弓烨弘[1]（2021）在《色氨酸及代谢物抑制β-淀粉样蛋白聚集的分子动力学研究 ——对运动延缓阿尔茨海默病的机理初探》文中研究说明研究目的:阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）,是众多神经退行性疾病中影响人数最多的一种,脑内β-淀粉样蛋白（β-Amyloid,Aβ）聚集引发的神经毒性被证实是导致AD的关键因素。虽然研究者们长期致力于Aβ聚集及其抑制的研究,但至今仍未开发出有效的治疗药物,目前迫切需要寻找无毒副作用且不受限于血脑屏障的治疗手段和方法。运动能够促进脂肪动员,诱导人体必需氨基酸色氨酸（Tryptophan,Trp）高效跨过血脑屏障,在增强脑内色氨酸水平的同时也增强了其代谢物——人体的重要神经递质血清素（Serotonin,Ser）及激素褪黑素（Melatonin,Mel）的合成。实验研究发现,色氨酸能够对Aβ的聚集过程产生抑制,破坏成熟的Aβ纤维,降低Aβ纤维的神经毒性,并且血清素和褪黑素同样也被证明能够抑制Aβ的纤维化过程,但目前这些分子发挥抑制作用的具体机理仍不清晰。本研究采用分子动力学模拟、副本交换分子动力学模拟等方法探究色氨酸及其代谢物（血清素和褪黑素）抑制/破坏Aβ低聚体和Aβ原纤维的分子机理,能够对运动影响Aβ纤维化过程提供解释的视角,为阐明运动影响AD病理进程提供一定的理论支持,并为运动干预等药物替代疗法和药物设计提供结构基础和理论借鉴。研究方法:为研究色氨酸及代谢物（血清素和褪黑素）影响Aβ聚集过程的微观机理,本研究采用全原子副本交换分子动力学模拟,研究了色氨酸、血清素和褪黑素对Aβ低聚体聚集的抑制机理,并采用全原子常规分子动力学模拟研究了这些小分子解离Aβ原纤维的机理。本研究中的所有全原子分子动力学模拟均使用GROMACS软件进行,使用GAFF力场处理色氨酸、血清素和褪黑素的相关参数,正式的分子动力学模拟采用AMBER99SB-ILDN力场。此外,本研究所涉及的数据处理与分析同样使用GROMACS进行,与此同时,使用自编脚本与程序和一些第三方程序作为数据分析的补充工具。研究结果:阐明色氨酸及代谢物影响Aβ聚集过程的分子机理,有助于为运动延缓AD病理进程提供解释。本研究综合使用分子动力学和副本交换分子动力学模拟方法,对现有实验难以表征的色氨酸及代谢物抑制Aβ聚集的细节机理进行探究。研究的主要结果如下:（1）色氨酸（Trp）有效抑制了二级结构中β-sheet结构的生成,尤其是在N-端区域2AEF4、中心疏水区域17LVF19和C-端区域34LMVGGVV40,同时Trp也促进了对应区域coil和helix结构的生成。Trp削弱了Aβ42二聚体中氨基酸对之间的相互作用,对链间相互作用的削弱更显着,从溶液可及性表面积、链间接触面积、链间接触数量和链间结合自由能的计算也得到了证实。本研究识别出Aβ42二聚体中Trp的主要结合位点,包括F4、Y10、F19、F20、I31、I32和34LMVGGV39。针对Trp与Aβ42原纤维相互作用的研究结果显示,Trp的加入显着降低了Aβ42原纤维N-端的结构稳定性,并破坏了Aβ42原纤维N-端的β-sheet结构,RMSF计算结果则显示Trp增强了N-端区域的蛋白柔性。Trp能够破坏肽链间的稳定性,减少主链氢键,破坏局部疏水核心HC1的疏水相互作用,并削弱K28和A42形成链内和链间盐桥的稳定性。Trp与Aβ42原纤维的主要结合位点包括F4、H6、Y10、H13、H14和L34。（2）血清素（Ser）能够影响Aβ42二聚体的二级结构,在26SNKGAII32区域抑制beta结构的生成。通过分析氨基酸-氨基酸相互作用、溶液可及性表面积、链间接触面积、接触数量和结合自由能的结果可知,Ser的加入明显影响了Aβ42二聚体整体和局部的链间相互作用。本研究识别出Ser与Aβ42二聚体结合于4FRH6、Y10、13HHQKLVFF20、K28、I31、I32和34LMV36。在Ser与Aβ42原纤维相互作用的分析中发现Ser能够削弱Aβ42原纤维的结构稳定性,并且对N-端和C-端区域产生的影响更为明显。此外,Ser的加入还在很大程度上破坏了K28-A42之间的链内和链间盐桥。从综合接触数量、氢键数量和π-π堆积形式的计算结果可知,Ser能够减弱HC1中的疏水相互作用,破坏N-端的β-sheet结构,削弱了原纤维的结构稳定性。（3）Aβ42原纤维的Cα-RMSD结果显示,血清素（Ser）对Cα-RMSD的提高强于质子化血清素（Protonated serotonin,Serpro）。而回旋半径的计算结果则显示质子化后的Serpro能在一定程度上增大原纤维的回旋半径。针对Ser/Serpro影响链间接触数量和结合能的研究结果显示,Ser和Serpro均能减少接触数量并削弱链间结合能,且Serpro的效果相对较强。有关氨基酸相互作用的分析结果显示,尽管Ser/Serpro均能通过破坏HC1中氨基酸间的疏水相互作用和K28-A42盐桥相互作用,但Ser的破坏效果强于Serpro。本研究识别出芳香相互作用主要驱动了Ser与结合位点F4、H6、Y10、H13、Q15和L34之间的结合,而芳香相互作用、疏水相互作用和静电相互作用共同驱动了Serpro与结合位点D1、F4、R5、H6、D7、Y10、H13、Q15、F20、E22、D23和L34的结合。但尽管Serpro的结合位点更加广泛并与更多芳香氨基酸形成了π-π堆积,但Ser与结合位点之间的结合强度更强且与原纤维N-端形成的π-π堆积形式更加丰富,这使Ser能够在更大程度上破坏Aβ42原纤维的稳定结构,解聚已形成的Aβ42纤维。（4）褪黑素（Mel）在Aβ42二聚体上的结合位点几乎遍布整个序列。Mel削弱了N-端区域和中心疏水区域形成beta结构的几率,抑制Aβ42低聚体进一步纤维化。Mel能够减少Aβ42二聚体中链间氨基酸对和链内氨基酸对的相互接触,尤其对链间相互作用的影响更加显着。针对二聚体溶液可及性表面积、两条肽链间的接触面积和数量以及结合自由能的计算结果也显示,Mel能够削弱相邻肽链的链间相互作用。针对Mel和Aβ42原纤维相互作用的研究结果显示,Mel能够提高Aβ42原纤维的Cα-RMSD,降低原纤维的β-sheet结构含量,削弱Aβ42原纤维的链间稳定性。并同时减少疏水核心中的氨基酸相互接触,破坏K28和A42之间的链间和链内盐桥。此外,本研究还识别出Mel能够广泛结合于Aβ42原纤维的外表面和内表面。（5）色氨酸（Trp）与色氨酸混合血清素（Trp＿Ser）均提高了Aβ42原纤维的Cα-RMSD,但尽管Trp＿Ser在N-端和C-端共同提高了Aβ42原纤维结构的Cα-RMSD,但Trp仍能通过仅对N-端结构Cα-RMSD的影响,在更大程度上破坏Aβ42原纤维的整体稳定性。RMSF、主链氢键和Rg的结果同样显示,Trp在更大程度上使整体蛋白构型由紧凑转为松散。同时,Trp＿Ser对链间相互作用的削弱则强于Trp。对二级结构的分析显示Trp和Trp＿Ser都能够明显降低原纤维N-端形成β-sheet的几率。疏水核心稳定性的分析结果表明,Trp和Trp＿Ser分别更加明显地破坏了原纤维N-端和C-端的稳定结构并且Trp＿Ser在更大程度上破坏了K28-A42盐桥。本研究还识别出Aβ42＿protofibril+Trp和Aβ42＿protofibril+Trp＿Ser体系中,Trp和Trp＿Ser的结合位点十分相似,几乎都位于原纤维的N-端。研究结论:（1）Trp能够抑制Aβ42二聚体β-sheet等有序结构的生成,从而使蛋白构象在Trp的抑制效果下,保持更加无序的二级结构。Trp通过削弱二聚体链间相互作用,破坏Aβ42纤维化的结构基础,以此抑制Aβ42异常纤维化的过程。Trp与Aβ42二聚体N-端的结合主要通过π-π堆积作用和氢键作用,而与C-端的结合则主要通过疏水相互作用。同时,Trp的加入显着降低了Aβ42原纤维的结构稳定性,且最显着的影响发生在Aβ42的N-端区域,Trp与N-端形成了较多的氢键和丰富的π-π堆积,说明Trp可在Aβ42的N-端对Aβ42原纤维产生破坏,进而解聚已形成的纤维并抑制纤维进一步聚集。（2）Ser在26SNKGAII32区域有效抑制了Aβ42二聚体的二级结构中beta结构的生成。并且,Ser在很大程度上削弱了由链间相互作用形成的稳定结构,进而阻止形成稳定的聚集体。静电相互作用、疏水相互作用及苯环相互作用共同驱动,且与N-端带电氨基酸形成的氢键是使Ser更多与N-端结合的主要动力。此外,Ser能够削弱Aβ42原纤维N-端和C-端区域的结构稳定性,破坏N-端的β-sheet结构。研究发现Ser可以依靠氢键和π-π堆积与Aβ42原纤维的N-端结合,使N-端成为解聚已形成的Aβ42纤维的关键区域。（3）Ser能够削弱Aβ42原纤维的稳定性,促进解聚已形成的稳定纤维,而质子化后的Serpro尽管能在一定程度上使蛋白结构变得松散,但对蛋白整体结构的影响不及Ser。Serpro对原纤维的链间稳定性的削弱效果相对强于Ser,表明Serpro主要通过削弱链间稳定性对已形成的Aβ42纤维进行解聚。而Ser在削弱链间作用的基础上,还能通过降低N-端的β-sheet形成几率,破坏Aβ42原纤维N-端的β-sheet结构,进而解聚Aβ42原纤维。此外,Ser与结合位点的结合主要依靠芳香相互作用,而Serpro与结合位点的结合主要依靠芳香相互作用、疏水相互作用和静电相互作用共同驱动,这促使相比于Serpro,Ser能够在更大程度解聚已形成的Aβ42纤维。（4）Mel通过削弱N-端区域和中心疏水区域的beta结构形成几率,并削弱肽链间的相互作用,达到对Aβ42低聚体进一步纤维化的抑制。Mel能够通过π-π堆积与疏水相互作用和Aβ42二聚体的几乎整个序列产生结合,其中疏水相互作用是驱动Mel与C-端结合的重要动力。同时,Mel能够大幅降低Aβ42原纤维N-端区域和C-端区域的结构稳定性,关于结合模式的分析显示,驱动Mel与N-端和C-端结合的主要动力分别是π-π堆积作用和疏水相互作用,并且在这些作用的共同影响下,Mel能够在很大程度上破坏原纤维N-端和C-端的β-sheet结构。（5）Trp和Trp＿Ser分别通过削弱Aβ42原纤维的整体稳定性和链间相互作用破坏原纤维稳定结构。Trp和Trp＿Ser都能够明显破坏原纤维N-端稳定的β-sheet结构,以此解聚Aβ42纤维,且Trp＿Ser的解聚效果更强。由于对疏水相互作用和盐桥相互作用的影响,Trp和Trp＿Ser分别对原纤维N-端和C-端的稳定结构产生更加明显的破坏。Trp和Trp＿Ser的结合位点几乎同样都位于原纤维的N-端。其中,与N-端带电氨基酸和N-端芳香氨基酸形成的氢键相互作用和丰富的π-π堆积,共同驱动了两个体系中小分子与原纤维之间的结合。
刘兴媛[2]（2021）在《电针通过长非编码RNA SNHG1调控细胞自噬、糖代谢和铁死亡延缓阿尔茨海默病进展及机制研究》文中指出背景和目的:阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）是临床常见神经退行性疾病,目前尚缺乏有效预防和治疗手段。大量事实表明表观遗传调控失常与AD的发生发展息息相关,但截至目前,AD发生的分子机制仍未完全阐明,因此,研究AD的发生发展分子机制对改善AD的临床诊疗具有重大意义。目前临床上采用电针治疗AD,取得了一部分临床效果,但电针作用于AD的治疗机制尚不清楚。研究电针对AD的治疗作用,以及影响AD进展的表观遗传调控因素,是增强电针治疗AD效果以及探索AD新治疗手段的必由之路。为联系传统电针治疗和表观遗传调控之间的关系,必须从更高纬度、更保守的水平上寻求分子机制的突破。方法:首先建立大鼠的AD模型,再将合格大鼠称重后随机分为假手术组、模型组与电针组。进行行为指标检测,在Morris水迷宫实验中,定位导航试验记录分析大鼠逃避潜伏期及轨迹,空间探索实验记录大鼠跨越平台期的次数。其次,建立AD细胞模型,进行SNHG1的检测及表型验证,采用实时荧光定量PCR检测SNHG1的表达水平;表型验证包括采用彗星电泳检测DNA损伤,利用CCK8和Edu增殖水平检测检测细胞增殖速率,利用克隆形成实验检测细胞的克隆形成能力。随后进行糖酵解相关指标的检测,指标包括葡萄糖摄取能力、ATP生成、乳酸生成、细胞外酸化（ECAR）以及耗氧量（OCR）等;最后进行铁死亡相关检测,包括铁、MDA和脂质活性氧（ROS）水平的检测。分析互作方面利用mRNA稳定性检测靶基因mRNA半衰期水平,利用RNA免疫共沉淀（RIP实验）检测RNA和蛋白质互作等。各组数据用SPSS22.0软件进行处理。先行正态性检验。符合正态分布者,行方差齐性检验,方差齐者用q检验,方差不齐者用Tamhane’s T2或Dunnett’s T3法;不符合正态分布者采用多个独立样本比较的秩和检验。结果:水迷宫实验发现,AD组大鼠的平均逃避潜伏期和平均游泳距离明显长于对照组;在空间探索实验中,AD组大鼠在目标象限的游泳时间和距离百分比明显低于对照组。在给予高频刺激（HFS）之前,先进行30min的测试刺激,观察基础f EPSP的波幅。结果表明,各组基础f EPSP始终保持稳定,f EPSP波幅无明显差异（P>0.05）;而AD模型组在0min、30min和60min时,f EPSP的波幅与对照组相比明显抑制。在H-SY5Y/Aβ-42神经元模型中,CCK8细胞增殖实验显示AD发生后神经元增殖活性明显降低,EDU活性细胞实验显示AD发生后EDU阳性神经元数量明显减少,集落形成能力也降低,证明AD发生后细胞神经元的增殖活性受到抑制。经过电针治疗后,电针组大鼠的平均逃避潜伏期和平均游泳距离均明显短于AD组,在空间探索实验中,电针组大鼠目标象限游泳时间和距离百分比明显高于AD组,说明电针组大鼠空间记忆能力明显改善和缓解。电针组在给药后0min、30min、60min与AD组相比,f EPSP波幅明显激活。为了探讨lncRNA表达谱在AD进展中的作用,利用H-SY5Y/Aβ-42神经细胞模型比较了AD发生时神经细胞和正常细胞转录产物的差异。结果表明,SNHG1在AD细胞中高表达。随后我们下调了SNHG1的表达,并对敲减前后RNA转录物的KEGG通路进行了分析。结果表明,SNHG1参与细胞的多种生物学过程,包括MAPK途径、药物代谢、糖代谢、氧化应激等。值得注意的是,SNHG1还影响自噬基因的富集。因此,SNHG1对自噬过程的影响是下一步的研究方向。同时,既往研究表明AD发生后正向调节自噬的关键蛋白Beclin1的表达下调。因此,需要研究SNHG1对Beclin1蛋白的影响。使用Starbase生物信息学分析数据库结果表明,RNA结合蛋白IGF2BP2可能同时与SNHG1和Beclin1相互作用,由此推测SNHG1通过IGF2BP2调控下游靶基因Beclin1。随后功能结果表明,AD发生后Beclin1蛋白的表达明显低于对照组,同时SNHG1能抑制Beclin1蛋白和mRNA的表达,此外,敲减SNHG1后,Beclin1 mRNA的稳定性和表达明显增强。双荧光素酶报告基因系统结果表明,SNHG1对Beclin1 mRNA的转录水平没有影响,SNHG1对Beclin1 mRNA的调控主要发生在转录后水平。生物信息学分析表明,RNA结合蛋白IGF2BP2可能同时与SNHG1和Beclin1相互作用。为了验证这一猜想,使用RNA结合蛋白免疫沉淀实验进行了验证。结果表明SNHG1通过与RNA结合蛋白IGF2BP2结合参与Beclin1 mRNA的调控。回复实验结果显示,自噬抑制剂组和SNHG1过表达组大鼠寻找水下平台的平均逃避潜伏期和平均游泳距离均显着高于电针组,说明自噬抑制剂和SNHG1过表达逆转了电针的治疗作用。在空间探索实验中,自噬抑制剂组和SNHG1高表达组大鼠在靶象限游泳的时间和距离百分比均短于电针组,说明自噬抑制剂组和SNHG1高表达组逆转了电针治疗大鼠的空间记忆能力。同时,自噬抑制剂和SNHG1过表达组在HFS刺激后,f EPSP波幅与电针组相比均有明显抑制。q RT-PCR结果显示,AD细胞株SNHG1明显升高。CCK-8检测结果显示,SNHG1敲减可显着增加AD细胞的增殖。此外,SNHG1敲减组EDU阳性细胞百分率明显升高。同时,SNHG1敲减的AD细胞发生了较少的凋亡。彗星电泳实验显示,在AD细胞中,SNHG1敲减组的DNA损伤百分率也低于对照组。敲减SNHG1的AD细胞的葡萄糖摄取、乳酸产生和ATP生成显着减少;细胞外酸化率（ECAR）显着降低,氧耗率（OCR）显着增加。铁死亡是AD发生的重要机制,我们继而探索了SNHG1与铁死亡之间的关系,结果显示,敲减SNHG1可以带来铁死亡相关表型的改变,如MDA水平减少、Iron水平减少、GSH增加等,同时这些效应能够被NRF2敲减所逆转。为了验证SNHG1与NRF2 mRNA的直接相互作用,RIP实验结果表明,与空载体或Ig G相比,AD细胞中的SNHG1 RIP对NRF2 mRNA的表达显着富集。然后确定了SNHG1和NRF2之间的调控关系,发现SNHG1的敲减显着提高了AD细胞中NRF2 mRNA和蛋白的表达。而SNHG1的敲减并没有影响NRF2启动子的荧光素酶活性,表明SNHG1通过转录后方式调节NRF2的表达。为了探讨SNHG1是否影响NRF2 mRNA的降解,用RNA合成抑制剂α-Amanitin处理SNHG1改变的AD细胞,然后测定NRF2 mRNA的衰减情况。结果显示,SNHG1的敲减增加了NRF2 mRNA的半衰期和稳定性。接着进行了Me-RIP分析,发现与Ig G相比,m6A抗体显着富集了NRF2mRNA。另外,还观察到SNHG1的敲减显着增加了AD细胞中NRF2 mRNA的m6A甲基化,提示SNHG1对NRF2 mRNA的m6A修饰有负性调节作用。FTO和ALKBH5是m6A脱甲基转移酶,RIP结果表明,FTO抗体能显着富集SNHG1转录本,同时SNHG1的敲减显着降低了FTO在NRF2 mRNA中的结合,FTO过表达挽救了si-SNHG1诱导的NRF2上调。为进一步证实SNHG1/FTO/NRF2轴在AD中的作用,回复实验结果表明,SNHG1基因被敲减后NRF2蛋白的表达增加,而NRF2的敲减可以部分挽救SNHG1带来的效应。在细胞增殖分析中,NRF2的敲减可以部分挽救敲减SNHG1对AD细胞增殖的上调作用。NRF2的敲减挽救了SNHG1基因敲减引起的葡萄糖摄取和乳酸产生的抑制。ECAR和OCR分析表明,NRF2敲减可以部分恢复SNHG1基因敲减对糖酵解过程的抑制。结论:电针可以调节神经元及突触的lncRNA表达,通过表观遗传途径调控神经元的活性和突触抑制。分子机制方面,SNHG1/IGF2BP2/Beclin1通路通过抑制自噬导致神经元损伤和LTP抑制,同时,SNHG1/FTO/NRF2通路参与了AD细胞铁死亡、有氧糖酵解进程。
丁秀仿[3]（2021）在《神经退行性疾病相关蛋白相分离及聚集的调控机制研究》文中研究表明神经退行性疾病是神经元细胞结构或功能逐渐丧失甚至死亡而导致功能障碍的一类疾病,严重危害人类的健康。肌萎缩侧索硬化症（ALS）和额颞叶痴呆（FTD）是两种常见的神经退行性疾病,具有相似的病理学特征,即患者的大脑和脊髓中存在一些蛋白的聚集体。细胞内存在着许多无膜细胞器,如核仁、应激颗粒等,调控着很多重要的生物学过程。神经元的无膜细胞器中存在着许多与ALS/FTD相关的蛋白质,无膜细胞器的形成由蛋白液液相分离（LLPS）驱动。蛋白LLPS形成的液滴通过异常的不可逆相变可以转化为淀粉样纤维。这个淀粉样纤维即是在ALS/FTD患者神经元中观察到的聚集体。ALS/FTD患者神经元中存在多种蛋白（包括FUS和TIA1）,这些蛋白的低复杂域（LCD）往往能够促进聚集和相分离。然而,蛋白FUS和TIA1聚集和LLPS之间的关系以及调控机制还有待研究。在本论文中,对蛋白FUS和TIA1相分离及聚集的调控机制进行了研究,具体内容如下:1.FUS淀粉样聚集片段的确定及其对相分离的影响研究。目前有研究发现FUS-LCD能形成淀粉样纤维,结构研究表明一个57个残基的片段构成了FUS-LCD纤维结构的核心。以此为基础,把FUS-LCD核心片段分成序列相似的四个多肽,命名为R1-R4,探究FUS更短的淀粉样聚集片段。通过对多肽聚集的能力、聚集体的形貌特征、聚集体的稳定性,聚集体的二级结构进行表征,发现只有R2能够形成具有β折叠结构的淀粉样纤维,且纤维具有温度可逆性。进一步研究发现,R2可以诱导FUS-LCD在相分离液滴中聚集。本研究揭示了一种纤维在液滴内部生长的中间状态,这为功能性相分离的FUS如何聚集形成致病蛋白提供了新的见解。2.特定位点磷酸化对FUS相分离和聚集的调控机制研究。以FUS淀粉样聚集片段R2为基础,首先研究了Ser54（54位的丝氨酸）和Ser61位点磷酸化对其聚集的影响。通过原子力显微镜和透射电镜对聚集的形貌观察,发现Ser61磷酸化有更显着的影响,能够抑制R2的聚集。毒性实验研究表明,Ser61磷酸化降低了细胞毒性。进一步地,通过无细胞表达体系得到全长FUS蛋白,发现R2可以作为种子诱导全长蛋白FUS的聚集,而Ser61磷酸化破坏种子能力。另外,Ser61磷酸化抑制FUS-LCD在相分离液滴中聚集。最后,通过分子动力学模拟和固态核磁共振光谱研究了Ser61磷酸化影响聚集的分子机制,Ser61位点磷酸化会破坏维持R2平行对齐β折叠结构的分子内和分子间的相互作用。研究结果表明特定位点磷酸化在调控FUS的相分离和聚集中发挥关键作用。3.TIA1的液液相分离性质表征。在体外实验中,利用共聚焦显微镜初步观察到全长TIA1（FL-TIA1）和TIA1-LCD蛋白发生相分离。进一步地,通过浊度实验发现高离子强度即静电相互作用可以抑制TIA1-LCD液液相分离。在4-50℃温度范围内,高温抑制TIA1-LCD的液液相分离。进一步,构建了FL-TIA1和TIA1-LCD的真核质粒,并通过瞬时转染在细胞内表达了蛋白。共聚焦显微镜、荧光漂白恢复实验观察到FL-TIA1和TIA1-LCD在细胞内可以发生相分离形成具有流动性的液滴。这些结果对于进一步研究TIA1相分离的调控机制奠定了基础。4.脯氨酸相关突变对TIA1相分离和聚集的调控。脯氨酸抑制淀粉样聚集体的形成,最近研究发现某些蛋白富含脯氨酸的区域会调控蛋白相分离过程。通过共聚焦显微镜、荧光漂白恢复实验发现,与野生型TIA1-LCD相比,LCD中的脯氨酸相关突变改变了TIA1-LCD的液滴形态和流动性。对FL-TIA1的突变研究发现,脯氨酸-亮氨酸（P-L）突变加速TIA1的纤维化。进一步细胞内实验对FL-TIA1研究发现,P-L突变（包括P352L,P362L）相分离液滴流动性降低,且多个脯氨酸突变（11P-A,11个脯氨酸突变为丙氨酸）直接导致聚集。此外,所有这些脯氨酸突变（P352L,P362L,11P-A）都延迟了细胞内应激颗粒的清除。这些结果表明,脯氨酸是调控TIA1相分离和聚集的关键残基。综上所述,本文确定了一个FUS淀粉样纤维片段并以此为基础阐释了FUS蛋白特定位点磷酸化调控的机理,同时阐释了TIA1脯氨酸相关突变调控液液相分离和聚集的机制。本论文所揭示的磷酸化和突变调控机理、蛋白结构模型以及相分离与聚集的转变机制等信息,能够为相关蛋白的研究深入提供基础。
林枫[4]（2021）在《神经丝蛋白编码基因在中国散发性肌萎缩侧索硬化症中的遗传和功能研究》文中进行了进一步梳理目的:1、研究中国人群散发性肌萎缩侧索硬化症（sporadic amyotrophic lateral sclerosis,s ALS）患者及对照人群中神经丝蛋白编码基因NEFH/NEFM/NEFL的变异情况,构建蛋白变异图谱,阐明神经丝蛋白编码基因变异尤其是罕见变异在s ALS患者中的负担;2、结合携带变异患者的临床特点,从基因水平及变异位点水平分析其与临床表型的关系,并利用所发现基因罕见变异富集后通过机器学习的方式构建生存期预测模型;3、对所发现的高风险罕见变异进行细胞水平初步功能验证,探索高风险变异导致蛋白的功能变化并初步探讨机制,进一步阐明神经丝蛋白编码基因与s ALS的关联性。方法:1、采用PCR-Sanger DNA测序技术,对来自于多中心371例临床诊断为散发性肌萎缩侧索硬化症（sporadic amyotrophic lateral sclerosis,s ALS）患者和711名正常健康对照的NEFH/NEFM/NEFL三个基因的所有11个外显子,以及内含子和外显子交界区进行测序。通过正反双向测序以及双人复核读序方式检出变异,采用多个遗传学数据库进行检索和比对,明确变异的频率、有害性的预测。对常见变异、低频变异及罕见变异富集于基因水平后进行病例对照分析,并进行单变异水平分析和变异负担分析。构建在中国s ALS患者中三个基因变异的图谱,对出现率高的罕见变异采用独立的中国健康老年人群对照队列776人进行一代测序验证;2、对所检测的罕见变异在基因和变异水平进行临床特点的关联分析和生存分析,并综合常用临床维度的信息和神经丝蛋白基因变异信息通过逻辑回归、支持向量机、决策树、随机森林、随机生存森林构建生存期预测模型;3、对重复出现的高风险变异构建质粒转染A型人胚肾细胞系（HEK293A细胞）、大鼠脊髓前角运动神经元细胞系（VSC4.1细胞）以及人神经母细胞瘤细胞系（SH-SY5Y细胞）,通过细胞活力检测实验、细胞乳酸脱氢酶释放实验以及细胞内ATP检测实验进行突变体在细胞水平的功能初步验证,通过免疫荧光实验初步探讨可能的机制。结果:1、在371例s ALS和711例健康对照中,共检出92种变异,其中在NEFH基因上发现36种罕见变异,NEFM基因上有27种,而在NEFL上有16种。三个基因的罕见变异在病例和对照组的负担情况并无不同。通过病例-对照对比分析发现,位于NEFH基因4号外显子的罕见变异rs568759161（p.Ser787Arg）的最小等位基因频率在病例组（5/742,0.67%）显着高于数据库中东亚人群频率（12/8628,0.14%）以及总对照组频率（2/2974,0.07%）（OR:10.08;95%CI:1.95-52.07;p=0.005）;2、这三个基因的罕见变异与临床特点无关联,其中携带高风险变异rs568759161的患者在临床上以肢体起病（80%）为主,男性占多数（80%）,其临床特点上与未携带变异患者及携带其他罕见变异的患者无统计学差异;3、利用常见的临床信息和NEFH/NEFM/NEFL基因是否变异进行随机森林生存期预测效率更高,尤其是长生存期预测（准确率85.00%,AUC 0.90）,随机生存森林对短生存期的预测能力更佳,但结合生存分析和统计模型,所研究的三个基因的罕见变异对生存期影响不重要;4、高风险变异NEFH p.Ser787Arg在细胞水平研究发现可影响NEFH蛋白的功能,其机制不是通过影响其与β-tubulin及NEFL的结合而发挥作用。结论:1、本研究对散发性肌萎缩侧索硬化患者中进行了NEFH/NEFM/NEFL基因的系统突变筛查,检出的NEFH基因p.Ser787Arg变异在中国s ALS患者中属于高风险变异。该变异经过细胞水平验证发现可影响NEFH蛋白功能。携带该变异s ALS患者临床表型与其他患者并无不同。NEFM、NEFL与s ALS无明确关联。本结果为进一步阐明ALS疾病的遗传基础提供证据;2、本次发现的中国s ALS患者的NEFH/NEFM/NEFL基因变异的形式和频率与欧美患者人群不尽相同,提示了s ALS的遗传异质性;3、本研究也提出一个利用临床信息结合基因的罕见变异信息构建的随机森林、随机生存森林预测模型,为人工智能的医学应用提供进一步的依据。
李戈辉[5]（2021）在《HMGA1/miR-103/107负反馈环路通过CDK5R1/CDK5信号通路调控帕金森病自噬机制的研究》文中研究说明研究背景帕金森病（Parkinson’s Disease,PD）是一种复杂的神经退行性疾病,表现为多巴胺神经元缺失导致的运动及非运动症状,主要病变部位为黑质及纹状体。目前,发病原因非常复杂,仅对症治疗不能有效阻止PD进展。已有研究发现多巴胺能神经元自噬功能障碍与PD的发生和进展直接相关,但其潜在机制尚不明确。自噬调节可能有望成为PD的有效治疗策略。因此,揭示PD背后的自噬调控机制非常重要。研究目的自噬是一种溶酶体依赖的蛋白质降解过程,用于消除细胞内受损的细胞器和异常蛋白质聚集物。自噬平衡对于神经元存活是必不可少的。研究表明,多巴胺能神经元自噬功能障碍在PD进展中起到关键作用,然而其具体机制仍不明确。高迁移率族蛋白 A1（High-mobility group A1,HMGA1）与 miR-103/107 家族是自噬重要调控因子,基于我们前期研究结果及文献检索论证,HMGA1与miR-103/107家族相互作用,调控多巴胺能神经元自噬。因此,本课题拟分别通过分子、细胞及动物模型证明:在PD病理过程中,HMGA1表达升高,miR-103/107表达下降;HMGA1通过直接与miR-103/107的启动子结合,维持miR-103/107的表达;同时,miR-103/107又可促进HMGA1的表达,彼此形成一负反馈环路;该环路通过CDK5R1/CDK5信号通路调控多巴胺能神经元自噬障碍和死亡。该研究进一步丰富现有对PD分子生物学机制的认识,为后续展开基于HMGA1信号通路的PD靶基因药物治疗提供新的靶点。研究方法及内容1.分子水平:下调HMGA1,过表达/下调miR-103/107家族,利用免疫印迹法和实时荧光定量PCR,分析其在神经元细胞中的表达及相互调控作用;进一步采用染色质免疫沉淀（ChIP）实验、双荧光素酶报告基因实验,确定HMGA1与miR-103/107之间的相互调控关系;2.细胞水平:下调HMGA1,过表达/下调miR-103/107家族,利用免疫印迹法和流式细胞术检测细胞自噬相关表型,明确HMGA1/miR-103/107家族/CDK5R1/CDK5信号通路对多巴胺能神经元自噬和神经毒性的影响;3.动物水平:构建亚急性PD小鼠模型,立体定向注射下调中脑黑质HMGA1表达,免疫荧光技术、免疫印迹法、实时定量PCR法检测中脑黑质TH（酪氨酸羟化酶）、自噬蛋白和miR-103/107的表达。明确HMGA1对PD中脑黑质多巴胺神经元自噬和神经毒性的影响。研究结果1.HMGA1表达升高,miR-103/107表达下降;2.下调HMGA1加剧MPTP/MPP+诱导的细胞自噬损伤和神经毒性作用;3.HMGA1/miR-103/107形成负反馈环路,通过CDK5R1/CDK5信号通路调控细胞自噬损伤和死亡。结论HMGA1/miR-103/107负反馈环路通过CDK5R1/CDK5信号通路调控多巴胺能神经元自噬损伤和死亡。
冉龙艳[6]（2021）在《NRH：醌氧化还原酶2介导慢性氟中毒大鼠脑组织氧化应激损伤及自噬功能改变的机制研究》文中指出目的:长期摄入过量的氟能够通过血脑屏障沉积在脑组织中,引起中枢神经病理学改变和认知功能障碍,导致慢性氟中毒性脑损伤。其海马区功能和分子水平的变化机制研究,是目前慢性氟中毒脑损伤的研究重点。氧化应激学说对慢性氟中毒引起的机体多系统病理改变能给出较全面的和相对合理的解释,是慢性氟中毒脑损伤机制中较重要的支撑性理论,但仍需继续丰富和进一步证实。近年来,已发现慢性氟中毒导致的中枢神经系统损伤与自噬水平改变有关,且自噬在氧化应激产生的细胞信号传导改变和细胞损伤过程中起到关键作用。NRH:醌氧化还原酶2（NRH:quinone oxidoreductase 2,NQO2）具有高活性分子特征,能够导致活性氧（Reactive oxygen species,ROS）产生,加重氧化应激损伤,也能造成自噬异常改变。但是,在慢性氟中毒脑损伤机制中,氧化应激水平升高和自噬改变之间是否有相关关系、两者之间是否有关键因子相连接等仍不清楚。本课题主要研究慢性氟中毒导致的大鼠脑组织海马区域氧化应激和自噬功能的改变,并研究氧化应激和自噬改变之间是否通过NQO2相连接,来探讨慢性氟中毒脑损伤的发生机制。方法:1、慢性氟中毒大鼠研究:（1）动物模型复制:采用不同含氟浓度饮水（5 ppm,50 ppm和100 ppm）分别饲喂Sprague-Dawley（SD）大鼠3个月和6个月,复制慢性氟中毒动物模型。实验结束时观察大鼠氟斑牙形成,测定大鼠血液、尿液、骨组织和脑组织中含氟量,用以评价模型复制情况。（2）动物行为学研究:使用Morris水迷宫开展定向巡航实验和空间探索实验以评价长期摄入氟对实验动物学习和记忆能力的影响。（3）脑组织病理学观察:用苏木精-伊红染色法检查大鼠脑组织一般组织形态改变;用神经元尼氏染色法观察动物大脑海马区域神经元尼氏小体的变化。（4）海马组织氧化应激水平检测:使用流式细胞仪和生化方法检测大鼠脑组织ROS和脂质过氧化物代谢产物丙二醛（Malonydialdehyde,MDA）含量及超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）活性。（5）海马组织自噬水平检测:使用透射电子显微镜观察大鼠脑组织海马区域神经元亚显微结构变化以及自噬体数量;蛋白印迹法检测自噬相关蛋白,包括:哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（Mechanistic target of rapamycin,m TOR）,自噬相关蛋白5（Autophagy related5,ATG5）,微管结合蛋白1A/1B轻链3B（Microtubule-associated proteins 1A/1B light chain 3B,LC3Ⅱ）和自噬接头蛋白p62（p62/sequestosome-1,p62/SQSTM1）的表达变化;荧光免疫组化检测大鼠海马区域自噬相关蛋白m TOR、ATG5和p62的表达。（6）实验动物海马组织转录组和蛋白组测序以及生物信息学分析:采用高通量RNA测序（RNA-seq）和串联质谱标签（Tandem-Mass-Tag,TMT）蛋白组学技术对大鼠海马组织进行测序;通过差异分析和聚类分析评价高氟处理对于大脑海马组织基因和蛋白层面的影响;使用相关性分析和交集分析获取在基因和蛋白层面协同变化的分子,并挑选与氧化应激和自噬有关的分子——NQO2进行后续研究;转录组和蛋白组测序数据采用实时荧光定量聚合酶链反应（Quantitative real-time PCR,q RT-PCR）和平行反应检测（Parallel reaction monitoring,PRM）靶向蛋白组学技术进行验证。（7）NQO2表达与自噬及氧化应激相关性:蛋白印迹法检测动物脑组织NQO2的蛋白表达,并与自噬相关蛋白和氧化应激指标进行皮尔森相关性分析。2、体外培养SH-SY5Y（人神经母细胞瘤）细胞NQO2改变相关性机制研究:（1）RNA干扰和小分子药物处理干扰NQO2表达:构建靶向NQO2的干扰慢病毒转染SH-SY5Y细胞,并使用NQO2抑制剂S29434及激活剂Menadione来调控氟处理的SH-SY5Y细胞模型中NQO2的表达;（2）分析靶向调控氟处理的SH-SY5Y细胞模型中NQO2的表达后自噬和氧化应激改变:检测NQO2抑制或活化状态下,氟处理对自噬水平和氧化应激水平的影响。结果:1、慢性氟中毒大鼠模型复制成功:染氟组大鼠出现不同程度的氟斑牙,血液、尿液、骨组织和脑组织中氟含量均明显高于对照组,且与染氟剂量成正相关关系。2、慢性氟中毒大鼠学习记忆能力降低:染氟组大鼠逃避潜伏期明显高于对照组;普遍出现穿台次数减少和在目标象限停留时间减少的现象。3、慢性氟中毒大鼠脑组织神经元病理改变:HE染色显示,经氟处理后大鼠脑组织海马CA3区未见明显形态学变化;尼氏染色结果显示染氟组大鼠脑组织海马CA3区神经元尼氏小体较对照组数量明显减少,染色变浅。4、染氟组大鼠脑组织氧化应激水平增高:慢性氟中毒大鼠大脑海马组织MDA和ROS含量明显升高,SOD活性明显降低。5、透射电镜观察结果:染氟组大鼠海马CA3区神经元细胞出现核型不规则,核膜皱缩、凹陷呈锯齿状、染色质聚集;胞浆内自噬体明显增多,但未见自噬体数量随染氟时间延长而增多的情况。6、慢性氟中毒大鼠海马组织LC3II及p62蛋白水平表达改变:p-m TOR表达降低,ATG5、LC3 II和p62表达升高,提示自噬流阻滞,自噬水平异常。7、转录组学和蛋白组学测序结果:与对照组相比,差异表达基因主要富集在认知功能,学习记忆能力,长时程增效以及自噬调控信号通路中。联合转录组学和蛋白组学分析发现13个变化趋势一致的差异基因,其中NQO2表达差异性最高。8、慢性氟中毒大鼠脑组织NQO2蛋白表达水平改变:蛋白印迹和免疫荧光组织化学结果均显示NQO2在慢性氟中毒大鼠海马组织中呈现高表达状态,与染氟剂量呈正相关关系;NQO2表达量与自噬相关蛋白的变化以及氧化应激指标呈显着相关性。9、体外培养细胞NQO2调节机制研究结果:氟处理后,SH-SY5Y细胞NQO2表达升高,p-m TOR表达降低,ATG5、LC3 II和p62表达升高,提示自噬流阻滞,自噬水平异常;细胞MDA和ROS含量明显升高,SOD活性降低,提示氧化应激水平升高。采用慢病毒干扰和小分子化合物特异性处理调控NQO2表达,结果提示抑制NQO2表达能够降低p62表达,恢复自噬流水平,降低氧化应激影响。结论:1、慢性氟中毒大鼠学习记忆能力降低可能与海马区氧化应激水平升高、自噬功能异常有关:染氟大鼠脑组织ROS及MDA含量增多,SOD活性降低;自噬启动相关蛋白p-m TOR表达降低,自噬体形成相关蛋白ATG5和LC3 II表达增加,自噬溶酶体功能相关蛋白p62积累。2、慢性氟中毒大鼠智力损伤与海马区基因及蛋白水平改变密切相关:差异基因主要出现在富集于与学习、记忆能力和大脑奖赏机制相关的信号通路;部分与认知相关的基因改变持续存在,无法逆转。3、慢性氟中毒大鼠海马组织NQO2增加,可能促进氧化应激水平增加及自噬功能异常:NQO2升高与染氟剂量有关,且与自噬功能异常和氧化应激水平显着相关。4、氟可以促进自噬启动,在一定程度是一种代偿性保护机制;但是随着损伤积累,自噬流不畅,自噬清除功能受阻。而抑制NQO2能够降低氧化应激水平、恢复自噬流通畅,提示NQO2可能是调控自噬流的关键因子。
郑超然[7]（2021）在《Sigma1R对大鼠脊髓运动神经元的功能影响及肝细胞癌中SNHG1基因调控网络的研究》文中研究指明肌萎缩性脊髓侧索硬化症（Amyotrophiclateral sclerosis,ALS）,是一种影响脊髓和大脑运动神经元（Motorneuron,MN）的神经退行性疾病。其特征是在疾病过程中患者上（UMN）、下（LMN）运动神经元发生退行性变性,可导致多个脑区（包括大脑皮层运动区、脑干和脊髓部分）中的运动神经元丧失功能,进而影响肌力、呼吸、吞咽等功能,最终致使患者瘫痪以及死亡。ALS引起的神经元功能障碍导致的突触传递异常,神经元兴奋-抑制平衡失衡对于神经元影响深远,因此,了解在ALS病程中脊髓运动神经元是如何受到影响,能否通过其他途径来弥补以改变疾病的病程,能为推进疾病治疗方法的进步提供思路。Sigma1R是一种较小的（仅28 KDa）、高度保守的跨膜蛋白,位于运动神经元突触后C-终末的下池（Subsurfacecisternae）,通常特异性地在线粒体相关膜（MAM）区域的内质网膜上富集。在动物体内,Sigma1R选择性高表达于神经系统,尤其是脊髓的运动神经元中。研究显示Sigma1R的缺失突变可导致一种被称为ALS16的神经退行性疾病或者其它类似的运动神经元缺陷。此外,即使在非Sigma1R突变的病例中,Sigma1R也被发现参与ALS的发病。我们认为,Sigma1R在神经系统中可能参与介导神经发生等一系列过程的调节,并广泛参与疾病病程中的各种细胞过程。我们的前期实验已经验证Sigma1R敲除的大鼠表现出神经损伤相关的表型,随后我们分离大鼠背部的脊髓,采用RNA-seq技术进行对照组（野生型组）和基因敲除组（Sigma1RKnockout组）的转录组学研究。最终得到在Sigma1R-/-中上调的基因为551个,下调的基因为674个。通过Sigma1R敲除后上调基因的KEGG功能富集分析我们发现HVP感染过程和PI3K-Akt信号通路相关基因功能的富集。通过Sigma1敲除后分析下调基因的KEGG功能富集发现钙信号通路和γ-氨基丁酸等相关功能的富集。通过Sigma1R敲除后上调基因的GO功能富集分析我们发现,神经元鞘和轴突鞘相关功能的富集。通过Sigma1R敲除后下调基因的GO功能富集分析可以检测到大量神经递质和突触相关功能的富集。在对Sigma1R敲除对大鼠脊髓运动神经元的影响进行研究的过程中,我们以脊髓腹角运动神经元的数量作为体现相应的脊髓目标脑区的功能受损程度的重要指标。尼氏染色结果显示,在敲除Sigma1R基因后,大鼠脊髓运动神经元在六月龄时就已经存在数量减少,细胞体积萎缩的现象,该现象会随着年龄的增加而愈趋严重,在一年龄时神经元的数量显着降低,神经元的胞体体积也显着降低,提示敲除Sigma1R基因后,大鼠脊髓运动神经元会发生进行性的退行,这种现象可能是Sigma1R基因参与神经退行性疾病的病理生理过程的重要证据之一。通过对突触囊泡糖蛋白（SV2B）的标记显示,在敲除Sigma1R基因后,大鼠脊髓运动神经元胞体上的兴奋性突触连接数量显着减少,其原因可能与神经元的数量整体减少有关;同时神经元的突触发生和损伤修复功能的弱化也有可能导致神经元突触末梢的发育和维持发生障碍,从而无法将兴奋性突触的数量维持在原本的水平。随后我们使用透射电镜方法对脊髓运动神经元突触的超微结构进行了观察,结果显示,在敲除Sigma1R基因后,大鼠脊髓运动神经元突触中突触前活性带的长度没有显着变化,突触间隙变宽,突触后致密区显着增厚,提示Sigma1R敲除对神经元突触前释放递质的能力影响不大,但会使突触可塑性降低。电生理技术是研究神经元生理学活动的直接手段。通过对急性分离脊髓脑片进行膜片钳记录,我们得出以下结论,Sigma1R敲除大鼠和野生型大鼠相比:（1）脊髓腹角运动神经元的兴奋性明显增高,静息膜电位明显降低,膜电阻无显着变化,被给予电流刺激之后所产生的动作电位的最大幅度明显增高。（2）动作电位的幅度略小,峰型更宽,复极化所需要的时间更长,并且后超极化电位更小,指示钾离子流出过程的减慢。（3）激发动作电位的频率普遍更高,指示Sigma1R敲除能使神经元更易兴奋,且兴奋水平更高。（4）PSC频率显着更高,说明在正常生理条件下其囊泡释放的数量更多,提示更频繁的突触前活动;而PSC的幅度在两者间没有显着差异,说明两者在正常生理条件下突触后受体水平方面差别不大。（5）mEPSC频率略高于野生型,说明在没有动作电位的作用下其囊泡释放的数量更多,提示更频繁的突触前活动;mEPSC幅度显着升高,说明缺失Sigma1R基因的神经元的兴奋性突触后受体水平和反应能力的升高;电流峰面积更大,说明突触后对信号接受能力更强。在上述研究之外,我们对肝细胞性肝癌（HCC）患者的GDC数据进行了整理和挖掘,寻找其中关键的lncRNA-miRNA-mRNA网络和竞争性内源RNA（ceRNA）。我们发现SNHG1在HCC患者中过表达。SNHG1的上调与几种主要生物学功能的富集有关,包括细胞增殖,转录和蛋白质结合。小核仁RNA宿主基因1（SNHG1）,E2F8（E2F转录因子8）,FANCE（FA互补组E）和LMNB2（编码lamin B2）的表达趋势相似。在与SNHG1相关的网络中,SNHG1（对数秩p值=0.0643）,E2F8（对数秩p值=0.000048）,FANCE（对数秩p值=0.00125）和LMNB2（对数秩p）的高表达水平值=0.0392)与低生存率显着相关。单细胞分析表明,E2F8可能参与肿瘤发生或癌症发展。
李阔[8]（2021）在《miR-let-7f在阿尔茨海默病患者的血清含量以及对SHSY-5Y细胞氧化损伤作用机制研究》文中指出阿尔茨海默病（AD）为临床常见的慢性神经系统退行性疾病,包含了精神行为、社会功能和认知功能等多方面的障碍或者异常,同时患者病程表征为进行性发展,具有不可逆性。关于全球范围内AD的2015年报道显示,全世界范围内每3秒就可能出现1例临床新发的患者,而到2050年全世界AD患者可能会升高至1.315亿人左右,同时这其中约70%患者来自发展中国家。临床AD患者人数的不断的增加和发病率的日益升高对世界各国的经济与社会带来了巨大的负担和沉重的压力,在2015年全世界关于AD患者的护理与照料等成本在8200亿美元左右,而发展到2030年该成本可增大到约2万亿美元。同时上述报道还指出全世界范围内AD患者最多的区域为东亚,我国是东亚中人口最多、地理面积最大的国家,特别是近年来,伴随国内老龄化人口的持续增加,AD对我国社会经济、地区与患者家庭均带来了巨大的挑战与负担。近年的研究显示,AD发病机制和微小RNA（miRNA）联系紧密,在机体内正常神经系统中miRNA参加调控了诱导神经干细胞分化、神经系统发育、神经保护、神经元增殖与凋亡、产生树突棘、突触可塑性等不同的信号传导通路、不同生理过程。因此本研究通过分析miR-let-7f在AD患者中的表达以及对SHSY-5Y细胞氧化损伤作用机制,以期为临床患者的诊疗提供更多的实验室依据和理论支撑。本研究将从3个方面开展研究,第一部分研究AD患者血清氧化应激指标表达及与认知功能障碍的相关性,明确AD患者血清氧化应激相关指标（如Mn SOD、GSH-Px、CAT、SOD等）的异常表达。第二部分为分析miR-let-7f在AD患者中的表达及临床意义,以明确miR-let-7f在AD患者中的可能作用。第三部分通过阐明miR-let-7f在SHSY-5Y细胞氧化损伤中的潜在作用,有望进一步明确miR-let-7f在AD发病机理中的分子机制。第一部分阿尔茨海默病患者血清氧化应激指标表达及与认知功能障碍相关性目的:分析AD患者血清氧化应激指标表达及与认知功能障碍相关性情况。方法:回顾性分析于沧州市中心医院治疗AD患者30例作为AD组,选取同期在本院体检的健康者30例作为对照组。记录患者临床资料情况,包含姓名、婚姻史、性别、家族史、年龄、联系电话、体重、身高和生命体征等。记录患者血清氧化指标（Mn SOD、GSH-Px、CAT、SOD、MDA、Hcy）水平和CDR、MMSE评分情况。对AD患者血清氧化指标和CDR、MMSE评分行相关分析。结果:1.AD组患者年龄在58至69岁之间,平均（63.18±10.17）岁,男性16例、女性14例,BMI指数在21.9至26.8 kg/m2之间,平均（25.58±3.20）kg/m2,受教育时间4至16年,平均（11.01±6.14）年,12例有吸烟史,12例有饮酒史,合并症方面:8例有心脏疾病、15例有高脂血症、10例有糖尿病。对照组患者年龄在55至70岁间,平均（66.94±10.84）岁,男性15例、女性15例,BMI指数在21.4至26.9 kg/m2间,平均（24.64±4.10）kg/m2,受教育时间4至15年,平均（9.27±5.10）,13例有吸烟史,14例有饮酒史,合并症方面:9例有心脏疾病、14例有高脂血症、9例有糖尿病,两组患者年龄、性别、合并症、吸烟与饮酒史、受教育时间和BMI指数等对差异无统计学意义（P>0.05）。2.AD组患者血清Mn SOD、GSH-Px、CAT、SOD含量分别为（7.65±1.36）ng/ml、（152.66±40.13）μmol/L、（18.32±2.17）U/ml、（62.01±4.99）U/ml,低于对照组的（12.49±2.18）ng/ml、（199.74±41.82）μmol/L、（18.32±2.17）U/ml、（69.17±4.31）U/ml,AD组患者血清MDA、Hcy含量分别为（6.41±1.60）μmol/L、（29.10±6.47）μmol/L,高于对照组的（4.69±1.74）μmol/L、（23.70±7.52）μmol/L;AD组患者CDR评分为（2.61±0.35）分,高于对照组的0分,MMSE评分为（22.57±3.18）分,低于对照组（27.79±3.15）分,差异均有统计学意义（P<0.05）。3.AD患者血清Hcy、MDA含量和CDR评分为正相关（P<0.05）,AD患者血清Mn SOD、GSH-Px、CAT及SOD含量和CDR评分为负相关（P<0.05）。AD患者血清Hcy、MDA含量和MMSE评分为负相关（P<0.05）,AD患者血清Mn SOD、GSH-Px、CAT及SOD含量和MMSE评分为正相关（P<0.05）。小结:1.相比健康者AD患者血清氧化应激指标出现显着异常;2.AD患者认知功能障碍和血清氧化应激指标存在明显的相关性;3.AD患者机体内氧化平衡损伤可能为导致认知降低的因素。第二部分miR-let-7f在阿尔茨海默病患者的血清表达及临床意义目的:通过分析miR-let-7f在AD患者中的表达及临床意义,以明确miR-let-7f在AD患者中的可能作用。方法:回顾性分析于本院治疗AD患者30例作为AD组,选取同期在本院体检的健康者30例作为对照组。采集患者空腹静脉血5ml放置在无抗凝干燥试管中,离心机4000rmp离心10min,上清液分装在EP管内,保存于﹣80℃冰箱内保存。检测生化指标:血清脂联素（ANP）、总胆固醇（TG）、同型半胱氨酸（Hcy）、甘油三酯（TC）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）采用全自动生化分析仪检测,各项指标的检测都依据仪器和试剂盒的说明书来进行,为了对检测质量进行控制,本研究的全部样品都由检验科的人员在同一台仪器上进行检测,每个样本都重复检测3次。miRNA微阵列分析AD患者中各种miRNA表达水平情况;记录AD组和对照组血清miR-let-7f表达情况;记录AD组和对照组血清ANP、Hcy、TC、TG、HDL-C、LDL-C含量和MMSE评分情况;记录AD患者血清miR-let-7f表达与血清ANP、Hcy、TC、TG、HDL-C、LDL-C含量及MMSE评分相关性情况;对影响AD发病因素的二分类Logistic回归分析。结果:1.和对照组相比,AD患者内出现差异表达的miRNA共11种,其中有6个miRNA,即miR-242、miR-301、miR-134、miR-let-7i、miR-let-7f和miR-34a表达显着升高,而有5个miRNA,即miR-18a、miR-188、miR-214、miR-328和miR-3135a表达显着降低。2.AD组患者血清miR-let-7f表达为（1.84±0.32）,高于对照组的（1.02±0.14）,差异有统计学意义（P<0.05）。3.AD组患者TC、TG和HDL-C含量分别为（1.71±0.84）mmol/L、（21.63±1.77）mmol/L、（1.31±0.40）mmol/L,和对照组的（1.79±0.95）mmol/L、（22.04±1.81）mmol/L、（1.34±0.39）mmol/L对比差异无统计学意义（P>0.05）。AD组患者血清ANP含量、MMSE评分分别为（6.80±2.81）μg/ml、（22.57±3.18）分,低于对照组的（11.91±3.06）μg/ml、（27.79±3.15）分,AD组患者血清Hcy、LDL-C含量分别为（29.10±6.47）μmol/L、（2.85±0.68）mmol/L,高于对照组的（23.70±7.52）μmol/L、（2.37±0.54）mmol/L,差异有统计学意义（P<0.05）。4.AD患者血清miR-let-7f表达和HDL-C、TG与TC含量无相关性（P>0.05）。AD患者血清miR-let-7f表达和MMSE评分、ANP含量为负相关（P<0.05）,和Hcy含量、LDL-C含量为正相关（P<0.05）。小结:miR-let-7f在AD患者血清内高表达,可能参与了患者的发病与病情进展。第三部分miR-let-7f对SHSY-5Y细胞氧化损伤的作用机制研究目的:阐明miR-let-7f在SHSY-5Y细胞氧化损伤中的潜在作用,有望进一步明确miR-let-7f在AD发病机理中的分子机制。方法:培养SHSY-5Y细胞,制备H2O2损伤诱导氧化应激损伤模型,MTT检测细胞活力,流式细胞分析仪检测细胞凋亡情况,miR-let-7f模拟物、miR-let-7f-1抑制剂转染SHSY-5Y细胞,使用q RT-PCR和Western blot进行测量miR-let-7f、AKT-2和凋亡相关蛋白,萤光素酶报告基因检测miR-let-7f和AKT-2的靶向关系。结果:采用0、50、100、200、500μmol/L的H2O2引起SHSY-5Y氧化损伤,结果显示和未处理细胞相比,各剂量组的细胞活力均显着降低（P<0.05）,另外选取200μmol/L的H2O2用于后续实验。流式细胞仪对细胞凋亡检测显示,和对照组相比,应用200μmol/L的H2O2处理的SHSY-5Y细胞凋亡率显着升高（P<0.05）。和对照组相比,H2O2处理组Bcl-2蛋白表达降低,Bax、Caspase-3、Caspase-9蛋白表达升高（P<0.05）。采用miR-let-7f mimic、miR-let-7f inhibitor以及mimic NC、inhibitor NC分别转染SHSY-5Y细胞,q RT-PCR检测显示,相比mimic NC,miR-let-7f mimic组miR-let-7f表达显着升高;相比inhibitor NC,miR-let-7f inhibitor组miR-let-7f表达显着降低（P<0.05）。相比对照组,H2O2处理组细胞活力显着降低,而细胞凋亡率显着升高（P<0.05）;相比mimic NC,miR-let-7f mimic组细胞活力显着升高,而细胞凋亡率显着下降（P<0.05）;相比inhibitor NC,miR-let-7f inhibitor组细胞活力显着降低,而细胞凋亡率显着升高（P<0.05）。在明确miRNA-let-7f为潜在分子改善H2O2导致氧化损伤后,进行广泛生物学信息分析,以确定miRNA-let-7f的靶向基因。通过搜索各种数据库（micro RNA.org和Target Scan）显示,ALT-23’-UTR具有对应的配对和miR-let-7f结合应用,见图9。萤光素酶报告基因测定来检测miR-let-7f和AKT-2的关系,共转染的SHSY-5Y细胞的相对荧光素酶活性明显降低应用miR-let-7f和AKT-2的3’-UTR（P<0.05）。小结:miR-let-7f的上调减轻了H2O2诱发的通过靶向AKT-2对SHSY-5Y细胞的氧化损伤。这些发现为miR-let-7f在AD患者氧化损伤的发病机理中的作用提供了新的视角。
孙婷[9]（2021）在《新结构化合物生物碱异黄酮LY01和外泌体抗帕金森病的疗效及分子机制研究》文中研究表明中国有着丰富多彩的民族传统医药学,蒙医药学是其中的重要组成部分,具有相对完整的理论体系,丰富的临床实践以及较为完整的文献记载。蒙药嘎顺-包日其格,拉丁名为Sophora alopecuroidesL.,干燥全草和种子用药,能安五脏、定志益精,具有清热解毒、祛风燥湿、止痛杀虫的功效,临床上常用于湿热泻痢,疮疖溃疡,吞酸胃痛等多种疾病和症状的治疗,值得深入研究,从中筛选治疗重大疾病的创新药物。本实验室前期利用靶向筛选技术从嘎顺-包日其格中获得的新结构化合物LY01,分子量486,具有生物碱和异黄酮的双重结构,结构新颖。实验证明LY01能够抗神经损伤、减轻神经元慢性炎症,影响神经干细胞迁移、分化,具有抗神经退行性病变的作用,有应用前景,值得开发。但其药理作用和分子机制尚不清楚,亟待研究。帕金森病（Parkinson’s Disease,PD）,蒙医学称之为“彻彻热乎病”,属于“赫依”型白脉病。在蒙医药学中,白脉泛指神经,“源出脑中,向下循行”,分布到五脏六腑和四肢,主司运动和知觉等功能。蒙医学认为人体中保持着相互对立统一的状态,一旦人体受到外因干扰,致使平衡失调时,就会引起疾病。帕金森病是世界第二大神经退行性疾病,发病率高,现代医学治疗困难。其发病的机制至今仍然不明确,近年来外泌体在神经退行性疾病中的作用受到广泛关注。外泌体是一类从细胞内释放到外环境的膜性囊泡,由含有跨膜蛋白的双层脂质和一个内核组成,在细胞间信息交流和生物分子传递中发挥重大作用,易于进入细胞影响关键节点基因的mRNA活性,并参与众多生理和病理过程。目的本研究通过体内外实验研究蒙药嘎顺-包日其格抗白脉病关键活性成分LY01的药理作用和科学机制,评价其对帕金森病模型小鼠和细胞的神经保护作用,并研究LY01对帕金森病中外泌体的调节作用,从行为学、病理学和分子生物学等层面探索LY01在帕金森病模型中发挥神经保护作用的机制,为源于民族药资源宝库的新结构先导化合物的开发提供关键技术资料,阐释民族药抗白脉病的科学性。本研究研究内容分四部分。第一部分LY01对帕金森病模型小鼠的神经保护作用方法1)使用经典的神经毒性药物（1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶盐酸盐,MPTP）诱导法和C57BL/6小鼠复制帕金森病小鼠模型。20mg/kg MPTP,腹腔注射4次,每次间隔2 h。小鼠随机分为6组:正常对照组,模型对照组,LY01低剂量组,LY01中剂量组,LY01高剂量组,阳性对照组（红景天苷,50mg/kg,Salidroside）。LY01给药方案是在第一次注射MPTP前1小时,腹腔分别注射0.067 mg/kg,0.2mg/kg,0.6mg/kg浓度的LY01,之后每天一次,共计10天。2)利用转棒测试法评价小鼠的运动协调和平衡能力;3)利用组织免疫荧光、免疫组化和组织免疫印迹技术检测小鼠脑内黑质致密部和纹状体组织中多巴胺能神经元和酪氨酸羟化酶（TH）蛋白水平;4)利用RT-PCR技术检测小鼠脑内黑质致密部和纹状体组织中炎症相关因子 IL-10、IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-4、TGF-β 的 mRNA 水平;5)利用常规生物化学法检测血清中超氧化物歧化酶和丙二醛水平;6)利用组织免疫印迹法检测黑质致密部和纹状体组织中凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax蛋白水平。结果1)LY01显着增加了帕金森病模型小鼠在转棒上的运动时间（p<0.01）;2)LY01显着减少帕金森病模型小鼠黑质致密部多巴胺能神经元丢失（p<0.05）,增加纹状体组织中多巴胺神经元的神经纤维,增加黑质致密部和纹状体组织中TH蛋白水平（p<0.05）;3)LY01显着降低了 IL-1β、IL-6的mRNA表达水平,升高了 IL-4、TGF-β mRNA 水平（p<0.05）;4)LY01显着降低小鼠血清中丙二醛水平（p<0.001）,增加超氧化物歧化酶水平（p<0.01）;5)LY01显着增加小鼠脑内黑质致密部和纹状体组织中Bcl-2/Bax水平（p<0.05）。结论LY01具有改善帕金森病模型小鼠运动平衡能力,减少脑内黑质致密部和纹状体组织中神经元丢失,减轻氧化应激损伤,缓解神经炎症,减少细胞凋亡的作用。第二部分LY01对帕金森病细胞模型的保护作用方法1)不同浓度的LY01（3.125μM、6.25 μM、12.5 μM）处理人源神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y,预保护1 h后,使用1-甲基-4-苯基-2,3-二氢吡啶离子（MPP+）建立帕金森病细胞模型,共同处理细胞24 h;2)MTT法检测SH-SY5Y细胞活力;3)常规生物化学法检测细胞内总抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）水平;4)利用脂多糖（LPS）诱导小鼠小胶质细胞BV2建立抗炎评价模型,不同浓度的 LY01（3.125 μM、6.25 μM、12.5 μM）预处理 1h 后加入含LPS的培养基,共同处理细胞24 h后,RT-PCR法检测BV2细胞中 IL-1β、IL-6、TNF-α 和 iNOS 的 mRNA 表达量。结果1)浓度为 3.125μM、6.25μM、12.5 μM 和 25μM 的 LY01 均能够增加 SH-SY5Y 细胞的活力（p<0.05,p<0.01,p<0.05,p<0.41）;2)浓度为 3.125 μM、6.25 μM、12.5 μM 的 LY01 均能够增加 SH-SY5Y 细胞 SOD 和 T-AOC,显着减少 MDA 水平（p<0.01,p<0.01,p<0.05）;3)浓度为 3.125 μM、6.25 μM、12.5 的 LY01 显着减少 IL-1β、IL-6、TNF-α 和 iNOS 的 mRNA 表达量（p<0.01,p<0.05）。结论LY01改善MPP+引起的SH-SY5Y细胞活力降低,减轻氧化应激损伤;减轻LPS诱导的BV2细胞炎症反应。第三部分LY01对帕金森病模型小鼠外泌体的调节作用方法1)使用MPTP诱导C57BL/6小鼠建立帕金森病小鼠模型。小鼠随机分为三组:正常对照组,模型对照组,LY01高剂量组。在第一次注射MPTP前1小时,腹腔注射0.6 mg/kg的LY01,之后每天一次,共计10天。2)使用广泛靶向的代谢组学评估正常对照组和模型对照组小鼠血清和大脑中外泌体代谢物的差异;3)使用广泛靶向的代谢组学评估模型对照组小鼠和LY01治疗小鼠之间血清外泌体代谢物的差异。结果1)代谢组学结果显示,PD模型小鼠和对照组小鼠血清中的外泌体代谢物有69个具有显着差异,脑组织中外泌体代谢物有148个具有显着差异,血清和脑组织外泌体中共有的差异代谢物有25个;2)PD模型小鼠和LY01治疗小鼠的血清外泌体代谢物共有15个具有显着差异;3)上述差异表达的代谢物显着富集酪氨酸代谢通路、嘌呤代谢通路,烟酸和烟酰胺代谢通路,以及苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成等与帕金森病相关的通路中。结论LY01治疗帕金森病的机制与调控外泌体代谢物L-多巴有关,其中的机制与酪氨酸代谢通路、嘌呤代谢通路,烟酸和烟酰胺代谢通路,以及苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成等通路相关。第四部分外泌体对帕金森病模型小鼠的神经保护作用及机制研究方法1)小鼠随机分为三组:正常对照组,模型对照组,外泌体组。在MPTP诱导的C57BL/6小鼠建立帕金森病小鼠模型上,注射健康志愿者血液来源的外泌体,共计4次;2)利用转棒测试法评价小鼠的运动协调和平衡能力;3)利用组织免疫荧光、免疫组化和组织免疫印迹技术检测小鼠脑内黑质致密部和纹状体组织中多巴胺能神经元和TH蛋白水平;4)利用实时荧光定量PCR技术检测小鼠脑内黑质致密部和纹状体组织中炎症相关因子的mRNA水平;5)利用常规生物化学法检测血清中SOD和MDA水平;6)利用组织免疫印迹法检测黑质致密部和纹状体组织中凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax蛋白水平。结果1)外泌体显着增加了帕金森病模型小鼠在转棒上的运动时间（p<0.01）;2)外泌体显着减少帕金森病模型小鼠黑质致密部多巴胺能神经元丢失（p<0.0001）,增加纹状体组织中多巴胺神经元的神经纤维,增加黑质致密部和纹状体组织中TH蛋白水平（p<0.05）;3)外泌体显着降低了 IL-1β、IL-6的mRNA表达水平,提高了IL-4、IL-10、TGF-β mRNA 水平（p<0.05）;4)外泌体显着降低小鼠血清中MDA水平（p<0.01）,增加SOD水平（p<0.05）;5)外泌体显着增加小鼠脑内黑质致密部和纹状体组织中Bcl-2/Bax水平（p<0.05）。结论来自健康志愿者的血源性外泌体缓解了小鼠受损的运动协调性,挽救了 PD模型小鼠黑质和纹状体多巴胺能神经元的损失,恢复PD模型小鼠氧化应激、神经炎症和细胞凋亡的内稳态。综上,本研究证实了 LY01对帕金森病模型小鼠和细胞具有神经保护作用,发现其中的机制与LY01调节外泌体代谢物有关,并进一步证实外泌体参与帕金森病的发病机制。本研究发掘了民族药嘎顺-包日其格治疗白脉病的优势,为其临床使用提供了理论基础和科学依据,为活性成分LY01发挥神经保护作用提供了研究基础,增加了研发价值。
张瑜[10]（2021）在《薯蓣皂苷元诱导自噬对帕金森病细胞模型的保护作用研究》文中研究说明目的:探讨薯蓣皂苷元（Diosgenin,DG）诱导自噬以及对帕金森病细胞模型的保护作用研究。方法:1)DG干预稳定表达GFP-LC3的大鼠肾细胞（Normal Rat Kidney cell,NRK）,使用激光共聚焦显微镜检测自噬体数目的变化,Western Blot检测NRK细胞中p62、LC3-II蛋白表达变化;2)DG干预PC12细胞,MTT法和平板克隆形成实验检测DG对PC12细胞的毒性作用,Western Blot检测自噬相关蛋白p62、LC3-II表达变化以及PI3K/AKT/m TOR自噬相关信号通路蛋白表达;3)DG干预帕金森疾病（Parkinson disease,PD）细胞模型,Western Blot检测细胞中α-突触核蛋白（α-Synuclein,α-Syn）、LC3-II蛋白表达,激光共聚焦显微镜检测细胞内活性氧变化和Mito Tracker Red染色观察线粒体变化。结果:1)浓度为15μg/m L的DG作用于NRK细胞12 h后,DG组较空白组（Control,CT）自噬体数目显着增多（P<0.001）,p62蛋白表达显着降低（P<0.05）、LC3-II蛋白表达显着升高（P<0.05）;2)MTT和平板克隆形成实验结果表明,薯蓣皂苷元浓度在15μg/m L时对PC12细胞活力没有影响;DG干预PC12细胞12 h后,免疫荧光结果显示,DG组较空白组LC3自噬体显着增多（P<0.001）;Western Blot结果显示,DG组较空白组中p62蛋白表达显着减少（P<0.05）,LC3-II蛋白表达显着升高（P<0.05）,而DG联合自噬抑制剂氯喹组（Chloroquine,CQ）较单独应用氯喹组LC3-II蛋白表达显着升高（P<0.01）。DG组与空白组比较p-PI3K、p-AKT、p-m TOR蛋白水平均显着降低（P<0.05）;3)DG干预PD细胞模型,较空白组α-突触核蛋白表达显着减少（P<0.05）,LC3-II蛋白表达显着增多（P<0.05）,氯喹联合薯蓣皂苷元组较DG组α-突触核蛋白表达显着增高（P<0.05）,且较氯喹组LC3-II蛋白表达显着升高（P<0.05）。DG干预鱼藤酮（Rotenone,ROT）损伤的PC12细胞帕金森病模型后,鱼藤酮+DG组较鱼藤酮组细胞内活性氧显着降低（P<0.001）,线粒体损伤减弱,而鱼藤酮+薯蓣皂苷元+氯喹组较鱼藤酮+DG组细胞内活性氧显着升高（P<0.001）,线粒体损伤严重;结论:DG可能是通过诱导自噬降解细胞中α-突触核蛋白、清除细胞内活性氧和减小线粒体损伤而改善了帕金森病细胞模型的损伤作用。
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
| 主要英文缩略词表 (Abbreviations) |
| 摘要 |
| abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 研究目的 |
| 1.3 研究意义 |
| 2 文献综述 |
| 2.1 阿尔茨海默病与β-淀粉样蛋白聚集的相关研究 |
| 2.1.1 阿尔茨海默病概述 |
| 2.1.2 β-淀粉样蛋白聚集概述 |
| 2.2 运动对阿尔茨海默病的延缓及其机制研究 |
| 2.2.1 运动延缓阿尔茨海默病的动物实验 |
| 2.2.2 运动延缓阿尔茨海默病的人体实验 |
| 2.2.3 运动影响β-淀粉样蛋白致病的机制探讨 |
| 2.3 运动影响色氨酸及代谢物的研究 |
| 2.3.1 运动影响色氨酸和血清素的人体实验 |
| 2.3.2 运动影响色氨酸和血清素的动物实验 |
| 2.3.3 运动时段对褪黑素的影响 |
| 2.4 抑制剂与β-淀粉样蛋白相互作用的相关研究 |
| 2.4.1 天然小分子抑制β-淀粉样蛋白聚集的相关研究 |
| 2.4.2 内源性小分子抑制β-淀粉样蛋白聚集的相关研究 |
| 2.4.3 色氨酸及代谢物抑制β-淀粉样蛋白聚集的相关研究 |
| 3 研究方案 |
| 4 研究方法 |
| 4.1 文献分析法 |
| 4.2 分子动力学方法 |
| 4.2.1 常规分子动力学模拟 |
| 4.2.2 副本交换分子动力学模拟 |
| 4.2.3 常用软件 |
| 4.2.4 分子力场 |
| 4.2.5 分子力场的相互作用项 |
| 4.2.6 小分子力场构建与结构处理 |
| 4.2.7 模拟细节 |
| 4.2.8 分析方法 |
| 5 研究内容 |
| 5.1 色氨酸抑制阿尔茨海默病β-淀粉样蛋白聚集、破坏β-淀粉样蛋白原纤维的分子机理研究 |
| 5.1.1 前言 |
| 5.1.2 材料与方法 |
| 5.1.3 结果与讨论 |
| 5.1.4 结论 |
| 5.2 血清素抑制阿尔茨海默病β-淀粉样蛋白聚集、破坏β-淀粉样蛋白原纤维的分子机理研究 |
| 5.2.1 前言 |
| 5.2.2 材料与方法 |
| 5.2.3 结果与讨论 |
| 5.2.4 结论 |
| 5.3 血清素/质子化血清素破坏β-淀粉样蛋白原纤维的分子机理研究 |
| 5.3.1 前言 |
| 5.3.2 材料与方法 |
| 5.3.3 结果与讨论 |
| 5.3.4 结论 |
| 5.4 褪黑素抑制阿尔茨海默病β-淀粉样蛋白聚集、破坏β-淀粉样蛋白原纤维的分子机理研究 |
| 5.4.1 前言 |
| 5.4.2 材料与方法 |
| 5.4.3 结果与讨论 |
| 5.4.4 结论 |
| 5.5 色氨酸/色氨酸+血清素破坏β-淀粉样蛋白原纤维的分子机理研究 |
| 5.5.1 前言 |
| 5.5.2 材料与方法 |
| 5.5.3 结果与讨论 |
| 5.5.4 结论 |
| 参考文献 |
| 6 总结与展望 |
| 6.1 总结 |
| 6.2 展望 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
| 攻读学位期间的科研工作 |
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 第一章 电针通过SNHG1/IGF2BP2/Beclin1 轴改善AD大鼠的认知功能和LTP抑制 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 动物分组、动物模型的建立及处理 |
| 2.3 AD细胞模型的建立 |
| 2.4 SNHG1 的检测 |
| 2.5 细胞转染 |
| 2.6 细胞增殖和凋亡检测 |
| 2.7 DNA损伤和修复检测 |
| 2.8 Edu增殖水平的检测 |
| 2.9 蛋白检测 |
| 2.10 mRNA稳定性检测 |
| 2.11 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 AD动物及细胞模型的建立及鉴定 |
| 3.2 电针改善AD大鼠认知功能及LTP抑制作用 |
| 3.3 生物信息学分析表明SNHG1可能通过自噬途径参与AD进展的调控 |
| 3.4 SNHG1/IGF2BP2/Beclin1 抑制AD状态神经元的生物活性 |
| 3.5 SNHG1 促进AD神经元凋亡和DNA损伤 |
| 3.6 回复实验证实电针治疗AD是通过诱导自噬和抑制SNHG1来实现的 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二章 SNHG1 通过FTO/NRF2 轴促进铁死亡和有氧糖酵解导致AD进展 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 AD细胞模型的建立 |
| 2.3 SNHG1 的检测 |
| 2.4 细胞的转染 |
| 2.5 细胞增殖和凋亡检测 |
| 2.6 DNA损伤和修复检测 |
| 2.7 Edu增殖水平的检测 |
| 2.8 铁死亡相关检测 |
| 2.9 蛋白检测 |
| 2.10 mRNA稳定性检测 |
| 2.11 Me-RIP检测NRF2 mRNA的 m6A修饰以及SNHG1 对其的影响 |
| 2.12 RIP实验检测FTO和 SNHG1/NRF2 mRNA存在互作 |
| 2.13 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 SNHG1在AD细胞中表达上调,促进细胞死亡和功能损伤 |
| 3.2 SNHG1 基因敲减可抑制AD细胞的有氧糖酵解 |
| 3.3 SNHG1 通过NRF2 途径促进了AD的铁死亡 |
| 3.4 SNHG1与NRF2 mRNA结合促进其稳定性 |
| 3.5 SNHG1 通过与RNA脱甲基转移酶FTO结合下调NRF2 的表达 |
| 3.6 SNHG1/FTO/NRF2 轴促进AD增殖和功能损伤 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三章 全文总结 |
| 1 结论 |
| 2 创新点 |
| 3 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 综述 非编码RNA和外泌体在神经退行性疾病中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 摘要 |
| abstract |
| 符号说明 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 神经退行性疾病介绍 |
| 1.1.1 神经退行性疾病概述 |
| 1.1.2 蛋白FUS、TIA1与神经退行性疾病的关系 |
| 1.2 蛋白FUS、TIA1的结构与功能 |
| 1.2.1 FUS结构和功能 |
| 1.2.2 TIA1结构和功能 |
| 1.3 蛋白质聚集和神经退行性疾病 |
| 1.3.1 蛋白质聚集 |
| 1.3.2 淀粉样纤维 |
| 1.3.3 FUS和TIA1的聚集 |
| 1.4 液液相分离和神经退行性疾病 |
| 1.4.1 液液相分离与无膜细胞器概述 |
| 1.4.2 液液相分离和神经退行性疾病的关系 |
| 1.4.3 FUS、TIA1与液液相分离 |
| 1.5 翻译后修饰调控液液相分离和聚集 |
| 1.6 蛋白聚集性质表征手段 |
| 1.6.1 ANS荧光光谱 |
| 1.6.2 硫磺素-T(ThT)荧光结合实验 |
| 1.6.3 透射电子显微镜 |
| 1.6.4 原子力显微镜 |
| 1.6.5 聚集体毒性表征:MTT实验 |
| 1.6.6 圆二色谱 |
| 1.6.7 固体核磁共振波谱 |
| 1.6.8 分子动力学模拟 |
| 1.7 液液相分离性质表征手段 |
| 1.7.1 荧光显微镜或共聚焦显微镜观察 |
| 1.7.2 浊度测量 |
| 1.7.3 荧光漂白恢复实验 |
| 1.8 本论文研究目的与意义 |
| 1.9 本论文主要研究内容 |
| 第二章 FUS淀粉样聚集片段的确定及其对相分离的影响 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 实验仪器和实验试剂 |
| 2.2.2 多肽储液配制 |
| 2.2.3 透射电镜 |
| 2.2.4 ANS荧光结合实验 |
| 2.2.5 淀粉样纤维热稳定性实验 |
| 2.2.6 硫黄素T(ThT)荧光分析 |
| 2.2.7 原子力显微镜观察 |
| 2.2.8 多肽二级结构表征 |
| 2.2.9 重组蛋白的基因克隆 |
| 2.2.9.1 PCR反应扩增 |
| 2.2.9.2 琼脂糖凝胶电泳和胶回收 |
| 2.2.9.3 目的片段、载体双酶切 |
| 2.2.9.4 连接 |
| 2.2.9.5 转化 |
| 2.2.9.6 重组质粒鉴定 |
| 2.2.9.7 重组质粒的提取和转化 |
| 2.2.10 重组蛋白的表达纯化 |
| 2.2.10.1 重组蛋白的表达 |
| 2.2.10.2 重组蛋白分离 |
| 2.2.10.3 重组蛋白的纯化 |
| 2.2.11 SDS-PAGE蛋白电泳 |
| 2.2.12 蛋白相分离 |
| 2.2.13 荧光漂白荧光恢复实验(FRAP) |
| 2.3 实验结果与讨论 |
| 2.3.1 FUS-LCD内多肽片段淀粉样预测 |
| 2.3.2 多肽的聚集性质观察 |
| 2.3.3 淀粉样纤维的温度可逆性 |
| 2.3.4 多肽对FUS的LCD的相分离影响 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 特定位点磷酸化对FUS相分离和聚集的调控机制研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 实验仪器和实验试剂 |
| 3.2.2 多肽的聚集实验 |
| 3.2.3 细胞毒性实验 |
| 3.2.4 多肽的种子实验 |
| 3.2.5 相分离和FRAP实验 |
| 3.2.6 固态核磁共振光谱 |
| 3.2.7 从核磁共振约束模拟结构模型 |
| 3.2.8 无限制的粗粒化模拟 |
| 3.2.9 平均力势计算 |
| 3.3 实验结果与讨论 |
| 3.3.1 丝氨酸磷酸化对R2纤维形成的影响 |
| 3.3.2 Ser61磷酸化对细胞毒性的影响 |
| 3.3.3 Ser61磷酸化对种子传播的影响 |
| 3.3.4 Ser61的磷酸化破坏R2诱导的FUS-LCD的液滴到纤维的转变 |
| 3.3.5 Ser61的磷酸化影响的分子机制 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 TIA1的液液相分离性质表征 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 实验仪器和实验试剂 |
| 4.2.2 重组质粒的构建 |
| 4.2.3 重组蛋白的表达纯化 |
| 4.2.4 蛋白相分离的浊度表征 |
| 4.2.5 共聚焦显微镜表征重组蛋白液液相分离的液滴 |
| 4.2.5.1 体外蛋白相分离现象观察 |
| 4.2.5.2 细胞内蛋白相分离现象观察 |
| 4.2.6 荧光漂白恢复实验 |
| 4.3 结果分析与讨论 |
| 4.3.1 原核表达体系的构建 |
| 4.3.2 蛋白的表达纯化 |
| 4.3.3 蛋白TIA1的体外相分离性质表征 |
| 4.3.4 真核质粒的构建 |
| 4.3.5 蛋白TIA1的细胞内相分离性质表征 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 脯氨酸相关突变调控TIA1的相分离和聚集 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验部分 |
| 5.2.1 实验仪器和实验试剂 |
| 5.2.2 基因定点突变 |
| 5.2.3 基因Gibson组装 |
| 5.2.4 蛋白的表达纯化 |
| 5.2.5 ThT荧光实验 |
| 5.2.6 TEM观察蛋白聚集形貌 |
| 5.2.7 共聚焦显微镜表征重组蛋白液液相分离的液滴 |
| 5.2.8 液滴荧光漂白恢复实验 |
| 5.2.9 细胞内蛋白液滴的定位 |
| 5.2.10 热激诱发应激颗粒 |
| 5.3 结果分析与讨论 |
| 5.3.1 突变的原核和真核重组质粒的构建 |
| 5.3.2 脯氨酸相关突变对蛋白的相分离的影响 |
| 5.3.3 脯氨酸相关突变对蛋白的聚集的影响 |
| 5.3.4 共聚焦显微镜观察突变对细胞内蛋白的液液相分离与聚集的影响 |
| 5.3.5 突变对细胞内蛋白的液液相分离与聚集的影响 |
| 5.3.6 脯氨酸突变对应激颗粒消失动力学的影响 |
| 5.3.7 突变影响的机理探讨 |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 总结与展望 |
| 6.1 总结 |
| 6.2 本论文创新点 |
| 6.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 研究成果及发表论文 |
| 作者简介 |
| 导师简介 |
| 博士研究生学位论文答辩委员会决议书 |
| 英文缩略词表(Abbreviations and acronyms) |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一章 NEFH/NEFM/NEFL在中国散发性肌萎缩侧索硬化症中的遗传学研究 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 材料和方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 结论 |
| 第二章 sALS的高风险变异NEFH(p.Ser787Arg)的细胞功能初步研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述:神经丝在肌萎缩侧索硬化症研究中的现状 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一章 下调HMGA1抑制细胞自噬，加剧多巴胺能神经元死亡 |
| 1. 引言 |
| 2.材料和试剂 |
| 3. 实验方法 |
| 4. 结果 |
| 5. 讨论 |
| 6. 小结 |
| 第二章 HMGA1与miR-103/107形成负反馈环路协同调控MPP~+诱导的MN9D细胞自噬和死亡 |
| 1. 引言 |
| 2. 材料和试剂 |
| 3. 实验方法 |
| 4. 结果 |
| 5. 讨论 |
| 6. 小结 |
| 第三章 下调HMGA1在MPTP小鼠模型中加剧多巴胺神经元死亡 |
| 1. 引言 |
| 2. 材料和试剂 |
| 3. 实验方法 |
| 4. 结果 |
| 5. 讨论 |
| 6. 小结 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 中英文缩略词对照表 |
| 攻读学位期间成果 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.结论 |
| 参考文献 |
| 综述 自噬与脑损伤 |
| 参考文献 |
| 作者简介及攻读学位期间科研成果 |
| 致谢 |
| 学位论文数据集 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 论文创新点 |
| Sigma1R 对大鼠脊髓运动神经元的功能影响 |
| 第一章 背景概述 |
| 1.1 肌萎缩性脊髓侧索硬化症概述 |
| 1.2 Sigma1R概述 |
| 1.2.1 Sigma1R的发现及其分子药理学特征 |
| 1.2.2 Sigma1R的结构和定位 |
| 1.2.3 Sigma1R的分子功能 |
| 1.2.4 Sigma1R作为配体伴侣 |
| 1.2.5 Sigma1R的人类遗传学研究 |
| 1.3 Sigma1R与神经退行性疾病 |
| 1.4 ALS与脊髓运动神经元 |
| 1.5 转录组分析 |
| 1.6 电生理记录在研究神经元特性中的应用 |
| 1.6.1 动作电位 |
| 1.6.2 mEPSC微小兴奋性突触后电流 |
| 1.7 神经元功能与神经元膜表面各种通道的关系 |
| 第二章 Sigma1R敲除影响脊髓运动神经元的转录组分析及验证 |
| 引言 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验动物及分组 |
| 2.1.2 主要实验仪器及耗材 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要试剂配制和用具预处理 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 大鼠组织样本转录组测序分析 |
| 2.2.2 大鼠脊髓组织实时荧光定量PCR |
| 2.3 分析结果 |
| 2.3.1 数据产出及质控 |
| 2.3.2 差异基因分析 |
| 2.3.3 上调基因功能注释 |
| 2.3.4 下调基因功能注释 |
| 2.3.5 Quantitative Real-time PCR验证 |
| 2.4 小结与讨论 |
| 2.4.1 上调基因的KEGG富集功能促进神经损伤 |
| 2.4.2 下调基因的KEGG富集功能影响神经的兴奋和抑制过程 |
| 2.4.3 上调基因的GO富集功能增强神经元和外周神经发育 |
| 2.4.4 下调基因的GO富集功能影响神经递质水平和突触功能 |
| 第三章 Sigma1R敲除对大鼠脊髓运动神经元的影响 |
| 引言 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 实验动物及分组 |
| 3.1.2 主要实验仪器及耗材 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.1.4 主要试剂配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 实验动物的基因组提取 |
| 3.2.2 Sigma1R敲除对大鼠脊髓运动神经元数量的影响 |
| 3.2.3 Sigma1R敲除对大鼠脊髓运动神经元兴奋性突触数量的影响 |
| 3.2.4 Sigma1R敲除对大鼠脊髓运动神经元突触超微结构的影响 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 Sigma1R敲除大鼠脊髓运动神经元数量和面积都存在变化 |
| 3.3.2 Sigma1R敲除大鼠脊髓运动神经元胞体兴奋性突触数量存在变化 |
| 3.3.3 Sigma1R敲除对脊髓运动神经元突触超微结构的影响 |
| 3.4 小结与讨论 |
| 第四章 Sigma1R敲除对大鼠脊髓运动神经元电生理学功能特性的影响 |
| 引言 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 实验动物及分组 |
| 4.1.2 主要实验仪器及耗材 |
| 4.1.3 实验所需试剂配制 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 大鼠脊髓脑片的制备和细胞活力评估 |
| 4.3.2 Sigma1R敲除对大鼠脊髓运动神经元的基本电生理性质的影响 |
| 4.3.3 Sigma1R敲除对大鼠脊髓运动神经元动作电位的影响 |
| 4.3.4 Sigma1R敲除对大鼠脊髓运动神经元兴奋性特性的影响 |
| 4.3.5 Sigma1R敲除对大鼠脊髓运动神经元突触后电流(PSC)的影响 |
| 4.3.6 Sigma1R敲除对大鼠脊髓运动神经元m EPSC的影响 |
| 4.4 小结与讨论 |
| 总结与展望 |
| 肝细胞癌中SNHG1 的表达和基因调控网络的研究 |
| 第五章 背景概述 |
| 5.1 肝癌概述 |
| 5.1.1 肝癌的形成机制 |
| 5.1.2 肝癌相关的部分基因 |
| 5.1.3 肝癌的筛查 |
| 5.1.4 肝癌的治疗 |
| 5.2 肝癌发生与miRNA |
| 5.2.1 微小RNA |
| 5.2.2 miRNA沉默基因表达的机制 |
| 5.2.3 miRNA参与癌症发生的机制 |
| 第六章 肝细胞癌中SNHG1 的表达研究 |
| 引言 |
| 6.1 材料 |
| 6.1.1 主要数据库 |
| 6.1.2 主要软件 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 数据下载和组织 |
| 6.2.2 基因表达分析 |
| 6.2.3 功能分析 |
| 6.2.4 代谢通路分析 |
| 6.3 实验结果 |
| 6.3.1 RNA在 HCC中的表达 |
| 6.3.2 差异表达基因的功能注释和富集分析 |
| 6.3.3 差异表达基因的功能调控网络 |
| 6.3.4 肝癌中差异表达基因所影响的代谢通路 |
| 6.4 小结与讨论 |
| 第七章 肝细胞癌中SNHG1 的基因调控网络的研究 |
| 引言 |
| 7.1 实验材料 |
| 7.1.1 主要数据库 |
| 7.1.2 主要软件 |
| 7.2 实验方法 |
| 7.2.1 数据下载和组织 |
| 7.2.2 ceRNA网络分析 |
| 7.2.3 单变量生存分析 |
| 7.2.4 单细胞分析 |
| 7.3 实验结果 |
| 7.3.1 肝癌中的生物相互作用网络 |
| 7.3.2 肝细胞癌共表达基因的单因素生存分析 |
| 7.3.3 血管内皮细胞和巨噬细胞SNHG1 相关mRNA的表达 |
| 7.4 小结与讨论 |
| 总结与展望 |
| 附表 |
| 参考文献 |
| 攻博期间发表的科研成果 |
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 阿尔茨海默病患者血清氧化应激指标表达及与认知功能障碍相关性 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 miR-let-7f在阿尔茨海默病患者的血清表达及临床意义 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 miR-let-7f对SHSY-5Y细胞氧化损伤的作用机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 阿尔茨海默病病理生理机制中氧化应激的作用与干预策略研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 蒙医“白脉病”与现代医学神经系统疾病的联系 |
| 1.1.1 蒙医“白脉”理论概述 |
| 1.1.2 蒙医对白脉病的认识 |
| 1.1.3 白脉病与现代医学神经系统疾病的联系 |
| 1.1.4 白脉病与帕金森病的联系 |
| 1.2 帕金森病研究进展 |
| 1.2.1 帕金森病概述 |
| 1.2.2 帕金森病的临床症状 |
| 1.2.3 帕金森病的病理特征 |
| 1.2.4 帕金森病的影响因素 |
| 1.2.5 帕金森病的诊断 |
| 1.2.6 帕金森病的发病机制 |
| 1.2.7 帕金森病的治疗 |
| 1.3 外泌体在帕金森病研究中的进展 |
| 1.3.1 外泌体概述 |
| 1.3.2 外泌体与神经退行性疾病 |
| 1.3.3 外泌体参与帕金森发病 |
| 1.3.4 外泌体作为帕金森病的生物标志物 |
| 1.3.5 外泌体的治疗作用 |
| 1.4 嘎顺-包日其格在传统医学中的应用及其现代药学研究 |
| 1.4.1 传统医学应用 |
| 1.4.2 现代药物化学研究 |
| 1.4.3 现代药理学研究 |
| 1.4.4 研究意义 |
| 1.4.5 新化合物 |
| 第二章 LY01对帕金森病模型小鼠的神经保护作用 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 仪器 |
| 2.1.3 试剂 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 动物在体给药 |
| 2.2.2 转棒测试 |
| 2.2.3 收取样本 |
| 2.2.4 免疫组织化学染色 |
| 2.2.5 免疫荧光染色 |
| 2.2.6 组织总蛋白提取 |
| 2.2.7 BCA法测定蛋白浓度 |
| 2.2.8 Western blot |
| 2.2.9 组织RNA提取和实时荧光定量PCR |
| 2.2.10 超氧化物歧化酶和丙二醛含量测定 |
| 2.2.11 统计学处理 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 LY01改善帕金森病模型小鼠运动能力 |
| 2.3.2 LY01减少帕金森病模型小鼠多巴胺能神经元丢失 |
| 2.3.3 LY01减轻帕金森病模型小鼠黑质致密部和纹状体组织的神经炎症 |
| 2.3.4 LY01减轻帕金森病模型小鼠的氧化应激损伤 |
| 2.3.5 LY01减少帕金森病模型小鼠的黑质致密部和纹状体组织中凋亡相关蛋白 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 LY01对帕金森病模型细胞的保护作用 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 实验细胞 |
| 3.1.2 仪器 |
| 3.1.3 试剂 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 细胞培养 |
| 3.2.2 建立帕金森病细胞模型 |
| 3.2.3 MTT检测细胞活力 |
| 3.2.4 细胞总蛋白的提取 |
| 3.2.5 细胞总抗氧化能力、超氧化物歧化酶和丙二醛含量测定 |
| 3.2.6 建立炎症细胞模型 |
| 3.2.7 细胞RNA提取和实时荧光定量PCR |
| 3.2.8 统计学处理 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 LY01增加PD模型细胞的活力 |
| 3.3.2 LY01减轻PD模型细胞的氧化应激损伤 |
| 3.3.3 LY01减轻LPS诱导的BV2细胞的神经炎症 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 LY01对帕金森病模型小鼠外泌体的调节作用 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 仪器 |
| 4.1.3 试剂 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 提取血清外泌体 |
| 4.2.2 外泌体处理 |
| 4.2.3 色谱质谱采集条件 |
| 4.2.4 数据分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 鉴定血清外泌体形态、粒径和浓度 |
| 4.3.2 帕金森病模型小鼠与正常小鼠之间差异表达的代谢产物 |
| 4.3.3 LY01对帕金森病模型小鼠血清外泌体中代谢物的影响 |
| 4.3.4 LY01调控差异代谢物统计及分析 |
| 4.3.5 LY01调控差异代谢物KEGG分类及富集分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 外泌体对帕金森病模型小鼠的神经保护作用及机制研究 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 实验动物 |
| 5.1.2 仪器 |
| 5.1.3 试剂 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 采集健康志愿者血清外泌体 |
| 5.2.2 外泌体蛋白定量(microBCA法) |
| 5.2.3 动物给药 |
| 5.2.4 免疫组织化学染色 |
| 5.2.5 免疫荧光染色 |
| 5.2.6 组织总蛋白提取和蛋白浓度测定 |
| 5.2.7 Western blot |
| 5.2.8 组织RNA提取和实时荧光定量PCR |
| 5.2.9 超氧化物歧化酶和丙二醛含量测定 |
| 5.2.10 统计学处理 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 血清外泌体对PD模型小鼠运动能力的影响 |
| 5.3.2 血清外泌体对PD模型小鼠多巴胺神经元的影响 |
| 5.3.3 血清外泌体调节黑质致密部和纹状体组织中炎症和抗炎因子的mRNA水平 |
| 5.3.4 血清外泌体减轻PD模型小鼠氧化应激损伤 |
| 5.3.5 血清外泌体调节PD模型小鼠黑质致密部和纹状体组织中凋亡相关蛋白 |
| 5.3.6 血清外泌体代谢物作为PD的潜在生物标志物 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 总结及展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 中英文缩略词对照表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 研究内容与方法 |
| 1 实验材料与设备 |
| 1.1 材料与试剂 |
| 1.2 实验仪器 |
| 2 实验内容与方法 |
| 2.1 薯蓣皂苷元诱导PC12 细胞自噬的影响 |
| 2.2 薯蓣皂苷元诱导自噬对帕金森病细胞模型的保护作用 |
| 3 质量控制 |
| 3.1 样本控制 |
| 3.2 实验技术 |
| 3.3 仪器质控 |
| 4 统计学处理 |
| 5 技术路线图 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 天然化合物在神经退行性疾病中的应用及研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
| 新疆医科大学硕士研究生学位论文 导师评阅表 |
