同源重组改变家蚕丝心蛋白重链基因

一、利用同源重组改变家蚕丝心蛋白重链基因（论文文献综述）

王彬彬^[1]（2015）在《突变对家蚕1型乙酰胆碱酯酶基因结构及功能的影响研究》文中指出乙酰胆碱酯酶（acetylcholinestrase, AChE, EC 3.1.1.7）是一种重要的丝氨酸水解酶,其经典功能是在神经传导中,将神经递质乙酰胆碱（acetylcholine, ACh）催化水解为乙酸和胆碱,终止神经冲动,维持正常的神经传导。AChE主要存在于神经元和肌肉接头处,终止神经冲动向肌肉细胞的正常传递。AChE是有机磷（OPs）和氨基甲酸酯（CBs）类杀虫剂的作用靶标。杀虫剂与AChE活性中心位点丝氨酸残基结合,占据酶的催化区域,ACh不能进入和降解。ACh长时间结合在乙酰胆碱受体（AChR）上,持续刺激肌肉细胞,引起昆虫抽搐甚至死亡。此外,AChE还与神经发育、神经细胞分化与迁移、突触的形成有关；AChE参与造血细胞的增殖与分化,参与巨核细胞的形成；AChE还与肿瘤增殖、细胞凋亡有关。AChE表达量的增加、膜锚定的增加、特定位点的突变是昆虫抗药性增加的重要原因。家蚕AChE有两种类型（AChE1和AChE2）,家蚕AChE1对农药相对敏感。为了研究特定位点的突变（A286S、G312A、L537S）对家蚕AChE1结构、活性以及对农药敏感性的影响,本研究利用原核表达系统表达了突变前后的AChE1基因（wace1和mace1）,经过分离和纯化制备了有活性的AChE,研究了活性及抑制动力学的变化；对突变前后的AChE1结构进行了预测,分析了影响AChE1功能的原因；将wace1及mace1转入BmN细胞,研究其在细胞中的表达特征,并进一步确定突变对AChE1活性及抑制动力学的影响；构建了家蚕通用型基因打靶载体（pSK-LoxpFRTA3GFP-IEneo-A3tk）,并利用此载体对BmN细胞acel进行敲除；将mace1转入到家蚕,构建携带mace1的家蚕。主要研究结果如下：1 wace1和mace1的原核表达及功能分析为了研究突变对AChE1活性和抑制动力学的影响,本研究利用原核表达系统,对家蚕野生型AChE1 （wAChE1）和突变型AChE1 （mAChE1）进行了表达；经过复性和纯化得到有活性的AChE1,两者活性差异不显着；用10-6M的毒扁豆碱和10-3mg/mL的辛硫磷孵育后, mAChE1的剩余酶活力分别比w AChE1高4.42%和8.86%。结果表明,突变对AChE1酶的活性无明显影响,但降低了其的对毒扁豆碱和辛硫磷的敏感性。2 wAChEl和mAChE1的结构分析为了探究突变对AChE1结构的影响,本研究对突变前后AChE1的二级结构及三维结构进行了预测和分析。结果发现,突变改变了AChE1的二级结构和三维结构,影响了催化活性中心部位的空间构象。A286S、G312A突变后的氨基酸残基大于原先的残基,突变后氨基酸侧链伸向活性中心部位,距离仅有2.80 A和3.68 A。推测这影响大分子抑制剂与活性中心丝氨酸残基的结合,是mAChE1抑制剂敏感性降低的原因。3 wacel和mace1转基因细胞构建为了研究wace1与mace1在家蚕细胞中的表达特征及蛋白活性,本研究将vace1与mace1连接到转基因载体pIZT/V5-His,转入BmN细胞,通过筛选和鉴定得到转基因细胞。经过PCR和Western检测,acel在细胞中正常表达。测定了wace1和mace1转基因细胞中acel表达量,分别是对照的21.51倍和21.69倍。对转基因细胞AChE活力的检测显示,wace1和mace1转基因细胞AChE活力分别比对照组高10.62%和20.21%。用10-6M毒扁豆碱和10-3mg/mL辛硫磷分别与wace1和mace1转基因细胞酶液孵育后,mAChE的剩余酶活力比wAChE分别高7.47%和17.41%。结果表明,转入acel可以显着提高acel的表达量,acel特定位点的突变可以降低AChE对抑制剂的敏感性。4家蚕通用型基因打靶载体的构建及应用为了构建适合在家蚕中使用的通用型基因打靶载体,方便实现家蚕的简单基因敲除、条件基因敲除及基因敲入,打靶阳性个体的筛选。本研究以pBluescript ⅡSK+为骨架,插入了一个Actin3启动子驱动的GFP报告基因和一个IE启动子驱动的正向选择标记基因（新霉素磷酸转移酶基因,neo）,并在其两侧各添加一个方向相同的FRT位点,以方便打靶成功后去除正向筛选标记基因,在GFP上游加入多克隆位点（multiple cloning site, MCS） MCSII,在MCSII和下游FRT两侧加入一个方向相同的LoxP以方便实现条件基因敲除,在两个LoxP外侧各加一个多克隆位点,加入一个attP以方便基因的敲入,加入一个Actin3启动子驱动的负选择标记基因（单纯疱疹病毒胸苷激酶基因,HSV-tkl）,构建家蚕通用型基因打靶载体（pSK-LoxpFRTA3GFP-IEneo-A3tk）。为了验证基因打靶载体的可行性,本研究利用此载体对家蚕BmN细胞的ace1进行了敲除。克隆acel的两段序列到家蚕通用型基因打靶载体,分别做为上下游交换臂,转染BmN细胞后,采用G418进行筛选,经筛选后细胞可见绿色荧光,表明GFP和neo正常表达。通过PCR鉴定,外源基因与基因组发生同源重组。结果表明构建的家蚕通用型基因打靶载体可用于家蚕基因打靶。5 mace1转基因家蚕的制备本研究将pIZT-mace1与脂质体混合,用精子介导法进行转基因,产下的蚕卵正常催青饲养至化蛹,记为GO代。利用体视荧光显微镜对绿色荧光蚕蛹进行筛选,取荧光蚕蛹,正常化蛾并交配产卵,催青饲养,记为G1代,并依次类推。提取G2代蚕蛾基因组,PCR鉴定GFP和转入的mace1,结果检测到GFP和mace1,表明转基因家蚕构建成功。本研究首次研究了突变对家蚕AChE1结构和功能的影响,发现三个关键位点的突变,改变了AChE1的结构,降低了其对抑制剂的敏感性；构建了家蚕通用型基因打靶载体,利用此载体对家蚕acel进行打靶；构建转基因载体,并将mace1转入家蚕。本研究阐明了家蚕AChE1三个位点的突变可以降低对抑制剂的敏感性,为研究AChE突变与抗药性的关系提供新的思路；为家蚕基因敲除和转基因提供素材；也为培育家蚕抗药性新品种提供材料。

李静芝,曹广力,杨李阳,薛仁宇,黄元姣,贡成良^[2]（2013）在《基于同源重组的产绿色荧光蚕丝转基因家蚕的制备》文中研究指明采用基因打靶技术对家蚕丝素蛋白基因（fib）进行分子设计与遗传改造,探讨从基因水平改良蚕丝性能的可行性。以家蚕丝素轻链基因（fib-L）终止密码子TAA上游1.2 kb（fib-LL）和下游0.5 kb（fib-LR）片段作为基因打靶载体的左右同源臂,将绿色荧光蛋白基因（gfp）插入到两同源臂的中间,并使其与fib-L基因处于同一读码框,构建基因打靶载体pSK-FibL-L-GFP-FibL-R。将该载体质粒转染BmN细胞后,荧光显微镜下观察细胞呈现绿色荧光,表明载体构建成功。将该载体质粒通过精子介导法导入家蚕品种高白的卵,在G0代筛选出茧呈绿色荧光的家蚕,并通过PCR检测证实其为转基因家蚕;用GFP抗体对G3代转基因家蚕幼虫后部丝腺组织进行Western blotting检测,有分子质量为65 kD的Fib-L-GFP融合蛋白特异性条带呈现。转基因家蚕所产蚕丝在蓝光的激发下发出绿色荧光,表明通过基因打靶将gfp导入了家蚕丝素轻链基因中,并成功实现融合表达。

李静芝^[3]（2013）在《丝蛋白基因的分子设计及过表达RaslCA基因提高实用品种产丝量研究》文中提出家蚕（Bombyx mori）属鳞翅目蚕蛾科，可大规模饲养，遗传背景比较清楚，其丝腺具有合成和分泌丝蛋白的能力。蚕丝有纤维皇后之美誉，但也存在易霉变，黄化、皱缩、褪色和脆化等缺陷。为了探讨通过家蚕丝素基因（fib）的分子设计与遗传改造，从基因水平改善丝纤维的性能，本研究利用家蚕丝素轻链基因（fib-L）上游约1.2kb的第56外显子片段和约0.5kb的第7外显子及其下游序列作为基因打靶的左右同源臂，将gfp基因和人工合成的家蚕抗菌肽基因（cec）融合克隆插入到两同源臂之间，并使其与fib-L基因处于同一读码框；将由ie-1驱动的DsRed基因克隆至同源右臂右侧，作为负选择标记，构建基因打靶载体pSK-Fib.L-L-GFP-cec-Fib.L-R-IE-DsRed-PolyA。将该载体转染BmN细胞后，发现部分转染细胞呈现绿色荧光而无红色荧光，表明载体构建成功。将该载体通过精子介导转入家蚕卵，在G0代筛选茧呈绿色荧光的家蚕，PCR检测证实筛选出的蚕为转基因家蚕；同蛾圈转基因家蚕杂交传代，用GFP抗体对G6代家蚕后部丝腺组织进行western blot检测，可观察到Fib-L-GFP融合蛋白的特异性条带；抗菌性实验显示，转基因家蚕丝表面的菌落数明显少于对照组；转基因家蚕丝在紫外光的激发下发出绿色荧光，表明通过基因打靶gfp-cec已与fib-L融合并表达。为了探讨提高实用品种的产丝水平和叶丝转化率的可能性，将后部丝腺特异性表达Gal4的Fil-Gal4/3XP3-DsRed2转基因家蚕系与实用品种菁松回交6代，获得Fil-Gal4转基因家蚕菁松系统；将带有UAS-Ras1CA元件的UAS-Ras1CA/3XP3-EGFP转基因家蚕系与实用品种皓月回交6代，获得UAS-Ras1CA转基因家蚕皓月系统。将Gal4菁松系与UAS皓月系杂交，得到在后部丝腺特异性表达Ras1CA的转基因实用品种Fil-Gal4-菁松×UAS-Ras1CA-皓月，调查结果显示，与菁松×皓月相比，转基因家蚕的的后部丝腺重和蚕丝产量分别提高了11%、1.3%，叶丝转化率提高0.57%。实时定量PCR检测结果显示Fil-Gal4-菁松×UAS-Ras1CA-皓月后部丝腺Ras1mRNA水平提高了4.08倍。

胡莹莹^[4]（2012）在《非转座子载体介导的转基因家蚕的研究》文中研究指明家蚕因具有世代周期短、繁殖率高、遗传背景清楚，后代个体数量多、能大规模饲养等优点而成为经典遗传学研究的模式生物之一。家蚕转基因技术可以获得新品种、生产外源蛋白，存在着巨大的发展潜力和很高的利用价值。它包括基于转座子载体的家蚕转基因以及基于非转座子载体的家蚕转基因。本研究主要探讨非转座子载体介导家蚕转基因的可能性。人胰岛素样生长因子I（human insulin-like growth factor-I，hIGF-I）是一种多功能细胞增殖调控因子，在活体内外hIGF-I能促进多种细胞的生长和分化,是生长激素功能的主要辅助调节因子,并且具有类似胰岛素的降血糖活性，在医学领域具有广阔的应用前景。由于成熟hIGF-I在人血内含量不高，且提纯技术难度大。缺少hIGF-I纯制品已成为对其进行研究与应用的主要障碍。家蚕作为一种高效真核表达系统，在生产基因工程药物方面有很好的应用前景。同时，为了进一步探讨非转座子载体pIZT/V5-His介导转基因家蚕表达外源基因的可能性，我们将人胰岛素样生长因子I（hIGF-I）基因克隆进pIZT/V5-His载体中，构建了转基因载体pIZT/V5-His-hIGF-I，并利用精子介导法将其导入家蚕，通过绿色荧光筛选并结合PCR、Dot blotting等分子鉴定，证实成功获得了转基因家蚕，并将其培育至G2代；Western blotting分析结果显示转基因家蚕表达的重组hIGF-I的分子量约为12.5kD，ELISA检测结果显示，hIGF-I在G2代转基因蚕、后部丝腺、脂肪组织冻干粉中的表达水平分别为65、411和469ng/g。证实通过非转座子载体介导可以将外源基因导入家蚕基因组，并实现外源基因的表达。此外，为了研究基于基因打靶载体的家蚕转基因，我们以家蚕ovo基因上下游各1.2kb内含子区域片段作为同源臂，将a3启动子驱动绿色荧光蛋白（gfp）基因的表达盒，以及ie-1启动子驱动新霉素（neo）抗性基因的表达盒克隆进二同源臂之间，作为正向选择基因；并将ie-1启动子驱动红色荧光蛋白（DsRed）基因的表达盒连接在右侧同源臂外部，作为负向选择基因，构建了基因打靶载体pSK-ovoL-A3-GFP-IE-neo-ovoR-IE-DsRed，并通过精子介导法将该打靶载体导入家蚕卵，通过G418筛选、绿色荧光筛选并结合PCR等分子鉴定，证实获得了转基因家蚕，进一步对外源基因的插入位点进行鉴定，判断获得的转基因家蚕为基于基因打靶载体的非同源重组的随机整合的转基因家蚕，同时表明同源重组的效率仍然很低。

张昊堃^[5]（2012）在《Gai4/UAS转基因系统表达BmKIT3R对家蚕蛹期发育的影响》文中研究指明家蚕（Bombyx mori Linnaeus）的蛹期在实际生产生活中,一般维持在两周左右,但是通过延长蛹期,可以节约大量花费在鲜茧加工过程中的人力物力。本文旨在利用Gal4/UAS酵母双杂交系统,蛹期特异性表达启动子介导,控制东亚钳蝎毒素基因（BmKIT3R, Chinese scorpion Buthus martensii Karsch）特异性地在家蚕蛹期表达。Gal4蛋白由蛹期特异性表达启动子,家蚕翅原基细胞蛋白BmWCP4（B. mori wing-cuticle protein gene）或家蚕溶茧酶PDP （B. mori cocoonase gene）控制；BmKIT3R基因由可以被Gal4蛋白特异性识别的UAS （cis-acting element）序列控制表达,双元系统的激活系统和效应系统都装载在piggBac转座子载体上。piggyBac载体中含有由家蚕多角体病毒BmNPV ie-1（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus immediate-early gene）极早期基因启动子控制的新霉素抗性基因（neomycin-resistance gene, neo）,以及家蚕A3（B. mori actin3）基因启动子控制的绿色荧光蛋白基因（green fluorescent protein gene, gfp）。载体被精子介导法导入家蚕受精卵,经绿色荧光蛋白观察和G418筛选,制得转基因家蚕。经传代后提取家蚕基因组,用PCR验证家蚕基因组中存在gfp与neo基因。双元系统杂交种的幼虫与对照组Gal4-和UAS-的种系相同,并无发育滞缓的情况,而在蛹期,前者因双元系统控制的BmKIT3R基因的表达,有些在蛹期死亡,有些蛹期发育迟缓,而对照组正常发育化蛾。并且,在Gal4/UAS双元系统中,BmWCP4的启动效果在试验中优于PDP的启动效果。双元系统杂交种UAS-BmKIT3R（3-247）×BmWCP4-Gal4（大造）,UAS-BmKIT3R （3-247）×PDP-Gal4（3-166）和UAS-BmKIT3R （3-247）×PDP-Gal4（3-247）的蛹期延长效果较对照组而言,分别延长5天,2天和4天。从本文研究结果得出,Gal4/UAS介导的BmKIT3R基因在蛹期特异性表达阻滞蛹期发育,是延长家蚕蛹期的很好方法。

杨李阳^[6]（2011）在《基于基因打靶的绿色荧光丝转基因家蚕研究》文中研究指明家蚕（Bombyx mori）属于鳞翅目蚕蛾科,能大规模饲养,遗传背景比较清楚,其丝腺具有强大合成和分泌丝蛋白的能力。为了探索从分子改良上对家蚕进行遗传改造,本研究利用家蚕丝素轻链基因终止密码子TAA上游约1.2 kb片段和TAA下游约0.5 kb片段作为基因打靶的左右同源臂,将缺少启动子驱动的绿色荧光蛋白基因（ gfp ）插入到两同源臂的中间,构建获得基因打靶载体pSK-FibL-L-GFP-FibL-R。然后将该载体转染BmN细胞,通过绿色荧光检测,证明载体构建有效。通过精子介导法将该载体导入家蚕卵,首先在G0代通过绿色荧光筛选荧光蚕,由PCR结果证实所筛选出的荧光蚕为转基因家蚕;western blot检测结果显示,在G3代后部丝腺组织中可检测到分子量为70 kDa的GFP-Fib.L融合表达蛋白的特异性条带。研究结果表明通过基因打靶将外源基因导入了家蚕丝素轻链基因中,并成功实现融合表达。同时,本研究利用家蚕丝素轻链序列的第57外显子片段（约1.2 kb）和第7外显子及其侧翼序列片段（约0.5 kb）作为基因打靶的左右同源臂,将gfp基因和人工合成的家蚕抗菌肽基因（cec）融合克隆到两同源臂之间,并从设计上将gfp-cec基因融合到丝素轻链基因;将由ie-1驱动的DsRed基因表达盒克隆在右侧同源臂的外面,作为负选择标记,构建了在结构与功能上与上述不同的另一个基因打靶转基因载体pSK-Fib.L-L-GFP-cec-Fib.L-R-IE-DsRed-PolyA。将该载体转染细胞进行功能验证,发现转基因细胞中存在只有绿色荧光而无红色荧光的细胞,表明载体构建成功;再将该载体用精子介导转入家蚕卵,对呈绿色荧光的个体进行鉴定。初步获得了能产生绿色荧光抗菌丝的转基因家蚕。研究为探索通过分子改良,对家蚕进行遗传育种提供了新的思路。研究过程中,通过RT-PCR方法获得了家蚕JAK/STAT途径中的信号传导抑制因子（suppressor of cytokine signaling,SOCS）2的cDNA基因（BmSOCS-2A）,测序结果表明,该792 bp片段含有完整的ORF,由4个外显子组成,编码263个氨基酸残基,分子量为28.8 kD。结构分析显示BmSOCS-2A有5个α螺旋结构,存在典型的SH2结构域和SOCS结构域。基因芯片数据分析结果显示,BmSOCS-2在家蚕雌雄性腺组织中表达量最高。进化分析表明,SOCS以不同种类聚类在一起,表明各种SOCS基因在各昆虫物种形成前就已产生SOCS基因家族。

周启升,于奇,刘庆信^[7]（2011）在《转基因家蚕的研究进展及应用前景》文中进行了进一步梳理转基因家蚕Bombyxmori是指利用分子生物学手段,将外源基因转移到家蚕染色体中,使之出现先前不具有的性状和产物,并且可以保持传代,在个体水平可以体现外源基因的功能,使外源基因获得大量表达。目前转基因家蚕研究主要以piggyBac转座系统为常用载体,绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）基因为常用报告基因,经显微注射法获得转基因家蚕的成功率可达40%。通过转基因家蚕技术已经探明了家蚕外源导入核受体基因BmFtz-F1,调控家蚕体壁半透明的BmBLOS2基因、蜕皮启动激素（ecdysis-triggering hormone,ETH）基因以及家蚕抗菌肽CecB（cecropin B）基因的功能;获得了具有高品质、高细纤度、高拉伸强度和高弹性丝品种,能吐带绿色荧光或粉红色荧光的蚕丝品种,抗家蚕核型多角体病毒（Bombyxmori nucleopolyhedrovirus,BmNPV）品种及抗藤黄微球菌的品种;成功表达纯化了人的Ⅲ型前胶原蛋白、人碱性纤维生长因子、人血清蛋白、人脑源性神经营养因子、人胰岛素生长因子Ⅰ、猫干扰素、单克隆抗体等生物活性蛋白、疫苗及特殊的生物材料。随着家蚕转基因技术的深入研究,转基因家蚕产物将在国防、军工、航天、医药等方面有着更为广阔的应用前景。

李艳梅^[8]（2010）在《基于基因打靶载体和昆虫表达载体的转基因家蚕丝腺生物反应器表达hGM-CSF的研究》文中指出人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（human granulocyte-macrophage colony stimulating factor,hGM-CSF）作为一种重要的具有免疫调节功能的糖蛋白,在当前具有重要的临床应用价值。如何获得高效表达、高活性、毒副作用小的hGM-CSF是近年来基因工程研究的热点。目前重组hGM-CSF已在多种表达系统中表达,随着重组hGM-CSF的临床研究的日趋成熟,其应用前景将更为广阔。家蚕转基因的研究已经有20多年的历史了,具有家蚕杆状病毒表达系统无可比拟的优势。但是,外源基因的有效导入、整合表达水平及遗传稳定性上还存在很多不足。本研究将带有以家蚕丝素重链基因第一外显子及其下游部分序列和第二外显子部分序列及其上游部分序列做为同源序列和A3启动子控制下的gfp报告基因以及由丝素轻链（fib-L）启动子控制下的hGM-CSF基因的打靶载体利用精子介导法导入家蚕,通过绿色荧光和分子生物学方法筛选转基因家蚕,首次利用基因打靶技术成功获得可以正常结茧传代的转基因家蚕,ELISA检测结果显示,hGM-CSF在每克鲜组织中的表达量为1.26 ng。同时,成功构建了具有hGM-CSF表达元件的昆虫细胞转化载体PIZT-hGM-CSF,转基因载体与辅助质粒分别共转染家蚕BmN细胞和昆虫Sf-9细胞,利用博莱霉素筛选获得持续表达hGM-CSF稳定转化细胞系,ELISA检测结果显示,hGM-CSF在106个稳定转化的家蚕BmN细胞和昆虫Sf-9细胞中的表达量分别为0.7 ng和0.3 ng;利用精子介导法将转基因载体导入家蚕,通过绿色荧光和分子生物学方法筛选转基因家蚕,western blot结果显示,转基因家蚕丝腺表达的hGM-CSF的分子量为22 kD。ELISA检测结果显示,每克鲜组织中hGM-CSF表达量为4.7 ng。证明昆虫表达载体plZT/V5- His可以直接应用于转基因家蚕研究。

陈慧梅^[9]（2010）在《转基因家蚕/细胞表达hGM-CSF和绿色荧光蚕丝的制备》文中进行了进一步梳理人粒-巨噬细胞集落刺激因子（human granulocyte-macrophage colony stimulating factor ,hGM-CSF）是一造血刺激因子,能够刺激T细胞和巨噬细胞增殖、成熟和分化,提高机体免疫力,具有十分重要的临床应用价值,在国际生物技术制药市场上也占有重要的位置。家蚕（Bombyx mori）属于鳞翅目蚕蛾科,能大规模饲养,遗传背景比较清楚,其丝腺具有强大合成和分泌丝蛋白的能力。为探讨在家蚕丝腺特异性表达hGM-CSF的可能性,以家蚕丝素轻链基因（fib-L）组序列为左（约1.2kb）、右（约0.5kb）同源臂,用丝素重链基因（fib-H）启动子控制hGM-CSF基因,家蚕肌动蛋白A3启动子控制GFP报告基因,构建了轻链基因打靶载体pSK-FibL-L-A3GFP-PH-GMCSF-LPA-FibL-R;通过精子介导法将该载体导入初产卵,首先在G0代通过绿色荧光筛选荧光蚕,由PCR和DNA杂交结果证实所筛选出的荧光蚕为转基因家蚕;western blot检测结果显示,在G3代后部丝腺组织中可检测到分子量为22 kDa的hGM-CSF特异性条带;ELISA分析结果显示,hGM-CSF在转基因后部丝腺组织的表达水平为2 700 pg/g冻干粉。表明通过基因打靶可以将外源基因导入希望的家蚕基因组位点,并实现表达。缺失丝素轻链基因的第6外显子第30核苷酸下游区域不影响家蚕的吐丝结茧。为了能通过遗传分子来改造家蚕丝,本研究构建轻链基因打靶载体pSK-FibL-L-GFP-FibL-R,以丝素蛋白轻链基因组终止密码TAA上游1.2 kb和TAA下游0.5 kb左右的片段为同源臂,将绿色荧光蛋白（GFP）基因的DNA序列克隆进二同源臂之间,使GFP基因的读码框与丝素蛋白轻链基因的读码框一致,转基因载体通过精子介导法将该载体导入初产卵,并结合分子生物学检测,获得了能吐绿色荧光丝的基因打靶蚕。有关结果为分子设计改变蚕丝的性状奠定了基础。另外,我们建立了非转座子载体介导的持续表达外源基因的转化家蚕BmN细胞系,我们将家蚕核型多角体病毒极早期基因（ie-1）启动子控制的人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（hGM-CSF）基因的表达盒克隆进pIZT/V5-His获重组pIZT-IE-hGM-CSF,该载体转染家蚕BmN细胞后,通过博莱霉素（zeocin）筛选获得了稳定转化细胞系IE-hGM-CSF。转基因细胞基因组经PCR鉴定,成功检测到ie-hGM-CSF,western blot分析结果显示转化细胞表达的重组hGM-CSF的为22 kDa,ELISA检测结果显示hGM-CSF在转化细胞系里的表达水平大约为2 814.7 pg/106个细胞。

曹甲,刘朝良,朱保建,魏国清,王在贵,钱岑^[10]（2010）在《柳蚕丝素重链基因（Fib-H）cDNA 5′端片段的克隆与表达分析》文中指出柳蚕（Actias selene Hübner）是鳞翅目大蚕蛾科的一种珍稀野生绢丝昆虫。利用RT-PCR方法克隆了柳蚕丝素重链基因（Fib-H）cDNA 5′端的一个片段,该片段序列长819 bp,编码273个氨基酸,含有4个保守多聚丙氨酸结构域。序列比对分析表明,该片段序列与樟蚕（Saturnia japonica）、天蚕（Antheraea yamamai）、柞蚕（Antheraea pernyi）、印度柞蚕（Antheraea mylit-ta）和家蚕（Bombyxmori）的Fib-H基因cDNA 5′端同源序列的相似性分别为72.5%、65.8%、65.1%、65.1%、47.1%。半定量PCR分析显示柳蚕Fib-H基因cDNA 5′端片段序列在5龄幼虫第1-12天的表达量呈现逐渐上升的趋势。

二、利用同源重组改变家蚕丝心蛋白重链基因（论文开题报告）

（1）论文研究背景及目的

此处内容要求：

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例：

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

（2）本文研究方法

调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、利用同源重组改变家蚕丝心蛋白重链基因（论文提纲范文）

（1）突变对家蚕1型乙酰胆碱酯酶基因结构及功能的影响研究（论文提纲范文）

（3）丝蛋白基因的分子设计及过表达RaslCA基因提高实用品种产丝量研究（论文提纲范文）

（4）非转座子载体介导的转基因家蚕的研究（论文提纲范文）

（5）Gai4/UAS转基因系统表达BmKIT3R对家蚕蛹期发育的影响（论文提纲范文）

（6）基于基因打靶的绿色荧光丝转基因家蚕研究（论文提纲范文）

（8）基于基因打靶载体和昆虫表达载体的转基因家蚕丝腺生物反应器表达hGM-CSF的研究（论文提纲范文）

（9）转基因家蚕/细胞表达hGM-CSF和绿色荧光蚕丝的制备（论文提纲范文）

（10）柳蚕丝素重链基因（Fib-H）cDNA 5′端片段的克隆与表达分析（论文提纲范文）

四、利用同源重组改变家蚕丝心蛋白重链基因（论文参考文献）

• [1]突变对家蚕1型乙酰胆碱酯酶基因结构及功能的影响研究[D]. 王彬彬. 苏州大学, 2015(12)
• [2]基于同源重组的产绿色荧光蚕丝转基因家蚕的制备[J]. 李静芝,曹广力,杨李阳,薛仁宇,黄元姣,贡成良. 蚕业科学, 2013(04)
• [3]丝蛋白基因的分子设计及过表达RaslCA基因提高实用品种产丝量研究[D]. 李静芝. 苏州大学, 2013(11)
• [4]非转座子载体介导的转基因家蚕的研究[D]. 胡莹莹. 苏州大学, 2012(03)
• [5]Gai4/UAS转基因系统表达BmKIT3R对家蚕蛹期发育的影响[D]. 张昊堃. 苏州大学, 2012(05)
• [6]基于基因打靶的绿色荧光丝转基因家蚕研究[D]. 杨李阳. 苏州大学, 2011(06)
• [7]转基因家蚕的研究进展及应用前景[J]. 周启升,于奇,刘庆信. 昆虫学报, 2011(02)
• [8]基于基因打靶载体和昆虫表达载体的转基因家蚕丝腺生物反应器表达hGM-CSF的研究[D]. 李艳梅. 苏州大学, 2010(01)
• [9]转基因家蚕/细胞表达hGM-CSF和绿色荧光蚕丝的制备[D]. 陈慧梅. 苏州大学, 2010(01)
• [10]柳蚕丝素重链基因（Fib-H）cDNA 5′端片段的克隆与表达分析[J]. 曹甲,刘朝良,朱保建,魏国清,王在贵,钱岑. 蚕业科学, 2010(01)