张凡凡,夏仕文,谢永芳,刘姣,林晖[1]（2021）在《类产碱假单胞菌XW-40发酵-生物转化级联产生D-脯氨酸》文中指出建立了一个新颖的用于产生D-脯氨酸的发酵-生物转化过程.发酵过程中,以DL-脯氨酸为发酵前体,类产碱假单胞菌XW-40利用L-对映体诱导产生脯氨酸脱氢酶,D-对映体完全保留.在最优条件下,发酵阶段产生6 g/L D-脯氨酸.生物转化过程中,细胞不经分离,发酵液直接作为反应介质.采用分批补料策略实现DL-脯氨酸中L-对映体的转化.DL-脯氨酸单批补料浓度为10 g/L,补料次数达到5批.通过发酵和生物转化的级联,累积的D-脯氨酸浓度达到31 g/L,ee>99%.推测了生物转化过程中D-脯氨酸产生的反应机理.
龙梦飞[2]（2021）在《系统代谢改造大肠杆菌高效合成反式-4-羟基-L-脯氨酸》文中提出氨基酸发酵是我国发酵工业的支柱产业。羟化氨基酸作为其中一类高附加值小品种氨基酸,其在食品、医药、材料化工等方面均有广泛的应用。羟脯氨酸是在其前体脯氨酸（L-proline,L-Pro）的五元环羟化后的衍生物,其中的反式-4-羟基-L-脯氨酸（trans-4-hydroxy-L-proline,trans-4-Hyp）是一种重要的手性氨基酸。trans-4-Hyp可作为碳青霉烯类抗生素等重要物质的前体,其在医药保健、食品等领域具有重要价值。trans-4-Hyp可利用微生物法生产,该方法具有极大的经济效应和环境效益。根据流加底物的不同,微生物法生产trans-4-Hyp可分为以葡萄糖等廉价碳源从头发酵生产,以及流加前体L-Pro生产两种方式。目前,微生物法生产trans-4-Hyp的研究主要为外源添加L-Pro发酵,这种生产方式需要外源添加大量的L-Pro作为底物,且发酵液中L-Pro与trans-4-Hyp的分离也大大增加了其工业化生产成本。以葡萄糖等廉价碳源的从头发酵生产trans-4-Hyp可实现原料低成本、产品高产出,其将逐渐成为适应工业化生产trans-4-Hyp的主流趋势。然而,高产羟化氨基酸生产菌株的改造面临三个问题:前体氨基酸底盘细胞的构建较复杂;共底物α-KG供应不足;以及氨基酸羟化酶的催化效率较低。本研究试图提出一种通用的微生物高效合成羟化氨基酸策略,以改造大肠杆菌生产trans-4-Hyp为研究目标,利用合成生物学、代谢工程以及蛋白质工程改造技术系统改造大肠杆菌生产trans-4-Hyp,主要研究结果如下:（1）构建了基于稀有密码子选择的L-Pro筛选系统。分别在kanR和apmR中替换不同数量的对应的L-Pro稀有密码子,并在大肠杆菌中构建诱变质粒MP6辅助进化的、基于稀有密码子选择的L-Pro筛选系统。筛选获得的突变菌株E.coli PM-14在摇瓶水平下的L-Pro含量达到0.816 g/L,且经5 L发酵罐补料分批发酵后L-Pro产量为18.2 g/L,生产强度为0.455 g/L/h。进一步在S.marcescens中验证该筛选系统,通过ARTP制备S.marcescens JNB5-1文库,并通过基于稀有密码子选择的L-Pro筛选,获得的突变株LK-18的灵菌红素的产量比出发菌株高3.3倍。对野生型菌株S.marcescens JNB5-1和突变菌株S.marcescens JNB5-1 LK-18中的pig I分别敲除后,后者的L-Pro产量是前者的2.6倍。（2）人工创制trans-4-Hyp新型合成路线,即首次尝试利用精氨酸-4羟化酶、精氨酸酶和鸟氨酸环化脱氨酶的级联反应创建trans-4-Hyp的全细胞级联催化策略。此外,首次将稀有密码子筛选策略用于酶定向进化。采用结合稀有密码子选择和pEvolvR的筛选策略对鸟氨酸环化脱氨酶进行改造,单突变体K205G、M86K和T162A酶活分别提高了70.3%,64.8%和55.7%。组合突变后,三突变体OCDM86K/T162A/K205G的活性提高了2.41倍,其kcat值是OCDWT的2.85倍。重组菌GAO-4经全细胞转化生成的trans-4-Hyp产物浓度达105.5 mg/L,是重组菌GAO-1的2.35倍。进一步基于Red Libs的智能RBS组合对多酶催化trans-4-Hyp途径进行优化,重组菌株EH#1的trans-4-Hyp产量达189.3mg/L,产量较优化前提高79.4%。在EH#1的基础上,引入氧化还原及辅酶自给循环,即共表达gox和cat以消除H2O2副产物,并共表达nox用于NAD+辅酶循环。经全细胞转化体系优化后,重组菌株GAO-5 trans-4-Hyp产量达269.2 mg/L。（3）利用比较转录组分析突变株PM-14的L-Pro相关合成途径,包括糖酵解、TCA循环、L-Pro合成途径和L-Pro转运系统的转录水平变化。与野生型菌株相比,PM-14中编码糖酵解酶的基因具有更高的转录水平。在PM-14的TCA途径中,编码异柠檬酸脱氢酶和乌头酸酶的icd和acn显示出明显增加的转录水平,这增强了α-KG的代谢通量。此外,限速酶基因proB在PM-14突变菌株中也具有更高的转录水平。进一步利用代谢工程对PM-14进行改造,即敲除putA、putP、proP和aceA基因,并对proB进行定点改造以消除反馈抑制。M10菌株中的L-Pro产量达37.5 g/L,为出发菌PM-14的L-Pro产量的2.06倍,生产强度为0.938 g/L/h。进一步将p DXW-10-Datp4h转化至M10菌株中,获得的重组菌HM10的trans-4-Hyp产量达15.7 g/L,但同时也导致了发酵液中L-Pro积累达18.1 g/L。（4）设计基于群体感应基因线路调控策略动态调控α-酮戊二酸脱氢酶活性。sucA基因的天然启动子被PesaS启动子取代,在不存在高丝氨酸内酯（Acyl-homoserine lactones,AHL）时可与转录调节子EsaRI70V结合后触发其转录。胞内逐渐积累的AHL破坏Pesa S启动子与EsaRI70V的结合并抑制ODHC活性。四个不同强度的Pbs启动子可驱动不同水平的esa I表达,从而可控制AHL的动态积累。因此,在不同时间下调PesaS启动子可获得较佳的α-KG代谢流。经验证,该群体感应基因线路调控系统可动态控制GFP表达。进一步将群体感应基因线路调控系统用于调节ODHC活性,HM14经补料分批发酵后的trans-4-Hyp产量达43.2 g/L,为对照菌的2.75倍。此外,HM14中残留的L-Pro较对照菌下降了76.6%,但仍积累了4.3 g/L的L-Pro。（5）以Dactylosporangium SP.RH1的脯氨酸羟化酶序列为参考,利用NCBI中的BLASTP选取几条假定的trans-P4H,经酶活测定筛选出具有最高羟化活力的UB2TP4H。根据结构比对分析,对UB2TP4H中的170和172位点共设计了四个单突变点。其中,单突变体UB2TP4HL170A和UB2TP4HP172N的酶活分别提高了16.1%和27.8%。组合突变后,双突变体UB2TP4HL170A/P172N的比活达115.5 U/mg,较UB2TP4HWT提高了38.2%。进一步的结构分析表明,L170A和P172N突变后与底物形成额外的氢键。利用Gromacs软件分别对UB2TP4HWT和双突变体UB2TP4HL170A/P172N的蛋白质复合物进行分子动力学模拟,双突变体UB2TP4HL170A/P172N的底物结合口袋较UB2TP4HWT大,且底物口袋的构象波动较UB2TP4HWT稳定,其loop170-175的RMSF也更低。Rosetta工具Cartesian＿ddg测定了酶与底物L-Pro之间的结合自由能ΔΔG,双突变体UB2TP4HL170A/P172N的ΔΔG为-3.27 KJ/mol。经5 L发酵罐发酵,双突变体重组菌HMH的trans-4-Hyp最终产量达54.8g/L,较HM14高26.9%,糖酸转化为0.236 g/g。此外,L-Pro残留量最终降至0.2 g/L。
景晓冉[3]（2021）在《Fe（Ⅱ）/α-酮戊二酸依赖型双加氧酶催化合成羟基氨基酸及其耦联体系的构建》文中指出手性羟基氨基酸是一类重要的手性模块化合物,如羟基异亮氨酸、羟基脯氨酸、羟基丙氨酸等,广泛应用于手性药物制剂及手性医药中间体的合成。Fe（Ⅱ）/α-酮戊二酸依赖型双加氧酶（Fe/2-KG DOs,EC1.14.11.1～49）是一类专一性依赖亚铁离子和α-酮戊二酸（2-KG）的单核非血红素铁酶,能够催化多种类型C-H键氧化反应,转化氨基酸底物合成羟基氨基酸,在手性羟基氨基酸的选择性合成方面扮演着重要的角色。目前,针对羟基氨基酸的合成,能够高效羟基化游离氨基酸的双加氧酶资源相对匮乏;且Fe/2-KG DOs选择性识别游离氨基酸的作用机制认识仍不清楚;此外,Fe/2-KG DOs羟基氨基酸合成过程严格依赖共底物2-KG,2-KG的供给会直接影响Fe/2-KG DOs的催化效率。针对以上问题,本研究以已知功能酶的基因或氨基酸序列为探针在数据库中进行检索,同时结合分子模拟等工具筛选功能类似的同源序列,以获得新型双加氧酶资源。进一步,通过解析Fe/2-KG DOs选择性羟基化反应的分子作用机制,锁定参与底物选择性识别和催化的关键位点,进而通过分子改造手段改善其催化特性。最后,构建高效、低成本2-KG供给的共性反应体系,实现羟基氨基酸的高效合成。主要研究结果如下:（1）针对杂环类氨基酸底物,以Dactylosporangium sp.来源的L-脯氨酸4-羟化酶（P4H）为模板在Gene Bank中挖掘具有相似同源结构的潜在新酶序列信息,以L-脯氨酸为模式底物,获得来源于Kutzneria albida的Ka PH1可催化L-脯氨酸选择性羟基化生成反式-4-羟基-L-脯氨酸（trans-4-Hpro）。以120 m M的L-脯氨酸作为底物时,反应4 h后,摩尔产率达到92.8%,时空产率达到3.93 g·（L·h）-1。此外,Ka PH1在催化杂环类氨基酸衍生物C-H键的氧化反应中具有很大的潜力,对L-高脯氨酸及3,4-脱氢-L-脯氨酸都展示出很高的活性。随后,基于Escherichia coli Ka PH1菌株的L-脯氨酸羟基化活性,利用自诱导培养基,将产酶表达和催化过程进行耦联,对整个反应过程进行阶段性温度调控,利用内源2-KG实现L-脯氨酸的高效转化。（2）针对脂肪族氨基酸底物,L-异亮氨酸双加氧酶（IDO）可催化一系列疏水性氨基酸形成羟基氨基酸。以L-正亮氨酸为底物时,IDO存在区域选择性的问题。基于IDO的蛋白结构信息（PDB:6LNH）,利用分子模拟手段锁定IDO结构中选择性识别和催化羟基化反应的关键位点,通过饱和突变策略获得了库容量约1000株的突变文库。以L-正亮氨酸为底物,突变体D173E的比活比野生型IDO提高了40.27%;突变体T244S显示出很高的区域选择性,产物5-羟基正亮氨酸与4-羟基正亮氨酸的比例为1:20.47,而野生型IDO为1:3.73。同时发现,当244位的苏氨酸突变成小体积氨基酸可明显提高IDO催化的区域选择性,获得4-羟基正亮氨酸纯度均大于95%。分子动力学模拟结果解释了底物分子在催化中心的定位不明确导致的催化位置羟基化的偏好性现象,当D173被谷氨酸取代后,其侧链长度的增长会减小底物分子侧链的摆动,从而束缚底物分子导致酶催化速率增加。（3）针对Fe/2-KG DOs对共底物2-KG的依赖性,以IDO介导的（2S,3R,4S）-4-羟基异亮氨酸（4-HIL）为模式反应,采用模块化设计思路,从廉价易得的L-谷氨酸出发,构建由L-谷氨酸氧化酶（LGOX）催化的2-KG供给模块和模式酶IDO催化的羟基化模块组成的体外级联反应体系。首先,尝试建立“一锅法”级联反应合成4-HIL,发现IDO和LGOX分别被H2O2和Fe2+抑制,表明LGOX催化L-谷氨酸生成2-KG反应与IDO介导的底物羟基化反应不相容。随后,建立两步法级联反应合成4-HIL,整个级联体系反应时间为14.5 h,最终产生465 m M 4-HIL,产率为93%。同时,将该体外级联系统应用于L-亮氨酸、L-正亮氨酸、L-正缬氨酸高效转化,成功实现了一系列脂肪族羟基氨基酸的高效合成。（4）针对上述级联反应中2-KG供给模块H2O2积累问题,基于Fe-N-C单原子催化剂的类过氧化氢酶（CAT）活性,将其与生物酶LGOX结合,建立Fe-N-C单原子纳米酶级联反应器（Fe-ZIF-LGOX）,降解副产物H2O2的毒害作用。其中,小粒径的Fe-ZIF-LGOX（50 nm）展现出较好的催化性能,其kcat/Km值约为游离LGOX的1.34倍。此外,与游离酶LGOX相比,Fe-ZIF-LGOXs温度和p H耐受范围变宽,热稳定性得到明显提升。将不同粒径的Fe-ZIF-LGOXs应用于2-KG的连续合成反应,经过六轮的重复使用,仍保留其初始活力的80%以上。进一步,将纳米级联反应器应用于羟基氨基酸的合成中,原位消除H2O2毒害的同时提高了体系的稳定性。
何迎粉[4]（2020）在《外源海藻糖改善酿酒酵母乙醇耐受性及葡萄酒品质的研究》文中进行了进一步梳理贺兰山东麓地区地理条件和气候条件优越,酿酒葡萄种植面积日益增长,葡萄酒酿造工业发展迅速,已经成为宁夏特色产业之一。随着全球气候变暖,葡萄果实含糖量升高,潜在酒度增加,使得酿酒酵母在酒精发酵阶段面临的酒精胁迫更加严重,导致发酵不完全,从而影响葡萄酒品质和贮藏条件。本文通过研究外源海藻糖、肌醇和脯氨酸对酿酒酵母乙醇耐受性的影响,从中筛选出最佳外源添加物及添加量,进一步研究发酵过程理化指标的变化趋势及酿酒酵母发酵特性,并将其应用于赤霞珠发酵实验,旨在为提高赤霞珠葡萄酒品质提供一定的理论依据。具体研究内容及实验结果如下:（1）乙醇耐受性实验:选择宁夏本土酿酒酵母NX1 1424（Saccharomyces cerevisiae NX11424）为实验菌株,海藻糖、肌醇和脯氨酸为添加物,设置实验酒度为12、14和16,探究其对酿酒酵母乙醇耐受力的影响。结果表明:添加300mg/L海藻糖使酿酒酵母菌密度达到最大值0.955;菌体海藻糖含量最大值为132.58mg/mL;胞内ATP含量最大值为4430.548 μmol/gport;质膜H+-ATP酶活力4.266 mgprot/mL;菌体麦角固醇含量最大值为550.8μg/mL。添加150 mg/L肌醇使酿酒酵母菌密度达到最大值0.792;菌体海藻糖含量最大值为109.928 mg/mL;胞内ATP含量最大值为4411.506 μmol/gport;质膜H+-ATP酶活力4.103 mgprot/mL;菌体麦角固醇含量最大值为490.8 μg/ml。添加200mg/L脯氨酸使酿酒酵母菌密度达到最大值0.7905;菌体海藻糖含量最大值为109.15 mg/mL;胞内ATP含量最大值为4233.776 μmol/gport;质膜H+-ATP酶活力4.024 mgprot/mL;菌体麦角固醇含量最大值为482.8 μg/mL。综合分析不同酒度中各发酵组菌体密度、菌体海藻糖含量、胞内ATP含量、质膜H+-ATP酶活力和菌体麦角固醇含量,得出这三种物质对酿酒酵母乙醇耐受力影响顺序为海藻糖>肌醇>脯氨酸。（2）模拟葡萄汁发酵实验:通过实验（1）确定添加物为海藻糖,添加量为300mg/L。根据糖醇转化率设置模拟葡萄汁的酒度为12、14和16,探究海藻糖在发酵早期、中期和晚期对酿酒酵母NX11424发酵特性的影响。结果表明:海藻糖可以提高酿酒酵母NX11424的发酵力、发酵速度和产酒率,使发酵液酒度升高,对总酸、pH值的影响较小。（3）赤霞珠发酵实验:将赤霞珠葡萄汁灭菌后,接入宁夏本土酿酒酵母NX11424和300mg/L海藻糖。通过测定发酵完成后各发酵组理化指标、酚类物质含量、色度色调和香气成分,探究海藻糖对赤霞珠发酵液品质的影响。结果表明:与对照组比较,海藻糖发酵组残糖、总酸和挥发酸含量降低,酚类物质含量和色度值升高,两组酒度、pH值和色调值无显着差异。海藻糖发酵组增加了香气物质的种类和含量,乙酸异戊酯、乙酸己酯、辛酸乙酯、辛酸异戊酯、月桂酸乙酯、月桂酸异戊酯和辛酸的含量增加,赋予葡萄酒浓郁的花香和果香。2-甲基-1-丁醇、庚酸乙酯、乙酸苯乙酯、棕榈酸乙酯和2,6,8-三甲基-4-壬酮增加的香气物质的种类,赋予葡萄酒更加复杂的香气。正癸酸和醋酸含量降低,未检出异戊醇,降低葡萄酒中不良风味物质,改善葡萄酒的口感。
李浩[5]（2020）在《改造谷氨酸棒杆菌及其利用秸秆酶解液发酵产羟脯氨酸》文中认为木质纤维素生物质是一种绿色、清洁的可再生资源,可广泛用于生产不同的生物加工产品（乙醇、丁醇和氨基酸等）。作为农业大国,我国每年会产生稻秆、麦秆、玉米秸秆和玉米芯等大量的农业废弃物。我国对农业废弃物的处理手段相对单一,主要处理方式为焚烧。本研究采用低共熔溶剂处理稻秆、小麦秸秆和玉米芯等木质纤维素生物质,选择处理效果最好的玉米芯为后续高值化利用的原料;然后将处理后的玉米芯经纤维素酶水解获得高糖浓度的水解液;最后采用Clostridium saccharobutylicum DSM 13864和代谢工程改造的谷氨酸棒杆菌利用水解液发酵得到丁醇和反式-4-羟基-L-脯氨酸,实现了玉米芯到高附加值产品的转化。主要研究内容和结果如下:（1）采用由乙胺盐酸盐和乳酸合成的DES（EaCl:Lac）预处理小麦秸秆、稻秆和玉米芯等农业废弃物,发现EaCl:Lac对玉米芯的处理效果最好。通过对预处理前后玉米芯中纤维素、半纤维素和木质素等组分含量进行测定发现,EaCl:Lac去除了玉米芯中87.9%半纤维素和71.5%木质素,这增加了处理后玉米芯中纤维素含量,从而增大了玉米芯中纤维素与纤维素酶的接触机会。处理后的玉米芯经50 FPU·g-1total-solid纤维素酶水解得到总糖浓度为50 g·L-1的酶解液。为了进一步提高酶解效率,向酶解体系中添加0.5%Tween80,糖浓度提高至53.8 g·L-1,糖浓度比未添加Tween80时提高7.6%。（2）以玉米芯酶解液为碳源进行微生物发酵产丁醇。为了降低微生物发酵生产丁醇的成本,对附着在玉米芯上的纤维素酶进行了五次重复利用。对于对照组（未添加Tween80）,Cycle I的糖浓度为49.5 g·L-1;实验组（添加0.5%Tween80）Cycle I的糖浓度为52.9 g·L-1。在附着纤维素酶循环利用五次后,对照组和实验组Cycle VI的糖浓度分别为54.9 g·L-1和58.8 g·L-1。每批次纤维素酶添加量降低5 FPU·g-1total-solid,整个过程总共节约了75 FPU·g-1total-solid。C.saccharobutylicum DSM 13864使用对照组和实验组的Cycle VI酶解液进行发酵,其丁醇浓度分别为10.2 g·L-1和10.4 g·L-1,略低于相应的葡萄糖对照组的丁醇产量(11.2 g·L-1和11.4 g·L-1),均达到较好的丁醇发酵水平。（3）构建合成反式-4-羟基-L-脯氨酸（Hyp）的菌株并考察其在玉米芯酶解液中进行氨基酸发酵的能力。以鸟氨酸生产菌株KBJ07（SNK118ΔargRΔarg FΔncgl2228）作为出发菌株,为将菌株KBJ07改造为合成Hyp的菌株,在菌株KBJ07中异源表达鸟氨酸环化脱氨酶（ornithine cyclodeaminase,ocd）和脯氨酸羟化酶（proline-4-hydroxylase,p4h）。为减少脯氨酸的代谢消耗,利用CRISPR-Cpf1技术敲除菌株中的脯氨酸脱氢酶（putA）基因。得到以下菌株:LH02（LH01-pDXW-8）、LH03（LH01-pDXW-ocd/Dap4h）、LH04（LH01-pDXW-ocd/Ubp4h）、LH05（LH01-pDXW-Dap4h/ocd）和LH06（LH01-pDXW-Ubp4h/ocd）,菌株LH01为KBJ07ΔputA。上述菌株在发酵培养基中（碳源为葡萄糖）发酵92 h后,菌株LH06具备最高的Hyp生产水平,为310 mg·L-1。将其在玉米芯酶解液配制的的发酵培养基中发酵92 h后,发酵液中Hyp浓度为327 mg·L-1。因此,菌株LH06表现出良好的利用玉米芯酶解液发酵产酸的能力。本研究为将木质纤维素转变为氨基酸等高价值产品提供了新思路。
郑金珠,吴华伟,李相前[6]（2019）在《培养基添加剂促进重组大肠杆菌胞外分泌β-环糊精葡萄糖基转移酶的工艺优化》文中进行了进一步梳理随着对β-环糊精的需求的增加,开发提高β-环糊精葡萄糖基转移酶产量成为主要焦点之一。为了克服重组质粒pET28a-DacD-cgt-his胞外产酶量低的缺陷,研究了培养基添加剂对β-环糊精葡萄糖基转移酶胞外分泌的影响,提高胞外表达量。首先通过向培养基中分别添加表面活性剂（Tween-80、Triton X-100）、氨基酸（天冬氨酸、甘氨酸）、渗透调节剂（L-脯氨酸、山梨醇、甜菜碱）和环糊精（α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精）4种类型添加剂以确定对重组大肠杆菌胞外分泌β-环糊精葡萄糖基转移酶的有益添加剂;其次对Tween-80、Triton X-100、甘氨酸和L-脯氨酸进行单因素试验和正交试验以确定培养基添加剂的组合条件。结果表明,各因素对胞外产β-环糊精葡萄糖基转移酶的影响顺序依次是:Tween-80>Triton X-100>甘氨酸>L-脯氨酸;培养基添加剂促进胞外分泌β-环糊精葡萄糖基转移酶的最优组合是:Triton X-100 0.5%、Tween-80 2%、甘氨酸30 mmol/L、L-脯氨酸80 mmol/L,胞外产酶量达50.3 U/mL,是对照组的2.04倍。
李强,韩亚昆,蒋帅,张悦,吴鹤云,徐庆阳,谢希贤[7]（2020）在《代谢工程改造大肠杆菌合成反式-4-羟基-L-脯氨酸》文中进行了进一步梳理通过比对筛选,从Micromonospora sp. CNB394中获得高活性的L-脯氨酸-4-羟基化酶,随后利用规律成簇的间隔短回文重复-associated protein 9基因编辑方法,通过强化L-脯氨酸合成途径和引入高活性的L-脯氨酸-4-羟基化酶,构建1株以葡萄糖为碳源合成反式-4-羟基-L-脯氨酸的大肠杆菌基因工程菌HYP15。摇瓶发酵30 h,工程菌的反式-4-羟基-L-脯氨酸产量达到13.6 g/L。5 L发酵罐分批补料发酵40 h,反式-4-羟基-L-脯氨酸产量达到48.6 g/L,糖酸转化率和平均生产强度分别达到21.6%和1.22 g/（L·h）,具有良好的工业应用前景。
全冰华[8]（2017）在《嗜醋酸棒杆菌发酵生产L-脯氨酸的优化研究》文中研究指明L-脯氨酸是构成生物体蛋白质20种基本氨基酸之一,在工业、农业、食品及医药领域,有着非常广泛的应用,需求量不断增加。广东肇庆星湖生物科技有限公司上世纪90年代开始利用嗜醋酸棒杆菌进行有氧发酵获得L-脯氨酸,直到目前,在生产实践中还会遇到一些问题。本文立足于解决这些工艺上的问题,通过对工作菌种保藏方法、分批发酵培养条件的优化、发酵补料方式的优化、前体物质添加方式的优化。改进现有发酵工艺,提高并稳定发酵产酸水平,降低生产成本。主要结论如下:经过研究发现,发酵生产用菌种保藏的最关键因素时低温,嗜醋酸棒杆菌在超低温条件下,以斜面或者20%甘油作为介质,在360天之内,均可维持菌体的生长活性及产酸能力,在生产实践中分离复壮工作采取6个月开展一次,比原来的1个月一次会更节约生产成本。经过分批发酵培养条件的研究,发现分批发酵最佳碳源为水解淀粉糖,当水解淀粉糖浓度为100g·L-1,添加L-谷氨酸40g·L-1,经过70h的有氧发酵,产酸率可达69g·L-1。玉米浆为最佳速效氮源,10g·L-1玉米浆与5g·L-1丝肽粉组合会更好,可以将100g·L-1的水解淀粉糖及L-谷氨酸40g·L-1转化为71.1g·L-1L-脯氨酸。对比原工艺产酸率提高2g·L-1。在补料分批发酵中,最佳的初始还原糖浓度为80g·L-1,补加葡萄糖最适维持浓度为30-40g·L-1,在50L罐中发酵75h可获得112g·L-1,糖酸转化率为42.2%,对比其他维持浓度,高出4-12%。平均合成速率为1.56g·（L·h）-1。最佳的补加氮源为尿素,能自然控制发酵液的pH值,并避免“氨中毒”的现象。前体物质L-谷氨酸的能提高最终产酸率,并能促进菌体快速启动产酸。谷氨酸添加的时间应在菌体快速生长期,产酸阶段加入谷氨酸,吸收利用率会下降,一般在发酵初始的8 h内,谷氨酸的钠盐在培养基中形成较高的渗透压,因此,浓度应控制在60g·L-1以内,达到80g·L-1可以看到明显的抑制菌体生长的现象。
胡丹丹[9]（2015）在《无外源L-脯氨酸产反式-4-羟脯氨酸大肠杆菌的构建及发酵优化》文中研究指明反式-4-羟基-L-脯氨酸是L-脯氨酸羟基化后的产物,在医药、化工、食品、美容等行业中应用广泛。将微生物体内L-脯氨酸的生物合成途径与脯氨酸4-羟化酶催化的羟基化反应结合起来,在无外源L-脯氨酸的条件下直接从葡萄糖转化生成反式-4-羟脯氨酸,可以节约生产成本,充分利用微生物资源。首先,构建L-脯氨酸生物合成能力增强的重组大肠杆菌:通过全质粒PCR对克隆得到的pro BA中的pro B进行定点突变,突变的氨基酸位点是E143A、K145A;选择色氨酸串联启动子驱动突变基因的表达,构建得到重组质粒p ET28a-Ptrp2-pro BA2;发酵验证含有该重组质粒的重组大肠杆菌,摇瓶培养24 h测得L-脯氨酸的浓度可达1436mg/L,比原菌的L-脯氨酸积累量增加了约26倍。其次,构建无外源L-脯氨酸发酵生产反式-4-羟脯氨酸的共表达重组菌。在pro BA2、hyp基因共表达体系的构建中,选择这两个基因所在的载体p ET28a-Ptrp2-pro BA2、p UC19-Ptrp2-hyp作为共表达体系的依托,构建得到两个含有双基因的单质粒共表达体系和一个双质粒共表达体系,这两个基因的共表达可以实现从葡萄糖到反式-4-羟脯氨酸的连续转化。在以葡萄糖为单一碳源、无外源L-脯氨酸存在的培养基中,培养含有三个不同表达体系的重组大肠杆菌,发现以p UC19质粒作为共表达载体时,反式-4-羟脯氨酸的浓度较高,摇瓶培养24 h达到98.9 mg/L,比原始菌株的反式-4-羟脯氨酸浓度提高了一倍。最后,优化无外源L-脯氨酸发酵生产反式-4-羟脯氨酸的重组大肠杆菌的培养基,采用单因素和正交实验得到最适摇瓶培养基成分为:Glucose 10 g/L,Tryptone 15 g/L,Fe SO4 3 mmol/L,Mg SO4 1 g/L,K2HPO4 3 g/L,Ca Cl2 0.015 g/L,培养基的初始p H为7.0。发酵验证优化后的培养基,重组菌培养24 h后测得反式-4-羟脯氨酸浓度达到222.7mg/L,比优化前提高了1.25倍。
胡丹丹,王付才,张震宇,孙付保,周邦炜[10]（2015）在《无外源脯氨酸发酵产反式-4-羟脯氨酸重组大肠杆菌的构建及发酵优化》文中研究指明为实现无外源脯氨酸的条件下直接从葡萄糖转化生成反式-4-羟脯氨酸,本实验采用定点突变和基因共表达的方法构建重组大肠杆菌:首先对L-脯氨酸生物合成途径中的关键酶谷氨酸激酶进行定点突变E143A、K145A,以增强L-脯氨酸生物合成能力;然后引入脯氨酸4-羟化酶基因,通过两个基因的共表达可以实现从葡萄糖到反式-4-羟脯氨酸的连续转化,而不再需要添加外源L-脯氨酸。得到的L-脯氨酸生物合成能力增强的菌株在摇瓶阶段L-脯氨酸的产量可达到1.4 g/L;pro BA2与hyp双基因共表达菌株的反式-4-羟脯氨酸产量为98.9 mg/L,比原始菌株提高了一倍,经发酵优化后得到培养基为:葡萄糖10 g/L,胰蛋白胨15 g/L,硫酸亚铁3 mmol/L,硫酸镁1 g/L,磷酸氢二钾3 g/L,氯化钙0.015 g/L,在这个培养条件下反式-4-羟脯氨酸的产量为220.0 mg/L,比优化前提高1.2倍。
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本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 反式-4-羟基-L-脯氨酸及其生产方法 |
| 1.1.1 反式-4-羟基-L-脯氨酸性质 |
| 1.1.2 反式-4-羟基-L-脯氨酸的生理功能及应用 |
| 1.1.3 反式-4-羟基-L-脯氨酸的生产方法 |
| 1.2 反式-4-羟基-L-脯氨酸的生物合成 |
| 1.2.1 L-脯氨酸的生物合成及调控 |
| 1.2.2 脯氨酸-4-羟化酶 |
| 1.3 反式-4-羟基-L-脯氨酸工程菌株改造研究进展 |
| 1.4 本论文主要研究内容 |
| 1.4.1 立题依据与研究意义 |
| 1.4.2 研究内容 |
| 第二章 基于稀有密码子筛选策略筛选L-脯氨酸生产底盘细胞 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 试剂和仪器 |
| 2.2.2 菌株、质粒及引物 |
| 2.2.3 微生物培养 |
| 2.2.4 分子生物学操作 |
| 2.2.5 质粒及菌株构建 |
| 2.2.6 突变文库构建 |
| 2.2.7 重组酶制备和纯化 |
| 2.2.8 酶活测定 |
| 2.2.9 鸟氨酸环化脱氨酶动力学参数研究 |
| 2.2.10 产物分析 |
| 2.2.11 结构及分子动力学模拟分析 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 基于稀有密码子筛选的L-脯氨酸生产菌筛选系统验证 |
| 2.3.2 基于稀有密码子筛选的L-脯氨酸生产菌筛选系统构建 |
| 2.3.3 基于稀有密码子选择的鸟氨酸环化脱氨酶定向进化用于新型反式-4-羟基-L-脯氨酸生物合成 |
| 2.3.4 全细胞转化合成反式-4-羟基-L-脯氨酸体系的优化 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 代谢工程改造脯氨酸底盘细胞合成反式-4-羟基-L-脯氨酸 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 试剂和仪器 |
| 3.2.2 菌株、质粒及引物 |
| 3.2.3 微生物培养 |
| 3.2.4 分子生物学操作 |
| 3.2.5 菌株构建 |
| 3.2.6 酶的制备和纯化 |
| 3.2.7 产物分析 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 L-脯氨酸合成相关差异基因分析 |
| 3.3.2 代谢改造PM-14 提高L-Pro合成 |
| 3.3.3 过表达脯氨酸羟化酶生产反式-4 羟基-L-脯氨酸 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 基于群体感应基因线路动态调控α-酮戊二酸代谢流 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 试剂和仪器 |
| 4.2.2 菌株、质粒及引物 |
| 4.2.3 微生物培养 |
| 4.2.4 分子生物学操作 |
| 4.2.5 菌株构建 |
| 4.2.6 产物测定 |
| 4.2.7 酶活测定 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 群体感应基因线路调控系统的构建 |
| 4.3.2 群体感应基因线路调控系统的验证 |
| 4.3.3 群体感应基因线路动态调控ODHC活性 |
| 4.3.4 补料分批发酵 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 通过理性设计提高脯氨酸羟化酶催化活性 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 试剂和仪器 |
| 5.2.2 菌株、质粒及引物 |
| 5.2.3 微生物培养 |
| 5.2.4 菌株构建 |
| 5.2.5 酶活测定 |
| 5.2.6 酶学性质测定 |
| 5.2.7 酶的制备和纯化 |
| 5.2.8 产物分析 |
| 5.2.9 脯氨酸羟化酶动力学参数研究 |
| 5.2.10 结构及分子动力学模拟分析 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 新型脯氨酸羟化酶挖掘与表征 |
| 5.3.2 脯氨酸羟化酶及其突变体酶动力学研究 |
| 5.3.3 脯氨酸羟化酶及其突变体酶结构分析 |
| 5.3.4 脯氨酸羟化酶及其突变体酶分子动力学模拟及Rosetta分析 |
| 5.3.5 补料分批发酵 |
| 5.4 本章小结 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 论文创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅰ:作者在攻读博士学位期间发表的论文与专利 |
| 附录Ⅱ |
| 附录Ⅲ |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词注释表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 Fe/2-KG DOs概述 |
| 1.1.1 Fe/2-KG DOs的结构特征 |
| 1.1.2 Fe/2-KG DOs的共性催化机制 |
| 1.1.3 Fe/2-KG DOs的序列研究及系统发育分析 |
| 1.2 Fe/2-KG DOs的定向进化研究进展 |
| 1.2.1 非理性设计 |
| 1.2.2 理性设计 |
| 1.2.3 Fe/2-KG DOs分子改造的研究进展 |
| 1.3 Fe/2-KG DOs在羟基氨基酸合成中的应用 |
| 1.3.1 基于P4H合成羟脯氨酸 |
| 1.3.2 基于IDO合成4-HIL |
| 1.3.3 基于Sad A合成β-羟基α-氨基酸 |
| 1.3.4 基于L-亮氨酸羟化酶合成5-羟基-L-亮氨酸 |
| 1.3.5 CAS-Like超家族双加氧酶在羟基氨基酸合成中的应用 |
| 1.4 基于Fe/2-KG DOs酶促反应的转化系统构建及其研究进展 |
| 1.4.1 重构TCA循环途径 |
| 1.4.2 酶法合成 2-KG促进羟基氨基酸生成 |
| 1.5 多酶级联催化研究进展 |
| 1.5.1 多酶级联反应概述 |
| 1.5.2 体内级联反应 |
| 1.5.3 体外级联反应 |
| 1.6 本研究的目的和意义 |
| 1.7 主要研究内容 |
| 第二章 基于序列分析及分子模拟的功能双加氧酶挖掘 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 试剂和仪器 |
| 2.2.2 菌种和质粒 |
| 2.2.3 培养基与溶液 |
| 2.2.4 重组菌株的构建 |
| 2.2.5 重组菌株的培养及表达 |
| 2.2.6 重组菌株转化合成trans-4-Hpro |
| 2.2.7 重组蛋白的纯化 |
| 2.2.8 重组蛋白酶学性质测定 |
| 2.2.9 重组蛋白酶底物普适性测定 |
| 2.2.10 产物检测方法及构型鉴定 |
| 2.2.11 重组蛋白3D结构建模及对接分析 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 基于基因挖掘的功能双加氧酶表征 |
| 2.3.2 候选基因的重组表达及功能验证 |
| 2.3.3 重组蛋白的动力学测定 |
| 2.3.4 温度和p H对酶活性的影响 |
| 2.3.5 催化体系组分对酶活力的影响 |
| 2.3.6 重组蛋白的底物普适性 |
| 2.3.7 酶促羟脯氨酸的合成 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 基于表达和反应耦联的双加氧酶催化合成羟基氨基酸 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 试剂和仪器 |
| 3.2.2 重组菌株的培养与诱导表达 |
| 3.2.3 全细胞酶活测定方法 |
| 3.2.4 全细胞转化合成羟基氨基酸 |
| 3.2.5 表达和反应耦联合成羟基氨基酸的过程调控 |
| 3.2.6 底产物检测分析方法 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 双加氧酶的诱导表达 |
| 3.3.2 全细胞转化体系调控合成羟基氨基酸 |
| 3.3.3 表达和反应耦联的过程调控 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 L-氨基酸双加氧酶选择性催化机制解析 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 试剂和仪器 |
| 4.2.2 菌种和质粒 |
| 4.2.3 培养基与溶液 |
| 4.2.4 突变文库的构建 |
| 4.2.5 突变体的培养及表达 |
| 4.2.6 突变文库的高通量筛选 |
| 4.2.7 优势突变体的纯化及SDS-PAGE |
| 4.2.8 优势突变体的酶学性质测定 |
| 4.2.9 产物检测方法及构型鉴定 |
| 4.2.10 重组蛋白3D结构建模及分子模拟分析 |
| 4.3 结果讨论 |
| 4.3.1 IDO底物广谱性表征 |
| 4.3.2 关键催化位点的预测和分析 |
| 4.3.3 多位点饱和突变文库的构建及筛选 |
| 4.3.4 定点饱和突变文库的构建及筛选 |
| 4.3.5 优势突变体的动力学参数测定 |
| 4.3.6 催化活性及选择性的分子调控机制 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 体外多酶级联催化合成羟基氨基酸 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 试剂和仪器 |
| 5.2.2 菌种和质粒 |
| 5.2.3 培养基与溶液 |
| 5.2.4 重组菌株的构建 |
| 5.2.5 重组蛋白的纯化及SDS-PAGE分析 |
| 5.2.6 重组蛋白的酶学性质测定 |
| 5.2.7 温度和pH对酶活性的影响 |
| 5.2.8 反应体系中各组分对重组蛋白活性的影响 |
| 5.2.9 多酶级联催化合成羟基氨基酸 |
| 5.2.10 产物检测方法 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 基于IDO体外酶促合成羟基氨基酸体系设计 |
| 5.3.2 温度和pH对酶活力的影响 |
| 5.3.3 级联反应组分对IDO和 LGOX活性的影响 |
| 5.3.4 酶级联反应催化合成4-HIL |
| 5.3.5 分批补料4-HIL合成反应 |
| 5.3.6 体外多酶级联体系底物普适性研究 |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 Fe-N-C纳米酶级联催化促进辅底物供给 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 试剂与仪器 |
| 6.2.2 Fe-N-C单原子纳米酶的制备与表征 |
| 6.2.3 重组蛋白纯化 |
| 6.2.4 纳米级联反应器的构建及表征 |
| 6.2.5 纳米级联反应器的动力学参数测定 |
| 6.2.6 纳米级联反应器的pH和温度耐受性测定 |
| 6.2.7 纳米级联反应器的热稳定性测定 |
| 6.2.8 纳米级联反应器重复使用稳定性测定 |
| 6.2.9 纳米级联反应器的应用 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 Fe-N-C单原子纳米酶的表征 |
| 6.3.2 纳米级联反应器的动力学参数 |
| 6.3.3 纳米级联反应器的pH和温度耐受性 |
| 6.3.4 纳米级联反应器重复使用稳定性 |
| 6.3.5 纳米级联反应器催化合成辅底物2-KG |
| 6.4 本章小结 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 论文主要创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录:表 |
| 附录:图 |
| 附录:作者在攻读博士学位期间发表的论文 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 葡萄酒相关酵母菌概述 |
| 1.2 酿酒酵母乙醇耐受性的研究现状 |
| 1.3 外源添加物提高酿酒酵母乙醇耐受性的研究现状 |
| 1.4 研究目的及意义 |
| 1.5 主要研究内容 |
| 第二章 不同外源添加物与酿酒酵母乙醇耐受性的相关性研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与仪器 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 海藻糖与酿酒酵母发酵特性及发酵过程中理化指标变化趋势的相关性研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与仪器 |
| 3.3 试验方法 |
| 3.4 结果分析 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 赤霞珠葡萄酒发酵过程中添加海藻糖对葡萄酒品质的影响 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与仪器 |
| 4.3 试验方法 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 结论及展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 木质纤维素生物质预处理 |
| 1.1.1 木质纤维素生物质的来源 |
| 1.1.2 木质纤维素生物质结构 |
| 1.1.3 低共熔溶剂在木质纤维素预处理中的应用 |
| 1.2 利用木质纤维素生物质酶解液进行丁醇发酵 |
| 1.2.1 丁醇的生产方法 |
| 1.2.2 生物丁醇的研究现状 |
| 1.3 利用木质纤维素生物质酶解液产反式-4-羟基-L-脯氨酸 |
| 1.3.1 反式-4-羟基-L-脯氨酸 |
| 1.3.2 反式-4-羟基-L-脯氨酸的生产制备 |
| 1.4 课题的研究背景和研究意义 |
| 1.5 课题的主要研究内容 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株和质粒 |
| 2.1.2 本实验所用引物 |
| 2.1.3 实验试剂及仪器设备 |
| 2.1.4 培养基及相关试剂配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 合成低共熔溶剂 |
| 2.2.2 C.saccharobutylicum DSM13864 活化与保藏 |
| 2.2.3 纤维素酶酶活测定 |
| 2.2.4 不同生物质材料的预处理 |
| 2.2.5 不同生物质材料的结构表征及理化性质分析 |
| 2.2.6 玉米芯预处理条件的优化 |
| 2.2.7 玉米芯酶解反应及其条件的优化 |
| 2.2.8 玉米芯附着纤维素酶的再利用 |
| 2.2.9 玉米芯酶解液的丁醇发酵研究 |
| 2.2.10 敲除质粒及基因敲除菌株构建 |
| 2.2.11 重组表达质粒及异源基因表达菌株构建 |
| 2.2.12 谷氨酸棒杆菌的摇瓶发酵及发酵参数的测定 |
| 第三章 结果与讨论 |
| 3.1 EaCl:Lac预处理不同木质纤维素生物质及组分分析 |
| 3.1.1 EaCl:Lac预处理不同木质纤维素生物质 |
| 3.1.2 不同木质纤维素生物质预处理前后组分变化分析 |
| 3.2 EaCl:Lac处理玉米芯及丁醇发酵 |
| 3.2.1 EaCl:Lac处理玉米芯条件优化 |
| 3.2.2 玉米芯处理前后理化性质表征 |
| 3.2.3 EaCl:Lac处理后玉米芯酶解条件优化 |
| 3.2.4 附着纤维素酶的循环利用 |
| 3.2.5 玉米芯酶解液的丁醇发酵 |
| 3.3 反式-4-羟基-L-脯氨酸生产菌株构建及发酵 |
| 3.3.1 putA基因(编码脯氨酸脱氢酶)敲除菌株构建 |
| 3.3.2 鸟氨酸环化脱氨酶和脯氨酸羟化酶串联表达质粒构建 |
| 3.3.3 反式-4-羟基-L-脯氨酸生产菌株摇瓶发酵 |
| 3.3.4 敲除putA基因对菌株生长及反式-4-羟基-L-脯氨酸产量影响 |
| 3.3.5 增加还原力供给对菌体生长和反式-4-羟基-L-脯氨酸产量的影响 |
| 3.3.6 菌株LH06利用玉米芯酶解液进行反式-4-羟基-L-脯氨酸发酵 |
| 主要结论与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录A:反式-4-羟基-L-脯氨酸标准曲线 |
| 附录B:作者在硕士学位期间发表的论文 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.1.1 菌种与质粒 |
| 1.1.2 培养基 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 重组菌株诱导培养 |
| 1.2.2 单因素试验 |
| 1.2.3 正交试验(L934) |
| 1.2.4 菌体浓度的测定 |
| 1.2.5 β-CGT酶活力的检测[13] |
| 1.2.6 重组蛋白浓度的测定 |
| 1.2.7 不同组分重组β-CGT酶的制备 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 不同类型添加剂对胞外分泌重组β-CGTase的影响 |
| 2.2 单因素试验 |
| 2.2.1 Triton X-100对胞外分泌重组β-CGTase的影响 |
| 2.2.2 Tween-80对胞外分泌重组β-CGTase的影响 |
| 2.2.3 甘氨酸对胞外分泌重组β-CGTase的影响 |
| 2.2.4 L-脯氨酸对胞外分泌重组β-CGTase的影响 |
| 2.3 正交试验 |
| 2.4 验证试验 |
| 3 结论 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料与试剂 |
| 1.1.1 菌株与质粒 |
| 1.1.2 试剂 |
| 1.2 仪器与设备 |
| 1.3 方法 |
| 1.3.1 工程菌构建 |
| 1.3.1. 1 gRNA质粒和重组DNA片段构建 |
| 1.3.1. 2 DNA片段重组 |
| 1.3.2 摇瓶发酵 |
| 1.3.3 发酵罐分批补料发酵 |
| 1.3.4 发酵过程中检测与分析 |
| 1.4 数据统计学分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 木糖诱导基因表达系统建立 |
| 2.2 强化L-脯氨酸合成途径 |
| 2.2.1 L-脯氨酸操纵子过表达对L-脯氨酸合成的影响 |
| 2.2.2 增加胞内NADPH供应对L-脯氨酸合成的影响 |
| 2.3 高活性L-脯氨酸-4-羟基化酶的筛选 |
| 2.4 L-脯氨酸-4-羟基化酶过表达对反式-4-羟基-L-脯氨酸合成的影响 |
| 2.5 工程菌发酵罐分批补料发酵 |
| 3 结论 |
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 L-脯氨酸的理化性质 |
| 1.2 L-脯氨酸的用途 |
| 1.3 L-脯氨酸的测定方法 |
| 1.4 L-脯氨酸的生产方法 |
| 1.5 L-脯氨酸微生物发酵生产研究进展 |
| 1.6 L-脯氨酸发酵工艺研究进展 |
| 1.7 本论文研究的意义思路与内容 |
| 第二章 菌种传代及保藏方法的优化研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料与方法 |
| 2.3 本章小结 |
| 第三章 L-脯氨酸分批发酵培养条件的优化研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.3 方法 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 L-脯氨酸发酵补料方式的优化研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.3 结果及讨论 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 L-脯氨酸发酵前体物质添加的优化研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.4 本章小结 |
| 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附件 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 反式4羟脯氨酸概述 |
| 1.1.1 反式4羟脯氨酸的应用 |
| 1.1.2 反式4羟脯氨酸的生产方法 |
| 1.2 谷氨酸激酶简介 |
| 1.3 外源基因的表达 |
| 1.3.1 宿主与载体的选择 |
| 1.3.2 启动子的选择 |
| 1.3.3 多基因共表达策略 |
| 1.4 国内外研究现状 |
| 1.5 本课题的研究意义和研究内容 |
| 1.5.1 研究意义 |
| 1.5.2 研究内容 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌种和质粒 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.1.4 培养基 |
| 2.1.5 主要溶液 |
| 2.2 高产L-脯氨酸重组大肠杆菌的构建及检测方法 |
| 2.2.1 大肠杆菌BL21(DE3)基因组的提取 |
| 2.2.2 PCR引物设计 |
| 2.2.3 质粒的提取 |
| 2.2.4 扩增proBA的PCR反应体系及反应条件 |
| 2.2.5 PCR产物的纯化 |
| 2.2.6 大肠杆菌感受态细胞的制备 |
| 2.2.7 含有proBA重组质粒的构建 |
| 2.2.8 大肠杆菌感受态细胞的转化方法(热激法) |
| 2.2.9 酶切鉴定阳性重组质粒 |
| 2.2.10 DNA测序鉴定重组质粒 |
| 2.2.11 全质粒PCR定点突变方法 |
| 2.2.12 全质粒PCR产物转化大肠杆菌的方法 |
| 2.2.13 DNA测序鉴定点突变重组质粒 |
| 2.2.14 在重组质粒上插入色氨酸串联启动子的方法 |
| 2.2.15 SDS-PAGE检测谷氨酸激酶的表达 |
| 2.2.16 重组菌L-脯氨酸积累量的检测方法 |
| 2.3 产反式4羟脯氨酸重组大肠杆菌的构建及检测方法 |
| 2.3.1 含脯氨酸 4-羟化酶基因质粒的提取 |
| 2.3.2 共表达载体的构建 |
| 2.3.3 大肠杆菌感受态细胞的制备 |
| 2.3.4 大肠杆菌感受态细胞的热激转化方法 |
| 2.3.5 酶切鉴定阳性重组质粒 |
| 2.3.6 DNA测序鉴定重组质粒 |
| 2.3.7 SDS-PAGE检测脯氨酸 4-羟化酶的表达 |
| 2.3.8 重组菌反式4羟脯氨酸积累量的测定 |
| 2.4 反式4羟脯氨酸生产菌株的摇瓶发酵条件优化方法 |
| 2.4.1 重组大肠杆菌生长曲线的绘制 |
| 2.4.2 重组大肠杆菌发酵曲线的绘制 |
| 2.4.3 单因素优化方法 |
| 2.4.4 正交实验方法 |
| 2.4.5 优化后重组菌反式4羟脯氨酸积累量的测定 |
| 第三章 结果与讨论 |
| 3.1 高产L-脯氨酸重组大肠杆菌的构建及检测 |
| 3.1.1 大肠杆菌BL21(DE3)基因组的提取 |
| 3.1.2 proBA基因片段的获得 |
| 3.1.3 含有野生型目的基因proBA的重组质粒的构建 |
| 3.1.4 DNA测序鉴定点突变重组质粒 |
| 3.1.5 在重组质粒上插入色氨酸串联启动子 |
| 3.1.6 SDS-PAGE结果分析 |
| 3.1.7 重组菌L-脯氨酸积累量的检测 |
| 3.2 产反式4羟脯氨酸重组大肠杆菌的构建及检测 |
| 3.2.1 共表达载体的构建及验证 |
| 3.2.2 DNA测序鉴定重组质粒 |
| 3.2.3 SDS-PAGE结果分析 |
| 3.2.4 重组菌反式4羟脯氨酸积累量的测定 |
| 3.3 产反式4羟脯氨酸重组大肠杆菌的摇瓶发酵条件优化 |
| 3.3.1 重组大肠杆菌生长曲线的绘制 |
| 3.3.2 重组大肠杆菌发酵曲线的绘制 |
| 3.3.3 单因素优化 |
| 3.3.4 正交实验结果 |
| 3.3.5 优化后重组菌反式4羟脯氨酸积累量的测定 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文 |
