaplan-Meier法绘制生存曲线,分析ILT4对NSCLC患者总生存的影响;同时结合Kaplan-Meier Plotter在线生存分析系统,分析ILT4表达对肺癌患者预后的影响。3.应用免疫组化的方法检测NSCLC组织中ILT4表达与肿瘤微血管密度相关蛋白的表达情况,同时结合 GEPIA（gene expression profiling interactive analysis）数据库,统计分析ILT4与微血管密度的相关性,ILT4/CD34共表达与临床病理参数的相关性。4.采用转染技术,将携带ILT4过表达载体的慢病毒转染内源性ILT4低表达的H1650、A549细胞株,上调H1650、A549细胞中的ILT4的表达,空载体作为对照;将携带ILT4短发夹RNA（short hairpin RNA,shRNA）慢病毒转染内源性ILT4过表达的H1975、H1299细胞株,以下调ILT4的表达,空载体作为对照。收集该细胞培养基作为条件培养基,用于培养人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelia cells,HUVECs）。应用 qPCR 和 Western blot实验方法验证转染效果。采用Transwell细胞迁移实验和HUVECs小管形成实验检测ILT4过表达及敲除对血管内皮细胞迁移能力和小管形成能力的影响。5.通过基因芯片技术发现ILT4上调后可引起促血管生成因子VEGF-A和MMP9表达的上调。细胞水平上,通过转染技术上调和下调NSCLC细胞ILT4的表达,利用qPCR和Western blot技术验证ILT4对VEGF-A和MMP9表达的调节作用;组织水平上,通过将NSCLC组织连续切片应用免疫组化验证ILT4与VEGF-A、MMP9在组织中表达的相关性。6.采用转染技术,将内源性低表达ILT4的细胞系H1650和A549过表达ILT4,采用VEGF-A中和抗体或MMP9中和抗体进行干预,收集条件培养基,应用Transwell细胞迁移实验和HUVECs小管形成实验观察条件培养基对血管内皮细胞迁移能力和成管能力的影响。7.结合基因微阵列筛选出ILT4调控的信号通路,采用转染技术过表达和沉默NSCLC细胞ILT4的表达,利用Western blot技术检测ILT4对促分裂素原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）信号通路中关键蛋白及其磷酸化水平的影响,包括pERK、ERK、pp38、p38、pJNK和JNK。8.将内源性低表达ILT4的细胞系H1650和A549过表达ILT4后,加入ERK抑制剂、p38抑制剂进行干预,分别阻断ERK信号通路,p38信号通路,应用Western blot方法检测通路抑制后VEGF-A和MMP9的表达情况,采用Transwell细胞迁移实验和小管形成实验观察ERK信号通路在ILT4调控血管生成方面的作用。9.通过慢病毒感染建立稳定ILT4过表达的NSCLC细胞株A549 LV-ILT4和对照组细胞株A549 LV-NC;建立稳定干扰ILT4的NSCLC细胞株H1299 LV-shILT4和对照组细胞株H1299 LV-shNC,选择BALB/c Nude裸鼠皮下注射上述细胞,体内实验观察ILT4对NSCLC细胞体内成瘤能力的影响;利用免疫组化的方法检测移植瘤组织中微血管密度,同时检测促血管生成因子VEGF-A、MMP9和信号通路ERK和pERK蛋白表达,进一步验证ILT4对血管生成能力的影响。研究结果1.ILT4在NSCLC细胞系和NSCLC肿瘤组织中高表达qPCR和Western blot检测显示ILT4在NSCLC细胞中的表达高于正常支气管上皮细胞。内源性低表达ILT4的细胞系为H1650和A549,内源性高表达ILT4的细胞系为H1299和H1975。免疫组化显示ILT4在NSCLC肿瘤组织中的表达高于肿瘤周围正常组织,ILT4在肿瘤组织的阳性表达率为:57.7%（52/90）,在周围正常组织中的阳性率为4.4%（4/90）。2.ILT4表达与NSCLC患者临床病理指标及患者预后的相关性ILT4在NSCLC肿瘤组织中的表达与较晚的TNM分期（III期-IV期,p=0.0104）,淋巴结转移（p=0.001）成正相关。随访90例NSCLC患者生存,Kaplan-Meier生存分析显示ILT4高表达患者的OS低于ILT4低表达患者OS（p=0.0419）。利用Kaplan-Meier Plotter在线生存分析系统分析ILT4对肺癌患者预后的影响,采用包含ILT4基因特定序列的探针进行测探,探针207697xat信息显示ILT4高表达组患者总生存OS（p=0.056）及中位至疾病进展时间FP均低于ILT4低表达组（p=0.022）。3.ILT4表达水平与NSCLC瘤内微血管密度的相关性,ILT4/CD34共表达与临床病理指标的相关性目前尚没有ILT4在NSCLC血管生成方面的研究,我们探索性的分析了ILT4表达水平与NSCLC肿瘤组织中的微血管密度的相关性。采用临床常用的CD34阳性的细胞表达情况代表微血管密度。GEPIA数据库分析提示,ILT4与CD34表达呈正相关;组织标本免疫组化结果提示ILT4高表达组的微血管密度显着高于ILT4低表达组的微血管密度（p=0.0058）。同时ILT4+/CD34+共表达患者,较ILT4-/CD34-组患者,有更高的淋巴结转移率（p=0.0466）,共表达组腺癌的患者比例明显增高（p=0.0 12）。4.ILT4促进HUVECs细胞迁移能力和HUVECs小管形成能力Transwell细胞迁移实验证实过表达ILT4的H1650和A549的条件培养基促进HUVECs细胞迁移,并提高其成管能力;ILT4下调的H1975和H1299的条件培养基抑制HUVECs的细胞迁移,减弱其成管能力。5.ILT4可以上调NSCLC中促血管生成因子VEGF-A和MMP9的表达基因芯片检测提示肿瘤细胞ILT4过表达可引起VEGF-A和MMP9基因表达上调。在细胞水平上,通过qPCR和Western blot结果提示过表达ILT4后的NSCLC细胞系VEGF-A和MMP9的RNA水平和蛋白水平均明显升高;下调ILT4表达后的NSCLC细胞系VEGF-A和MMP9的RNA水平和蛋白水平均显着下降;组织水平上,在病理连续切片中通过免疫组化提示ILT4高表达组织中VEGF-A、MMP9的蛋白表达水平偏高。6.ILT4通过调控NSCLC细胞的VEGF-A、MMP9表达参与血管内皮细胞迁移和HUVECs小管形成内源性低表达ILT4的H1650和A549细胞系过表达ILT4后,加入VEGF-A中和抗体或MMP9中和抗体进行干预,收集条件培养基,培养HUVECs,结果示阻断VEGF-A、MMP9表达后,HUVECs细胞迁移能力明显降低;HUVECs的小管形成能力明显下降。7.ILT4可以激活NSCLC细胞ERK、p38信号通路基因微阵列分析提示上调ILT4后可引起MAPK信号通路中多种基因的表达。MAPK信号通路主要包括ERK通路,JNK通路和p38信号通路。Western blot实验提示H1650和A549细胞过表达ILT4后,肿瘤细胞的pERK、pp38水平升高,H1975和H1299细胞下调ILT4表达后,pERK,pp38蛋白表达水平均明显降低。8.ILT4通过激活ERK信号通路促进VEGF-A、MMP9表达将内源性低表达ILT4的H1650、A549细胞过表达ILT4后,加入ERK抑制剂U0126和p38通路抑制剂SB 203580（20μM）进行干预,培养48小时,收集条件培养基,Western blot提示加入ERK抑制剂U0126后ILT4过表达上调的VEGF-A、MMP9表达被显着逆转,加入p38通路抑制剂对VEGF-A、MMP9表达无影响。9.ILT4通过ERK信号通路调控血管内皮迁移和HUVECs的小管形成Transwell迁移实验和HUVECs小管形成实验证实抑制ERK信号通路后,ILT4上调的血管内皮细胞迁移能力和成管能力均显着逆转。结果提示:ILT4通过ERK信号通路诱导VEGF-A、MMP9表达并调控血管内皮细胞迁移和HUVECs的小管形成。10.ILT4促进NSCLC细胞体内成瘤及血管生成通过裸鼠皮下注射稳定过表达ILT4的NSCLC细胞株A549 LV-ILT4,和注射稳定干扰ILT4表达的细胞株H1299 LV-shILT4,建立裸鼠移植瘤模型,结果提示ILT4过表达组,NSCLC肿瘤生长速度显着快于对照组,ILT4过表达组的肿瘤体积和重量明显大于对照组;干扰ILT4表达组,肿瘤生长速度显着慢于对照组,ILT4干扰组的肿瘤体积和重量明显小于对照组。通过建立裸鼠移植瘤模型,造模4周后,分离肿瘤组织行免疫组化,结果提示ILT4过表达组,肿瘤微血管密度显着高于对照组,VEGF-A和MMP9表达高于对照组,pERK明显高于对照组,ERK表达无明显改变;干扰ILT4表达后,肿瘤微血管密度显着低于对照组,VEGF-A和MMP9表达低于对照组,pERK明显低于对照组,ERK表达无明显改变。体内实验进一步支持ILT4具有促进NSCLC血管生成的潜力。结论1.ILT4在NSCLC组织中及多个NSCLC细胞株中高表达,与更晚的病理分期、淋巴结转移及临床不良预后明显相关,可作为预后预测因子。体内体外实验证实ILT4可促进NSCLC血管生成。2.体外实验证实了 ILT4通过激活ERK信号通路上调VEGF-A、MMP9的表达并促进NSCLC血管内皮细胞迁移和小管形成,体内实验进一步验证了 ILT4对NSCLC血管生成的作用及潜在机制。

李青^[3]（2021）在《ILT4通过调控肿瘤浸润T淋巴细胞亚群诱导肺腺癌的免疫逃逸》文中指出肺癌是全球发病率、死亡率最高的恶性肿瘤。据文献报道,过去的40年里,肺癌的5年生存率小于21%。肺腺癌（Lungadenocarcinoma,LUAD）作为非小细胞肺癌（Non-small cell lung cancer,NSCLC）最重要的亚型,发病率逐渐增多,成为备受关注的NSCLC亚型。伴随着靶向治疗的出现,晚期LUAD患者的5年总生存有所改善,但仍面临靶向药物耐药、获益人群受限、缓解率不高等问题。以PD-1/PD-L1、CTLA-4等免疫检查点阻断（Immunecheckpointblockade,ICB）及以抗原嵌合受体T细胞（CAR-T）治疗为代表的过继性T细胞转移（ACT）治疗的出现为晚期肺癌患者带来了新的希望。而目前PD-I/PD-L1抑制剂在实体瘤的临床有效率及瘤种反应率不尽相同。单纯抗PD-1/PD-L1免疫治疗在晚期NSCLC的客观有效率仅为20%,除了患者选择不足和肿瘤自身免疫原性低外,复杂的免疫抑制微环境,包括抑制性免疫细胞、细胞因子和代谢物,以及肿瘤浸润淋巴细胞（Tumor-infiltrating lymphocytes,TILs）数量和功能下降,是T细胞免疫和有效ICB治疗的主要障碍。因此,寻找新的免疫检查点分子作为替代或补充,以突破肿瘤免疫抑制性屏障,逆转肿瘤免疫抑制微环境是目前肿瘤免疫治疗亟需解决的问题。肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）是肿瘤免疫微环境的重要组成部分,而肿瘤浸润T淋巴细胞是肿瘤免疫微环境中参与抗肿瘤免疫应答的最重要的免疫细胞,如何提高肿瘤浸润T淋巴细胞亚群的浸润水平及功能是当下免疫治疗的研究热点。成熟T淋巴细胞膜表面可表达CD3分子,根据T细胞表面分化抗原的不同,T细胞可分为CD3+CD4+T细胞和CD3+CD8+T细胞二个亚群。CD4+T淋巴细胞,通过与外源性抗原肽-MHCII分子结合发挥辅助作用;CD8+T淋巴细胞,主要与内源性抗原肽-MHC-I分子结合、活化,借助于颗粒酶、穿孔素等发挥特异性杀伤功能,是机体免疫系统中最重要的效应细胞。目前研究表明肿瘤浸润淋巴细胞,特别是CD4+Th1和CD8+细胞毒性T淋巴细胞（Cytotoxic lymphocyte,CTL）的存在与肿瘤患者较好的预后及肿瘤免疫治疗的疗效相关。FOXP3是Tregs的特异性转录因子。它不仅控制其表型,而且维持其免疫抑制功能,是应用最广泛的Treg标记。Treg通常通过接触依赖方式抑制Teffertor、NK或APC的激活,或通过分泌IL-10、TGF-β等抑制因子介导免疫抑制功能。目前大部分研究表明,在绝大多数肿瘤类型中,细胞毒性抗肿瘤免疫应答的主要细胞(如细胞毒CD8+T细胞、Th1导向的CD4+T细胞、三级淋巴结构（TLSs,tertiary lymphoid structures）的存在与良好的临床结果相关。相反,Tregs表达者预后较差。肿瘤微环境（Tumor microenvironment,TME）中Tregs和抑制性检查点分子等复杂的免疫抑制因子可以限制T细胞的浸润和杀伤能力,而这对于肿瘤的根除至关重要。因此,开展肿瘤微环境中T淋巴细胞亚群的研究对肿瘤的免疫治疗尤为重要。ILT4作为免疫球蛋白样转录子抑制性受体的一种,主要在髓系固有细胞（DC细胞、单核巨噬细胞及中性粒细胞）中表达,通过与经典或非经典组织相容复合体I类分子（MHC-I）结合,在维持母婴免疫耐受、器官移植耐受及炎症反应中发挥重大作用。研究表明,免疫细胞中ILT4的表达可有效抑制CD4+T细胞、CD8+细胞毒T细胞、NK细胞及树突状细胞的免疫活性,同时亦能诱导不同类型Treg细胞发挥免疫抑制作用。其虽在免疫学研究中取得十足的进展,但在肿瘤领域的研究相对较少。近年来,研究发现ILT4在NSCLC、白血病、乳腺癌、食管癌、胰腺癌等多种肿瘤细胞中存在表达,且与恶性肿瘤的增殖、侵袭、转移等多种恶性生物学行为息息相关。此外,ILT4在髓系抑制性细胞（Myeloid-derived suppressor cell,MDSC）中高表达,可促进肿瘤相关巨噬细胞（Tumor-associatedmacrophages,TAM）的M2极化,在创造肿瘤免疫抑制微环境中发挥重要作用。但肿瘤源性ILT4对实体肿瘤免疫抑制性微环境中T淋巴细胞亚群的调控作用及相关机制尚无报道。研究目的1.通过免疫组化染色方法和大数据统计分析ILT4在肺腺癌中的表达及其与T细胞浸润与亚群分布的相关性,以及二者与患者预后的相关性,明确ILT4对免疫抑制微环境的调控作用。以此为基础构建肺腺癌患者预后Nomogram列线图模型,为患者预后的预测提供量化工具。2.体外利用CD3+、CD4+和CD8+T细胞及敲低/过表达ILT4的肺腺癌细胞株构建T细胞-肿瘤细胞共培养体系,应用CCK-8和流式细胞术检测T细胞的增殖和凋亡情况。旨在探讨肿瘤源性ILT4抑制T细胞浸润的可能机制。方法1.收集216例经烟台市烟台山医院病理科诊断明确的原发性肺腺癌患者的病理组织标本及临床病理资料,并通过电话随访的方式获得入组患者的生存资料。应用免疫组织化学染色法检测其ILT4及CD3、CD4、CD8、FOXP3在肿瘤癌巢及间质的表达情况;结合免疫组化结果和GEO公共数据库统计分析ILT4与肺腺癌预后的关系。其次,分别统计ILT4的表达与上述T淋巴细胞亚群在癌巢及间质的分布密度关系,探讨ILT4与T淋巴细胞两者共表达对肺腺癌患者生存预后的影响。2.利用KM-plotter在线工具（http://kmplot.com/）数据库分析肺腺癌患者ILT4的生存情况。对基因表达综合数据库（GEO）中的720例和461例LUAD患者分别进行无进展生存期（PFS）和总生存期（OS）分析。自动选择每个队列的最佳截止值,其他所有参数均为默认设置。从GEO数据库下载LUAD患者的基因表达谱（GSE50081;https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE50081）,GSE50081的基因注释基于微阵列平台GPL570,对127个L UAD样本进行了进一步的研究。对于癌症基因组图谱（TCGA）队列,泛癌的RNASeq数据从UCSC xena下载（https://xenabrowser.net/datapages/）,共纳入515个样本。用ssGSEA函数对R package GSVA中的Treg浸润评分进行量化。采用Spearman相关系数评价ILT4表达与Treg浸润的相关性。3.利用患者临床病理资料、ILT4的表达状况、CD3、CD4、CD8及FoxP3在癌巢及间质的表达数据创建可评估患者预后生存的诺谟图。其中,利用Lasso回归,基于Lambda.1se筛选有意义的指标,将能够反应免疫微环境状态（即ILT4的表达状况、CD3、CD4、CD8及FoxP3在癌巢及间质的表达数据）的这些自变量与其回归系数组成一个计算评分,即为lasso系数。将lasso回归筛选得到的指标联合临床病理参数制作诺谟图,以估算NSCLC患者2年和3年的生存率。其中模型的构建采用R语言3.0.1（R Foundation for Statistical Computing,Vienna,Austria）和glmnet package进行LASSO Cox回归模型分析,并运用图形校准法检验模型的一致性/标定度（Calibration）及C-Index值评价模型的区分度。4.利用基因转染技术,分别敲低/过表达LUAD细胞系-H1975中ILT4的表达,应用Western blot、RT-PCR方法分别检测ILT4的转染效率。然后,运用Ficoll-Paque分离液分离健康志愿者全血中的单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC）,采用相应T细胞亚群磁珠分选试剂盒分选并利用CD3单抗活化人CD3+、CD4+及CD8+T淋巴细胞亚群。将敲低/过表达ILT4的LUAD H1975细胞系（H1975-shILT4与H1975-ILT4）分别与活化的CD3+、CD4+及CD8+T细胞按2:1比例共培养48h。然后,分离共培养之后的T细胞。分别利用CCK-8法和流式细胞术检测共培养体系中T淋巴细胞亚群增殖和凋亡情况。结果1.ILT4在LUAD高表达,正常邻近组织低表达,其表达与肿瘤的TNM分期、淋巴结转移及较差的PFS、OS相关。此外,ILT4的表达与肿瘤浸润T淋巴细胞的减少有关。进一步行T细胞亚群分析显示,ILT4高表达肿瘤中癌巢和间质中浸润的CD8+T淋巴细胞的减少,Treg浸润增加,而与CD4+T淋巴细胞亚群的浸润密度无关。同时ILT4highCD8low/ILT4highTreghigh肺腺癌患者的OS更差。因此,ILT4与CD8/Treg联合相比任何单一标记具有更好的生存预测价值。2.根据Lasso回归筛选所得免疫指标联合临床参数构建的诺谟图模型可以有效的预测患者2年及3年的生存率,为临床医生提供一种可定量的方法来预测肺腺癌患者的2年、3年生存概率。3.应用RT-PCR及Western blot方法分别检测敲低/过表达肺腺癌细胞H1975中ILT4的转染效率满意。敲低H1975细胞中ILT4表达后,CD3+、CD8+T细胞增殖活性增加,而凋亡比例明显减少。而过表达H1975细胞中ILT4后,CD3+、CD8+T细胞增殖活性受到抑制,凋亡比例明显增加。但两组中均未观察到CD4+T淋巴细胞亚群的浸润变化。结论1.肿瘤源性ILT4的表达与肺腺癌免疫抑制T淋巴细胞亚群的浸润和不良的临床预后相关。提示ILT4可能成为LUAD患者潜在的免疫治疗靶点和预后生物标记物。同时,ILT4与CD8/Treg联合可作为评估LUAD患者预后的更佳指标。2.根据Lasso回归筛选所得免疫指标联合临床参数构建的诺谟图模型可为临床医生提供一种可定量的方法来预测肺腺癌患者生存概率。3.肿瘤源性ILT4通过调控T细胞亚群增殖、凋亡诱导肺腺癌的免疫逃逸。

石磊^[4]（2020）在《基于基因编辑构建表达β2m-HLA-G融合蛋白的低免疫原性人胚胎干细胞》文中指出人多能干细胞（human pluripotent stem cells,hPSCs）具有在体外维持环境下自我更新及在特定分化条件下分化为三胚层细胞谱系的能力。因此,hPSCs可以作为理想的种子细胞为再生医学提供细胞移植所需的各类功能谱系。然而,hPSCs及其分化产生的功能谱系具有免疫原性,即移植由hPSCs分化获得的细胞/组织会诱发受体患者体内的同种异体免疫排斥反应,造成移植物的死亡。因此,构建低免疫原性hPSCs已经成为推动细胞替代治疗的核心环节。作为哺乳动物中普遍存在的最有效的同种异体免疫抑制案例,绒毛外滋养层细胞与母体子宫蜕膜直接接触,但是母胎屏障的存在有效地保护了作为同种异体抗原的胎儿免受来自母体免疫系统的攻击。母胎屏障的分子机制与人类白细胞抗原（human leukocyteantigen,HLA）直接相关。而绒毛外滋养外胚层细胞具有不表达HLA-A,-B,低表达HLA-C,高表达HLA-G蛋白质的特点。已有研究证明,该蛋白质分子能够抑制NK细胞、T细胞、DC细胞等多种免疫细胞的激活与杀伤作用。为了构建HLAⅠ表达缺失的hPSCs,我们设计了 B2M基因敲除的编辑方案。B2M是HLAⅠ型分子细胞膜定位的关键分子,敲除B2M的hPSCs的细胞膜表面将不表达任何HLAⅠ型分子。我们首先构建了一个高效、可精确控制且无需供体质粒的双gRNAs基因敲除系统,即通过将一对gRNAs与CRISPR/Cas9共同导入hPSCs,人为造成基因组相邻两个位点产生DSB,这两个DSB的平末端通过无缝连接后,可以产生一个提前终止密码子,从而阻止了非内源性蛋白质的翻译。利用这套双gRNAs敲除系统,我们成功的在人类多能干细胞中敲除了包括SMAD3和β-Catenin在内的十几个基因。另外,针对多个基因的敲除结果显示双gRNAs敲除系统可以同步对多个基因进行高效敲除。对于敲除非编码RNA,我们通过引入双gRNAs切除整段转录MIR1193的DNA序列实现了对该miRNA的敲除以及特异性切除MALAT1启动子核心区域的方案实现了对该lncRNA的敲除。我们设计的双gRNA敲除策略高效,适合敲除编码与非编码基因,可以实现多基因同步敲除,并且敲除后的基因产物可以进行精确预测。基于这一原理,我们成功的使用双gRNA基因敲除系统构建了内源性B2M基因敲除的低免疫原性hPSCs。为了构建细胞膜表面经典型HLAⅠ分子缺失,但是表达非经典型HLA-G的hPSCs,我们通过同源重组方案在人类胚胎干细胞内源性B2M基因的终止密码子位置插入了一段编码连接肽（G4S）4与HLA-G1的DNA序列,并在此细胞系的基础上,利用慢病毒载体,将一段编码B2M-（G4S）3-HLA-G5融合蛋白质的DNA序列引入该细胞系。我们的研究结果证明,B2M敲除hPSCs的细胞膜表面缺失β2m以及HLAⅠ分子。而过表达HLA-G的细胞系则成功表达β2m-HLA-G1与β2m-HLA-G5,其中流式细胞分析检测证明β2m-HLA-G1可以到达细胞膜表面且该融合蛋白的表达受内源性B2M基因启动子的调控,可以响应IFN-y的刺激。Western blot分析证明β2m-HLA-G5可以被分泌到细胞外培养环境中。同时,由于游离内源性β2m蛋白质的缺失,经典型HLAI蛋白质复合物无法完成组装,导致基因修饰后的人类胚胎干细胞系细胞膜表面缺失HLA-A、-B、-C蛋白质。体外与体内的同种异体免疫学实验证明上述表达HLA-G细胞系相较于野生型人类胚胎干细胞具有明显的低免疫原性。相比于B2M基因缺失的细胞系而言,表达HLA-G的细胞系能够更加有效的抑制NK细胞的激活。另外,β2m-HLA-G5分泌蛋白可以显着抑制野生型人类胚胎干细胞对NK细胞的激活,并且可以有效调控免疫细胞分泌的炎症因子。综上所述,我们成功构建了双gRNAs基因编辑系统,实现了在人类多能干细胞中高效,可预测的基因敲除。同时,我们成功实现了在人类多能干细胞中表达膜定位与分泌型的HLA-G蛋白,并且同时阻断了经典型HLAI分子在细胞膜表面的分布。该细胞系可以有效抑制T细胞、NK细胞诱导的免疫排斥,同时可以调节移植物周围的免疫环境,从而为广泛适用型细胞移植物提供了重要的细胞来源。

麻怀露^[5]（2020）在《KIR2DL4对肾透明细胞癌细胞增殖活性的影响及其相关分子机制的研究》文中进行了进一步梳理肾癌是一种来源于肾实质小管上皮系统的恶性肿瘤,它是泌尿系统第二常见的恶性肿瘤,其发病率仅次于膀胱癌。最常见的肾癌病理类型是肾透明细胞癌。尽管一些新的靶向治疗药物已被批准用于晚期肾癌治疗,但肾癌患者的治疗效果并不成功。因此探究肾癌发病的分子机制,为获得更加有效的治疗手段提供参考依据显得十分重要。对整个肾癌基因组数据的分析可以帮助我们提高对肾癌的理解和识别新的抗癌靶点。因此,我们通过对TCGA数据库的生物信息学分析,发现杀伤细胞免疫球蛋白样受体2DL4（killer cell Ig-like receptor2DL4,KIR2DL4）的m RNA在肾癌中表达增加（P<0.05）,在基因组中的拷贝数也同样增加（P<0.05）,并通过免疫组化方法证明KIR2DL4确实在肾癌中表达。但是并未得出有统计学意义的差异,这可能是由于样本量过小（3例）造成的。随后,我们将插入到Plenti载体中的KIR2DL4 c DNA和对照空载体通过慢病毒感染的方式插入肾透明细胞癌细胞系Caki-1和769-P细胞基因组内,并通过嘌呤霉素筛选出稳定细胞株。然后,通过MTT细胞活性实验和软琼脂克隆形成实验发现KIR2DL4过表达可以促进体外培养的Caki-1和769-P细胞的增殖能力（P<0.05）。为进一步评价KIR2DL4在肾透明细胞癌增殖生长中的作用,我们在动物模型中检测了KIR2DL4的过表达是否促进了肾癌细胞的生长。在BALB/c-nu/nu小鼠中,由KIR2DL4过表达的Caki-1细胞形成的肿瘤比对照Caki-1细胞形成的肿瘤出现得更早,生长得更快。同时,我们敲低Caki-1细胞中KIR2DL4的表达。通过MTT实验检测sh KIR2DL4组的增殖能力。结果显示,下调KIR2DL4可以抑制Caki-1的增殖（P<0.05）。同时,软琼脂克隆实验也得到了同样的结果（P<0.05）。最后,我们还采用细胞转录组测序的手段,对稳转的Caki-1-p Lenti-KIR2DL4和Caki-1-p Lenti-NC进行了差异表达分析。发现改变KIR2DL4表达后,肿瘤相关通路以及PI3K-Akt信号通路的相关蛋白出现了转录组水平的改变。此外,敲除KIR2DL4降低了Caki-1细胞中的p-ERK和NF-κB蛋白水平,而过表达KIR2DL4则增加了p-ERK和NF-κB的水平。综上所述,实验结果提示KIR2DL4与肾透明细胞癌的细胞生长增殖密切相关,在体内及体外可能会通过相关分子机制促进肾透明细胞癌细胞的增殖活性。我们有理由相信KIR2DL4可能是肾透明细胞癌的促癌基因,有望成为肾透明细胞癌临床治疗的有效靶点。

孙永正^[6]（2020）在《利用CRISPR/Cas9文库筛选黑色素瘤细胞抵抗T细胞杀伤的相关microRNA》文中认为黑色素瘤是一种侵袭性很强的肿瘤,其5年生存率小于5%。随着BRAF和MEK抑制剂、免疫靶向疗法和免疫检查点抑制剂等治疗方法的快速发展,黑色素瘤患者的生存率得到了显着提高。虽然免疫疗法在黑素瘤患者的治疗过程中发挥重要作用,但肿瘤引起的免疫逃逸限制了免疫治疗的效果。人们尚未对肿瘤免疫逃逸有太深入的了解,许多人类癌症对免疫疗法都有抵抗力。micro RNA是真核细胞中一种长度为21～23 nt的内源性非编码RNA。人类肿瘤中有多种micro RNA表达失调,它们在免疫治疗的过程中发挥至关重要的作用。micro RNA在肿瘤的诊断和预后过程中作为重要的生物标志物,可通过靶向多个关键基因参与肿瘤免疫调控。micro RNA可以通过影响肿瘤细胞的免疫原性导致肿瘤的免疫逃逸,还可以通过平衡肿瘤微环境或者调控免疫细胞的生长和发育调节机体的免疫应答。通过对micro RNA调节肿瘤免疫原性和抵抗细胞毒性T细胞介导的杀伤机制的研究,将对免疫治疗的进一步的研究有着重要作用。目的CRISPR/Cas9作为基因编辑领域中一种十分重要的工具,为我们发现更多潜在的肿瘤免疫治疗靶点发挥了重要的作用。利用CRISPR/Cas9全基因组的筛选已经用来寻找肿瘤细胞耐药、肿瘤细胞增殖和迁移的相关基因。由于micro RNA在肿瘤免疫调控中的重要作用,通过设计CRISPR/Cas9 micro RNA文库无偏的寻找抵抗细胞毒性T细胞杀伤相关的micro RNA,将为黑色素瘤的免疫治疗提供潜在的靶点。方法1.设计了全基因组micro RNA相关的sg RNA文库,得到质控合格的CRISPR/Cas9文库。2.首先使用低病毒感染复数感染表达Cas9的A375细胞系,采用嘌呤霉素来筛选,得到micro RNA敲除细胞系。利用梯度离心法和免疫磁珠筛选,获得细胞毒性T细胞。通过细胞毒性T细胞对感染文库病毒的A375 Cas9细胞系进行筛选。筛选完成后,提取基因组保证文库的丰度,对sg RNA靶向的区域进行PCR扩增。二代测序完成后,使用MAGe CK VISPR来评价样本的测序质量。质控合格后,使用MAGe CK工具对样本的sg RNA进行计数和标准化处理,并使用MAGe CK RRA计算实验组与对照组间sg RNA的富集差异,得到最终的筛选结果。3.通过有限稀释法,经过扩大培养得到稳定敲除micro RNA18a的单克隆株,并对敲除的细胞系进行RNA-SEQ分析。在RNA-SEQ的分析过程中,首先确定基因的表达量,利用Bioconductor DESeq2工具计算实验组与对照组之间的差异表达基因。最终将得到的实验组与对照组之间重叠的差异基因进行比较,在重叠的差异基因中寻找micro RNA18a抵抗细胞毒性T细胞杀伤的相关基因。采用GO富集分析和KEGG信号通路分析来预测micro RNA106b作用的靶基因。结果1.根据文库设计的相关策略,合成了CRISPR/Cas9 micro RNA文库。一共设计了2196个micro RNA相关的sg RNA的文库,该文库涵盖了最新最全的micro RNA。根据二代测序结果,设计的CRISPR/Cas9 micro RNA文库完全匹配率为83.8%,覆盖率为100%,均一性为4,覆盖倍数为162。2.筛选完成之后,对筛选结果进行质控分析。MAGe CK VISPR和Fast QC结果显示,sg RNA提取结果准确,质量与均一性良好。通过MAGe CK RRA分析,我们选择了正向筛选结果中sg RNA富集差异最明显的micro RNA18a和micro RNA106b作为后续研究对象。3.成功构建了micro RNA18a的单克隆细胞系,并对敲除的细胞系进行了RNA-SEQ分析。在micro RNA18a敲除的两个单克隆细胞系的RNA-SEQ分析结果进行重叠。经过RNA-SEQ分析和靶基因预测,micro RNA18a可能通过靶向THBS1,影响细胞毒性T细胞对黑色素瘤细胞的杀伤。最后,通过GO富集分析和KEGG信号通路分析,讨论了micro RNA106b可能发挥的作用。结论1.成功构建了2196个micro RNA相关的sg RNA的文库,该文库几乎涵盖了最新最全的micro RNA,并为以后进行相关micro RNA的筛选打下了坚实的基础。2.micro RNA18a敲低之后,可能通过上调THBS1的表达,影响黑色素瘤的EMT过程,进而影响细胞毒性T细胞对黑色素瘤细胞的杀伤。

陈泉^[7]（2018）在《miR-148a在食管鳞状细胞癌中的功能和调控机制研究》文中研究说明在我国,食管癌（Esophageal Cancer,EC）是消化系统中常见的恶性肿瘤之一,多数为食管鳞状细胞癌（Esophageal Squamous Cell Carcinoma,ESCC）,在食管癌中的比例大于90%。大多数患者出现明显症状后通过内镜活检确诊,很大比例为中晚期,预后较差。早期检测是减轻疾病负担的有效策略。近年来,微小RNA（miRNAs）已被用作血清肿瘤生物标记物。早先研究报道,miR-148a在患有复发性EC的患者中表达不足,是复发性食管癌的肿瘤抑制因子（Tumor Suppressor）。然而,miR-148a在原发性食管鳞癌中是否表达下调及其调控作用仍不清楚。人类白细胞抗原-G（human leukocyte antigen G,HLA-G）是具有免疫调节性质的重要分子,在生理情况下主要分布于胎盘,以往对HLA-G的研究多集中于妊娠合并症、自身免疫性疾病、感染、移植领域。近十余年来,肿瘤领域对HLA-G研究较多,既往研究表明,HLA-G可异位表达于患者的外周血和组织中,HLA-G的异常表达可以使得肿瘤细胞发生免疫耐受、逃逸,并且与不同肿瘤的恶性程度、转移、预后存在密切关系。早先不同的研究分别显示:HLA-G在原发性ESCC组织中具有高表达且与预后相关,HLA-G可由miR-148a调控。本研究的目的在于研究miR-148a、HLA-G在原发性食管鳞癌组织中的表达水平,通过双荧光素酶报告基因实验证实HLA-G是miR-148a调控的一个靶点,免疫荧光（IF）+荧光原位杂交（FISH）检测实验证明miR-148a、HLA-G在食管鳞癌组织中共同表达。同时研究miR-148a在ESCC细胞中对于HLA-G表达及ESCC细胞增殖、侵袭、凋亡的影响。第一部分miR-148a、HLA-G在食管鳞癌中的表达及意义目的:研究原发食管鳞状细胞癌组织及癌旁组织中miR-148a、HLA-G的表达,探讨Mi R-148、HLA-G在ESCC中的可能作用,对不良预后的可能相关性。方法:对20组不同TNM分期食管鳞癌组织及癌旁组织进行定量实时PCR（Quantitative Real-time PCR）来检测miR-148a、HLA-G的表达水平,miR-148a、HLA-G表达水平的检测以GAPDH为内参照。检验分析miR-148a、HLA-G表达与患者病理TNM分期、预后之间的相关性。结果:q PCR结果显示:食管鳞癌组织与相应癌旁组织中的miR-148a和HLA-G表达有明显差异。食管鳞癌组织中miR-148a的表达明显低于癌旁组织,HLA-G的表达明显高于癌旁组织,差异均具有统计学意义;分析了miR-148a表达水平与病理分期的关系:发现miR-148a低表达的比例在TNM低分期组（Ⅰ期+Ⅱ期）中较低,TNM高分期组（Ⅲ期）中较高,分别是38.5%（5/13）和85.7%（6/7）;Kaplan-Meier生存曲线分析同样提示miR-148a显着低表达组的预后明显差于相对高表达组,具有统计学意义。相比较于癌旁组织,HLA-G在食管鳞癌组织样本中显着表达,上调到约4倍（P<0.01）,具有统计学意义。HLA-G高表达在TNM低分期组（Ⅰ期+Ⅱ期）中较低,TNM高分期组（Ⅲ期）中较高,分别是15.4%（2/13）和71.4%（5/7）。Kaplan-Meier生存曲线分析提示HLA-G相对高表达组的预后明显差于相对低表达组。差异具有统计学意义。结论:miR-148a、HLA-G可能是食管鳞癌的潜在生物标记物（Biomarker）,食管鳞癌组织中miR-148a、HLA-G的表达水平与食管鳞癌的发生、发展相关。第二部分食管鳞癌中miR-148a和HLA-G的调控关系目的:本研究通过生物信息学分析进一步证实miR-148a和HLA-G直接关联,双荧光素酶报告基因分析确认在原发性食管鳞状细胞癌中,HLA-G是miR-148a调控的一个靶点。免疫荧光（IF）+荧光原位杂交（FISH）检测观察食管鳞癌组织中Mi R148a和HLA-G的表达。方法:根据Targetscan1数据库,通过计算机辅助得出Mi R148-a具有潜在的HLA-G结合位点。用miR-148a mimics模拟miR-148a表达,将含有HLA-G 3-UTR的双荧光酶报告载体（psi CHECK2）与miR-148a mimic通过lipofectamine 2000共转染于293T细胞。所有瞬时转染和荧光素酶检测样本每个重复3次。免疫荧光（IF）+荧光原位杂交（FISH）检测证实食管鳞癌组织中Mi R148a和HLA-G的特异性共表达。结果:通过生物信息学分析miR-148a具有HLA-G的结合位点。双荧光素酶报告基因分析确认在HLA-G 3-UTR野生型转染组,miR-148a高表达可明显抑制相应的荧光活性,而在突变组miR-148a未有这种抑制作用。因此miR-148a与HLA-G的结合是特异性的。miR-148a及HLA-G免疫荧光（IF）+荧光原位杂交（FISH）检测实验可明确观察到Mi R148a、HLA-G在食管鳞癌组织中表达。结论:miR-148a具有HLA-G的结合位点,HLA-G是miR-148a调控的一个靶点。食管鳞状细胞癌中,miR-148a和HLA-G共同表达。第三部分Mi R148a调节HLA-G表达,影响食管鳞癌细胞行为目的:提供上调miR-148a在ESCC细胞中的表达,观察对HLA-G表达及ESCC细胞增殖、侵袭、凋亡的影响,探讨miR-148a在ESCC的作用及可能机制。方法:以miR-148a模拟物（Mimic）转染人类ESCC细胞系EC9706,非同源RNA双链体（Non-homologous RNA Duplex）作阴性对照,空载体作空白对照。CCK-8实验检测各组ESCC细胞的活性,侵袭小室实验检测透过侵袭小室的单位面积的ESCC细胞数,分析各组细胞的侵袭能力。用定量实时PCR及免疫印迹试验（Western Blot）来检测HLA-G的表达水平。以膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙锭（Annexin V-fluorescein Isothiocyanate/Propidium Iodium,Annexin V-FITC/PI）将细胞染色,且通过流式细胞术（Flow Cytometry）来检测细胞凋亡。结果:EC9706细胞中,miR-148a模拟物转染可抑制ESCC细胞活性,降低ESCC细胞侵袭能力,并可诱导细胞凋亡。miR-148a模拟物转染的细胞的凋亡率比空载体转染的细胞或阴性对照的提高了10倍（P<0.01）。同时HLA-G的信使RNA（m RNA）水平及蛋白水平也显着降低（均为P<0.01）。与空白对照组相比,非同源RNA双链体的转染不影响细胞凋亡率或HLA-G的表达。结论:上调miR-148a表达水平可能通过直接调控HLA-G表达,诱导食管鳞癌细胞凋亡,抑制食管鳞癌细胞增殖、侵袭。食管鳞状细胞癌中,miR-148a低表达导致HLA-G异常高表达,从而影响食管鳞癌细胞行为。

周永刚^[8]（2018）在《NK细胞产生生长促进因子的功能及机制研究》文中认为自然杀伤细胞（Natural killer cells,NK cells）因其天然的杀伤能力而得名。从1975年的偶然发现到如今被免疫学家和临床医生寄予厚望,学界对NK细胞的认识经历了从最早CD56+CD3-简单表型描述到鉴定NK细胞是机体抗病毒和抗肿瘤的天然淋巴细胞重要亚群之一的漫长过程。NK细胞不仅是宿主防御中的“哨兵”,而且可以通过分泌细胞因子和趋化因子在维持组织稳态中发挥关键作用。体内成熟NK细胞数量的异常对肿瘤的发生发展,甚至是对自身免疫疾病发生都有重要影响。但是,目前无论是NK细胞功能分子的研究,还是促进NK细胞发育成熟调控因子的研究,仍主要局限于IFN-γ和IL-15等少数细胞因子。生长促进因子作为一类广泛表达且对于细胞发育成熟非常作用的细胞因子,在NK细胞的研究中鲜有报道。同时,NK细胞功能的研究仍主要集中于外周NK细胞在宿主防御中的作用,但是关于组织居留NK（Tissue-Resident NK,trNK）细胞的组织特异性功能报道甚少。人外周血中,NK细胞约占淋巴细胞总数的10%。但是在子宫组织中,随着妊娠反应的开始,子宫内膜迅速蜕膜化,NK细胞数量迅速增加,最高可达蜕膜组织淋巴细胞总数的70%。蜕膜组织NK细胞数量和最佳功能状态对于女性正常妊娠和胎儿健康具有重要意义。蜕膜组织中CD56+CD3-NK细胞一般认为包含少量仍然保留杀伤能力的外周CD11b+NK细胞和少量产生IFN-γ抑制Th17细胞维持母胎免疫耐受的CD27+ NK细胞,但是其中约占蜕膜NK细胞总量80%的CD1 1b-CD27-NK细胞的功能及其作用机制仍然未知。另一方面,NK细胞发育和成熟的研究不仅可以增强我们对体内成熟NK细胞库形成和维持机制的认识,而且更有助于我们在体外分化扩增具有最佳功能状态的成熟NK细胞。一般认为骨髓是NK细胞最主要的发育和成熟场所。NK细胞由存在于骨髓中的造血干细胞通过程序化的发育分化路径,历经淋巴共有前体细胞、NK细胞前体、不成熟NK细胞最终形成成熟的NK细胞迁出骨髓进入外周行使功能。NK细胞在骨髓中的发育和成熟依赖骨髓微环境,其中来源于微环境的细胞因子IL-15 目前被认为是促进NK细胞发育和成熟的重要因素,但是对于NK细胞自身的影响因素以及生长促进因子对NK细胞发育和成熟的关键作用机制知之甚少。本文主要从探究生长促进因子在NK细胞组织特异性功能和促进NK细胞发育和成熟过程中的作用机制和转录调控机制方面展开研究,获得如下结果:Ⅰ、NK细胞产生生长促进因子促进胚胎发育本研究通过高通量基因芯片差异分析子宫trNK细胞和外周血NK细胞,筛选鉴定子宫trNK细胞组织特异性功能分子。通过荧光定量PCR、免疫荧光和流式内标技术检测分析子宫trNK细胞产生生长促进因子（Growth-promoting factors,GPFs）的能力,包括多效生长因子（Pleiotrophin,PTN）、骨生成诱导因子（Osteoglycin,OGN）和骨桥蛋白（Osteopontin,OPN）。通过绒毛外滋养层细胞与子宫trNK细胞共培养体系研究子宫trNK细胞产生GPFs的调控机制。最后通过检测临床反复流产病人的子宫trNK细胞分泌GPFs能力确定其与胚胎早期发育相关性,进一步通过Ptn-/-Ogn-/-Sppl-/-小鼠确认子宫trNK细胞分泌生长促进因子促进胚胎早期发育的重要生理意义。通过上述研究方案取得了如下结果:1.基因芯片差异分析子宫trNK细胞和外周血NK细胞差异分析子宫trNK细胞和外周血NK细胞的基因芯片数据,结果显示子宫trNK细胞与外周血NK细胞功能分子存在显着差异,子宫trNK细胞特异性高表达PTN、OGN和OPN等对胚胎早期发育非常重要的生长促进因子。2.子宫trNK细胞分泌生长促进因子PTN,OGN和OPN定量PCR、免疫荧光、流式内标检测结果均验证基因芯片结果,子宫trNK细胞相较于外周血NK细胞特异性产生生长促进因子PTN、OGN和OPN。3.HLA-G诱导NK细胞分泌生长促进因子建立绒毛外滋养层细胞与子宫trNK细胞共培养体系模拟体内子宫trNK细胞微环境,结果显示绒毛外滋养层细胞可以促进子宫trNK细胞产生生长促进因子。细胞干扰和抗体阻断实验及721.221-HLA-G细胞系共培养实验结果均提示,绒毛外滋养层细胞过表达的HLA-G分子可以促进子宫trNK细胞产生生长促进因子。4.反复流产病人NK细胞分泌生长促进因子能力显着降低分析反复流产病人子宫trNK细胞,结果显示病人该细胞数量以及产生生长促进因子能力相较正常人均显着减少。该结果提示,子宫trNK细胞产生生长促进因子能力与正产妊娠密切相关。进一步研究发现发育异常的胚胎相较于正常发育胚胎的HLA-G分子表达显着降低。5.Ptn-/-Ogn-/-Spp1-/-小鼠胚胎发育受限分析Ptn-/-Ogn-/-Spp1-/-小鼠胚胎发育情况,结果显示生长促进因子联合缺陷小鼠子宫trNK细胞产生生长促进因子能力缺陷后,孕鼠胚胎发育受限,体重、体长值均显着降低。该结果提示子宫trNK细胞可以产生PTN、OGN等生长促进因子促进胚胎早期发育。综上所述,该研究通过人转录组基因芯片,比较了子宫NK细胞和外周血NK细胞的功能基因差异,发现早期妊娠中CD11b-CD27-子宫NK细胞高表达PTN、OGN等对胚胎早期发育非常重要的生长促进因子。胚胎来源的绒毛外滋养层细胞表达的HLA-G与子宫trNK细胞相互作用,诱导NK细胞大量表达生长促进因子,促进胚胎发育。反复流产病人中子宫trNK细胞表达生长促进因子的能力显着下降,不能支持胚胎早期的正常发育。该研究不仅丰富了 NK细胞的功能,而且为临床治疗胚胎生长受限和反复流产等相关疾病提供新的思路。Ⅱ、PBX1通过调控生长促进因子转录促进NK细胞在骨髓发育成熟本研究从NK细胞进化中关键分子保守性的角度筛选鉴定调控NK细胞发育和成熟的关键转录因子PBX1,并且通过定量PCR,Western blotting,流式内标技术方法检测分析人NK细胞体外分化扩增体系不同时间点的细胞和骨髓NK细胞的关键转录因子PBX1和其潜在靶基因生长促进因子PTN和OGN的表达情况。为了研究关键转录因子PBX1的调控机制,通过电核转技术构建NK细胞基因干扰体系,以及通过慢病毒感染构建NK细胞体外分化扩增过程中基因过表达体系,验证PBX1与生长促进因子的潜在调控相关性。为了进一步研究PBX1调控PTN和OGN的作用机制,利用NK细胞CH1P-Seq技术,荧光素酶报告体系和DNA-pulldown体系确认PBX1转录调控PTN和OGN的机制。接下来为了鉴定PBX1对NK细胞发育和成熟的调控作用,通过构建小鼠骨髓嵌合体模型及条件型Pbx1敲除小鼠模型检测分析NK细胞的发育和成熟情况。最后构建Ptn-/-Ogn-/-小鼠模型验证PBX1-PTN/OGN轴对NK细胞发育和成熟的关键作用机制。本研究通过上述研究方案取得了如下结果:1.PBX1是NK细胞高度保守的转录因子分析NK细胞关键分子基因在不同物种中的保守性,发现PBX1是NK细胞高度保守的转录因子。多种实验技术检测结果显示,人骨髓NK细胞相对T细胞特异性高表达PBX1,而且PBX1在NK细胞发育早期和成熟期均有较高表达。2.PBX1调控NK细胞表达PTN和OG]V生物信息学预测分析结果显示,PTN和OGN基因启动子区富含多个转录因子PBX1结合位点。NK细胞干扰和过表达PBX1基因后,流式内标检测生长促进因子PTN和OGN结果显示,在NK细胞中PBX1上调生长促进因子PTN和OGN的表达。为了进一步研究PBX1调控机制,在NK细胞中用抗PBX1抗体富集DNA序列的CHIP-Seq分析结果显示在PTN和OGN基因启动子区中分别存在转录因子PBX1的特异性结合峰。PTN和OGN和基因启动子区的荧光素酶报告实验结果和特异性序列的DNA-pulldown实验结果均验证PBX1可以识别特异性序列,并直接结合PTN和OGN基因启动子区。3.Pbx1缺陷小鼠NK细胞数量严重减少对比分析小鼠骨髓嵌合体模型中Pbx1基因被干扰的骨髓细胞和未被干扰的骨髓细胞中NK细胞的比例和数量,结果显示干扰Pbx1基因表达显着降低骨髓NK细胞和外周NK细胞的比例和数量。分析Pbx1条件型缺陷小鼠,Vav1-Cre小鼠介导的造血前体期Pbx1条件型缺陷严重影响NK细胞的发育,导致小鼠骨髓NK细胞和外周NK细胞的比例和数量显着下降,与骨髓嵌合体小鼠模型结果一致。Ncr1-Cre小鼠介导的NK细胞成熟期Pbx1条件型缺陷同样显着减少成熟NK细胞在骨髓和外周的比例和数量。该结果提示,PBX1不仅可以调控NK细胞的早期发育而且对于NK细胞的成熟具有关键调控作用。4.PBX1促进骨髓NK细胞末端成熟进一步分析发现Vav1-Cre小鼠和Ncr1-Cre小鼠介导的Pbx1条件型缺陷均可以导致小鼠骨髓CD11b+单阳性NK细胞的比例和数量显着减少,从而导致外周CD11b+单阳性NK细胞同样比例和数量显着减少。重组表达的生长促进因子PTN和OGN体内和体外恢复实验结果显示,补充的PTN和OGN可以恢复条件型Pbx1缺陷小鼠CD1 1b+ NK细胞的比例和数量。该结果提示,PBX1通过上调PTN和OGN促进NK细胞自身的末端成熟。5.PBX1-PTN/OGN轴参与NK细胞库的维持分析Ptn-/-Ogn-/-小鼠骨髓和外周CD11b+单阳性NK细胞的比例和数量,发现与Pbx1条件型缺陷小鼠结果一致,细胞的比例和数量均显着减少。分析小鼠骨髓NK细胞生长促进因子受体的表达,结果显示小鼠骨髓CD11b+单阳性NK细胞高表达PTN受体RPTP-β。野生小鼠骨髓细胞和Ptn-/-Ogn-/-小鼠骨髓细胞混合转输实验结果显示,少量的野生型小鼠骨髓细胞即可恢复Ptn-/-Ogn-/-小鼠骨髓和外周中成熟NK细胞的比例和数量。重组表达的PTN和OGN体内恢复实验结果也显示,补充PTN和OGN可以恢复Ptn-/-Ogn-/-小鼠骨髓和外周成熟NK细胞的比例和数量。该结果提示PBX1通过促进PTN/OGN自分泌支持NK细胞在骨髓的发育和成熟,即PBX1-PTN/OGN轴参与体内成熟NK细胞库的形成和维持。6.PBX1-PTN/OGN 轴上调 T-bet 表达分析Pbx1条件型缺陷小鼠和Ptn-/-Ogn-/-小鼠骨髓NK细胞增殖和存活以及迁出骨髓的能力,结果显示PBX1-PTN/OGN轴可以促进骨髓NK细胞的增殖和迁出骨髓的能力,但不影响NK细胞存活。T-bet作为控制NK细胞末端成熟和迁出骨髓能力的重要检查点转录因子,T-bet表达检测结果显示在条件型Pbx1缺陷小鼠和Ptn-/-Ogn-/-小鼠骨髓NK细胞中T-bet表达显着降低,重组表达的PTN和OGN可以显着恢复缺陷小鼠骨髓NK细胞T-bet的表达。该结果提示,PBX1-PTN/OGN轴通过上调T-bet表达促进NK细胞在骨髓的成熟。综上所述,本研究鉴定PBX1是NK细胞高度保守的转录因子。在NK细胞中PBX1可以直接分别结合生长促进因子PTN和OGN启动子区调控其转录。PBX1-PTN/OGN轴上调T-bet表达促进骨髓NK细胞终末成熟,参与体内成熟NK细胞库的形成和维持。该研究不仅对于深入理解NK细胞的发育和成熟具有重要意义,而且对于进一步完善基于NK细胞过继转输的免疫治疗方案也有深远影响。

朱相露^[9]（2021）在《维吾尔族和汉族女性三阴性乳腺癌发生与抗原呈递元件（APM）表达调控的关系研究》文中研究指明

蒋莉^[10]（2017）在《非经典MHC I类分子HLA-G在广西肝癌家族聚集性中的作用》文中认为1.研究背景原发性肝癌是一种常见的恶性肿瘤,世界上肝癌的发病率和死亡率地域差别较大。中国是肝癌的高发区之一,肝癌的发病率和死亡率分别占所有恶性肿瘤的第3位和第3位。肝癌发生是环境因素和遗传因素相互作用的结果,目前已达到共识的病因包括慢性乙肝病毒（hepatitis B virus,HBV）或/和丙肝病毒感染（hepatitis C virus,HCV）、黄曲霉毒素的暴露、酒精摄入过多及个体遗传因素等。广西是我国肝癌高发地区之一,其发病率和死亡率均高于全国平均水平。广西某些肝癌高发地区存在肝癌家族聚集现象,即在一个家族中发生肝癌的病例数达到2人或2人以上。目前,广西肝癌家族聚集发生机制尚未完全明确。其中,肝癌家族聚集与肝炎病毒感染、黄曲霉毒素、饮用不洁水源等外因的研究较多,而对内在的遗传因素则所知较少。HLA-G是机体一个重要的免疫耐受因子,能够调节多种免疫细胞的生物学功能,发挥免疫抑制的功能。HLA-G与恶性肿瘤的关系是近年来研究的一个热点,HLA-G基因多态性及蛋白的表达与多种恶性肿瘤的发生、发展关系密切。前期研究表明,HLA-G参与了肝炎病毒感染的转归和肝癌的发生、发展过程,但其与肝癌家族聚集的关系研究尚未见报道。本课题应用配对病例-对照研究方法,以广西肝癌高发家族家庭成员为研究对象,选择无癌家族家庭成员作为对照,拟从HLA-G基因多态性和蛋白表达水平的角度,探讨其与肝癌家族聚集性的关系,从遗传学角度去寻找肝癌家族聚集性的危险因素和潜在的预测指标。2.方法（1）样本收集:以来自广西肝癌高发区11个县区的35个肝癌高发家族中140名家庭成员作为实验组。其中,HBs Ag（+）35名,HBs Ag（-）105名。一级亲属57名,二级亲属39名,三级亲属44名。为减少混杂因素的影响,以相同性别、年龄±5岁、相同民族、相同生活环境、相同生活习惯作为配对条件,以140名无癌家族家庭成员作为对照组。所有受试者均接受肝炎病毒血清学标志物、HIV和肝功能等的检测。排除非血缘关系的家族成员,排除甲肝、丙肝、戊肝及HIV感染者。所有受试对象均未接受过抗病毒治疗。收集完整的受试者人口学资料和临床资料。所有研究对象空腹采外周静脉血10m L,分别注入抗凝（EDTA）管（6ml）和有盖普通无菌干燥管（4ml）,进行分装,并保存于-80℃冰箱中。抗凝血用于提取外周血白细胞DNA。干燥管血样离心后留取血清进行ELISA法检测s HLA-G抗体的浓度。（2）聚合酶链反应（PCR）结合测序法检测HLA-G基因多态性:采用试剂盒严格按照说明书的步骤进行提取外周血DNA。采用聚合PCR和测序技术对HLA-G基因3’UTR区14bp插入/缺失多态性、+3142C/G、+3187A/G以及位于HLA-G基因第三外显子的HLA-G*0105N等位基因进行多态性分析。并比较不同位点基因型与肝癌家族聚集的关系。（3）采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测血清中s HLA-G的水平:严格按照ELISA试剂盒中说明书要求操作,对所有受试对象外周血中可溶性HLA-G（solube HLA-G,s HLA-G）的水平进行检测,并分析肝癌高发家族家庭成员与无癌家族家庭成员s HLA-G水平的差异。3.结果（1）HLA-G基因多态性与肝癌家族聚集的关系检测结果显示:对于HLA-G3’UTR区而言,14bp插入/缺失基因型频率分布在肝癌高发家族家庭成员组和无癌家族家庭成员组中的差异有统计学意义（c2=8.69,P=0.01）。相对于+14bp/+14bp基因型来说,-14bp/-14bp基因型可能增加肝癌家族聚集的风险（OR=4.00,95%CI=1.38-11.61,P=0.01）;而+14bp/-14bp则不能增加肝癌家族聚集的风险（OR=2.54,95%CI=0.87-7.43,P=0.09）。两组的+14bp、-14bp等位基因频率分布差异也有统计学意义（c2=7.88,P=0.01）,-14bp等位基因与肝癌家族聚集的风险增加有关（OR=1.70,95%CI=1.17-2.46,P=0.01）。而在本研究中,对于HLA-G+3142C/G位点,基因型和等位基因的分布在肝癌高发家族家庭成员组和无癌家族家庭成员组中的差异都没有统计学意义（c2=2.08,P=0.35;c2=0.28,P=0.60）。+3187A/G位点的基因型分布及等位基因频率在两组中的差异也未见统计学意义（c2=3.35,P=0.19;c2=0.01,P=0.93）。而对于位于第三外显子的HLA-G*0105N的多态性分析发现,在本研究所纳入的研究对象中,只检测到HLA-G*0105NC/C和C/-两种,并没有发现-/-基因型。在分析HLA-G*0105N基因多态性与肝癌家族聚集性的关系时,发现其基因型频率和等位基因频率在两组中的分布并没有显着性差异（c2=0.88,P=0.19;c2=0.73,P=0.39）。（2）s HLA-G与肝癌家族聚集的关系检测结果表明,肝癌高发家族家庭成员血清s HLA-G水平显着高于无癌家族家庭成员（22.83U/ml vs 15.45U/ml,P=0.00）。为排除HBV感染的混杂因素,进一步分析,HBs Ag（+）的肝癌高发家族家庭成员的s HLA-G水平高于HBs Ag（+）的无癌家族家庭成员,差异有统计学意义（32.06U/ml vs21.96U/ml,P=0.04）;HBs Ag（-）的肝癌高发家族家庭成员的s HLA-G水平高于HBs Ag（-）的无癌家族家庭成员,差异有统计学意义（23.26U/ml vs12.93U/ml,P=0.00）。而在高发家族中,s HLA-G浓度在HCC先证者的一级亲属、二级亲属和三级亲属中分别为39.84U/ml、19.87U/ml和20.96U/ml。与二级亲属、三级亲属相比,一级亲属的s HLA-G水平显示升高（P=0.00,P=0.00）。s HLA-G的水平在家族中有2例HCC患者的家庭成员组,家族中有3例HCC患者的家庭成员组以及家族中有>3例HCC患者的家庭成员组分别为25.89U/ml,27.66U/ml以及22.38U/ml,s HLA-G在三组中浓度的差别没有统计学意义（P=0.98）。（3）HLA-G基因多态性与s HLA-G水平的关系,分析肝癌高发家族家庭成员组中HLA-G基因多态性与s HLA-G水平的关系,结果显示对于HLA-G 14bp插入/缺失多态性,s HLA-G水平在基因型-14bp/-14bp、+14bp/-14bp和+14bp/+14bp个体中的分别为31.41U/ml,24.14U/ml和17.69U/ml,s HLA-G水平在三组间的差异无统计学意义（P=0.22）。对于HLA-G+3142C/G位点,s HLA-G水平在基因型C/C、C/G和G/G个体中的分别为34.45U/ml,23.64U/ml和23.93/ml,s HLA-G水平在三组间的差异无统计学意义（P=0.15）。对于HLA-G+3187A/G位点,s HLA-G水平在基因型A/A、A/G和G/G个体中的分别为24.14U/ml,27.35U/ml和35.69/ml,s HLA-G水平在三组间的差异无统计学意义（P=0.81）。HLA-G*0105N,s HLA-G水平在基因型C/C和C/-基因型分别为27.35U/ml和25.87U/ml,差异也无统计学意义（P=0.67）。4.结论（1）HLA-G基因14bp插入/缺失多态性与肝癌家族聚集性有关。而HLA-G+3142C/G、+3187A/G位点和HLA-G*0105N可能不是肝癌家族聚集性的危险因素。（2）肝癌高发家族家庭成员外周血中s HLA-G水平升高可能是促进肝癌家族聚集性发生的一个危险因素。（3）在本次研究所纳入的人群中,未发现HLA-G基因多态性与s HLA-G表达水平存在相关性。

二、HLA-G突变分子对NK细胞抑制作用的研究（论文开题报告）

（1）论文研究背景及目的

此处内容要求：

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例：

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

（2）本文研究方法

调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、HLA-G突变分子对NK细胞抑制作用的研究（论文提纲范文）

（1）1型糖尿病患者免疫细胞表面SLAMF分子异常表达与机制研究（论文提纲范文）

（2）ILT4调控非小细胞肺癌血管生成的作用和机制研究（论文提纲范文）

（3）ILT4通过调控肿瘤浸润T淋巴细胞亚群诱导肺腺癌的免疫逃逸（论文提纲范文）

（4）基于基因编辑构建表达β2m-HLA-G融合蛋白的低免疫原性人胚胎干细胞（论文提纲范文）

（5）KIR2DL4对肾透明细胞癌细胞增殖活性的影响及其相关分子机制的研究（论文提纲范文）

（6）利用CRISPR/Cas9文库筛选黑色素瘤细胞抵抗T细胞杀伤的相关microRNA（论文提纲范文）

（7）miR-148a在食管鳞状细胞癌中的功能和调控机制研究（论文提纲范文）

（8）NK细胞产生生长促进因子的功能及机制研究（论文提纲范文）

（10）非经典MHC I类分子HLA-G在广西肝癌家族聚集性中的作用（论文提纲范文）

四、HLA-G突变分子对NK细胞抑制作用的研究（论文参考文献）

• [1]1型糖尿病患者免疫细胞表面SLAMF分子异常表达与机制研究[D]. 孙琳. 吉林大学, 2021(01)
• [2]ILT4调控非小细胞肺癌血管生成的作用和机制研究[D]. 宫文静. 山东大学, 2021(11)
• [3]ILT4通过调控肿瘤浸润T淋巴细胞亚群诱导肺腺癌的免疫逃逸[D]. 李青. 山东大学, 2021(10)
• [4]基于基因编辑构建表达β2m-HLA-G融合蛋白的低免疫原性人胚胎干细胞[D]. 石磊. 浙江大学, 2020(01)
• [5]KIR2DL4对肾透明细胞癌细胞增殖活性的影响及其相关分子机制的研究[D]. 麻怀露. 河北北方学院, 2020(06)
• [6]利用CRISPR/Cas9文库筛选黑色素瘤细胞抵抗T细胞杀伤的相关microRNA[D]. 孙永正. 天津医科大学, 2020(06)
• [7]miR-148a在食管鳞状细胞癌中的功能和调控机制研究[D]. 陈泉. 苏州大学, 2018(06)
• [8]NK细胞产生生长促进因子的功能及机制研究[D]. 周永刚. 中国科学技术大学, 2018(10)
• [9]维吾尔族和汉族女性三阴性乳腺癌发生与抗原呈递元件（APM）表达调控的关系研究[D]. 朱相露. 新疆医科大学, 2021
• [10]非经典MHC I类分子HLA-G在广西肝癌家族聚集性中的作用[D]. 蒋莉. 广西医科大学, 2017(01)