高丽影[1]（2020）在《α-葡萄糖苷酶基因的敲除对黑曲霉糖类利用和柠檬酸产量关系的研究》文中研究说明柠檬酸是目前仅次于乙醇的第二大工业生物发酵技术产品,是具有显着经济价值和战略意义的大宗生物技术产品,被广泛应用于食品（70%）、化学、医药等工业。目前80%左右的柠檬酸的生产方式是通过黑曲霉液态深层分批发酵生产而来。在柠檬酸发酵过程中,发酵液中有2%左右的残糖不能被利用,其成分主要为异麦芽糖。由于异麦芽糖主要是由α-葡萄糖苷酶催化形成的,因此本研究对柠檬酸生产菌株中的49940号α-葡萄糖苷酶基因进行敲除,并且对40261号、214233号基因进行组合敲除,研究该基因敲除对残糖形成和柠檬酸产量的关系。利用根瘤农杆菌介导的同源重组的转化方法构建了黑曲霉α-葡萄糖苷酶基因敲除菌株KO-49940和双敲菌株KO-40261-214233,然后对敲除菌株和出发菌株进行了菌落形态、菌丝球形态和孢子形态的比较观察,并对菌丝球周长和生长曲线进行了测定,结果显示没有明显差异。用DNS法和HPLC对敲除菌株KO-49940、和KO-214233、KO-40261、和双敲菌株KO-40261-214233发酵液中糖酸含量的检测显示:在84 h发酵结束时,敲除菌株和出发菌株发酵液中还原糖含量接近零,说明α-葡萄糖苷酶基因的敲除没有显着影响菌株利用还原糖的速率;但与出发菌株相比,敲除菌KO-49940、KO-214233、KO-40261、KO-40261-214233 的残糖含量分别下降了约 6.4%、12.9%、12.9%、19.3%;异麦芽糖含量分别下降了约19.1%、23.8%、24.5%和28.5%;柠檬酸产量分别提高了 1.2%、2.5%、2.5%和3.7%。说明这些α-葡萄糖苷酶基因敲除有利于减少异麦芽糖的形成,降低残糖的含量,提高残糖的利用率进而提高柠檬酸的产量。
刘欢[2]（2018）在《一株嗜酸性霉菌的鉴定及其α-淀粉酶和甘露聚糖酶基因的克隆与表达》文中认为黑曲霉是一种重要的工业发酵菌,生长迅速,发酵周期短,且生长过程中不受杂菌的污染及不产毒素的特点,为符合美国FDA之GRAS公认安全菌株,产酶种类多,产酶能力强,一些极端酶大部分来自于曲霉,由此更加奠定了其在发酵工业上的地位。耐酸性α-淀粉酶可补足常用淀粉酶在低pH条件下性能不足的短板,在提高工业生产废品的利用和处理、降低原料消耗等方面具有很大的应用潜力与开发前景,甘露聚糖酶是一种新型的工业化生产酶,但是由于其发酵酶活低而导致其成本高,限制了应用范围,因此,对该酶的研究具有一定的价值。本实验从新疆某铀矿酸性浸出液分离得到一株霉菌,本实验中命名为MJ 5。根据形态学特征、rDNA ITS序列分析以及Biolog鉴定系统对该菌株进行鉴定,同时Biolog鉴定板可提供菌株对碳源的消耗情况,由此可分析了解该菌的生长情况及优势碳源。通过对菌株的粗酶液测定α淀粉酶酶活,根据全基因组测序结果,设计引物获得耐酸性α淀粉酶和甘露聚糖酶基因的序列片段,与pPIC9K构建表达载体,导入酵母受体细胞进行表达,结果表明:（1）结合三种鉴定系统鉴定霉菌MJ 5为黑曲霉Aspergillus niger,霉菌的最适碳源为p-羟苯乙酸,在8大类碳源中对氨基酸类、脂类、酸类的利用率较高,由其所产的粗酶液酶学性质研究可知该菌产酸性淀粉酶,酶催化反应的最适pH和温度为5.0和45℃,相同温度不同pH的条件下保温反应1h,MJ 5淀粉酶的酶活性在pH 3-7范围内仍保持在80%以上,在pH相同温度不同的环境下进行保温反应1h,MJ 5淀粉酶在40℃、45℃、50℃以及55℃酶活性还剩余70%以上,由此可说明MJ 5的淀粉酶具有较好的pH稳定性和热稳定性。（2）根据黑曲霉全基因组测序结果对耐酸性α-淀粉酶基因序列设计合适引物,运用PCR扩增法从真菌Aspergillus niger MJ 5中得到属于糖苷水解酶第13家族（GH13）的耐酸性α-淀粉酶基因α-amy-5片段,将基因片段连接载体pPIC9K导入大肠杆菌TransI-T1中进行克隆,挑取阳性克隆测序,由结果可知:α-淀粉酶基因总长为1650 bp,N端前28个氨基酸为信号肽序列,去除信号肽序列后该基因长度为1566 bp,编码521个氨基酸和一个终止密码子,将重组质粒pPIC9K-α-amy-5线性化并电击转入毕赤酵母表达,但是没有检测到重组酶酶活,具体原因尚待分析。（3）从Aspergillus niger MJ 5中克隆得到的甘露聚糖酶基因man-5片段,全长为1008 bp,BlastP显示该酶为糖苷水解酶第26家族,除去信号肽序列后DNA片段与cDNA片段长度为954 bp,编码317个氨基酸和一个终止密码子,由生物信息学分析可以知道该段氨基酸序列有4个可被糖基化位点,并且等电点和分子量分别预测为5.71和37KDa,通过酶学性质测定可知该段基因的最适温度和最适pH为35℃和pH 5.0,在不同缓冲液下,37℃反应1 h,在pH 5.0-pH 7.0之间还残余80%的酶活,对pH耐受范围不广,在40℃反应1h,酶活几乎没有损失,但是随着温度的提高,甘露聚糖酶几乎失活,K+、β-巯基乙醇、Na+、Pb2+、Mg2+和EDTA可以提高甘露聚糖酶的酶活,Cr3+、Mn2+、Cu2+和Ca2+则对酶活有抑制作用,其中β-巯基乙醇对酶活的提高能力最强,Fe3+对Man-5酶活的提高不受浓度的影响,其他离子及试剂对酶活几乎没有影响,由此可知金属离子及化学试剂对MJ 5所产的甘露聚糖酶影响不大,纯化后的Man-5的蛋白含量为8.57mg/mL,酶活为864 U/mL,最后得出比活为101 U/mg,动力学测定得出Man-5的Km和Vmax分别为1.9 mg/mL,1638μmol/min·mg。
宋佳[3]（2018）在《黑曲霉ras基因功能的初步探究》文中研究指明黑曲霉（Aspergillus niger）,因其代谢产物较多,并且拥有丰富的酶系而成为曲霉属中工业生产应用最为广泛的一个常见种。而后基因组时代的来临,也将黑曲霉的研究推入基因工程的领域。作为小G蛋白的重要成员,多功能细胞因子Ras的研究热度一直有增无减,不过在真菌中关于Ras的报道仍是少数,而黑曲霉中ras基因的功能更是一直不明确。因此,利用分子生物学的手段对ras基因在黑曲霉中的功能进行探究,一方面为菌种改造奠定基础,另一方面也将对小G蛋白在真菌中的深入研究具有推进作用。本文采用基因过表达的方法使ras基因表达量提高,通过对转化子及野生型菌株的生物学特性的差异进行分析,初步探究ras基因在黑曲霉CGMCC 3.316中生长及代谢过程中的作用。首先,根据实验室已知的ras基因部分保守序列及NCBI中同源性较高的两组序列预测ras基因的编码区序列,多次设计引物后成功克隆得到目的基因。然后,将目的基因两侧加上合适的酶切位点,与pCAMBIA 1301质粒和pBARGPE1-Hygro-EGFP质粒进行酶切、连接、转化,完成两种类型过表达质粒的构建。接下来,选定PEG介导的原生质体转化法进行质粒的转化,筛选具有潮霉素B抗性转化子,再选取其中部分抗性转化子进行目的基因遗传稳定性检测,共获得既具有潮霉素B抗性又具有遗传稳定转化子8株,即作为空白对照的pCAMBIA 1301空质粒转化子,pBARGPE1空质粒转化子,及过表达转化子pCAMBIA 1301:ras（pC:ras）,pBARGPE1:ras（pB:ras）各2株。最后,对转化子及野生型进行了生物学差异的试验。（1）RT-PCR结果显示,pC:ras,pB:ras两株转化子ras基因表达量分别上升4.49倍和7.82倍。Western blot结果显示,Ras蛋白表达量也均有所上升。（2）通过测量培养5天的菌落直径发现pC:ras,pB:ras两株转化子生长速度分别是野生型菌株的1.10倍和1.17倍,测量培养60h的生物量结果为1.53倍和1.98倍。（3）液体发酵试验,测定pC:ras,pB:ras两株转化子纤维素总酶活最高时是野生型的1.30倍和1.44倍,柠檬酸酸度分别是1.40倍和1.86倍。并且实验过程中pB:ras过表达转化子在转化效率和过表达效果上均有优于pC:ras过表达转化子的趋势。本研究结果初步说明,黑曲霉ras基因的过表达对黑曲霉生长状态及代谢过程是有促进作用的。
李丹丹[4]（2017）在《基于CRISPR系统的丝状真菌基因组快速编辑》文中进行了进一步梳理真菌因其高分泌蛋白质的能力而备受关注,黑曲霉（Aspergillus niger）是一种常见的丝状真菌。黑曲霉在代谢过程中会产生多种高活性的酶,如α-淀粉酶、果胶酶、葡萄糖淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、纤维素酶、单宁酶等,而这些酶都具有重要的经济价值。其中,黑曲霉用于生产柠檬酸的应用最为广泛。实现黑曲霉的基因组编辑使其表型向更利于人类的方面发展,这有着重要的经济价值。但真菌转化难问题限制着真菌基因组编辑的研究。近年来,CRISPR系统（Clustered regμlarly interspersed short palindromic repeats）因其独特的优势,广受国内外科研工作者的青睐。CRISPR系统具有很大潜力能突破传统基因编辑方法的局限,但CRISPR系统黑曲霉中的应用还未有报道。本研究通过尝试将CRISPR系统应用于丝状真菌的基因组编辑,初步探究CRISPR系统在黑曲霉中的适用性及编辑效率。主要研究成果如下:（1）pCAMBIA1302-hFnCpf1 载体的构建。hFnCpf1 来源于Francisella novicida,是具有核酸内切酶活性的蛋白。使用PCR的方法从pcDNA3.1-hFnCpf1质粒上体外扩增目的hFnCpf1蛋白基因序列,再连接到pCAMBIA1302载体上（载体上携带潮霉素抗性基因）。在此过程中不引入任何冗余序列,保证了 hFnCpf1蛋白阅读框架的正确性,成功构建pCAMBIA1302-hFnCpf1载体。（2）农杆菌介导A.niger CBS513.88遗传转化系统构建。通过优化5个影响因素,建立了高效的转化体系。在这一转化体系中,以潮霉素为筛选标签,使用1.2×107个的孢子,通过三个平行实验获得的转化子数量为85个。成功将pCAMBIA1302-hFnCpf1稳定整合到A.niger CBS513.88的基因组上（pCAMBIA1302载体上的潮霉素抗性基因也随之整合A.niger CBS513.88的基因组上）。（3）sgRNA的设计与合成。综合考虑sgRNA的种子序列、靶标编辑位点（以潮霉素抗性基因为靶编辑基因）、发夹结构、PAM（protospacer adjacent motif）序列等,确定 sgRNA 所对应的 DNA 序列（5’-AATTAACCCTCACTAAAGAATTTC TACTGTTGTAGATTGCGGCCATTGTCCGTCAGGACA-3 ’）。随后,以该双链DNA序列为模板体外转录获得sgRNA。相比于直接合成sgRNA,体外转录的方法更为经济。（4）验证 CRISPR/Cpf1 系统在A.niger CBS513.88 中的适用性。以 A.niger CBS513.88基因组上的潮霉素抗性基因为靶编辑基因,通过电击转化的方法将外源的 sgRNA 瞬时导入到A.niger CBS513.88-pCAMBIA1302-hFnCpf1 中。以潮霉素抗性基因为筛选标签,结合测序的方法寻找目的突变子并进行分析。本研究对10个突变子序列进行BLAST对比,分析突变的位点。并使用Clustal X软件对突变子的表达框架进行分析,并对实验结果进行讨论。本研究为CRISPR系统首次应用于黑曲霉的基因组编辑,扩充了 CRISPR系统在丝状真菌中的应用。
柏英[5]（2016）在《黑曲霉ras基因敲除子的构建及其生物学特性》文中提出黑曲霉（Aspergillus niger）,一种广泛存在于自然界的腐生性丝状真菌,是工业上重要的产酶和产酸菌株,尤其是纤维素酶和有机酸。ras基因是小G蛋白Ras家族的成员,其所介导的GTPase蛋白信号途径是丝状真菌感受外界环境信号调控生长发育及基因表达等重要信号转导机制。目前,对黑曲霉ras基因的功能并不了解。因此,GTPase蛋白信号途径中相关基因的研究对于真菌生长发育及代谢产物的获得具有重大的意义和贡献。本试验旨在采用农杆菌介导的同源重组的方法对黑曲霉中的ras基因进行敲除,通过对转化子生物学特性的研究,初步分析ras基因在黑曲霉3.316生长过程中的作用。用已知全基因组测序信息的黑曲霉CBS513.88 ras基因及其上下游的序列信息为模板,设计一对引物,以黑曲霉3.316基因组为模板,PCR扩增ras基因大片段,测序获得确切的序列信息,用生物信息学软件分析ras基因保守区域,确定同源臂长度,加上合适的酶切位点,通过两步酶切,连接的方法构建敲除质粒pPZPtk8.10:ras:hyg,并采用PCR、酶切等方法进行验证。用冻融法将敲除质粒转入根癌农杆菌中,将转有敲除质粒的农杆菌菌液与黑曲霉一定浓度的分生孢子悬液于IM诱导培养基上共培养介导真菌转化,将质粒转化进入黑曲霉细胞中,同源重组整合到基因组相应位置。在筛选浓度为250μg/mL的潮霉素抗性平板上进行初筛,获得68个转化子,再通过扩增其潮霉素基因、ras基因和验证片段验证因同源重组到正确位置的转化子,进而获得一株ras基因敲除子。黑曲霉ras基因敲除子的生物学特性研究。敲除株的生长速度明显较野生型菌株慢,野生型菌株的生长速度约为敲除株的2.18倍。宏观上看,敲除株菌丝生长较为致密,边生长菌丝边产生孢子,且伴随培养时间的增加,菌丝颜色逐渐变深,而野生型菌株的菌丝生长比较疏松,先生长菌丝,再产生孢子;微观上看,敲除株菌丝的分隔明显增多,这可能对真菌的无性繁殖有影响。野生型的生物量明显比敲除株多,约为敲除株的1.78倍。温度的变化对敲除株无明显影响。葡聚糖内切酶酶活力和β-葡聚糖苷酶酶活力都有所下降,尤其是β-葡聚糖苷酶酶活力。说明黑曲霉ras基因的敲除会影响其菌丝生长、分裂和孢子的产生及无性繁殖,并对纤维素酶的酶活有抑制作用。
刘晓燕[6]（2012）在《海洋解脂耶罗威亚酵母菌产柠檬酸的研究》文中认为柠檬酸是一种重要的有机酸，在制药业、食品业及化妆业等具有极多的用途，并对人体健康有一定的益处。工业柠檬酸主要是玉米、红薯等粮食作物通过发酵方式获得的。近年来世界粮食短缺，价格飞涨，使柠檬酸产品的低价优势不断减小。木薯淀粉和菊粉是新型工业非粮食原料，其水解产物分别为葡萄糖和果糖，是生产柠檬酸的良好碳源，将这2种非粮食原料运用于柠檬酸的工业生产，在降低成本、节约粮食资源和粮食安全等方面具有良好的应用前景。目前，柠檬酸的工业生产菌株主要是黑曲霉（Aspergillus niger），但该菌发酵产酸易引起环境污染且其菌体结构不利于遗传改造。产酸酵母菌解脂耶罗威亚酵母（Yarrowia lipolytica）能弥补黑曲霉产酸的不足，因而成为近年来研究的热点。为了扩大产酸酵母菌种的筛选范围，我们对实验室现保存120株海洋解脂耶罗威亚酵母菌进行了筛选，获得了1株高产柠檬酸的菌株Y. lipolyticaSWJ-1b （中国海洋微生物菌种保藏中心编号2E00068）。该菌利用甘油（40.0g/l）发酵产酸量为24.0±0.7g/l （柠檬酸生产力0.20g/l h），高于陆地同种酵母菌相同条件下的发酵产酸量。通过进一步研究发现该菌发酵产酸的最佳碳源为葡萄糖，其用于产酸培养的最适浓度为40.0g/l，发酵产酸量为25.5±1.2g/l （0.21g/l h）。木薯淀粉（Cassava strach）应用于柠檬酸生产的前提是产酸菌株必须具备水解木薯淀粉的能力，但Y. lipolytica SWJ-1b不能分泌淀粉酶，且外源淀粉酶（Amylase）基因在Y. lipolytica SWJ-1b中难以表达。本实验室研究发现扣囊复膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera） IFO0111可以产生大量的淀粉酶，可使用该菌产生的淀粉酶先将木薯淀粉水解，所得木薯淀粉水解液（碳源浓度40.0g/l）进而被用于发酵产酸，其柠檬酸产量为29.4±0.3g/l （0.25g/l h）。而在2-l发酵罐中分批补料发酵培养时，柠檬酸产量达60.2±1.8g/l （0.21g/l h）。最近几年我们实验室研究发现菊粉（Inulin）也是发酵工业很好的原料，Y.lipolytica SWJ-1b同样不能产生菊粉酶，为了使产酸菌株能够直接利用菊粉发酵产酸以简化发酵生产工艺，我们将菊粉酶活力较高的马克思克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus） CBS6556的菊粉酶（Inulinase）基因成功整合至Y.lipolytica SWJ-1b的基因组DNA，并通过表面展示技术将该基因表达的菊粉酶展示于Y. lipolytica SWJ-1b细胞表面，得到具稳定菊粉酶活力的转化菌株INU-87，其表面展示菊粉酶活力为22.6±0.8U/mg细胞干重，具有较高的外切酶活性。研究发现该表面展示菊粉酶与菌株K. marxianus的原始菊粉酶性质基本一致，且表面展示技术的应用使该酶易于回收利用。转化菌株INU-87在菊粉培养基（菊粉浓度40.0g/l）中一步发酵产酸时，柠檬酸产量为31.2±1.6g/l（0.26g/l h），其在2-l发酵罐中发酵菊粉（100.0g/l）产酸量可达68.9±2.4g/l（0.22g/l h）。转化菌株INU-87以非粮原料菊粉一步发酵产柠檬酸，节约了粮食资源，降低了柠檬酸的生产成本，简化了非粮原料发酵产酸工艺，对柠檬酸的工业生产具有深远意义。产酸酵母菌最大的缺点在于发酵产酸过程中副产物异柠檬酸（Iso-citrateacid, ICA）产量和菌体油脂（Lipid）累积量较高，对柠檬酸产量的提高极为不利。产酸代谢途径中的异柠檬酸裂解酶（Iso-citrate lyase ICL）能够减少异柠檬酸的产量，而ATP-柠檬酸裂解酶（ATP-citrate lyase ACL）则促进油脂累积。为了减少发酵产柠檬酸过程中的副产物产量，本实验通过转化菌株INU-87ACL1基因敲除和ICL1基因超表达，得到遗传改良菌株IAI-30。该菌株的ACL1基因表达量降低了18.9%，受该基因控制的ACL酶活力明显降低；同时，其ICL1基因表达量增加了259.4%，ICL酶活力有较大提高。经测定遗传改良菌株IAI-30的油脂累积量和副产物异柠檬酸的产量都明显降低，其在菊粉产酸培养基（菊粉浓度40.0g/l）中发酵产酸量增至36.0±0.6g/l （0.30g/l h）。而遗传改良菌株IAI-30在2-l发酵罐中一步发酵菊粉（100.0g/l）产酸量可达84.0±1.6g/l （0.39g/l h）。遗传改良从基因水平上对产酸菌株的产酸代谢途径做出了一定调整，降低了发酵产酸过程中的副产物产量，有效提高了柠檬酸产量及碳源转化率。利用钙盐法从发酵液提取得到柠檬酸结晶，反复纯化后使用高效液相色谱分析，发现提取的柠檬酸样品纯度高达95.0%（w/w）。
王东升[7]（2011）在《扣囊复膜酵母A11菌株酸性蛋白酶基因和MIG1基因敲除对酶的生产和海藻积累的影响》文中研究表明扣囊复膜酵母菌（Saccharomycopsis fibuligera）是子囊菌属的一个种,它可以利用淀粉积累海藻糖,并能分泌大量的淀粉酶、酸性蛋白酶、β-葡糖苷酶和其它酶。所以扣囊复膜酵母在发酵行业、医药行业和生物能源工业有着巨大的潜在应用价值,但是人们对它的生理遗传系统了解得还很少。本实验室最近几年对高产海藻糖的扣囊复膜酵母A11菌株进行了大量研究,获得许多重要结果。由于酸性蛋白酶在酸性条件下可以分解其它酶,对其它酶的产生会造成不利的影响。所以本研究试图通过基因敲除法敲掉扣囊复膜酵母A11菌株酸性蛋白酶基因,然后研究该基因的敲除对其它酶的产生和稳定会产生什么样的影响。首先利用编码潮霉素B磷酸转移酶的基因HPT （hygromycin B phosphotransferase）的ORF （Open Reading Frame）替换A11菌株的酸性蛋白酶基因的ORF。获得的敲除菌株A11-a能在含有潮霉素的培养基中生长,并且在牛奶平板上不能形成水解透明圈,而原始菌株A11在牛奶平板上能形成大而清晰的水解透明圈。在培养3 d的情况下,敲除菌株A11-a的酸性蛋白酶和淀粉酶的活性分别为0.89 U/mL和424.7 U/mL,而原始菌株A11分别为13.5 U/mL和259.9 U/mL,说明了酸性蛋白酶的缺失会大大提高敲除菌株淀粉酶的合成能力。敲除菌株A11-a和原始菌株A11产生的粗淀粉酶放置在37℃下2 d,它们残余的活性分别为原来的88.8%和45.5%,说明了酸性蛋白酶的缺失会大大提高敲除菌株淀粉酶的稳定性。敲除菌株A11-a细胞的海藻糖积累量达到了细胞干重的28.3% （w/w）,而原始菌株A11只有23.6 （w/w） ,说明了酸性蛋白酶的缺失还会大大提高敲除菌株转化淀粉合成海藻糖的能力。目前如何有效地从酵母细胞中提取海藻糖是一个问题,一般是用0.5M三氯乙酸提取,但是三氯乙酸是蛋白质变性剂,并且具有很强的腐蚀作用。有研究表明当高热敏渗透突变株（highly thermosensitive and permeable mutant）酵母细胞在37℃的低渗透压水中孵育时,细胞内含物能被释放出来。所以本研究利用上述获得的高含海藻糖扣囊复膜酵母A11-a菌株经亚硝基胍诱变获得了这样的高热敏渗透突变菌株A11-b,在37℃的蒸馏水中过夜处理能释放自身海藻糖含量的73.8%,而扣囊复膜酵母菌A11-a菌株在同样条件下仅能释放10%的海藻糖。突变菌株A11-b细胞悬浮在蒸馏水中经37℃过夜处理后,细胞体积比经过相同条件处理的A11-a菌株要大,说明由于细胞通透性发生变化,导致细胞在蒸馏水中发生膨胀。在摇瓶和5-l发酵罐中培养,突变菌株A11-b的生长量和海藻糖积累量与菌株A11-a几乎相同。突变菌株A11-b和菌株A11-a都能利用木薯淀粉在细胞中累积大约28.0% （w/w）的海藻糖。用蒸馏水从突变株A11-b中提取和纯化了海藻糖,最后获得了高纯度的海藻糖晶体。从而建立了一种从酵母菌细胞中提取海藻糖的简单、经济、安全和有效的新工艺。在微生物中葡萄糖阻遏是一种非常普遍的现象,在葡萄糖存在情况,许多酶的合成和基因表达都会受到抑制。参与葡萄糖阻遏作用的主要两种蛋白是Snf1和Mig1,Snf1是一种蛋白激酶,在培养基中有葡萄糖存在情况下可以使Mig1发生磷酸化反应,磷酸化的Mig1可以使有关的基因表达受到阻遏,所以如果把编码Mig1的基因敲除,酵母细胞不管是否生长在葡萄糖培养基中有关基因表达都不会受到阻遏。本研究首先用简并引物PCR法和反向PCR法从扣囊复膜酵母A11菌株的基因组DNA中克隆出了MIG1（Multicopy Inhibitor of Glucose）基因。克隆的MIG1基因（NCBI的登录号:HM450676）全长1152 bp,编码384个氨基酸的蛋白质,该蛋白质的氨基酸序列与其它真菌的Mig1s非常类似,有高度保守的两个锌指结构,Mig1蛋白还有一个短的保守模序,可能在葡萄糖阻遏中有重要作用。然后敲除扣囊复膜酵母A11菌株的MIG1基因,利用上述的HPT基因ORF替换了MIG1基因的ORF,结果在含有潮霉素的YPD平板上获得了敲除菌株A11-c,它能在含有2-脱氧-D葡萄糖的YPS平板上生长,而原始菌株A11则都不能,说明敲除菌株的葡萄糖阻遏得到了解除。与菌株A11相比,敲除菌株A11-c淀粉酶、酸性蛋白酶和β-葡糖苷酶的产量有很大提高,同时编码α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、酸性蛋白酶和β-葡糖苷酶基因的表达量也有极大提高。这就证明,扣囊复膜酵母中的Mig1确实能阻遏某些基因的转录,它对一些基因的表达和一些胞外酶的生产起调控作用。综上所述,本论文研究了扣囊复膜酵母A11酸性蛋白酶基因和MIG1基因被敲除后对多种酶生产及海藻糖积累的影响,这对于了解扣囊复膜酵母菌生理和遗传,开发和利用扣囊复膜酵母具有积极意义。
白洪志[8]（2008）在《降解纤维素菌种筛选及纤维素降解研究》文中指出利用纤维素的最佳方法是微生物降解转化,鉴于目前纤维素降解菌株酶活力低、纤维素酶诱导产酶及纤维素降解机理不完全清楚等限制纤维素资源有效利用的情况下,为了有效利用纤维素这种可再生能源,筛选高效降解菌,研究菌株产酶机制以及纤维素降解机理仍然具有重要的理论和实践意义。本文从57份土样中,通过分离纯化得到97株菌株。对其进行刚果红鉴别培养基和滤纸条液体培养法初筛,并结合复筛得到2株纤维素酶活较高的菌株。经形态学鉴定H-11为简青霉（Penicillium simplicissimum）,C-08为绿色木霉（Trichoderma viride）。研究了几种影响二菌株发酵产酶的因素,液体发酵结果表明:麸皮和稻草为适合碳源,两者比例H-11为4:3,C-08为5:2;最适有机氮源为豆饼粉,而无机氮源分别是KNO3和（NH4）2SO4。H-11产酶最适为豆饼粉,而C-08产酶的（NH4）2SO4:豆饼粉比例为1:5。最适产酶碳源和氮源比例,H-11为7:1,C-08为5:1;最适百分含量,都为3.6%;最适产酶pH,H-11为3.6,C-08为3.2;最适温度都为30℃;最适产酶时间H-11为144h,C-08为96h。固态发酵结果表明:秸秆粉和麸皮为2∶4最适合产酶;尿素和氨态氮适合H-11产酶。氨态氮适合C-08产CMCase,NO3-利于产Xylanase,其中NH4NO3最好;料水比1∶1比较适合H-11产CMCase,1∶1.5适合产Xylanase。料水比1∶2适合C-08产CMCase,1∶2.5适合产Xylanase;H-11随底物粒度的降低CMCase增加,在60100目时产Xylanase最低。稻草粉粒度40100目时,适合C-08产CMCase,此范围外适合产Xylanase;初始pH为3和4时则适合H-11菌株产CMCase和Xylanase。pH值为4适合C-08产酶;孢子接种量为78×107孢子/mL时适合两株菌产酶;28℃适合H-11产酶,在低于28℃时适合C-08产酶;发酵时间H-11为60h,C-08为72h。固定化研究表明,制备小球的最适海藻酸钠溶液浓度为5%。麸皮汁较适合菌株产酶,H-11比C-08产酶能力强。菌株间亲和性不强。H-11则在pH为3和4时,更适合产CMCase和Xylanase,C-08产酶适宜pH为7。固定化细胞产酶能力强于游离细胞。Tween-80有利于提高菌株的产酶活力。利用液体培养和洗涤菌丝诱导培养法研究了碳源对菌株的诱导特性。结果发现D-甘露糖对H-11有较好的诱导作用,葡萄糖对C-08有较好的产酶作用。葡萄糖促使H-11、C-08产生FPase、CMCase、C1和β-Gase,各种酶产量在菌株间及菌株内差别很大。制备细胞外、细胞壁膜、细胞内纤维素酶,并用其分别转化纤维二糖,对转化产物高效液相色谱定性分析,从而探讨碳源的诱导本质。结果显示:H-11胞内酶和C-08的胞外酶的转化产物,除产生葡萄糖外,亦产生一种未知的物质A。胞壁膜酶无转化作用。H-11的胞外酶和C-08的胞内酶液对纤维二糖除水解外亦有转化作用。从而证明纤维二糖不是菌株的诱导物。将H-11液体发酵粗酶液经硫酸铵分级沉淀、柱层析后得到电泳纯的β-GaseⅠ、β-GaseⅡ和CMCase组分。对纯组分的理化性质研究表明:三组分的分子量分别为126.0KDa、77.8KDa和33.2kDa;最适温度都为60℃,分别在40℃、40℃和50℃以下稳定;最适pH值为pH4.45.2、3.64.0和2.8,在pH值4.46.8、2.86.8和2.86.8范围内稳定。Mn2+、Ca2+、Sn2+和Li+对β-GaseⅠ有促进作用,Mg2+、Zn2+、Cu2+、Co2+、Fe2+和Fe3+对β-GaseⅠ有抑制作用;Mn2+、Sn2+和Fe2+对β-GaseⅡ有促进作用,Zn2+、Cu2+、Co2+和Fe3+对β-GaseⅡ有抑制作用;Sn2+对CMCase酶活力有明显的增强作用,Mn2+和Cu2+对酶有显着的抑制作用。β-GaseⅠ水解水杨素的Km和Vmax值分别622.306mg·mL-1和15.480mg·mL-1·min-1,β-GaseⅡ水解水杨素的Km和Vmax值分别26.689mg·mL-1和0.508mg·mL-1·min-1,CMCase作用于CMC-Na的动力学参数Km和Vmax值分别1.744mg·mL-1和14.124mg·mL-1·min-1。三种酶的底物特异性较差,β-GaseⅠ、β-GaseⅡ不以CMC-Na为底物,CMCase不作用于水杨素,除此之外,三组分对MCC、滤纸、几丁质、pNPC和pNPG都有作用。通过对三组分的红外图谱特征频率区进行分析,结果表明其蛋白质二级结构都主要以α-螺旋形式存在。H-11的粗酶液中C1、CMCase对MCC都具有吸附-解吸附作用,而β-Gase对MCC不具有吸附-解吸附作用,三种纯组分和C-08粗酶液中的C1、CMCase、β-Gase对MCC都具有吸附-解吸附作用。β-GaseⅠ和β-GaseⅡ对CMCase降解纤维素有很强的协同降解作用,三种纯组分对C-08粗酶液降解纤维素没有协同作用。H-11的固态、液态发酵和C-08的固态发酵都存在氧化降解机制。
岳学敏[9]（2018）在《以少根根霉为基础生物转化餐厨废弃物生产富马酸的研究》文中进行了进一步梳理随着人均生活水平的提高,我国每年餐厨废弃物已达9000万吨。餐厨废弃物具有高有机质含量,高含水量,营养物质丰富的特点,可为微生物的生长代谢提供一定量的碳源、氮源、微量元素等来生产有机酸。但由于其储存难度大、极易被分解,若处理不及时将会对环境和人体健康产生较大影响,所以对餐厨废弃物的资源化利用已经成为人们需要解决的关键问题。本文利用少根根霉生长条件简单且体内TCA循环可积累富马酸的特点,通过生物发酵法以餐厨废弃物作为少根根霉生长及代谢的营养物质来源,实现富马酸的生产同时降解餐厨废弃物的目的。1.为优化少根根霉在餐厨废弃物中的菌体形态,提高富马酸产量,本研究考虑到少根根霉属于非生长耦合型菌株,首先对其种子培养基的主要成分含量进行实验优化。结果表明优化后富马酸的产量最高达到15.55 g/L,较优化前（11.28 g/L）提高37.85%,时空产率达到162.00 mg/（L·h）。菌种的均匀性和致密性都相较于优化前有一定的提高,发酵后菌球的直径减小,约为5 mm,这些现象的改变都有助于富马酸的生产。2.为提高菌种对餐厨废弃物发酵液的适应能力,先后通过餐厨废弃物压力筛选和诱变筛选的方法对菌种进行选育。发现压力筛选后得到的菌株,富马酸最高产量稳定在19.72 g/L,与初始菌株发酵的富马酸产量（15.55 g/L）相比提高了 26.82%,诱变筛选后,富马酸产量稳定在23.94 g/L,较初始菌株产量提高近53.95%,且时空产率为249.38 mg/（L-h）。3.少根根霉利用餐厨废弃物发酵得到产物的同时由于利用了其中一部分营养物质也实现了对餐厨废弃物的降解。对发酵后的餐厨废弃物降解率进行测定发现餐厨废弃物COD值由初始133558.65 mg/L降至4926.28 mg/L,降解率达96.31%。4.为达到富马酸富集的目的对摇瓶发酵实验进行工艺优化。结果表明在发酵过程中富马酸产量达到最高点时,及时将已经富集富马酸的发酵培养液倒出更换为新鲜发酵液继续发酵,而置换出的发酵液用于富马酸的析出提取是有效可行的。
曾小波[10]（2016）在《两株米曲霉蛋白酶及发酵特性研究》文中研究表明酱油属于传统的发酵食品,菌种是发酵的基础,其性能对酱油的原料利用率和质量影响甚大。因此对企业已有的使用菌种进行较为全面细致的研究极为重要,一方面可以让企业更好地应用现有菌种,另一方面可以针对菌种的不足之处进行定向改造,以提高生产效率。本课题以2株生产用的米曲霉菌株为研究对象,研究和比较了菌种的形态特征、生长特征、产酶能力、蛋白酶酶促水解特性和发酵性能,得出以下主要结论。（1）研究和比较了2株生产用米曲霉菌种的形态特征及其蛋白酶的性质。形态研究结果显示,2株米曲霉的形态差异明显,米曲霉1号菌落较大、发芽和产孢子较快,种曲及成曲颜色偏黄,菌丝较短,孢子较多；而米曲霉2号菌落较小,孢子发芽时间及产孢子时间比1号晚,成曲孢子较1号少,但菌丝长且粗壮,种曲颜色偏绿,成曲颜色偏白。2个菌株产生淀粉酶的能力相当,但米曲霉2号的产生蛋白酶的能力更强。蛋白酶性质的研究结果显示,1号和2号的最适反应温度分别为45℃和50℃,最适反应pH分别为6.0和9.0。此外,2株米曲霉蛋白酶的耐盐性相当,随着盐浓度的增大,酶活力均逐渐降低,在20%氯化钠条件下,酶活力均降至无盐条件下的20%-30%。（2）研究和比较了2株生产用米曲霉菌种在酸性条件下对大豆分离蛋白的水解特性。在pH 3.0-7.0范围内,2株米曲霉菌种所产蛋白酶均呈现出较强的催化能力,但2号菌株释放水溶性蛋白、氨基氮的能力更强；随着pH值的上升,水解度值分别从65.57%和67.29%上升到68.4%和72.89%,水溶性蛋白含量分别从77.12%和80.37%增加到83.02%和85.51%,氨基酸态氮生成率分别从17.05%和18.18%增加到24.02%和29.23%。SDS-PAGE图谱显示2个菌株存在不同的内切酶,由于其酶切位点及最适作用pH不同,在不同的pH值条件下,对不同蛋白条带的水解能力有所不同。此外,米曲霉2号产生的游离氨基酸较多,其中谷氨酸、天冬氨酸、酪氨酸、赖氨酸的释放能力更强。（3）研究和比较了2株生产用米曲霉菌种的发酵性能。米曲霉2号菌株在蛋白质利用率和氨氮生成率上有优势,但在制曲过程中曲温较难控制,发酵液中产生更多的加热沉淀。2株菌种释放的游离氨基酸种类和挥发性成分差异不大,但含量有差异,感官评定时,米曲霉1号发酵液偏向醇香味,米曲霉2号发酵液偏向酯香味。实际生产中2个菌株混合使用能很好的解决使用单独使用时的缺点,发酵液风味良好,酱、酯、醇香味浓郁,滋味柔和协调,后处理过程中加热沉淀较少,原料利用率较高。
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1. 前言 |
| 1.1. 柠檬酸产业介绍 |
| 1.2. 黑曲霉生产菌种的研究现状 |
| 1.3. 发酵液残糖的研究 |
| 1.4. α-葡萄糖苷酶基因敲除的研究进展 |
| 1.5. 根瘤农杆菌介导的同源重组基因敲除方法 |
| 1.6. 论文立题依据及主要研究内容 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1. 实验仪器与材料 |
| 2.1.1. 菌株与质粒 |
| 2.1.2. 引物 |
| 2.1.3. 试剂 |
| 2.1.4. 主要仪器 |
| 2.1.5. 溶液配置 |
| 2.1.6. 培养基配置 |
| 2.2. 实验方法 |
| 2.2.1. 敲除载体的构建 |
| 2.2.2. 黑曲霉的转化 |
| 2.2.3. 黑曲霉菌落形态的观察 |
| 2.2.4. 黑曲霉孢子形态的观察 |
| 2.2.5. 黑曲霉生长曲线的测定 |
| 2.2.6. 黑曲霉菌丝球周长的测量 |
| 2.2.7. 发酵液还原糖和残糖含量的测定 |
| 2.2.8. 发酵液中异麦芽糖和柠檬酸含量的测定 |
| 3. 结果与讨论 |
| 3.1. 敲除载体的构建与鉴定 |
| 3.1.1. pPZP-49940敲除载体的构建与鉴定 |
| 3.1.2. pPZP-Bleo-40261敲除载体的构建与鉴定 |
| 3.2. 敲除载体转化根瘤农杆菌及其鉴定 |
| 3.2.1. pPZP-49940载体的根瘤农杆菌转化子的鉴定 |
| 3.2.2. pPZP-Bleo-40261载体的的根瘤农杆菌转化子的鉴定 |
| 3.3. 黑曲霉的转化及转化子筛选与鉴定 |
| 3.4. 菌落形态的比较观察 |
| 3.5. 孢子形态的比较观察 |
| 3.6. 生长曲线的测定与比较 |
| 3.7. 菌丝球周长的测量与比较 |
| 3.8. 发酵液还原糖和残糖含量的测定与分析 |
| 3.9. 发酵液中异麦芽糖含量的测定与分析 |
| 3.10. 发酵液中柠檬酸含量的测定与分析 |
| 4. 结论 |
| 5. 展望 |
| 6. 参考文献 |
| 7. 论文发表情况 |
| 8. 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 黑曲霉 |
| 1.1.1 黑曲霉简介 |
| 1.1.2 黑曲霉的工业应用 |
| 1.1.2.1 黑曲霉在柠檬酸生产中的应用 |
| 1.1.2.2 黑曲霉表达系统以及酶制剂生产中的应用 |
| 1.1.2.3 黑曲霉在冶金领域的应用 |
| 1.1.2.4 黑曲霉在养殖业上的应用 |
| 1.2 耐酸性α-淀粉酶 |
| 1.2.1 耐酸性α-淀粉酶的来源 |
| 1.2.2 耐酸性α-淀粉酶的催化机制 |
| 1.2.3 α-淀粉酶的特性及作用机制 |
| 1.2.4 耐酸性α-淀粉酶的耐酸机制及耐热性 |
| 1.2.5 α-淀粉酶的酶活测定方法 |
| 1.2.6 耐酸性α-淀粉酶的应用 |
| 1.2.7 耐酸性α-淀粉酶的异源表达 |
| 1.2.8 耐酸性α-淀粉酶的开发和应用概况 |
| 1.3 甘露聚糖酶 |
| 1.3.1 β-甘露聚糖酶的来源 |
| 1.3.2 β-甘露聚糖酶的酶学性质 |
| 1.3.3 β-甘露聚糖酶的异源表达 |
| 1.3.4 国内外研究进展 |
| 1.3.5 β-甘露聚糖酶的应用 |
| 1.4 巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)表达系统[95] |
| 1.4.1 毕赤酵母表达系统研究现状 |
| 1.4.2 毕赤酵母表达系统的优点 |
| 1.4.3 影响外源基因在巴斯德毕赤酵母表达的因素 |
| 1.4.4 巴斯德毕赤酵母表达系统的应用 |
| 1.5 真菌ITS序列分析与Biolog微生物鉴定系统 |
| 1.6 研究内容、目的与意义 |
| 第二章 嗜酸性霉菌MJ5的鉴定、碳源分析及所产α淀粉酶的酶学性质 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株和试剂 |
| 2.1.2 培养基 |
| 2.2 引物合成及测序 |
| 2.3 实验仪器 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 菌株的分离、纯化与保存 |
| 2.4.2 菌体的形态学观察 |
| 2.4.3 rDNAITS序列以及进化树的构建 |
| 2.4.4 Biolog微生物鉴定系统 |
| 2.4.5 在不同培养基下MJ5的产酸情况 |
| 2.4.6 MJ5淀粉酶性质的研究 |
| 2.4.6.1 淀粉酶酶活标准曲线的测定 |
| 2.4.6.2 淀粉酶的酶活力测定 |
| 2.4.6.3 MJ5淀粉酶产酶曲线的绘制 |
| 2.4.6.3 MJ5胞外淀粉酶的最适反应温度 |
| 2.4.6.4 MJ5胞外淀粉酶最适反应pH |
| 2.4.6.5 MJ5胞外淀粉酶pH稳定性和温度稳定性的测定 |
| 2.5 结果与分析 |
| 2.5.1 MJ5的形态特征观察 |
| 2.5.2 rDNAITS序列鉴定结果 |
| 2.5.3 碳源代谢分析 |
| 2.5.4 不同培养基下的产酸情况 |
| 2.5.5 葡萄糖标准曲线的绘制 |
| 2.5.6 MJ5淀粉酶的产酶曲线 |
| 2.5.7 MJ5淀粉酶的最适温度 |
| 2.5.8 MJ5淀粉酶的最适pH |
| 2.5.9 MJ5淀粉酶pH稳定性 |
| 2.5.10 MJ5淀粉酶的热稳定性 |
| 2.6 讨论 |
| 2.7 小结 |
| 第三章 黑曲霉MJ5(AspergillusnigerMJ5)耐酸性α-淀粉酶基因的克隆与表达 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 菌株、载体、工具酶和试剂 |
| 3.1.2 引物合成及测序 |
| 3.1.3 培养基及试剂的配制 |
| 3.1.4 实验仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 黑曲霉MJ5全基因组测序 |
| 3.2.2 耐酸性α-淀粉酶基因的克隆 |
| 3.2.3 耐酸性α-淀粉酶基因cDNA全长序列 |
| 3.2.4 耐酸性α-淀粉酶在毕赤酵母中的表达 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 黑曲霉MJ5全基因组测序结果 |
| 3.3.2 AspergillusnigerMJ5耐酸性α-淀粉酶基因α-amy-5的扩增 |
| 3.3.3 重组表达载体的构建与阳性克隆菌落的鉴定结果 |
| 3.3.4 耐酸性α-淀粉酶基因α-amy-5基因序列分析 |
| 3.3.5 耐酸性α-淀粉酶基因编码蛋白序列的糖基化分析 |
| 3.3.6 耐酸性α-淀粉酶基因基因所编码蛋白的等电点和分子量预测 |
| 3.3.7 重组质粒的线性化与α-amy-5重组菌株的筛选 |
| 3.3.8 重组淀粉酶酶活测定结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 黑曲霉MJ5(AspergillusnigerMJ5)甘露聚糖酶基因的克隆与表达 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 菌株、载体、工具酶和试剂 |
| 4.1.2 引物合成及测序 |
| 4.1.3 培养基及试剂的配制 |
| 4.1.4 实验仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 MJ5甘露聚糖酶基因的克隆 |
| 4.2.2 甘露聚糖酶基因cDNA全长序列 |
| 4.2.3 MJ5甘露聚糖酶在毕赤酵母中的表达 |
| 4.2.4 重组甘露聚糖酶的酶学性质测定 |
| 4.2.4.1 甘露聚糖酶酶活标准曲线的测定 |
| 4.2.4.2 甘露聚糖酶的酶活力以及比活力的测定 |
| 4.2.4.3 MJ5甘露聚糖酶的最适反应温度 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 AspergillusnigerMJ5甘露聚糖酶基因man-5的扩增 |
| 4.3.2 重组表达载体的构建与阳性克隆菌落的鉴定结果 |
| 4.3.3 MJ5甘露聚糖酶基因man-5基因序列分析 |
| 4.3.4 MJ5甘露聚糖酶基因编码蛋白序列的糖基化分析 |
| 4.3.5 MJ5甘露聚糖酶基因基因所编码蛋白的等电点和分子量预测 |
| 4.3.6 重组质粒的线性化与man-5重组菌株的筛选 |
| 4.3.7 MJ5甘露聚糖酶man-5的纯化及脱糖基化 |
| 4.3.8 MJ5甘露聚糖酶man-5的酶学性质分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者攻读学位期间的科研成果 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 课题来源 |
| 1.2 课题研究的背景和目的意义 |
| 1.3 黑曲霉的研究现状及应用 |
| 1.3.1 黑曲霉的简介 |
| 1.3.2 黑曲霉发酵工程的研究进展 |
| 1.3.3 黑曲霉组学的研究进展 |
| 1.4 小G蛋白家族 |
| 1.4.1 小G蛋白家族在真菌中的研究进展 |
| 1.4.2 Ras在真菌中的研究进展 |
| 1.5 基因过表达的国内外研究现状 |
| 1.6 课题主要研究内容及技术路线 |
| 第2章 实验材料及方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验所用到的菌株和质粒 |
| 2.1.2 实验所用到的培养基 |
| 2.1.3 实验试剂配制 |
| 2.1.4 实验所用的引物 |
| 2.1.5 实验所用到的酶与试剂盒 |
| 2.1.6 实验所用到的仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 黑曲霉ras基因编码区序列的克隆和鉴定 |
| 2.2.2 黑曲霉ras基因过表达质粒的构建 |
| 2.2.3 黑曲霉CGMCC 3.316原生质体的制备 |
| 2.2.4 PEG介导的黑曲霉原生质体转化 |
| 2.2.5 转化子的筛选与验证 |
| 2.2.6 实时定量PCR检测ras基因表达量 |
| 2.2.7 Western Blotting检测Ras蛋白表达量 |
| 2.2.8 转化子生长速度测定 |
| 2.2.9 转化子产孢情况 |
| 2.2.10 转化子生物量测定 |
| 2.2.11 柠檬酸酸度测定 |
| 2.2.12 转化子纤维素总酶活测定 |
| 第3章 重组过表达质粒的构建 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 黑曲霉ras基因编码区序列的克隆和鉴定 |
| 3.3 重组过表达质粒的构建 |
| 3.3.1 重组过表达质粒pCAMBIA 1301:ras的构建 |
| 3.3.2 重组过表达质粒pBARGPE1:ras的构建 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 黑曲霉原生质体转化及转化子的筛选 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 Hygromycin B对黑曲霉CGMCC 3.316菌株最小抑制浓度确定 |
| 4.3 黑曲霉原生质体的制备 |
| 4.3.1 菌丝球培养时间对原生质体制备的影响 |
| 4.3.2 酶解时间对原生质体制备的影响 |
| 4.4 PEG介导的黑曲霉原生质体转化 |
| 4.5 转化子的分子鉴定及其稳定性验证 |
| 4.6 本章小结 |
| 第5章 ras基因过表达转化子生物学特性的研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实时定量PCR检测过表达效率 |
| 5.3 Western Blotting实验检测Ras蛋白表达量 |
| 5.4 转化子生长速度的测定 |
| 5.5 转化子产孢状况的观察 |
| 5.6 转化子生物量的测定 |
| 5.7 柠檬酸酸度的测定 |
| 5.8 纤维素酶酶活的测定 |
| 5.8.1 葡萄糖标准曲线的绘制 |
| 5.8.2 纤维素酶总酶活的测定 |
| 5.9 本章小结 |
| 结论 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 常见的丝状真菌及其应用 |
| 1.1.1 黑曲霉(Apergllius niger) |
| 1.1.2 米曲霉(Aspergillus oryzae) |
| 1.1.3 构巢曲霉(Aspergillus nidulans) |
| 1.1.4 青霉属(Penicillium) |
| 1.1.5 红曲霉(Monascus purpureus Went.) |
| 1.2 转化方法 |
| 1.2.1 原生质体转化(protoplast-mediated transformation,PMT) |
| 1.2.1.1 原生质体转化基本步骤 |
| 1.2.1.2 原生质体转化方法的评价 |
| 1.2.2 电击转化(Electroporation) |
| 1.2.2.1 影响电击转化的因素 |
| 1.2.2.2 电击转化方法的评价 |
| 1.2.3 农杆菌介导转化(Agrobacterium-Mediated Transformation,AMT) |
| 1.2.3.1 影响农杆菌介导转化的因素 |
| 1.2.3.2 农杆菌介导转化方法的评价 |
| 1.2.4 基因枪法(Biolistic) |
| 1.3 筛选标签 |
| 1.3.1 药物抗性筛选标签 |
| 1.3.2 营养缺陷型筛选标签 |
| 1.3.3 报告基因 |
| 1.3.3.1 绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP) |
| 1.3.3.2 荧光素酶 |
| 1.4 CRISPR/Cas系统 |
| 1.4.1 基因编辑技术的发展 |
| 1.4.2 CRISPR系统组分及作用机制 |
| 1.4.2.1 CRISPR系统组分 |
| 1.4.2.2 CRISPR/Cas9系统作用机制 |
| 1.4.3 DSBs修复途径 |
| 1.4.4 CRISPR系统的优势 |
| 1.5 本研究的目的意义、内容及技术路线 |
| 1.5.1 研究的目的意义 |
| 1.5.2 研究内容 |
| 1.5.2.1 核酸内切酶质粒的设计与构建 |
| 1.5.2.2 构建丝状真菌转化系统 |
| 1.5.2.3 sgRNA的设计与合成 |
| 1.5.2.4 sgRNA的电击转化 |
| 1.5.2.5 阳性克隆筛选及验证 |
| 1.5.3 技术路线 |
| 第二章 CRISPR系统应用于黑曲霉基因组编辑 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株与质粒 |
| 2.1.2 主要药品与耗材 |
| 2.1.2.1 试剂 |
| 2.1.2.2 试剂盒 |
| 2.1.2.3 耗材 |
| 2.1.3 主要培养基与试剂配制 |
| 2.1.3.1 试剂的配制 |
| 2.1.3.2 抗生素的配制 |
| 2.1.3.3 培养基的配制 |
| 2.1.4 仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 pCAMBIA1302-hFnCpf1载体的构建 |
| 2.2.1.1 In-Fusion引物的设计 |
| 2.2.1.2 载体构建思路及克隆模拟 |
| 2.2.1.3 pCAMBIA1302和pcDNA3.1-hFnCpf1质粒的准备 |
| 2.2.1.4 pCAMBIA1302质粒的双酶切及胶回收 |
| 2.2.1.5 hFnCpf1目的基因的PCR |
| 2.2.1.6 hFnCpf1目的基因PCR产物纯化 |
| 2.2.1.7 hFnCpf1目的基因与pCAMBIA1302-Nco I-Eco91 I载体In-Fusion反应 |
| 2.2.1.8 In-Fusion连接产物的转化 |
| 2.2.1.9 pCAMBIA1302-hFnCpf1重组质粒的PCR验证 |
| 2.2.2 农杆菌介导的黑曲霉转化系统的建立 |
| 2.2.2.1 A.niger CBS513.88菌株潮霉素耐受试验及引物的设计 |
| 2.2.2.2 农杆菌GV3101的培养与感受态细胞的制备 |
| 2.2.2.3 pCAMBIA1302-hFnCpf1质粒冻融法转化农杆菌GV3101感受态 |
| 2.2.2.4 农杆菌GV3101-pCAMBIA1302-hFnCpf1单菌落PCR检测阳性克隆 |
| 2.2.2.5 重组农杆菌的活化和诱导培养 |
| 2.2.2.6 黑曲霉孢子的获取 |
| 2.2.2.7 农杆菌介导的黑曲霉转化体系的建立 |
| 2.2.2.8 A.niger CBS513.88-pCAMBIA1302-hFnCpf1转化子基因组的提取 |
| 2.2.2.9 A.niger CBS513.88-pCAMBIA1302-hFnCpf1转化子的PCR验证 |
| 2.2.3 sgRNA的设计与合成 |
| 2.2.3.1 sgRNA的设计 |
| 2.2.3.2 体外转录sgRNA |
| 2.2.4 CRISPR系统应用于黑曲霉的编辑及验证 |
| 2.2.4.1 突变检测引物的设计 |
| 2.2.4.2 A.niger CBS513.88-pCAMBIA1302-hFnCpf1孢子的收集 |
| 2.2.4.3 电击参数的设置、电击及筛选 |
| 2.2.4.4 突变单菌落的筛选 |
| 2.2.4.5 突变单菌落的PCR验证 |
| 2.2.4.6 突变单菌落的测序结果分析与讨论 |
| 第三章 结果与讨论 |
| 3.1 pCAMBIA1302-hFnCpf1载体的构建结果 |
| 3.2 农杆菌介导的黑曲霉转化系统的构建 |
| 3.2.1 A.niger CBS 513.88与Agrobacterium tumefaciens GV3101的培养结果 |
| 3.2.2 A.niger CBS513.88的潮霉素耐受试验结果分析 |
| 3.2.3 pCAMBIA1302-hFnCpf1质粒转化农杆菌GV3101感受态的效率与鉴定 |
| 3.2.4 农杆菌介导的黑曲霉转化的效率与分析 |
| 3.2.4.1 黑曲霉孢子的获取情况 |
| 3.2.4.2 农杆菌介导的黑曲霉转化初步探究结果 |
| 3.2.5 A.niger CBS513.88-pCAMBIA1302-hFnCpf1转化子的二次筛选 |
| 3.2.6 A.niger CBS513.88-pCAMBIA1302-hFnCpf1转化子的验证结果分析 |
| 3.3 sgRNA的设计与合成 |
| 3.3.1 sgRNA的设计思路与结果 |
| 3.3.2 sgRNA的体外转录结果与分析 |
| 3.4 CRISPR系统应用于黑曲霉的基因组编辑及验证 |
| 3.4.1 电击后培养结果 |
| 3.4.2 突变子的筛选 |
| 3.4.3 突变子验证结果分析 |
| 3.4.3.1 目的基因PCR结果与分析 |
| 3.4.3.2 突变子的hph基因测序结果分析及核酸序列对位排列 |
| 3.4.3.3 突变子表达框架分析 |
| 3.4.3.4 构建起始菌株与突变子的核酸序列、蛋白序列的进化树 |
| 3.4.4 CRISPR/Cpf1系统应用于黑曲霉基因组编辑结果讨论及分析 |
| 3.4.4.1 影响编辑效率的因素 |
| 3.4.4.2 编辑的精确性分析 |
| 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历、在学期间的研究成果及发布的学术论文 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 课题来源 |
| 1.2 课题研究的背景和目的意义 |
| 1.3 黑曲霉的研究现状及应用 |
| 1.3.1 黑曲霉的简介 |
| 1.3.2 黑曲霉在产酶和产酸方面的应用 |
| 1.3.3 黑曲霉在生物饲料方面的应用 |
| 1.3.4 黑曲霉在生物转化方面的应用 |
| 1.4 基因敲除的国内外研究现状 |
| 1.4.1 基因敲除的概念 |
| 1.4.2 基因敲除的原理及方法 |
| 1.5 小G蛋白家族在真菌中的研究进展 |
| 1.6 课题主要研究内容及技术路线 |
| 第2章 实验材料及方法 |
| 2.1 实验所用材料 |
| 2.1.1 实验所用到的菌株和质粒 |
| 2.1.2 实验所用到的引物 |
| 2.1.3 实验所用到的仪器 |
| 2.1.4 实验所用到的药品和试剂 |
| 2.1.5 实验所用到的培养基 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 黑曲霉ras基因大片段的克隆和鉴定 |
| 2.2.2 黑曲霉ras基因敲除质粒pPZPtk8.10：ras：hyg的构建 |
| 2.2.3 敲除质粒的真菌转化及敲除子的筛选鉴定 |
| 2.2.4 敲除子生长速度的测定 |
| 2.2.5 敲除子菌丝形态及产孢情况的观察 |
| 2.2.6 敲除子生物量的测定 |
| 2.2.7 敲除子生长温度的观测 |
| 2.2.8 敲除子纤维素酶酶活力的测定 |
| 第3章 敲除质粒pPZPtk8.10：ras：hyg的构建 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 黑曲霉ras基因及其上下游序列的克隆和鉴定 |
| 3.2.1 黑曲霉ras基因大片段的获得 |
| 3.2.2 黑曲霉ras基因保守区域的分析及上下游同源序列长度的确定 |
| 3.3 中间重组质粒pPZPtk8.10：ras的构建 |
| 3.4 敲除质粒pPZPtk8.10：ras：hyg的构建 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 第4章 黑曲霉的真菌转化及ras基因敲除子筛选鉴定 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 敲除质粒pPZPtk8.10：ras：hyg转化农杆菌 |
| 4.3 黑曲霉ras基因敲除子对潮霉素B的最小筛选浓度的确定 |
| 4.4 农杆菌与黑曲霉共培养介导的真菌转化 |
| 4.5 ras基因敲除子的分子生物学鉴定及其遗传稳定性的验证 |
| 4.6 讨论 |
| 4.7 本章小结 |
| 第5章 ras基因敲除子生物学特性的研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 ras基因敲除子生长速度的测定 |
| 5.3 ras基因敲除子菌丝形态及产孢状况的观察 |
| 5.4 ras基因敲除子生物量的测定 |
| 5.5 ras基因敲除子培养温度对其影响的观察 |
| 5.6 ras基因敲除子纤维素酶酶活的测定 |
| 5.6.1 葡萄糖标准曲线的绘制 |
| 5.6.2 Cx酶酶活的测定 |
| 5.6.3 β-葡聚糖苷酶酶活的测定 |
| 5.7 讨论 |
| 5.8 本章小结 |
| 结论 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文及其它成果 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 0 前言 |
| 第一节 柠檬酸及其发酵工业的背景知识 |
| 1 柠檬酸的性质 |
| 2 柠檬酸的生产史 |
| 2.1 国外柠檬酸生产研究史 |
| 2.2 国内柠檬酸生产研究史 |
| 3 柠檬酸的工业生产 |
| 3.1 柠檬酸的工业生产及市场现状 |
| 3.2 柠檬酸的工业生产方式 |
| 3.3 发酵生产柠檬酸的菌种 |
| 3.4 发酵生产柠檬酸的原料 |
| 4 柠檬酸生物合成的调节及控制 |
| 4.1 柠檬酸生物合成途径的发现 |
| 4.2 柠檬酸生物合成途径 |
| 4.3 柠檬酸生物合成的调节机制 |
| 4.4 柠檬酸发酵过程控制 |
| 5 柠檬酸的提取 |
| 6 柠檬酸的主要用途 |
| 第二节 本论文研究的背景、内容和意义 |
| 第二章 海洋解脂耶罗威亚酵母菌发酵产柠檬酸的筛选及其发酵产酸的初步探索 |
| 0 前言 |
| 第一节 海洋 Y. lipolytica发酵产柠檬酸的筛选 |
| 1 材料和试剂 |
| 2 方法 |
| 3 结果与讨论 |
| 第二节 发酵产酸的碳源选择和接种量确定 |
| 1 材料和试剂 |
| 2 方法 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 产酸碳源的确定 |
| 3.2 产酸最佳葡萄糖浓度的确定 |
| 3.3 产酸最适接种量的确定 |
| 本章小结 |
| 第三章 利用木薯淀粉发酵产柠檬酸的研究 |
| 0 前言 |
| 第一节 淀粉酶的获得及木薯淀粉水解液的制备 |
| 1 材料和试剂 |
| 2 方法 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 淀粉酶酶活力的测定 |
| 3.2 淀粉酶与底物最适配比及水解时间的确定 |
| 第二节 利用木薯淀粉水解液发酵产柠檬酸 |
| 1 材料和试剂 |
| 2 方法 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 分批发酵过程中发酵液还原糖浓度变化 |
| 3.2 分批发酵过程中菌体生长量的变化 |
| 3.3 分批发酵过程中发酵液柠檬酸含量变化 |
| 3.4 2-l 发酵罐分批补料发酵产柠檬酸 |
| 本章小结 |
| 第四章 菊粉酶基因在产酸菌株中的表达及利用菊粉发酵产柠檬酸的研究 |
| 0 前言 |
| 第一节 菊粉酶基因表面展示载体的构建及表达 |
| 1 材料和试剂 |
| 2 方法 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 尿嘧啶缺陷型的筛选 |
| 3.2 菊粉酶基因表面展示表达载体的构建 |
| 3.3 转化子阳性克隆的检测 |
| 3.4 阳性转化子表面展示菊粉酶活力的测定及筛选 |
| 3.5 表面展示菊粉酶表达的最佳时间测定 |
| 4 讨论 |
| 第二节 表面展示菊粉酶酶学性质的研究 |
| 1 材料和试剂 |
| 2 方法 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 表面展示菊粉酶的最适反应温度及温度稳定性 |
| 3.2 表面展示菊粉酶最适反应 pH 和 pH 稳定性 |
| 3.3 表面展示酶的重复利用 |
| 3.4 水解产物的薄层层析 |
| 第三节 利用菊粉一步发酵产柠檬酸 |
| 1 材料和试剂 |
| 2 方法 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 利用菊粉发酵产柠檬酸 |
| 3.2 最佳碳源浓度的确定 |
| 3.3 在 2-l 发酵罐中利用菊粉一步发酵产柠檬酸 |
| 本章小结 |
| 第五章 转化菌株 INU-87 的进一步遗传改良 |
| 0 前言 |
| 第一节 ACL1 基因敲除载体的构建 |
| 1 材料和试剂 |
| 2 方法 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 ACL1 基因敲除载体的构建 |
| 3.2 目的敲除片段的获得 |
| 第二节 ICL1 基因超表达载体的构建 |
| 1 材料和试剂 |
| 2 方法 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 ICL1 基因超表达载体的构建 |
| 3.2 ICL1 基因超表达载体目的片段的获得 |
| 第三节 菌株 INU-87 的遗传改良及阳性转化子的筛选检测 |
| 1 材料和试剂 |
| 2 方法 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 阳性转化子的筛选 |
| 3.2 阳性转化子的 PCR 检测 |
| 第四节 遗传改良对产酸菌株的影响及遗传改良菌株IAI-30在发酵产酸中的应用 |
| 1 材料和试剂 |
| 2 方法 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 ACL1 基因部分敲除对产酸菌株的影响 |
| 3.2 ICL1 基因超表达对产酸菌株的影响 |
| 3.3 各发酵体系柠檬酸及异柠檬酸产量比较 |
| 3.4 利用 2-l 发酵罐一步发酵菊粉产柠檬酸 |
| 3.5 2-l 发酵罐中利用菊芋提取液发酵产柠檬酸 |
| 本章小结 |
| 第六章 发酵液中柠檬酸的提取及精制 |
| 0 前言 |
| 1 材料和试剂 |
| 2 方法 |
| 3 结果及分析 |
| 3.1 柠檬酸的提取及精制 |
| 3.2 柠檬酸样品的高效液相色谱分析 |
| 本章小结 |
| 总结与创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 论文发表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 前言 |
| 2 扣囊复膜酵母菌利用淀粉生产海藻糖 |
| 3 扣囊复膜酵母的淀粉酶 |
| 3.1 α-淀粉酶 |
| 3.2 葡糖淀粉酶 |
| 3.3 可分解生淀粉的葡糖淀粉酶 |
| 4 扣囊复膜酵母的酸性蛋白酶 |
| 5 扣囊复膜酵母的β-葡萄糖苷酶 |
| 6 生产乙醇 |
| 7 扣囊复膜酵母的遗传学研究进展 |
| 8 葡萄糖阻遏 |
| 8.1 不同水平的葡萄糖阻遏 |
| 8.2 Mig1 复合体和葡萄糖阻遏之间的关系 |
| 8.3 复合体和葡萄糖阻遏之间的关系 |
| 9 基因敲除的方法 |
| 9.1 基因敲除的定义和应用 |
| 9.2 基因敲除的常用方法 |
| 9.2.1 利用同源重组技术进行基因敲除 |
| 9.2.2 随机插入突变的基因敲除 |
| 9.2.3 RNAi 技术进行基因敲除 |
| 10 本论文研究的目的和主要内容 |
| 10.1 研究的目的 |
| 10.2 研究的主要内容 |
| 第二章 扣囊复膜酵母A11 酸性蛋白酶基因敲除提高淀粉酶活性稳定性以及海藻糖含量 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 菌株和质粒 |
| 2.1.1 实验菌株 |
| 2.1.2 质粒 |
| 2.2 培养基和试剂 |
| 2.2.1 培养基 |
| 2.2.2 试剂 |
| 2.3 方法 |
| 2.3.1 扣囊复膜酵母基因组DNA 的提取 |
| 2.3.2 酸性蛋白酶基因敲除载体的构建 |
| 2.3.3 扣囊复膜酵母A11 感受态的制备 |
| 2.3.4 转化与筛选 |
| 2.3.5 酸性蛋白酶的制备和活性的测定 |
| 2.3.6 酸性蛋白酶基因敲除的验证 |
| 2.3.7 生长曲线的测定 |
| 2.3.8 形态学观察 |
| 2.3.9 淀粉酶的制备和活性的测定 |
| 2.3.10 不同温度对淀粉酶稳定性的影响 |
| 2.3.11 外源重组酸性蛋白酶对淀粉酶稳定性的影响 |
| 2.3.12 扣囊复膜酵母A11-a 海藻糠的积累及其含量的测定 |
| 2.3.13 细胞干重的测定 |
| 2.3.14 培养基中还原糖含量的测定 |
| 3 结果和讨论 |
| 3.1 扣囊复膜酵母A11 基因组DNA 的提取 |
| 3.2 酸性蛋白酶基因敲除载体的构建 |
| 3.3 扣囊复膜酵母转化与筛选结果 |
| 3.4 酸性蛋白酶活性的测定结果 |
| 3.5 酸性蛋白酶基因敲除的验证结果 |
| 3.5.1 PCR 验证结果 |
| 3.5.2 牛奶平板上的水解透明圈的验证结果 |
| 3.6 扣囊复膜酵母A11 和敲除菌株A11-a 的生长曲线 |
| 3.7 形态学观察结果 |
| 3.8 扣囊复膜酵母A11 和敲除菌株A11-a 的酸性蛋白酶、淀粉酶生产的变化 |
| 3.9 淀粉酶热稳定性的变化 |
| 3.10 外源重组酸性蛋白酶对淀粉酶稳定性的影响 |
| 3.11 在摇瓶培养条件下海藻糖的积累 |
| 3.12 细胞干重的测定结果 |
| 3.13 培养基中还原糖含量的变化 |
| 4 本章小结 |
| 第三章 扣囊复膜酵母A11-a 高热敏渗透突变菌株的海藻糖积累与释放 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 菌株 |
| 2.2 培养基和试剂 |
| 2.2.1 培养基 |
| 2.2.2 试剂 |
| 2.3 方法 |
| 2.3.1 亚硝基胍诱变扣囊复膜酵母A11-a 菌株 |
| 2.3.2 高度热敏渗透突变菌株的分离 |
| 2.3.3 分别用三氯乙酸和蒸馏水提取海藻糖 |
| 2.3.4 酵母细胞在28℃和37℃下用蒸馏水和1.0 M 山梨醇处理 |
| 2.3.5 摇瓶振荡培养下扣囊复膜酵母 A11-a 和突变菌株 A11-b 海藻糖的积累 |
| 2.3.6 发酵培养下扣囊复膜酵母A11-b 海藻糖的积累 |
| 2.3.7 细胞干重的测定 |
| 2.3.8 发酵培养下还原糖和总糖含量的测定 |
| 2.3.9 海藻糖的纯化 |
| 3 结果和讨论 |
| 3.1 高热敏渗透菌株的诱变和筛选 |
| 3.2 用三氯乙酸和蒸馏水提取海藻糖的比较 |
| 3.3 酵母细胞在28℃和37℃下经蒸馏水和1.0 M 山梨醇处理的结果 |
| 3.4 摇瓶振荡培养下扣囊复膜酵母A11-a 和突变菌株A11-b 海藻糖的积累和细胞生长量 |
| 3.5 发酵培养下扣囊复膜酵母A11-b 海藻糖积累和细胞生长量 |
| 3.6 扣囊复膜酵母A11-b 发酵培养下还原糖和总糖含量的变化 |
| 3.7 海藻糖的纯化和结晶 |
| 4 本章小结 |
| 第四章 扣囊复膜酵母A11 的MIG1 基因克隆 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 菌株和质粒 |
| 2.2 培养基和试剂 |
| 2.2.1 培养基 |
| 2.2.2 试剂 |
| 2.3 方法 |
| 2.3.1 扣囊复膜酵母A11 基因组DNA 的提取 |
| 2.3.2 简并引物的设计 |
| 2.3.3 简并引物PCR 扩增 |
| 2.3.4 总RNA 提取 |
| 2.3.5 RACE 方法扩增基因 |
| 2.3.6 用HindⅢ酶切并环化基因组DNA，PCR 扩增 |
| 2.3.7 用XbaI 酶切并环化基因组DNA，PCR 扩增 |
| 2.3.8 MIG1 基因全长的获得 |
| 2.3.9 MIG1 基因生物信息学分析 |
| 3 结果和讨论 |
| 3.1 简并引物的设计 |
| 3.2 简并引物PCR 扩增结果 |
| 3.3 RNA 提取结果 |
| 3.4 RACE 方法扩增基因结果 |
| 3.5 用HindⅢ酶切并环化基因组DNA 及PCR 扩增结果 |
| 3.6 用XbaI 酶切并环化基因组DNA 及PCR 扩增结果 |
| 3.7 MIG1 基因生物信息学分析 |
| 3.7.1 MIG1 基因全长的获得及推测ORF 框、氨基酸序列 |
| 3.7.2 Mig1 蛋白氨基酸序列保守性 |
| 3.7.3 Mig1 蛋白质保守区3D 结构预测 |
| 3.7.4 MIG1 基因启动子预测 |
| 3.7.5 Mig1 蛋白氨基酸序列糖基化位点分析 |
| 3.7.6 Mig1 蛋白氨基酸序列信号肽预测 |
| 4 本章小结 |
| 第五章 扣囊复膜酵母A11 菌株的MIG1 基因对菌丝体形成、胞外酶合成及其表达的影响 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 菌株和质粒 |
| 2.1.1 实验菌株 |
| 2.1.2 质粒 |
| 2.2 培养基和试剂 |
| 2.2.1 培养基 |
| 2.2.2 试剂 |
| 2.3 方法 |
| 2.3.1 扣囊复膜酵母基因组DNA 的提取 |
| 2.3.2 MIG1 基因敲除载体的构建 |
| 2.3.3 扣囊复膜酵母A11 感受态的制备 |
| 2.3.4 转化与筛选 |
| 2.3.5 MIG1 基因敲除的验证 |
| 2.3.6 形态学观察 |
| 2.3.7 扣囊复膜酵母A11 菌株和MIG1 基因敲除菌株 A11-c 生长曲线的测定 |
| 2.3.8 酸性蛋白酶的制备和活性测定 |
| 2.3.9 α-淀粉酶的制备和活性测定 |
| 2.3.10 葡糖淀粉酶的制备和活性测定 |
| 2.3.11 β-葡萄糖苷酶的制备和活性测定 |
| 2.3.12 细胞干重的测定 |
| 2.3.13 实时荧光定量PCR |
| 3 结果和讨论 |
| 3.1 MIG1 基因敲除载体的构建 |
| 3.2 扣囊复膜酵母转化与筛选结果 |
| 3.3 MIG1 基因敲除的验证结果 |
| 3.3.1 PCR 验证结果 |
| 3.3.2 在2-脱氧-D-葡萄糖培养基中生长情况 |
| 3.4 形态学观察结果 |
| 3.5 扣囊复膜酵母A11 菌株和MIG1 基因敲除菌株A11-c 的生长曲线 |
| 3.6 引物特异性验证结果 |
| 3.7 MIG1 基因敲除菌株A11-c 和扣囊复膜酵母A11 菌株胞外酶生产及其它们基因的表达 |
| 4 本章小结 |
| 总结与创新点 |
| 参考文献 |
| 缩略语 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
| 论文发表情况 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 课题研究的目的和意义 |
| 1.2 国内外文献综述 |
| 1.2.1 纤维素的研究进展 |
| 1.2.2 纤维素酶的产生菌及其生产概况 |
| 1.2.3 纤维素酶的分子生物学研究动态 |
| 1.2.4 纤维素降解机理研究概况 |
| 1.2.5 纤维素酶的应用 |
| 1.3 纤维素降解研究中存在的问题 |
| 1.4 课题的来源及主要研究内容 |
| 1.4.1 课题的来源 |
| 1.4.2 主要研究内容 |
| 第2章 实验材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 土壤样品 |
| 2.1.2 培养基 |
| 2.1.3 实验药品 |
| 2.1.4 缓冲液和常用试剂的配制 |
| 2.1.5 主要仪器 |
| 2.1.6 数据统计 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 纤维素降解菌株的分离纯化 |
| 2.2.2 纤维素分解菌液态发酵条件优化 |
| 2.2.3 纤维素分解菌固态发酵研究 |
| 2.2.4 菌株固定化及固定化产酶过程 |
| 2.2.5 碳源对菌株产纤维素酶的诱导作用 |
| 2.2.6 菌株纤维素酶的分离纯化 |
| 2.2.7 纤维素降解机理研究 |
| 第3章 纤维素降解菌的筛选和鉴定 |
| 3.1 葡萄糖标准曲线的绘制 |
| 3.2 降解纤维素菌株的分离和纯化 |
| 3.3 刚果红平板和滤纸条液体培养基筛选 |
| 3.4 摇瓶筛选 |
| 3.5 菌株的形态学鉴定 |
| 3.5.1 H-11 的形态学鉴定 |
| 3.5.2 C-08 的形态学鉴定 |
| 3.6 关于纤维素降解菌的筛选效果分析 |
| 3.7 本章小结 |
| 第4章 简青霉和绿色木霉产酶及酶解动力学 |
| 4.1 简青霉和绿色木霉液态发酵产纤维素酶 |
| 4.1.1 培养基成分对两株真菌产纤维素酶的影响 |
| 4.1.2 培养条件对两株真菌产纤维素酶的影响 |
| 4.2 简青霉和绿色木霉固态发酵产酶研究 |
| 4.2.1 两株真菌核酸含量与菌体量线性关系 |
| 4.2.2 培养基成分对两株真菌产酶影响 |
| 4.2.3 培养条件对两株真菌产酶影响 |
| 4.3 简青霉和绿色木霉固定化产酶研究 |
| 4.3.1 固定化小球稳定性的研究 |
| 4.3.2 简青霉和绿色木霉固定化产酶条件 |
| 4.4 简青霉和绿色木霉纤维素酶诱导及粗酶液性质 |
| 4.4.1 简青霉和绿色木霉纤维素酶的诱导 |
| 4.4.2 简青霉和绿色木霉粗酶液酶学性质 |
| 4.5 简青霉和绿色木霉粗酶液降解动力学研究 |
| 4.5.1 温度对酶促反应速度的影响 |
| 4.5.2 pH值对酶促反应速度的影响 |
| 4.5.3 反应时间对酶促反应速度的影响 |
| 4.5.4 酶浓度对酶促反应速度的影响 |
| 4.5.5 底物浓度对酶促反应速度的影响 |
| 4.6 简青霉和绿色木霉产酶及降解特性分析 |
| 4.6.1 两株真菌产酶特性的分析 |
| 4.6.2 两株真菌诱导产酶及降解特性的分析 |
| 4.7 本章小结 |
| 第5章 简青霉纤维素酶的分离纯化 |
| 5.1 几种标准曲线的绘制 |
| 5.1.1 蛋白质的标准曲线获得 |
| 5.1.2 DNS法绘制木糖标准曲线 |
| 5.1.3 对硝基苯酚标准曲线的绘制 |
| 5.2 纤维素酶纯化介质选择及酶分子量确定 |
| 5.2.1 分离纯化介质对纤维素酶分离效果影响 |
| 5.2.2 SDS-PAGE凝胶电泳确定酶的分子量 |
| 5.3 β-GaseⅠ的分离纯化及性质研究 |
| 5.3.1 β-GaseⅠ的纯化及分子量测定 |
| 5.3.2 β-GaseⅠ的高效液相色谱检测 |
| 5.3.3 β-GaseⅠ酶学特性研究 |
| 5.3.4 β-GaseⅠ的紫外及红外光谱测定 |
| 5.4 β-GaseⅡ的分离纯化及性质研究 |
| 5.4.1 β-GaseⅡ的纯化及分子量测定 |
| 5.4.2 β-GaseⅡ的高效液相色谱检测 |
| 5.4.3 β-GaseⅡ的酶学特性研究 |
| 5.4.4 β-GaseⅡ的紫外和红外光谱测定 |
| 5.5 CMCase的分离纯化及性质研究 |
| 5.5.1 CMCase的纯化及分子量测定 |
| 5.5.2 CMCase的高效液相色谱检测 |
| 5.5.3 CMCase的酶学特性研究 |
| 5.5.4 CMCase的紫外和红外光谱测定 |
| 5.6 纤维素酶的分离纯化及特性分析 |
| 5.6.1 纤维素酶分离纯化 |
| 5.6.2 纤维素酶的酶学特性 |
| 5.7 本章小结 |
| 第6章 简青霉和绿色木霉降解纤维素机理研究 |
| 6.1 简青霉和绿色木霉纤维素酶的吸附特性 |
| 6.1.1 单组分纤维素酶的吸附特性研究 |
| 6.1.2 粗酶液中纤维素酶的吸附特性研究 |
| 6.2 简青霉和绿色木霉纤维素酶的诱导 |
| 6.3 纤维素酶的协同降解纤维素的研究 |
| 6.4 简青霉和绿色木霉纤维素的氧化降解研究 |
| 6.5 简青霉和绿色木霉降解纤维素机理的分析 |
| 6.5.1 纤维素酶的吸附 |
| 6.5.2 纤维素酶的诱导 |
| 6.5.3 纤维素的降解机理 |
| 6.6 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 餐厨废弃物应用概述 |
| 1.1.1 餐厨废弃物的成分研究 |
| 1.1.2 餐厨废弃物预处理的方法研究 |
| 1.1.3 餐厨废弃物的应用现状 |
| 1.2 富马酸简介 |
| 1.2.1 富马酸的理化性质 |
| 1.2.2 富马酸的应用 |
| 1.3 富马酸的生产方法 |
| 1.3.1 化学法生产富马酸 |
| 1.3.2 酶催化法生产富马酸 |
| 1.3.3 发酵法生产富马酸 |
| 1.3.4 基因工程法生产富马酸 |
| 1.4 根霉发酵生产富马酸的研究 |
| 1.4.1 发酵原料的开发 |
| 1.4.2 根霉菌种的选育 |
| 1.4.3 根霉菌种形态的控制 |
| 1.4.4 根霉生产富马酸代谢机理的研究 |
| 1.5 富马酸的分离提取 |
| 1.6 本文的研究思路及内容 |
| 第二章 通过对种子培养基进行优化提高富马酸产量 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 餐厨废弃物取样 |
| 2.2.2 实验菌种 |
| 2.2.3 实验用培养基 |
| 2.2.4 实验用试剂及仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 餐厨废弃物的预处理 |
| 2.3.2 餐厨废弃物的成分检测方法 |
| 2.3.3 培养液制备及培养方法 |
| 2.3.4 种子培养基正交实验 |
| 2.3.5 分析方法 |
| 2.4 实验结果与讨论 |
| 2.4.1 餐厨废弃物预处理 |
| 2.4.2 餐厨废弃物成分测定 |
| 2.4.3 少根根霉利用餐厨废弃物预发酵 |
| 2.4.4 种子培养基正交实验 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 根霉菌种的选育 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 实验菌种 |
| 3.2.2 实验用培养基 |
| 3.2.3 实验用试剂及仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 培养液制备及培养方法 |
| 3.3.2 菌种的压力筛选 |
| 3.3.3 菌种的诱变筛选 |
| 3.3.4 分析方法 |
| 3.4 实验结果与讨论 |
| 3.4.1 菌种的压力筛选 |
| 3.4.2 菌种的诱变筛选 |
| 3.4.3 诱变菌株发酵对富马酸产量的影响 |
| 3.4.4 发酵过程中餐厨废弃物的降解情况 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 富马酸的连续发酵生产及5L发酵罐放大实验 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 实验菌种 |
| 4.2.2 实验用培养基 |
| 4.2.3 实验用试剂及仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 补料发酵实验 |
| 4.3.2 换料发酵实验 |
| 4.3.3 根霉菌在5L搅拌式反应器内发酵产富马酸 |
| 4.3.4 分析方法 |
| 4.4 实验结果及分析 |
| 4.4.1 补料发酵实验 |
| 4.4.2 换料发酵实验 |
| 4.4.3 根霉菌在5L搅拌式反应器内发酵产富马酸的放大初试 |
| 4.4.4 根霉菌在5L搅拌式反应器内发酵产富马酸的条件优化 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 结论与建议 |
| 5.1 本论文的主要研究内容及结论 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 问题、建议及展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录一 常用实验试剂整理表 |
| 附录二 常用实验仪器整理表 |
| 附录三 菌种选育新增实验试剂整理表 |
| 附录四 菌种选育新增实验仪器整理表 |
| 附录五 5L发酵罐放大实验新增仪器整理表 |
| 致谢 |
| 研究成果及发表的学术论文 |
| 作者及导师简介 |
| 附件 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 酱油 |
| 1.2.1 酱油酿造原料 |
| 1.2.2 酱油酿造原理 |
| 1.2.3 酱油酿造工艺 |
| 1.2.4 酱油的现状与趋势 |
| 1.3 米曲霉 |
| 1.3.1 米曲霉的基本性质和特征 |
| 1.3.2 国内米曲霉的研究进展 |
| 1.3.3 米曲霉诱变选育的研究进展 |
| 1.3.4 国外米曲霉的研究进展 |
| 1.4 本论文的立项依据和研究内容 |
| 1.4.1 立项依据 |
| 1.4.2 研究内容 |
| 第二章 菌种的形态特征及其蛋白酶性质研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 主要材料 |
| 2.2.2 主要仪器设备 |
| 2.2.3 试验方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 形态特征 |
| 2.3.2 平皿产酶能力的对比 |
| 2.3.3 不同酶的活力比较 |
| 2.3.4 成曲蛋白酶性质对比 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 菌种蛋白酶酸性条件下的酶促特性研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 主要试剂 |
| 3.2.3 主要仪器设备 |
| 3.2.4 实验方法 |
| 3.2.5 分析方法 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 不同pH条件下2株米霉菌成曲蛋白酶活力比较 |
| 3.3.2 2株米曲霉蛋白酶催化SPI降解产物情况分析 |
| 3.3.3 水解产物SDS-PAGE图谱分析 |
| 3.3.4 水解产物游离氨基酸分析 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 菌种的生产性能研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 原料 |
| 4.2.2 主要仪器设备 |
| 4.2.3 试验方法 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 发酵过程中各指标的变化 |
| 4.3.2 发酵完成后发酵液各指标对比 |
| 4.4 本章小结 |
| 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 答辩委员会对论文的评定意见 |
