亓润智[1]（2021）在《基于肿瘤细胞外泌体调控TAM细胞极化探讨双参颗粒抑制肺癌的作用机制》文中研究指明研究背景肺癌在我国及世界范围内的发病率、死亡率均居前列。尽管越来越多的肺癌被早期诊断和治疗,新的免疫治疗药物不断问世,放射治疗技术得到不断提升,肺癌患者的总生存时间仍没有得到明显延长,生活质量没有得到明显改善。ⅠA期肺癌患者的5年生存率为83%,ⅢA期患者仅为36%,晚期肺癌患者5年生存率仅3.5%。肺癌的整体中位生存期仍未突破1年。如何减少早期肺癌患者术后复发转移,延长晚期肺癌患者生存期,抑制肺癌进展仍然是目前亟待解决的医学难题。随着大量临床研究证实中医药防治肺癌的有效性,以及基础实验研究对中医药防治肺癌的机制探讨不断深入,中医药在肺癌防治中的地位也逐渐上升。越来越多的研究发现中医药防治肺癌的机制可能与调控肿瘤微环境密切相关。肺癌属中医学“肺积”范畴。《医宗必读》中提到:“积之成也,正气不足,而后邪气踞之”。邪之所凑,其气必虚,正气亏虚则气血阴阳失和,脏腑机能紊乱,气机升降失调。随着中医肿瘤理论的发展,“正虚”是肺癌重要的发病基础已逐渐成为中医肿瘤学术界的共识。肺癌的病机多为虚实夹杂,虚证常见阴虚或气阴两虚,实证多见气滞、痰凝及血瘀,病位在肺,与脾、肾密切相关。气阴两虚、瘀血内阻是肺癌形成与进展的重要因素。肺为娇脏,易受外邪,伤及肺气与肺阴,肺主气功能受损,一身之气不足则邪毒内盛,气不行血、癌毒阻络,则见瘀血内停,瘀毒互结,逐渐形成癌肿。益气养阴活血法是防治肺癌的重要治法之一。双参颗粒由三七、西洋参、冬虫夏草组成,三七活血化瘀兼能补血;西洋参健脾益气而不燥,并能养阴生津;冬虫夏草补益肺肾。三药共奏益气健脾养阴、补益肺肾、金水相生之效,扶正以治本,活血化瘀以治标。临床研究也证明,益气养阴活血法是中医药防治肺癌的重要治法,在临床应用广泛并取得良好疗效。但由于中医临床证候的复杂性,以及中医辨证论治处方的多样性,使中医“益气养阴活血法”防治肺癌的理论未能在细胞分子层面得到很好的验证。我们前期预实验发现双参颗粒可以抑制荷Lewis肺癌小鼠移植瘤的生长,减少自发肺癌小鼠模型肺部肿瘤形成。同时,对双参颗粒干预后的自发肺癌小鼠与未经过双参颗粒干预的小鼠肺组织进行全转录组测序分析。结果提示在经过双参颗粒干预后,巨噬细胞迁移抑制因子（Macrophage migration inhibitory factor,MIF）,巨噬细胞标志蛋白（MannosereceptorCtype 1,MRC1/CD206）,含锌指转录因子（Kruppel-like factors,KLF）家族如 KLF4、KLF2,基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinases,MMPs）家族,以及非编码 RNA（Non-coding RNA）如microRNA-34a（miR-34a）、microRNA-21（miR-21）的表达以及外泌体相关基因表达存在差异。这些差异基因都与肿瘤相关巨噬细胞（Tumor-associated macrophages,TAMs）表型、功能调控以及外泌体功能密切相关,基于TAMs极化在调控肿瘤微环境影响肿瘤生长中的重要作用,我们从TAMs与肿瘤细胞外泌体入手,探讨双参颗粒抑制荷Lewis肺癌的作用是否与肿瘤细胞外泌体调控TAMs表型和功能相关。研究目的本研究拟通过体内实验与体外实验,借助分子生物学技术,探明双参颗粒抑制肿瘤生长是否与肺癌细胞外泌体调控TAMs表型与功能相关,以及初步探讨双参颗粒通过外泌体影响TAMs极化的机制是否与MIF-miR-34a-KLF4通路相关,为中医药“益气养阴活血法”防治肺癌提供客观依据。研究方法1.构建荷Lewis肺癌小鼠模型,以高、中、低三个剂量的双参颗粒对荷Lewis肺癌小鼠进行干预,观察各组小鼠移植瘤的体积、移植瘤质量,验证以益气养阴活血为治法的双参颗粒对小鼠肺癌的抑制作用。2.通过流式细胞术、免疫荧光染色法,分别对小鼠脾脏、移植瘤组织的M1型与M2型TAMs进行检测,观察双参颗粒对TAMs表型的影响。3.通过Lewis与M1型巨噬细胞混合皮下接瘤的方法,构建M1型TAMs过表达的小鼠肺癌移植瘤模型。观察移植瘤体积与质量,并通过流式细胞术检测小鼠M1型TAMs比例、M2型TAMs比例;免疫组织化学染色检测M1型TAMs标志蛋白一氧化氮合酶（inducible Nitric Oxide Synthase,iNOS）表达;Western Blot法检测肿瘤组织中精氨酸酶1（Arginase-1,ARG1）、iNOS的表达,探讨双参颗粒抑制Lewis肺癌的作用与TAMs极化的相关性。4.通过流式细胞术、Western Blot法检测小鼠体内调节性T细胞（Regulatory T cells,Tregs）比例、记忆T细胞比例,肿瘤组织中转化生长因子-β（Transforming growth factor-β,TGF-β）、血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）、MMP-9、MIF的表达,探讨双参颗粒调控肿瘤微环境,调节TAMs功能与调控TAMs极化的相关性。5.构建MIF+/+Lewis稳定转染细胞株、shMIF Lewis稳定转染细胞株,通过双参颗粒含药血清的干预,观察双参颗粒对小鼠肺癌细胞MIF表达的影响。6.提取各组肺癌细胞外泌体,qPCR法检测外泌体中miR-34a表达,观察双参颗粒对Lewis细胞来源外泌体中MIF下游靶基因miR-34a的影响,探讨双参颗粒是否通过影响MIF调节外泌体miR-34a的表达。7.收集双参颗粒干预后的MIF+/+Lewis细胞、MIF+/+Lewis细胞、Lewis细胞、shMIF Lewis细胞来源外泌体;并将各组外泌体对巨噬细胞进行干预,观察各组外泌体对巨噬细胞表型的影响,探讨双参颗粒能否通过肺癌细胞来源外泌体影响巨噬细胞极化,以及这一作用与MIF的关系。8.观察各组肺癌细胞外泌体干预后的巨噬细胞中KLF4基因的表达;探讨经双参颗粒干预后的肺癌细胞外泌体影响巨噬细胞极化与功能的作用是否与MIF-miR-34a-KLF4 通路相关。研究结果1.经双参颗粒干预后,荷Lewis肺癌小鼠移植瘤体积与质量减小,随着双参颗粒剂量的增加,其抑制肿瘤体积与质量的作用逐渐增强,高剂量双参颗粒对肿瘤体积与质量的抑制作用最强。2.高、中、低三个剂量的双参颗粒均能减少小鼠脾脏M2型TAMs 比例,增加M1型TAMs比例,但双参颗粒抑制M2型TAMs比例的作用未表现出与双参颗粒剂量有明确负相关。小鼠脾脏M1型TAMs 比例与双参颗粒剂量呈正相关,随双参颗粒剂量增大M1型TAMs比例逐渐增加。移植瘤组织中CD86的表达与双参颗粒的剂量呈正相关,CD206的表达与双参颗粒的剂量呈负相关。3.与经典的荷Lewis肺癌小鼠模型比较,荷Lewis+M1混合移植瘤小鼠模型的肿瘤体积减小,脾脏M1型TAMs比例明显升高。双参颗粒对Lewis+M1混合移植瘤小鼠模型进行干预后,M1型TAMs 比例增加,小鼠肿瘤体积进一步减小,提示双参颗粒抑制Lewis肺癌的作用可能与增加M1型TAMs比例相关。4.双参颗粒可以减少荷Lewis+M1混合移植瘤小鼠肿瘤组织中肿瘤微环境因子 ARG1、TGF-β、MMP-9、VEGF、MIF 的表达,增加 iNOS 的表达。5.双参颗粒能够增加CD8+中枢性记忆T细胞比例,并且与M1型TAMs 比例呈正比;降低CD8+效应性记忆T细胞比例,与M1型TAMs比例呈反比。同时,双参颗粒可以增加CD4+CD25+T细胞比例,减少CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比例。6.通过慢病毒稳定转染细胞技术成功构建了 MIF+/+Lewis、shMIFLewis稳定转染肺癌细胞株,并分别在基因与蛋白水平进行了验证。7.MIF+/+Lewis细胞外泌体中miR-34a表达减少。双参颗粒含药血清在体外可以抑制MIF+/+Lewis细胞MIF蛋白与RNA的表达,同时增加MIF+/+Lewis细胞外泌体中miR-34a的表达。8.成功提取MIF+/+Lewis、shMIFLewis、Lewis细胞来源外泌体,并对巨噬细胞进行干预,成功检测到巨噬细胞吞噬外泌体过程。MIF+/+Lewis细胞来源外泌体在体外可以增加M2型巨噬细胞比例,降低M1型巨噬细胞比例;而经双参颗粒含药血清干预后的MIF+/+Lewis细胞,其外泌体能够逆转这一作用,增加M1型巨噬细胞比例。9.MIF+/+Lewis细胞外泌体在体外可以增加巨噬细胞中KLF4基因的表达;经双参颗粒含药血清干预后的MIF+/+Lewis细胞外泌体能够减少巨噬细胞KLF4基因的表达。研究结论1.双参颗粒可以抑制小鼠肺癌,其作用机制可能与调控小鼠TAMs向M1型极化相关;肺癌细胞中的MIF可能是双参颗粒的作用靶点之一。2.双参颗粒可以通过肺癌细胞来源的外泌体调控TAMs极化,其机制可能与MIF-miR-34a-KLF4 通路相关。3.中医益气养阴活血法防治肺癌的分子生物学机制可能与调节肿瘤细胞外泌体,调控TAMs极化与功能,重塑肿瘤微环境相关。
高瑞珂[2]（2021）在《疏肝健脾法治疗乳腺癌的疗效评价及对瘤前抑郁障碍小鼠乳腺癌作用机制研究》文中指出背景:乳腺癌已发展成为世界上新发病例中排名第一的恶性肿瘤,乳腺癌患者在发病前、诊断时、治疗中及长期存活期常伴有抑郁症状。既往的研究发现长期抑郁使患者罹患癌症的风险显着增加,且抑郁症状与乳腺癌的生存期呈负相关。疏肝健脾法是乳腺癌治疗的重要法则之一,但目前循证证据等级不足,因此本研究将系统评价疏肝健脾法对乳腺癌的疗效。疏肝健脾方为我科以疏肝健脾法确立的经验方,本课题组前期研究中发现疏肝健脾方可降低持续抑郁荷瘤小鼠和瘤后抑郁荷瘤小鼠体内MDSC细胞比例,通过激活NLRP3介导的细胞焦亡通路,抑制肿瘤的生长,但对瘤前抑郁对乳腺癌的发生发展有待进一步研究,故本研究建立瘤前抑郁障碍荷瘤小鼠模型,进一步探究抑郁对机体微环境、肿瘤发生发展的影响及疏肝健脾方的干预作用。目的:1.开展疏肝健脾法治疗乳腺癌有效性及安全性的系统评价和Meta分析,为疏肝健脾法治疗乳腺癌的临床运用提供更高级别的证据。2.建立瘤前抑郁障碍荷瘤小鼠模型,进一步阐明抑郁对机体微环境及肿瘤生长的影响。3.从肿瘤免疫微环境和NLRP3/caspase-1/GSDMD介导细胞焦亡通路,探索疏肝健脾方对瘤前抑郁荷瘤小鼠的作用机制,进一步揭示疏肝健脾法防治乳腺癌新的科学内涵,为中医学“情志学说”延长晚期带瘤生存提供理论依据。方法:1.疏肝健脾法治疗乳腺癌有效性及安全性的系统评价和Meta分析:检索国内外数据库;收集各数据库建库至2021年1月23日符合纳排标准的疏肝健脾法联合化疗治疗乳腺癌的RCT研究。疗效指标为ORR、DCR、KPS评分、抑郁量表评分、不良反应发生率。文献质量评价使用Cochrane手册提供的评估标准。Meta分析采用Review Manager 5.3软件。采用卡方检验进行组间的异质检验,若I2≤50%且P≥0.1采用固定效应模型进行分析,若I2>50%或P<0.1则采用随机效应模型进行分析,结果以森林图呈现,并进行敏感性和发表偏倚分析。2.疏肝健脾方对瘤前抑郁障碍小鼠乳腺癌的干预作用及分子机制研究:（1）瘤前抑郁荷瘤乳腺癌模型的构建与评价:采用慢性温和不可预知性刺激方法（CUMS）构建抑郁模型成功后,随机选取抑郁模型组小鼠,接种4T1-Luciferase（4T1-luc）小鼠乳腺癌细胞。以体重、蔗糖水偏嗜度、行为学测评、脑组织5-HT1AR表达量、接瘤成功率为模型评价指标。（2）抑郁对乳腺癌发生发展作用的研究:抑郁模型构建成功后,①进行脾脏HE染色、免疫细胞流式检测、血清炎症因子检测（ELISA法）;②随机选取正常对照组和抑郁模型组小鼠,接种4T1-luc细胞,观察各组小鼠体重、蔗糖水偏嗜度、行为学测评、脑组织5-HT1AR表达量、肿瘤体积、瘤重;并接瘤21天后进行脾脏HE染色、免疫细胞流式检测、血清炎症因子检测（ELISA法）。（3）疏肝健脾方对瘤前抑郁障碍荷瘤小鼠的干预作用的研究:各组干预21天,观察小鼠体重、蔗糖水偏嗜度、行为学测评、脑组织5-HT1AR表达量、肿瘤体积、瘤重;并进行脾脏HE染色、免疫细胞流式检测、血清炎症因子检测（ELISA法）。（4）疏肝健脾方对瘤前抑郁障碍乳腺癌小鼠干预作用机制的研究:①体外实验:培养4T1-luc细胞,采用CCK8法检测不同含药血清作用下4T1-luc细胞的增殖率。选取对4T1-luc细胞有明显抑制作用的含药血清浓度,设正常对照组、含药血清组,检测LDH释放量,IL-1 β、IL-18释放量（ELISA法）,细胞内NLRP3、caspase-1、GSDMD蛋白的表达量（Westernblotting法检测）。②体内实验:各组干预21天后,采用Western blotting法、免疫组化法检测肿瘤组织中NLRP3、caspase-1、GSDMD蛋白的表达量,免疫荧光法检测肿瘤组织中IL-1β的表达量。结果:1.疏肝健脾法治疗乳腺癌有效性及安全性的系统评价和Meta分析共纳入的29项疏肝健脾法联合化疗与单纯化疗的随机对照研究,共2294例患者。Meta分析结果显示与化疗组相较,疏肝健脾法联合化疗组的ORR、DCR、KPS改善率均明显升高,RR值分别为1.20、1.09、1.29;疏肝健脾法联合化疗组可明显改善患者的抑郁状态、提高KPS评分、CD4+T细胞比例,SMD分别为0.68、0.54、0.98;疏肝健脾法联合化疗组患者的消化道不良反应发生率、肝肾损伤发生率均低于单纯化疗组,RR值分别为0.79、0.44,上述组间差异均具有统计学意义,P<0.05。敏感性分析表明,排除任何研究都不会改变总体统计效果,不会影响最终统计结论。发表偏倚分析结果显示ORR、DCR、KPS改善率均未见发表偏倚。2.疏肝健脾方对瘤前抑郁障碍小鼠乳腺癌的干预作用及分子机制研究:（1）瘤前抑郁荷瘤乳腺癌模型的构建:CUMS造模35天后,与正常对照组相较,抑郁模型组体重、蔗糖水偏嗜度明显降低,运动总距离、中央区运动路程、中央区停留时间明显缩短,静止时间明显延长,海马组织CA1区5HT1AR表达量明显降低,差异均具有统计学意义,P<0.05。接种4T1-luc细胞后第7天,各组均可触及肿瘤结节,证明瘤前抑郁障碍型乳腺癌小鼠模型构建成功。（2）抑郁对机体免疫和炎症微环境的影响:CUMS造模35天后,脾脏中NKT、MDSC、TAM细胞比例明显增高,血清炎症因子IL-6、IL-1β、IL-18表达量明显升高,与正常对照组相较,差异明显,P<0.05。（3）抑郁可促进肿瘤的生长:接种乳腺癌细胞21天后,单纯荷瘤组的平均瘤重为1.02±0.08g,抑郁荷瘤组的平均瘤重为1.26±0.13g,抑郁对乳腺癌小鼠的促瘤率为23.50%。（4）抑郁可加重荷瘤小鼠体内免疫抑制和炎症微环境:与单纯荷瘤组相较,抑郁荷瘤组的脾脏组织红白髓结构模糊,脾窦扩张;抑郁荷瘤组免疫抑制细胞TAM细胞、MDSC细胞比例明显升高,差异具有统计学意义,P<0.05。（5）疏肝健脾方可改善小鼠抑郁状态:接瘤干预21天后,中药组、中药联合化疗组蔗糖水偏嗜度与正常对照组相较,差异无统计学意义;与抑郁荷瘤组相较,中药组、中药联合化疗组运动总路程明显延长,静止时间明显缩短,P<0.05。与化疗组相较,中药联合化疗组运动总路程明显延长、静止时间明显缩短,P<0.05。抑郁荷瘤组相较,中药组、中药联合化疗组脑组织5-HT1AR表达量明显升高,差异存在统计学意义,P<0.05。（6）疏肝健脾方可抑制肿瘤生长,改善机体免疫和炎症微环境:干预后21天,化疗组、中药组、中药联合化疗组的抑瘤率分别为67.28%,16.08%和81.29%。中药组脾脏组织中巨噬细胞增多,中药联合化疗组脾脏结构改善最为明显。与抑郁荷瘤组相较,中药联合化疗组脾脏、肿瘤组织中CD4+T细胞、CD8+T细胞、NKT细胞比例增高,MDSC细胞、TAM细胞的比例明显降低;中药联合化疗组脾脏和肿瘤组织中CD8+T细胞分泌INF-γ、Granzyme B的水平明显升高,P<0.05。与抑郁荷瘤组、化疗组相较,中药组IL-1 β的表达量明显减少（P<0.05）;与化疗组相较,中药联合化疗组IL-6的表达量明显降低（P<0.05）。（7）疏肝健脾方可通过NLRP3/caspase-1/GSDMD通路诱导4T1-luc乳腺癌细胞焦亡:①20%低剂量含药血清对4T1-luc细胞增殖率抑制最为明显。②与正常对照组相较,20%低剂量含药血清干预4T1-luc细胞48h后,LDH释放量和IL-1 β表达量明显增加（P<0.05）;NLRP3炎症小体蛋白、Caspase-1剪切段（p20）、GSDMD-N段蛋白表达量升高（P<0.05）。③干预21天后,与抑郁荷瘤组相较,干预各组NLRP3、Caspase-1、GSDMD蛋白的表达量均明显升高,其中Western blotting检测结果显示中药联合化疗组蛋白表达量明显高于抑郁荷瘤组、化疗组,且中药组活化的caspase-1、GSDMD-N端表达量明显高于抑郁荷瘤组（P<0.05）。免疫荧光检测结果显示化疗干预后IL-1 β表达量增多,中药组IL-1 β表达量明显减少。结论:1.以疏肝健脾法为治则的中药可能为抑郁障碍乳腺癌患者重要的治疗方案。2.疏肝健脾方抑制瘤前抑郁障碍乳腺癌发生发展的机制可能为疏肝健脾方通过NLRP3/caspase-1/GSDMD细胞焦亡通路,诱导乳腺癌细胞死亡,并控制促炎因子IL-6、IL-1 β释放,降低MDSC、TAM细胞比例,提高NKT细胞比例、CD8+T细胞功能,从而改善抑郁对机体微环境的影响,抑制肿瘤生长。
钟鹏程[3]（2021）在《艾可清颗粒减轻环磷酰胺心脏毒性的作用及机制研究》文中研究表明目的:作为一线肿瘤化疗药物及强力免疫抑制剂,环磷酰胺（Cyclophosphamide,CTX）广泛应用于多种恶性肿瘤及自身免疫性疾病的治疗。然而,CTX在发挥治疗作用的同时也可引起多种严重不良反应,如骨髓抑制、心脏毒性、肝功能损害、出血性膀胱炎等。此外,在中医药基础科研领域,CTX常被用作复制中医阳虚、血虚证候动物模型的药物。目前针对CTX毒副反应尚无特效药物,预防或缓解CTX化疗导致的毒副反应对于提高肿瘤治疗效果具有重要的临床意义。艾可清颗粒（AKQ）作为广州中医药大学热带医学研究所创制的专利复方,在艾滋病治疗方面已运用多年,具有增强艾滋病患者免疫力、提高生活质量的作用。本课题组认为AKQ扶阳益气、补肾健脾的功效用于CTX引起的气阳两虚、脾肾双亏副作用的“纠偏”,在理论上具有针对性。基于此,本研究以AKQ为研究对象,通过体内、体外实验结合网络药理学分析、代谢组学以及肠道菌群分析,期望达到以下研究目的:1.明确AKQ对CTX引起的正常与荷瘤小鼠的毒性反应是否具有减毒作用及减毒效应的主要靶器官。2.评估AKQ对CTX毒性代谢产物丙烯醛（ACR）诱导的H9c2心肌细胞损伤是否具有保护作用。3.探索AKQ在上述动物和细胞水平减轻CTX毒性的机制,为中医异病同治理论提供实验依据。方法:1.体内（动物）实验1:观察AKQ对CTX所致昆明小鼠毒性反应的影响。（1）昆明小鼠CTX中毒模型的建立:8周龄,体重25±3g的健康昆明小鼠CTX连续4天腹腔注射给药:第1、2天100 mg/kg/d,第3、4天50 mg/kg/d。（2）分组处理及一般状况观察:健康昆明小鼠24只,随机分为3组,每组8只:正常对照组（第1-4天生理盐水0.3 mL/次/d腹腔注射+第1-7天纯水0.3 mL/次/d灌胃）,模型组（第1-4天CTX注射造模+第1-7天纯水灌胃0.3 mL/次/d）,艾可清组（第1-4天CTX注射造模+第1-7天AKQ灌胃1.3 g/kg/d）,实验周期8天,每日观察并记录各组小鼠一般状况及死亡数。艾可清给予小鼠1.3 g/kg/d相当于人临床剂量的9倍。（3）血液及生化指标的测定:实验结束后处死各组小鼠,取全血及血清,血细胞分析仪及生化分析仪检测WBC、RBC、PLT、HGB、LYM、MON、AST、ALT、CRE、CK。（4）主要脏器组织病理学观察:实验结束后处死各组小鼠,取各组小鼠心、肝、脾、肺、肾组织进行HE染色并观察。2.体内（动物）实验2:观察AKQ对CTX中毒小鼠心脏毒性的影响（1）CTX中毒小鼠心脏毒性模型的建立及分组:8周龄,体重25±3 g的健康昆明小鼠50只,随机分为5组,每组10只,CTX连续4天（第8-11天）腹腔注射造模（方案同体内实验1）。动物分组为正常组（第8-11天N.S 0.3 mL/次/d腹腔注射+第1-13天纯水0.3 mL/次/d灌胃）,模型组（第8-11天CTX注射造模+第1-13天纯水灌胃0.3 mL/次/d）,艾可清低剂量组（第8-11天CTX腹腔注射+第1-13天AKQ灌胃0.65 g/kg/d）,艾可清中剂量组（第8-11天CTX腹腔注射+第1-13天AKQ灌胃1.3g/kg/d）,艾可清高剂量组（第8-11天CTX腹腔注射+第1-13天AKQ灌胃2.6 g/kg/d）,实验周期14天,14天后取血清及心脏,进行相关检测。艾可清给予小鼠低、中、高剂量相当于人临床剂量的4.5、9、18倍。（2）心脏指数的测定:各组小鼠取心脏称重,计算心脏指数。（3）心肌酶及氧化指标的测定:各组小鼠取血清检测CK、CK-MB、GSH、SOD、MDA。（4）心脏的组织病理学观察:取各组小鼠心脏组织进行HE染色并观察。（5）心脏组织凋亡检测:Western blot检测各组小鼠心脏组织中Bax及Bcl-2的表达。3.体外（细胞）实验:观察AKQ对ACR诱导的H9c2毒性损伤的影响及机制探索（1）AKQ对H9c2活力影响的观察:AKQ颗粒甲醇提取物,加DMSO溶解,加细胞培养基稀释,配成不同浓度梯度,加入H9c2培养液,共孵育24、48及72小时,CCK8法测定细胞活力。（2）ACR对H9c2 IC50测定:将不同浓度梯度ACR溶液加入H9c2培养液培养,24小时后CCK8法测定细胞活力。（3）AKQ对ACR诱导的H9c2毒性损伤影响的观察:H9c2细胞分5组:对照组（正常培养）,ACR组（ACR 20μmol/L干预培养）,ACR+AKQ低剂量组（ACR+AKQ 20μg/mL）,ACR+AKQ 中剂量组（ACR+AKQ 40 μg/mL）,ACR+AKQ 高剂量组（ACR+AKQ 80 μg/mL）。培养24小时后观察细胞形态,进行CCK8检测、Hochest染色、流式Annexin V-FITC/PI双染及WB检测bax、Caspase3、Caspase9及bcl-2表达。（4）AKQ缓解CTX心脏毒性的网络药理学分析:进行CTX心脏毒性相关疾病靶点及AKQ药物成分治病靶点筛选并映射,构建药物-成分-靶点网络及PPI网络,对靶点进行GO分析和KEGG通路富集分析。（5）网络药理学分析的实验验证:用RT-qPCR及WB技术验证网络药理学分析富集的通路靶点表达水平。（6）AKQ对ACR诱导的H9c2毒性损伤机制的探索:H9c2细胞分4组:对照组（正常培养）,ACR组（ACR20 μmol/L干预培养）,ACR+AKQ组（ACR+AKQ 80μg/mL）,AKQ+LY294002 组（ACR+AKQ 80 μg/mL+LY294002 10 μmol/L）。培养 24小时后RT-qPCR及WB检测相关通路蛋白及凋亡蛋白的表达。4.体内（动物）实验3:AKQ对CTX化疗的荷瘤小鼠心脏毒性的影响及机制研究（1）荷瘤小鼠模型的建立:将密度为1× 107个/mL的S180肉瘤细胞悬液以0.2 mL/只的体积皮下接种于昆明小鼠后颈部。（2）动物分组及处理:将肿瘤体积范围为40-100 mm3的S180荷瘤小鼠24只随机分为3组,每组8只:肿瘤模型对照组（第1-13天纯水0.3 mL/次/d灌胃+第8-11天连续N.S 0.3 mL/次/d腹腔注射）,CTX单独化疗组（第8-11天连续CTX腹腔注射,CTX注射方案同前+第1-13天纯水灌胃0.3mL/次/d）,CTX化疗联合AKQ治疗组（第8-11天CTX连续腹腔注射+第1-13天艾可清2.6g/kg/d灌胃）。实验周期14天,第12天收集新鲜粪便,第14天取血清及心脏,进行后续检测。（3）心肌酶及氧化指标的测定:各组小鼠取血清检测CK、CK-MB、SOD、MDA。（4）心脏组织病理学观察:取各组小鼠心脏组织进行HE染色并观察。（5）心脏凋亡相关蛋白检测:WB检测各组小鼠心脏组织bax及bcl-2。（6）心脏通路蛋白检测:WB及免疫组化检测各组小鼠心脏组织相关通路靶点蛋白表达。（7）荷瘤小鼠瘤体重量测定:实验结束后取各组小鼠瘤体称重。（8）荷瘤小鼠血清代谢组学研究:各组小鼠取血清做GC/MS非靶向代谢组学分析。（9）荷瘤小鼠肠道菌群分析:接取小鼠新鲜未污染粪便做肠道菌群16SrRNA测序分析。结果:1.昆明小鼠腹腔注射环磷酰胺（100 mg/kg/d×2d,50 mg/kg/d×2d）后可见活动减少,畏寒蜷缩,毛发蓬松、竖立,进食减少,体重减轻等明显的中毒症状,加服AKQ后,上述中毒症状减轻,且死亡率较模型组明显下降（P=0.0028）。昆明小鼠予环磷酰胺注射后白细胞、血小板及淋巴细胞可出现显着减少（P<0.001,P<0.001,P<0.01）,而红细胞、血红蛋白及单核细胞无明显变化;AST、ALT及CRE无明显改变,CK出现显着上升（P<0.05）,加服AKQ 口服后,CK上升情况较模型组明显缓解（P<0.05）,其他血液生化指标比较无显着性差异。HE染色显示各组小鼠肝、脾、肺、肾组织病理改变无明显差异;模型组可见明显心肌损伤改变,加服AKQ后心肌病变程度减轻。2.昆明小鼠腹腔注射环磷酰胺（100 mg/kg/d ×2d,50 mg/kg/d×2d）后心脏指数较正常组明显增大（P<0.05）,AKQ低、中、高剂量组心脏指数较模型组均有显着性减小（P<0.05,P<0.01,P<0.01）。模型组CK-MB、MDA较正常组显着升高（P<0.001,P<0.001）,GSH 及 SOD 明显降低（P<0.05,P<0.001）,加服 AKQ 后,AKQ 各剂量组上述指标得到不同程度改善,其中以高剂量组改善最明显,高剂量组CK、CK-MB、MDA较模型组均显着下降（P<0.05,P<0.001,P<0.001）,而GSH及SOD明显上升（P<0.05,P<0.001）。模型组心脏HE染色可见明显心肌损伤改变,艾可清低、中、高剂量组心肌病变程度较模型组依次减轻。与正常组比较,模型组小鼠心脏组织中Bax表达增强,Bcl-2的表达减弱,AKQ各剂量组Bax表达与模型组相比呈剂量依赖性减弱,Bcl-2的表达呈剂量依赖性增强。3.AKQ醇提物在0-80 μg/mL浓度范围呈浓度依赖性促进H9c2细胞的增殖,ACR对H9c2细胞24小时IC50为20.37 μM。ACR作用于H9c2细胞24小时,引起的细胞损伤涉及:形态改变、细胞活力下降、Hochest染色阳性数目增多、流式Annexin V-FITC/PI双阳性细胞比例增加,凋亡蛋白Bax、Caspase3、Caspase9表达增强及抗凋亡蛋白Bcl-2表达减弱。H9c2细胞予AKQ处理后,与模型组相比,可剂量依赖性地改善H9c2细胞损伤形态、增强细胞活力、减少Hochest染色阳性及Annexin V-FITC/PI双阳性细胞比例,抑制Bax、Caspase3、Caspase9表达而增强Bcl-2表达。网络药理学分析结果显示:通过靶点筛选及映射得到192个靶点为AKQ主要成分治疗CTX心脏毒性损伤的作用靶点;通过构建AKQ药物-活性化合物-治病靶点网络图,得到15个关键化合物（包括等槲皮素、木犀草素、山奈酚、丹参酮Ⅱa、柚皮素等）;通过构建PPI网络得到30个核心靶点;GO分析显示靶点涉及的生物学功能主要包括调控细胞增殖/凋亡过程及氧化/炎症反应等。KEGG通路富集分析显示排名前10的信号通路涉及PI3K-AKT、TNF及MAPK通路。RT-qPCR显示上述3条通路关键靶点中的PI3K及AKT在AKQ组中表达较ACR组显着上调（P<0.001）,WB实验也观察到PI3K及AKT总蛋白及磷酸化蛋白水平均显着高于ACR组。AKQ+ACR组加入抑制剂LY294002后,上调的PI3K及AKT mRNA及蛋白水平被逆转;AKQ+ACR组较ACR组中上调的bax、Caspase3、Caspase9及下调的bcl-2同样被逆转。4.以密度为1×107个/mL的S180肉瘤细胞悬液,按0.2mL/只皮下接种于昆明小鼠后颈部,约6天后可成模。CTX单独化疗组CK-MB、MDA较肿瘤模型对照组显着升高（P<0.001,P<0.001）,SOD明显降低（P<0.001）,CTX化疗联合AKQ治疗组CK、CK-MB、MDA较CTX单独化疗组显着下降（P<0.01,P<0.001,P<0.001）,而SOD明显上升（P<0.001）。CTX单独化疗组心脏HE染色可见显着的心肌损伤,CTX化疗联合AKQ治疗组心肌病变程度较CTX单独化疗组明显减轻。与肿瘤模型对照组相比,CTX单独化疗组小鼠心脏组织Bax表达上调,Bcl-2、PI3K及AKT表达下调,加服AKQ后,Bax表达减弱,Bcl-2、PI3K及AKT表达增强。实验结束后,CTX化疗联合AKQ治疗组瘤体重量较单独化疗组显着减轻（P<0.05）。血清代谢组学分析在三组间共鉴定出44个差异代谢产物,AKQ干预能使CTX化疗改变的L-谷氨酸、L-天冬氨酸、柠檬酸、甘氨酸、鸟氨酸等代谢物轮廓向肿瘤模型对照组靠近;CTX联合AKQ治疗后显着增强的代谢通路包括:柠檬酸循环、精氨酸生物合成、丙氨酸天冬氨酸和谷氨酸代谢、乙醛酸和二羧酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、氨酰tRNA生物合成、谷胱甘肽代谢、组氨酸代谢、D-谷氨酰胺与D-谷氨酸代谢。肠道菌群分析显示CTX单独化疗组鞘氨醇单胞菌（Sphingomonadales）、溶杆菌（Lysobacter）相对丰度下调,普雷沃菌9（Prevotella9）上调,CTX 化疗联合 AKQ 治疗后,Sphingomonadales及Lysobacter 丰度上调,Prevotella9丰度下调。CTX单独化疗组中显着下调的p53信号通路、倍半萜生物合成、胆汁分泌及咖啡因代谢等通路,在AKQ干预后重新被显着上调。结论:1.AKQ能改善CTX引起的昆明小鼠中毒症状,显着降低死亡率;AKQ能降低CTX引起的心肌酶异常升高,减轻氧化应激失衡、减少心肌细胞凋亡,改善CTX诱导的心脏病理形态改变。2.AKQ能促进H9c2心肌细胞增殖,激活PI3K/AKT通路而减少ACR诱导的H9c2凋亡。3.荷瘤小鼠CTX化疗可引起心肌酶异常升高、氧化应激失衡、心肌细胞凋亡增加及PI3K/AKT表达下调,联用AKQ能改善上述病变,且能增强CTX抑瘤效果。4.AKQ可调节CTX化疗的荷瘤小鼠L-谷氨酸、L-天冬氨酸、柠檬酸、甘氨酸、鸟氨酸等44种差异代谢物表达,增强TCA循环,精氨酸生物合成,丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢等16条代谢通路功能;上调有益菌（目水平Sphingomonadales、属水平Lysobacter）,下调有害菌（属水平Prevotella 9）丰度,增强肠道菌p53信号通路、胆汁分泌等功能从而发挥减轻CTX心脏毒性的作用。
张志莹[4]（2021）在《西黄丸治疗非小细胞肺癌疗效的系统评价及作用机制研究》文中研究说明研究背景:肺癌是临床常见的恶性肿瘤,在世界范围内,发病率在恶性肿瘤中居第二位,死亡率居第一位。非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）是肺癌的主要类型,发展新的治疗手段和方法,一直是NSCLC临床需要解决的一大难题。NSCLC的中医研究也在不断发展,西黄丸作为具有确切临床疗效的经典抗癌中药名方,对NSCLC的治疗也发挥了作用。既往的基础研究发现西黄丸可通过诱导肿瘤细胞凋亡、逆转上皮间质转化、调节免疫微环境等多种作用机制发挥抗肿瘤作用,但研究多围绕乳腺癌、胃癌,对于治疗肺癌的机制,仅涉及有效率、体内实验抑瘤率等,较为局限,因此,西黄丸治疗NSCLC的研究还存在较大空间,值得进一步深入。研究目的:本研究结合系统综述、网络药理学、体外实验、体内实验、转录组学等多种方法,研究西黄丸治疗NSCLC的相关机制,为西黄丸在临床治疗NSCLC提供更多的数据支持和科学依据。研究方法:1.首先通过系统综述和meta分析,评价西黄丸在临床随机对照试验中治疗NSCLC的效果,评价指标包括:近期客观有效率、临床症状改善、生活质量、不良反应等。2.通过网络药理学,对西黄丸抗NSCLC的活性成分和主要作用靶点进行预测。首先通过中药数据库BATMAN-TCM检索西黄丸中所有的活性成分及对应靶点,然后通过疾病数据库DisGeNET、GeneCards、OMIM检索NSCLC相关基因,将西黄丸的作用靶点和NSCLC疾病靶点两个数据集进行映射,筛选重复靶点,构建“西黄丸-NSCLC-靶点”数据集。将数据集导入String数据库进行蛋白质蛋白质互作网络,将获得的网络导入Cytoscape3.8.0软件中进行拓扑参数分析,获得“西黄丸-NSCLC-靶点”的核心作用靶点。然后使用Metascape工具对核心靶点进行生物功能注释,分析西黄丸抗NSCLC的主要信号通路和生物过程等。3.通过细胞实验和动物实验,进行西黄丸抗NSCLC的药效学验证。在细胞实验中,通过CCK-8实验、流式细胞术、Transwell实验检测西黄丸对小鼠Lewis肺癌细胞株LL/2增殖、凋亡、细胞周期、迁移能力和侵袭能力的影响。在动物实验中,以C57/BL6小鼠Lewis肺癌皮下瘤为模型,将小鼠分为对照组、西黄丸低剂量组（0.617g/kg,每日灌胃两次）、西黄丸中剂量组（1.233g/kg,每日灌胃两次）、西黄丸高剂量组（2.466g/kg,每日灌胃两次）、顺铂组（3 mg/kg,每周腹腔注射一次）,并另设无瘤的空白组。药物干预15天,观察小鼠的一般状态、皮下移植瘤体积及重量、体重及内脏系数,并通过HE染色观察肿瘤和肝脏的组织病理变化和皮下瘤的肺转移,通过Ki-67免疫组化染色观察对肿瘤增殖的影响,并通过流式细胞数检测小鼠脾脏淋巴细胞的 CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+和 CD3+CD4+/CD3+CD8+免疫分型。4.通过转录组学方法,对西黄丸高剂量组和对照组的肿瘤组织进行RNA测序,进行mRNA差异分析和基因功能注释,分析西黄丸抗小鼠Lewis肺癌的主要信号通路和生物过程等。5.通过聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）和蛋白质免疫印迹（Western Blot,WB）,对网络药理学和转录组学筛选出的目标分子变化进行检测,包括热休克蛋白（heatshockprotein,HSP）家族、雌激素受体（estrogenreceptor,ER）、维甲酸X受体（Retinoid X receptor,RXR）、过氧化物酶体增殖激活受体（peroxisome proliferator activated receptor,PPAR）等。研究结果:1.Meta分析结果显示,西黄丸辅助治疗NSCLC能够提高近期客观有效率,改善患者的临床症状,提高患者的生活质量。但在改善肝肾功能异常、改善消化道症状和血液系统抑制方面,西黄丸辅助治疗并未有明显获益。2.网络药理学分析显示,西黄丸共检索到74个靶点可预测的活性成分,“西黄丸-NSCLC-靶点”的核心作用靶点共230个,包括HSP90AA1、HSP90AB1、HSPA1A、ESR1、ESR2、RXRA、RXRB、RXRG、PPARG、PPARA 等。西黄丸抗 NSCLC 的相关KEGG通路有癌症通路、PI3K-Akt信号通路、内分泌抵抗、foxo信号通路、雌激素信号通路、EGFR酪氨酸激酶抑制剂抵抗、HIF-1信号通路、T细胞受体信号通路、催乳素信号通路、Ras信号通路、黏着斑和非小细胞肺癌等。GO富集分析显示,西黄丸抗NSCLC涉及的主要生物过程有细胞对有机环状化合物的反应、细胞对激素刺激的反应、细胞对脂质的反应、凋亡信号通路、对类固醇激素的反应、细胞迁移的正调控、细胞死亡的正调控、细胞运动的正调控等。3.药效学实验显示,西黄丸含药血清在体外对Lewis肺癌细胞株LL/2并无显着的增殖抑制作用,西黄丸浸提液对LL/2有浓度依赖的抑制作用,作用24 h时,西黄丸浸提液对LL/2细胞的IC50为1.830 mg/mL。流式结果显示,作用24 h时,西黄丸浸提液对LL/2细胞有明显的促凋亡作用,能够促进LL/2细胞株向G2/M期转化。Transwell实验结果显示,作用24h时,西黄丸浸提液能够降低LL/2细胞株的迁移能力和侵袭能力,且这种作用呈浓度依赖性。在小鼠Lewis肺癌皮下移植瘤模型中,西黄丸对皮下肿瘤的生长抑制作用具有浓度依赖性,其中西黄丸高剂量组能够抑制小鼠皮下瘤的生长,其剂量为临床等效剂量的2倍。肿瘤的病理结果显示,西黄丸高剂量组和顺铂组有大片的细胞坏死区。Ki-67免疫组化染色结果显示,西黄丸和顺铂均能降低Ki-67阳性肿瘤细胞的个数,西黄丸的这种作用与浓度关系不大。肝脏的病理结果显示,各组的肝组织均为正常的肝实质,无明显异常。脾细胞流式分型结果显示,各组小鼠脾脏淋巴细胞中CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+和CD3+CD4+/CD3+CD8+未见显着统计学差异。4.对西黄丸高剂量组和对照组的皮下瘤进行转录组学测序,结果筛选出406个差异基因,其中130个基因表达上调,276个基因表达下调,差异基因包括:Hspb7、Hspb1、Hspb6等。对差异基因进行KEGG通路富集分析,结果显示,显着性改变明显的信号通路有:肿瘤坏死因子（tumornecrosis factor,TNF）信号通路、雌激素信号通路、胰岛素分泌、环鸟苷酸依赖性蛋白激酶（cyclic guanosine monophosphate-dependent protein kinase,cGMP-PKG）信号通路、脂肪细胞中的脂肪分解调节、脂肪细胞因子信号通路、催产素信号通路、过氧化物酶体增殖激活受体信号通路等。5.PCR和WB结果显示,西黄丸能够降低小鼠Lewis肺癌肿瘤组织中Hspb6、Hspb7、Hspb1、Hspb2、Hspa1a、Hspa8、Hsph1 和的 mRNA 表达水平,且能够降低 HSPB7、HSP27、HSP70、HSPH1蛋白的表达水平,升高HSC70的蛋白质表达水平,而不影响HSP20、HSP90的蛋白质水平。西黄丸能够降低小鼠Lewis肺癌肿瘤组织中Esr1、Rxra、Krt19、Ppara、Ppard和Pparg的mRNA表达水平,并降低ER、RXRα蛋白的表达,升高PPARδ和PPARγ的蛋白表达,对KRT19和PPARα的表达水平无明显影响。研究结论:1.西黄丸辅助治疗NSCLC能够提高近期客观有效率,改善患者的临床症状,提高患者的生存质量。2.网络药理学实验和转录组学实验显示,西黄丸通过多靶点、多通路作用于NSCLC,核心作用靶点包括HSP家族、ER等。3.西黄丸在体外实验和体内实验中,均表现出抗小鼠Lewis肺癌的作用,在体内实验中无明显毒性,其有效剂量为临床等效剂量的2倍。其抗小鼠Lewis肺癌的机制可能与降低HSP27、HSP70、HSPH1、ER的mRNA和蛋白质表达水平,升高PPARγ的蛋白质表达水平相关。
周肸[5]（2021）在《固正消癌方对结肠癌糖代谢作用机制研究》文中研究表明背景:肿瘤细胞的持续高速增殖、不停转移、侵袭,顽强抵抗化疗药物的效用,很大程度上都依赖于其周身所营造的酸性缺氧微环境。此种微环境毫无疑问的会杀伤正常的机体细胞,提供违背规律的能量代谢结果。最早从1924年起,就有着名的医学家Otto Herinrich Warburg针对此非正常代谢形式提出了“Warburg Effect”学说,这种新代谢型编码程序,在现代研究认为是启动肿瘤局部缺氧、酸性环境和畸形无限生长的关键。从糖代谢的角度来切入研究抗肿瘤药品,已经成为目前结肠癌有望治愈的新希望。国医大师周仲瑛教授在长年累月的临床工作中,提炼出了具有中医基础和科学性、实用性为一体的“癌毒理论”。在“祛毒即扶正”的治疗理念下结合中药组方优势形成了集清热解毒、扶正补气、行气活血为一体的消癌解毒方。此方不管是在基础研究还是临床实践中能证实可以实现带癌共存的宗旨。本研究团队在临床运用周老消癌解毒方门诊治疗结肠癌术后患者过程中,经周仲瑛团队的帮助对消癌解毒方予以化裁,演变为固正消癌方。实践观察认为对于结肠癌患者更具有针对性和适用性,大大提高了结肠癌病患的生活质量。目的:从糖代谢及肿瘤微环境视角,探索固正消癌方押制结肠癌细胞的具体机制,从而更深入地巩固“癌毒理论”,发挥中医药抗肿瘤的优势。方法:1.细胞实验:1.1选取HT-29人结肠癌细胞系,将细胞系随机分为四组。即①空白对照组（Control）:细胞接种于含正常大鼠血清的RPMI-1640培养基中培养;②低剂量组（Low）:使用包含10%固正消癌方含药血清的RPMI-1640培养基培养;③中剂量组（Medium）:使用包含20%固正消癌方含药血清的RPMI-1640培养基培养;④高剂量组（High）:使用包含30%固正消癌方含药血清的RPMI-1640培养基培养。观察不同分组培养12h、24h的HT-29细胞Transwell实验情况;测定4个分组干预48h后的葡萄糖含量和乳酸水平、乳酸脱氢酶含量（LDH）、HT-29细胞内、外pH的影响、72h后的各组中ATP的浓度;利用Western Blot检测不同分组下低氧诱导因子1α（HIF-1α）、细胞能量感受器AMPK α1、磷酸化的AMPKα1（p-AMPK α1）、己糖激酶（HK2）;以AnnexinV-FITC/PI双标记法流式细胞术检测HT-29细胞的凋亡率。1.2选取HT-29人结肠癌细胞系,将细胞系随机分为四组。即①空白对照组（Control）:HT-29细胞接种于含正常大鼠血清的RPMI-1640培养基中培养;②高剂量组（High）:使用包含30%固正消癌方含药血清的RPMI-1640培养基培养HT-29细胞;③高剂量合并小分子干扰AMPK（High+Si-AMPK）组:以包含30%固正消癌方含药血清的RPMI-1640培养基与特异性沉默AMPK技术结合,对HT-29细胞共同作用。④高剂量合并AMPK激动剂（High+AMPK activator）组:使用包含30%固正消癌方含药血清的RPMI-1640与AMPK激动剂AICAR共同作用HT-29细胞。计算不同分组下培养24h、48h、72h后细胞的OD值;4个分组下对HT-29细胞进行划痕和Transwell实验观察12h、24h的迁移和侵袭能力;利用Western Blot检测不同分组下HIF-1α、葡萄糖转运蛋白4（Glut4）、凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2以及p53的表达情况。2.动物实验:选取HT-29人结肠癌细胞系构建荷瘤裸鼠模型,随机分为5组,每组8只,雌雄各半。即空白对照组、模型组、低剂量固正消癌方组（5g/kg）、中剂量固正消癌方组（10g/kg）、高剂量固正消癌方组（20g/kg）。药物干预14天,处死裸鼠后进行肝、肾、脾脏的HE染色;瘤体组织的免疫组化检测Cleaved-caspase-3、HIF-1α、HK2、Ki67、p-AMPK α1的表达;利用Western Blot检测瘤体内AMPKα1、p-AMPKα1、HIF-1α、HK2、Glut4蛋白情况;对模型组、低剂量组、高剂量组内裸鼠末次给药后2h取血清进行糖代谢组学液相色谱、质谱联用技术（Liquid ChromatograpH Mass Sepctrometer,LC-MS）分析。结果:1.细胞实验:在细胞体外实验中发现,不同分组药物干预后证实固正消癌方能抑制肿瘤细胞Transwell侵袭、迁移能力;ATP浓度测定结果显示固正消癌方含药血清浓度与ATP的浓度呈反比,固正消癌方含药血清浓度越高,ATP的浓度就越低;当固正消癌方含药血清达到一定药物浓度时,可以降低HT-29细胞对葡萄糖的获取,减慢糖代谢进程;同时,固正消癌方也能相应的降低HT-29细胞产生的乳酸以及限制LDH的表达;固正消癌方含药血清可以下降细胞内的pH值,缩小细胞内外pH差值,且随着固正消癌方含药血清干预浓度的上升而作用效果增强;固正消癌方含药血清可以下调HK2、HIF-1α蛋白的表达,明显激活AMPK的信号通路,调节HT-29细胞的代谢方式;Annexin—FITC/PI流式细胞术亦证实固正消癌方可以呈剂量依赖性方式发挥抑制HT-29细胞增殖的作用。在固正消癌方含药血清对HT-29细胞AMPK通路影响的细胞实验研究结果中可知,High组HT-29细胞的增殖情况弱于High+Si-AMPK组,但是High组HT-29细胞的增殖情况强于High+AMPK activator组,说明固正消癌方含药血清可以通过激活AMPK信号通路作用HT-29细胞,且其抑制肿瘤细胞的程度受活化的AMPK数量的影响;同时,固正消癌方含药血清可以通过激活AMPK通路弱化HT-29细胞的迁移、侵袭能力;High组Western Blot结果显示:Glut4明显表达受到抑制,弱于Control组（P<0.05）;High+Si-AMPK 组的 Glut4 表达强于 High 组（P<0.05）;High+AMPK activator 组的 Glut4 表达又弱于High组。说明,固正消癌方含药血清可以通过AMPK通路调控Glut4蛋白的表达,从而抑制HT-29细胞的糖代谢。High组与Control组的HIF-1α表达量未见差异,High+Si-AMPK组与High组的HIF-1α得表达也未见差异;High+AMPK activator组的HIF-1α表达却明显低于High组（P<0.05）。High组的p53蛋白表达明显高于Control组（P<0.05）,High+AMPK activator组的p53含量亦多于High组（P<0.05）,说明p53依赖于活化的AMPK发挥抗肿瘤作用;而相反地,抑制HT-29细胞中的AMPK,会使得High+Si-AMPK组内p53表达量下凋,影响HT-29细胞的凋亡。High+Si-AMPK组的Bcl-2表达高于High组（P<0.05）,在AMPK被沉默后,HT-29细胞增殖程度会提高。在High+AMPK activator组内的Bax含量高于High组,但无统计学差异;然而,High+AMPK activator组内的Bcl-2表达量低于High组（P<0.05）,可以认为在AMPK活化达到一定程度时能够促进HT-29细胞的凋亡,其结果与AMPK可能影响下游Bcl-2通路有关。2.动物实验在荷瘤裸鼠的体内实验中可知,固正消癌方对肝、脾、肾脏无明显损害;瘤体组织的免疫组化检测显示固正消癌方会下调Ki67、HIF-1α、HK2蛋白及促进Cleaved-caspase-3、p-AMPK α1蛋白的表达,以此通过限制糖代谢来控制瘤体细胞的增殖,促进其凋亡;Western Blot检测显示固正消癌方也同样会激活AMPK通路,限制糖代谢相关酶HIF-1α、HK2、Glut4的表达,磷酸化p53,诱发结肠癌细胞程序性凋亡。模型组、低剂量组、高剂量组内裸鼠血清LC-MS分析:各分组区分聚集性明显,筛选出5种差异糖类代谢产物分别是甘露糖（Mannose）、葡萄糖（Glucose）、阿拉伯糖（Arabinose）、岩藻糖（Fucose）、果糖（Fructose）以及多条信号通路比如:ABC转运蛋白通路、半乳糖的代谢途径。结论:1)固正消癌方可以从糖代谢途径减少结肠癌细胞的能量来源,改善其周围的微酸环境,下调相关蛋白等方面起到抗肿瘤作用。2)在固正消癌方的作用下,AMPK通路的激活也会起到干预结肠癌细胞的糖代谢过程,诱导细胞凋亡的作用。3)LC-MS分析认为固正消癌方作用下的差异糖类代谢物为甘露糖（Mannose）、葡萄糖（Glucose）、阿拉伯糖（Arabinose）、岩藻糖（Fucose）、果糖（Fructose）,以此为靶点的信号通路还包括ABC转运蛋白通路、半乳糖的代谢途径等。
王志清[6]（2020）在《芪附扶正合剂联合低剂量传统化疗方案治疗老年急性髓系白血病（非M3）的疗效分析及机制研究》文中研究说明研究目的本研究通过比较传统低剂量化疗方案联合和不联合芪附扶正合剂（Modified Qifu Fuzheng Decoction,QFFZD）治疗老年急性髓系白血病（Acute Myeloid Leukemia,AML）（非M3）的相关临床指标,包括缓解率、中医症候积分、复发率、生存率及感染发生率等,客观评价QFFZD在老年AML治疗中的临床疗效和安全性。再通过体外实验探讨QFFZD协同阿糖胞苷（Cytarabine,Ara-C）对人急性髓系白血病HL-60细胞增殖及凋亡的影响,并探寻其分子学作用机制,为临床QFFZD辅助治疗AML提供科学依据。研究方法临床研究方法:根据患者治疗期间是否联合口服芪附扶正合剂中药,将58例老年AML患者分为观察组（30例）和对照组（28例）,观察组予低剂量传统化疗方案联合QFFZD口服,对照组仅予低剂量传统化疗方案治疗。比较两组患者的CR率、诱导治疗后中医症候积分变化情况、复发率、中位生存期、总生存率;同时比较两组患者诱导期感染发生率及远期感染发生率。实验研究方法:（1）采用20只SD雄性大鼠,适应性饲养后随机分为对照组与QFFZD治疗组,分别予2mL生理盐水和2mL生药浓度为1.68 g/mL QFFZD灌胃,连续7天。第8天麻醉后主动脉取血,分离得到上层血清,-80℃保存备用;2.采用MTT比色分析法检测不同浓度QFFZD含药血清、Ara-C单用和联合干预HL-60细胞24h和48h后对其的增殖抑制作用;（3）PI单染流式细胞术（FCM）用于检测QFFZD含药血清、Ara-C单用以及联合使用对HL-60细胞细胞周期的影响;（4）Annexin V/PI双染流式细胞术（Flow Cytometry,FCM）检测QFFZD含药血清、Ara-C单用以及联合使用对HL-60细胞的凋亡诱导作用;（5）免疫印迹实验（Western Blot,WB）检测QFFZD含药血清、Ara-C单用以及联合使用对HL-60细胞凋亡相关蛋白兔Bcl-2相关X蛋白（Bax）、B淋巴细胞瘤-2基因（Bcl-2）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase-3）、多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶（PARP）及其剪切体cleaved caspase-3、cleaved PARP以及Akt/p53信号通路相关蛋白的表达情况;（6）免疫印迹实验被用于检测Akt特异性抑制剂MK-2206 2HCL干预HL-60细胞后凋亡相关蛋白的表达情况。结果临床研究结果:观察组和对照组的CR率分别为66.7%、60.7%,差异无统计学意义（p>0.05）;在诱导化疗结束后改善中医症候积分方面,观察组明显优于对照组（p<0.05）;观察组的复发率略低于对照组,分别为55.0%和58.8%,但差异无统计学意义（p>0.05）;在远期生存方面,观察组和对照组的估计中位生存期分别为21.818.7个月和16.8±5.7个月,1年生存率分别为（60.3±9.4）%和（56.7±9.4）%,3年生存率分别为（39.0±9.8）%和（27.2±9.6）%,5年生存率分别为（27.9±9.7）%和（20.4±9.3）%,均未达到统计学差异（P=0.213）;在不良反应方面,观察组诱导期感染发生率（46.7%）与对照组（46.4%）相差不大;观察组远期的感染发生率（28.0%）低于对照组（34.9%）,差异有统计学意义（p<0.05）。实验研究结果:1.MTT比色分析法结果显示,相同干预时间下,QFFZD含药血清（2%、4%、6%、8%、10%）和 Ara-C（0.5μmol/L、1μmol/L、2μmol/L、4μmol/L、8μmol/L）单用以及联合使用对HL-60细胞的增殖抑制作用均呈浓度依赖性,与对照组相比,差异具有统计学意义（p<0.05）;不同浓度QFFZD含药血清和Ara-C单独和联合干预HL-60细胞24h和48h后,其对细胞的增殖抑制作用随着干预时间的延长而增强,差异具有统计学意义（p<0.05）;此外,相同干预时间下,二者联合使用对HL-60细胞的增殖抑制作用与二者单独使用对细胞的增殖抑制作用相比,差异具有统计学意义（p<0.05）。2.PI单染流式细胞术结果显示,与对照组相比,QFFZD含药血清（10%）和Ara-C（8μmol/L）单独以及联合干预HL-60细胞24h后,均能将HL-60细胞阻滞于G1期,两药联合时对HL-60细胞的周期阻滞作用更加明显（p<0.05）。3.流式细胞术检测QFFZD含药血清（10%）和Ara-C（8μmol/L）单独以及联合干预HL-60细胞24h后细胞的凋亡率。结果显示,单用以及联合使用均能诱导细胞发生凋亡,并且两药合用时凋亡效果更加明显（p<0.05）。4.QFFZD含药血清（10%）和Ara-C（8μmol/L）单独以及联合干预HL-60细胞24h后,采用Western blot法检测凋亡相关蛋白的表达情况,结果显示,促凋亡蛋白Bax以及执行凋亡程序的关键蛋白cleaved caspase-3、cleaved PARP的表达均明显高于空白组（p<0.05）,而抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平则低于空白组（p<0.05）。与此同时,Akt/p53信号通路相关蛋白p-Akt的表达水平各给药组明显低于空白组（p<0.05）,而p53的表达水平各给药组则明显高于空白组（p<0.05）。5.在用QFFZD含药血清（10%）和Ara-C（8 μmol/L）共同干预HL-60细胞前,予Akt特异性抑制剂MK-2206 2HCL（5 nmol/L）预处理24h后,以Western Blot检测凋亡相关蛋白的表达情况。结果显示,Akt特异性抑制剂预处理后,凋亡相关蛋白Bax、cleaved caspase-3、cleaved PARP的表达明显降低（p<0.05）,而抗凋亡蛋白Bcl-2的表达则有所升高（p<0.05）。结论临床研究表明,QFFZD联合低剂量传统化疗方案治疗老年AML较单纯应用化疗有一定优势,尤其体现在可以改善中医症候积分,降低远期感染发生率;随着服药时间的延长,一定程度上可延长中位生存期,提高3年及5年生存率的趋势（虽未达到统计学差别）。实验研究表明,1.芪附扶正合剂含药血清和阿糖胞苷在体外单用和联合使用均能以浓度和时间依赖的方式有效地抑制HL-60细胞的增殖,而且表现出两者之间可能存在协同或叠加效应。2.芪附扶正合剂含药血清和阿糖胞苷在体外单用和联合使用均能明显地提高处于G1期的HL-60细胞比率,同样表现出明显的协同作用。3.芪附扶正合剂含药血清和阿糖胞苷可诱导HL-60细胞发生凋亡,其过程可能是通过调控Akt/p53信号通路从而启动内源性细胞凋亡途径发挥作用。
张济周[7]（2020）在《基于活血化瘀法探讨三七粉抗肺癌的机制研究》文中研究表明目的:本项目在临床疗效的基础上通过理论研究、细胞实验、动物实验,探讨三七对肺癌的干预作用及其抗肿瘤的可能机制,为临床使用中药饮片三七治疗肺癌提供理论基础。方法:1.理论研究:通过查阅大量的参考文献,了解肺癌的发病机理、三七的药用机制、血瘀与肺癌发病的关系及肿瘤治疗基因学研究进展。2.临床研究（回顾性分析）:通过临床资料回顾性分析,得出三七在治疗肺癌上可能起作用;结合临床数据收集统计结果,进一步从细胞水平及动物水平两个层面进行研究认证。3.细胞实验:1)筛选最佳目的基因CTSB干扰组;2)三七含药血清低、中、高剂量进行干预实验,并于目的基因CTSB干扰组进行对比,从细胞水平研究三七粉对肺腺癌细胞系的作用及其对Cathepsin B的作用关系及机制。4.动物实验:用A549肺腺癌细胞进行皮下成瘤,分为5组,正常对照组、荷瘤模型组、三七低剂量干预组、三七中剂量干预组、三七高剂量干预组,用三七粉低、中、高剂量进行瘤体干预实验,与正常肺组织及肿瘤肺组织进行对比,从动物水平研究三七粉对CTSB基因表达的调控作用及抑制肺癌生长的机制。结果:1.理论研究:查阅大量的参考文献后,结果分析:1)中医认为血瘀与肺癌发病存在一定的相关性;2)活血化瘀药治疗肿瘤存在一定的争议:“争对血瘀的病因治疗肿瘤”和“活血化瘀促进肿瘤的扩散”;3)肿瘤治疗基因学研究发现cathepsin B在肿瘤组织中高表达,可能与肿瘤发病相关,并确定其对应基因为CTSB。2.临床研究（回顾性分析）:对2组肺癌患者进行临床观察,发现使用三七粉治疗后可不同程度降低观察期患者体内CEA、NSE和CYFRA21的含量、纤维蛋白原、活化部分凝血酶原时间及凝血酶原时间水平,并且可降低患者血清中D-二聚体的水平,其中,CYFRA21、D-二聚体、纤维蛋白原三项指标改善比较明显,CT结果无进展,患者体内肿瘤情况稳定,生活质量改善。3.细胞实验:1)转染后针对cathepsin B的小干扰RNA能够有效抑制A549细胞中cathepsin B的表达,通过荧光定量PCR和western blot检测,发现细胞中cathepsin B的mRNA和蛋白表达水平均显着下降,并筛选出CTSB最佳干扰组;2)三七含药血清低、中、高剂量干预实验:三七含药血清处理后肺癌A549细胞的细胞增殖能力下降、凋亡能力上升,且细胞的增殖能力与凋亡能力改变具有剂量依赖性。荧光定量PCR检测三七含药血清能够下调A549细胞中CTSB mRNA表达,以高剂量组更为明显。4.动物实验:1)荷瘤模型组与正常对照组相比,cathepsin B的mRNA和蛋白表达水平呈高表达状态;2)三七干预组与荷瘤模型组相比瘤子生长速度明显减慢,且具有剂量依耐性,不同组间瘤子体积差异有显着性（P<0.05）;三七干预后不同组瘤体的CTSB mRNA的表达量及CTSB蛋白的表达水平均有不同程度的下降,且具有剂量依赖性;三七干预后能够不同程度影响小鼠血清中肿瘤标志物（CEA、NSE和CYFRA21）的水平、降低荷瘤小鼠血清中D-二聚体的含量,可不同程度延长小鼠总生存期,且高剂量组更为明显。结论:通过理论研究、临床回顾性分析及体内外实验证实三七能够作用于CTSB基因、下调肺癌细胞cathepsin B（CTSB）mRNA及蛋白表达、降低D-二聚体、改变血液粘度等方式抑制肺癌生长,实现抗肿瘤作用,为临床三七（粉）运用于肺癌的治疗提供了一定的实验基础。
曹淑君[8]（2019）在《逆萎康通过AKT/GSK-3β/β-catenin途径抑制MC细胞上皮—间质转化过程》文中指出目的:观察逆萎康对MC细胞增殖、凋亡以及迁移侵袭的影响,探究AKT/GSK-3β/β-catenin途径抑制MC细胞上皮-间质转化的过程。方法:第一部分MNNG（M-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍）对GES-1细胞增殖和上皮间质转化的促进作用。胃癌癌前病变的细胞（MC细胞）模型的构建,采用Western blot法检测α-SMA、E-cadherin、N-cadherin和vimentin等EMT相关蛋白的表达。第二部分采用CCK-8法、克隆集落形成实验观察逆萎康对MC细胞的抑制作用;采用transwell方法观察逆萎康对MC细胞迁移和侵袭的抑制作用;采用流式细胞仪检测逆萎康对MC细胞凋亡的促进作用;采用蛋白免疫印迹法（Western blot）检测MC细胞PCNA、Caspase-3、Bax、Bcl-2、MMP-2、MMP-9、E-cadherin、N-cadherin、vimentin、P-AKT、β-catnin、α-SMA、GSK-3β、P-GSK-3βSer9蛋白的表达。第三Western blot法检测逆萎康、AKT抑制剂GSK690693（10μM）以及逆萎康高剂量组+AKT抑制剂GSK690693（10μM）对MC细胞P-AKT Ser473、GSK-3β、P-GSK-3βSer9、AKT、β-catnin、E-cadherin、N-cad-rin、vimentin和α-SMA蛋白的表达;采用实时荧光定量PCR（Real-time PCR）检测逆萎康对MC细胞C-myc mRNA的表达。结果:第一部分构建了MC细胞模型。Western blot结果显示,与GES-1细胞相比,MC细胞的E-cadherin显着下调,而间充质标志物vimentin、α-SMA和N-cadherin则显着上调。第二部分与BC组相比,CCK8检测结果表明,MC细胞的存活率呈剂量依赖性（P<0.05）降低;克隆集落形成实验显示,逆萎康含药血清抑制细胞的增殖且呈剂量依赖型（P<0.05）;流式细胞术检测细胞凋亡情况,细胞凋亡率明显增加（P<0.05）;Transwell实验结果表明,各组的迁移和侵袭细胞个数减少（P<0.05）。Western blot结果显示,PCNA、MMP-2、MMP-9和Bcl-2（P<0.05）蛋白水平的相对表达量均降低,逆萎康上调Bax和Caspase-3（P<0.05）的蛋白表达,并呈剂量依赖性而且具有统计学意义。第三部分Western blot实验表明,逆萎康下调β-catenin、P-AKT Ser473、E-cadherin和P-GSK-3βSer9蛋白表达调（P<0.05）,而α-SMA、N-cadherin和vimentin在蛋白水平上的表达上调（P<0.05）,但GSK-3β和AKT蛋白的表达统计学意义不明显;加入AKT抑制剂GSK690693后抑制了MC细胞的EMT过程,其E-cadherin蛋白的表达上调（P<0.05）,N-cadherin、vimentin和α-SMA蛋白的表达下调显着（P<0.05）;抑制P-AKT Ser473、P-GSK-3βSer9和β-catenin的表达（P<0.05）,但GSK-3β和AKT蛋白的表达无明显变化;q RT-PCR结果证实逆萎康含药血清可以抑制C-myc m RNA（P<0.05）的表达,并且加入抑制剂后抑制作用增强,具有统计学意义（P<0.05）。结论:逆萎康含药血清能够抑制MC细胞的增殖、迁移和侵袭能力,提示逆萎康抑制MC细胞的转移是通过AKT/GSK-3β/β-catenin途径抑制EMT过程。
刘超敏[9]（2019）在《益气养阴方含药血清对肺癌A549细胞的休眠作用研究》文中提出目的:通过研究益气养阴方含药血清对非小细胞肺癌A549细胞株的增长抑制、细胞周期改变、PCNA mRNA和蛋白表达以及VEGF mRNA和蛋白表达的影响,探讨其诱导肿瘤休眠的机制。方法:20只SD大鼠随机分为4组,对照组、高剂量组、中剂量组和低剂量组,每组5只。将益气养阴方熬煮浓缩,中剂量为等效剂量,即每天需给与生药量10.26 g/100g大鼠;高剂量乘以1.5,即每天需给与生药量15.39 g/100 g大鼠;低剂量除以1.5,即每天需给与生药量6.84 g/100 g大鼠。对照组给予等量生理盐水,连续灌胃3天。末次给药后2 h采眼眶血,分离出含药血清,将采自同组5只小鼠的血清进行充分混合。A549细胞经24 h预培养进入对数生长期后,将对照组、高、中、低剂量组含药血清分别加入培养基继续培养24 h。用CCK-8法检测细胞抑制率,流式细胞技术检测细胞周期,荧光定量PCR技术检测PCNA、VEGF mRNA表达水平,Western blotting技术检测PCNA、VEGF蛋白表达水平。结果:1、细胞增殖抑制作用实验:高、中、低剂量组与对照组相比均有抑制作用,差异具有统计学意义（P（27）0.01）,高、中、低剂量组抑制率分别为46.09%、57.45%、70.27%。2、细胞周期阻滞实验:与对照组相比,用不同剂量含药血清处理A549细胞后G0/G1期细胞比例均有所升高,差异均有统计学意义（P（27）0.05）,高、中、低剂量组作用A549细胞后细胞分裂周期停滞在G0/G1期。3、PCNA mRNA和蛋白质表达水平检测:与对照组相比,低、中剂量组PCNA mRNA表达量都有降低,差异有统计学意义（P（27）0.05）,高剂量处理组作用后PCNA mRNA表达量略有升高,但差异无显着性（P（29）0.05）。与对照组相比,各剂量含药血清处理组PCNA蛋白的表达均降低,差异均有统计学意义（P（27）0.01）。4、VEGF mRNA和蛋白质表达水平检测:与对照组相比,中、低剂量益气养阴方含药血清各剂量处理组对A549细胞内VEGF mRNA表达没有明显的影响（P（29）0.05）,而高剂量处理组的细胞内VEGF蛋白相对表达升高,差异有统计学意义（P（27）0.01）。结论:适当浓度的益气养阴方可能通过降低PCNA的表达抑制细胞增殖,诱导A549细胞进入细胞休眠状态。益气养阴方诱导A549细胞休眠的作用可能与下调血管生成途径的VEGF因子无关。
林举择[10]（2018）在《肝癌休眠中健脾化瘀方干预血管生成相关因子的机制研究》文中研究表明目的:（1）探究原发性肝癌从脾虚血瘀论治的学术溯源和相关理论基础,并抓住肝癌脾虚血瘀的基本核心病机,论证了临证上以健脾化瘀法为主要治法并组成中药复方防治肝癌术后复发和转移的理论依据。（2）在健脾化瘀方前期研究的基础上,一方面通过动物体内试验,掌握肝癌术后休眠/复发过程中血管生成的动态时空变化规律以及健脾化瘀方的干预作用效果;另一方面通过体内外双水平实验进一步探讨了Jagged1/Notch信号通路介导的血管生成在肝癌休眠中的作用以及健脾化瘀方的干预作用,为健脾化瘀方抗肿瘤血管生成治疗提供临床应用的理论基础,也为中药复方今后更好地应用于临床提供科学依据。方法:第一部分:从古今论述肝癌的中医典籍和文献资料入手,分别探究了肝癌从脾虚证和血瘀证论治的学术溯源和理论基础。第二部分:依照前期动物建模方法,于裸鼠腋下注射人源肝癌SMMC7721细胞成瘤法建立肝癌动物模型,成瘤后予手术切除,建立肝癌休眠动物模型,采用截尾创伤打破术后肝癌休眠后,观察肝癌模型组、健脾化瘀方（高、中、低剂量:24.96 g/kg、12.48 g/kg、6.24 g/kg）组4组裸鼠肝癌复发后肿瘤生长情况;分别在给药后的第1、4、8、15天,剥离瘤体,HE染色观察肿瘤病理情况,采用q PCR、Western Blot法和免疫组化检测HIF-lα、VEGF、MMP-9、TIMP-1、EMMPRIN的表达情况;采集裸鼠外周血,流式细胞仪检测外周血循环内皮细胞（CECs）和活性循环内皮细胞的含量（v CECs）。第三部分:体外细胞实验:制备SPF级裸鼠的健脾化瘀方加药血清,HPLC鉴定健脾化瘀方中药与加药血清中药指纹图谱。配制体外细胞完全培养基,根据添加物不同分为正常血清对照组、DAPT抑制剂对照组和加药血清组三组培养人源肝癌SMMC7721细胞。先采用CCK8法分别在0、24、48、72 h检测细胞增殖能力和在倒置显微镜下拍照对比观察血管形成实验;之后进一步运用q PCR法和Western blot法检测Jagged1、Notch1、VEGF的表达水平;Co-IP实验检测Jagged1和Notch1的结合情况。体内动物实验:依照前期动物建模方法,于裸鼠腋下注射人源肝癌SMMC7721细胞成瘤法建立肝癌动物模型,成瘤后予手术切除,建立肝癌休眠动物模型,采用截尾创伤打破术后肝癌休眠后,观察肝癌复发模型组、健脾化瘀方（高、中、低剂量:24.96 g/kg、12.48 g/kg、6.24 g/kg）组4组裸鼠肝癌复发后肿瘤生长情况;打破肝癌术后裸鼠的肿瘤休眠状态,动态观察肿瘤生长情况;剥离瘤体,HE染色观察各组肿瘤病理情况;四组瘤体切片,CD43标记后在倒置显微镜下（×200）进行拍照对比观察;采用q PCR和Western blot法检测Jagged1、Notch1、VEGF的表达水平;通过Co-IP实验检测各组瘤体中Jagged1和Notch1的结合情况。结果:第一部分:肝癌的基本核心病机是脾虚血瘀,于此确立的健脾化瘀法是肝癌的关键治法。第二部分:在相同时间点上,肝癌复发模型组的HIF-lα、VEGF、MMP-9、TIMP-1、EMMPRIN的表达和CECs和v CECs的比例都要显着高于健脾化瘀方组。与此相应指标对比的是,四组中高剂量健脾化瘀方组表达最低（P<0.01）,且低、中、高剂量组上述指标的表达和数量值呈现一定的递减趋势。第三部分:体外细胞实验:在24、48、72 h时点上正常血清对照组的细胞比加药血清组的增殖快,差异显着（P<0.01）;加药血清组的细胞表达Jagged1、Notch1、VEGF的水平较正常血清对照组明显下降（P<0.01）;加药血清组和抑制剂对照组均较正常血清对照组的新生血管面积更小,血管管道更稀疏;加药血清组和抑制剂对照组中细胞表达Jagged1、Notch1、VEGF的蛋白电泳灰度明显比正常血清对照组减弱（P<0.01）;加药血清组和抑制剂对照组中细胞Jagged1与Notch1的结合水平相比正常血清对照组明显减弱（P<0.01）。体内动物实验:（1）实验中通过HE染色观察四组肿瘤病理情况,镜下（x200）发现肝癌模型组所示核染色呈异形的肿瘤细胞密度最高,排列最紊乱;而健脾化瘀方高剂量组镜下所示核染色呈异形的肿瘤细胞密度最低,排列最接近正常。四图中所呈现的肿瘤细胞密度的高低排列顺序依次为肝癌模型组>健脾化瘀方低剂量组>健脾化瘀方中剂量组>健脾化瘀方高剂量组。从动物体内试验的肿瘤病理切片观察情况来看,体内试验的病理结果与体外细胞培养的肝癌细胞增殖能力结果基本一致。（2）进一步比较四组裸鼠瘤体内肿瘤的血管形成能力。从实验免疫组化检测（CD43标记）四组瘤体内的肿瘤微血管形成的情况来看,肝癌模型组瘤体的新生血管面积较大,新生血管管道较稠密。而健脾化瘀方高剂量组的瘤体内形成的新生血管面积更小,新生血管更少,血管密度更稀疏。四组所呈现肿瘤微血管的大小和密度的高低排列顺序依次为肝癌模型组>健脾化瘀方低剂量组>健脾化瘀方中剂量组>健脾化瘀方高剂量组。动物体内试验的肿瘤血管形成能力观察结果与体外培养肝癌细胞血管形成实验结果相类似。（3）通过q PCR法检测了四组瘤体细胞表达Jagged1、Notch1、VEGF的水平,四组瘤体细胞的Jagged1、Notch1及VEGF表达水平的组间比较有显着性差异（P<0.01）。健脾化瘀方高、中、低剂量组均较肝癌模型组明显下降,其中高剂量组瘤体细胞的Jagged1、Notch1、VEGF表达水平下降最显着。（4）再次通过Western blot法检测健脾化瘀方高、中、低剂量组和肝癌模型组四组瘤体细胞中Jagged1、Notch1、VEGF的表达水平,结果发现肝癌模型组和健脾化瘀方低、中、高剂量组瘤体细胞表达Jagged1、Notch1、VEGF的蛋白电泳灰度均依次减弱,四组瘤体细胞表达Jagged1、Notch1、VEGF的蛋白电泳灰度数值组间比较均有显着性差异（P<0.01）。其中,高剂量组瘤体细胞表达Jagged1、Notch1、VEGF的蛋白电泳灰度值下降最明显,表达水平最弱,组间差异有统计学意义（P<0.01）。这在体外细胞培养实验中亦观察到了相类似的结果。（5）从Co-IP实验检测四组瘤体中Jagged1与Notch1的结合情况来看,肝癌模型组和健脾化瘀方低、中、高剂量组瘤体细胞的Jagged1与Notch1的结合能力依次减弱,四组组间比较有显着性差异（P<0.01）。其中,健脾化瘀方高剂量组瘤体细胞的Jagged1与Notch1的结合能力最弱。这在体外细胞培养实验中也观察到了相类似的结果。结论:（1）紧抓住肝癌的基本核心病机,以健脾化瘀法立治法组方,临床上有望在防治肝癌术后复发和转移这一难题上有所突破。（2）成功建立人源肝癌SMMC7721细胞裸鼠肝癌动物模型和肝癌术后肿瘤休眠/复发动物模型;（3）健脾化瘀方对肝癌术后肿瘤细胞的休眠状态和休眠时间有促进作用,这种作用具有一定的药物浓度依赖性;（4）健脾化瘀方促进肿瘤休眠和防治肝癌术后复发的作用与抑制了肿瘤血管新生有密切关系,且这种作用亦呈现一定的药物浓度依赖性;（5）健脾化瘀方抗肿瘤血管新生的部分机制是通过多途径、多靶点降低了肿瘤微血管密度,抑制了肿瘤细胞HIF-lα、VEGF、MMP-9、TIMP-1、EMMPRIN的表达以及降低了外周血循环内皮细胞（CECs）和活性循环内皮细胞的含量（v CECs）有密切关联。（6）健脾化瘀方具有抑制肝癌细胞增殖和肿瘤血管生成的双重作用,这些抗肿瘤作用的机制可能是抑制了肿瘤细胞中配体Jagged1的表达及其与Notch信号通路的结合,降低了肝癌细胞VEGF的活性并下调了其表达,从而抑制了肿瘤新生血管形成,最终发挥其防治肝癌术后复发的作用。
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本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略语表 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 肺癌微环境中外泌体的生物学功能及其临床应用 |
| 1 研究背景 |
| 2 外泌体的形成和特征 |
| 3 外泌体的释放 |
| 4 肺癌微环境中外泌体的功能 |
| 5 外泌体在化疗耐药与靶向治疗耐药中的作用 |
| 6 外泌体在临床诊断和治疗中的应用 |
| 7 肿瘤微环境中外泌体可以作为肺癌的预测指标 |
| 8 讨论 |
| 参考文献 |
| 附表1 外泌体肺癌微环境不同细胞之间的调控 |
| 附表2 外泌体在治疗、诊断与预后中的相关研究 |
| 综述二 中医药调控肿瘤微环境防治肺癌研究进展 |
| 1 肿瘤免疫微环境 |
| 2 中医药对肿瘤相关巨噬细胞极化与功能的调控 |
| 3 中医药对髓源性抑制细胞的调节 |
| 4 中医药对T、B淋巴细胞、NK细胞及免疫靶点的调控 |
| 5 中医药对调节性T细胞的调控 |
| 6 中医药重塑上皮间质转化 |
| 7 中医药对血管生成的作用 |
| 8 中医药对肿瘤相关成纤维细胞的调控 |
| 9 中医药对肿瘤相关树突状细胞的作用 |
| 10 中医药对肿瘤微环境炎症因子的调控 |
| 11 中医药对微环境中外泌体及非编码RNA表达的作用 |
| 12 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 实验研究 |
| 实验一 双参颗粒抑制荷Lewis肺癌小鼠移植瘤的药效学实验 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验二 双参颗粒对荷Lewis肺癌小鼠肿瘤相关巨噬细胞表型的影响 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验三 双参颗粒干预荷M1型巨噬细胞与Lewis肺癌细胞混合移植瘤小鼠模型的实验研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验四 双参颗粒对小鼠TAM细胞功能因子、记忆T细胞、Treg细胞的影响 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验五 MIF基因过表达与MIF基因干扰稳定转染Lewis细胞株的构建 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验六 双参颗粒含药血清对MIF~(+/+)Lewis及shMIF-Lewis细胞中MIF蛋白表达的影响 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验七 双参颗粒含药血清对Lewis来源外泌体及外泌体中MicroRNA-34a的影响 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验八 双参颗粒含药血清干预MIF~(+/+)Lewis细胞来源外泌体对巨噬细胞表型及KLF4的影响 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 附件 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 细胞焦亡与恶性肿瘤发生发展作用的研究进展 |
| 1 细胞焦亡的研究历程 |
| 2 细胞焦亡的分子机制 |
| 3 细胞焦亡与恶性肿瘤 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 综述二 中医药治疗乳腺癌的研究进展 |
| 1 中医对乳腺癌的认识 |
| 2 中药在化疗阶段的作用及其主要治则治法 |
| 3 中医药联合化疗的基础研究 |
| 4 总结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 疏肝健脾法治疗乳腺癌有效性及安全性的系统评价和Meta分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 文献检索及筛选 |
| 1.2 数据提取 |
| 1.3 纳入标准 |
| 1.4 排除标准 |
| 1.5 质量评估方法 |
| 1.6 数据分析方法 |
| 1.7 文献检索过程 |
| 2 结果 |
| 2.1 纳入研究的基本信息 |
| 2.2 研究质量的评估 |
| 2.3 疏肝健脾法+化疗与单纯化疗治疗乳腺癌的ORR比较 |
| 2.4 疏肝健脾法+化疗与单纯化疗治疗乳腺癌的DCR比较 |
| 2.5 疏肝健脾法+化疗与单纯化疗改善乳腺癌患者抑郁状态的差异 |
| 2.6 疏肝健脾法+化疗与单纯化疗对乳腺癌患者生存质量的影响差异 |
| 2.7 疏肝健脾法+化疗与单纯化疗对乳腺癌患者CD3~+、CD4~+T细胞的影响差异 |
| 2.8 疏肝健脾法+化疗与单纯化疗乳腺癌患者不良事件构成比 |
| 2.9 疏肝健脾法+化疗与单纯化疗乳腺癌患者不良事件发生率差异 |
| 2.10 敏感性及发表偏倚分析 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 疏肝健脾方对瘤前抑郁障碍型乳腺癌小鼠的干预作用及分子机制研究 |
| 前言 |
| 实验一: 瘤前抑郁障碍型乳腺癌小鼠模型的建立及评价 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验二: 抑郁障碍对小鼠乳腺癌发生发展影响的研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验三: 疏肝健脾方对瘤前抑郁障碍乳腺癌小鼠干预作用及对肿瘤微环境影响的研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验四: 基于NLRP3/caspase-1/GSDMD细胞焦亡通路探讨疏肝健脾方对瘤前抑郁障碍乳腺癌的作用机制研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 研究结论 |
| 第五部分 不足与展望 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
| 附件 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 1.1 环磷酰胺诱导心脏毒性的分子机制 |
| 1.2 补肾健脾方对肿瘤化疗增效减毒的实验和临床研究进展 |
| 第二章 艾可清对环磷酰胺中毒小鼠毒副反应的影响 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 药品及试剂 |
| 1.1.3 实验仪器 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 动物分组及处理 |
| 1.2.2 生存曲线分析 |
| 1.2.3 血常规检测 |
| 1.2.4 生化指标检测 |
| 1.2.5 HE染色 |
| 1.2.6 统计学分析 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.3.1 实验动物的一般状况 |
| 1.3.2 生存曲线分析 |
| 1.3.3 AKQ对CTX染毒小鼠血常规的影响 |
| 1.3.4 AKQ对CTX染毒小鼠主要脏器生化指标的影响 |
| 1.3.5 主要脏器HE染色 |
| 1.4 讨论 |
| 第三章 艾可清对环磷酰胺中毒小鼠心脏毒性的影响 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 药品及试剂 |
| 2.1.3 主要耗材 |
| 2.1.4 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 动物分组及处理 |
| 2.2.2 心脏指数计算 |
| 2.2.3 血清心肌酶及氧化指标测定 |
| 2.2.4 心脏组织HE染色 |
| 2.2.5 心肌凋亡相关蛋白免疫印迹 |
| 2.2.6 统计学分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 AKQ对CTX中毒小鼠心脏指数的影响 |
| 2.3.2 AKQ对CTX中毒小鼠心肌酶及氧化指标的影响 |
| 2.3.3 AKQ对CTX中毒小鼠心脏组织病理改变的影响 |
| 2.3.4 AKQ对CTX染毒小鼠心肌凋亡相关蛋白的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 第四章 艾可清对丙烯醛所致心肌细胞损伤的影响及机制探讨 |
| 3.1 药物制备及作用剂量的确定 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.1.3 实验结果 |
| 3.2 AKQ对ACR所致H9C2损伤的影响 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.2.3 实验结果 |
| 3.3 AKQ缓解CTX心脏毒性的网络药理学分析 |
| 3.3.1 材料与方法 |
| 3.3.2 实验结果 |
| 3.4 AKQ缓解ACR心肌细胞毒性的通路靶点验证 |
| 3.4.1 实验材料 |
| 3.4.2 实验方法 |
| 3.4.3 实验结果 |
| 3.5 讨论 |
| 第五章 艾可清对荷瘤小鼠CTX心脏毒性的影响及机制探讨 |
| 4.1 AKQ对荷瘤小鼠CTX心脏毒性的影响 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验方法 |
| 4.1.3 实验结果 |
| 4.2 AKQ对荷瘤小鼠CTX心脏毒性影响的血清代谢组学研究 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.2.3 实验结果 |
| 4.3 AKQ对肉瘤小鼠CTX心脏毒性影响的肠道菌群分析 |
| 4.3.1 实验材料 |
| 4.3.2 实验方法 |
| 4.3.3 实验结果 |
| 4.4 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校期间发表的论文 |
| 致谢 |
| 附件 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 综述一 非小细胞肺癌的西医研究进展 |
| 综述二 西黄丸抗肿瘤的实验研究进展 |
| 综述三 热休克蛋白与肿瘤的关系 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第一部分 西黄丸治疗非小细胞肺癌的疗效：系统综述和Meta分析 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二部分 西黄丸抗非小细胞肺癌的网络药理学分析 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第三部分 西黄丸抗小鼠Lewis肺癌的药效学研究 |
| 实验一 西黄丸含药血清和浸提液对LL/2细胞株增殖的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验二 西黄丸浸提液对LL/2细胞株凋亡和细胞周期的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验三 西黄丸浸提液对LL/2细胞株迁移及侵袭能力的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验四 西黄丸抑制Lewis肺癌小鼠皮下移植瘤生长的作用研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第四部分 西黄丸对Lewis肺癌小鼠皮下移植瘤的转录组学的影响 |
| 实验五 西黄丸对Lewis肺癌小鼠皮下移植瘤转录组学的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验六 西黄丸对Lewis肺癌小鼠皮下移植瘤热休克蛋白家族的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验七 西黄丸对Lewis肺癌小鼠皮下移植瘤的ER/RXRα/PPAR的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 在学期间主要研究成果 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 理论研究 |
| 第一章 祖国医学对结肠癌的研究概述 |
| 1. 祖国医学对结肠癌病名的认识 |
| 2. 祖国医学对结肠癌病因病机的认识 |
| 3. 祖国医学对结肠癌的辨证论治 |
| 参考文献 |
| 第二章 现代医学对结肠癌糖代谢的研究概述 |
| 1. Warburg理论的回顾与发展 |
| 2. 肿瘤微环境与糖代谢 |
| 3. AMPK信号通路 |
| 参考文献 |
| 第三章 中医药与代谢组学的研究 |
| 1. 代谢组学概论 |
| 2. 结肠癌代谢组学的研究现状 |
| 3. 中医药与代谢组学的关系 |
| 参考文献 |
| 第二部分 实验研究 |
| 第一章 固正消癌方对HT-29细胞糖代谢的调控作用 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 固正消癌方含药血清的制备 |
| 1.2 细胞系 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 人结肠癌HT-29细胞的复苏、培养、传代与冻存 |
| 2.2 细胞分组与给药 |
| 2.3 Transwell迁移与侵袭实验 |
| 2.4 ATP浓度测定 |
| 2.5 葡萄糖含量测定 |
| 2.6 乳酸水平检测 |
| 2.7 乳酸脱氢酶水平检测 |
| 2.8 细胞内、外pH检测 |
| 2.9 Western Blot实验 |
| 2.10 流式细胞检测细胞凋亡 |
| 3. 统计学方法 |
| 4. 结果 |
| 4.1 固正消癌方含药血清抑制HT-29细胞Transwell迁移、侵袭能力 |
| 4.2 固正消癌方含药血清下调HT-29细胞ATP浓度 |
| 4.3 固正消癌方含药血清减少HT-29细胞内葡萄糖含量 |
| 4.4 固正消癌方含药血清降低HT-29细胞乳酸水平 |
| 4.5 固正消癌方含药血清降低HT-29细胞乳酸脱氢酶含量 |
| 4.6 固正消癌方含药血清对HT-29细胞内、外pH的影响 |
| 4.7 固正消癌方含药血清影响HT-29细胞糖代谢相关蛋白的表达 |
| 4.8 固正消癌方含药血清诱导HT-29细胞的凋亡 |
| 5. 讨论 |
| 6. 结论 |
| 第二章 固正消癌方对HT-29细胞AMPK信号通路的影响 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 固正消癌方含药血清的制备 |
| 1.2 细胞系 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 人结肠癌HT-29细胞的复苏、培养、传代与冻存 |
| 2.2 细胞分组与给药 |
| 2.3 引物的设计与合成 |
| 2.4 CCK8法监测细胞抑制率 |
| 2.5 划痕实验 |
| 2.6 Transwell迁移与侵袭实验 |
| 2.7 Weste Blot实验 |
| 3. 统计学方法 |
| 4. 结果 |
| 4.1 固正消癌方含药血清通过AMPK通路抑制HT-29细胞增殖 |
| 4.2 固正消癌方含药血清通过AMPK通路弱化HT-29细胞的迁移 |
| 4.3 固正消癌方含药血清通过AMPK通路减弱HT-29细胞的Transwell迁移、侵袭 |
| 4.4 固正消癌方含药血清通过AMPK通路影响HT-29细胞糖代谢相关蛋白的表达 |
| 4.5 固正消癌方含药血清通过AMPK通路诱导HT-29细胞凋亡蛋白的表达 |
| 5. 讨论 |
| 6. 结论 |
| 第三章 固正消癌方对荷瘤裸鼠糖代谢的调控作用 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 中药煎液制备 |
| 1.2 动物与细胞系 |
| 1.3 荷瘤裸鼠模型的建立 |
| 1.4 主要试剂 |
| 1.5 主要仪器及用具 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 动物分组与给药 |
| 2.2 裸鼠肝、脾、肾HE染色 |
| 2.3 肿瘤组织免疫组化 |
| 2.4 瘤体组织Western Blot实验 |
| 2.5 裸鼠血清液相色谱、质谱联用代谢组学分析 |
| 3. 统计学方法 |
| 4. 结果 |
| 4.1 裸鼠一般情况 |
| 4.2 裸鼠肝、脾、肾HE染色 |
| 4.3 肿瘤组织免疫组化 |
| 4.4 肿瘤组织中糖代谢相关蛋白的表达 |
| 4.5 裸鼠血清糖代谢LC-MS分析 |
| 5. 讨论 |
| 6. 结论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 博士期间取得的成果 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 理论研究 |
| 1.老年急性髓系白血病西医治疗现状与进展 |
| 1.标准化疗(强化化疗) |
| 2.异基因造血干细胞移植 |
| 3.低强度化疗 |
| 4.靶向治疗 |
| 5.免疫治疗 |
| 参考文献 |
| 2.当代中医治疗急性白血病概况 |
| 2.1 关于急性白血病的中医病名 |
| 2.2 急性白血病的病因病机 |
| 2.3 “伏邪(毒)”概念的提出 |
| 2.4 治疗概况 |
| 2.5.讨论 |
| 参考文献 |
| 3.扶正中药在急性白血病临床与基础研究中的现状 |
| 3.1 扶正中药的临床研究 |
| 3.2 扶正中药的基础研究 |
| 3.3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 临床研究 |
| 1.研究目的 |
| 2.材料和方法 |
| 2.1 病例纳入标准 |
| 2.2 病例排除标准 |
| 2.3 一般资料 |
| 2.4 治疗方案 |
| 2.5 支持治疗 |
| 2.6 观察指标 |
| 2.7 疗效评价 |
| 2.8 统计学分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 近期效果比较 |
| 3.2 远期效果比较 |
| 3.3 感染并发症比较 |
| 4.讨论 |
| 4.1 芪附扶正合剂组方合理性探讨 |
| 4.2 芪附扶正合剂取得临床疗效的原因分析 |
| 参考文献 |
| 第三部分 实验研究 |
| 1.研究目的 |
| 2.QFFZD含药血清的制备(实验一) |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3.QFFZD含药血清和Ara-C对HL-60细胞增殖和细胞周期的影响(实验二) |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 4.芪附扶正合剂含药血清和阿糖胞苷对HL-60细胞凋亡的影响(实验三) |
| 4.1 实验材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 5.芪附扶正合剂含药血清协同阿糖胞苷诱导HL-60细胞凋亡的作用机制(实验四) |
| 5.1 实验材料 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.3 实验结果 |
| 6.讨论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 附录 |
| 缩略词表 |
| 急性白血病症状分级量化表 |
| 攻读博士学位期间取得的研究结果 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语 |
| 前言 |
| 第一部分 理论研究 |
| 1. 对“血瘀理论”及“活血化瘀法”的认识 |
| 1.1 “瘀”是体内一种状态(高凝状态) |
| 1.2 “致瘀”是一个致病过程(血栓形成) |
| 1.3 “瘀血”是病理结果(血栓栓塞) |
| 1.4 “瘀”与D-二聚体的相关研究 |
| 1.5 活血化瘀法的中医溯源 |
| 1.6 活血化瘀药治疗肿瘤的争议与思考 |
| 2. 中医学对肺癌的认识及治疗 |
| 2.1 肺癌的中医病名认识 |
| 2.2 肺癌的中医病因认识 |
| 2.3 肺癌的中医主要病机认识 |
| 3. 肺癌的中医治疗 |
| 3.1 药物治疗 |
| 3.2 食物治疗 |
| 3.3 康复治疗 |
| 3.4 中医特色适宜技术治疗 |
| 4. 现代医学对肺癌的认识及治疗 |
| 4.1 肺癌的定义及临床分型 |
| 4.2 肺癌的分期 |
| 4.3 现代医学对肺癌的病因认识 |
| 5. 肺癌的西医治疗 |
| 5.1 手术 |
| 5.2 放射治疗 |
| 5.3 化学治疗 |
| 5.4 靶向治疗 |
| 5.5 免疫治疗 |
| 6. 三七的研究进展 |
| 6.1 三七的中医研究概述 |
| 6.2 三七的现代药理学研究进展 |
| 6.3 三七的前期基础研究 |
| 7. 立项依据及意义 |
| 7.1 肺癌的流行病学概况及治疗现状 |
| 7.2 血瘀与肺癌发病的相关性 |
| 7.3 组织蛋白酶B(Cathepsin B,CTSB)与肿瘤的相关性 |
| 7.4 立项思路与科学假说 |
| 8. 小结 |
| 第二部分 回顾性临床研究 |
| 1. 目的 |
| 2. 临床资料与方法 |
| 2.1 一般资料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 观察指标 |
| 2.4 统计学分析 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 不足之处 |
| 6. 典型病例举例1例 |
| 7. 结论 |
| 第三部分 实验研究 |
| 1. 细胞实验 |
| 1.1 实验材料与方法 |
| 1.2 实验结果 |
| 2. 动物实验 |
| 2.1 实验材料与方法 |
| 2.2 实验结果 |
| 3. 讨论 |
| 3.1 肺癌研究中“中医药治疗”介入的必要性 |
| 3.2 实验中三七剂量组设定及其效量关系探讨 |
| 3.3 三七粉与三七含药血清药效成分探讨 |
| 3.4 三七在肺癌及肿瘤治疗中的药用机制探讨 |
| 3.5 CSTB在肺癌及肿瘤治疗中的研究价值 |
| 3.6 活血化瘀法在肺癌及肿瘤治疗中应用的思考 |
| 4. 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1: 综述 |
| 参考文献 |
| 附录2: 临床研究伦理批件 |
| 附录3: 三七质检报告 |
| 附录4: 体力状态评分表 |
| 附录5: 压力指数评分表 |
| 攻读博士学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一部分 MC细胞模型的构建 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 细胞株 |
| 1.2 复苏GES-1 细胞 |
| 1.3 GES-1 细胞培养 |
| 1.4 GES-1 细胞的冻存 |
| 1.5 主要试剂 |
| 1.6 主要仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 将GES-1 细胞诱导成为MC细胞的方法 |
| 2.2 Western blot检测EMT相关蛋白的表达 |
| 2.3 统计学分析 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 第二部分 逆萎康对MC细胞增殖、凋亡以及迁移侵袭的影响 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验药材 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 含药血清的制备 |
| 2.2 细胞培养 |
| 2.3 CCK8 法检测细胞增殖 |
| 2.4 克隆集落形成 |
| 2.5 Transwell小室迁移实验步骤 |
| 2.6 Transwell小室侵袭实验步骤 |
| 2.7 流式细胞仪检测细胞凋亡能力 |
| 2.8 Western blot法检测相关蛋白表达 |
| 2.9 统计学分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 逆萎康对MC细胞增殖的结果 |
| 3.2 逆萎康对MC细胞凋亡的结果 |
| 3.3 逆萎康对MC细胞迁移、侵袭的结果 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 第三部分 逆萎康通过AKT/GSK-3β/β-catenin通路抑制MC细胞的EMT过程 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 主要仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 MC细胞培养 |
| 2.2 实验分组 |
| 2.3 Western blot法检测EMT以及AKT/GSK-3β/β-catenin通路蛋白表达 |
| 2.4 实时荧光定量PCR检测C-myc mRNA表达 |
| 2.5 统计学分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 逆萎康影响AKT/GSK-3β/β-catenin以及EMT蛋白表达结果 |
| 3.2 阻断AKT/GSK-3β-β-catenin通路后逆萎康对MC细胞的EMT影响结果 |
| 3.3 逆萎康对AKT/GSK-3β/β-catenin下游通路C-myc mRNA的影响结果 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 英语缩略词 |
| 第一章 前言 |
| 1 肺癌与肿瘤休眠治疗 |
| 1.1 原发性支气管肺癌 |
| 1.2 肿瘤休眠 |
| 1.2.1 细胞休眠 |
| 1.2.2 血管性休眠 |
| 1.2.3 血管生成因子 |
| 1.2.4 免疫休眠 |
| 1.3 肿瘤休眠相关因子 |
| 1.4 中国传统医学对肺癌的认识 |
| 1.4.1 中医与肿瘤血管性休眠 |
| 1.4.2 益气养阴方的组方和配伍 |
| 1.4.3 益气养阴方及其在肺癌治疗中的应用 |
| 1.4.4 有关益气养阴方相关研究 |
| 1.5 本研究的意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 1 实验材料与仪器 |
| 1.1 细胞株 |
| 1.2 益气养阴方 |
| 1.3 SD雄性大鼠 |
| 1.4 试剂 |
| 1.5 实验仪器 |
| 1.6 主要试剂的制备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 药品制备 |
| 2.2 给药方案及含药血清制备 |
| 2.3 A549 细胞的复苏及培养 |
| 2.4 CCK-8(Cell Counting Kit-8)检测细胞增殖实验 |
| 2.4.1 CCK-8 法筛选A549 细胞最佳生长时间 |
| 2.4.2 CCK-8 法检测益气养阴方含药血清抗增殖作用 |
| 2.5 流式细胞术分析细胞周期 |
| 2.6 RT-PCR检测PCNA、VEGF mRNA的表达水平 |
| 2.7 Western Blotting方法检测PCNA、VEGF蛋白的表达 |
| 2.8 统计分析 |
| 第三章 结果 |
| 3.1 A549 细胞的生长曲线 |
| 3.2 益气养阴方含药血清对A549 细胞增殖的影响 |
| 3.3 益气养阴方含药血清对A549 细胞分裂周期的影响 |
| 3.4 荧光定量PCR检测PCNA、VEGF mRNA的表达 |
| 3.5 Western-blotting检测益气养阴方含药血清处理后A549 细胞的PCNA、VEGF蛋白表达的影响 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 含药血清在药效学研究中的应用 |
| 4.2 益气养阴方含药血清对A549 细胞增殖的抑制作用 |
| 4.3 益气养阴方含药血清对A549 细胞分裂周期的影响 |
| 4.4 PCNA mRNA的和蛋白表达与细胞休眠 |
| 4.5 VEGF mRNA的和蛋白表达与细胞休眠 |
| 4.6 有关益气养阴方组方成分的抗肿瘤活性和抗血管生成作用研究 |
| 4.7 小结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 1.1 祖国医学对肝癌的认识 |
| 1.2 现代医学对肝癌术后肿瘤复发和转移的研究进展 |
| 1.2.1 肿瘤术后休眠/复发的中医认识 |
| 1.2.2 肿瘤术后休眠/复发的中医认识 |
| 1.2.3 肿瘤术后休眠/复发的中医认识 |
| 1.3 健脾化瘀方促进肝癌细胞肿瘤休眠的研究 |
| 1.3.1 肿瘤术后休眠/复发的中医认识 |
| 1.3.2 中药抗血管生成的机制是多途径、多靶点的 |
| 1.3.3 健脾化瘀方多靶点、多途径促进肝癌细胞休眠 |
| 1.4 展望和设想 |
| 第二章 临床理论探究 |
| 2.1 肝癌从脾虚血瘀论治的学术溯源和理论基础 |
| 2.1.1 肝癌从脾虚证论治的学术溯源和理论基础 |
| 2.1.2 肝癌从血瘀证论治的学术溯源和理论基础 |
| 2.2 肝癌从脾虚血瘀论治的临床指导意义 |
| 2.2.1 从肝癌关键病机入手确立健脾化瘀法 |
| 2.2.2 健脾化瘀法可防治肝癌术后复发和转移 |
| 第三章 实验研究 |
| 3.1 观察肝癌术后肿瘤血管生成的动态变化规律以及健脾化瘀方的干预作用 |
| 3.1.1 试剂与仪器 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.1.3 统计分析 |
| 3.1.4 结果 |
| 3.1.5 讨论 |
| 3.2 观察肝癌术后血管微环境中JAGGED1 调控的NOTCH通路对肝癌术后肿瘤休眠的作用机制以及健脾化瘀方的干预作用 |
| 3.2.1 Jagged1/Notch通路介导的血管生成在体外培养肝癌细胞增殖中的作用及健脾化瘀方的干预研究 |
| 3.2.2 观察Jagged1 调控的Notch通路对肝癌裸鼠术后肿瘤休眠的作用机制以及健脾化瘀方的干预作用 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校期间发表论文情况 |
| 致谢 |
| 附件 |
