王宪璞[1]（2021）在《基于Pro-BIUTNT启动子的苹果原生质体高效表达体系的建立及其免疫研究应用》文中研究表明苹果优异基因的发掘和特异信号转导机制的深入解析离不开以苹果细胞为基础的高效精准目标蛋白表达技术体系。目前相关研究手段主要为同源稳定遗传转化体系和异源遗传转化体系,同源稳定遗传转化体系不仅技术周期长,效率低,而且在某些关键蛋白在特定时间下发生的修饰或相互作用等方面的研究中极为不便;异源遗传转化体系虽能借鉴模式植物成熟的研究手段,然而在异源植物细胞中,由于遗传基础不同,细胞特性和生化调控机理往往存在巨大差异,可能无法准确揭示目标蛋白的真实生物学功能。原生质体瞬时表达技术作为有力的生化机理研究手段,虽已在拟南芥等模式植物中得到成熟和广泛的应用,但在苹果中尚未有相关报道。本研究以‘王林’和‘紫红’苹果愈伤组织为试材分离原生质体,基于Pro-BIUTNT启动子建立苹果原生质体高效瞬时表达技术体系,并对苹果部分免疫抗性的分子机理进行了研究,初步揭示了flg22诱导BAK1和FLS2特异性互作和MKK7-MAPK6-WRKY33的苹果PTI抗性途径,并证实AvrRpt2和NAA介导AXR2降解和AvrRpt2剪切RIN4的苹果ETI抗性途径,并首次发现RIN4内源性剪切机制及NAA和RIN4介导AvrRpt2反馈降解的苹果特异性免疫抗性机制。主要研究结果如下:1.平均每克鲜重愈伤组织制得1×106个以上的原生质体,其中以继代培养10 d的愈伤组织为试材分离的原生质体产量最高,平均每克鲜重的‘王林’和‘紫红’愈伤组织分别最多制得3.68×106个和4.07×106个原生质体。培养20 d和25 d的‘紫红’愈伤组织因老化脱水,质地硬脆且致密,表面深红内部褪色变黄,未分离到正常的原生质体。2.花椰菜病毒（Cauliflower mosaic virus,CaMV）的35S启动子虽能在多种作物中有效驱动目标基因表达,然而在苹果原生质体中瞬时表达活性较弱,无法满足相关生化研究的需要。拟南芥泛素基因UBQ10（Ubiquitin 10）的天然启动子Pro-BIUTNT在苹果原生质体中具有显着高于CaMV 35S的瞬时表达活性,本研究分别检测了Pro-BIUTNT和CaMV 35S启动子驱动参试基因MdERF98、MdERF1、MdERF2、MdERF3a、MdERF6a、MdWRKY29、MdWRKY33、MdBAK1、MdFLS2、MdEIL2在苹果原生质体中的表达水平,结果表明,多数基因在Pro-BIUTNT驱动下获得了强烈的目标蛋白信号,而CaMV 35S启动子驱动的目标蛋白信号微弱或未检出。我们分别以MdERF1、MdWRKY33和MdFLS2为参试基因对愈伤组织继代培养时间和表达时间对目标蛋白表达水平影响进行了研究,结果显示,继代培养6 d的愈伤组织制得的原生质体表达目标蛋白的水平最高,孵育表达6～8 h所得目标蛋白水平最高。Pro-BIUTNT启动子还驱动了目标GFP及GFP融合蛋白在苹果原生质体和烟草叶肉细胞中的高效表达,其荧光信号水平显着强于CaMV 35S启动子。3.不同于苹果原生质体,在拟南芥原生质体中,CaMV 35S启动子具有较高的瞬时表达活性,并与Pro-BIUTNT启动子差异并不显着,且两种启动子在拟南芥原生质体中的瞬时表达活性整体高于苹果原生质体,这可能与由遗传背景决定的种间蛋白表达调控机理的差异有关。4.拟南芥UBQ10基因的苹果直系同源基因的启动子Pro-MdBIUTNT和Pro-MdBIUTNT-2（长度分别为1539 bp和2501 bp）在苹果原生质体中同样具有优于CaMV35S的驱动表达活性,其中,两个长度为539 bp和739 bp（自ATG翻译起始位点向上游）的Pro-MdBIUTNT区段活性较强。5.鉴于核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶（Rubisco）是植物叶片中含量最丰富的蛋白质,我们分别鉴定了长度分别为1972 bp和3050 bp的苹果Rubisco基因天然启动子Pro-MdRP-1和Pro-MdRP-2及长度分别为2025 bp和2542 bp的Rubisco活化酶（Rubisco activase,RCA）基因的天然启动子Pro-MdRC-1和Pro-MdRC-2在苹果原生质体中的组成型表达活性和光诱导表达活性,结果显示,Rubisco基因相关启动子在苹果原生质体中的组成型表达活性较低,光照处理后微弱提升了其表达水平。6.应用苹果原生质体瞬时表达技术进一步印证了部分苹果PTI和ETI抗性响应机制,PTI抗性方面,证实flg22诱导At BAK1与At FLS2的特异性相互作用在苹果细胞中的保守性,结合体外激酶试验结果发现At MKK7ac可通过磷酸化MdMAPK6对MdWRKY33进行蛋白修饰和磷酸激酶信号传递,MdMAPK6通过不依赖于At MKK7ac的方式提高了MdWRKY33的蛋白质稳定性。ETI抗性方面,在‘王林’苹果原生质体中,萘乙酸（NAA）处理或共表达AvrRpt2均能显着降低AXR2的蛋白质稳定性,AXR2 P87S突变后其稳定性显着提高,说明该机制在苹果细胞同样保守存在。AvrRpt2利用其自身半胱氨酸蛋白酶活性剪切RIN4的机制在苹果细胞中依旧保守存在。7.本研究首次发现了有别于模式植物的苹果特异免疫抗性机制,NAA处理显着降低了AvrRpt2的蛋白水平,说明在苹果细胞中可能存在介导病原菌效应蛋白AvrRpt2降解的特异性反馈调控机制以缓解病原菌对宿主的持续伤害,对平衡植物生长和免疫过程具有重要作用,RIN4的存在同时进一步降低了AvrRpt2的水平。苹果细胞中还存在着不依赖于AvrRpt2的特异RIN4剪切机制,说明苹果细胞中可能存在某些基于RIN4剂量的调控途径,以保持对AvrRpt2的适度敏感性。综上所述,本研究基于Pro-BIUTNT启动子建立了苹果原生质体高效瞬时表达技术体系,初步揭示了部分植物PTI和ETI抗性在苹果细胞中的保守性,同时首次发现了R IN4内源性剪切机制和NAA和RIN4介导AvrRpt2反馈降解的苹果特异性免疫调控机制,这些共性与特性并存的调控机制不仅反映了种间保守免疫机制对植物生存的重要意义,更是植物不断进化以适应自然环境的具体体现。本研究不仅为苹果功能基因和特异信号途径的相关研究提供了良好的技术支持,同时也为深入解析苹果特异免疫抗性机理提供了一定的理论和技术参考。
刘彩霞[2]（2021）在《小黑杨单倍体悬浮细胞筛选体系的建立及应用研究》文中认为植物悬浮细胞可为植物研究提供一个简化的模型系统,它的开发和应用目前主要集中在草本植物和农作物中,在林木中的应用研究还鲜有报道。与草本植物相比,木本植物具有明显的次生生长特点,使其在应激反应调节,信号转导调控等方面存在差异,因此在诸多科研探究中,草本植物悬浮细胞系具有明显的局限性,不能够完全替代木本植物细胞系进行研究。小黑杨（Populus simonii ×P.nigra）是在上世纪五六十年代由育种工作者人工杂交选育而成,以欧洲黑杨和小叶杨为父母本,由于生长快,适应性强,兼具耐寒、耐旱、耐盐碱等特点而被广泛种植。本文以小黑杨为研究材料,通过对小黑杨花药进行愈伤诱导,通过对单倍体群体的筛选,从而获得具有优良性状的单倍体细胞系Qu-1,并对Qu-1 在分子生物学上的应用进行了深入研究,建立了系统的小黑杨单倍体细胞系应用体系,揭示了小黑杨单倍体细胞系具有广泛的应用前景和价值,可为植物领域尤其是林木分子生物学研究提供优良的试验材料。其主要研究结果包括:（1）小黑杨单倍体愈伤组织诱导体系的建立:通过对本地区小黑杨的物候情况进行观察,小黑杨雄蕊于每年3月开始萌动,4月中旬可观察到花药处于不同的发育时期。以不同发育时期的小黑杨花药为外植体,经常规消毒处理后,进行愈伤组织诱导,并对获得的愈伤进行继代培养,流式细胞仪倍性检测,k-mer分析以及植株再生诱导等一系列实验。通过对愈伤组织诱导情况进行统计,共获得3000个愈伤组织,同时发现当花药处于单核靠边期时,诱导效率最高;经杂合度及倍性检测最终获得300个单倍体愈伤组织,其中有20个单倍体愈伤组织已经获得完整植株。（2）小黑杨单倍体悬浮细胞系Qu-1培养体系的建立:从可再生植株的单倍体愈伤组织中挑选颜色淡黄、质地松散以及生长旺盛的愈伤Qu-1作为悬浮培养的材料,通过对不同激素比例浓度的调节筛选出最适合的悬浮培养条件,结果表明,小黑杨单倍体细胞系Qu-1的最适悬浮培养基是MS+1.25 mg/L 2,4-D+ 0.2 mg/L KT+50 g/L蔗糖,pH为6.0,最佳培养温度及转数为26℃,110 rpm,最佳接种量为0.023 g/mL,培养周期为10 d。（3）小黑杨单倍体细胞系Qu-1生长特性的研究:通过与BY-2细胞系在固体培养和悬浮培养状态下的生长量,分散性以及细胞大小比较分析表明,Qu-1较BY2细胞系在悬浮培养时表现出生长速度更为旺盛且具有良好分散性等特点;同时对Qu-1细胞系进行木材组分测定和植株再生诱导,结果表明,Qu-1细胞系在悬浮培养状态下木质素总含量为8.33%,S/G 比例为3.51。经过不定芽诱导,Qu-1细胞系可以再生形成完整植株。（4）小黑杨单倍体细胞系Qu-1全基因组测序:Qu-1细胞系基因组测序采用三代PacBio和二代测序两种技术相结合的方式,依赖三代测序长读长的特点,保证更完整的基因组组装,并使用二代测序数据校正,保证组装结果更精确可靠。同时结合Hi-C等新技术,将Qu-1细胞系基因组组装到染色体水平,从而为后续分析提供精准而全面的基因组信息。最终组装得到的Qu-1细胞系基因组大小为397.9 Mb,contig N50为6.7 Mb,scaffold N50为20.6 Mb,GC含量为33.8%;最终注释的重复序列总计196,327,743 bp,占全部基因组序列的49.3%。（5）小黑杨单倍体细胞系Qu-1瞬时遗传转化体系的建立:以农杆菌介导的瞬时遗传转化操作中,通过对Qu-1细胞系瞬时遗传转化中的几个主要因素进行单因素比较试验,建立了有效的Qu-1细胞系的瞬时遗传转化体系,结果表明,将悬浮培养6 d的Qu-1细胞系与含有以水为溶剂OD600为0.2的农杆菌菌液,0.75 mM AS和0.0002 mg/L TDZ的侵染悬液在26℃,110 rpm共培养2 d时,Qu-1细胞系的瞬时遗传转化效果最好;在以原生质体介导的瞬时遗传转化操作中,选择培养8-9 d的Qu-1细胞系进行原生质体分离,原生质体得率最高,转化效率可达30～35%,利用Qu-1原生质体分离及转化系统已进行多种细胞器定位及BiFC试验。（6）小黑杨单倍体细胞系Qu-1稳定遗传转化体系的建立:对Qu-1细胞系进行过表达,RNAi抑制表达以及CRISPR/Cas9基因编辑的遗传转化试验,通过对抗性愈伤进行常规的分子检测,结果表明,抗性筛选25-30 d即可获得抗性愈伤;DNA分子水平检测显示外源基因已整合到 Qu-1 细胞系基因组上,RNA分子水平检测显示,过表达与RNAi抑制表达的目的基因在不同转基因愈伤中相对表达量存在差异;通过基因编辑获得的转基因愈伤,为纯合突变株。（7）小黑杨单倍体细胞系Qu-1响应ABA处理分析:设置不同浓度梯度ABA对Qu-1细胞系进行不同时间处理,通过对处理后Qu-1细胞系的活性检测,以及对已有报道的应答基因进行定量分析,确定最适的ABA处理浓度,从而建立Qu-1细胞系ABA处理体系。利用100 μM ABA对Qu-1细胞系处理0 h,0.5 h,4 h,12 h和24 h并进行转录组分析,结果表明Qu-1细胞系具有与已知报道的ABA相同的应答通路,鉴于其胁迫处理操作简单方便,可以作为优良的模型系统进行胁迫处理研究。综上所述,小黑杨单倍体细胞系Qu-1的获得及开发应用表明其具有巨大的潜力成为植物领域尤其是林木分子生物学研究的模式细胞系,为相关领域研究提供重要的帮助。
潘兆喜[3]（2020）在《人参不定根悬浮培养体系的优化及5L培养体系的建立》文中指出人参是传统名贵中药,目前人参资源几近枯竭,为保护人参资源,满足市场需求。本研究以人参四种不同来源的外植体为材料,通过比较人参不定根形态学的差别,选择出长势良好的最优无性系。并在此基础上,建立摇瓶培养体系,简易生物反应器培养体系,并优化相关培养参数,最后考察了茉莉酸甲酯诱导下人参不定根在生物反应器中皂苷积累和相关关键酶基因表达量,为人参不定根大规模生产人参皂苷提供理论基础和技术基础,主要结果如下:（1）人参不同外植体均能诱导愈伤组织,人参无菌苗叶更容易诱导愈伤组织,人参无菌苗叶柄诱导愈伤组织更难一些。（2）人参四种外植体愈伤组织再分化不定根数目不同,无菌苗叶柄愈伤组织再分化不定根数目最多,不定根长势更好。（3）以人参无菌苗叶柄愈伤组织诱导而来的不定根为原材料,比较B5培养基中12种无机盐元素浓度（1.0倍,0.5倍）组合对人参不定根生长的影响,并利用软件Mintab试验设计筛选出影响最显着的三个因素,分别为:MgSO4·7H2O、NH4NO3和MnSO4·4H2O,利用响应面法优化得到人参不定根最佳培养条件是MgSO4·7H2O:167.29 mg/L,NH4NO3:84.20 mg/L,MnSO4·4H2O:8.28 mg/L,在此条件下,人参不定根鲜重达11.57 g。（4）250 mL悬浮培养条件的优化:通过单因素实验,研究了激素浓度、接种量大小、摇床转速对人参不定根生长的影响,再以Box-Behnken试验设计及响应面优化得到最佳培养参数为IBA浓度4.18 mg/L,接种量0.509 g,摇床转速128.99 rpm,此时人参不定根悬浮培养皂苷产量2.44 mg;（5）500 mL悬浮培养条件的优化:研究4种不同碳源,3种不同浓度处理,结果发现,蔗糖添加浓度30 g/L时,更适合人参不定根的培养。（6）为了优化5 L生物反应器中不定根培养和皂苷积累的培养体系,研究了接种量、装液量、通气量、蔗糖浓度对人参不定根和皂苷积累的影响,结果表明在5 L生物反应器装液量3 L,通气量0.15 vvm,将10 g的人参不定根接种于优化后的B5培养基（IBA 4mg/L+30 g/L蔗糖pH:5.8）此时不定根皂苷生产量最大,为:52.52 mg。（7）比较四年生栽培参与生物反应器培养不定根皂苷含量,发现四年生人参主根皂苷含量为人参不定根中皂苷含量的6.93倍。生物反应器培养不定根中Rd皂苷含量（0.63 mg/g）接近四年生原植物（0.86 mg/g）。（8）茉莉酸甲酯处理,抑制不定根生物量的积累,提高了达玛烷型人参皂苷的含量,其中Rd在48 h变化倍率最大,处理48时,总苷含量最大。（9）茉莉酸甲酯的诱导处理,促进人参皂苷合成途径中PgFPS、PgUGT、PgDDS基因的上调表达。
刘芳君[4]（2019）在《甘蔗体细胞融合的分子基础研究》文中研究指明甘蔗是喜温作物,甘蔗新台糖22号（ROC22）具有高产高糖等优良特性但耐寒性差,桂糖28号（GT28）是耐寒品种,用ROC22和GT28进行体细胞融合,可望获得耐寒性更强且农艺性状优良的杂交后代。但甘蔗杂合体细胞再生植株目前仍存在很大的困难,原生质体是基因功能分析检测的优质材料,可为研究体细胞融合过程中的分子机理以及解决杂合体细胞再生植株困难提供新的途径。本研究以ROC22和GT28甘蔗品种为材料,探究了甘蔗原生质体RNA提取困难的原因及影响甘蔗原生质体RNA的提取条件,筛选了最适宜甘蔗RNA提取的方法,以甘蔗幼叶和酶解后的原生质体为材料,运用转录组测序技术筛选了甘蔗体细胞融合过程中幼叶酶解前后的差异表达基因,分析了甘蔗杂合体细胞在不同激素浓度下再生相关关键基因的表达情况。研究结果表明:（1）影响甘蔗原生质体RNA提取的两大因素是原生质体RNase活性和渗透压。原生质体RNase活性与原生质体的活力呈极显着负相关,渗透压与原生质体RNase活性呈显着正相关。提取高质量的甘蔗原生质体总RNA需要保证原生质体的活力至少在70%以上,用改良Trizol法提取的甘蔗原生质体总RNA纯度好且产量高。（2）通过对甘蔗幼叶酶解前后的材料进行转录组测序,分析了甘蔗体细胞融合过程中酶解前后的基因表达差异。共得到117411个Unigene,43460个差异表达基因,其中有21123个基因上调表达,22337个基因下调表达。其中与甘蔗体细胞融合密切相关的GO term有发育过程（developmental process）、生长（growth）、细胞增殖（cell proliferation）、转录调控因子活性（transcription regulator activity）、信号转导因子活性（signal transducer activity）、抗氧化活性（antioxidant activity）、氧化胁迫（oxidative stress）、激酶活性（kinase activity）、细胞周期（cell cycle）、细胞分化（cell differentiation）、植物激素信号转导（plant hormone signal transdution）等。杂合体细胞再生相关的关键基因（细胞壁合成、细胞周期调控、细胞增殖、激素信号转导途径）在甘蔗体细胞杂合体细胞融合的不同阶段表达量差异显着,以上结果表明体细胞融合的处理过程可能在分子水平上对杂合体细胞再生植株造成一定程度的影响。（3）将甘蔗杂合体细胞在不同激素浓度下培养,研究了甘蔗杂合体细胞分别在最优和最差激素组合下的生长情况和再生关键基因的差异表达。结果表明,最优激素组合显着提高甘蔗杂合体细胞细胞壁再生速度,且有利于甘蔗杂合体细胞的增殖分裂,在培养30天时,最优激素组合培养条件下的植板率更高;选取了细胞壁合成（GAUT、CESA）、细胞周期调控（Cvclin B、Cyclin A）、细胞增殖（PSK）、生长素和细胞分裂素信号转导途径（Aux/IAA、Cyclin D3、CDC2）8个关键基因,分析了甘蔗杂合体细胞在最优和最差激素组合培养下的8个关键基因的差异表达,结果表明,荧光定量结果与杂合体细胞再生过程的生理指标一致,可见激素是通过调控杂合体细胞再生相关关键基因从而在杂合体细胞再生中起至关重要的作用。
刘小英[5]（2013）在《枇杷细胞悬浮培养体系的建立及优化》文中研究表明论文以不同品种枇杷为试验材料，以诱导的愈伤组织状态以及愈伤含有的Ursolic Acid（UA）及Oleanic acid（OA）含量为指标，选择适宜枇杷细胞悬浮培养的品种、外植体以及适宜的激素配比，建立良好的愈伤组织诱导与继代体系。将该愈伤组织转入液体进行振荡培养，初步建立枇杷细胞悬浮培养系，并在此基础上优化，建立适宜枇杷细胞生长及UA、OA含量积累的培养体系。主要结果如下：1枇杷优良愈伤组织的获得及继代培养试验从枇杷品种、外植体部位、激素配比、显微观察方面研究，获得枇杷悬浮培养适宜的愈伤，结果表明：最适宜枇杷细胞悬浮培养及UA、OA含量积累的枇杷品种为早钟6号，虽然含有的UA、OA含量较低（6.898、2.343mg/g.DW），但其诱导率高（83.697%）、愈伤组织嫩黄、疏松、颗粒明显，为最适枇杷品种。最适外植体为幼胚，花丝诱导率虽高（接近100%），但质地坚硬；叶片及茎尖的诱导率低；而幼胚诱导的愈伤组织，诱导率（83.17%）较高。同时幼胚诱导的愈伤组织的UA及OA（5.099、1.617mg/g.DW）显着高于花丝、叶片、茎尖，为最佳外植体。最合适的幼胚诱导培养基为MS+1.0mg/L2,4-D+0.5mg/LKT，继代培养基为MS+0.5mg/L2,4-D+0.25mg/LKT。显微观察也表明幼胚诱导的愈伤组织最适用于枇杷悬浮培养。同时，试验鉴于花丝诱导的优越性，对花丝愈伤组织进行调控，调控两代后出现细软、嫩黄的愈伤组织，但继代两三次后愈伤组织转白，水渍化，状态不佳，有待进一步研究。2枇杷细胞悬浮培养体系建立在枇杷细胞的液体培养中，细胞生长呈现典型的“S”曲线，培养周期为18d。以细胞FW增长倍数及UA、OA的增长倍数为衡量指标，对悬浮培养体系进行优化。结果表明：悬浮培养最适培养基配方为：MS+NAA0.5mg/L，枇杷细胞鲜重25.863g.FW，为初始3.577倍，UA及OA含量分别为36.490、6.975mg/g.DW，为初始4.744倍、2.881倍。最适接种量80g/L，pH6.0，碳源浓度30g/L，温度25℃，光照400Lux，转速130r/min，装液量130mL/250mL。对最适激素的考察可知，生长素NAA>2,4-D>IBA，细胞分裂素KT>BA，且生长素、细胞分裂素的单独作用效果好于组合作用，及NAA>KT>NAA、KT。同时，试验研究了诱导子对枇杷细胞生长及UA、OA含量的影响，结果表明100mg/LMJ的加入为试验中最适宜的诱导子，鲜重34.65g.FW，UA及OA含量33.089、6.496mg/g.DW，分别为对照CK的1.080、2.540、2.590倍。综上，试验建立了适宜的枇杷细胞悬浮培养体系。3UA及OA含量的提取与测定试验在枇杷叶UA及OA超声提取方法的基础上改良，以95%乙醇为溶剂，对UA、OA的超声提取方法进行优化，得到最适的提取方法为：超声功率50W、超声时间25min、料液比1:40、超声次数2次。在此方法下，测得枇杷细胞内UA及OA的超声提取率分别达99.3%、98.4%。同时，试验结果还表明：建立的HPLC法稳定性好、精确度高，UA、OA的分离度较好，适用于枇杷细胞的UA、OA含量测定。综上所述，试验建立了良好的愈伤组织诱导和继代方法，获得了适宜枇杷悬浮培养的疏松、嫩黄、颗粒状明显的愈伤；在初步建立枇杷悬浮培养体系的基础上，优化悬浮培养条件，建立了适宜枇杷细胞生长及UA、OA含量积累的培养体系。
羿德磊[6]（2012）在《桑树原生质体分离及融合的研究》文中研究指明桑树为多年生木本植物，其生长及育种周期较长，虽然桑树可以通过扦插来扩大栽培面积，但不能保证桑树免受病毒感染和优良种质的延续。随着植物细胞工程的迅猛发展，通过植物细胞工程来改良桑树品种己经成为现代桑树育种的一个必然趋势。目前对于桑树的细胞工程研究多集中在组培快繁、外植体愈伤组织的诱导及转基因等。利用原生质体融合技术进行桑树育种的研究少有报道。鉴于此，本试验以桂桑优12号、农桑14号和新桑11号的组培苗为材料，进行了桑树原生质体的分离培养及其融合的研究，初步筛选出了适合桑树原生质分离与纯化、培养、原生质体融合及杂种筛选等的条件和方法。旨在为桑树体细胞杂交育种研究和种质资源保护等提供理论依据。主要研究结果如下：1.明确了桑树愈伤组织的诱导条件，确定了胚型愈伤组织的获得方法。幼嫩的桑树茎段适合愈伤组织诱导。愈伤组织的诱导培养基为：MS+2,4-D2mg/L；愈伤组织继代培养基为：MS+6-BA1.0mg/L+2,4-D2mg/L，经过3次继代，可得到淡黄色、结构松脆的胚性愈伤组织。2.建立了桑树细胞悬浮培养体系，研究了培养材料、培养基配方、初始接种量、摇床转速、蔗糖浓度、换液量、继代周期、培养过程中pH值变化等因素对桑树细胞悬浮培养体系的影响。确定了桑树细胞悬浮培养的最佳条件：以桂桑优12号的幼嫩胚性愈伤组织作为材料，在液体培养基B5+6-BA1.5mg/L+NAA0.15mg/L上，附加蔗糖40g/L，培养瓶的装液量为25mL/50mL，每瓶接种PCV量为1mL，转速为175rpm的摇床上振荡培养，每5d继代1次，每次换液量为15mL。培养21d时，桑树细胞产量最高，达98.1mg/L，细胞生长速度最快，达183.3mg/（L·d）。3.明确了酶液组成成分与浓度对桑树原生质体分离有很大的影响。试验采用100U/mL纤维素酶R-10、150U/mL果胶酶Y-23和6U/mL离析酶R-10组合酶液来分离原生质体，其中添加了细胞-原生质体洗液（1480mg/L CaCl2·2H2O，27.2mg/L KH2PO4），以0.6mol/L甘露醇作为渗透压调节剂，在28℃酶解温度条件下酶解6h，用桑树胚性悬浮细胞作分离材料可获得7.8×106个/g的原生质体产量，且原生质体活力达91.4%。4.优化了桑树原生质体培养的基本条件和方法。将分离纯化后的桑树原生质体用KPR液体培养基稀释至1×105个/mL，然后在附加6-BA1.0mg/L和2,4-D0.2mg/L，以0.6mol/L葡萄糖作为渗透剂的KPR培养基上，采用低熔点琼脂糖包埋培养。在第56d可以看到第一次细胞分裂，第1317d时发生大量的细胞分裂，培养15d时，桑树原生质体的分裂频率最高，达9.88%，植板率达4.96%。5.试验采用PEG-高Ca2+高pH法诱导桂桑优12号原生质体和农桑14号原生质体进行不对称融合。融合前将供体和受体材料分别进行UV辐射处理和IOA处理，研究UV辐射和IOA对原生质体分裂及生长钝化作用，结果表明将供体桂桑优12号原生质体进行辐射强度300μW/（cm2）时，处理时间6min为宜；将受体农桑14号原生质体用16mmo1/L IOA处理10min钝化。在桑树原生质体的融合过程中，诱导剂的分子量和浓度、处理时间和原生质体密度等对原生质体都有影响。试验选用PEG6000浓度为35%时，在原生质体密度为0.5×105个/mL中诱导处理15min时，桑树原生质体聚合率达51.47%，且对桑树原生质体的融合效果好。对融合后的原生质体进行再培养，2h后可以观察到原生质体的聚集，培养2530d形成了肉眼可见的愈伤组织块。
张晓丽[7]（2012）在《青天葵组织培养与原生质体分离的研究》文中提出青天葵[Nervilia fordii （Hance） Schitr.]是我国珍稀濒危植物,主要以球茎进行繁殖,繁殖系数极低,加之多年来灭绝式的挖掘,导致野生青天葵资源日益枯竭。而国内外市场的需求量却逐年加大,野生青天葵己远远满足不了市场的需求。因此,组织培养与人工种植成为保护野生青天葵资源和解决供需矛盾的有效途径。建立该植物扩繁体系可为其药材野生品种转家种,进行人工栽培提供技术基础。为建立更加稳定完善的青天葵扩繁体系,本研究在前期研究结果基础上进行了优化。细胞悬浮培养可直接用于原生质体分离、培养与杂交、基因转移和生产次生代谢物等。本实验在成功获得稳定的青天葵愈伤组织培养体系的基础上,对青天葵悬浮细胞培养进行了初步研究,取得初步进展。组织培养和人工种植是保护野生青天葵资源和解决供需矛盾的有效途径,而组培再生植株与人工种植植株的品质如何,能否真正替代野生青天葵,尚缺乏系统的研究。由于在前期实验中已成功培养得到青天葵组培球茎,因此,将组培球茎同栽培青天葵进行解剖结构及化学成分比较,以研究青天葵组培物与人工栽培植株的差异。同时,本研究尝试以青天葵叶片为材料,进行原生质体分离,为青天葵转基因、原生质体融合及青天葵生物学基础理论研究提供新的实验体系。本论文主要研究结果如下：1、以青天葵新鲜球茎为外植体,发现1.0g.L-1升汞溶液处理球茎10min、玻璃培养皿有利于青天葵球茎的诱导；青天葵走茎及愈伤组织在M③（MS+1.0mg·L-16-BA）培养基中培养可得到大量丛生芽及愈伤组织,多次继代培养可得到完整植株；组培苗基本生长模式为：球茎外植体一白色走茎一绿色走茎一组培球茎一组培苗。但该过程历时久,组培苗生长力较弱,尚不具备炼苗下田和批量生产的条件。2、经过多次继代培养,得到生命力强、颗粒状、疏松易碎的浅黄白色胚性愈伤组织；愈伤细胞在1／4MS和1／2MS培养基上生长良好,优于其他培养基；1／2MS组培养物干重增加率最大,MDA含量最低,POD含量最高,说明此种培养基适宜青天葵愈伤组织的生长和有机物的积累；光照悬浮培养有利于愈伤组织总黄酮含量的积累,而暗培养条件有利于愈伤组织干重增加率的增加；当以获得大量培养物为目的时可调整液体培养基蔗糖浓度为1%,当以获得黄酮类化学成分为培养目的时可将蔗糖浓度增加至3%；调培养基pH值为6.0,并添加1.0g·L-1MES,可能增加青天葵愈伤组织悬浮培养物的干重增加率及总黄酮含量。3、经过对比发现,青天葵组培物与栽培植株之间主要存在以下差异：组培芽横切面明显可见维管束10束,导管不明显,呈不规则环状排列,中部维管束不甚明显,栽培植株走茎维管束为6束,维管束与周围薄壁细胞区分不显着,而维管束中的导管清晰可见；组培物中未见草酸钙针晶束和内生菌,栽培植株中针晶束较多,有内生菌分布；组培球茎维管束3束,清晰可见,栽培植株球茎维管束不明显。经过LC-MS检测后发现,青天葵组培物中可能含有比栽培植物更多的化学成分,但是由于受实验材料、时间等限制,未能对其进行定性,有待于后期的深入研究。4、适宜青天葵叶片原生质体分离的条件是：1.0%纤维素酶R-10+0.6%离析酶R-10的混合酶液酶解12h,在此条件下原生质体产量达6.85×106（个/g）,存活率为92.91%；适宜青天葵叶片原生质体游离的条件是：13%甘露醇溶液预处理叶片1h、酶解温度（25±1）℃、黑暗、静置；原生质体纯化采用离心沉淀法,以200目细胞筛网过滤后800rpm离心8min,重复操作2次,可得到大量完整清晰、细胞碎片少的原生质体。
王震[8]（2010）在《巴西橡胶树胶乳非细胞凋亡体系的研究及应用》文中研究表明本研究以橡胶树胶乳和烟草为研究材料,进行巴西橡胶树胶乳非细胞凋亡体系的研究。鉴定转HbMyb1基因烟草。通过形态学鉴定、PCR检测及Southern检测,证明实验所用的烟草为转HbMyb1基因烟草。建立烟草细胞悬浮培养体系,实验结果表明：以MS+2,4-D 0.5mg/L+KT 0.5mg/L+琼脂7.5g/L诱导烟草愈伤效果最好；最佳继代培养基为MS+2,4-D 0.3mg/L+KT0.3mg／L+琼脂7.5g／L,继代四代之后可获得脆散性愈伤组织；将所得脆散性愈伤组织接种于MS+2,4-D 0.2mg,L+KT 0.2mg／L+0.1％水解酪蛋白液体培养基中,可获得生长迅速、颜色淡黄、分散性和均一性均较好的烟草细胞悬浮系；第7天为烟草悬浮培养细胞的最佳继代时间。采用不同方法采集胶乳,提取胶乳DNA,结果显示不同采集方法对胶乳DNA的完整性没有明显影响。胶乳经超速离心后分为三层（上层主要是橡胶粒子,中间层是胶乳的可溶性胞质成分,下层主要是黄色体）,分别对这三层提取DNA,发现DNA几乎全部集中于黄色体层中。证明胶乳的可溶性胞质中几乎不含有DNA,不会干扰到后续的实验。在胶乳非细胞体系加入细胞色素c,至终浓度为2.5μmol/L,可将该非细胞体系转化为凋亡诱导体系。在该体系中加入烟草细胞核,23℃温浴,可诱导烟草细胞核发生细胞凋亡,TUNEL检测呈阳性,琼脂糖凝胶电泳产生典型的DNA Ladder.在诱导烟草细胞核发生细胞凋亡的过程中,发现转HbMyb1基因烟草细胞核发生凋亡的时间晚于野生型烟草细胞核。对健康树和死皮树胶乳非细胞体系进行In-gel nuclease assay分析的初步结果示,两者的核酸酶带型有差异。死皮树胶乳核酸酶在33-48KD之间出现2条特异带。
徐蓓蕾[9]（2009）在《黄芩组织培养及毛状根诱导》文中研究表明黄芩为唇形科植物Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根,有清热燥湿、泻火解毒、止血,安胎等功效。由于黄芩的生物活性多样,极具开发价值,呈现出供不应求的市场局面。野生资源日渐匮乏,栽培黄芩应允而生,然而栽培黄芩生长速度缓慢,仍然不能满足与日剧增的市场需要。采用组织培养及毛状根培养等方法生产次生代谢产物成为一种可行且必要的措施。本课题从生物学角度出发,采用不同的诱导条件及培养条件,对黄芩愈伤组织进行诱导及培养,选出最佳的诱导部位、外植体、诱导期,其最佳选择为生长约60d的长0.81.1cm的带节茎段;同时筛选出最佳诱导条件为MS+6-BA0.5 mg/L +NAA0.5 mg/L,光照条件为12h/d等。此种培养基上黄芩愈伤组织的诱导率最高,颜色鲜黄绿色,疏松,愈伤块大,增殖较快,生长旺盛。而MS+6-BA1.0 mg/L +NAA0.5 mg/L培养基对于丛芽诱导最有利,丛芽生长旺盛。实验中还发现丛芽在不添加激素或只添加NAA的培养基中均可生根。添加前体化合物、诱导子,考察不同种类不同浓度的前体化合物、诱导子对黄芩愈伤组织中苯丙氨酸解氨酶PAL的影响。添加1mmol/L乙酸钠（NaAc）前体化合物、0.001g/L酵母诱导子对提高PAL酶活性有利,添加AgNO3诱导子亦可提高PAL酶活性,但不同浓度间对其活性影响的差别较小。不同前体化合物、诱导子对其过氧化物同工酶谱也有不同程度的影响。实验中发现几组谱带的颜色存在一定差异,且添加NaAc前体物的谱带较其他两者多出一条带。本课题利用发根农杆菌A4诱导黄芩毛状根,所采用的实验材料为直接灭菌的黄芩外植体、黄芩的愈伤组织等,初步诱导出黄芩毛状根,比较不同的诱导条件及方法,本实验表明若采用直接灭菌的外植体,菌液浓度为OD600=0.6,预培养2d,共培养3d,其出根时间约17d,其分支较多,无向地性,具有激素自养性。若采用愈伤组织诱导黄芩毛状根菌液浓度为OD600=0.4,侵染后培养2d为宜,出根时间晚,约30d,诱导率低。结果表明采用两种实验材料进行黄芩毛状根诱导仍需进一步探讨。实验中分离出黄芩愈伤组织原生质体的细胞团,并对不同的实验条件进行了比较,结果表明:1%纤维素酶、1%果胶酶、0.25%离析酶,酶解3h,而后1000rpm离心5min,加入蔗糖后800rpm,离心5min对于本实验最合适。原生质体可以作为黄芩毛状根诱导的又一良好的材料。虽未分离出独立的原生质体,但实验条件的摸索可以为今后的实验提供一定的基础。
骆美洁[10]（2009）在《柑橘胚性愈伤组织中四倍体变异细胞的凋亡研究》文中进行了进一步梳理植物组织培养中体细胞染色体数目存在变异现象,已有研究表明,部分植物在离体培养条件下,其染色体多倍化变异往往会随着培养时间的延长而增加。然而,柑橘愈伤组织在长期的继代培养过程中染色体其倍性组成却保持相对稳定,部分愈伤组织在继代10多年后仍然具有较强的胚胎发生能力。本实验室研究推测二倍体愈伤组织中的四倍体细胞在不断产生的同时,以高频率的细胞凋亡方式被淘汰,从而维持四倍体细胞比率的相对稳定。为了验证这一假说,利用带有绿色荧光蛋白标记的‘国庆一号’温州蜜柑（CitrusUnshiu‘Guoqing No.1’Satsuma mandarine）二倍体愈伤组织与经原生质体低密度包埋培养得到的四倍体愈伤纯系进行共培养,研究其相互作用,以四倍体愈伤组织单独培养作为对照,主要研究结果如下:1.对与二倍体愈伤组织混合悬浮振荡共培养的四倍体愈伤组织进行切片形态检测,统计其不同培养时间的凋亡率,TUNEL法检测其在不同培养比率和不同培养质量共培养条件下凋亡率。统计结果表明,共培养和单独培养的四倍体细胞凋亡率均随着培养时间的延长而增加;在不同培养阶段,共培养中的四倍体细胞凋亡率均要高于单独培养,且在培养8d、11d和17d后,存在显着性差异（p＜0.05）;随着总培养质量和二倍体比例的增加,四倍体凋亡率也呈递增趋势。2.对悬浮共培养中的四倍体细胞进行半薄切片及其活体核分离,荧光染料DAPI染色观察表明,悬浮培养中发生细胞凋亡的柑橘愈伤细胞具有典型的细胞凋亡特征,包括细胞核中染色质凝聚、片段化和凋亡小体状结构出现。3.分别对混合共培养及单独培养中的四倍体愈伤细胞和二倍体愈伤细胞凋亡率和细胞周期进行分析发现,相对于单独培养,二倍体愈伤细胞凋亡率及细胞周期变化均不存在显着性差异,而四倍体愈伤细胞凋亡率在共培养中显着增加,细胞周期在S期有显着性滞留（p＜0.05）,推测混合共培养中的四倍体愈伤细胞通过S期细胞诱导而发生细胞凋亡。4.为了研究四倍体愈伤细胞与二倍体愈伤细胞间的互作是否需要接触,设计了隔离共培养装置。即不同倍性愈伤组织被0.45μm微孔滤膜隔开,不能接触,而悬浮培养液能自由通过,保证不同倍性愈伤组织之间能通过分泌化学物质进行相互通讯。TUNEL检测结果表明,隔离共培养中的四倍体愈伤细胞凋亡率仍然显着性高于单独培养（p＜0.05）,表明四倍体愈伤与二倍体愈伤细胞之间相互作用不需要接触,而通过分泌的水溶性化学物质作用。5.为了探寻细胞周期调节蛋白和植物中介导细胞凋亡相关的蛋白是否在四倍体愈伤细胞凋亡中作用,克隆cyclinB2;1,cyclinD3;2,CDKB2;1周期调节蛋白基因和metacaspase1和metcaspas2两个介导植物细胞凋亡的metacaspase蛋白家族基因,并对其表达量进行实时定量分析。结果表明cyclinB2;1,cyclinD3;2和CDKB2;1在隔离共培养中的四倍体愈伤中表达量比单独培养时下降,metacaspase1,metcaspas2表达量则上升。其中cyclinD3;2和metcaspas2表达量存在显着性差异（p＜0.05）。推测,cyclinB2;1,cyclinD3;2,CDKB2;1在四倍体细胞周期调节中作用,且metacaspase1,metcaspas2在四倍体细胞凋亡中作用。6.为了从单细胞水平对四倍体愈伤细胞凋亡进行研究,分离四倍体和二倍体愈伤的原生质体进行相关操作。低密度包埋单独培养四倍体和二倍体原生质对其第一次有丝分裂进行观察,观察结果表明其二倍体与四倍体原生质体均在7d进行第一次有丝分裂。原生质体浅层培养TUNEL检测共培养与单独培养中四倍体和二倍体原生质体凋亡,检测结果表明单独培养及混合培养均可见凋亡细胞。
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 苹果遗传转化技术 |
| 1.1.1 苹果同源遗传转化技术 |
| 1.1.2 苹果异源遗传转化技术 |
| 1.2 植物原生质体技术研究进展 |
| 1.3 植物组成型启动子 |
| 1.3.1 CaMV35S启动子 |
| 1.3.2 拟南芥泛素10(UBQ10)基因启动子 |
| 1.4 植物先天免疫防御机制 |
| 1.4.1 病原菌相关分子模式激发的免疫(PTI) |
| 1.4.1.1 FLS2 介导的植物PTI抗性 |
| 1.4.1.2 EFR和 CERK1 介导的植物PTI抗性 |
| 1.4.2 病原菌效应因子激发的免疫(ETI) |
| 1.4.2.1 ETI的“警卫”模型 |
| 1.4.2.2 ETI的“诱饵”模型 |
| 1.5 研究目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 植物试材 |
| 2.1.2 菌株 |
| 2.1.3 表达载体 |
| 2.2 生物化学试剂 |
| 2.3 仪器设备及耗材 |
| 2.4 溶液和培养基配制 |
| 2.4.1 Western blot和蛋白纯化 |
| 2.4.2 琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.4.3 正钒酸钠激活储存液 |
| 2.4.4 培养基 |
| 2.4.4.1 LB(Luria-Bertani)培养基 |
| 2.4.4.2 ‘王林’愈伤组织MS培养基 |
| 2.4.4.3 ‘紫红’愈伤组织MS培养基 |
| 2.4.4.4 拟南芥MS培养基 |
| 2.4.5 质粒大量提取 |
| 2.4.6 原生质体分离和转化 |
| 2.4.7 Luciferase报告试验 |
| 2.4.8 免疫共沉淀(Co-IP) |
| 2.4.9 体外激酶试验 |
| 2.4.10 植物RNA提取(CATB法) |
| 2.5 实验方法 |
| 2.5.1 基因序列信息检索、引物设计和启动子调控元件预测 |
| 2.5.2 植物试材培养 |
| 2.5.2.1 ‘王林’愈伤组织继代培养 |
| 2.5.2.2 ‘紫红’愈伤组织继代培养 |
| 2.5.2.3 本生烟烟草(Nicotiana benthamiana)培养 |
| 2.5.2.4 野生哥伦比亚生态型拟南芥(Arabidopsis thaliana col-0)培养 |
| 2.5.3 重组表达载体构建策略 |
| 2.5.3.1 重组瞬时表达载体构建策略 |
| 2.5.3.2 重组二元表达载体构建策略 |
| 2.5.4 植物总RNA提取(CTAB法) |
| 2.5.5 cDNA第一链的合成 |
| 2.5.6 植物基因组DNA提取(试剂盒法) |
| 2.5.7 载体构建 |
| 2.5.7.1 基因和启动子克隆 |
| 2.5.7.2 琼脂糖凝胶回收 |
| 2.5.7.3 阳性选择克隆载体构建 |
| 2.5.7.4 转化大肠杆菌感受态 |
| 2.5.7.5 菌落PCR鉴定阳性转化 |
| 2.5.7.6 阳性克隆载体的提取与目的片段酶切回收 |
| 2.5.7.7 目标表达载体的酶切和目标核酸片段连接 |
| 2.5.7.8 目标重组表达载体的筛选鉴定 |
| 2.5.8 重组载体定向突变 |
| 2.5.9 质粒大量提取 |
| 2.5.10 原生质体分离 |
| 2.5.10.1 苹果愈伤组织原生质体分离 |
| 2.5.10.2 拟南芥原生质体分离 |
| 2.5.11 PEG介导的原生质体转化和瞬时表达 |
| 2.5.12 原生质体免疫共沉淀(Co-IP) |
| 2.5.13 原生质体luciferase报告试验 |
| 2.5.14 蛋白质印迹试验(western blot) |
| 2.5.15 MBP融合蛋白制备 |
| 2.5.15.1 pMAL重组载体转化大肠杆菌DE3 感受态 |
| 2.5.15.2 MBP融合蛋白原核诱导表达与纯化 |
| 2.5.16 体外激酶试验 |
| 2.5.17 转化农杆菌LBA4404 感受态 |
| 2.5.17.1 农杆菌LBA4404 感受态的制备 |
| 2.5.17.2 转化农杆菌LBA4404 感受态 |
| 2.5.17.3 农杆菌阳性转化单克隆菌落鉴定和保存 |
| 2.5.18 苹果愈伤组织遗传转化和阳性转化细胞系鉴定 |
| 2.5.18.1 苹果愈伤组织遗传转化 |
| 2.5.18.2 阳性转化细胞系鉴定 |
| 2.5.19 农杆菌介导烟草叶片下表皮细胞瞬时转化 |
| 2.5.20 GFP荧光信号显微观察 |
| 2.5.20.1 烟草叶片下表皮细胞GFP荧光信号显微观察 |
| 2.5.20.2 苹果原生质体GFP荧光信号显微观察 |
| 2.5.21 原生质体显微观察、计数和直径计算 |
| 2.5.21.1 原生质体显微观察 |
| 2.5.21.2 原生质体显微计数 |
| 2.5.21.3 原生质体平均直径计算 |
| 2.5.22 数理统计分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 苹果愈伤组织原生质体分离及条件优化 |
| 3.1.1 酶解时间、蔗糖和果胶酶对‘王林’苹果愈伤组织原生质体分离产量的影响 |
| 3.1.2 不同愈伤组织继代培养时间对原生质体分离产量的影响 |
| 3.2 Pro-BIUTNT启动子驱动目标基因在苹果原生质体中高效表达 |
| 3.2.1 Pro-BIUTNT启动子驱动参试基因在苹果原生质体中高效表达 |
| 3.2.2 不同愈伤组织继代培养时间和原生质体表达时间对目标蛋白表达水平的影响 |
| 3.2.3 Pro-MdBIUTNT启动子的不同区段在苹果原生质体中的活性比较 |
| 3.2.4 Pro-BIUTNT和 CaMV35S启动子在拟南芥和苹果原生质体中的活性比较 |
| 3.2.5 Pro-BIUTNT和 Pro-MdBIUTNT序列比对、相似度计算和相关调控元件预测 |
| 3.2.6 苹果细胞对Md MAPK6 的动态调控 |
| 3.2.7 Rubisco基因相关启动子在苹果原生质体中的驱动表达活性 |
| 3.3 Pro-BIUTNT高效驱动GFP融合蛋白在苹果原生质体和烟草表皮细胞中瞬时表达 |
| 3.3.1 Pro-BIUTNT驱动目标GFP融合蛋白在苹果原生质体中高效表达 |
| 3.3.2 Pro-BIUTNT驱动目标GFP融合蛋白在烟草叶片下表皮细胞中高效表达 |
| 3.4 基于Pro-BIUTNT的苹果原生质体瞬时表达技术在苹果免疫调控研究中的应用 |
| 3.4.1 flg22 诱导At BAK1和At FLS2 在苹果原生质体中的特异性蛋白互作 |
| 3.4.2 MKK7-MdMAPK6-MdWRKY33 介导的苹果PTI信号途径 |
| 3.4.3 Avr Rpt2 介导的苹果ETI抗性机制 |
| 3.4.3.1 AvrRpt2 和苹果细胞内源机制介导的RIN4 特异性剪切 |
| 3.4.3.2 生长素负反馈调控苹果原生质体Avr Rpt2 蛋白水平 |
| 4 讨论 |
| 4.1 酶解时间和愈伤组织培养时间对苹果原生质体分离和瞬时表达的影响 |
| 4.2 UBQ10 基因启动子高效促进目标基因在苹果原生质体中表达 |
| 4.3 5’-UTR和基因特异性调控对目标蛋白表达水平的影响 |
| 4.3.1 5’-UTR对目标蛋白表达水平的影响 |
| 4.3.2 基因特异性调控对目标蛋白表达水平的影响 |
| 4.4 AvrRpt2 介导的苹果特异ETI防御机制 |
| 4.4.1 不依赖于AvrRpt2的RIN4 细胞内源性剪切 |
| 4.4.2 生长素负调控苹果原生质体中AvrRpt2 的蛋白水平 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 细胞系 |
| 1.2.1 HeLa细胞系 |
| 1.2.2 植物细胞系 |
| 1.3 植物单倍体的研究进展 |
| 1.3.1 植物单倍体的获得过程和方法 |
| 1.3.2 植物单倍体的鉴定方法 |
| 1.3.3 植物单倍体的重要应用价值 |
| 1.4 杨树单倍体研究进展 |
| 1.5 杨树基因组研究进展 |
| 1.6 研究目的和意义 |
| 1.7 主要研究内容及技术路线 |
| 1.7.1 主要研究内容 |
| 1.7.2 技术路线 |
| 2 小黑杨单倍体愈伤组织诱导及再生体系的建立 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 实验耗材及试剂材料 |
| 2.1.3 实验仪器设备 |
| 2.1.4 实验试剂配制 |
| 2.1.5 培养基配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 小黑杨单倍体愈伤组织的诱导 |
| 2.2.2 小黑杨单倍体愈伤组织的鉴定 |
| 2.2.3 小黑杨单倍体愈伤组织再生植株的诱导 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 小黑杨单倍体愈伤诱导体系的建立 |
| 2.3.2 小黑杨单倍体愈伤组织的获得 |
| 2.3.3 小黑杨单倍体愈伤组织再生植株诱导体系的建立 |
| 2.4 本章讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 3 小黑杨单倍体细胞系Qu-1的获得及生长特性研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 植物材料 |
| 3.1.2 实验耗材及试剂材料 |
| 3.1.3 实验仪器设备 |
| 3.1.4 实验试剂配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 小黑杨单倍体细胞系Qu-1悬浮培养体系的建立 |
| 3.2.2 小黑杨单倍体细胞系Qu-1的生长特性分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 小黑杨单倍体细胞系培养体系的建立 |
| 3.3.2 小黑杨单倍体细胞系Qu-1的生长特性研究 |
| 3.4 本章讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 4 小黑杨单倍体细胞系Qu-1全基因组测序 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 植物材料 |
| 4.1.2 材料测序 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 DNA提取 |
| 4.2.2 DNA建库测序 |
| 4.2.3 RNA提取及测序 |
| 4.2.4 Hi-C建库及测序 |
| 4.2.5 DNA数据清洗和过滤 |
| 4.2.6 RNA数据清洗和过滤 |
| 4.2.7 k-mer分析及基因组评估 |
| 4.2.8 基因组组装及挂载 |
| 4.2.9 重复序列查找 |
| 4.2.10 非编码RNA结构注释 |
| 4.2.11 编码基因结构注释 |
| 4.2.12 编码基因功能注释 |
| 4.2.13 基因组可视化 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 数据质控与统计 |
| 4.3.2 k-mer分析及基因组评估 |
| 4.3.3 基因组的组装与挂载 |
| 4.3.4 基因组中基因结构与功能注释 |
| 4.3.5 基因组可视化 |
| 4.4 本章讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 5 小黑杨单倍体细胞系Qu-1瞬时遗传转化体系的建立 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 植物材料 |
| 5.1.2 载体质粒和感受态 |
| 5.1.3 实验耗材及试剂材料 |
| 5.1.4 实验仪器设备 |
| 5.1.5 实验试剂配制 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 小黑杨单倍体细胞系Qu-1农杆菌瞬时遗传转化体系的建立 |
| 5.2.2 小黑杨单倍体细胞系Qu-1原生质体分离及转化 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 小黑杨单倍体细胞系Qu-1的农杆菌瞬时遗传转化结果观察 |
| 5.3.2 小黑杨单倍体细胞系Qu-1原生质体分离及转化 |
| 5.4 本章讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 6 小黑杨单倍体细胞系Qu-1稳定遗传转化体系的建立 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.1.1 植物材料 |
| 6.1.2 载体质粒和感受态 |
| 6.1.3 实验耗材及试剂材料 |
| 6.1.4 实验仪器设备 |
| 6.1.5 实验试剂配制 |
| 6.1.6 培养基配制 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 基因克隆及植物表达载体的构建 |
| 6.2.2 农杆菌介导的小黑杨单倍体细胞系Qu-1的稳定遗传转化 |
| 6.2.3 转基因植株的鉴定 |
| 6.3 实验结果 |
| 6.3.1 基因克隆及植物表达载体的构建 |
| 6.3.2 转基因愈伤组织的鉴定 |
| 6.4 本章讨论 |
| 6.5 本章小结 |
| 7 小黑杨单倍体细胞系Qu-1响应ABA处理RNA-seq分析 |
| 7.1 实验材料 |
| 7.1.1 植物材料 |
| 7.1.2 实验耗材及试剂材料 |
| 7.1.3 实验试剂配制 |
| 7.1.4 实验仪器设备 |
| 7.2 实验方法 |
| 7.2.1 小黑杨单倍体细胞系Qu-1 ABA处理体系的建立 |
| 7.2.2 小黑杨单倍体细胞系Qu-1响应ABA处理 |
| 7.2.3 转录组数据分析 |
| 7.3 实验结果 |
| 7.3.1 小黑杨单倍体细胞系Qu-1 ABA处理体系的建立 |
| 7.3.2 RNA样品质检 |
| 7.3.3 转录组数据分析 |
| 7.4 本章讨论 |
| 7.5 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
| 东北林业大学博士学位论文修改情况确认表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 人参概述 |
| 1.2 人参细胞工程研究进展 |
| 1.3 药用植物不定根规模化培养研究进展 |
| 1.4 本研究的目的与意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验设备与试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.4 检测方法 |
| 第三章 结果与分析 |
| 3.1 人参不定根固体培养 |
| 3.2 人参不定根悬浮培养体系的建立 |
| 3.3 人参不定根优良无性系扩繁 |
| 3.4 人参不定根5L悬浮培养体系的建立和条件优化 |
| 3.5 茉莉酸甲酯诱导处理不定根 |
| 第四章 讨论与结论 |
| 4.1 讨论 |
| 4.2 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 前言 |
| 1.1 体细胞融合概述 |
| 1.1.1 原生质体的分离 |
| 1.1.2 原生质体融合 |
| 1.1.3 杂合体细胞的筛选 |
| 1.1.4 杂合体细胞的培养 |
| 1.2 甘蔗体细胞融合研究进展 |
| 1.3 甘蔗体细胞融合存在的瓶颈 |
| 1.4 体细胞融合相关分子生物学研究进展 |
| 1.5 激素是调控原生质体再生植株的关键因素 |
| 1.5.1 激素对原生质体细胞壁再生的影响 |
| 1.5.2 激素对细胞周期的影响 |
| 1.5.3 激素对细胞增殖的影响 |
| 1.5.4 激素对体细胞胚形成的影响 |
| 1.5.5 激素对器官分化的影响 |
| 1.6 本研究的目的和意义 |
| 1.7 技术路线 |
| 第二章 甘蔗原生质体RNA提取条件和方法的优化 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 研究材料 |
| 2.1.2 甘蔗幼叶酶解方法 |
| 2.1.3 甘蔗原生质体钝化方法 |
| 2.1.4 甘蔗原生质体融合方法 |
| 2.1.5 原生质体活力检测 |
| 2.1.6 原生质体RNase活性测定方法 |
| 2.1.7 原生质体RNA含量测定方法 |
| 2.1.8 总RNA提取方法 |
| 2.1.9 RNA检测 |
| 2.1.10 RT-PCR |
| 2.1.11 数据分析 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 不同甘蔗原生质体活力对RNase活性的影响 |
| 2.2.2 不同甘蔗原生质体活力对核酸含量的影响 |
| 2.2.3 不同甘蔗原生质体活力对RNA提取效果的影响 |
| 2.2.4 不同渗透压对甘蔗原生质体RNase活性的影响 |
| 2.2.5 不同渗透压对甘蔗原生质体核酸含量的影响 |
| 2.2.6 不同渗透压对甘蔗原生质体活力的影响 |
| 2.2.7 RNase活性与甘蔗原生质体活力、渗透压相关性分析 |
| 2.2.8 不同提取方法对甘蔗原生质体RNA提取效果的影响 |
| 2.2.9 体细胞融合不同阶段对甘蔗原生质体RNase活性的影响 |
| 2.2.10 体细胞融合不同阶段对甘蔗原生质体核酸含量的影响 |
| 2.2.11 体细胞融合不同阶段对原生质体活力的影响 |
| 2.2.12 体细胞融合不同阶段对原生质体渗透压的影响 |
| 2.2.13 体细胞融合不同阶段原生质体RNA的提取效果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 RNase是影响RNA提取的主要因素 |
| 2.3.2 原生质体活力是影响RNase活性及RNA提取成功与否的直接因素 |
| 2.3.3 渗透压对RNase活性的直接影响和间接影响 |
| 2.3.4 甘蔗体细胞融合过程中原生质体RNA提取困难的原因 |
| 2.3.5 选用合适的提取方法是甘蔗原生质RNA提取成功的重要因素 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 甘蔗体细胞融合过程中(幼叶酶解前后)转录组学研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 转录组测序的样品处理及采集 |
| 3.1.2 转录组测序的文库建立 |
| 3.1.3 测序数据质量控制 |
| 3.1.4 转录本拼接 |
| 3.1.5 基因功能注释 |
| 3.1.6 基因表达量计算 |
| 3.1.7 基因差异表达分析 |
| 3.1.8 差异基因GO富集分析 |
| 3.1.9 差异基因KEGG富集分析 |
| 3.1.10 qRT-PCR验证转录组数据可靠性 |
| 3.1.11 数据分析 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 甘蔗体细胞融合过程中（幼叶酶解前后）转录组学研究的幼叶及细胞采样要求 |
| 3.2.2 甘蔗体细胞融合过程中（幼叶酶解前后）转录组学研究对RNA提取质量的验证 |
| 3.2.3 甘蔗体细胞融合过程中（幼叶酶解前后）转录组学研究测序数据质置评估 |
| 3.2.4 甘蔗体细胞融合过程中（幼叶酶解前后）转录组学研究转录本拼接 |
| 3.2.5 甘蔗体细胞融合过程中(幼叶酶解前后)差异表达基因数量分析 |
| 3.2.6 qRT-PCR验证结果 |
| 3.2.7 差异基因表达水平的聚类分析 |
| 3.2.8 差异表达基因的GO功能分析 |
| 3.2.9 差异表达基因的KEGG富集分析 |
| 3.2.10 酶解前后再生植株相关差异表达基因分析 |
| 3.2.11 再生关键基因在甘蔗体细胞融合不同阶段中的差异表达 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 细胞壁再生相关基因 |
| 3.3.2 细胞周期调控相关基因 |
| 3.3.3 细胞增殖相关基因 |
| 3.3.4 植物激素信号转导途径相关基因 |
| 3.3.5 体细胞胚形成相关基因 |
| 3.3.6 胁迫相关基因 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 激素调控甘蔗杂合体细胞再生过程中关键基因的表达 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 研究材料 |
| 4.1.2 甘蔗幼叶酶解方法 |
| 4.1.3 甘蔗原生质体钝化方法 |
| 4.1.4 甘蔗原生质体融合方法 |
| 4.1.5 甘蔗杂合体细胞培养方案 |
| 4.1.6 原生质体细胞壁的检测 |
| 4.1.7 原生质体分裂频率的检测 |
| 4.1.8 原生质体植板率的检测 |
| 4.1.9 原生质体RNA提取方法与RNA的检测 |
| 4.1.10 RT-PCR |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 不同激素浓度对甘蔗杂合体细胞壁再生的影响 |
| 4.2.2 不同激素浓度对甘蔗杂合体细胞分裂能力和植板率的影响 |
| 4.2.3 不同激素浓度对甘蔗杂合体细胞再生过程中GAUT表达的影响 |
| 4.2.4 不同激素浓度对甘蔗杂合体细胞再生过程中CESA表达的影响 |
| 4.2.5 不同激素浓度对甘蔗杂合体细胞再生过程中Cyclin A表达的影响 |
| 4.2.6 不同激素浓度对甘蔗杂合体细胞再生过程中Cyclin B表达的影响 |
| 4.2.7 不同激素浓度对甘蔗杂合体细胞再生过程中PSK表达的影响 |
| 4.2.8 不同激素浓度对甘蔗杂合体细胞再生过程中Aux/IAA表达的影响 |
| 4.2.9 不同激素浓度对甘蔗杂合体细胞再生过程中cyclin D3表达的影响 |
| 4.2.10 不同激素浓度对甘蔗杂合体细胞再生过程中cdc2表达的影响 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 激素与甘蔗杂合体细胞的再生密切相关 |
| 4.3.2 杂合体细胞再生与激素对细胞壁再生相关基因的调控密切相关 |
| 4.3.3 杂合体细胞再生与激素对细胞周期相关基因的调控密切相关 |
| 4.3.4 杂合体细胞再生与激素对细胞增殖相关基因的调控密切相关 |
| 4.3.5 杂合体细胞再生与激素对信号转导相关基因的调控密切相关 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 结论 |
| 5.1 全文总结 |
| 5.2 问题与展望 |
| 5.3 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
| 目录 |
| 缩略词 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 枇杷离体培养研究进展 |
| 1.1 叶片培养 |
| 1.2 茎尖培养 |
| 1.3 胚培养 |
| 1.4 胚乳培养 |
| 1.5 花药培养 |
| 1.6 原生质体培养 |
| 2 植物细胞悬浮培养技术 |
| 2.1 悬浮培养技术的发展概况 |
| 2.2 细胞悬浮培养技术的影响因子 |
| 2.2.1 起始密度 |
| 2.2.2 激素 |
| 2.2.3 转速 |
| 2.2.4 pH 值 |
| 2.2.5 光照 |
| 2.2.6 营养物质 |
| 2.2.7 供氧状况 |
| 2.3 提高植物细胞次生代谢产物的措施 |
| 2.3.1 筛选高产细胞系 |
| 2.3.2 添加诱导子 |
| 2.3.3 前体饲喂 |
| 2.3.4 适宜的培养方法 |
| 2.4 枇杷同科属植物的细胞悬浮培养 |
| 3 熊果酸和齐墩果酸的研究进展 |
| 3.1 熊果酸和齐墩果酸 |
| 3.2 熊果酸和齐墩果酸的药理作用 |
| 3.3 熊果酸和齐墩果酸的合成途径 |
| 3.4 枇杷叶片 UA 和 OA 的提取工艺流程 |
| 3.5 熊果酸和齐墩果酸的提取及 HPLC 测定 |
| 4 研究技术路线 |
| 5 研究目的及研究内容 |
| 第二章 枇杷愈伤组织诱导与继代保持 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 材料处理及消毒 |
| 1.2.2 枇杷愈伤诱导的优化 |
| 1.2.3 花丝愈伤状态调控 |
| 1.3 统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 激素配比对枇杷愈伤组织诱导的影响 |
| 2.2 枇杷品种对愈伤组织诱导及 UA、OA 含量的影响 |
| 2.3 外植体对愈伤组织诱导及 UA、OA 含量的影响 |
| 2.4 枇杷愈伤组织继代方式的选择 |
| 2.5 枇杷愈伤细胞的显微观察 |
| 2.6 枇杷花丝愈伤状态的调控 |
| 3 讨论 |
| 3.1 AgNO3处理对枇杷胚性愈伤组织的继代保持作用不大 |
| 3.2 幼胚诱导的愈伤组织较适用于枇杷细胞悬浮培养 |
| 3.3 花丝愈伤调控可深入研究 |
| 第三章 枇杷细胞悬浮培养体系的初步建立及优化 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 获取悬浮培养种子液 |
| 1.2.2 悬浮细胞生长曲线的绘制 |
| 1.2.3 悬浮培养条件的优化 |
| 1.2.4 统计分析方法 |
| 2 结果和分析 |
| 2.1 悬浮细胞生长曲线的绘制 |
| 2.2 悬浮培养条件调控因子的筛选 |
| 2.2.1 接种量对枇杷悬浮细胞生长和熊果酸、齐墩果酸含量的影响 |
| 2.2.2 pH 值对枇杷悬浮细胞生长和熊果酸、齐墩果酸含量的影响 |
| 2.2.3 转速对枇杷悬浮细胞生长和熊果酸、齐墩果酸含量的影响 |
| 2.2.4 装液量对枇杷悬浮细胞生长和熊果酸、齐墩果酸含量的影响 |
| 2.2.6 碳源浓度对枇杷悬浮细胞生长和熊果酸、齐墩果酸含量的影响 |
| 2.2.7 光照对枇杷悬浮细胞生长和熊果酸、齐墩果酸含量的影响 |
| 2.2.8 温度对枇杷悬浮细胞生长和熊果酸、齐墩果酸含量的影响 |
| 2.2.9 激素对枇杷悬浮细胞生长及熊果酸、齐墩果酸含量的影响 |
| 2.2.10 诱导剂对枇杷悬浮细胞生长和熊果酸、齐墩果酸含量的影响 |
| 3 讨论 |
| 3.1 激素单独使用比组合效果好 |
| 3.2 适宜的外界培养条件优化悬浮培养系 |
| 3.3 环境胁迫下细胞增殖及有效次生代谢产物积累规律 |
| 第四章 熊果酸、齐墩果酸的提取及含量测定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 色谱条件 |
| 1.2.2 对照品溶液的制备 |
| 1.2.3 样品溶液的制备 |
| 1.2.4 熊果酸及齐墩果酸的计算方法 |
| 1.2.5 标准曲线的制定 |
| 1.2.6 样品提取率测定 |
| 1.2.7 样品提取工艺改良 |
| 1.2.8 提取优化验证试验 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 UA、OA 检测体系的建立 |
| 2.2 检测方法考察 |
| 2.2.1 线性关系试验 |
| 2.2.2 精密度试验 |
| 2.2.3 稳定性试验 |
| 2.2.4 重复性试验 |
| 2.3 样品提取率分析 |
| 2.4 提取优化分析 |
| 2.4.1 提取功率对熊果酸、齐墩果酸提取量的影响 |
| 2.4.2 提取时间对熊果酸、齐墩果酸提取量的影响 |
| 2.4.3 料液比对熊果酸、齐墩果酸提取量的影响 |
| 2.4.4 提取次数对熊果酸、齐墩果酸提取量的影响 |
| 2.4.5 样品提取优化正交试验分析 |
| 2.5 提取优化验证分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 试验建立了最优的提取工艺 |
| 3.2 超声提取法适用于枇杷细胞 UA 及 OA 含量的测定 |
| 3.3 以植物细胞为提取材料具有显着优点 |
| 第五章 小结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 植物细胞悬浮培养研究概况 |
| 1.1.1 植物细胞悬浮培养的概念和特点 |
| 1.1.2 植物细胞悬浮培养的目的及意义 |
| 1.1.3 细胞悬浮培养的研究现状 |
| 1.1.3.1 植物细胞悬浮培养 |
| 1.1.3.2 木本植物细胞悬浮培养 |
| 1.1.3.3 愈伤组织与细胞悬浮系的建立 |
| 1.1.3.4 激素的配比对悬浮细胞培养的影响 |
| 1.1.3.5 糖类物质对悬浮细胞培养的影响 |
| 1.1.3.6 起始密度对悬浮细胞培养的影响 |
| 1.2 植物原生质体的分离和培养 |
| 1.2.1 植物原生质体的分离 |
| 1.2.1.1 原生质体分离的起始材料 |
| 1.2.1.2 酶的种类与用量 |
| 1.2.1.3 酶解时间 |
| 1.2.1.4 酶液的渗透势 |
| 1.2.1.5 酶液的酸碱度 |
| 1.2.2 植物原生质体的纯化和活力检测 |
| 1.2.3 植物原生质体的培养 |
| 1.2.3.1 供体材料 |
| 1.2.3.2 原生质体培养基的组成 |
| 1.2.3.3 原生质体培养的方法 |
| 1.2.3.4 原生质体培养的密度 |
| 1.3 植物原生质体融合研究概况 |
| 1.3.1 植物原生质体的融合方法 |
| 1.3.2 植物原生质体的融合方式 |
| 1.3.2.1 供体处理 |
| 1.3.2.2 受体处理 |
| 1.3.3 体细胞杂种筛选方法 |
| 1.4 桑树细胞工程研究现状 |
| 1.5 本研究的目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 供试材料 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要培养基及溶液 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 桑树愈伤组织的诱导及继代培养 |
| 2.2.1.1 不同外植体对愈伤组织诱导的影响 |
| 2.2.1.2 生长调节剂浓度对愈伤组织诱导的影响 |
| 2.2.2 桑树悬浮细胞系的建立 |
| 2.2.2.1 悬浮细胞系的生长特性 |
| 2.2.2.2 桑树悬浮细胞的培养材料优化 |
| 2.2.2.3 桑树悬浮细胞的培养基及激素配比优化 |
| 2.2.2.4 桑树悬浮细胞的接种量优化 |
| 2.2.2.5 桑树悬浮细胞培养中摇床转速的优化 |
| 2.2.2.6 桑树悬浮细胞中蔗糖浓度的优化 |
| 2.2.2.7 桑树悬浮细胞的换液量优化 |
| 2.2.2.8 桑树悬浮细胞的继代周期优化 |
| 2.2.2.9 桑树悬浮细胞培养过程中培养液的 pH 值变化规律 |
| 2.2.3 桑树原生质体的分离 |
| 2.2.3.1 组培苗叶片原生质体的分离 |
| 2.2.3.2 胚性悬浮细胞和愈伤组织原生质体的分离 |
| 2.2.3.3 桑树原生质体的纯化 |
| 2.2.3.4 桑树原生质体分离酶液组合的优化 |
| 2.2.3.5 桑树原生质体渗透压调节剂的优化 |
| 2.2.3.6 桑树原生质体酶解时间的优化 |
| 2.2.3.7 桑树原生质体酶解温度的优化 |
| 2.2.3.8 桑树原生质体产量测定 |
| 2.2.3.9 桑树原生质体活力测定 |
| 2.2.4 桑树原生质体的培养 |
| 2.2.4.1 原生质体热激 |
| 2.2.4.2 原生质体培养 |
| 2.2.5 桑树原生质体的融合 |
| 2.2.5.1 原生质体的预处理 |
| 2.2.5.2 原生质体活力测定 |
| 2.2.5.3 处理后原生质体分裂和愈伤组织再生的测定 |
| 2.2.5.4 原生质体的融合 |
| 2.2.6 杂种细胞的培养及愈伤组织的形成 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 愈伤组织诱导及胚性愈伤组织筛选培养和保持 |
| 3.1.1 不同外植体对愈伤组织诱导的影响 |
| 3.1.2 生长调节剂浓度对愈伤组织诱导的影响 |
| 3.1.3 愈伤组织继代培养基的筛选 |
| 3.2 桑树悬浮细胞的建立及优化 |
| 3.2.1 桑树悬浮细胞系的建立 |
| 3.2.2 桑树悬浮细胞系培养条件的优化 |
| 3.2.2.1 培养材料对桑树悬浮细胞生长的影响 |
| 3.2.2.2 培养基及激素配比对桑树悬浮细胞生长的影响 |
| 3.2.2.3 接种量对桑树悬浮细胞生长的影响 |
| 3.2.2.4 摇床转速对桑树悬浮细胞生长的影响 |
| 3.2.2.5 蔗糖浓度对桑树悬浮细胞生长的影响 |
| 3.2.2.6 换液量对桑树悬浮细胞生长的影响 |
| 3.2.2.7 继代周期对桑树悬浮细胞生长的影响 |
| 3.2.2.8 桑树悬浮细胞培养过程中培养液 pH 值的变化规律 |
| 3.2.2.9 桑树悬浮细胞系的培养条件 |
| 3.3 桑树原生质体分离 |
| 3.3.1 分离酶液组合对桑树原生质体分离的影响 |
| 3.3.2 渗透压调节剂浓度对桑树原生质体分离的影响 |
| 3.3.3 酶解时间对桑树原生质体分离的影响 |
| 3.3.4 酶解温度对桑树原生质体分离的影响 |
| 3.3.5 桑树原生质体分离的最佳条件 |
| 3.4 桑树原生质体培养 |
| 3.4.1 原生质体的形态和分裂 |
| 3.4.2 不同培养基对桑树原生质体培养的影响 |
| 3.4.3 不同激素配比对桑树原生质体培养的影响 |
| 3.4.4 不同培养方式对桑树原生质体分裂的影响 |
| 3.4.5 不同培养密度对桑树原生质体分裂的影响 |
| 3.4.6 不同渗透剂(碳源)对桑树原生质体分裂的影响 |
| 3.4.7 桑树原生质体的培养条件 |
| 3.5 桑树原生质体融合 |
| 3.5.1 原生质体预处理 |
| 3.5.1.1 不同 UV 照射时间对桑树原生质体活力和再生的影响 |
| 3.5.1.2 不同浓度 IOA 预处理对桑树原生质体活力和再生的影响 |
| 3.5.2 影响桑树原生质体融合的因素 |
| 3.5.2.1 PEG 种类对桑树原生质体融合的影响 |
| 3.5.2.2 PEG 浓度对桑树原生质体融合的影响 |
| 3.5.2.3 PEG 处理时间对桑树原生质体融合的影响 |
| 3.5.2.4 原生质体密度对融合效果的影响 |
| 3.5.3 桑树原生质体的融合条件 |
| 3.5.4 融合细胞的培养及愈伤组织的形成 |
| 3.5.5 桑树融合杂种细胞的筛选 |
| 4 讨论 |
| 4.1 桑树愈伤组织培养 |
| 4.2 桑树悬浮细胞的培养 |
| 4.3 桑树原生质体分离纯化及培养 |
| 4.4 桑树原生质体培养 |
| 4.5 桑树原生质体融合 |
| 5 结论 |
| 5.1 桑树悬浮培养体系的建立 |
| 5.2 桑树原生质体的分离纯化 |
| 5.3 桑树原生质体的培养 |
| 5.4 桑树原生质体融合 |
| 参考文献 |
| 附录 1 图版说明 |
| 附录 2 培养基配方 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 目录 |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 1 青天葵研究 |
| 1.1 本草考证 |
| 1.2 品种鉴别研究 |
| 1.3 生境分布 |
| 1.4 组织培养研究进展 |
| 2 植物细胞培养 |
| 2.1 植物细胞培养概述 |
| 2.2 细胞悬浮培养方法 |
| 2.3 细胞悬浮培养的应用 |
| 3 植物原生质体研究进展 |
| 3.1 原生质体概述 |
| 3.2 原生质体技术的应用 |
| 3.3 兰科植物原生质体研究进展 |
| 4. 讨论 |
| 第二章 组织培养 |
| 第一节 固体培养 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 结果与分析 |
| 1.4 讨论 |
| 第二节 悬浮培养 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.4 讨论 |
| 第三节 组培物与栽培植株比较 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.4 讨论 |
| 第三章 原生质体分离条件 |
| 1 材料 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 青天葵叶片表皮细胞等渗浓度的确定 |
| 2.2 最佳酶液组合、酶解时间的确定 |
| 2.3 分离条件的优化 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 青天葵叶片表皮细胞等渗浓度的确定 |
| 3.2 最佳酶液组合、酶解时间的确定 |
| 3.3 分离条件的优化 |
| 4 讨论 |
| 第四章 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录Ⅰ 附图 |
| 附录Ⅱ 相关植物激素的配制 |
| 附录Ⅱ-1 6-BA(1.0mg·L-1×200)的制备 |
| 附录Ⅱ-2 NAA(1.0mg·L-1×200)的制备 |
| 附录Ⅱ-3 2,4-D(1.0mg·L-1×200)的制备 |
| 附录Ⅲ 丙二醛(MDA)含量测定试剂盒使用说明书 |
| 附录Ⅳ 植物过氧化物酶(POD)ELISA试剂盒使用说明书 |
| 获资助项目 |
| 在校期间发表论文情况 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 目录 |
| 1 前言 |
| 1.1 橡胶树概况 |
| 1.1.1 橡胶树形态及生理学 |
| 1.1.2 橡胶树死皮病研究概况及进展 |
| 1.2 植物程序性细胞死亡研究概况及进展 |
| 1.2.1 植物界普遍存细胞凋亡现象 |
| 1.2.1.1 植物细胞凋亡在植物发育中的作用 |
| 1.2.1.2 植物超敏反应与PCD |
| 1.2.1.3 环境胁迫与PCD |
| 1.2.2 植物细胞凋亡的调节 |
| 1.2.3 与植物细胞凋亡相关的蛋白酶 |
| 1.2.3.1 植物半胱氨酸蛋白酶 |
| 1.2.3.2 液泡加工酶(VPE) |
| 1.2.3.3 Metacaspases |
| 1.2.3.4 丝氨酸蛋白酶 |
| 1.2.3.5 细胞色素c |
| 1.2.3.6 核酸酶 |
| 1.2.4 与植物细胞凋亡相关的基因 |
| 1.2.4.1 ACD2基因 |
| 1.2.4.2 AtBI-1基因 |
| 1.2.4.3 AtMYB30基因 |
| 1.2.4.4 GA相关的合成基因 |
| 1.2.4.5 HbMybl基因 |
| 1.2.4.6 Iisl基因 |
| 1.2.4.7 Isdl基因 |
| 1.2.4.8 mlo基因 |
| 1.2.4.9 nucellin基因 |
| 1.2.4.10 sus基因 |
| 1.2.4.11 twin基因 |
| 1.2.4.12 Ts2基因 |
| 1.3 非细胞体系 |
| 1.3.1 非细胞体系研究细胞凋亡的优越性 |
| 1.3.2 植物非细胞体系研究现状 |
| 1.4 植物细胞凋亡的检测方法 |
| 1.4.1 细胞形态观察 |
| 1.4.1.1 光学显微镜 |
| 1.4.1.2 荧光显微镜 |
| 1.4.1.3 电子显微镜 |
| 1.4.2 生化及分子生物学法 |
| 1.4.2.1 凝胶电泳 |
| 1.4.2.2 原位标记法(TUNEL法) |
| 1.4.2.3 流式细胞仪 |
| 1.4.2.4 caspase活性检测 |
| 1.4.3 免疫学方法 |
| 1.4.3.1 酶联免疫吸附(ELISA)法 |
| 1.4.3.2 检测细胞色素c的释放 |
| 1.4.4 生理学检测 |
| 1.5 本研究的目的和意义及研究内容 |
| 1.5.1 目的和意义 |
| 1.5.2 研究内容 |
| 1.6 本研究的技术路线 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 主要生化试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 转HbMyb1基因烟草的鉴定 |
| 2.2.1.1 卡那霉素筛选及形态学鉴定 |
| 2.2.1.1.1 转HbMyb1基因烟草无菌苗的获得及卡那霉素筛选 |
| 2.2.1.1.2 转HbMyb1基因烟草的形态学鉴定 |
| 2.2.1.2 PCR检测 |
| 2.2.1.2.1 转HbMyb1基因烟草叶片总DNA提取(CTAB法) |
| 2.2.1.2.2 PCR检测 |
| 2.2.1.3 Southern检测 |
| 2.2.1.3.1 转HbMyb1基因烟草叶片总DNA提取(CTAB法) |
| 2.2.1.3.2 探针的标记 |
| 2.2.1.3.3 烟草总基因组的酶切 |
| 2.2.1.3.4 电泳与转膜 |
| 2.2.1.3.5 预杂交及杂交 |
| 2.2.1.3.6 洗膜及显影 |
| 2.2.2 烟草细胞悬浮系的建立 |
| 2.2.2.1 烟草无菌苗的获得 |
| 2.2.2.2 初始愈伤组织的获得 |
| 2.2.2.3 愈伤组织的继代 |
| 2.2.2.4 烟草细胞悬浮系的建立 |
| 2.2.3 烟草细胞核的分离与纯化 |
| 2.2.3.1 烟草原生质体的分离与纯化 |
| 2.2.3.2 烟草细胞核的分离与纯化 |
| 2.2.4 胶乳非细胞体系的建立 |
| 2.2.4.1 胶乳DNA的提取 |
| 2.2.4.2 胶乳非细胞体系的建立 |
| 2.2.5 烟草细胞核凋亡的诱导及检测 |
| 2.2.5.1 烟草细胞核凋亡的诱导 |
| 2.2.5.2 凋亡细胞核核酸降解检测 |
| 2.2.5.3 TUNEL检测 |
| 2.2.6 确定橡胶树胶乳中与细胞凋亡相关的核酸酶 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 转HbMyb1基因烟草的鉴定 |
| 3.1.1 种子萌发率 |
| 3.1.2 转HbMyb1基因烟草的形态学鉴定 |
| 3.1.3 PCR检测 |
| 3.1.3.1 烟草叶片DNA完整性分析 |
| 3.1.3.2 PCR检测 |
| 3.1.3.3 Southern检测 |
| 3.2 烟草细胞悬浮系的建立 |
| 3.2.1 烟草愈伤组织诱导培养基的筛选 |
| 3.2.2 最佳继代培养基的筛选及脆散性愈伤组织的获得 |
| 3.2.3 烟草细胞悬浮培养体系的建立 |
| 3.3 烟草细胞核的分离和纯化 |
| 3.3.1 酶液浓度对原生质体分离的影响 |
| 3.3.2 酶解时间对原生质体分离的影响 |
| 3.3.3 烟草细胞核的分离和纯化 |
| 3.4 胶乳非细胞体系的建立 |
| 3.4.1 胶乳DNA的提取 |
| 3.4.2 胶乳非细胞体系的建立 |
| 3.5 烟草细胞核凋亡的诱导及检测 |
| 3.5.1 胶乳非细胞体系中凋亡细胞核的统计 |
| 3.5.2 TUNEL标记 |
| 3.5.3 DNA特异性降解检测 |
| 3.6 确定胶乳中与细胞凋亡相关的核酸酶 |
| 4 讨论 |
| 4.1 应用非细胞体系研究细胞凋亡的优越性 |
| 4.2 2,4-D在烟草组织培养中的作用 |
| 4.3 不同孔径不锈钢筛网对原生质体分离纯化的影响 |
| 4.4 细胞核纯化过程中的损失 |
| 4.5 建立胶乳非细胞体系的意义 |
| 4.6 后续工作展望 |
| 5 结论 |
| 缩写词及其英汉对照 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 一 |
| 中文摘要 二 |
| 英文摘要 三 |
| 前言 四 |
| 文献综述 五 |
| 材料方法 第一部分 |
| 黄芩的组织培养 第二部分 |
| 诱导子与前体化合物对黄芩愈伤组织中 |
| PAL |
| 活性的影响 第三部分 |
| 诱导子与前体化合物对黄芩愈伤组织中 |
| POD |
| 酶谱的影响 第四部分 |
| 黄芩毛状根诱导的初步研究 第五部分 |
| 原生质体的分离 六 |
| 结果 七 |
| 讨论 八 |
| 结论 九 |
| 参考文献 十 |
| 致谢 十一 |
| 英文缩写 十二 |
| 附图 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 1 前言 |
| 1.1 问题的提出 |
| 1.2 前人的研究进展 |
| 1.2.1 植物愈伤组织离体保存过程中的遗传变异研究 |
| 1.2.2 多倍体细胞凋亡及细胞互作研究 |
| 1.2.3 植物细胞凋亡研究进展 |
| 1.2.4 柑橘胚性愈伤组织离体保存与变异研究 |
| 1.3 本研究的目的和内容 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 供试材料 |
| 2.2 主要仪器和试剂 |
| 2.2.1 主要仪器设备 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.3.1 原生质体操作 |
| 2.3.2 隔离及混合共培养操作 |
| 2.3.3 半薄切片形态观察及凋亡检测 |
| 2.3.4 凋亡细胞核分离及染色观察 |
| 2.3.5 TUNEL检测细胞凋亡 |
| 2.3.6 流式细胞仪细胞周期分析 |
| 2.3.7 同源基因克隆 |
| 2.4 数据统计分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 共培养中柑橘四倍体愈伤细胞凋亡形态学观察 |
| 3.1.1 原生质体DAPI染色结果 |
| 3.1.2 树脂半薄切片染色观察 |
| 3.1.3 凋亡细胞核DAPI染色观察 |
| 3.2 共培养中四倍体胚性愈伤细胞凋亡分析 |
| 3.2.1 接触共培养和隔离共培养模型确定 |
| 3.2.2 混合接触共培养中四倍体愈伤细胞凋亡率统计 |
| 3.2.3 接触共培养中二倍体和四倍体细胞周期分析 |
| 3.2.4 隔离共培养中四倍体细胞凋亡率统计 |
| 3.3 柑橘愈伤组织细胞凋亡和细胞周期相关基因的表达分析 |
| 3.3.1 总RNA的提取 |
| 3.3.2 RT-PCR克隆目的基因 |
| 3.3.3 克隆基因在隔离培养中四倍体愈伤中实时定量分析 |
| 3.4 柑橘四倍体胚性愈伤原生质体分裂及凋亡分析 |
| 3.4.1 原生质体分裂观察 |
| 3.4.2 原生质体共培养凋亡检测 |
| 4 讨论 |
| 4.1 共培养模型在研究柑橘多倍体细胞凋亡的应用 |
| 4.2 多倍体变异细胞凋亡的调节 |
| 4.3 柑橘二倍体细胞对四倍体细胞凋亡和增殖的‘社会化控制’ |
| 4.4 本实验研究的意义及展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
