抑癌基因PTEN在食管癌中的表达

一、抑癌基因PTEN在食管癌中的表达（论文文献综述）

冯健^[1]（2020）在《长链非编码RNA CASC2在食管鳞状细胞癌中的作用研究》文中研究表明目的:研究长链非编码RNA CASC2在食管鳞状细胞癌及其对应癌旁组织的表达差异,并初步探究lncRNACASC2在食管鳞状细胞癌中的作用。方法:首先,我们利用PCR检测了 lncRNACASC2在食管鳞癌组织和癌旁组织中的表达水平;同时利用qPCR技术检测了多种食管鳞癌细胞株及正常上皮细胞中lncRNACASC2的表达结果。其次,基于以上研究,为了探究lncRNACASC2在食管癌中所发挥的生物学功能,我们在食管鳞癌细胞EC109中分别转染CASC2 siRNA后进行培养,并收集EC109细胞,通过qPCR实验检测细胞中lncRNA CASC2的表达以及转染效率,观察lncRNACASC2在细胞水平对食管癌细胞增殖的影响。此外,为进一步探明lncRNA CASC2对食管癌细胞生长增殖的影响,我们构建CASC2 siRNA慢病毒和CASC2过表达慢病毒及其相对应的对照慢病毒,构建慢病毒后先转染至食管鳞癌细胞,通过对细胞荧光拍照观察慢病毒侵染效果,进一步验证lncRNACASC2在细胞水平对食管鳞癌细胞增殖的影响。最后,在动物水平上构建食管癌裸鼠皮下瘤模型,利用HE染色,Tunnel染色,免疫组化等实验进一步检测CACS2对食管鳞癌的作用。结果:本课题实验结果表明与食管鳞癌患者癌旁组织相比,lncRNACASC2癌组织中的表达下降;同时通过对多种食管鳞癌细胞株及正常上皮细胞株中lncRNA CASC2的检测,证实其在食管鳞癌细胞中的表达也低于正常食管上皮细胞;而在食管鳞癌细胞中CASC2表达增加能够降低细胞的增殖,其表达降低后则促进癌细胞增殖,表明lncRNA CASC2在食管鳞癌中作为抑癌基因发挥作用,一定程度抑制了食管鳞癌细胞的增殖;此外,为了探究CASC2在动物提体内对食管鳞癌的影响,我们构建了食管鳞癌皮下瘤小鼠,并发现体内实验结果与细胞结果一致,即CASC2表达增加可减缓细胞的增殖抑制肿瘤的形成,CASC2表达降低后可加快细胞增殖促进肿瘤的形成;CASC2表达变化对食管癌肿瘤组织中细胞凋亡的影响。结论:lncRNA CASC2在食管鳞状细胞癌组织和细胞中表达均下调初步证实了CASC2在食管鳞癌中作为抑癌基因而发挥作用,其表达升高可以抑制食管鳞癌肿瘤细胞的增殖,进而抑制食管肿瘤的形成。

薛文华^[2]（2020）在《Circ-FIG4/miR-99a/ABHD4轴影响人食管癌进展的分子机制研究》文中指出1 研究背景和目的食管癌（Esophageal Carcinoma,ESCA）是世界上常见的恶性肿瘤,其发病率居恶性肿瘤的第八位,死亡率居恶性肿瘤第六位。尤其是中国,更是食管癌的高发地之一。由于早期症状不明显,大多数食管癌患者在确诊时已是晚期,常伴有淋巴结转移或者远处转移。目前食管癌的治疗手段较为单一,靶向药物较少,导致食管癌患者生存率低,预后较差。因此,探讨食管癌发生、发展机制,筛选有效的诊断标志物和特异性的治疗靶点,对于降低食管癌死亡率和提高患者生活质量具有重要的意义。环状RNA（circular RNA,circRNA）是一种特殊类型的内源性非编码RNA。与传统线性RNA不同的是,circRNA的3’端和5’端头尾相接形成闭合的环状结构,这一结构使其更加保守和稳定,从而避免被RNA剪切酶降解。同时,这一特性也赋予了 circRNA许多特殊的生物学功能。近年来,circRNA在恶性肿瘤中的作用备受研究者关注。研究报道,许多circRNA在恶性肿瘤中异常表达并参与肿瘤的发生发展。目前,circRNA在食管癌中的功能与机制尚未完全阐明,因此,筛选和鉴定在食管癌进展中发挥重要作用的circRNA并探索其调控机制,对于开发食管癌诊断、预后分子标志物以及潜在治疗靶点具有重要意义。circRNA参与肿瘤进展往往是通过内源竞争RNA（Competing Endogenous RNA,ceRNA）网络实现的。ceRNA网络主要包括circRNA、lncRNA、假基因和编码蛋白RNA等,这些分子能够作为miRNA应答元件（MicroRNAResponse Element,MRE）,竞争性地结合相同的miRNA来调控各自表达水平。其中,作为ceRNA网络中的重要分子,circRNA能通过miRNA海绵作用大量吸附与其相应的miRNA,进而在转录后水平调控相应基因的表达,从而影响恶性肿瘤的生物学行为和发生发展。同时,多项研究证实circRNA在食管癌中异常表达,并且能通过“海绵作用”调控下游miRNA的表达进而抑制或促进恶性食管癌的进展。例如,circ-0006168在食管癌组织中高表达,且能够靶向调节miR-100/mTOR和miR-339-5p/CDC25A通路,进而促进食管癌的进展;在食管癌患者的血浆及食管癌细胞系（EC9706和TE1）中,高表达circ-0004771可作用于miR-339-5p/CDC25A通路从而调节恶性食管癌的进展;在食管癌组织中,高表达circ-0000654能够通过海绵作用吸附miR-149-5p和促进STAT3蛋白的表达,进而促进食管癌细胞的增殖、迁移和侵袭,抑制其凋亡;在食管癌组织中,circ-0004370表达显着升高并通过调控miR-1294/LASP1轴促进恶性食管癌的进展;在食管癌组织和细胞系中,高表达的circ-0006948可直接与miR-490-3p结合,靶向癌基因HMGA2的3’ UTR诱导上皮间质转化（Epithelial Mesenchymal Transformation,EMT）,也在食管癌的发生发展中起重要作用。但是,目前circRNA影响食管癌进展的功能及机制尚不完全清楚,需要进一步阐明。因此,深入研究影响食管癌发生发展过程中circRNA/microRNA/mRNA信号轴的生物学功能,对推动食管癌早期诊断及治疗手段的发展,具有较高的科研价值和临床意义。在第一部分,本研究证实环状RNA circ-0077607（circ-FIG4）在食管癌中显着高表达。circ-FIG4表达水平和食管癌患者临床特征的分析结果显示circ-FIG4高表达与食管癌TNM分期、肿瘤大小、淋巴结转移和远处转移显着相关,生存分析提示circ-FIG4高表达的食管癌患者生存时间更短,提示在食管癌中circ-FIG4可能是潜在的促癌基因。为了探索circ-FIG4对食管癌恶性生物学行为的影响,本研究开展了一系列体内、体外功能实验。体外实验结果显示,与阴性对照组相比,circ-FIG4沉默组食管癌细胞EC9706和KYSE30的增殖、DNA合成、克隆形成、迁移和侵袭能力显着下调,细胞凋亡水平明显升高。体内实结果显示,circ-FIG4沉默组的裸鼠皮下移植瘤生长速度显着减慢,肿瘤增殖标志物Ki-67显着下降。以上研究结果证实circ-FIG4具有促进食管癌细胞增殖和侵袭、抑制食管癌细胞凋亡的生物学功能,发挥促癌基因功能。circRNA作为非编码RNA,其生物学作用主要是影响编码蛋白的活性和表达,而ceRNA调控网络机制是其重要的作用机制之一。为了阐明circ-FIG4是否通过调控ceRNA网络参与了食管癌的进展,本研究的第二部分通过生物信息学和分子生物学实验筛选并验证了 circ-FIG4/miR-99a/ABHD4调控网络以及其对食管癌细胞生物学行为的影响。本研究首先筛选并预测了circ-FIG4可以通过竞争性结合miR-99a上调ABHD4的表达,并通过RT-qPCR、Western blotting以及双荧光素酶报告基因实验进一步证实了 circ-FIG4/miR-99a/ABHD4调控轴的相互作用。本研究的第三部分利用功能回补实验分析了 circ-FIG4/miR-99a/ABHD4调控网络对食管癌增殖和侵袭的影响。揭示了 circ-FIG4可作用于miR-99a间接促进ABHD4的表达,从而促进食管癌细胞增殖和侵袭等恶性表型,沉默miR-99a或者过表达ABHD4可部分逆转circ-FIG4沉默导致的增殖和侵袭抑制。另外,研究结果证实circ-FIG4/miR-99a/ABHD4通过调控EMT信号通路而调节食管癌的恶性表型。本研究的第四部分分析了 circ-FIG4/miR-99a/ABHD4调控网络的功能蛋白ABHD4在食管癌中的表达及其临床意义及其对食管癌细胞增殖和侵袭的影响。本研究通过TCGA数据库分析和组织芯片验证,证实ABHD4在食管癌中显着高表达,并且同circ-FIG4相似,高表达ABHD4的食管癌患者生存时间更短。功能实验结果显示,与阴性对照组相比,ABHD4沉默组食管癌细胞EC9706和KYSE30的增殖、DNA合成、克隆形成、迁移和侵袭能力显着下调。以上结果提示ABHD4可能在食管癌中发挥促癌基因功能。综上所述,本研究首次发现并鉴定了 circ-FIG4/miR-99a/ABHD4 ceRNA调控网络在食管癌进展中的生物学功能,揭示了食管癌发生、发展新机制,对寻找食管癌新型药物治疗靶点有着极为重要的理论意义和临床价值。2 实验方法2.1 第一部分2.1.1利用RT-qPCR检测120对食管癌和癌旁组织中circ-0077607（circ-FIG4）的表达;检测4株食管癌细胞系（TE-13、KYSE140、EC9706、KYSE30）和 1 株食管上皮细胞系（Het-IA）中的 circ-0077607（circ-FIG4）的表达。2.1.2采用RT-qPCR法测定circ-FIG4在食管癌组织中的相对表达水平,结合患者的临床信息,分析circ-FIG4表达水平与食管癌患者临床特征（TNM分期、肿瘤大小、淋巴结转移和远处转移）以及生存预后的相关性。2.1.3设计circ-FIG4反向引物和正向引物,采用PCR法鉴定circ-FIG4的环状RNA特性;通过核酸原位杂交实验确认环状RNA circ-FIG4在食管癌细胞中的定位。2.1.4通过慢病毒转染的方法构建环状RNA circ-FIG4沉默的食管癌细胞系,并采用RT-qPCR鉴定基因干扰的效果。2.1.5对circ-FIG4高表达的食管癌细胞系使用沉默慢病毒观察沉默circ-FIG4对食管癌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡表型的影响。2.1.6采用稳定沉默circ-FIG4的食管癌细胞系构建裸鼠皮下移植瘤模型,观察裸鼠体内肿瘤增殖速度、体积的变化。2.2第二部分2.2.1通过生物信息学分析、RT-qPCR筛选并验证circ-FIG4调控的miR-99a。2.2.2采用RT-qPCR分析过表达或沉默circ-FIG4后miR-99a的表达水平;使用双荧光素酶报告基因实验证实circ-FIG4能够直接结合miR-99a。2.2.3分析食管癌组织中circ-FIG4的表达及其与miR-99a的表达相关性。2.2.4利用生物信息学分析、RT-qPCR、Western blotting、双荧光素酶报告基因实验预测并证实miR-99a能够结合并抑制ABHD4的表达。2.2.5 采用 Western blotting 分析 circ-FIG4 通过吸附 miR-99a 促进 ABHD4的表达。2.3第三部分2.3.1将食管癌细胞分为6组,分别为转染阴性对照组（NC）、circ-FIG4沉默组（sh-circ-FIG4）、circ-FIG4 沉默&miR-99a 抑制组（sh-circ-FIG4&miR-99a inhibitor）、ABHD4 沉默组（sh-ABHD4）、ABHD4 沉默组&miR-99a 抑制组（sh-ABHD4&miR-99a inhibitor）和 circ-FIG4 沉默&ABHD4 过表达组（sh-circ-FIG4&ABHD4）,观察 circ-FIG4/miR-99a/ABHD4 轴对食管癌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响。2.3.2利用上述几组细胞构建皮下移植瘤,观察circ-FIG4/miR-99a/ABHD4轴对裸鼠皮下移植瘤增殖生长曲线、瘤体重量的影响。2.3.3采用生物信息学预测circ-FIG4/miR-99a/ABHD4轴参与食管癌进展的下游潜在的信号通路,通过Western blotting验证EMT信号通路。2.4第四部分2.4.1采用RT-qPCR、Western blotting和免疫组化实验测定ABHD4在食管癌组织中的相对表达水平,结合患者的临床随访信息分析ABHD4表达水平与食管癌患者预后的关系。2.4.2通过慢病毒转染的方法构建ABHD4的稳定沉默食管癌细胞系,并检测沉默的效果。2.4.3通过功能实验分析ABHD4沉默对食管癌细胞增殖和侵袭表型的影响。3研究结果3.1第一部分3.1.1在食管癌组织中circ-FIG4表达显着增加,并与肿瘤组织大小、远处转移、TNM分级等临床恶性表型密切相关。circ-FIG4高表达患者的生存时间明显短于circ-FIG4低表达患者。3.1.2在食管癌细胞中沉默circ-FIG4,其凋亡水平显着增加,而增殖、迁移和侵袭能力显着降低。3.1.3沉默circ-FIG4后,食管癌裸鼠皮下移植瘤的增殖能力显着下降,肿瘤重量明显降低,Ki-67的表达也显着受到抑制。3.2第二部分3.2.1 circ-FIG4能够结合并吸附miR-99a,miR-99a在食管癌中表达显着降低且和circ-FIG4的表达呈显着负相关。3.2.2 miR-99a能够结合并抑制ABHD4的表达且miR-99a和ABHD4的表达呈显着负相关。3.2.3 circ-FIG4能够通过吸附miR-99a促进ABHD4的表达,且circ-FIG4和ABHD4的表达呈显着正相关。3.3第三部分3.3.1功能回补实验证实,沉默circ-FIG4能够显着抑制食管癌细胞EC9706和KYSE30的增殖、DNA合成、迁移和侵袭能力,而抑制miR-99a或者过表达ABHD4能够部分逆转此现象。3.3.2功能回补实验证实,沉默circ-FIG4能够显着抑制食管癌细胞体内裸鼠皮下移植瘤模型的增殖,而抑制miR-99a或者过表达ABHD4能够部分逆转此现象。3.3.3 circ-FIG4/miR-99a/ABHD4通过EMT信号通路调控食管癌恶性表型。机制回补实验证实,沉默circ-FIG4能够显着抑制食管癌细胞EMT表型,而抑制miR-99a或者过表达ABHD4可部分逆转此现象。3.4第四部分3.4.1 TCGA数据分析证实ABHD4在食管癌中表达明显增高且与患者临床预后密切相关。3.4.2食管癌组织芯片分析进一步证实ABHD4蛋白在食管癌组织中表达明显增高并与患者临床预后密切相关。3.4.3沉默ABHD4的食管癌细胞的增殖、克隆形成和侵袭能力显着降低。4结论4.1 circ-FIG4在食管癌中显着高表达,与患者临床恶性表型及生存预后密切相关,是潜在的促癌基因。4.2 circ-FIG4能够通过吸附miR-99a促进ABHD4的表达形成ceRNA调控网络,circ-FIG4/miR-99a/ABHD4轴通过影响EMT通路调控食管癌的生物学行为。4.3 ABHD4在食管癌中显着高表达,与患者临床恶性表型及生存预后密切相关,是潜在的促癌基因。综上所述,本研究证实circ-FIG4/miR-99a/ABHD4调节轴可调控食管癌的发生及发展,可为食管癌早期诊断和治疗的潜在靶点。

丹尼尔·多里坤^[3]（2020）在《哈萨克族食管癌甲基化易感基因表达水平及其临床意义的研究》文中进行了进一步梳理目的:食管癌在细胞内高甲基化基因的种类在不同地理区域、人群和种族之间有显着的差异,体现出不同人群对此疾病的遗传易感性。本研究旨在探讨食管癌甲基化易感基因在哈萨克族食管鳞癌中的表达水平及其临床意义。方法:首先,用文献检索方法筛选16个食管癌特异性高甲基化候选基因,用Methyl Primer软件预测候选基因CpG岛。其次,候选基因与人食管鳞癌全基因组寡核苷酸芯片差异表达基因交叉分析,确定哈萨克族食管鳞癌甲基化易感基因,最后,采用qRT-PCR方法和免疫组织化学法检测易感基因在哈萨克族食管癌和癌旁组织中的表达情况并分析与临床特征和患者生存率的关系。结果:16个候选基因通过甲基化CpG岛预测、食管鳞癌表达芯片差异表达基因交叉分析以及TCGA数据库查询表达水平及预后的关系等生物信息学分析,最终筛选出PTEN、FHIT、CLDN3、MLH1、MSH2等5个基因。qRT-PCR结果显示食管鳞癌组织hMSH2A和FHIT两个基因的mRNA的表达水平显着低于癌旁组织。IHC结果显示hMSH2A（P=0.010）和FHIT（P=0.002）基因在食管癌癌组织与癌旁组织表达中有明显的统计学差异,均在癌旁组织中高表达,癌组织中低表达。统计分析后发现hMSH2A和FHIT两种基因表达缺失与食管癌患者的年龄、性别及肿瘤部位无关,hMSH2A基因的分化程度（P=0.020）,TNM分期中的淋巴结转移（P=0.028）情况及术后病理分期（P=0.014）有关,FHIT基因表达与肿瘤TNM分期浸润深度（P=0.031）有关。Kaplan-Meier生存分析发现,癌组织中hMSH2A基因表达阳性的患者存活率及存活时间均优于基因表达阴性的患者。两种基因在癌组织与癌旁组织中共同表达提示hMSH2A表达与FHIT表达呈正相关（r=0.430,P<0.01）。结论:甲基化易感基因hMSH2A和FHIT蛋白可能在哈萨克族食管癌发生发展中起重要作用,两种基因的联合表达的检测可作为预测恶性表型以及预后的重要指标。

张猛^[4]（2019）在《MicroRNA-4286靶向INPP4A激活JAK2/STAT3信号通路调控食管癌生长、迁移和侵袭的机制研究》文中进行了进一步梳理研究背景和目的食管癌是一种常见的消化系统恶性肿瘤,具有发病率高和死亡率高的特点,危害极大。尽管随着手术、放化疗和其他辅助手段的发展,食管癌的临床治疗取得了明显进步,对延缓肿瘤进展、提高患者生活质量和延长患者生存期有一定效果,但总体上食管癌的远期预后仍很差,5年生存率不足30%。微小RNA（microRNA,miRNA）被证明对肿瘤有重要的调控作用。随着特异性表达的miRNA不断被发现和鉴定,目前已经发现了几十种与人类食管癌有关的miRNA。我们在前期研究中发现miR-4286在食管癌中表达升高,文献报道miR-4286与黑色素瘤、皮肤鳞状细胞癌、前列腺癌等都有关。我们通过软件预测肌醇多聚磷酸-4-磷酸酶 Ⅰ 型（inositol polyphosphate-4-phosphatase type I,INPP4A）为miR-4286的靶基因,但目前尚未见miR-4286、INPP4A参与食管癌的报道。我们拟以miR-4286在食管癌中高表达为切入点,深入探讨miR-4286与食管癌的关系,以及其靶基因INPP4A及JAK2/STAT3信号通路对食管癌生物学行为的影响。第一部分miR-4286及其预测靶基因INPP4A在食管癌组织和细胞株的表达方法:收集75例确诊的食管癌患者癌组织及癌旁正常食管组织,体外培养人食管鳞癌细胞株（TE-1、HCE-4和HCE-7）、人食管腺癌细胞株（SKGT-4和Bic-1）以及正常食管上皮HEEC细胞株,定量PCR或Western blot检测miR-4286、INPP4A在食管癌组织标本和细胞株中的表达水平;分析食管癌中miR-4286和INPP4A表达水平之间的关系。结果1.miR-4286在食管癌组织中表达水平较癌旁正常组织显着升高,是正常食管组织的 3.15 倍（p<0.001）;miR-4286 在 TE-1、HCE-4、HCE-7、SKGT-4 和 Bic-1 5种食管癌细胞株中的表达水平分别是正常食管上皮细胞的2.854倍（p<0.01）、2.721 倍（p<0.01）、3.273 倍（p<0.001）、1.915 倍（p<0.05）和 2.421 倍（p<0.01）。2.INPP4A mRNA在食管癌组织表达水平较癌旁正常组织显着降低,是正常食管组织的0.487倍（p<0.01）;INPP4AmRNA在食管癌细胞的表达水平均较正常上皮细胞显着降低,在TE-1、HCE-4、HCE-7、SKGT4和Bic-1表达水平分别是正常食管上皮细胞的0.676倍、0.589倍、0.613倍、0.575倍和0.622倍（p均<0.01）。3.INPP4A蛋白在食管癌组织中的表达水平较癌旁正常组织显着降低（p<0.01）;INPP4A蛋白在TE-1、HCE-4、HCE-7和SKGT-4 4种食管癌细胞株中的表达水平均较食管正常上皮细胞显着降低（p<0.01）。4.食管癌组织中miR-4286和INPP4A mRNA的表达量呈负相关,|r|=0.675,p<0.001。结论1.miR4286是一个食管癌相关因子,在食管癌组织和细胞株中高表达;2.INPP4A是miR-4286的一个下游预测靶基因,在食管癌组织和细胞株中低表达,与miR-4286水平呈负相关。第二部分 miR-4286靶向INPP4A激活JAK2/STAT3信号通路调控食管癌生长、迁移和侵袭的机制方法:1.在食管癌HCE-7细胞株中利用双荧光素酶报告基因检测系统证实miR-4286和INPP4A之间存在相互作用,INPP4A是miR-4286的靶基因;将miR-4286 minic/inhibitor转染食管癌细胞,定量PCR和Western blot检测食管癌细胞中INPP4A、JAK2、STAT3的表达,同时检测与细胞增殖、凋亡、侵袭性相关的细胞因子 BCL-2、BAX、Caspase、E-cadherin、N-cadherin 等的表达;MTT 法检测细胞存活,流式细胞术检测细胞凋亡,Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力。2.将 INPP4A siRNA 单独或联合 miR-4286 inhibitor 转染食管癌细胞,Western blot检测INPP4A、JAK2、STAT3表达水平,MTT法检测细胞存活,流式细胞术检测细胞凋亡,Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力。结果:1.miR-4286和INPP4A基因的3’-UTR野生型重组报告质粒共转染HCE-7细胞后的荧光素酶活性显着降低,说明INPP4A是miR-4286的直接作用靶点。2.miR-4286 mimic 组 INPP4A mRNA 表达是对照组的 0.37 倍（p<0.001）;miR-4286 inhibitor组 INPP4A mRNA 表达是对照组的 2.88 倍（p<0.001）;mimic NC组和 inhibitor NC 组 INPP4A mRNA与对照组无显着差异（p>0.05）。miR-4286 mimic组INPP4A蛋白表达水平低于对照组（p<0.01）,miR-4286 inhibitor组INPP4A蛋白表达水平高于对照组（p<0.01）,mimic NC组和inhibitor NC组INPP4A蛋白水平与对照组无显着差异（p>0.05）。3.TE-1、HCE-7和Bic-1 3种食管癌细胞株中miR-4286 mimic组细胞存活率分别为 172.12%、170.53%和 144.38%,均较对照组升高（p<0.05）,miR-4286 inhibitor组细胞存活率分别为71.38%、56.28%和72.83%,均较对照组降低（p<0.05）;3种细胞株的mimic NC组和inhibitor NC组细胞存活率与对照组均无显着差异（p>0.05）,说明miR-4286能促进食管癌细胞增殖。4.TE-1、HCE-7和Bic-1 3种食管癌细胞株中miR-4286 mimic组细胞凋亡率分别为 4.67%、4.67%和 4.13%,均较对照组降低（p<0.01）;miR-4286 inhibitor组细胞凋亡率分别为14.22%、13.51%和8.64%,均较对照组升高（p<0.05）;3种细胞株中mimic NC组和inhibitor NC组细胞凋亡率与对照组均无显着差异（p>0.05）,说明miR-4286能抑制食管癌细胞凋亡。5.TE-1、HCE-7和Bic-1 3种食管癌细胞株中miR-4286 mimic组迁移的细胞数分别为137、168和147,侵袭的细胞数分别为142、184和146,均较对照组显着升高（p<0.05）,miR-4286 inhibitor组迁移的细胞数分别为76、75和57,侵袭的细胞数分别为66、44和78,均较对照组显着降低（p<0.05）,3种细胞mimic NC组和inhibitor NC组迁移和侵袭的细胞数与对照组均无显着差异（p>0.05）,说明miR-4286能增强食管癌细胞迁移和侵袭性。6.miR-4286 mimic 组 BCL-2、N-cadherin、Vimentin、ZEB1、Snail、JAK2、STAT3蛋白表达水平较对照组升高（p<0.05）,BAX、cleaved-Caspase-3、cleaved-Caspase-9、E-cadherin 表达较对照组降低（p<0.05）;miR-4286 inhibitor组 BCL-2、N-cadherin、Vimentin、ZEB1、Snail、JAK2、STAT3 表达较对照组降低（p<0.05）,BAX、cleaved-Caspase-3、cleaved-Caspase-9、E-cadherin 表达较对照组升高（p<0.05）。mimic NC组和inhibitor NC组中以上蛋白表达水平与对照组均无显着差异（p>0.05）。7.si-INPP4A组细胞INPP4A mRNA和蛋白水平均较对照组显着降低（p<0.01）,si-INPP4A+miR-4286 inhibitor 组 INPP4A mRNA 和蛋白水平均较 si-INPP4A 组显着升高（p<0.01）,si-NC组INPP4A mRNA和蛋白水平与对照组无显着差异（p>0.05）,si-INPP4A+miR-4286 NC组INPP4A mRNA和蛋白水平与si-INPP4A组无显着差异（p>0.05）。8.si-INPP4A组细胞存活率为170.34%,显着高于对照组（p<0.01）,si-INPP4A+miR-4286 inhibitor 组细胞存活率为 102.05%,显着低于 si-INPP4A 组（p<0.01）,si-NC组细胞存活率与对照组无显着差异（p>0.05）,si-INPP4A+miR-4286 NC组细胞存活率与si-INPP4A组无显着差异（p>0.05）。9.si-INPP4A组细胞总凋亡率为2.66%,显着低于对照组（p<0.01）,si-INPP4A+miR-4286 inhibitor 组细胞凋亡率为 7.78%,显着高于 si-INPP4A 组（p<0.01）,si-NC组细胞凋亡率与对照组无显着差异（p>0.05）,si-INPP4A+miR-4286 NC组细胞存活率与si-INPP4A组无显着差异（p>0.05）。10.si-INPP4A组细胞相对迁移数和侵袭数分别为147.26%和158.72%,显着高于对照组（p<0.01）,si-INPP4A+miR-4286 inhibitor组细胞相对迁移数和侵袭数分别为89.77%和89.89%,显着低于si-INPP4A组（p<0.01）,si-NC组细胞相对迁移数和侵袭数与对照组无显着差异（p>0.05）,si-INPP4A+miR-4286NC组细胞相对迁移数和侵袭数与si-INPP4A组无显着差异（p>0.05）。11.si-INPP4A组细胞JAK2、STAT3蛋白水平显着高于对照组（p<0.01）,si-INPP4A+miR-4286 inhibitor 组细胞 JAK2、STAT3 蛋白表达低于 si-INPP4A 组（p<0.05）;si-NC组JAK2、STAT3蛋白水平与对照组无显着差异（p>0.05）,si-INPP4A+miR-4286 NC 组 JAK2、STAT3 蛋白水平与 si-INPP4A 组无显着差异（p>0.05）。结论:1.miR-4286高表达能促进食管癌细胞增殖、抑制细胞凋亡、增强细胞的迁移和侵袭性,并活化JAK2/STAT3信号通路;miR-4286低表达能抑制食管癌细胞增殖、促进细胞凋亡、削弱细胞的迁移和侵袭性,抑制JAK2/STAT3信号通路,说明miR-4286能调控食管癌的恶性表现;2.miR-4286 inhibitor能逆转si-INPP4A所引起的食管癌细胞增殖促进、凋亡抑制和迁移和侵袭性增强的效应,miR-4286对食管癌恶性表型的调控是通过INPP4A实现的。miR-4286靶向INPP4A激活JAK2/STAT3信号通路调控食管癌生长、迁移和侵袭。

梁承潇,沈钢^[5]（2019）在《PTEN基因在食管癌中的研究进展》文中进行了进一步梳理我国是食管癌的高发地区之一。由于诊治的食管癌患者多数属于中晚期,预后较差。从食管癌发生和发展的分子机制入手探索新的治疗靶点和途径,对食管癌的治疗具有重要的意义。人类第十号染色体缺失与磷酸酶和张力蛋白同源基因（gene of phosphate and tension homology deleted on chromsome ten,PTEN）是首个被发现的具有双特异性磷酸酶活性的抑癌基因,与一些恶性肿瘤的发生、发展、生物学行为和预后有密切关系。目前对PTEN基因在食管癌组织中的突变、表达变化及作用机制存在争议,本文就PTEN基因在食管癌发生和发展中的分子机制相关的最新研究作一综述。

乔冠恩^[6]（2019）在《miR-106b-3p靶向ZNRF3调控食管鳞癌恶性生物学行为及分子机制研究》文中进行了进一步梳理目的:本实验主要研究食管鳞癌（esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）组织中miR-106b-3p的表达情况,通过体外细胞实验和体内动物实验确认miR-106b-3p的差异表达能够影响ESCC细胞的增殖、迁移、侵袭、黏附和上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）进程。通过Target Scan以及双荧光素酶报告实验预测及验证miR-106b-3p在ESCC调控中的靶基因。最后,深入探讨miR-106b-3p调控ESCC恶性生物学功能的机制。方法:1、收集苏州大学附属第一医院和邯郸市第一医院的ESCC组织和癌旁样本3对,应用Agilent miRNAs表达谱芯片技术筛选出差异表达的miRNAs;2、RT-qPCR检测差异比较大的miR-106b-3p的表达水平;3、RT-qPCR检测miR-106b-3p在ESCC细胞株（KYSE150、ECA109和EC9706）和人正常食管上皮细胞（HET-1A）中的表达;MTT-8和克隆形成实验检测ESCC细胞株（KYSE150、ECA109和EC9706）和人正常食管上皮细胞（HET-1A）的增殖能力;4、将合成的miR-106b-3p mimics NC、miR-106b-3p mimics、miR-106b-3p inhibitors NC及miR-106b-3p inhibitors转染至ESCC细胞株（ECA109和KYSE150）中,RT-qPCR检测转染效率;MTT和克隆形成实验检测miR-106b-3p对ESCC细胞株（ECA109和KYSE150）增殖能力的影响,流式周期实验观察对周期分布的影响,Western blot实验观察对细胞周期、迁移、侵袭及EMT相关蛋白表达的影响,划痕实验观察对细胞非定向迁移能力的影响,Transwell迁移实验观察对细胞定向迁移能力的影响,Transwell侵袭移实验观察对细胞侵袭能力的影响,光镜观察细胞形态的变化,细胞黏附实验观察对细胞黏附能力的影响;5、构建ESCC细胞株（ECA109）裸鼠移植瘤模型,观察miR-106b-3p对ESCC细胞株移植瘤生长的作用;6、免疫荧光和Western blot实验检测ZNRF3在ESCC细胞株（KYSE150、ECA109和EC9706）和人正常食管上皮细胞（HET-1A）中的表达;RT-qPCR、Western blot和免疫荧光实验检测ESCC细胞株（ECA109和KYSE150）转染miR-106b-3p mimics NC、miR-106b-3p mimics、miR-106b-3p inhibitors NC及miR-106b-3p inhibitors后ZNRF3 m RNA和蛋白的表达;Target Scan预测miR-106b-3p的靶基因,双荧光素酶报告实验验证miR-106b-3p的靶基因;7、RT-qPCR和Western blot检测miR-106b-3p对ESCC细胞株（ECA109和KYSE150）中Wnt/β-catenin信号通路的影响。结果:1、利用Agilent miRNAs表达谱芯片筛选出62个ESCC差异表达的miRNAs,其中ESCC表达上调的miRNAs 41个,下调的miRNAs 21个;2、RT-qPCR实验结果显示miR-106b-3p在ESCC临床组织样本的表达水平要显着高于其在癌旁中的表达;3、RT-qPCR结果显示miR-106b-3p在ESCC细胞株（KYSE150、ECA109和EC9706）中的表达要显着高于其在人正常食管上皮细胞（HET-1A）的表达;MTT和克隆形成实验结果显示ESCC细胞株（KYSE150、ECA109和EC9706）的增殖能力要显着高于人正常食管上皮细胞（HET-1A）;4、转染miR-106b-3p inhibitors后,ESCC细胞株（ECA109和KYSE150）中miR-106b-3p的表达水平显着降低,转染miR-106b-3p mimics后,ESCC细胞株（ECA109和KYSE150）中miR-106b-3p的表达水平显着升高;MTT实验表明转染miR-106b-3p inhibitors后ESCC细胞株（ECA109和KYSE150）的增殖能力显着降低,而转染miR-106b-3p mimics后的增殖能力显着增强;克隆形成实验验表明转染miR-106b-3p inhibitors后ESCC细胞株的克隆形成能力显着降低,而转染miR-106b-3p mimics后的克隆能力显着增强;流式周期实验表明转染miR-106b-3p inhibitors后ESCC细胞株细胞阻滞在G1期,而转染miR-106b-3p mimics后的G1比例显着下调,且miR-106b-3p inhibitors能够显着抑制Cyclin D1蛋白的表达,促进p21和p27的表达,而miR-106b-3p mimics能够显着促进Cyclin D1蛋白的表达,抑制p21和p27的表达;划痕实验和Transwell迁移表明转染miR-106b-3p inhibitors后ESCC细胞株的迁移能力显着降低,而转染miR-106b-3p mimics后的迁移显着增强;Transwell侵袭实验表明转染miR-106b-3p inhibitors后ESCC细胞株的侵袭能力显着降低,而转染miR-106b-3p mimics后的侵袭显着增强;Western blot实验表明,miR-106b-3p inhibitors能够显着抑制MMP-2和MMP-9蛋白的表达,而miR-106b-3p mimics能够显着促进MMP-2和MMP-9蛋白的表达;细胞形态和黏附实验表明,miR-106b-3p inhibitors能够抑制ESCC细胞株对collagen I、collagen IV和fibronectin的黏附,而miR-106b-3p mimics能够增强对collagen I、collagen IV和fibronectin的黏附;Western blot实验表明,miR-106b-3p inhibitors能够显着抑制Snail、N-cadherin和Vimentin蛋白的表达,促进E-cadherin蛋白的表达,而miR-106b-3p mimics能够显着促进Snail、N-cadherin和Vimentin蛋白的表达,抑制E-cadherin蛋白的表达;5、裸鼠移植瘤实验表明,抑制miR-106b-3p的表达能够显着抑制移植瘤的生长,而促进miR-106b-3p的表达则显着促进移植瘤的生长;6、免疫荧光和Western blot实验表明ZNRF3在ESCC细胞株（KYSE150、ECA109和EC9706）的表达要显着低于其在人正常食管上皮细胞（HET-1A）中的表达;RT-qPCR、Western blot和免疫荧光实验结果表明,ESCC细胞株（ECA109和KYSE150）转染miR-106b-3p mimics后,ZNRF3 m RNA和蛋白的表达显着降低,转染miR-106b-3p inhibitors后,ZNRF3 m RNA和蛋白的表达显着升高;Target Scan预测ZNRF3是miR-106b-3p的潜在靶基因,且双荧光素酶报告实验验证ZNRF3是miR-106b-3p的靶基因;7、RT-qPCR结果显示抑制miR-106b-3p的表达可以显着抑制Wnt和β-catenin m RNA的表达,促进GSK3βm RNA的表达;促进miR-106b-3p的表达可以显着促进Wnt和β-catenin m RNA的表达,降低GSK3βm RNA的表达。Western blot实验示抑制miR-106b-3p的表达可以显着抑制Wnt和β-catenin蛋白的表达,上调p-GSK3β蛋白的表达;促进miR-106b-3p的表达可以显着促进Wnt和β-catenin蛋白的表达,降低p-GSK3β蛋白的表达。结论:1、miR-106b-3p在食管鳞癌临床样本中显着高表达;2、miR-106b-3p可以显着促进食管鳞癌细胞株的增殖、周期、迁移、侵袭、黏附及EMT进程;能够显着促进食管鳞癌细胞移植瘤的生长;3、miR-106b-3p能够靶向作用于ZNRF3;4、miR-106b-3p可以显着促进Wnt/β-catenin信号通路的表达。

孙清超^[7]（2019）在《lncRNA GAS5/miR-21/SOX6信号轴调控新疆哈萨克族食管癌进程的机制研究》文中提出目的:通过检测lncRNA GAS5在新疆哈萨克族食管癌患者中的表达量以及分析其与临床病理特征的相关性,探究GAS5在食管癌中的相关作用;通过过表达GAS5检测其对食管癌细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移的作用,进一步通过生物信息学预测显示miR-21可能为GAS5的下游靶基因,SOX6可能为miR-21的下游靶基因,提示GAS5有可能通过竞争性结合于miR-21调控SOX6的表达量,从而参与食管癌的发生发展,为食管癌的诊断、治疗提供潜在的作用靶点。方法:通过q PCR的方法分别检测GAS5在新疆哈萨克族食管癌组织和细胞系（EC9706、EC109、KYSE150、KYSE45）中的表达水平,并分析其表达量与患者临床病理特征的相关性;MTT实验检测过表达GAS5对食管癌细胞增殖的影响;Transwell法检测GAS5对食管癌细胞迁移、侵袭的影响;流式细胞术检测过表达GAS5对食管癌细胞凋亡的影响。通过生物学信息预测GAS5的靶miRNA,双荧光素酶、RIP实验、RNA Pull-down实验验证GAS5与miR-21的靶向关系;通过q PCR的方法分别检测miR-21在新疆哈萨克族食管癌组织和细胞系（EC9706、EC109、KYSE150、KYSE45）中的表达水平,并分析其表达量与GAS5的相关性;上调或下调GAS5观察miR-21的表达量;回复实验探究GAS5是否通过miR-21调控食管癌的发生发展。通过生物学信息预测miR-21的靶m RNA,双荧光素酶、RIP实验验证miR-21与SOX6的靶向关系;通过q PCR、免疫组化分别检测SOX6在新疆哈萨克族食管癌组织中的表达水平,并分析其表达量与miR-21的相关性;q PCR、Western blot检测SOX6在细胞系中的表达水平;上调或下调miR-21分析SOX6的表达量;回复实验探究miR-21是否通过SOX6调控食管癌的发生发展;Western blot检测共转染GAS5和miR-21对SOX6蛋白水平的影响。结果:1)第一部分:食管癌组织以及细胞系中GAS5的表达水平显着下调（P<0.05）,并与患者TNM分期相关,但与患者性别、年龄、肿瘤分化、淋巴结转移无相关性;与对照组食管癌细胞相比,转染pc DNA-GAS5显着升高食管癌细胞系中（EC9706、EC109）GAS5的表达量（P<0.05）;过表达GAS5显着抑制细胞的增殖、侵袭、迁移,诱导其凋亡（P<0.05）。2)第二部分:生物信息学预测显示miR-21为GAS5的潜在靶基因;双荧光素酶、RIP实验、RNA Pull-down实验验证miR-21为GAS5的靶基因;miR-21在食管癌组织和细胞系中表达量显着上调（P<0.05）,且其表达量与GAS5成线性负相关;在食管癌细胞系（EC9706、EC109）中上调GAS5的表达量显着抑制miR-21的表达量（P<0.05）,而下调GAS5的表达量显着促进miR-21的表达量（P<0.05）;共转染过表达GAS5和miR-21载体显着回复GAS5对miR-21表达量的抑制作用,逆转GAS5对食管癌细胞增殖、迁移、侵袭的抑制作用,挽救GAS5对食管癌细胞凋亡的诱导作用。3)第三部分:生物信息学预测显示miR-21为GAS5的潜在靶基因;双荧光素酶、RIP实验、RNA Pull-down实验验证miR-21为GAS5的靶基因;miR-21在食管癌组织和细胞系中表达量显着上调（P<0.05）,且其表达量与GAS5成线性负相关;在食管癌细胞系（EC9706、EC109）中上调GAS5的表达量显着抑制miR-21的表达量（P<0.05）,而下调GAS5的表达量显着促进miR-21的表达量（P<0.05）;共转染过表达GAS5和miR-21载体显着回复GAS5对miR-21表达量的抑制作用,逆转GAS5对食管癌细胞增殖、迁移、侵袭的抑制作用,挽救GAS5对食管癌细胞凋亡的诱导作用。结论:GAS5在食管癌组织和细胞系中的表达量下调,且与患者的TNM分期相关,过表达GAS5抑制食管癌细胞的增殖、侵袭、迁移,诱导凋亡,在食管癌演进过程中发挥抑癌功能。

王祥虎^[8]（2018）在《长链非编码RNA UCA1参与亚硝胺和藻毒素联合染毒致食管癌发生发展机制研究》文中认为研究背景与目的食管癌（Esophageal cancer,EC）是一种严重威胁人类健康的消化道恶性肿瘤,在我国恶性肿瘤死因中排名第四位。研究表明,食管癌作为一种环境相关性肿瘤,是由环境因素和遗传因素相互作用所致的复杂性疾病。亚硝胺类化合物是一种强致癌物,流行病学研究发现,当水源水被含氮化合物污染后,再经氯化消毒产生的亚硝胺类消毒副产物可能是致食管癌的重要污染物。近年来,由于我国水环境的广泛污染,其中水体富营养化越来越严重,这致使各大湖泊均发现有大量藻类繁殖。微囊藻毒素是微囊藻细胞破裂产生的次级代谢产物,在水体富营养化较严重的水源水中,藻毒素可直接进入集中式供水的管网末梢水,人群可经饮水长期持续暴露于藻毒素。藻毒素具有强烈的毒性,有研究已证实藻毒素在体内外均有潜在的促癌作用。本课题组前期研究已发现并证实亚硝胺和藻毒素联合染毒可诱导EC的发生发展,但对于长链非编码RNA（lncRNA）是否参与该过程,以及lncRNA是否对EC具有调控作用及其相关分子机制,目前研究尚不清楚。本文研究目的是通过通过高通量芯片技术比较EC相关lncRNAs表达谱;通过差异倍数、lncRNAs子类分析、邻近编码基因信息分析、lncRNA-mRNA共表达分析等策略筛选EC相关lncRNA分子;对lncRNA-UCA1在EC组织和细胞的表达进行验证;探讨lncRNA-UCA1在EC组织中表达水平与EC发病风险及临床病理参数相关性;进一步探讨lncRNA-UCA1对EC109细胞表型的影响及其机制,从而为阐明lncRNA-UCA1在EC中的分子调控机制,发展其可用于EC高危人群筛检和早期诊断的新型表遗传标志,并为EC的治疗提供有效的潜在作用靶点。研究方法1.应用lncRNA和mRNA高通量芯片技术筛选食管癌组织和癌旁组织中的差异lncRNA和mRNA表达谱,结合lncRNA子类分析,mRNA的GO、KEGG分子,以及生物信息学分析构建lncRNA-mRNA共表达网络,进一步筛选出食管癌相关lncRNA。采用qRT-PCR技术在扩大食管癌人群样本中对筛选出的lncRNA进行验证,条件logistic回归分析其异常表达与食管癌发病风险之间的关系,采用两独立样本t检验分析候选lncRNA表达水平与食管癌临床病理参数之间关系2.构建lncRNA-UCA1慢病毒过表达和干扰载体系统,分别将其转染至食管鳞癌EC109细胞中建立lncRNA-UCA1过表达和干扰稳转细胞模型,应用qRT-PCR技术检测稳转后lncRNA-UCA1表达情况,以评价慢病毒过表达和干扰效率。进一步在此基础上分析过表达和干扰lncRNA-UCA1对食管鳞癌EC109细胞的增殖、侵袭和迁移等生物学功能影响,包括CCK8法检测细胞增殖、Transwell小室实验检测细胞侵袭和迁移能力。采用裸鼠皮下成瘤实验和尾静脉转移瘤实验检测过表达lncRNA-UCA1对裸鼠体内肿瘤形成和远处转移能力的影响。3.构建lncRNA-UCA1真核表达载体,并在食管鳞癌EC109细胞中过表达,应用qRT PCR、荧光素酶报告基因（DLR）、蛋白免疫印迹（Westernblot）、RNA-pulldown、蛋白银染实验、质谱鉴定、RNA结合蛋白免疫沉淀（RNABinding ProteinImmunoprecipitation,RIP）等技术,寻找并验证与lncRNA-UCA1直接结合靶蛋白及其相关信号通路4.通过对肿瘤基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）大数据库中筛选食管癌组织和癌旁组织中差异miRNA和mRNA表达谱,应用生物信息学预测软件（TargetScan和miRanda）,再结合ceRNA理论构建lncRNA-miRNA-mRNA共表达网络,经DLR系统进行初步筛选,确定lncRNA-UCAl/miR-18a-5p/SORBS2信号轴作为后续研究目标,分别应用DLR qRT-PCR、MS2-RIP、Western blot等技术验证该信号轴对食管鳞癌EC109细胞的增殖影响及分子调控作用机制5.构建亚硝胺（NMBA）和藻毒素（MCLR）体外染毒诱导正常食管上皮Het-1A细胞发生恶性转化模型;在该恶转细胞模型基础上,应用qRT-PCR检测lncRNA-UCA1在恶转细胞（慢性染毒处理10代和20代）表达情况,以及在NMBA和MCLR急性处理EC109细胞12h,24h 48h,72h后lncRNA-UCA1表达变化情况;Western blot检测lncRNA-UCA1下游靶分子蛋白FGFR2 Ⅲb和Ⅲc、SORBS2、PI3K-AKT信号通路关键蛋白（PI3K、AKT、P-AKT、PTEN）和EMT标志蛋白（ZO-1、N-Cadherin、E-Cadherin、Snail）表达情况主要研究结果1.食管癌相关lncRNA的筛选及lncRNA-UCA1与食管癌发病风险关系研究1.1食管癌相关lncRNA差异表达谱及其邻近基因的功能分析LncRNA表达谱芯片筛选出1360条在食管癌中具有统计学差异的lncRNAs,其中上调473条,下调887条;根据差异倍数（Fold Change,FC）大于2倍的标准,进一步筛选出差异lncRNAs 745条,其中上调300条,下调445条;对邻近mRNA表达谱分析筛选出1992条差异表达转录本,其中上调1026条,下调896条;根据FC>2进一步筛选出差异转录本1480条,其中上调801条,下调679条;通过对本芯片结果中差异基因进行lncRNA子类分析,mRNA的GO和KEGG Pathway分析,结果显示这些差异基因主要与MAPK信号通路,P53信号通路,细胞因子-细胞因子受体相互作用信号通路以及细胞外基质受体相互作用等通路相关。根据差异表达的lncRNAs和mRNAs,进行lncRNA-mRNA共表达分析,在共表达网络总体结构基础上,找到居于该网络中的一个核心基因即UCA1（NR015379）,该基因在芯片结果中表达显着下调（P<0.05）,这提示UCA1与食管癌关系密切,可能在食管癌中发挥重要的生物学功能。1.2LncRNA-UCA1与食管癌发病风险的流行病学研究应用 qRT-PCR技术检测人EC细胞（EC109、EC9706、CaEs-17、KYSE150和TE-1）和人正常食管上皮细胞（Het-lA）中lncRNA-UCA1表达特征,结果显示其在5株EC细胞系中表达均显着低于Het-1A（P<0.05）;qRT-PCR结果显示lncRNA-UCA1在115例食管鳞癌组织中表达显着低于癌旁正常组织（P<0.05）;logistic回归分析结果表明,lncRNA-UCA1在食管癌组织中的表达与食管发病风险呈负相关,即低表达的lncRNA-UCA1可显着增加食管癌的发病风险（P<0.05）;单样本t检验对来自TCGA大数据库中81例食管癌组织中lncRNA-UCA1的测序表达值与EC病人的临床病理参数（Age,Gender,Race,Stage,T/N/M,Grade）进行分析,结果显示,lncRNA-UCA1在淋巴结有转移的患者癌组织中表达水平显着低于无淋巴结转移的病人（P<0.05）。这些结果表明lncRNA-UCA1在食管癌组织和细胞中均表达显着低于相应对照组,且其低水平表达可促进淋巴结转移,增加EC患病风险。2.长链非编码RNAUCA1对食管鳞癌细胞的功能学研究2.1 LncRNA-UCA1在食管鳞癌EC109细胞的亚定位情况利用荧光原位杂交实验（FISH）对lncRNA-UCA1在食管鳞癌EC109细胞的分布进行检测,结果发现lncRNA-UCA1的转录本在食管鳞癌EC109细胞的胞浆和胞核内均有分布,但其在胞浆中荧光信号值显着高于胞核（P<0.05）。这提示lncRNA-UCA1在胞浆和胞核的不同分布,可能与其参与不同的信号传导通路有关。2.2 LncRNA-UCAl对食管鳞癌EC109细胞生物学行为的影响将过表达和干扰UCA1慢病毒转染至EC109细胞获得稳定细胞系后,qRT-PCR结果显示,过表达实验组（Lv-UCA1）的lncRNA-UCA1的表达水平比阴性对照组（Lv-NC）高出274.9倍;干扰实验组（UCA1-shRNA#2）lncRNA-UCA1的表达水平被敲低至对照组（Ctrl-shRNA）的32%;当lncRNA-UCA1过表达后,CCK8实验、Transwell侵袭和迁移实验结果显示,与Lv-NC组比较,Lv-UCA1组的细胞增殖能力、侵袭和迁移能力显着下降（P<0.05）;当lncRNA-UCA1被干扰后,结果发现UCA1-shRNA#2组的细胞增殖能力、侵袭和迁移能力显着提高（P<0.05）。这些结果表明,lncRNA-UCA1可能在EC中发挥抑癌功能。2.3 LncRNA-UCA1对裸鼠移植瘤和体内转移的影响通过裸鼠成瘤实验和尾静脉转移瘤实验分别观察lncRNA-UCA1在体内对肿瘤的生长和转移影响。裸鼠成瘤实验结果显示,Lv-UCA1组的肿瘤体积明显低于Lv-NC组（271.29±83.26mm3 vs 676.39±56.80mm3）差异有统计学意义（P<0.05）;Lv-UCA1组的肿瘤重量明显低于Lv-NC组（152.37±78.32mg vs 384.64±68.08mg）,差异有统计学意义（P<0.05）;裸鼠尾静脉转移实验结果显示,Lv-UCA1组肝脏未见明显的转移灶,Lv-NC组可见较为明显的转移灶。这些实验结果进一步证实了 lncRNA-UCA1在体内能抑制肿瘤细胞的生长和远端转移能力。3.LncRNA-UCAl通过结合hnRNPF参与调控FGFR2可变剪接影响食管鳞癌EMT进程3.1 LncRNA-UCA1可在核内特异性结合hnRNP FRNA-Pulldown联合NanoLC-ESI-MS/MS分析结果鉴定出3个可与lncRNA-UCA1结合的蛋白,即hnRNP F（UniProtKB-P52597）、ACTA2（UniProtKB-P62736）、PRSS3（UniProtKB-P35030）,其相对富集度分别为51.6%、19.9%、28.5%,可信度为99%、89.7%,91.1%。基于此结果选取富集度和可信度均最高的蛋白即hnRNPF;RIP和Western blot实验进一步验证了lncRNA-UCA1可特异结合hnRNP F。Western blot发现hnRNP F主要在细胞核中表达,胞浆中基本无表达。qRT-pCR和Western blot结果表明hnRNPF的表达在食管鳞癌EC109,EC9706细胞株及正常食管上皮Het-lA细胞株中表达无显着差异变化（P>0.05）;qRT-pCR和Western blot结果发现过表达或干扰lncRNA-UCA1,均不影响hnRNP F的mRNA和蛋白表达（P>0.05）。以上结果表明,lncRNA-UCA1可在核内特异性结合hnRNPF,且hnRNPF的表达不受lncRNA-UCA1影响。这提示lncRNA-UCA1可能通过结合hnRNPF参与其在核内的信号转录通路。3.2 LncRNA-UCA1通过结合hnRNP F调控FGFR2可变剪接体MiasDB数据库检索结果发现hnRNP F可参与调控FGFR2可变剪接体Ⅲb和Ⅲc的产生;qRT-PCR和Western blot结果显示,过表达lncRNA-UCA1可促进Ⅲb的表达,上调Ⅲb/Ⅲc的比值（P<0.01）;干扰lncRNA-UCA1可促进Ⅲc的表达,抑制Ⅲb的表达,下调Ⅲb/Ⅲc的比值（P<0.01）;FGFR2的总mRNA表达水平不受lncRNA-UCA1过表达或干扰的影响（P>0.05）;应用siRNA技术敲低hnRNP F表达后,Western blot结果发现,Ⅲc的产生显着增加（P<0.01）。以上这些结果表明lncRNA-UCA1可通过结合hnRNPF参与调控FGFR2的可变剪接,进而影响Ⅲb、Ⅲc的产生及二者比值变化。3.4lncRNA-UCA1/hnRNPF/FGFR2 Ⅲc信号轴通过PI3K-AKT信号通路参与调控食管癌EMT进程Western blot结果显示,EMT标志蛋白ZO-1和E-Cadherin在lncRNA-UCA1过表达组（Lv-UCA1）表达显着高于阴性对照组（Lv-NC）,在lncRNA-UCA1干扰组（UCA1-shRNA）和hnRNP F干扰组（si-F）中表达显着高于相应对照组（Ctrl-UCA1和si-Ctrl）;N-Cadherin和Snail在Lv-UCA1组表达显着低于Lv-NC（P<0.05）,在UCA1-shRNA组和si-F组中表达显着高于相应对照组（P<0.05）;此外,Western blot发现PI3K-AKT信号通路中关键蛋白分子PI3K、AKT、P-AKT在Lv-UCA1 组表达显着低于Lv-NC（P<0.05）,在UCA1-shRNA组和 si-F组中表达显着高于相应对照组（P<0.05）;PTEN在Lv-UCA1组表达显着高于Lv-NC（P<0.05）,在UCA1-shRNA组和si-F组中表达显着低于相应对照组（P<0.05）。这些结果表明,lncRNA-UCA1/hnRNP F/FGFR2 IIIc信号轴可能通过PI3K-AKT信号通路来参与调控食管鳞癌EMT进程。4.LncRNA-UCA1/miR-18a-5p/SORBS2轴在食管癌发生发展机制研究4.1基于TCGA数据库构建lncRNA-miRNA-mRNA共表达网络利用TCGA数据库中173例食管癌病人的RNA测序数据,筛选出在食管癌组织和癌旁正常组织之间具有统计学差异的miRNA共82个,其中上调35个,下调47个;差异mRNA共1398个,其中上调725个,下调673个;选择有统计学差异的上调miRNAs和下调mRNAs,应用Targetscan和miRanda在线生物信息学预测软件进行分析,利用Cytoscape软件构建以lncRNA-UCA1 为核心的 ceRNA 共表达网络,结果发现miR-18a-5p,miR-196b-5p,miR-452-5p等7个miRNAs是lncRNA-UCA1为核心的ceRNA中重要节点。应过DLR实验对这7个miRNAs与lncRNA-UCA1结合能力进行初步验证,结果发现只有miR-18a-5p,miR-196b-5p这两个miRNA的荧光信号值与对照比较具有统计学差异（P<0.05）;但仅有miR-18a-5p与对照组比较其荧光信号值显着降低（P<0.05）。这提示lncRNA-UCA1/miR-18a-5p/SORBS2作用轴可能与食管癌关系密切。4.2 LncRNA-UCA1可作为分子海绵吸附miR-18a-5pMS2-RIP联合qRT-PCR实验结果发现,在共转染GV127-MS2-UCA1和pMS2-GFP的实验组中可显着富集miR-18a-5p（P<0.05）,而在共转染GV127-MS2和pMS2-GFP的对照组中未见到miR-18a-5p的显着富集（P>0.05）;DLR实验结果发现miR-18-5p可显着减弱含有野生型lncRNA-UCA1的报告质粒的荧光信号值（P<0.05）,而不减弱含有突变型报告质粒的荧光信号值（P>0.05）。这表明miR-18a-5p可被作为“分子海绵”lncRNA-UCA1竞争吸附,进而有可能影响其靶基因SORBS2的表达水平。4.3 LncRNA-UCA1通过与SORBS2竞争结合miR-18a-5p参与肿瘤生长调控DLR实验结果显示miR-18a-5p可显着降低野生型pmirGLO-SORBS2（WT）的荧光信号值（P<0.05）,但不影响突变型pmirGLO-SORBS2（WT）的荧光信号值,这表明SORBS2是miR-18a-5p靶基因,二者可发生共价结合;qRT-PCR和Western blot显示,过表达lncRNA-UCA1可显着上调SORBS2水平（P<0.05）,干扰lncRNA-UCA1可显着下调SORBS2水平（P<0.05）;qRT-PCR显示SORBS2在EC病人的癌组织表达显着低于癌旁正常组织（P<0.05）;TCGA数据库中SORBS2在EC组织中表达显着低于癌旁组织（P<0.05）。CCK8挽救实验结果显示,共转染lncRNA-UCA1和miR-18a-5p于EC109细胞能部分挽救单独转染mi-18a-5p后对EC109细胞的促进生长能力;共转染miR-18a-5p和SORBS2和于EC109细胞能部分逆转单独转染SORBS2后对EC109细胞的抑制生长能力。这些结果表明,lncRNA-UCA1/miR-18a-5p/SORBS2作用轴在食管癌细胞体外增殖能力上发挥重要调控作用。5.LncRNA-UCA1在NMBA和MCLR诱发食管癌中作用机制初探5.1 LncRNA-UCA1在NMBA和MCLR致Het-1A细胞恶转过程中的表达特征QRT-PCR结果显示,与Blank组比较,NMBA、MCLR单独和联合染毒食管鳞癌EC109细胞12h、24h、48h、72h后lncRNA-UCA1表达水平均表达显着下调（P<0.05）;QRT-PCR结果显示,在NMBA和MCLR单独、联合染毒10代、20代发生恶性转化的Het-1A细胞中,NMBA与Blank组比较分别均显着下调2.42倍（10代和20代）（P<0.05）,联合组与Blank 比较,下调更显着,分别是3.84倍（10代）和14.29倍（20代）（P<0.05）。这些结果表明NMBA和MCLR可诱导lncRNA-UCAl在恶转Het-1 A细胞模型中表达下调,提示了lncRNA-UCA1参与NMBA和MCLR致食管癌发生发展过程。5.2 FGFR2 Ⅲb和Ⅲc通过PI3K-AKT信号通路参与NMBA和MCLR诱发食管癌EMTQRT-PCR结果显示,与Blank组比较,FGFR2 Ⅲb在NMBA组中表达上调2.35倍（P<0.05）;Ⅲc在NMBA组和MCLR+NMBA组中分别上调5.85倍和5.32倍（P<0.05）;Western blot结果显示,与Blank组比较,NMBA组中Ⅲb水平显着升高（P<0.05）,NMBA和NMBA+MCLR组中Ⅲc水平也显着升高（P<0.05）;Westernblot结果显示PI3K-AKT信号通路中的关键分子如PI3K,AKT,P-AKT蛋白在NMBA和NMBA+MCLR组显着上调（P<0.05）,PTEN蛋白在NMBA和NMBA+MCLR组表达显着下调（P<0.05）,这表明NMBA和MCLR可诱发PI3K-AKT信号通路的激活;Western blot结果显示,与Blank组比较,间质细胞标志N-Cadherin水平在NMBA组和联合组显着升高（P<0.05）,上皮细胞标志E-Cadherin水平在NMBA组和联合组显着下降（P<0.05）,这提示NMBA和MCLR可诱发EMT的发生。以上这些结果表明,FGFR2的可变剪接参与了PI3K-AKT信号通路的激活,并促进了NMBA和MCLR诱发食管癌EMT进程。5.3 LncRNA-UCA1/miR-18a-5p/SORBS2轴参与亚硝胺和藻毒素诱发食管发生发展应用qRT-PCR技术对NMBA和MCLR单独和联合染毒致Het-lA发生恶转的20代细胞中分别检测了miR-18a-5p和SORBS2的表达情况,结果显示,与Blank组比较,miR-18a-5p在 NMBA、MCLR、NMBA+MCLR 组中表达均显着上调（P<0.05）,SORBS2 在 NMBA 和NMBA+MCLR组表达显着下调（P<0.05）;Western blot结果显示,SORBS2基因的蛋白表达水平在MCLR+NMBA组表达显着下调（P<0.05）。这些结果表明,lncRNA-UCA1/miR-18a-5p/SORBS2轴参与亚硝胺和藻毒素诱发食管发生发展过程。研究结论1.本研究通过芯片研究筛选出一个与食管癌发生发展密切相关lncRNA-UCA1,并发现lncRNA-UCA1在食管癌细胞和组织中均呈低表达,其低表达水平与食管癌发现风险负相关,且与淋巴结转移密切相关。2.本研究通过体内功能学实验证实lncRNA-UCA1过表达可显着抑制EC细胞的体外增殖、侵袭和迁移能力;动物整体实验研究发现,过表达lncRNA-UCA1能抑制EC细胞在裸鼠体内生长,并抑制EC细胞的远处肝转移,这提示lncRNA-UCA1在食管癌发生发展过程中发挥抑癌作用。3.本研究首次发现在食管癌细胞中lncRNA-UCA1与hnRNP F相互结合,进而发挥调控对FGFR2的2种可变剪接体IIIb和IIIc的产生,影响二者的比值,进而参与影响PI3K-AKT信号通路介导的EMT进程。4.本研究首次发现lncRNA-UCA1可通过对miR-18a-5p的封闭,部分解除对靶基因SORBS2的负性调控,促进SORBS2蛋白表达水平,从而发挥抑制食管癌细胞增殖的功能。5.本研究发现亚硝胺和藻毒素可抑制lncRNA-UCA1在恶转Het-1A细胞中的表达,一方面可通过以分子海绵的形式吸附miR-18a-5p,从而下调抑癌基因SORBS2的表达,进而促进肿瘤细胞的增殖;另一方面可通过lncRNA-UCA1/hnRNP F/FGFR2 IIIc参与激活PI3K-AKT信号通路介导的促食管癌EMT进程。

杨晨晨^[9]（2016）在《微小RNA（MicroRNA）26a及下游靶基因MTDH在食管癌转移中调控机制的研究》文中研究表明目的:探讨微小RNA（Micro RNA）26a（mi R-26a）及异粘蛋白（MTDH）在食管鳞状细胞癌（ESCC）转移中的作用。验证mi R-26a及MTDH之间的调控关系。探讨mi R-26a/MTDH途径能否成为诊断和治疗食管癌的分子靶标之一。方法:（1）采用原位杂交法在组织水平检测86例ESCC组织（含配对癌旁正常食管组织78例）中mi R-26a的表达。确定食管鳞癌和配对癌旁正常食管组织中mi R-26a的表达水平,并分析其与各临床病理参数（患者年龄、性别、肿瘤病理分级、分化程度、淋巴结转移）的关系。分析mi R-26a的表达与食管癌预后的关系。采用实时荧光定量PCR（q RT-PCR）检测mi R-26a在6种食管癌细胞系及正常食管上皮细胞中的本底表达。采用mi R-26a过表达和干扰慢病毒稳定转染ESCC细胞系。运用q RT-PCR技术检测转染干扰和过表达mi R-26a慢病毒后mi R-26a表达水平的变化;用四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法、细胞划痕实验检测mi R-26a过表达和干扰慢病毒稳定转染ESCC细胞系后对食管癌细胞增殖、迁移能力的改变;流式细胞术检测mi R-26a干扰和过表达慢病毒后细胞周期和凋亡的变化。（2）采用免疫组织化学法在组织水平检测86例ESCC组织（含配对癌旁正常食管组织78例）中MTDH的表达。确定食管鳞癌和配对癌旁正常食管组织中MTDH的表达水平,并分析其与各临床病理参数（患者年龄、性别,肿瘤病理分级、分化程度、淋巴结转移）的关系。分析MTDH的表达与食管癌预后的关系。（3）采用Meta分析对MTDH在鳞状细胞癌（SCC）中表达及临床病理学意义进行研究。（4）通过生物信息学软件Target Scan,分析mi R-26a与人MTDH基因m RNA的3’非翻译区潜在的结合位点。通过q RT-PCR和Westem blot检测食管癌细胞中转染过表达mi R-26a和mi R-26a干扰慢病毒后,细胞中MTDH m RNA和蛋白水平的表达变化。用人类基因组DNA上扩增并亚克隆野生型以及突变mi R-26a结合位点的MTDH基因的3’非翻译区序列进入双荧光报告基因载体,分别命名为3’-UTR MTDH和3’-UTR Mut MTDH。通过转染试剂将化学合成的NC或mi R-26a模拟物或相应的抑制物和3’-UTR MTDH或3’-UTR Mut MTDH共转染进入Eca109食管癌细胞系,检测NC、mi R-26a或mi R-26a的抑制物分别对3’-UTRMTDH和3’-UTR Mut MTDH报告基因表达的影响。（5）选取58周龄的BALB/c-nu鼠（简称裸鼠）,进行裸鼠皮下荷瘤实验。用mi R-26a过表达和干扰慢病毒稳定转染ESCC细胞系,细胞计数后按2×107个细胞/0.2m L/鼠的剂量接种于裸鼠背部皮下,后每周称重1次,测量并观察瘤块的生长情况。瘤块长出后,用游标卡尺测量裸鼠瘤块长径（A）及垂直横径（B）,按公式V=A×B2/2计算裸鼠肿瘤体积,绘制肿瘤体积增长曲线及体质量曲线。接种后28 d,麻醉后照相,用脱颈法处死裸鼠。采用原位杂交法和免疫组织化学法检测裸鼠瘤块组织中mi R-26a和MTDH的表达。结果:（1）mi R-26a在食管鳞状上皮细胞的胞浆及胞核中表达,在食管癌组织中低表达。mi R-26在食管癌组织中的表达明显低于配对癌旁正常食管组织,差异有统计学意义（2c=4.572,P=0.033）。食管癌组织中mi R-26a的表达与患者的病理分级、N分期、肿瘤体积有关（P<0.05）。Spearman等级相关分析表明,mi R-26a表达水平与病理分级（r=0.262,P=0.018）和N分期（r=0.247,P=0.023）有关。Kaplan-Meier分析显示,高mi R-26a表达的患者生存时间更长,低mi R-26a表达的患者生存时间较短（log-rank检验,P=0.019）。此外,单因素Cox回归分析表明,mi R-26a的表达、大体类型、淋巴结转移是ESCC的预后影响因素。多因素Cox回归分析表明,大体类型、淋巴结转移是ESCC的预后影响因素。mi R-26a在6种食管癌细胞系中的表达水平均明显低于正常食管上皮细胞（HEEC）。6种食管癌细胞系中,mi R-26a在KYSE450细胞系中表达最高,在Eca109细胞系中表达最低。因此,本研究采用Eca109细胞系研究mi R-26a过表达对ESCC细胞功能的影响,KYSE450细胞系研究mi R-26a干扰对ESCC细胞功能的影响。为了验证过表达mi R-26a后对ESCC细胞的影响,根据细胞转染的慢病毒种类将实验分3组:scramble Eca109组（正常培养的Eca109细胞）、LV-con组（转染随机序列慢病毒）及LV-mi R-26a组（转染过表达慢病毒mi R-26a）。为了验证mi R-26a干扰对ESCC细胞的影响,根据细胞转染的慢病毒种类将实验分3组:scramble KYSE450组（正常培养的KYSE450细胞）、LV-con组（转染随机序列慢病毒）及LV-mi R-26a-inhibitor组（转染干扰慢病毒mi R-26a）。转染mi R-26a过表达慢病毒后,LV-mi R-26a组m RNA水平较scramble Eca109组及LV-con组明显下调（P<0.05）;而mi R-26a干扰后,LV-mi R-26a-inhibitor组m RNA水平较scramble KYSE450组及LV-con组明显上调（P<0.05）。细胞增殖实验结果显示,过表达mi R-26a能够抑制Eca109细胞的增殖,干扰mi R-26a能够促进KYSE450细胞的增殖。过表达mi R-26a能够抑制Eca109细胞迁移能力,干扰mi R-26a能够促进KYSE450细胞的迁移能力。细胞凋亡实验显示,mi R-26a过表达和干扰均对ESCC细胞凋亡未产生影响。mi R-26a过表达可诱导细胞周期阻滞。mi R-26a下调能促进G1期的细胞过渡到S期。（2）MTDH在食管癌细胞和少量正常食管上皮细胞中均有表达,阳性细胞主要定位在胞浆,少量定位于细胞核,呈浅黄、棕黄色或褐色颗粒。在86例食管鳞癌组织,MTDH的阳性表达率为54.65%（47/86）,在配对癌旁正常食管组织中MTDH的阳性表达率为14.10%（11/78）,MTDH在食管癌组织中的阳性表达率明显高于配对癌旁正常食管组织,差异有统计学意义（P<0.05）。MTDH在食管癌中的表达与N分期（P=0.016）、分化程度（P=0.005）有关;发生淋巴结转移的患者MTDH表达的阳性率明显高于未发生淋巴结转移患者,差异有统计学意义（P<0.05）。Spearman等级相关分析表明,MTDH的表达水平与食管癌的分化程度（r=0.296,P=0.005）和N分期（r=0.609,P=0.044）有关。Kaplan-Meier分析显示,患者MTDH的表达高,生存时间更短,低MTDH表达的患者生存时间更长（log-rank检验,P=0.001）。此外,单因素Cox回归分析表明,mi R-26a的表达、大体类型、N分期是ESCC的预后影响因素。多因素Cox回归分析表明,大体类型、N分期是ESCC的预后影响因素。MTDH在鳞状细胞癌（SCC）中表达及其意义的Meta分析显示,MTDH的高表达与SCC的淋巴结转移、临床分期和T分期有关。另外,MTDH在细胞中主要定位于细胞质。（3）mi R-26a能够通过结合到MTDH基因的3’非翻译区保守的mi R-26a结合位点负调控MTDH基因的表达。干扰mi R-26a后,MTDH的表达明显增加,过表达mi R-26a后,MTDH的表达明显减少。采用sperman相关性检验分析mi R-26a与MTDH表达,mi R-26a与MTDH表达呈负相关关系（r=-0.249,P<0.05）。mi R-26a过表达细胞皮下注射裸鼠后,过表达组的瘤体生长较其他两组明显减慢（P<0.05）,3组间在各个测量时间点平均瘤体体积差异有统计学意义（P<0.05）。过表达组的瘤体体积明显低于其他两组,差异有统计学意义（P<0.05）。干扰组的瘤体生长较其他两组明显增快（P<0.05）。瘤体体积明显高于其他两组,差异有统计学意义（P<0.05）。在裸鼠体内,mi R-26a能明显地抑制食管鳞癌细胞的生长。mi R-26a在裸鼠瘤块组织中低表达。干扰mi R-26a后裸鼠瘤块组织中MTDH的表达明显升高,过表达mi R-26a后裸鼠瘤块组织中MTDH的表达明显降低,MTDH与mi R-26a的负调控关系。结论:mi R-26a在食管癌中呈低表达,mi R-26a能抑制食管鳞癌细胞的增殖、迁移以及影响细胞的周期分布,但对细胞的凋亡无影响。MTDH在食管癌中呈高表达,MTDH主要定位于细胞质中。MTDH与mi R-26a呈靶向负调控关系。mi R-26a/MTDH途径可能是诊断和治疗食管癌的分子靶标之一。

郭琼^[10]（2015）在《甲基化、乙酰化修饰改变对食管癌细胞生长及相关基因表达的研究》文中提出目的:1)在食管癌Eca109和KYSE150细胞中改变表观遗传学修饰并检测该修饰对食管癌细胞形态、细胞周期和细胞凋亡变化的影响,为今后临床食管癌使用TSA和5-Aza-dC的药物治疗奠定前期实验基础;2)以PTEN、Survivin和IKKα/IKKβ为抑癌基因、癌基因和肿瘤转移基因（癌基因）的代表,观察TSA和5-Aza-dC对靶基因甲基化和细胞内乙酰化的作用;深入观察低甲基化联合高乙酰化的结果。探讨食管癌发生中癌基因、抑癌基因和肿瘤转移基因（癌基因）的甲基化和乙酰化修饰的可逆性、不一致性和甲基化联合乙酰化的交互作用结果;3)将靶基因表观遗传学修饰改变、表达异常和食管癌发生相关联,探究在食管癌中改变表观遗传学修饰对癌基因、抑癌基因和肿瘤转移基因（癌基因）表达的影响,为临床食管癌的早期发现和诊治提供分子检测指标。方法:1)以人食管鳞状上皮细胞癌Eca109和KYSE150为实验模型,设置药物TSA和5-Aza-dC的梯度作用浓度和时间（TSA为0.08μMol/L、0.4μMol/L、2μMol/L、10μMol/L和50μMol/L;5-Aza-dC为0.2μMol/L、1μMol/L、5μMol/L、25μMol/L和125μMol/L,作用时间为12h、24h和48h）,采用CCK-8试剂盒检测,绘制生长曲线并使用公式计算其抑制率,选择药物最佳作用浓度及时间;设立正常对照组、TSA组、5-Aza-dC组和联合用药组,运用细胞形态学观察、细胞周期和细胞凋亡检测指标验证TSA和5-Aza-dC对食管癌细胞是否产生了药物作用,分析比较在不同实验分组中各个指标的变化特点;2)根据课题组前期研究结果[130-131,187]（即食管癌中筛选差异表达基因）,选择PTEN、Survivin、IKKα和IKKβ作为靶基因,从表观遗传学角度进行检测:①甲基化检测,找到目标基因启动子上游2000bp左右的碱基序列,使用http://cpgislands.usc.edu/和http://www.urogene.org/cgi-bin/Methrimer/Methprimer.cgi软件观察碱基序列中CG分布及甲基化位点的预测情况。根据预测结果从中选择富含CG岛的碱基区段作为受试对象设计甲基化引物;提取实验各组样本的基因组DNA并行BSP法处理;以BSP法处理过的DNA为模板进行PCR扩增并TA克隆测序,用软件将测序结果与原序列对比得出甲基化分布黑白散点图,计算甲基化频率,分析比较变化特点;②乙酰化检测,抽提样本细胞核内的hdac,根据hdac活性检测试剂盒操作提示,建立标准品曲线,使用酶标仪获得吸光光度数值,代入公式计算hdac的相对含量,各组进行统计分析并比较变化特点;3)转录和翻译水检测:real-timepcr技术检测各实验组中靶基因的mrna表达情况;westernblot检测各实验组中靶基因的蛋白表达情况;结合第二部分实验结果,将上述指标进行相关性分析,验证甲基化、乙酰化和甲基化+乙酰化作用对靶基因在食管癌中表达的影响及可能存在的相互调控关系。结果:1)细胞学各项结果显示:①tsa和5-aza-dc在48h对eca109细胞的有效药物作用浓度为2μmol/l和5μmol/l。eca109细胞对两类药物表现出随药物强度增加和作用时间延长出现的生长抑制,其中tsa作用更显着（p<0.05）;②超微结构改变常常会早于细胞大体形态改变,且联合用药比单独用tsa或5-aza-dc产生破坏细胞超微结构作用更明显;③单独用药和联合用药都可以促进细胞凋亡,其中tsa和联合用药促进细胞凋亡作用显着（p<0.05）;kyse150细胞对不同分组药物的敏感性弱于eca109细胞。④单独用药和联合用药可以使两类细胞被阻滞于细胞周期的不同时限内。tsa可阻滞eca109细胞于g0/g1期和g2/m期、阻滞kyse150细胞于g2/m期;5-aza-dc阻滞两类细胞于s期;联合用药组阻滞两类细胞于g2/m期。2)甲基化和乙酰化检测:①抑癌基因pten启动子区域甲基化频率较高,使用5-aza-dc后甲基化频率降低（p<0.01）,联合tsa用药后甲基化频率降低明显（p<0.01）;癌基因survivin启动子区域甲基化频率较低,使用药物干预后甲基化频率降低不明显;肿瘤转移基因（癌基因）ikkα和ikkβ启动子区域甲基化频率较survivin高,但低于pten;使用5-aza-dc后甲基化频率降低（p<0.05）,联合tsa用药后甲基化频率降低明显（p<0.01）。②不同食管癌中hdac浓度含量不一致,tsa作用后可有效降低细胞核内hdac含量,联合5-aza-dc并没有出现显着降低hdac的作用。3)靶基因表达:①抑癌基因pten:mrna和蛋白在不同类型食管癌中的表达较为一致;tsa或5-aza-dc均有助于食管癌中pten表达升高,两药联合作用后表达则显着增高（p<0.01）;相关性分析显示其甲基化改变与mrna负相关（p<0.01）,与蛋白表达呈负相关趋势（无统计学意义）;乙酰化改变与mrna有负相关趋势（无统计学意义）,与蛋白表达呈负相关（p<0.05）。②癌基因survivin:mrna在不同类型食管癌中的表达较为一致,蛋白表达在eca109中高于kyse150（p<0.05）;tsa和5-aza-dc分别可以抑制食管癌中survivin的高表达,两药联合作用后表达进一步被抑制,相关性分析显示甲基化和乙酰化改变与survivin表达呈正相关趋势,相关性较低。③肿瘤转移基因（癌基因）ikkα/ikkβ:mrna在不同类食管癌中的表达较为一致,ikkα蛋白表达在kyse150中较高,ikkβ蛋白表达在eca109中较高;tsa和5-aza-dc分别可以抑制食管癌中ikkα/ikkβ的高表达,两药联合作用后表达进一步被抑制（p<0.01）,相关性分析显示乙酰化改变与IKKα表达呈负相关（P<0.05）,相关性较高,甲基化频率与其有正相关趋势,但相关系数较低;甲基化频率和HDAC浓度的改变与IKKβ有正相关趋势,但是相关性较低。结论:1)TSA和5-Aza-d C在抑制食管癌细胞生长方面存在差异,单独用药和联合用药对食管癌细胞生长影响不同,说明TSA主导的增高乙酰化和5-Aza-dC主导的降低甲基化及二者联合作用对食管癌细胞的生长有阻碍作用,这为今后用表观遗传学理论指导临床用药提供治疗参考;2)以PTEN、Survivin和IKKα/IKKβ为代表的抑癌基因、癌基因和肿瘤转移基因（癌基因）在食管鳞状细胞癌中的甲基化修饰程度不同,本研究显示抑癌基因PTEN>肿瘤转移基因（癌基因）IKKα/IKKβ>癌基因Survivin;在上述三类基因中,5-Aza-dC可有效的产生去甲基化作用,但TSA不能够显着改变启动子区域甲基化状态,联合用药时TSA有助于5-Aza-dC去甲基化作用增强;3)不同类型食管癌细胞中,乙酰化修饰程度不一致体现在HDAC的浓度上。TSA可以有效地降低细胞内HDAC含量,联合去甲基化作用后并不增强TSA产生的提高乙酰化作用;4)改变表观遗传学对食管鳞状上皮细胞癌修饰结果导致靶基因在mRNA和蛋白水平有不同程度的表达升高或抑制,具体是抑癌基因PTEN甲基化降低、乙酰化升高促进该基因表达;癌基因Survivin经药物作用后表观遗传学修饰改变不明显,但最终该基因表达有改变,可能是受到PTEN和IKKα/IKKβ局部调控作用;IKKα甲基化降低、乙酰化升高抑制该基因的表达;IKKβ甲基化降低,乙酰化升高抑制该基因表达。以甲基化和乙酰化为主的表观遗传学修饰改变可能更多的参与了PTEN和IKKα/IKKβ的表达调控,而直接未参与调节Survivin的表达。

二、抑癌基因PTEN在食管癌中的表达（论文开题报告）

（1）论文研究背景及目的

此处内容要求：

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例：

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

（2）本文研究方法

调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、抑癌基因PTEN在食管癌中的表达（论文提纲范文）

（1）长链非编码RNA CASC2在食管鳞状细胞癌中的作用研究（论文提纲范文）

（2）Circ-FIG4/miR-99a/ABHD4轴影响人食管癌进展的分子机制研究（论文提纲范文）

（3）哈萨克族食管癌甲基化易感基因表达水平及其临床意义的研究（论文提纲范文）

（4）MicroRNA-4286靶向INPP4A激活JAK2/STAT3信号通路调控食管癌生长、迁移和侵袭的机制研究（论文提纲范文）

（5）PTEN基因在食管癌中的研究进展（论文提纲范文）

（6）miR-106b-3p靶向ZNRF3调控食管鳞癌恶性生物学行为及分子机制研究（论文提纲范文）

（7）lncRNA GAS5/miR-21/SOX6信号轴调控新疆哈萨克族食管癌进程的机制研究（论文提纲范文）

（8）长链非编码RNA UCA1参与亚硝胺和藻毒素联合染毒致食管癌发生发展机制研究（论文提纲范文）

（9）微小RNA（MicroRNA）26a及下游靶基因MTDH在食管癌转移中调控机制的研究（论文提纲范文）

（10）甲基化、乙酰化修饰改变对食管癌细胞生长及相关基因表达的研究（论文提纲范文）

四、抑癌基因PTEN在食管癌中的表达（论文参考文献）

• [1]长链非编码RNA CASC2在食管鳞状细胞癌中的作用研究[D]. 冯健. 苏州大学, 2020(02)
• [2]Circ-FIG4/miR-99a/ABHD4轴影响人食管癌进展的分子机制研究[D]. 薛文华. 郑州大学, 2020(02)
• [3]哈萨克族食管癌甲基化易感基因表达水平及其临床意义的研究[D]. 丹尼尔·多里坤. 新疆医科大学, 2020(07)
• [4]MicroRNA-4286靶向INPP4A激活JAK2/STAT3信号通路调控食管癌生长、迁移和侵袭的机制研究[D]. 张猛. 山东大学, 2019(02)
• [5]PTEN基因在食管癌中的研究进展[J]. 梁承潇,沈钢. 实用肿瘤杂志, 2019(05)
• [6]miR-106b-3p靶向ZNRF3调控食管鳞癌恶性生物学行为及分子机制研究[D]. 乔冠恩. 苏州大学, 2019(06)
• [7]lncRNA GAS5/miR-21/SOX6信号轴调控新疆哈萨克族食管癌进程的机制研究[D]. 孙清超. 新疆医科大学, 2019(02)
• [8]长链非编码RNA UCA1参与亚硝胺和藻毒素联合染毒致食管癌发生发展机制研究[D]. 王祥虎. 东南大学, 2018(01)
• [9]微小RNA（MicroRNA）26a及下游靶基因MTDH在食管癌转移中调控机制的研究[D]. 杨晨晨. 新疆医科大学, 2016(08)
• [10]甲基化、乙酰化修饰改变对食管癌细胞生长及相关基因表达的研究[D]. 郭琼. 新疆医科大学, 2015(03)