邱炳玲[1]（2021）在《三七茉莉酸响应WRKY转录因子的分离与分析》文中研究说明三七[Panax notoginseng（Burk）F.H.Chen]又名田三七,具有活血化瘀、消肿定痛、止血补血、提高机体免疫力等功效,药用价值高。近年来根腐病、黑斑病、圆斑病等真菌病害严重影响了三七的品质及三七产业的可持续发展,其中主要由茄腐镰刀菌导致的三七根腐病最为严重。本课题组在前期研究中发现茉莉酸信号是三七响应茄腐镰刀菌的重要信号途径,并且从三七中分离得到一系列茉莉酸响应的抗病相关基因（PnDEFL1、PnSN1、PnPR10-3、PnChI1、PnGlu1、PnPGIP）。WRKY转录因子在调控植物防御病原菌侵染的转录重编程过程中发挥重要作用,是植物防御反应过程中的重要表达基因,近年来得到了广泛的研究关注,但对三七WRKY转录因子的研究却鲜见报道,且WRKY转录因子在三七体内是否参与调控对病原菌的防卫反应尚不清楚,因此,本项目从三七中分离协同茉莉酸信号参与茄腐镰刀菌防卫反应的WRKY基因;分析其在正常生长的三七中、信号分子处理后以及茄腐镰刀菌侵染过程中的表达谱;并选择了响应茉莉酸且表达水平较高的三七PnWRKY9基因,对其进行结构和亚细胞定位分析、功能验证以及对三七防御素基因PnDEFL1的转录调控特性研究。本论文的开展将有助于进一步了解三七WRKY转录因子协同茉莉酸信号参与对茄腐镰刀菌的防卫反应机制,深入认识三七与根腐病菌的分子互作机制。本文的研究内容和研究结果总结如下:1、通过转录组测序技术获得三七WRKY基因家族序列,并克隆得到30个具有完整ORF框的三七WRKY基因,将其命名为PnWRKY1-PnWRKY30。对这些基因进行保守结构分析、系统发育树分析、茉莉酸甲酯信号分子处理后茄腐镰刀菌侵染过程的表达谱分析。结果表明三七WRKY基因家族具有完整的保守结构域,在进化过程中高度同源。PnWRKY5/6/9/11/15/21/22/25/28/30等10个WRKY基因响应茉莉酸甲酯处理,并在茄腐镰刀菌侵染过程中转录水平上升。2、选取响应表达水平较高的PnWRKY9基因进行深入的功能研究。序列分析发现该基因含有一个WRKY结构域和一个CTYQGCX23HTH锌指结构域;构建PnWRKY9与GFP的融合表达载体,将其转化至根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105感受态细胞中,在洋葱表皮细胞中瞬时表达,激光共聚焦显微镜下观察PnWRKY9蛋白的定位位置,结果表明PnWRKY9蛋白定位在细胞核中。构建了p CAMBIA2300s-PnWRKY9植物超表达载体转化至WT烟草中稳定表达,获得PnWRKY9转基因烟草,并进行抗性分析,结果表明PnWRKY9转基因烟草对茄腐镰刀菌的抗性明显提高。随后又构建了PnWRKY9的RNAi表达载体将其转化至三七叶片中瞬时表达,并接种茄腐镰刀菌,结果显示RNAi载体表达的三七叶片增强了对茄腐镰刀菌的敏感性。功能验证分析表明,PnWRKY9是三七应对茄腐镰刀菌侵染的正调控因子。3、为验证PnWRKY9是调控三七抗性相关基因的转录因子,克隆了三七防御素基因PnDEFL1的启动子PPnDEFL1。该启动子含有一个W-box,进而采用凝胶阻滞（electrophoretic mobility shift assay,EMSA）、酵母单杂交（yeast one hybrid,Y1H）分析PnWRKY9对PPnDEFL1的结合以及转录激活。构建了PnWRKY9的原核表达载体,通过异丙基β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导外源蛋白表达,并用Ni-NTA柱亲和层析法纯化出PnWRKY9重组蛋白,用于EMSA实验,结果显示PnWRKY9蛋白能与含有W-box的PPnDEFL1片段特异性结合;构建了PnWRKY9猎物载体和PPnDEFL1启动子诱饵载体,共同转化至酵母感受态细胞中用于YIH实验,结果表明,PnWRKY9转录因子具有转录激活特性;同时还构建了启动子与GUS基因表达融合载体,分别转化至过表达PnWRKY9的转基因烟草和WT烟草中表达,并测定转基因烟草的GUS活性,结果表明,PPnDEFL1与PnWRKY9共表达烟草的GUS活性明显强于PPnDEFL1单表达转基因烟草的GUS活性。可见PnWRKY9转录因子能转录激活PnDEFL1基因的启动子,正调控PnDEFL1的表达水平。三七WRKY是协同茉莉酸信号途径参与对茄腐镰刀菌防卫反应的重要转录因子基因,其中有10个基因响应茉莉酸甲酯的处理,并在茄腐镰刀菌侵染过程中转录水平上升。PnWRKY9是细胞核定位蛋白,特异结合根腐病抗病基因PnDEFL1的启动子序列,并正调控PnDEFL1的转录水平。PnWRKY9响应茉莉酸信号,正调节防御素基因的表达,在三七对茄腐镰刀菌防卫反应中起重要的调控作用。
杜雅梦[2]（2020）在《金针菇毒蛋白FTX271的转基因烟草构建及其抗TMV机理初步分析》文中认为烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus,TMV）自1883年被发现以来,一直备受关注。TMV宿主范围广,能侵染十字花科、茄科、豆科、菊科等30多个科,达300多种植物,由其引起的病害严重影响了作物的质量和产量,造成重大的经济损失。TMV在烟田的发病率较高,烟草在幼苗期发病不仅会出现矮化现象,还会影响其正常生长,导致的经济损失高达50-70%。迄今尚未开发出非常有效的防治方法,因此寻找新型的具有环境友好性的抗病毒生物农药是防治策略之一。抗病毒蛋白亦属于生物农药,它不仅可直接商业化开发应用,并且可以通过转基因技术使其在作物中长期表达而产生活性。金针菇蛋白FTX271能体外钝化TMV的侵染且在转基因普通烟中能延缓和减轻症状,但其机理目前尚不清楚。本实验利用金针菇毒蛋白FTX271,通过农杆菌介导的转基因技术将其基因导入本氏烟中,结合蛋白质组学技术,探索FTX271蛋白在本氏烟中的表达水平及表达产物对TMV的抑制状况。利用农杆菌介导法将FTX271基因转入本氏烟,通过植物组织培养技术成功获得3株转基因植株,分别命名为N1、N2、N3。以野生型烟草为空白对照,将经RT-PCR验证阳性的N1株系的T1代进行蛋白质组测序,结果表明FTX271蛋白确实能在本氏烟中获得表达。转基因组较野生型烟草上调表达差异蛋白87个,下调表达差异蛋白79个,且差异蛋白大部分集中在叶绿体中（36.14%）。其中上调表达的差异蛋白包括:参与植物自身免疫的有丝分裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activatedproteinkinase,MAPK）和胼胝质;参与抗病反应的防御酶超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）、过氧化物酶（Peroxidase,POD）以及多酚氧化酶（Polyphenol oxidase,POL）;参与系统获得抗性（Systemic acquired resistance,SAR）反应的病程相关蛋白（pathogenesis-relatedprotein,PR）PR-10、几丁质酶;植物处于逆境胁迫下产生的应急代谢物海藻糖（trehalose）,以及参与茉莉酸合成过程中的脂肪氧合酶（Lipoxygenase,LOX）。说明FTX271不仅能增强转基因烟草自身的免疫,促进抗病防御酶的表达,还能诱导产生SAR反应,同时也能诱导茉莉酸激素通路中关键蛋白LOX的上调表达,提高转基因植物的免疫能力。另外,利用KEGG通路对差异蛋白进行分析发现,亚麻酸通路上调明显,而亚麻酸作为茉莉酸（Jasmonicacid,JA）合成的前体物质,在植物的生长发育,抵抗生物胁迫和非生物胁迫中起着重要作用,推测FTX271蛋白能促进茉莉酸通路的表达,加强植物自身的防御能力。将植物瞬时表达载体p35s-30B-GFP分别侵染野生型和转基因本氏烟T1代发现,绿色荧光蛋白（Greenfluorescentprotein,GFP）在野生型本氏烟中在第3天明显表达,第3-8天表达逐渐增强,第8天能在新生的叶片和叶柄中明显观察到,说明TMV在第8天完成系统侵染。而在转基因烟草中,表达载体在第3天表达不明显,侵染后的第5天才明显观察到荧光,第5-8天表达量逐渐增强,且在第11天能在新叶和叶柄中观察到明显的荧光,TMV在转基因烟草中第11天完成系统侵染。说明转基因烟草能延缓TMV在植株中的表达和扩散,更进一步说明FTX271能增强转基因烟草的防御能力。利用TMV的瞬时表达系统同时侵染转基因型和野生型烟草,在侵染的第8天采样进行蛋白质组学分析。蛋白定量结果同样也检测到了 FTX271的表达。结合蛋白质组学通路分析发现,转基因烟草有11条通路发生显着变化,其中在上调表达通路内质网蛋白加工中,定量到了 class I sHSP和class II sHSP的上调表达。小热休克蛋白（small heat shock proteins,sHSP）是一类主要行使分子伴侣功能的蛋白,其能在逆境胁迫下协助蛋白复性,稳定蛋白的功能,提高植物的抗胁迫能力,推测FTX271蛋白能促进sHSP的表达上调,而这种上调可能与转基因烟草的抗TMV能力提高有关。另外,我们还发现光合作用通路下调表达,其中与电子传递链有关的oxygen-evolving enhancer protein 3-1蛋白和参与了 PS I反应中心复合体的构成photosystem I P700 apoprotein A1蛋白的下调表达显着,推测在感染TMV的第8天,转基因烟草可能通过激活sHSP通路来增强植株抗病能力,以此补偿TMV对光合作用的影响。本实验结合转基因技术与蛋白质组学,成功获得转FTX271基因的本氏烟,为研究FTX271抑制病毒机理建立平台。利用转基因本氏烟发现FTX271在没有病毒侵染时就能激活本氏烟的诱导抗性,增强转基因的抗逆性。另外,利用TMV的瞬时侵染后发现症状明显减缓而且推迟。蛋白质组学分析表明这种减缓和推迟TMV表达可能与sHSP的上调表达有关,sHSP可能参与修复了由TMV引起的与光合作用相关酶的活性,最终使得转基因植株在TMV侵染后花叶症状减轻。本次实验的蛋白质组学结果为探寻转基因对植物生长以及抗病性的影响提供理论依据。另外,转FTX271基因烟草的成功培育为烟草抗病品种的选育、病害防治奠定了重要的理论基础。
孙鸿瑜[3]（2020）在《大豆NL（G12g132200）基因的抗病毒作用机制研究》文中指出在植物抵御外界病原体入侵的防御反应中,植物抗性基因（Resistance gene,R）起着至关重要的作用。大部分R基因属于核苷酸结合位点-富含亮氨酸重复结构域（Nucleotide Binding Site and Leucine Rich Repeat domains,NBSLRR）类基因家族。NBS-LRR类抗病蛋白能够特异性地识别病毒因子,从而激活效应因子触发的植物免疫反应。在实验室前期工作中,我们从大豆中筛选到了一条对烟草花叶病毒（Tobacco Mosaic Virus,TMV）及大豆花叶病毒（Soybean Mosaic Virus,SMV）均具有抗性的基因,根据其在染色体上的位置及其结构我们将其命名为NL（G12g132200）。NL（G12g132200）的基因组DNA,即gDNA对病毒具有抗性,而其cDNA的作用尚不明确。本论文中,首先我们克隆了NL（G12g132200）基因的启动子并分析了其表达特性,1 mM的水杨酸（Salicylic acid,SA）处理及TMV的侵染诱导了该启动子,而SMV的侵染没有作用。通过不同长度的四种启动子诱导表达实验我们也找到了该基因受诱导的可能的未知功能顺式作用元件。NL（G12g132200）基因及调控其转录的ERF类转录因子基因的表达在大豆中受SMV侵染所抑制,暗示其在大豆-SMV互作中起着重要作用。由于无法直接克隆得到NL（G12g132200）基因的cDNA,我们利用酵母内源性同源重组系统得到了NL（G12g132200）基因ORF序列对应的cDNA并构建了两种过表达载体。NL（G12g132200）基因cDNA的瞬时表达对TMV和SMV仅具有部分抗性。NL（G12g132200）是N末端具有TIR结构域的TIR-NBS-LRR类抗病蛋白。为了明确这些结构域的功能,我们将其分为五个截段基因（TIR、NBS、LRR、TIR+NBS及NBS+LRR）以检测对病毒的抗性。结果表明无论是单独的结构域还是按序两两组合的结构域均完全丧失了对TMV及SMV的抗性,即三个结构域对其抗病毒活性而言都是缺一不可的。有趣的是,NL（G12g132200）的基因组DNA,即gDNA相比其cDNA对病毒更具抗性。有些内含子的存在能够有效提高基因的表达,这种现象称之为内含子介导的增强（Intron-Mediated Enhancement,IME）。NL（G12g132200）的gDNA上有四个内含子。为了探究上述实验结果是否与IME相关,我们利用含荧光素酶报告基因的过表达载体以筛选能起到关键作用的内含子。通过荧光素酶报告系统检测发现,插入了NL（G12g132200）各内含子的报告基因未能正常表达,因此NL（G12g132200）基因内含子对其表达的增强作用有待进一步研究。检测到包含内含子2的报告基因在转录水平的表达量上调,表明内含子2可能是在转录水平上具有IME作用的内含子。我们也构建了研究NL（G12g132200）基因内含子在转录和翻译水平上调控的各种表达载体。对NL（G12g132200）基因抗TMV及SMV作用机制的深入探索将对大豆-SMV互作研究具有重要意义。
赵光远[4]（2020）在《番木瓜畸形花叶病毒在寄主基因功能鉴定及交叉保护中的应用》文中研究指明番木瓜（Carica papaya L.）是一种广受人们喜爱的水果和重要的热带经济作物,但番木瓜果树自身抗病毒力较弱,很容易受到病毒的侵害,其中番木瓜畸形花叶病毒（Papaya leaf distortion mosaic virus,PLDMV）是一种新的威胁番木瓜种植业的病毒病害,近年来发病率逐年递增,已成为继木瓜环斑病毒（Papaya ringspot virus,PRSV）为害最严重的病毒病害。目前,PLDMV在栽培技术上如PRSV一样也很难通过化学防治的方法予以防控。所以,急需寻找到一种更为安全且广谱的抗病毒新策略。而这种抗病毒新策略的获得需要在PLDMV致病机理、PLDMV弱毒株“植物疫苗”及基因功能鉴定等方面取得一定的工作积累。本研究就是基于这些关键技术环节开展了系列的研究,以期为开辟安全广谱的抗PLDMV新策略奠定良好的理论和技术基础。开展上述这些研究工作,都会涉及植物病毒表达载体构建的关键环节,这是研究植物病毒的基础,也是最为关键的内容之一。由于许多植物病毒基因组较大,且会在大肠杆菌体内产生毒性,所以带有病毒全长表达载体的构建一直是研究工作的难点。本研究通过将病毒全长分段扩增,然后利用在体外进行Gibson拼接后直接转化农杆菌的方法,能快速、高效、稳定的构建病毒侵染性克隆,相对于传统的体外转录或者酵母同源重组的方法成功率更高、时间更节省而且成本相对较低,本研究获得的植物病毒表达载体构建方法有利于有效开展后续的科研工作。因此,本研究利用这种新方法构建了多种PLDMV病毒表达载体,并开展了如下科研工作:一.构建含有荧光标签的PLDMV表达载体并初步探索了番木瓜的基因沉默系统。本研究对感染了PLDMV-GFP的番木瓜植株进行病毒来源的Small RNA高通量测序分析。综合Vsi RNAs丰度、分布热点、类别、长度和碱基偏好性等特性方面的差异,分析所获得的数据和结果,从RNA沉默的角度初步探究番木瓜RNA沉默系统及病毒侵染机制,预测了Vsi RNAs靶基因序列,并对沉默系统中的关键基因进行了验证,所获得的结果为深入研究病毒的致病机理和制定抗病毒新策略的奠定了理论基础,同时为抗病毒病害育种技术的发展提供参考和指导。二.利用点突变技术构建突变体弱毒株并验证了其交叉保护效果及原理。使用弱毒株“植物疫苗”对番木瓜植株进行交叉保护是一种较为高效广谱的绿色病毒防控技术。本研究基于交叉保护的原理,利用点突变技术对PLDMV的致病关键区域HC-Pro中的两个保守区域KITC和FRNK进行了突变,构建了三种突变体弱毒株PLDMV-E、PLDMV-I、PLDMV-EI,并通过攻毒实验对所构建的弱毒株进行了验证,其中双位点突变弱毒株PLDMV-EI能在进行交叉保护的60天内未产生明显症状且对强毒株系保护效果明显,有望成为一种温和有效且对环境友好的交叉保护突变体弱毒株疫苗。通过大田试验进一步验证其在自然界中对PLDMV病毒的保护效果,经统计分析PLDMV-EI突变体弱毒株的相对防控效率达到70.94%。PLDMV突变体弱毒株的构建为获得番木瓜病毒防控新方法和新策略奠定了良好的基础。三.建立了番木瓜VIGS基因功能鉴定平台并测定其CYP83B1基因功能。一种对寄主温和不产生明显症状的弱毒株是构建VIGS（Virus Induced Gene Silencing,病毒诱导的基因沉默）基因功能鉴定载体的良好材料。本研究利用PLDMV-E突变体弱毒株构建了PLDMV-VIGS载体,很大程度上避免了植物病症对沉默表型的干扰。通过对NIb蛋白与CP蛋白之间插入指示基因PDS和Chl H的PLDMV-VIGS载体进行实验,验证了不同插入片段长度与环境温度对VIGS载体沉默效率的影响,建立了PLDMV-VIGS番木瓜基因功能鉴定平台。并以此平台测定番木瓜CYP83B1基因功能,利用表征判断、q RT-PCR以及高效液相色谱等方法,成功分析番木瓜CYP83B1基因是苄基葡萄糖硫苷生成途径中的关键基因。PLDMV-VIGS作为一种拥有操作程序简单、运行成本低、分析周期短、同时不需要遗传转化等优势的基因功能鉴定手段,为开展番木瓜功能基因组学研究提供了重要的技术支持,同时更为我国生物学领域占领功能基因组学的制高点提供了一个颇具战略意义的工具。已完成的番木瓜基因组的分析表明,番木瓜基因组是已发现的基因数目最小的显花植物基因组（372 Mb）,且拥有良好的基因转化系统（为全球第一种商业化转基因果树）和较短的生长周期,所以番木瓜具有作为“模式植物”的重大潜力。因此,对番木瓜基因沉默体系的解析具有重要的科学意义。而PLDMV还可侵染葫芦科作物,所以PLDMV弱毒株的构建和PLDMV-VIGS载体沉默平台的建立也为其他葫芦科经济作物的研究打下了坚实的基础。可见,本课题从植物病毒与植物寄主间相关性方面开展了系列研究,这对推动果树学的抗病育种研究具有重要科学意义。
王悦[5]（2020）在《病毒抑制子HCPro诱导生长素合成基因表达的分子机制》文中认为辅助成分蛋白酶（helper component proteinase,HCPro）是一种典型的RNA沉默抑制子。研究表明HCPro在病毒运输、病毒的蚜传以及病毒粒子的复制过程中起重要作用,而且,HCPro能够降低小干扰RNA（small interfering RNA,si RNA）的积累并抑制RNA沉默。生长素是植物生长发育过程中的关键调控因素,病毒侵染影响宿主生长素的积累。然而,病毒诱导生长素积累的分子机制并不清楚。本研究中,我们以拟南芥（Arabidopsis thaliana）为植物材料,p BI121-HCPro作为基因表达载体,采用农杆菌介导的叶片注射法和真空侵染法在拟南芥中表达HCPro。基因表达的检测结果表明我们成功完成了拟南芥中HCPro的瞬时表达。YUC基因家族调控生长素生物合成,调节植物中生长素含量。我们采用半定量RT-PCR在表达HCPro的拟南芥中检测了YUC5基因的表达水平,以侵染空载体的拟南芥作为对照植物。结果表明表达HCPro的拟南芥中YUC5基因的表达水平明显增加,亚硫酸盐测序结果表明YUC5基因启动子区重复序列的DNA甲基化水平显着降低。而且,DNA甲基化酶缺失突变体drm1/2和met1中YUC5基因表达明显增加,表明YUC5基因是Rd DM途径的靶基因,并揭示Rd DM途径在YUC5基因应答病毒及病毒抑制子过程中起重要作用。这些结果证实HCPro能够诱导YUC5基因启动子DNA去甲基化而激活其基因表达。DR5:GUS转基因植物已经被广泛应用,该植物中报告基因GUS的表达能够指示生长素的积累量。我们在DR5:GUS转基因拟南芥中完成了HCPro的瞬时表达和GUS染色。结果显示与用空载体侵染的DR5:GUS转基因拟南芥相比,用携带p35S-HCPro的农杆菌侵染的DR5:GUS转基因拟南芥中GUS表达明显增加。而且,半定量RT-PCR检测结果证实GUS基因的表达水平明显增加。这些结果表明HCPro能够诱导植物中生长素的生物合成和积累。本研究中我们揭示了病毒抑制子HCPro通过诱导YUC5启动子DNA去甲基化而激活生长素生物合成基因的表达,阐明了病毒抑制子HCPro诱导植物生长素积累的分子机制。
马洁雪[6]（2020）在《抑制内源蛋白酶水解作用对重组rPA在植物中积累的影响》文中研究指明植物生物反应器被认为是最经济和最安全的天然生物反应器。通过植物作为反应器来生产外源蛋白的植物病毒表达系统,是目前极具有发展潜力的新型平台。内源蛋白酶胞内水解外源重组蛋白致使其终产物积累量低是平台向商业化迈进的“瓶颈”问题。抑制重组蛋白胞内降解相关蛋白酶是打破桎梏的关键。前人研究表明,特定的保护性标签能够提高外源重组融合蛋白在胞内的积累,共表达蛋白酶抑制剂（Protease inhibitors,PIs）可以原位保护重组蛋白。基于此,我们以rPA为研究对象,从保护性标签和共表达PIs两方面入手开展研究。通过构建不同类型保护性标签与rPA融合的病毒表达载体,对重组融合蛋白在接种叶片中的表达情况进行分析,探索保护性标签对重组蛋白在植物中积累的影响;通过构建蛋白酶抑制剂植物二元表达载体,与病毒表达载体共接种,探索共表达蛋白酶抑制剂对重组蛋白在植物中积累的影响。主要研究结果与结论如下:（1）HFB标签融合表达策略未能在受体植物本氏烟叶片中检测到稳定表达。推测认为,HFB标签在外源基因表达中的作用可能受与其融合的外源基因种类的影响,HFB标签与rPA间可能存在着“不相容性”。（2）ELP标签并未能有效的提高和保护与其融合的重组rPA的胞内积累。考虑到ELP标签长度对其融合蛋白的保护作用存在着一定程度的相关性,推测实验中使用的ELP30标签可能不是重组rPA的最适标签“伴侣”,适用于rPA的ELP标签需要进一步的实验筛选。（3）Zera标签在一定程度上提高了与其融合的rPA蛋白表达量。由于提取过程中需要加入还原剂才能从不溶态微粒转变为可溶形式,因而建议在实际应用应采用谨慎态度对待。（4）在非复制型病毒载体与PIs组成的共表达体系中,3种供试的PIs（SlCYS8,NbPR4和HsTIMP）均对内质网或者胞外表达的重组rPA积累具有显着的竞争抑制效应,PIs共表达竞争抑制效应具有一定程度的普遍性。PIs共表达竞争抑制效应的程度高,推测竞争抑制掩盖了 PIs对外源重组蛋白的原位保护作用,致使观察到的重组蛋白积累量低于其正常时的积累水平。（5）PIs共表达所产生的竞争抑制效应与PIs丰度直接相关,竞争抑制效应随着PIs丰-度的下降而减弱。通过体外改变共接种混合菌液中PIs的接种比例,可以在一定程度上缓解竞争抑制效应程度,进而有限度地提高共表达外源重组蛋白的积累。（6）在复制型病毒与PIs组成的共表达体系中,重组rPA的积累未受到明显的抑制且重组rPA在内质网中的积累与PIs接种浓度呈现正相关关系,表明通过病毒复制在体内下调PIs相对丰度可以有效弱化竞争抑制效应。3种PIs对外源重组蛋白的积累提高了 3-12倍,说明共表达复制型病毒载体策略具有一定的实际应用潜力和价值,为PIs合理使用提供了新的思路。相关研究结果为解决植物病毒表达平台商业化进程中所面临“瓶颈”背后的关键共性问题提供了参考,为推动植物病毒表达系统的商业化进程奠定理论和实践基础。
郭炎[7]（2019）在《大豆花叶病毒介导的大豆生物反应器构建及抗除草剂蛋白表达的研究》文中研究说明植物生物反应器是最经济的生物反应器,能够为外源蛋白的表达提供安全的生产体系和完整的真核蛋白质修饰场所;然而,该系统却存在实验周期较长,外源蛋白的表达水平较低等问题;通过利用病毒载体来介导植物生物反应器,可以缩短实验周期,提高外源蛋白的表达量。大豆花叶病毒（Soybean Mosaic Virus,SMV）广泛分布于世界各地,由于对该病毒的研究主要集中在基因功能分析及抗病育种方面,在以SMV为载体介导植物生物反应器的方面,相关研究却相对较少。本实验室前期对大豆花叶病毒东北3号株系进行了全基因测序,并构建了该毒株的侵染性克隆,在此基础上,我们对大豆花叶病毒东北3号株系的全基因组侵染性克隆（SMV3）进行了改造,减弱其致病性而又不影响其侵染力的同时为了便于目的基因的插入和相应融合蛋白的表达,又利用融合PCR在SMV3基因组中插入限制性酶切位点AvrⅡ和大豆花叶病毒蛋白酶切位点ESVSLQ/S,从而构建了本试验中所用的介导大豆植物生物反应器的重组载体SMV3-2;此外,由于Bar基因（Bialaphos Resistance Gene,Bar）是常用的选择标记基因之一,由该基因编码的PAT蛋白具有良好的除草剂抗性,可用于后续试验的检测,所以本试验利用构建的SMV3-2载体携带Bar基因,形成SMV3-2-bar重组病毒,并将其转化至大豆植株体内。通过RT-PCR、ELISA及Western-blot检测方法,分别对目的基因及相应蛋白的表达进行检测,结果表明SMV3-2-bar重组病毒已成功转入大豆植株体内,并表达了PAT蛋白;通过对PAT蛋白表达趋势进行分析发现,在转化后的第六周,表达量最高;对其进行的生物学测定试验结果表明,PAT蛋白可以较好的发挥抗除草剂特性;同时,稳定性相对较好综上所述,本试验通过构建大豆花叶病毒载体并对其介导的大豆植物生物反应器进行了初步的探索,对其功能进行验证并分析其稳定性。结果表明,该系统可以完整的表达目的蛋白,且稳定性较好。本试验结果也将为基因功能研究和新型植物生物反应器的研究奠定基础。
张合红[8]（2019）在《水稻黑条矮缩病毒P10蛋白及油菜素内酯和生长素途径调控水稻应答病毒侵染机制的研究》文中研究指明水稻黑条矮缩病毒（Rice RBSDV）及水稻条纹病毒（Rice stripe virus,RSV）是目前水稻中危害较重的两种病毒。前期研究发现水稻中表达RBSDV P10外壳蛋白能够增强水稻对RBSDV和南方水稻黑条矮缩病毒（SRBSDV）的抗性,但关于RBSDV P10在与RBSDV亲缘关系较远的纤细病毒属RSV侵染过程中的作用还没有相关研究。本研究运用R13SDV P10表达的转基因水稻（OEP10）研究P10蛋白在RSV侵染过程中的作用。还通过水稻相关突变体及外源性激素处理研究油菜素内酯（brassinosteroids,BR）和生长素（Auxin）途径在RBSDV侵染过程中的作用机制。主要研究结果如下:1.室内人工接种病毒实验表明OEP10转基因水稻对RSV侵染的抗性减弱。同时,通过RBSDV与RSV复合侵染实验发现,在复合侵染中两种病毒含量多少与病毒的侵染顺序有关。转录组分析及qRT-PCR验证结果表明表达P10会影响植物与病原菌互作的水杨酸（Salicylic acid,SA）及茉莉酸（Jasmonic acid,JA）途径中与防卫反应相关基因显着下调表达。这些差异变化可能导致OEP10转基因对RSV侵染更敏感。此外,P10转基因中与BR,细胞分裂素及生长素途径相关基因也发生显着性差异变化。2.RBSDV侵染后水稻对外源BL处理更加敏感。BR途径抑制突变体（RI90B和dlt）对RBSDV侵染的抗性增强。转录组分析及qRT-PCR验证结果显示JA和SA途径相关基因及其介导的PR在病毒侵染后显着性上调表达,然而感病dlt突变体中这些基因的上调水平显着性高于感病对照ZH11。以上结果表明BR途径拮抗JA/SA途径应答RBSDV侵染。3.转录组分析结果发现,病毒侵染后,dlt突变体中与过氧化物酶体途径相关的基因显着性上调表达。通过过氧化物酶活性测定及NBT染色,显示BR途径抑制突变体（dlt,RI90B）能显着激活OsPrx以及ROS的积累。SHAM（过氧化物酶抑制剂）处理dlt及RI90B,OsPrx的活性及ROS积累量与对照相比未发生显着性变化。SHAM处理会增强BR途径抑制突变体对RBSDV的敏感性。此外,外源BL处理抑制OsPrx相关基因表达。BR途径关键转录因子OsBZR1能够直接结合OsPrx的启动子来调节基因的表达。以上结果表明BR途径通过转录因子BZR1转录抑制OsPrx基因的表达从而负调控水稻防御病毒侵染。4.RBSDV侵染后,检测生长素途径相关基因的变化,发现生长素信号途径被显着抑制。生长素信号途径抑制突变体（35S:miR393a、OsIAA20和OsIAA31）对RBSDV侵染的抗性减弱。qRT-PCR检测发现RBSDV侵染水稻后,感病生长素信号突变体中JA途径相关基因显着性低于感病对照。上述研究结果表明JA途径的激活可能作为生长素途径介导的对RBSDV抗性的一部分。5.ROS合成关键基因OsRboh（B,D）及其积累量在生长素途径抑制突变体中受到抑制。外源生长素类似物2,4-D、NAA处理正常水稻后,OsRboh（B,D）基因被显着激活,NBT染色显示生长素途径正调控OsRboh介导的ROS的积累。RBOH活性抑制剂DPI处理后水稻发病症状及病毒含量都显着增加。以上结果表明OsRboh介导的ROS途径可能作为生长素途径介导的对RBSDV抗性的一部分。综上所述,OEP10转基因水稻易感RSV,这可能与其体内SA、JA、BR和生长素等途径中与抗RSV相关防卫反应基因的差异表达有关。BR途径拮抗JA、SA和ROS抗病途径从而负调控水稻防御RBSDV的侵染。生长素信号途径则协同JA和ROS抗病途径从而正调控水稻防御病毒侵染。
马婷[9]（2016）在《重组Reteplase植物病毒载体表达系统的优化》文中研究表明Reteplase（瑞替普酶）是临床上治疗血栓性疾病的代表性药物。当前商品化的Reteplase存在生产成本高、价格昂贵等问题,探索和研究新型、高效的表达系统是解决这一问题的关键。实验室前期尝试利用烟草花叶病毒（Tobacco Mosaic Virus,TMV）载体表达系统和HFBI表达技术在烟草中表达Reteplase,但是产物的表达积累量较低。推测信号肽和密码子优化等两个因素是造成表达量低的可能原因。鉴于此,本研究从信号肽置换和密码子优化结果筛选等两个方面入手,明确不同来源信号肽和密码子优化结果对重组Reteplase在植物中表达作用；同时结合病毒编码的RNA沉默抑制子的作用特点,进一步优化了Reteplase植物病毒表达体系并探明其在植物中表达的时间变化规律；进而建立了重组瑞替普酶的下游纯化技术,对其纯化产物进行相关理化和生物学特性分析。在表达系统优化过程中,首先用生物信息学软件SignalP 4.1对不同来源信号肽进行评价。设计并利用体外基因合成和亚克隆技术构建了2个Reteplase病毒表达载体,农杆菌渗滤法接种寄主植物本氏烟（N. benthamiana）后,对重组Reteplase在植物中的表达情况进行分析。结果显示,“植物源”Prlb基因信号肽介导的重组Reteplase表达效率明显高于Reteplase基因“天然”信号肽介导的表达效率。其次,利用GeneOptimizer（?）程序分别按N. benthamiana和N. tabacum密码子使用频率对Reteplase编码基因的密码子进行了优化设计,并利用NetGene2软件对密码子优化后的基因序列进行了再评价。在此基础上,分别构建了相应的3个Reteplase病毒表达载体。接种植物后的结果分析显示,在不同接种浓度下,优化后序列的Reteplase表达效率明显得优于未优化的序列,因而密码子的优化是提高其表达水平的不可或缺的一步。第三,共接种烟草蚀纹病毒（Tobacco etch virus, TEV）编码的RNA沉默抑制子（RNA Silencing Suppressors, RSSs） HC-Pro可以有效的提高重组Reteplase在植物中的表达水平。共表达后的TMV病毒Reteplase表达系统最大表达量约为12.5μg/g鲜叶,最佳收取时间是接种后第9d左右。初步证明利用植物作为生物反应器表达重组Reteplase是可行性的。第四,在实验过程中发现,在烟草叶片上接种Reteplase的部位会有不同程度的坏死症状,而在空载体农杆菌对照和表达报告基因GFP的病毒表达载体的接种部位则未观察到坏死现象,且坏死症状的严重程度与重组Reteplase的表达量具有一定的正相关关系。初步推测,重组Reteplase对烟草植物细胞可能存在有细胞毒性,且细胞毒性与重组Reteplase在植物中的表达量有关系。在利用Strep Ⅱ标签技术纯化Reteplase的研究过程中发现,重组Reteplase在胞外的表达效率显着低于在内质网中的表达。此外,Strep Ⅱ标签位置对重组Reteplase在烟草中的表达效率也存在显着的影响。在结合缓冲液中加入Avdin会有效地抑制植物内源性生物素对Strep II标签技术纯化造成的影响,进而提高重组Reteplase与亲和介质的结合效率。纯化的重组Reteplase样品经过SDS-PAGE和Western blots检测发现存在着“多带现象”,实验证明多余条带是重组Reteplase自身蛋白酶识别位点断裂后的产物。纯化产物的理化性质研究表明,纯化的重组Reteplase产物分子量为45.0 kD左右,其分子量略大于原核表达的非糖基化Reteplase标准样品（39.0 kD）。糖基化实验证明,分子量差异是由于Reteplase自身存在的2个糖基化位点所致。体外生物学活性结果显示,纯化的重组Reteplase可以产生明显的溶圈现象。结果表明,烟草中表达的重组Reteplase具有一定的生物学活性且其活性与原核表达系统表达的商品化Reteplase的生物学活性基本一致,证实利用植物病毒载体表达系统在烟草中表达重组Reteplase具有一定程度的可行性,同时为进一步提高重组Reteplase在植物表达系统中的表达奠定了基础。
马婷,张西倩,丁向真,李志英,王盛[10]（2016）在《聚合酶Ⅱ转录的sRNA与RNA沉默抑制子对TMV病毒载体表达系统作用的比较》文中研究表明聚合酶Ⅱ介导合成的外源短链RNA（short RNA,s RNA）可以竞争性地抑制内源m RNA的核质转运,推测共表达s RNA可以间接地提高病毒载体表达系统的表达效率。为了验证这一假说和评价其应用潜能,本研究采用基因体外合成技术和亚克隆技术,分别构建了聚合酶Ⅱ转录的拟南芥U6-1 RNA和黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus,CMV）编码的RNA沉默抑制子（RNA silencing suppressors,RSSs）2b的植物表达载体。以农杆菌渗滤技术,与烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus,TMV）表达载体共接种寄主植物本氏烟（Nicotiana benthamiana）,通过对报告基因绿色荧光蛋白（green fluorescence protein,GFP）的荧光观察,并以Western blot和酶联免疫吸附测定法（enzyme-linked immunosorbnent assay,ELISA）测定GFP在烟草中的表达情况,分析s RNA对植物病毒载体表达系统的作用和可能的作用机制。同时通过与RSSs比较,评价s RNA在植物生物反应器中的应用潜能。实验结果表明,聚合酶Ⅱ转录的s RNA能有效地提高TMV病毒载体介导的外源基因在植物中的表达（GFP表达量比对照组高约2.5倍）,而且能够显着地降低TMV诱导的病程相关蛋白2（Pathogenesis-related protein 2,PR2）在细胞内的积累水平（PR2表达量比对照组下降约8倍）。推测Ⅱ型启动子转录的s RNA通过竞争性地抑制宿主抵御病毒入侵相关蛋白合成的m RNA核质运转促进病毒RNA介导的外源基因在植物中的表达。此外,Ⅱ型启动子转录的s RNA的作用效果与CMV病毒编码的RNA沉默抑制子2b相当。研究结果为提高病毒载体介导的外源基因在植物中的表达提供了一条可供借鉴的思路。
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 植物防御机制概述 |
| 1.2 WRKY转录因子 |
| 1.2.1 WRKY转录因子的结构特点 |
| 1.2.2 WRKY转录因子基因的表达模式 |
| 1.2.3 WRKY调控植物的生长发育及防卫反应 |
| 1.3 茉莉酸信号途径 |
| 1.3.1 茉莉酸信号途径概述 |
| 1.3.2 茉莉酸信号途径调控植物的生长发育以及对非生物和生物胁迫的反应 |
| 1.4 WRKY转录因子与激素信号共同调节植物的防御反应 |
| 1.5 三七根腐病的危害及研究现状 |
| 1.5.1 三七根腐病的危害 |
| 1.5.2 三七根腐病的研究现状 |
| 1.6 本课题的研究目的与意义 |
| 1.7 技术路线 |
| 第二章 三七WRKY转录因子基因家族的克隆及表达特性分析 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与试剂 |
| 2.2.1 主要材料 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 植物材料及处理 |
| 2.3.2 RNA的提取 |
| 2.3.3 转录组测序 |
| 2.3.4 三七cDNA的合成 |
| 2.3.5 三七WRKY基因的克隆 |
| 2.3.6 生物信息学分析 |
| 2.3.7 qRT-PCR |
| 2.4 结果 |
| 2.4.1 三七WRKY基因的克隆及生物信息学分析 |
| 2.4.2 三七WRKY基因协同JA途径参与对茄腐镰刀菌的防卫反应 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 三七PnWRKY9基因的功能及转录调控机制分析 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与试剂 |
| 3.2.1 主要材料 |
| 3.2.2 主要试剂 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 PnWRKY9蛋白序列分析 |
| 3.3.2 亚细胞定位分析 |
| 3.3.2.1 PnWRKY9的ORF扩增 |
| 3.3.2.2 构建PnWRKY9-GFP融合表达载体 |
| 3.3.2.3 融合表达载体在洋葱表皮细胞中的定位分析 |
| 3.3.3 PnWRKY9转基因烟草的产生及分析 |
| 3.3.3.1 植物超表达载体的构建 |
| 3.3.3.2 超表达载体转化农杆菌LBA4404感受态并浸染烟草 |
| 3.3.3.3 转基因烟草的产生及筛选 |
| 3.3.3.4 PnWRKY9转基因烟草分析 |
| 3.3.4 RNAi |
| 3.3.4.1 RNAi载体的构建 |
| 3.3.4.2 RNAi载体在三七叶片中的瞬时表达及分析 |
| 3.3.5 PPnDEFL1启动子的克隆及分析 |
| 3.3.6 原核表达及凝胶阻滞分析 |
| 3.3.6.1 构建pET-32a-PnWRK9表达载体 |
| 3.3.6.2 外源蛋白的诱导及纯化 |
| 3.3.6.3 EMSA实验 |
| 3.3.7 酵母单杂交 |
| 3.3.7.1 启动子诱饵载体构建 |
| 3.3.7.2 猎物载体的构建 |
| 3.3.7.3 诱饵载体和猎物载体转化酵母感受态 |
| 3.3.7.4 .验证反式激活特性 |
| 3.3.8 PnWRKY9与PPnDEFL1启动子的互作分析 |
| 3.3.8.1 构建pBI121-PPnDEFL1重组载体 |
| 3.3.8.2 启动子转化PnWRKY9转基因烟草 |
| 3.3.8.3 共表达转基因烟草的获得及分析 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 PnWRKY9蛋白序列分析 |
| 3.4.2 PnWRKY9蛋白是细胞核定位蛋白 |
| 3.4.3 PnWRKY9转基因烟草对茄腐镰刀菌的抗性增强 |
| 3.4.4 PnWRKY9RNAi片段表达的三七增强了对茄腐镰刀菌的敏感性 |
| 3.4.5 三七防御素基因的启动子克隆及顺式作用元件分析 |
| 3.4.6 PnWRKY9蛋白能专一性结合W-box |
| 3.4.7 PnWRKY9激活PnDEFL1的转录 |
| 3.4.8 PPnDEFL1与PnWRKY9在烟草中共表达 |
| 3.4.9 共表达转基因烟草的GUS活性显着增强 |
| 3.5 讨论 |
| 3.5.1 PnWRKY9蛋白的特殊结构和亚细胞定位决定其特定的功能 |
| 3.5.2 反向遗传学技术验证了PnWRKY9正调控对茄腐镰刀菌的防卫反应 |
| 3.5.3 PnWRKY9通过W-box与顺势作用元件结合发挥转录激活作用 |
| 3.5.4 PnWRKY9结合PPnDEFL1启动子序列,正调控PnDEFL1的表达从而参与对茄腐镰刀菌的防卫反应 |
| 第四章 结论与展望 |
| 4.1 结论 |
| 4.2 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录A 主要材料来源 |
| 附录B PnDEFL1基因序列 |
| 附录C PPnDEFL1启动子序列 |
| 附录D 攻读硕士学位期间发表的论文 |
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 前言 |
| 1.1 烟草花叶病毒 |
| 1.1.1 生物学特性 |
| 1.1.2 TMV的症状、危害及传播 |
| 1.2 生物源抗TMV活性物质 |
| 1.2.1 植物源抗TMV物质 |
| 1.2.2 微生物源抗TMV物质 |
| 1.2.2.1 真菌源抗TMV活性物质研究 |
| 1.2.2.2 细菌源抗TMV活性物质研究 |
| 1.2.2.3 放线菌源抗TMV活性物质研究 |
| 1.3 抗TMV植物转基因的研究现状 |
| 1.4 农杆菌介导的植物转基因 |
| 1.4.1 植物的稳定遗传转化系统 |
| 1.4.2 植物的瞬时遗传转化系统 |
| 1.5 多组学的应用与发展 |
| 1.6 FTX271的研究概况 |
| 1.7 研究目标和意义 |
| 1.7.1 研究目标 |
| 1.7.2 研究内容 |
| 1.7.3 实验技术路线 |
| 1.7.4 研究意义 |
| 第2章 FTX271基因的表达载体构建及检测 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株、质粒 |
| 2.1.2 生物化学试剂 |
| 2.1.3 引物设计软件及序列比对资源 |
| 2.1.4 实验仪器 |
| 2.1.5 实验试剂的配制 |
| 2.1.5.1 培养基 |
| 2.1.5.2 感受态细胞制备所用试剂 |
| 2.1.5.3 电泳缓冲液 |
| 2.1.6 引物 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 金针菇总RNA提取 |
| 2.2.2 RT-PCR扩增FTX271基因 |
| 2.2.2.1 FTX271基因的cDNA第一条链合成 |
| 2.2.2.2 FTX271基因的PCR扩增 |
| 2.2.3 PCR产物的电泳检测及产物纯化 |
| 2.2.4 DNA片段的凝胶回收 |
| 2.2.5 FTX271基因克隆载体的构建 |
| 2.2.6 大肠杆菌的感受态细胞制备 |
| 2.2.7 重组质粒的转化 |
| 2.2.8 重组质粒的菌液PCR鉴定 |
| 2.2.9 基因克隆产物的序列鉴定 |
| 2.2.10 pROKⅡ质粒转化实验 |
| 2.2.11 pROKⅡ质粒提取 |
| 2.2.12 FTX271基因和pROKⅡ质粒的载体构建 |
| 2.2.13 农杆菌GV3101的感受态细胞制备 |
| 2.2.14 农杆菌的转化试验 |
| 2.2.15 重组表达载体的菌液PCR鉴定 |
| 2.2.16 基因克隆产物的序列鉴定 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 FTX271基因的cDNA序列PCR扩增结果 |
| 2.3.2 重组质粒pUC-T-FTX271的菌液PCR鉴定结果 |
| 2.3.3 克隆阳性菌株的DNA测序结果 |
| 2.3.4 转基因载体热击转化农杆菌GV3101 |
| 2.4 分析和小结 |
| 第3章 转FTX271基因烟草的构建 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验种子 |
| 3.1.2 主要仪器与设备 |
| 3.1.3 生物化学试剂 |
| 3.1.4 组培培养基的配制 |
| 3.1.5 植物激素的配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 烟草叶盘法 |
| 3.2.1.1 预分化 |
| 3.2.1.2 共培养 |
| 3.2.1.3 选择培养 |
| 3.2.1.4 生根培养 |
| 3.2.2 转基因烟草的阳性检测 |
| 3.2.2.1 转基因烟草核酸提取 |
| 3.2.2.2 转基因烟草的RT-PCR检测 |
| 3.2.3.3 RT-PCR产物纯化及测序 |
| 3.2.3 转基因烟草的传代 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 叶盘法转化烟草 |
| 3.3.2 转基因烟草的阳性检测 |
| 3.3.3 转基因烟草的传代 |
| 3.4 分析与小结 |
| 第4章 转基因烟草的蛋白质组学分析 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验植物材料 |
| 4.1.2 主要实验试剂 |
| 4.1.3 蛋白质组学分析生物信息软件及参考数据库 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 烟草叶片总蛋白的提取 |
| 4.2.2 胰酶酶解 |
| 4.2.3 质谱分析 |
| 4.2.4 数据库搜索 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 蛋白定量及差异蛋白的筛选 |
| 4.3.2 样品重复性检验 |
| 4.3.3 所有鉴定到的肽段长度分布 |
| 4.3.4 差异表达蛋白的基因本体分析 |
| 4.3.5 差异表达蛋白的亚细胞结构定位 |
| 4.3.6 差异表达蛋白的KEGG通路分析 |
| 4.4 分析与小结 |
| 第5章 野生型与转基因烟草瞬时表达TMV及蛋白质组学分析 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 菌株、植物种子 |
| 5.1.2 实验试剂 |
| 5.1.3 实验仪器 |
| 5.1.4 蛋白质组学分析生物信息软件及参考数据库 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 农杆菌EHA105-p35S-30B-GFP接种野生型烟草 |
| 5.2.2 农杆菌EHA105-p35S-30B-GFP接种转基因烟草 |
| 5.2.3 烟草植株中GFP的表达情况 |
| 5.2.4 瞬时表达TMV后的蛋白质组学分析 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 烟草植株中GFP表达情况 |
| 5.3.2 TMV侵染烟草的蛋白质组学分析 |
| 5.3.2.1 差异表达蛋白的标准化分析 |
| 5.3.2.2 差异表达蛋白的GSEA分析 |
| 5.4 分析与小结 |
| 第6章 实验总结 |
| 第7章 实验不足与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 一 引言 |
| 1.1 大豆与大豆花叶病毒 |
| 1.2 烟草与烟草花叶病毒 |
| 1.3 植物免疫系统及R蛋白 |
| 1.3.1 植物免疫系统 |
| 1.3.2 植物抗性基因 |
| 1.4 NLR类基因的内含子及选择性剪接 |
| 1.4.1 植物NLR基因的内含子 |
| 1.4.2 NLR基因的选择性剪接 |
| 1.5 植物NLR类基因的表达调控 |
| 1.6 内含子介导的增强效应 |
| 1.6.1 转录水平的调控 |
| 1.6.2 翻译水平的调控 |
| 1.6.3 IME提高外源基因的表达 |
| 二 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验材料及其来源 |
| 2.1.2 实验所用试剂盒及来源 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 大豆基因组DNA的提取 |
| 2.2.2 NL(G12g132200)启动子的扩增 |
| 2.2.3 pBI121-NL(G12g132200)promoter:GUS表达载体的构建 |
| 2.2.4 侵染实验 |
| 2.2.5 SA处理及GUS染色 |
| 2.2.6 NL(G12g132200)基因c DNA的获取 |
| 2.2.7 NL(G12g132200)cDNA表达载体的构建 |
| 2.2.8 pC-LUC-Luciferase-NL(G12g132200)intron载体的构建 |
| 2.2.9 pC-LUC-Luciferase-NL(G12g132200)intron表达检测 |
| 2.2.10 植物总RNA的提取 |
| 2.2.11 cDNA的合成 |
| 2.2.12 qRT-PCR检测基因表达量 |
| 2.2.13 转基因拟南芥植株的获取 |
| 三 实验结果与分析 |
| 3.1 NL(G12g132200)基因启动子的克隆 |
| 3.2 NL(G12g132200)启动子能够响应水杨酸及TMV诱导 |
| 3.3 NL(G12g132200)基因c DNA的获取 |
| 3.4 NL(G12g132200)cDNA对 TMV、SMV呈部分抗性 |
| 3.5 NL(G12g132200)cDNA截段基因过表达载体的构建 |
| 3.6 NL(G12g132200)cDNA截段基因对TMV及 SMV均无抗性 |
| 3.7 IME作用及pC-LUC-Luciferase-NL(G12g132200)intron载体的构建 |
| 3.8 选择pC-LUC-Luciferase-NL(G12g132200)intron正对照的终浓度为0.1 |
| 3.9 NL(G12g132200)内含子IME作用分析 |
| 3.10 pCB301-2μ-HDV-NL(G12g132200)exon+intron组合基因过表达载体的构建 |
| 四 讨论 |
| 全文结果总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1 常用培养基及试剂的配制方法 |
| 附录2 本论文所用引物 |
| 附录3 部分GUS及 GFP荧光强度定量原始数据表 |
| 附录4 载体图谱 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间取得成果 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 一.引言 |
| 1.1 番木瓜畸形花叶病毒 |
| 1.1.1 PLDMV的特点、病征与基因结构 |
| 1.1.2 PLDMV的检测方法 |
| 1.1.3 Potyvirus侵染性克隆的构建及其在大肠杆菌中的不稳定性 |
| 1.2 植物病毒表达载体 |
| 1.2.1 用于外源基因表达 |
| 1.2.2 用于构建弱毒株进行交叉保护 |
| 1.2.3 用于病毒诱导的基因沉默(VIGS)对宿主基因功能鉴定 |
| 1.3 本研究的目的、意义、创新点及主要内容 |
| 1.3.1 本研究的目的及意义 |
| 1.3.2 本研究的主要内容及创新点 |
| 1.3.3 本研究的技术路线 |
| 二.材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料及病毒株 |
| 2.1.2 菌株及载体 |
| 2.1.3 主要试剂及培养基配方 |
| 2.1.4 主要仪器设备 |
| 2.1.5 引物 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 植物总RNA的提取 |
| 2.2.2 RNA纯度及完整性检测 |
| 2.2.3 反转录cDNA第一链的合成 |
| 2.2.4 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR) |
| 2.2.5 琼脂糖凝胶电泳及回收 |
| 2.2.6 DNA测序与数据分析 |
| 2.2.7 Gibson assembly |
| 2.2.8 农杆菌的转化 |
| 2.2.9 转化子阳性克隆鉴定PCR反应 |
| 2.2.10 农杆菌接种液的配置及接种方法 |
| 2.2.11 快速核酸提取方法 |
| 2.2.12 RT-LAMP可视化检测 |
| 2.2.13 q RT-PCR荧光实时定量检测 |
| 2.2.14 叶绿素的提取及含量测定 |
| 2.2.15 苄基硫代葡萄糖苷的提取 |
| 2.2.16 高效液相色谱 |
| 2.3 插入外源报告基因的PLDMV病毒表达载体的构建及应用 |
| 2.3.1 两种含有外源报告基因的PLDMV病毒表达载体的构建 |
| 2.3.2 PLDMV-GFP的接种、侵染效率测定及NGS样品制备 |
| 2.3.3 感病番木瓜植株Vsi RNA的测定及其靶基因的预测分析 |
| 2.3.4 番木瓜基因沉默系统中三种关键基因相对表达量分析 |
| 2.4 三种PLDMV-HC-Pro突变体弱毒株表达载体的构建及应用 |
| 2.4.1 三种PLDMV-HC-Pro突变体弱毒株病毒表达载体的构建 |
| 2.4.2 三种PLDMV-HC-Pro突变体弱毒株交叉保护及攻毒实验 |
| 2.4.3 交叉保护机制验证实验 |
| 2.4.4 PLDMV-EI突变体弱毒株在大田中的相对防效测定 |
| 2.5 PLDMV-VIGS病毒表达载体的构建及应用 |
| 2.5.1 多种PLDMV-VIGS基因功能鉴定载体的构建 |
| 2.5.2 插入片段长度对PLDMV-VIGS基因沉默效果的影响 |
| 2.5.3 不同环境温度对PLDMV-VIGS基因沉默效果的影响 |
| 2.5.4 番木瓜CYP83B1基因功能的鉴定 |
| 三.结果与分析 |
| 3.1 插入外源报告基因的PLDMV病毒表达载体的构建及应用结果 |
| 3.1.1 两种含有外源报告基因的PLDMV病毒表达载体的构建结果 |
| 3.1.2 PLDMV-GFP的侵染效率测定结果 |
| 3.1.3 感病番木瓜病毒来源的siRNA测序结果分析 |
| 3.1.4 番木瓜基因沉默系统中三种关键基因相对表达量分析结果 |
| 3.2 三种PLDMV-HC-Pro突变体弱毒株表达载体的构建及应用结果 |
| 3.2.1 三种PLDMV突变体弱毒株的表达载体构建结果 |
| 3.2.2 三种PLDMV-HC-Pro突变体弱毒株交叉保护及攻毒实验结果 |
| 3.2.3 交叉保护机制验证实验结果 |
| 3.2.4 PLDMV-EI突变体弱毒株在大田中的相对防效测定结果 |
| 3.3 PLDMV-VIGS病毒表达载体的构建及应用结果 |
| 3.3.1 多种PLDMV-VIGS基因功能鉴定载体的构建结果 |
| 3.3.2 插入片段长度对PLDMV-VIGS基因沉默效果的影响分析 |
| 3.3.3 不同环境温度对PLDMV-VIGS基因沉默效果的影响分析 |
| 3.3.4 番木瓜CYP83B1基因功能鉴定结果 |
| 四.讨论 |
| 4.1 一种E.coli-Free快速稳定构建Potyvirus病毒表达载体的新方法 |
| 4.2 一种适用于大田间感病植株可视化检测技术的建立 |
| 4.3 番木瓜基因沉默与防御系统分析 |
| 4.4 多位点突变弱毒株PLDMV致病力的影响及交叉保护效果分析 |
| 4.5 VIGS沉默效果的影响因素 |
| 五.结论 |
| 参考文献 |
| 缩略语表 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 植物基因沉默的研究进展 |
| 1.1.1 植物基因沉默的分子机制 |
| 1.1.2 病毒诱导的基因沉默 |
| 1.1.3 植物DNA甲基化主要途径 |
| 1.2 植物病毒及病毒抑制子 |
| 1.2.1 植物病毒 |
| 1.2.2 病毒抑制子HCPro及其功能 |
| 1.2.3 其他病毒抑制子的功能 |
| 1.3 病毒症状与内源激素有关 |
| 1.3.1 生长素及其生物合成基因调控植物生长发育 |
| 1.3.2 病毒干扰生长素及其信号途径 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 菌种及载体 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.1.4 药品及试剂 |
| 2.1.5 引物序列 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 在拟南芥中瞬时表达外源基因 |
| 2.2.2 GUS染色法分析生长素积累水平 |
| 2.2.3 半定量RT-PCR检测基因的表达 |
| 2.2.4 YUC5 基因启动子区DNA甲基化水平的检测 |
| 第三章 结果与分析 |
| 3.1 利用农杆菌介导法在拟南芥中表达外源基因 |
| 3.1.1 利用叶片注射法在拟南芥中表达外源基因GUS |
| 3.1.2 利用叶片注射法在拟南芥中表达外源基因HCPro |
| 3.1.3 利用真空侵染法在拟南芥中表达外源基因HCPro |
| 3.2 病毒抑制子HCPro诱导生长素积累 |
| 3.2.1 GUS染色法分析生长素含量 |
| 3.2.2 HCPro诱导DR5:GUS转基因拟南芥中GUS基因的表达 |
| 3.3 病毒抑制子HCPro诱导YUC5 基因启动子DNA去甲基化 |
| 3.3.1 病毒抑制子HCPro诱导YUC5 基因表达 |
| 3.3.2 HCPro诱导YUC5 基因启动子DNA去甲基化 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 利用农杆菌介导法瞬时表达外源基因 |
| 4.2 病毒抑制子 HCPro 诱导植物生长素的积累 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读硕士学位期间发表的主要科研成果 |
| 后记 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 中文缩略词表 |
| 1 前言 |
| 1.1 植物中的蛋白酶 |
| 1.2 重组蛋白的胞内降解 |
| 1.3 抑制内源蛋白酶的主要策略 |
| 1.4 研究目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 载体构建 |
| 2.2.2 重组质粒的农杆菌转化 |
| 2.2.3 重组质粒的筛选与鉴定 |
| 2.2.4 农杆菌渗滤法接种受体植物 |
| 2.2.5 PIs与病毒载体共接种方法 |
| 2.2.6 烟草叶片可溶性总蛋白的提取 |
| 2.2.7 SDS-PAGE凝胶电泳 |
| 2.2.8 重组rPA的Western blot检测 |
| 2.2.9 重组rPA的ELISA定量检测 |
| 2.2.10 生物统计学分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 保护性标签对重组rPA在植物中积累的影响 |
| 3.1.1 HFB标签对重组rPA胞内积累的影响 |
| 3.1.2 ELP标签对重组rPA胞内积累的影响 |
| 3.1.3 Zera标签对重组rPA胞内积累的影响 |
| 3.2 PIs共表达竞争抑制效应分析 |
| 3.2.1 胞外表达rPA的CPMV病毒载体的构建 |
| 3.2.2 内质网表达PIs的植物表达载体的构建 |
| 3.2.3 共接种PIs的方法建立 |
| 3.2.4 胞外共表达PIs对重组rPA积累的影响 |
| 3.2.5 内质网共表达PIs对重组rPA积累的影响 |
| 3.3 PIs丰度对竞争抑制效应的影响 |
| 3.3.1 CPMV病毒载体农杆菌接种浓度的测定 |
| 3.3.2 PIs丰度对重组rPA积累的影响 |
| 3.4 病毒复制对竞争抑制效应的影响 |
| 3.4.1 表达重组rPA的TMV病毒表达载体的构建 |
| 3.4.2 共接种复制型病毒载体对内质网中重组rPA积累的影响 |
| 3.4.3 共接种复制型病毒载体对重组rPA胞外积累的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 内源蛋白酶与植物RNA病毒载体表达系统 |
| 4.2 保护性标签在保护外源重组蛋白胞内积累中的应用 |
| 4.3 PIs共表达竞争抑制效应与共表达体系中PIs的相对丰度 |
| 4.4 基因沉默技术可为抑制内源蛋白酶的研究提供新的发展方向 |
| 5 主要研究结果与结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 植物生物反应器概况 |
| 1.1.1 植物生物反应器 |
| 1.1.2 植物生物反应器的构建流程 |
| 1.2 病毒介导的植物生物反应器 |
| 1.2.1 植物病毒载体用于表达外源蛋白的研究 |
| 1.2.2 植物病毒重组载体的构建策略 |
| 1.3 大豆花叶病毒 |
| 1.3.1 大豆花叶病毒的性质 |
| 1.3.2 大豆花叶病毒的基因组结构 |
| 1.4 抗除草剂蛋白概况 |
| 1.4.1 抗除草剂蛋白作用机理 |
| 1.4.2 Bar基因调控PAT蛋白的表达研究 |
| 1.5 本研究的目的和意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 毒源、菌株和植物材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 大豆花叶病毒侵染性克隆SMV3 的改造 |
| 2.2.2 目的基因的克隆 |
| 2.2.3 SMV3-2 载体的构建 |
| 2.2.4 SMV3-2-bar重组病毒的构建 |
| 2.2.5 重组载体转化大豆植株 |
| 2.2.6 SMV3-2-bar的表达分析 |
| 2.2.7 PAT蛋白在大豆叶片上的积累趋势 |
| 2.2.8 PAT蛋白的纯化 |
| 2.2.9 PAT蛋白的生物学测定 |
| 2.2.10 遗传稳定性分析 |
| 第三章 结果与分析 |
| 3.1 侵染性克隆改造 |
| 3.2 目的基因的克隆 |
| 3.3 SMV3-2 载体的构建 |
| 3.4 SMV3-2-bar重组病毒的构建 |
| 3.5 SMV3-2-bar重组病毒的表达 |
| 3.6 转化植株RT-PCR检测结果 |
| 3.7 转化植株ELISA检测 |
| 3.8 转化植株Western-Blot检测结果 |
| 3.9 PAT蛋白在大豆叶片上的积累趋势 |
| 3.10 生物学测定结果 |
| 3.11 纯化的PAT蛋白Western-blot分析结果 |
| 3.12 遗传稳定性分析结果 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 SMV3-2 介导的大豆植物生物反应器 |
| 4.2 外源蛋白PAT的积累趋势 |
| 4.3 验证PAT蛋白的生物活性 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 发表论文与参加科研情况说明 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号和缩略语 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 水稻黑条矮缩病毒的研究进展 |
| 1.1.1 水稻黑条矮缩病毒寄主范围及危害 |
| 1.1.2 RBSDV的基因组结构及功能 |
| 1.1.3 RBSDV与传毒介体昆虫的关系 |
| 1.2 水稻条纹病毒的研究进展 |
| 1.2.1 水稻条纹病寄主范围及危害 |
| 1.2.2 RSV基因组结构 |
| 1.3 寄主植物的抗病毒研究 |
| 1.3.1 寄主植物自身的抗病毒免疫反应 |
| 1.3.2 ROS介导的抗病毒研究 |
| 1.3.3 寄主RNA沉默介导抗病毒机制 |
| 1.3.4 病毒外壳蛋白介导的抗病毒研究 |
| 1.3.4.1 RNA水平 |
| 1.3.4.2 蛋白水平 |
| 1.4 激素途径与植物免疫间的关系 |
| 1.4.1 BR途径与植物的免疫 |
| 1.4.2 生长素途径与植物的免疫 |
| 1.4.2.1 生长素的生物合成 |
| 1.4.2.2 生长素途径的信号受体 |
| 1.4.2.3 生长素途径的转录抑制因子Auxin-IAA蛋白 |
| 1.4.2.4 生长素途径的转录因子ARF |
| 1.5 研究目的与意义 |
| 第二章 水稻黑条矮缩病毒外壳蛋白P10转基因减弱水稻对RSV侵染的抗性 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 水稻材料与介体昆虫 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 水稻Total RNA提取及cDNA的合成 |
| 2.2.2 RT-PCR |
| 2.2.3 实时荧光定量PCR (qRT-PCR) |
| 2.2.4 Western blot |
| 2.2.5 室内人工接毒RBSDV及RSV |
| 2.2.6 小RNA及RNA文库构建测序 |
| 2.2.7 数据分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 P10转基因水稻能增强RSV的侵染 |
| 2.3.2 RBSDV及RSV侵染顺序影响两种病毒的含量 |
| 2.3.3 RBSDV P10转基因水稻转录组数据分析 |
| 2.3.3.1 植物与病原菌互作途径 |
| 2.3.3.2 受体激酶相关基因 |
| 2.3.3.3 植物激素信号途径基因变化 |
| 2.3.3.4 防卫反应基因定量验证 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 油菜素内酯途径负调控水稻防御RBSDV侵染机制研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 水稻材料与介体昆虫 |
| 3.1.2 实验菌株与载体 |
| 3.1.3 实验试剂 |
| 3.1.4 实验仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 载体构建 |
| 3.2.1.1 PCR目的基因的扩增 |
| 3.2.1.2 PCR产物切胶回收 |
| 3.2.1.3 载体成功构建 |
| 3.2.2 转基因水稻遗传转化 |
| 3.2.3 转基因植株的阳性鉴定 |
| 3.2.3.1 TPS法提取水稻基因组DNA |
| 3.2.3.2 PCR检测 |
| 3.2.4 室内人工接毒RBSDV |
| 3.2.5 水稻总RNA的提取及qRT-PC |
| 3.2.6 Western blot |
| 3.2.7 激素处理及BR敏感性测定 |
| 3.2.8 NBT染色 |
| 3.2.9 过氧化物酶活性测定 |
| 3.2.10 EMSA |
| 3.2.10.1 OsBZR1融合蛋白的大量诱导 |
| 3.2.10.2 蛋白纯化 |
| 3.2.11 染色质免疫沉淀(CHIP) |
| 3.2.12 小RNA及RNA文库构建测序 |
| 3.2.13 数据分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 RBSDV侵染的植株对BR敏感性增强 |
| 3.3.2 BR合成缺失突变体RI90B中OsDWARF4基因的表达量 |
| 3.3.3 RI90B转基因水稻对RBSDV的抗性增强 |
| 3.3.4 BR信号不敏感突变体dlt对RBSDV的抗性增强 |
| 3.3.5 转录组分析 |
| 3.3.6 定量验证 |
| 3.3.7 BR途径对Ⅲ型过氧化物酶及活性氧积累的影响 |
| 3.3.8 BR途径以过氧化物酶依赖的方式调节ROS的积累 |
| 3.3.9 BR途径直接调控OsPrx基因的表达 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 抑制生长素信号途径减弱水稻对RBSDV的抗性 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 水稻材料 |
| 4.1.2 实验试剂 |
| 4.1.3 实验仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 水稻Total RNA提取及cDNA的合成 |
| 4.2.2 qRT-PCR及western blot检测 |
| 4.2.3 样品室内人工接毒RBSDV |
| 4.2.4 OE-IAA20/OE-IAA31过表达载体的构建 |
| 4.2.5 转基因水稻遗传转化 |
| 4.2.6 转基因植株的阳性鉴定 |
| 4.2.7 GUS染色 |
| 4.2.8 NBT染色 |
| 4.2.9 激素处理 |
| 4.2.10 植物内源IAA及JA含量的检测 |
| 4.2.11 数据分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 RBSDV侵染后生长素途径相关基因的表达变化 |
| 4.3.2 降低生长素受体OsTIR1表达减弱水稻对RBSDV的抗性 |
| 4.3.3 过表达生长素信号转录抑制因子减弱水稻对RBSDV的抗性 |
| 4.3.4 生长素信号突变体对灰飞虱死亡率的影响 |
| 4.3.5 RBSDV侵染后生长素信号突变体中JA途径相关基因的表达变化 |
| 4.3.6 RBSDV侵染后生长素信号突变体中JA含量 |
| 4.3.7 生长素信号突变体中OsRboh介导的ROS含量变化 |
| 4.3.8 外源生长素类似物处理对OsRboh介导的ROS积累的作用影响 |
| 4.3.9 OsRboh介导的ROS积累对RBSDV侵染的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 全文总结 |
| 1 全文总结 |
| 2 本研究创新点 |
| 参考文献 |
| 附录1: 本研究所用引物 |
| 附录2: 培养基及常用试剂的配制 |
| 附录3: 转录组测序数据 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 中文缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 溶栓药物研究现状 |
| 1.2 Reteplase的研究概述 |
| 1.3 植物病毒载体表达系统 |
| 1.4 影响外源基因表达效率的因素 |
| 1.5 重组蛋白纯化研究概述 |
| 1.6 研究的目的及意义 |
| 第二章 Reteplase植物病毒表达载体的优化及其在烟草中的表达与纯化 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.2 常用分子生物学实验方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 不同来源信号肽对Reteplase在植物中表达作用的研究 |
| 2.3.2 密码子优化对Reteplase在植物中表达的作用的研究 |
| 2.3.3 重组Reteplase对宿主细胞细胞毒性的分析 |
| 2.3.4 RNA沉默抑制子HC-Pro对Reteplase在植物中表达作用的研究 |
| 2.3.5 重组Reteplase在植物中表达的时间变化规律分析 |
| 2.3.6 表达产物的纯化及其纯化过程的优化 |
| 2.3.7 重组Reteplase的相关理化性质和体外生物学活性研究 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 主要研究结果与结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 试剂和试剂盒 |
| 1.3 寄主植物 |
| 1.4 U6 RNA和CMV-2b植物表达载体的构建 |
| 1.5重组质粒转化农杆菌 (Grimsley et al., 1986) |
| 1.6农 杆 菌 渗 滤 接 种 法 (Agro- infiltration)(Velásquez et al., 2009) |
| 1.7 烟草叶片接种部位的GFP荧光检测 |
| 1.8 烟草叶片可溶性总蛋白(TSP)的提取 |
| 1.9 Western blots印迹检测GFP表达量 |
| 1.10 RT-PCR检测Ⅱ型启动子转录U6-1 RNA在烟草中表达 |
| 1.11 烟草叶片中GFP表达的ELISA定量测定 |
| 1.12 统计学分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 植物表达载体p BIN19 U6-1和p CBNo X 2b的构建及其共接种病毒表达载体p JL TRBO-G |
| 2.2 s RNA通过干扰RNA核质转运提高植物病毒载体表达系统的效率 |
| 2.3 s RNA 与沉默抑制子对提高植物病毒表达载体在烟草中表达外源基因效果的比较 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
