马治国[1]（2021）在《降解植物甾醇产22-羟基-23,24-双降甾-1,4-二烯-3-酮工程菌株的构建》文中指出甾体类药物被广泛应用在各种疾病预防与治疗上,是仅次于抗生素的第二大类药物。22-羟基-23,24-双降甾-1,4-二烯-3-酮（HPD）作为一种重要的新型甾体药物中间体,是合成一些皮质类药物的重要原料之一。目前利用微生物转化技术来生产甾体类药物中间体具有环境友好、生产步骤少、反应条件简单等优点,在甾体药物行业已经得到了广泛的应用。通过构建工程新金分枝杆菌来降解植物甾醇生产新型甾体药物中间体HPD是一条重要的途径。3-甾酮-Δ1脱氢酶在微生物降解植物甾醇过程中发挥着重要作用,它能催化22-羟基-23,24-双降甾-4-烯-3-酮（4-HP）的A环C1,2脱氢形成双键而制得HPD。本论文,首先在实验室保存的一株基因突变菌株Mycobacterium neoaurum DSM 1381中过表达Kstd基因构建一株重组菌株,并对其发酵培养基进行优化,得到可以高产HPD的菌株。而后,为进一步构建更优的工程菌株,对模式菌株Mycobacterium neoaurum DSM44074中相关的甾醇侧链代谢途径中的基因以及降解产物进行分析,敲除与HPD积累相关的负调控基因以及与细胞壁通透性相关的基因,再通过调控细胞内环境的稳定,得到了更优的可转化植物甾醇制备HPD的工程菌株。主要的研究结果如下:1、以Mycobacterium neoaurum DSM 1381为初始菌株,构建了过表达Kst D重组菌株。以植物甾醇为底物进行发酵,发酵液中产物HPD的纯度由71%提高到了84%。然后,先筛选出发酵培养基中各营养成分,再通过做各成分之间交互作用对HPD产量影响的响应面优化实验,拟合了相应的响应面图,建立了玉米浆、磷酸氢二钾、葡萄糖和硝酸钠四因素三水平交互变化的二次回归方程,得到最适宜的发酵培养基配方:玉米浆9 g/L、硝酸钠1.8 g/L、葡萄糖6 g/L、磷酸氢二钾2 g/L,在此条件下以底物植物甾醇,发酵液中产物HPD的纯度由84%提高到了92%,产量由1.51 g/L提高到3.73 g/L。2、进一步构建了更优产HPD工程菌株。我们采用CRISPR/Cpf1系统在分枝杆菌Mycobacterium neoaurum DSM 44074中先敲除了三个羟化酶基因ksh A1&2&3防止植物甾醇完全降解,在此基础上进一步敲除与HPD积累相关负调控基因fad A5和hsd4A,发现单敲hsd4A和双敲fad A5和hsd4A基因的主产物都是HPD,为进一步加快底物转化,再敲除与细胞壁通透性相关的mmpk3和kas D基因,最后通过过表达NADH脱氢酶和过氧化氢酶调控发酵过程中细胞内环境,构建重组菌株Mycobacterium neoaurum DSM 44074ΔAHM/p38-kata-nadh,当底物甾醇浓度为20 g/L时,HPD的产量达到12.7 g/L,主产物的纯度达到93%。3、通过以上研究,我们获得了一株高效转化植物甾醇生成HPD的重组菌株Mycobacterium neoaurum DSM 1381/p38-Kstd,通过优化发酵培养基显着提高了HPD的产量,然后在模式菌株Mycobacterium neoaurum DSM 44074中进行一系列基因敲除以及质粒的导入,又构建了一株高产HPD的菌株Mycobacterium neoaurum DSM 44074ΔAHM/p38-kata-nadh,为微生物转化植物甾醇生成HPD提供了理论依据。
李欣,成细瑶,彭飞,陈甜,黄永棋,苏正定[2]（2021）在《工业分枝杆菌植物甾醇转化途径及菌种改造研究进展》文中提出相比于传统的化学转化法,微生物转化法在甾体药物的生产中显示出了明显的优势。利用分枝杆菌降解植物甾醇可以生成一系列甾体药物的中间体,这极大地方便了甾体药物的生产。通过基因工程、分子生物学和结构生物学等学科的技术手段,人们对甾醇转化菌株进行了深入的探索和改造。本文对工业分枝杆菌植物甾醇转化途径及菌种改造的研究进展进行了综述。
叶文祥[3]（2020）在《发酵法生产雄烯二酮的分离纯化清洁生产工艺研究》文中研究指明雄烯二酮（4AD）在激素类药物研发领域具有重要的作用,因其能够作为重要中间体合成其他多种品类的激素类药物。早期一些比较大量的4AD是从植物中获取的,到后来微生物法合成4AD因其成本低、污染少等优点占领市场。而目前,我国行业内普遍存在着难以将4AD从生物发酵液中高效分离的技术难题,因此,低成本、高效且环境友好型的分离纯化清洁生产工艺方案的研究已迫在眉睫。本论文开发了一种绿色安全、节约能耗、高效分离纯化的工艺方法。主要研究内容包括以下五个部分:1.利用膜处理工艺浓缩发酵液中的水分。为了减少发酵液的体积容量简化分离操作单元的处理难度,且能有效提高4AD的分离效率,采用二级膜处理方法,优化筛选出膜处理工艺的处理条件。结果表明:膜处理工艺条件为进口压力为0.25MPa,出口压力为0.15MPa,表面流速为4.0m/s,温度为35℃,其结果表明该处理工艺的脱水率可达到75.12%。2.经由膜浓缩后的发酵液的乳化性质研究。发酵液在浓缩脱水后高度乳化,为了使4AD能够被分离出来,通过研究乳化机理和性质,对破乳的工艺方案进行优化,分析是否达到预期的实验效果。3.提取分离4AD的实验方案研究。使用碱沉溶剂络合法分离4AD,在单因素试验的基础上,通过正交试验分析法确定最佳萃取条件为甲醇溶液浓度为85%,pH值为8.5,萃取温度为35℃,破乳剂添加量为7%,在该条件下得到4AD粗品萃取收率为89.45%,纯度为85.50%。4.结晶精制4AD的实验方案研究。使用升温溶解-蒸发浓缩-降温结晶的实验方案得到4AD产品,在单因素试验的基础上,通过正交试验分析法确定最佳结晶条件为结晶停留温度为17℃,结晶停留时间为18h,搅拌速度为50r/min,结晶次数为1次,在该条件下得到4AD结晶收率为88.37%,纯度为96.5%。5.将新研发工艺与传统生产工艺进行对比,在经济效益方面新工艺年税后利润及年利润率均有较大幅度提高,在环境效益方面,清洁生产工艺极大地减少了环境污染的产生,且在节能降耗方面也有较大幅度提高,结果表明该项目可行。
施海珊[4]（2020）在《分枝杆菌降解豆油副产物植物甾醇制备雄烯二酮关键技术》文中进行了进一步梳理雄烯二酮作为不可或缺的中间体在药物制造尤其是甾类药物中被广泛应用,但雄烯二酮的化学制造工艺一般都较为复杂和困难,并且在生产过程中会造成严重的环境污染。生物方法生产雄烯二酮较化学方法更经济也更环保,因此具有非常可期的发展前景。作为我国食品产业的重要组成部分之一,大豆加工产品在生产过程中,会产生大量的豆粕与馏出物,而大豆加工馏出物中的主要组分是植物甾醇,植物甾醇可作为生物技术生产雄烯二酮的底物进行深度利用。为了更好地规模化生产雄烯二酮,解决供需失衡,通过使用双水相系统来提高底物浓度,利用分枝杆菌转化豆油副产物植物甾醇的方法生产雄烯二酮。通过对比多种检测方法,发现以薄层层析法作为定性检测,以高效液相色谱作为雄烯二酮的定量检测,是比较高效且精确的。通过正交试验确定了微生物生产雄烯二酮的最优条件为:双水相系统为水/葵花油,温度30℃、起始pH 6.5、底物浓度0.4 g/L。在这种条件下,雄烯二酮的产率可超过84%。在正交试验的基础上,探究了影响雄烯二酮产率的其他因素,通过响应曲面实验的设计和分析,得出的最佳工艺条件是转速250 rpm、接种量14.83%、有机相比例20.65%、装液量30%。在此最优条件下,雄烯二酮的产率可超过85%。对比多种有机溶剂对发酵系统中雄烯二酮的萃取效果,选择乙酸乙酯作为萃取剂,相比为1,萃取级数为4。萃取完成后,可减压蒸馏来回收74.58%的乙酸乙酯。异丙酮萃取剩余溶液中的油,可以实现油的回收利用,回收率可达82.45%。本研究初步为微生物法生产雄烯二酮寻找到了适宜的工艺条件,并为其规模化生产提供了数据和理论方面的支持。实现了资源的回收利用,节约了生产成本。
朱敏[5]（2019）在《知母甾体皂苷元生物合成关键酶基因克隆及生化研究》文中提出目的:知母,百合科知母（Anemarrhena asphodeloides Bunge）的干燥根茎,是一种传统中药,其主要的药理活性成分是知母皂苷及其苷元,约占知母干燥根茎的6%,种类较多（近50多种）、含量丰富。目前知母皂苷BII对于阿尔茨海默病（Alzheimer disease,AD）以及改善学习记忆能力具有明显的效果,已经有了深入的研究,是一个有潜力的抗AD的药物。然而,其具体的生物合成途径及关键酶基因尚不清楚。知母甾体皂苷依靠植化分离不仅成本较高,而且受制于天然药用资源,提取物的质量难以控制。因此本研究挖掘知母皂苷生物合成途径上的关键酶基因,2,3-氧化鲨烯环化酶（2,3-oxidosqualene cyclase,OSC）、甾醇侧链甲基转移酶1（Sterol methyl transferase 1,SMT1）和甾醇侧链还原酶2（Sterol side chain reductase enzyme 2,SSR2）,对其进行异源表达和生化功能验证,为知母皂苷合成途径的研究奠定基础。方法:（1）对知母根茎和地上部分进行转录组测序,收集整理番茄中报道的甾体生物碱合成途径中所有的基因序列以及其他主要含有甾体皂苷物种中的转录组数据,通过本地Blast,找到与知母皂苷生物合成所有相关的Unigenes。然后通过在线工具,进行基因开放阅读框分析,找出全长和非全长的序列。对知母皂苷母核合成有关的Unigenes通过qRT-PCR进行表达部位分析,结合候选基因的表达特征与知母主要成分的含量分布特点,进一步预测知母甾体皂苷合成途径的候选基因。（2）克隆知母AaOSC、AaSMT1和AaSSR2候选基因,将AaOSC连接至酵母表达载体pESC-URA和pESC-HIS以及烟草表达载体pEAQ-HT-DEST1,AaSMT1和AaSSR2连接至酵母表达载体pESC-HIS,进行异源表达,利用GC/MS对其表达产物进行分析。（3）将AaOSC和AaSMT1与其他物种中的同源基因利用MEGA软件进行蛋白质序列比对,绘制环阿屯醇合酶（cycloartenol synthase,CAS）与甾醇侧链还原酶（Sterol methyl transferase,SMT）的系统进化树,分析其与其他物种的进化关系。（4）利用合成生物学多片段酵母染色体同源重组技术,将2,3-氧化鲨烯合成途径中的关键酶基因以及知母AaOSCR12整合至酵母基因组,进行稳定表达,构建产2,3-氧化鲨烯工程菌和产环阿屯醇酵母工程菌。结果:（1）知母根茎和地上部分转录组测序,找到了与知母皂苷生物合成所有相关的Unigenes共40条,其中与知母皂苷母核合成有关的Unigenes有18条。（2）结合基因差异表达水平与知母皂苷、甾醇代谢含量分析,显示知母皂苷在根中大量积累,与其合成相关的基因也在根中特异性表达;根茎中甾体皂苷的含量远远高于甾醇的含量,说明代谢流在胆固醇-甾体皂苷这条途径上流量很大。（3）AaOSCR12的产物为环阿屯醇,其另一个产物还需进一步分离纯化鉴定结构,确定AaOSCR12为知母环阿屯醇合酶,而AaOSCL6和AaOSCL10无催化活性。AaSMT1催化环阿屯醇产生24-亚甲基环木菠萝烷醇,具有甾醇侧链转移酶1活性。（4）构建了高产2,3-氧化鲨烯酵母工程菌Y2-SE-10和高产环阿屯醇酵母工程菌Y3-AaOSCR12,Y2-SE-10工程菌可以为2,3-氧化鲨烯环化酶的功能验证提供高含量的底物,同时也可以作为优势底盘菌进行下一步基因整合;Y3-AaOSCR12工程菌可以将环阿屯醇的产量提高7.4倍,从而为AaSMT1和AaSSR2基因的功能提供底物支持。结论:本论文挖掘了知母皂苷生物合成途径上的关键酶基因,并克隆鉴定了3条AaOSC基因、1条AaSMT1基因和2条AaSSR2基因,异源表达验证了AaOSCR12为知母环阿屯醇合酶。AaSMT1催化环阿屯醇产生24-亚甲基环木菠萝烷醇,具有甾醇侧链转移酶1活性,此外,还构建了产2,3-氧化鲨烯工程菌Y2-SE-10和产环阿屯醇工程菌Y3-AaOSCR12,为知母皂苷生物合成途径的解析、环阿屯醇合酶催化机制的研究奠定了基础。
贺坤[6]（2018）在《植物甾醇转运及侧链降解在分枝杆菌合成9-OHAD中的研究》文中研究说明随着越来越多疾病的出现,甾体激素类药物已逐渐发展成我国医药领域的重要门类。众所周知,甾体激素是人体重要的信号分子,通过与特定的受体蛋白结合,来调控细胞正常的生理功能,一旦缺失,将引发机体功能失调紊乱。9α-羟基雄甾4-烯-3,17-二酮（9-OHAD）是一类重要的甾药前体,是获得各类甾体药物的重要前体,可通过微生物降解植物甾醇获得。然而,植物甾醇的疏水性和侧链降解酶催化过程的复杂性制约了9-OHAD的产量,本文利用分枝杆菌Mycobacterium sp.136（MS136）为出发菌种,通过基因工程手段对植物甾醇转运系统及侧链降解过程进行研究,同时研究菌种传代和发酵条件对植物甾醇转化的影响,实现菌体对植物甾醇的高效转化。植物甾醇进入菌体是主动运输的过程,需要能量和跨膜蛋白的协助。以能量和跨膜蛋白相关基因,连接载体pmv261,构建植物甾醇转运系统,电转化分枝杆菌MS136,获得关于甾醇转运相关的基因工程菌。对其转化能力分析,甾醇投料量13.2 g/L,转化86 h,基因mceG-yrbE4A-yrbE4B、RmceG-sup4A改造菌摇瓶发酵9-OHAD产量达到了6.02 g/L左右,比原始菌株提高了19%。结果表明,转运系统有效提高了菌体对植物甾醇的传质过程。分枝杆菌降解植物甾醇侧链生产9-OHAD是一个涉及20多种酶参与的多酶催化过程。通过查找甾体代谢基因簇中的各有关侧链降解的关键基因,构建了11株不同的基因工程菌。经发酵分析,基因Rj125-fad19、fad19过表达菌摇瓶发酵9-OHAD产量比原始菌株提高16%-18%。结果表明,过表达侧链降解的关键基因可以提高菌体对植物甾醇的转化能力。分枝杆菌发酵活化种子前需要进行传代,原始菌株经发酵实验证实传到四代时9-OHAD的产量达到最大,但是菌改造后属于第几代没有明确的说法,实验中,将改造菌传代3次,记为二、三、四代,并对其都进行了发酵转化,结果发现改造菌在传到第三代时,已经具备了最强的转化能力,而第四代相对于第三代没有明显的变化。
袁俊杰[7]（2018）在《含离子液体体系中分枝杆菌降解植物甾醇侧链制备雄烯二酮的研究》文中认为生物法降解植物甾醇侧链是留体转化领域中的关键环节,其产物雄烯二酮（AD）作为中间体可用于合成上百种甾体激素类药物。由于过程复杂,机理不甚清楚,迄今为止该反应只能在全细胞中进行,存在着底物水溶性低和疏水性产物抑制这两个难题,是甾体药物合成的研究热点。离子液体作为21世纪的新型绿色溶剂逐渐进入人们的视野,近年来已有研究者尝试将离子液体用于甾体生物转化以通过溶剂工程实现过程强化,但是相关研究刚刚起步,且主要集中在甾体的羟化和C1位脱氢反应。本文构建含离子液体的生物转化溶剂体系,用于分枝杆菌Mycobacterium sp.MB 3683降解植物甾醇侧链生产AD的过程,并设计合成生物相容性和溶解性能优越的新型离子液体,以提高过程效率,推动离子液体绿色过程工艺的发展。首先,从商业化离子液体中选取13种具有代表性的亲水性/疏水性离子液体,系统评价其用于植物甾醇生物转化的溶剂特性,并建立离子液体结构与其理化性质、溶解性能和生物相容性之间的关系。发现随着离子液体阳离子烷基链的延长,其密度降低,黏度增加。离子液体疏水性参数logP>-2即能与水形成两相体系,其值随阳离子烷基链的延长而增大,随阳离子类型的变化顺序为:季鏻/铵类>二烷基吡咯烷类>二烷基咪唑类,随阴离子类型的变化顺序为:[NTf2]>[PF6]>[BF4]>[Lac]-。离子液体/水平衡相组成（离子液体与水互溶度）总是与logPP呈负相关。离子液体对植物甾醇的溶解度与水相比均有不同程度的提高,且与其氢键碱性β值呈正相关;AD的溶解度提高近1000倍,且分配系数log D>2,可以实现产物的原位萃取（ISPR）,且其值随着阳离子烷基链的延长而增大。分枝杆菌细胞膜完整性与离子液体浓度和阴离子疏水性呈负相关,而葡萄糖代谢活性与阴离子疏水性呈正相关。系统的溶剂特性评价为离子液体的应用提供了基础数据。其次,将9种疏水性离子液体构建两相体系用于分枝杆菌发酵降解植物甾醇侧链过程,其中离子液体[PrMIM][PF6]呈现出较好的性能。研究了两相萃取发酵过程操作参数对AD生产的影响,在12 vol.%接种量,48 h种龄,84 h时添加离子液体,相比1:20（离子液体/水,v/v）,底物投料浓度5 gL-1的200 mL发酵体系中,转化5天,AD产量为2.23g L-1,远高于单水相体系,且在高底物浓度下优势更明显。探讨了两相转化过程传质机理,明确了离子液体对ISPR所起的关键作用。进一步将11种水不溶性离子液体和2种水溶性离子液体用于分枝杆菌静息细胞催化过程。考察了细胞培养条件,发现在发酵培养基中添加8 gL-1葡萄糖和1 gL-1由tween80水溶液分散的植物留醇做诱导剂,培养至对数生长后期（60 h）,细胞催化活性较高。在0.1MTris-HC1缓冲液（pHH7.5）与离子液体构成的两相体系或共溶剂体系中,优化后添加50 g L-1湿细胞和3 g L-1底物转化12 h,[PrMIM][PF6]仍然表现出了较好的性能,分析原因其合适的细胞膜通透性（MI≈40%）有利于底物和产物的透过从而提高转化效果。转化结束后,用乙醇萃取法提取产物AD并实现了离子液体的多批次重复利用。此外,通过电镜观察和催化转化实验,确定丝瓜络吸附法为较合适的分枝杆菌固定化方法。最后,针对商业化离子液体对甾醇溶解性和分枝杆菌生物相容性的不足,以生物相容性好、氢键碱性强的生物分子乳酸和长链脂肪酸为阴离子供体,生物相容性和溶解性能均较好的季铵盐和季鏻盐为阳离子供体合成了 24种新型离子液体。核磁1H谱和13C谱表征了离子液体的结构和纯度。对合成离子液体的各项溶剂特性进行了分析,发现他们均具有较弱的极性和极强的氢键碱性,因而对植物甾醇表现出优越的溶解性能（是普通离子液体的近百倍）。将8种水不溶性离子液体构建两相体系用于分枝杆菌静息细胞催化植物甾醇侧链降解,当离子液体添加量为0.1 vol.%时,[P6,6,6,14][C12]和[N10,10,10,10][Lac]均将AD产率提高40%以上。但是当离子液体量超过1vol.%时,生物转化反应由于离子液体、底物和细胞的黏附聚集作用而表现不佳。相对应地,将另外16种水溶性离子液体构建共溶剂体系,由于具有类似于表面活性剂的两亲特性,其低浓度水溶液对底物和产物的溶解能力远优于有机溶剂和表面活性剂参与的体系,且黏度不超过1.6 cP,细胞和底物分散状况良好,细胞膜完整性几乎不受离子液体的影响。由于葡萄糖代谢活性与离子液体种类和浓度密切相关,详细考察了不同离子液体种类和浓度对生物转化效果的影响,在低至0.1 vol.%的离子液体浓度下,含[N4,4,4,4][C10]体系的AD时空产率为136 mg L-1h-1,相比初始体系提高1倍以上。离子液体/水两相体系可应用于植物甾醇侧链降解过程,并辅以离子液体的回收利用;开发的新型离子液体共溶剂体系,离子液体用量极少,节约了生产成本,也省却了离子液体回收的步骤。将离子液体与生物催化转化相结合,符合绿色可持续过程工程,具有广阔的应用前景。
陈宽[8]（2021）在《关于分枝杆菌环糊精体系转化植物甾醇过程中还原性产物积累问题的研究》文中研究指明由于甾醇在水中极低的溶解性,在甾醇生物转化过程中,作为底物助溶剂的环糊精常用于提高反应速率。本课题中我们利用Mycobacterium neoaurum NwIB-R1 0在静息细胞环糊精体系下转化植物甾醇过程中,尽管羟丙基-β-环糊精（HP-β-CD）的使用使得底物转化效率大幅提高,然而它也降低了转化过程中氧传质速率,导致转化过程供氧不足,进而造成胞内 NADH 过剩,还原性产物 HBC（22-hydroxy-23,24-bisnorchol-4-ene-3-one）作为最终的电子载体而大量积累从而实现NAD+再生。针对供氧不足造成的NAD+循环再生问题,我们尝试一些方法促进NAD+再生。在较低的单位菌体反应速率和HP-β-CD浓度下,增加摇床转速以改善供氧能一定程度上降低还原性产物占比。在环糊精体系中使用氧化态更高的硝酸盐替代铵盐能显着减少产物中还原性产物的积累,AD（androst-4-ene-3,17-dione）/HBC 比例最大从2.1增加到5.3,并且使用硝酸盐导致胞内NADH/NAD+相比于对照最大下降了 59.5%;分批补料通过降低代谢通量使该比例从66.4%下降到52.6%;另外,在Mycobacterium neoaurum NwIB-R10 中过表达 9α-羟基化酶（3-ketosteroid hydroxylase,KshA）促进 NADH 消耗,使得产物中还原性产物比例从68.9%下降到43.9%,进一步增加KshA活性,使该比例最终降低到22.3%。
刘允[9]（2017）在《菌株A35b对雄甾-4-烯-3,17-二酮（4AD）的微生物转化研究》文中研究表明雄甾-4-烯-3,17-二酮（androst-4-ene-3,17-dione,简称4AD）是合成甾体药物的重要中间体,生物转化是药物先导化合物合成的有效方法。本论文以4AD为底物,进行微生物转化研究,取得如下结果。经过30株真菌的筛选,得到一株对4AD有高效转化能力的菌株A35b,当底物浓度为0.5（g/L）,转化时间7天时,转化率为100%。以菌株A35b建立的转化体系,经扩大培养,分离纯化得到其中两个转化产物,结构鉴定为11α-羟基-雄甾-4-烯-3,17-二酮（11α-Hydroxyandrost-4-en-3,17-dione）和11α-羟基-睾酮（11α-Hydroxytestosterone）。通过18S r DNA序列分析,鉴定菌株A35b为Colletotrichum sp.对影响菌株A35b转化的因素如底物浓度、转化时间、培养基初始p H值、葡萄糖浓度进行了优化,结果表明,获得产物11α-羟基-雄甾-4-烯-3,17-二酮的最佳条件为:底物浓度0.5 g/L,转化时间7天,葡萄糖浓度10 g/L,p H自然。
邵明龙[10]（2017）在《代谢工程改造微生物合成甾体药物中间体ADD和TS》文中提出甾体药物是仅次于抗生素的第二大类药物,因其重要的生理活性,临床上具有广泛的应用。雄甾-4-烯-3,17-二酮（AD）和雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮（ADD）是重要甾体药物中间体,可通过结构上的化学修饰合成几乎所有的甾体类药物,在甾体药物行业中的地位日益突出。然而由于底物投料浓度低,发酵转化周期长及甾体微生物代谢机理认知的不足等问题,我国在甾体微生物转化生产上仍明显落后于欧美等国家,这严重制约了我国甾体药物产业绿色转型的步伐。因此,本论文以甾醇转化过程关键酶为目标,对新金色分枝杆菌Myobacterium neoaurum转化植物甾醇合成ADD过程中的关键酶3-甾酮-Δ1-脱氢酶（KSDD）,胆固醇氧化酶（Cho M）,甾酮C27单加氧酶（SMO）和3-甾酮-9α-羟化酶（KSH）进行研究,利用代谢工程策略,实现了ADD的高效积累。此外,本研究对甾醇代谢产物进行了拓展,将来源于人体中AD合成睾酮（TS）的途径在毕赤酵母中进行表达,实现了甾体药物TS的生物学合成。主要内容总结如下:1.课题组前期对M.neoaurum ST-095进行诱变获得菌株M.neoaurum JC-12,其转化植物甾醇合成AD和ADD的总产量相同但摩尔比例不同,推测原因是催化AD到ADD的KSDD活性差异所导致。因此,本研究通过对诱变前后菌株KSDD氨基酸序列比对,发现M.neoaurum ST-095中KSDDI和M.neoaurum JC-12中KSDDII的不同在于氨基酸序列V366S的突变,该突变直接影响了KSDD活性。枯草芽孢杆菌中异源表达和酶动力学分析表明V366S的突变使得KSDD对底物的亲和性和催化效率提高进而明显提高酶活性。对KSDDI和KSDDII在新金色分枝杆菌中的功能进行分析,证实该突变是引起菌株诱变前后产生不同AD和ADD摩尔比的原因。进一步对KSDD催化活性中心结构分析,发现V366S的突变能够减少底物与酶催化中心的空间位阻提高了KSDD的催化活性和稳定性,进而提高其酶活性。2.将M.neoaurum JC-12中的Cho M1和Cho M2基因在枯草芽孢杆菌中进行异源表达,对其酶学性质进行研究,结果表明重组Cho M1和Cho M2的反应最适p H和温度均分别为7.5和37°C,Mg2+和Mn2+能够明显促进其酶活性。动力学参数表明,和Cho M1相比,Cho M2对底物的亲和力更强,从而表现出更高的酶活性。利用构建的重组菌B.subtilis 168/p MA5-cho M1和B.subtilis 168/p MA5-cho M2全细胞实现了胆固醇到4-胆甾烯-3-酮的转化,24 h后产量分别为0.67 g·L-1和0.83 g·L-1。将Cho M2在M.neoaurum JC-12中过量表达以提高底物甾醇的摄取和转化能力,最终ADD产量达到4.73 g·L-1,提高了37.1%。结果表明可以通过提高甾醇转化菌株中Cho M活性来改良菌种的发酵特性,实现甾醇的高效转化。3.鉴定了来源于新金色分枝杆菌的三个SMO同工酶SMO1,SMO2和SMO3具有甾醇侧链末端氧化功能。对其进行异源表达与纯化,酶动力学分析表明SMO2对底物亲和性更强,催化效率更高。对三个同工酶基因的敲除和功能回补进行研究,发现缺陷菌株对底物甾醇的代谢速率受到明显的抑制作用,证实了SMO是分枝杆菌甾醇侧链转化第一步反应的关键酶,其中SMO2在甾醇代谢过程中作用最为明显。在M.neoaurum JC-12中分别过表达SMO1,SMO2和SMO3,考察过量表达SMO对菌株在甾醇转化能力上的影响。结果表明SMO1,SMO2和SMO3过表达菌株ADD的产量分别从3.48 g·L-1提高到4.49 g·L-1,4.96 g·L-1和4.13 g·L-1,分别提高了29.0%,42.5%和18.7%,其中SMO2在提高ADD产量上效果最为明显。结果表明可以通过提高SMO的酶活性来提高菌株转化甾醇合成ADD的能力。4.利用代谢工程手段调控M.neoaurum JC-12转化甾醇合成ADD的代谢途径。首先敲除ksh A1基因使得KSH活性缺失,从而阻断了ADD降解途径,ADD产量从3.45g·L-1提高到4.57 g·L-1,并且发酵后期ADD不再被降解。在KSH活性缺失的基础上,通过共表达代谢途径中的关键酶Cho M2,SMO2和KSDD提高甾醇代谢途径中的代谢通量,最终获得高效转化植物甾醇合成ADD的重组菌JC-12S2-cho M2-ksdd。以20 g·L-1植物甾醇作为底物进行发酵转化168 h,重组菌ADD的产量从6.55 g·L-1提高到12.40 g·L-1,提高了89.3%。为了缩短发酵周期,提高ADD的生产效率,本研究在5-L发酵罐上对重组菌株的发酵工艺进行优化。以果糖作为初始碳源,明显消除重组菌生长延滞期,然后结合多阶段发酵策略,最终180 h获得20.1 g·L-1的ADD,生产效率从0.074 g·（L·h）-1提高到0.112 g·（L·h）-1。这是目前文献报道中利用甾醇转化合成ADD的最高产量。同时发酵工艺技术手段具有广泛的通用性和突出的应用价值,理应得到大力推广。5.论文对甾体药物及中间体睾酮（TS）的微生物合成进行了初步研究。首先将来源于人体中AD合成TS的途径在毕赤酵母中进行表达,实现了TS的生物学合成。将经密码子优化后的人体17β-羟基类固醇脱氢酶3（17β-HSD3）基因在毕赤酵母中进行了异源活性表达,验证了其具有催化AD合成TS的功能,并且该催化反应为不可逆反应。然后在毕赤酵母中共表达17β-HSD3和酿酒酵母的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PDH）构建NADPH辅酶循环再生系统。以葡萄糖为辅底物,重组菌P.pastoris/17β-HSD3P-G6PDH全细胞能够高效转化AD合成TS。进一步优化其全细胞转化条件:温度为37°C,p H为7.5,底物最佳助溶剂为Me-β-CD,最适菌体生物量为200 g·L-1（湿重）,最适底物浓度为5 g·L-1。在5-L发酵罐上利用分批补料策略转化120 h,TS的终产量达到11.6 g·L-1,这是目前文献报道中微生物法转化合成TS的最高产量。结果表明毕赤酵母系统共表达目的酶蛋白和辅酶循环再生酶系可以作为合成其他甾体药物的有效途径。为实现由植物甾醇一步转化合成TS,将密码子优化后的17β-hsd3基因转化到高产AD的M.neoaurum ZADF-4中。然而遗憾的是,虽然表达出17β-HSD3目的蛋白,但是没有酶活性,并且重组菌也不能够转化植物甾醇合成TS。
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 研究的背景 |
| 1.1.1 甾体类化合物的概述 |
| 1.1.2 甾体药物的简介 |
| 1.1.3 微生物转化合成甾体药物 |
| 1.2 植物甾醇的微生物降解机理研究 |
| 1.2.1 甾体分子的摄取 |
| 1.2.2 甾体的初始氧化 |
| 1.2.3 甾体C17侧链的降解 |
| 1.2.4 甾体母核的开环氧化 |
| 1.2.4.1 3-甾酮-Δ~1-脱氢酶(KstD) |
| 1.2.4.2 3-甾酮-9α-羟化酶(KSH) |
| 1.2.5 完全降解开环产物 |
| 1.2.6 甾醇代谢的调节 |
| 1.3 分枝杆菌的基因敲除方法 |
| 1.4 微生物降解植物甾醇生成HPD的研究 |
| 1.4.1 HPD和4-HP的简介 |
| 1.4.2 微生物降解植物甾醇生成HPD的研究 |
| 1.5 降解植物甾醇的优化工艺 |
| 1.6 本课题的主要研究内容 |
| 1.6.1 选题依据和意义 |
| 1.6.2 主要研究内容 |
| 第二章 M.neoaurum DSM1381中过表达3-甾酮-Δ~1-脱氢酶及发酵培养基优化 |
| 2.1 研究背景 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 仪器与设备 |
| 2.2.2 工具酶和试剂耗材 |
| 2.2.3 培养基和培养条件 |
| 2.2.4 菌株、质粒和引物 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 菌种的保藏 |
| 2.3.2 菌株生长曲线绘制 |
| 2.3.3 过表达3-甾酮-Δ~1-脱氢酶菌株的构建 |
| 2.3.3.1 质粒DNA的提取 |
| 2.3.3.2 PCR扩增目标基因 |
| 2.3.3.3 过表达质粒的构建 |
| 2.3.3.4 感受态细胞的制备 |
| 2.3.3.5 重组菌株的构建及筛选 |
| 2.3.4 甾体化合物的检测方法 |
| 2.3.5 HPD和4-HP标准曲线的绘制 |
| 2.3.6 发酵培养基优化 |
| 2.3.6.1 氮源优化实验 |
| 2.3.6.2 碳源优化实验 |
| 2.3.6.3 磷酸盐优化实验 |
| 2.3.7 响应面优化方案 |
| 2.3.8 重组菌种发酵验证 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 M.neoaurum DSM1381的生长曲线 |
| 2.4.2 3-甾酮-Δ~1-脱氢酶过表达菌株的构建及筛选 |
| 2.4.3 HPD和4-HP标准曲线的绘制及发酵产物分析 |
| 2.4.4 重组菌株的摇瓶发酵 |
| 2.4.5 发酵培养基优化结果 |
| 2.4.5.1 氮源的选择 |
| 2.4.5.2 碳源的选择 |
| 2.4.5.3 磷酸盐的选择 |
| 2.4.6 响应面实验设计优化结果 |
| 2.4.6.1 回归拟合模型的建立及显着性分析 |
| 2.4.6.2 响应面优化分析 |
| 2.4.6.3 响应面试验优化结果验证 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 本章小结 |
| 第三章 改造M.neoaurum DSM44074构建产HPD的菌株 |
| 3.1 研究背景 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 使用仪器与设备 |
| 3.2.2 主要工具酶与试剂 |
| 3.2.3 培养基和培养条件 |
| 3.2.4 所用菌株、质粒和引物 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 CPISPR/Cpf1系统敲除分枝杆菌基因的方法 |
| 3.3.2 敲除质粒的电转、重组子筛选与验证 |
| 3.3.3 构建菌株生长及产物分析 |
| 3.3.4 NADH脱氢酶和过氧化氢酶表达载体的构建 |
| 3.3.5 重组菌株的构建及发酵产物分析 |
| 3.3.6 重组菌株NAD~+和H_2O_2含量的测定 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 M.neoaurum DSM44074侧链代谢相关基因的敲除 |
| 3.4.1.1 ksh A1&2&3编码基因的敲除 |
| 3.4.1.2 hsd4A和 fadA5编码基因的敲除 |
| 3.4.1.3 侧链代谢基因敲除菌株的发酵产物 |
| 3.4.2 与细胞通透性相关基因的敲除及发酵产物分析 |
| 3.4.2.1 mmpk3和kasD编码基因的敲除 |
| 3.4.2.2 敲除菌株的生长情况 |
| 3.4.2.3 敲除菌株的发酵产物分析 |
| 3.4.3 表达NADH脱氢酶和过氧化氢酶基因质粒的构建 |
| 3.4.4 重组菌株的发酵产物分析 |
| 3.4.5 重组菌株发酵过程中NAD(H)和H_2O_2等含量的测定 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 第四章 结论与展望 |
| 4.1 结论 |
| 4.2 展望 |
| 附录 |
| 相关成果情况 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 引言 |
| 1.1 背景介绍 |
| 1.1.1 甾体类研究进展 |
| 1.1.2 微生物转化概述 |
| 1.1.3 甾族化合物纯化方法 |
| 1.2 4AD的研究现状及问题 |
| 1.2.1 4AD的应用研究 |
| 1.2.2 4AD的提取研究现状及问题 |
| 1.3 清洁生产与膜技术应用 |
| 1.3.1 清洁生产 |
| 1.3.2 膜分离技术应用概述 |
| 1.4 本课题研究目的及意义 |
| 1.5 主要研究内容 |
| 第2章 雄烯二酮发酵液的脱水处理 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验试剂与仪器 |
| 2.2.1 实验原材料与试剂 |
| 2.2.2 主要实验仪器 |
| 2.3 检测分析方法 |
| 2.3.1 HPLC色谱条件及流动相的配制 |
| 2.3.2 标准品及试验样品溶液的配制 |
| 2.3.3 其他相关检测 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 发酵原液的基本成分 |
| 2.4.2 膜分离处理工艺流程 |
| 2.4.3 超滤膜工艺条件研究 |
| 2.4.4 纳滤膜工艺条件研究 |
| 2.5 本章小结 |
| 第3章 雄烯二酮的分离工艺研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验试剂和仪器 |
| 3.2.1 实验材料及试剂 |
| 3.2.2 主要实验仪器 |
| 3.2.3 检测分析方法 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 发酵浓缩液的基本成分 |
| 3.3.2 提取分离4AD方案的选择 |
| 3.4 实验分析 |
| 3.4.1 石油醚法提取工艺方案分析 |
| 3.4.2 皂化法提取工艺方案分析 |
| 3.4.3 乙醇法提取工艺方案分析 |
| 3.4.4 碱沉溶剂法提取工艺方案分析 |
| 3.4.5 碱沉淀络合法萃取4AD的正交试验 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 雄烯二酮的精制工艺研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验试剂和仪器 |
| 4.2.1 实验试剂 |
| 4.2.2 主要实验仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 4AD粗品的预处理 |
| 4.3.2 4AD结晶方案的选择 |
| 4.4 实验结果与分析 |
| 4.4.1 4AD粗品萃取溶解条件的确定 |
| 4.4.2 4AD结晶条件的确定 |
| 4.4.3 4AD的结晶正交实验 |
| 4.5 本章小结 |
| 第5章 经济效益分析 |
| 5.1 物料衡算 |
| 5.2 经济效益对比分析 |
| 第5章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 甾体化合物概述 |
| 1.1.1 甾体化合物 |
| 1.1.2 甾体化合物的应用 |
| 1.1.3 甾类药物的生产 |
| 1.2 雄烯二酮概述 |
| 1.2.1 雄烯二酮 |
| 1.2.2 雄烯二酮的生产 |
| 1.3 研究内容和立题意义 |
| 1.3.1 研究内容 |
| 1.3.2 立题意义 |
| 第二章 雄烯二酮的检测方法 |
| 2.1 检测方法建立背景 |
| 2.2 薄层层析法 |
| 2.3 分光光度计法 |
| 2.4 高效液相色谱法 |
| 2.5 气相色谱法 |
| 2.6 气质联用法 |
| 2.7 本章小结 |
| 第三章 微生物法生产雄烯二酮的工艺条件确定 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 菌种 |
| 3.1.2 试剂 |
| 3.1.3 设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 分枝杆菌BD-696的分离纯化方法 |
| 3.2.2 固体培养方法 |
| 3.2.3 种子培养方法 |
| 3.2.4 发酵培养方法 |
| 3.2.5 菌株生长情况的研究方法 |
| 3.2.6 产率计算方法 |
| 3.2.7 单因素实验设计 |
| 3.2.8 正交试验方法 |
| 3.2.9 分析方法 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 菌株生长曲线 |
| 3.3.2 雄烯二酮的液相标准曲线 |
| 3.3.3 单因素实验结果 |
| 3.3.4 正交试验结果 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 微生物法生产雄烯二酮的其他影响因素的确定 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 菌种 |
| 4.1.2 试剂 |
| 4.1.3 设备 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 培养方法 |
| 4.2.2 产率计算方法 |
| 4.2.3 单因素实验设计 |
| 4.2.4 响应曲面法 |
| 4.2.5 分析方法 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 单因素实验结果 |
| 4.3.2 响应曲面结果 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 培养液的萃取处理和综合利用 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 试剂 |
| 5.1.2 设备 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 萃取条件的选择方法 |
| 5.2.2 发酵液的组分分析方法 |
| 5.2.3 萃取剂的回收方法 |
| 5.2.4 油类的回收方法 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 萃取条件的选择结果 |
| 5.3.2 发酵液的组分分析结果 |
| 5.3.3 萃取剂的回收结果 |
| 5.3.4 油类的回收结果 |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介及读研期间主要科研成果 |
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 知母及知母皂苷研究进展 |
| 1.2 三萜类化合物生物合成途径 |
| 1.2.1 2,3-氧化鲨烯的生物合成 |
| 1.2.2 三萜类化合物的合成 |
| 1.3 本研究的目的、意义及内容 |
| 1.3.1 研究目的及意义 |
| 1.3.2 研究内容 |
| 第二章 知母转录组及甾体皂苷生物合成相关酶基因的挖掘 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 植物材料 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 转录组测序及数据分析 |
| 2.3.2 知母主要成分含量测定 |
| 2.3.3 实时荧光定量(qRT-PCR)分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 知母的转录组测序 |
| 2.4.2 知母主要成分含量测定结果 |
| 2.4.3 qRT-PCR验证目的基因的差异表达 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 知母甾体皂苷元上游生物合成途径解析 |
| 3.1 前言 |
| 3.1.1 环阿屯醇合酶 |
| 3.1.2 甾醇甲基转移酶 |
| 3.1.3 甾醇侧链还原酶2 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 植物材料 |
| 3.2.2 菌株与载体 |
| 3.2.3 主要试剂 |
| 3.2.4 引物及测序 |
| 3.2.5 主要实验仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 基因克隆 |
| 3.3.2 目的基因酵母异源表达及催化产物分析 |
| 3.3.3 目的基因烟草叶片的瞬时表达 |
| 3.3.4 知母环阿屯醇合酶(CAS)和甲基转移酶(SMT)进化分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 AaOSC的克隆与功能分析 |
| 3.4.2 环阿屯醇合酶的进化分析 |
| 3.4.3 AaSMT1 的克隆与功能分析 |
| 3.4.4 甾醇侧链甲基转移酶的进化分析 |
| 3.4.5 AaSSR2 的克隆与功能分析 |
| 3.5 讨论 |
| 3.5.1 AaOSC功能鉴定及进化分析 |
| 3.5.2 AaSMT1 功能鉴定及进化分析 |
| 3.5.3 AaSSR2 功能鉴定 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 酵母高产环阿屯醇工程菌的构建 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 菌株与质粒 |
| 4.2.2 主要试剂 |
| 4.2.3 引物及测序 |
| 4.2.4 实验仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 质粒构建 |
| 4.3.2 整合片段扩增 |
| 4.3.3 整合片段转化底盘菌株及位点检测 |
| 4.3.4 AaOSC整合酵母工程菌的发酵与产物萃取检测 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 酵母delta位点整合片段节点检测 |
| 4.4.2 AaOSC整合酵母基因组工程菌表达产物分析 |
| 4.4.3 产环阿屯醇工程菌的定量分析 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录A 缩略词及中英文对照表 |
| 附录A 缩略词及中英文对照表(续) |
| 附录B 本论文所用引物 |
| 附录B 本论文所用引物(续) |
| 附录B 本论文所用引物(续) |
| 附录C 攻读硕士期间完成论文情况 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 甾体药物的结构和分类 |
| 1.2 甾体激素类药物的合成 |
| 1.3 微生物转化植物甾醇生成9-OHAD的研究进展和趋势 |
| 1.3.1 植物甾醇摄取与转运生产9-OHAD的进展 |
| 1.3.2 微生物转化植物甾醇生产9-OHAD的分子研究 |
| 1.3.3 甾体微生物转化的研究趋势和困境 |
| 1.4 分枝杆菌转化植物甾醇生成9-OHAD的分子机制 |
| 1.4.1 植物甾醇摄取与转运的分子机制 |
| 1.4.2 分支杆菌降解甾醇侧链的机理 |
| 1.5 本课题的研究意义及内容 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验菌种 |
| 2.1.2 PCR引物 |
| 2.1.3 主要药品 |
| 2.1.4 主要试剂 |
| 2.1.5 实验仪器 |
| 2.1.6 培养基 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 质粒DNA提取 |
| 2.2.2 PCR引物的处理 |
| 2.2.3 PCR扩增 |
| 2.2.4 重叠PCR反应 |
| 2.2.5 酶切反应 |
| 2.2.6 琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.2.7 琼脂糖凝胶产物纯化 |
| 2.2.8 DNA产物的纯化 |
| 2.2.9 DNA分子的连接反应 |
| 2.2.10 转化感受态细胞Trans1-T1 |
| 2.2.11 大肠杆菌菌落PCR |
| 2.2.12 分枝杆菌电转感受态的制备 |
| 2.2.13 分枝杆菌电转化 |
| 2.2.14 分枝杆菌质粒的提取 |
| 2.2.15 分枝杆菌生长曲线的测定 |
| 2.2.16 发酵产物的处理与HPLC检测 |
| 第3章 甾醇分子转运系统的构建及表达 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 分枝杆菌的形态与培养 |
| 3.3 甾醇转运系统的构建 |
| 3.3.1 pmv261-mceG表达载体的构建 |
| 3.3.2 pmv261-mceG-yrbE4A表达载体的构建 |
| 3.3.3 pmv261-yrbE4A-yrbE4B表达载体的构建 |
| 3.4 分枝杆菌工程菌的发酵流程 |
| 3.4.1 菌种的活化培养 |
| 3.4.2 9-OHAD标准曲线的绘制 |
| 3.5 发酵结果与分析 |
| 3.5.1 分枝杆菌的生长曲线 |
| 3.5.2 9-OHAD的液相色谱图 |
| 3.5.3 9-OHAD的标准曲线 |
| 3.5.4 基因工程菌的发酵结果分析 |
| 3.6 本章小结 |
| 第4章 甾醇分子侧链降解机制研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 侧链关键基因在分枝杆菌中的强化表达 |
| 4.2.1 细胞色素氧化酶一Mt125及Rj125 |
| 4.2.2 酰基辅酶A连接酶一fad19 |
| 4.2.3 酰基辅酶A硫解酶一fad A5 |
| 4.2.4 酰基辅酶A脱氢酶一R28-29 |
| 4.2.5 Rj125与fad19 的共表达 |
| 4.3 发酵结果与分析 |
| 4.4 本章小结 |
| 第5章 分枝杆菌发酵工艺的优化 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 甾醇转化发酵工艺的优化 |
| 5.2.1 溶氧 |
| 5.2.2 菌种传代 |
| 5.2.3 静息细胞发酵法 |
| 5.3 结果分析 |
| 5.3.1 溶氧对甾醇转化发酵的影响 |
| 5.3.2 菌种传代对甾醇转化发酵的影响 |
| 5.3.3 静息细胞法发酵对甾醇转化的影响 |
| 5.4 本章小结 |
| 第6章 结论及展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 致谢 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 甾体药物概述 |
| 1.2.1 甾体化合物的结构和性质 |
| 1.2.2 自然界中甾体化合物来源和生理意义 |
| 1.2.3 甾体药物的种类和应用 |
| 1.2.4 甾体药物生产的发展历程 |
| 1.3 微生物降解植物甾醇侧链制备AD |
| 1.3.1 AD的结构和性质 |
| 1.3.2 微生物降解植物甾醇侧链过程及机理 |
| 1.3.3 微生物降解植物甾醇侧链过程中存在的主要问题和常用策略 |
| 1.4 含离子液体体系在生物催化与转化中的应用 |
| 1.4.1 离子液体概述 |
| 1.4.2 离子液体的生物毒性和可降解性 |
| 1.4.3 含离子液体体系在酶催化中的应用研究现状 |
| 1.4.4 含离子液体体系在全细胞生物转化中的应用研究现状 |
| 1.5 本文的研究思路和内容 |
| 第二章 离子液体用于植物甾醇生物转化的溶剂特性评价 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与方法 |
| 2.2.1 试剂 |
| 2.2.2 仪器及设备 |
| 2.2.3 菌种与培养基 |
| 2.2.4 离子液体基础性质测定 |
| 2.2.5 离子液体/水平衡相组成测定 |
| 2.2.6 底物、产物溶解度及在离子液体/水两相分配系数测定 |
| 2.2.7 分枝杆菌细胞培养 |
| 2.2.8 离子液体生物相容性表征 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 离子液体理化性质 |
| 2.3.2 离子液体/水平衡相组成 |
| 2.3.3 离子液体中底物植物甾醇的溶解度 |
| 2.3.4 离子液体中产物AD的溶解度 |
| 2.3.5 产物AD在离子液体/水两相分配行为 |
| 2.3.6 离子液体的生物相容性 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 离子液体/水两相体系中分枝杆菌发酵降解植物甾醇侧链 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与方法 |
| 3.2.1 试剂 |
| 3.2.2 仪器及设备 |
| 3.2.3 菌种与培养基 |
| 3.2.4 构建离子液体/水两相发酵体系 |
| 3.2.5 离子液体/水两相发酵体系条件优化 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 不同离子液体的影响 |
| 3.3.2 接种量的影响 |
| 3.3.3 种龄的影响 |
| 3.3.4 离子液体添加时间的影响 |
| 3.3.5 相比的影响 |
| 3.3.6 高底物投料浓度下的发酵转化 |
| 3.3.7 分枝杆菌发酵产AD反应进程 |
| 3.3.8 初步放大实验 |
| 3.3.9 离子液体/水两相体系中分枝杆菌发酵降解植物甾醇侧链的机理探讨 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 含离子液体体系中分枝杆菌静息细胞及固定化细胞催化植物甾醇侧链降解 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与方法 |
| 4.2.1 试剂 |
| 4.2.2 仪器及设备 |
| 4.2.3 菌种与培养基 |
| 4.2.4 分枝杆菌细胞生长曲线 |
| 4.2.5 分枝杆菌静息细胞制备及催化植物甾醇侧链降解 |
| 4.2.6 正交试验设计法优化分枝杆菌静息细胞培养及催化过程 |
| 4.2.7 离子液体的回收方法 |
| 4.2.8 分枝杆菌细胞固定化方法 |
| 4.2.9 扫描电子显微镜观察丝瓜络表面菌体分布 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 植物甾醇存在下的分枝杆菌生长曲线 |
| 4.3.2 分枝杆菌静息细胞培养及催化过程操作参数的优化 |
| 4.3.3 缓冲液种类及pH值 |
| 4.3.4 不同种类离子液体对分枝杆菌静息细胞催化植物甾醇侧链降解的影响 |
| 4.3.5 产物AD的提取及离子液体的回收利用 |
| 4.3.6 分枝杆菌固定化方法及对植物甾醇的生物转化 |
| 4.3.7 丝瓜络固定化分枝杆菌的形态 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 新型离子液体合成及两相体系中植物甾醇生物转化 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料与方法 |
| 5.2.1 试剂 |
| 5.2.2 仪器及设备 |
| 5.2.3 菌种与培养基 |
| 5.2.4 新型水不溶性离子液体的合成 |
| 5.2.5 核磁氢谱和碳谱表征离子液体结构 |
| 5.2.6 离子液体基础性质测定 |
| 5.2.7 离子液体/水平衡相组成 |
| 5.2.8 底物、产物溶解度及在离子液体/水两相分配系数测定 |
| 5.2.9 离子液体生物相容性 |
| 5.2.10 离子液体/水两相体系中分枝杆菌静息细胞降解植物甾醇侧链 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 新型离子液体的表征 |
| 5.3.2 新型离子液体的密度和黏度 |
| 5.3.3 新型离子液体的疏水性、极性和氢键碱性 |
| 5.3.4 新型离子液体/水平衡相组成 |
| 5.3.5 新型离子液体对植物甾醇的溶解性能 |
| 5.3.6 新型离子液体对AD的溶解性能 |
| 5.3.7 新型离子液体/水两相体系中植物甾醇和AD的分配行为 |
| 5.3.8 新型离子液体的生物相容性 |
| 5.3.9 新型离子液体/水两相体系中分枝杆菌降解植物甾醇侧链 |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 新型离子液体共溶剂的合成及在植物甾醇生物转化过程中的应用 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 实验材料与方法 |
| 6.2.1 试剂 |
| 6.2.2 仪器及设备 |
| 6.2.3 菌种与培养基 |
| 6.2.4 新型水溶性离子液体的合成 |
| 6.2.5 核磁氢谱和碳谱表征离子液体结构 |
| 6.2.6 离子液体基础性质测定 |
| 6.2.7 底物植物甾醇和产物AD在离子液体中的溶解度 |
| 6.2.8 离子液体生物相容性 |
| 6.2.9 离子液体共溶剂体系中分枝杆菌静息细胞降解植物甾醇侧链 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 新型离子液体共溶剂的表征 |
| 6.3.2 新型离子液体共溶剂的密度和黏度 |
| 6.3.3 新型离子液体共溶剂的疏水性、极性和氢键碱性 |
| 6.3.4 新型离子液体共溶剂对植物甾醇的溶解性能 |
| 6.3.5 新型离子液体共溶剂对AD的溶解性能 |
| 6.3.6 新型离子液体共溶剂的生物相容性 |
| 6.3.7 新型离子液体共溶剂体系中分枝杆菌降解植物甾醇侧链 |
| 6.4 本章小结 |
| 第七章 结论与展望 |
| 7.1 结论 |
| 7.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间研究成果 |
| 作者简介 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 甾体化合物 |
| 1.1.1 甾体化合物概述 |
| 1.1.2 甾体化合物的生理作用 |
| 1.2 甾体药物 |
| 1.2.1 甾体药物及其应用 |
| 1.2.2 甾体药物的合成 |
| 1.3 甾体药物中间体 |
| 1.3.1 甾体药物中间体简介 |
| 1.3.2 甾体药物中间体的合成 |
| 1.4 微生物降解甾醇 |
| 1.4.1 甾醇摄取 |
| 1.4.2 母核氧化 |
| 1.4.3 甾醇侧链降解 |
| 1.4.4 甾核羟基化反应 |
| 1.4.5 甾核脱氢和加氢反应 |
| 1.4.6 甾核降解 |
| 1.4.7 甾醇代谢调控 |
| 1.5 辅因子循环对细胞内代谢的影响 |
| 1.5.1 辅因子在细胞中的作用 |
| 1.5.2 辅因子循环对细胞内代谢的意义 |
| 1.5.3 辅因子工程 |
| 1.5.4 氧化还原水平对代谢的影响 |
| 1.5.5 细胞内氧化还原水平的调控 |
| 1.5.6 其他辅因子对代谢的影响 |
| 1.5.7 甾醇代谢过程中的辅因子循环 |
| 1.6 微生物转化法制备甾体药物中间体发展现状及存在的问题 |
| 1.6.1 菌种问题 |
| 1.6.2 底物溶解度低 |
| 1.6.3 副产物积累 |
| 1.6.4 底物和产物抑制及对细胞毒性作用 |
| 1.6.5 转化体系效率低 |
| 1.6.6 产物降解 |
| 1.7 本课题研究的目的、意义和实验计划 |
| 第2章 氧化还原水平对甾醇转化过程中还原性产物生成的影响 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与方法 |
| 2.2.1 菌株、质粒和培养基 |
| 2.2.2 实验药品和仪器 |
| 2.2.3 植物甾醇母液配制 |
| 2.2.4 R10-kshA重组菌构建 |
| 2.2.5 分枝杆菌转化植物甾醇 |
| 2.2.6 分析方法 |
| 2.2.7 细胞内NAD(H)浓度的测定 |
| 2.2.8 氧消耗速率测定 |
| 2.3 实验设计方案 |
| 2.3.1 静息细胞无环糊精体系和有环糊精体系转化植物甾醇 |
| 2.3.2 不同反应速率转化植物甾醇 |
| 2.3.3 不同转化条件对还原性产物积累的影响 |
| 2.3.4 HP-β-CD对氧在水相中传质的影响 |
| 2.3.5 新金分枝杆菌NwIB-R10、R10-kshA和NwIB-yV环糊精体系转化植物甾醇 |
| 2.3.6 发酵罐水平甾醇转化 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 静息细胞有环糊精体系和无环糊精体系转化植物甾醇 |
| 2.4.2 环糊精体系不同反应速率转化植物甾醇 |
| 2.4.3 不同转化条件对还原性产物积累的影响 |
| 2.4.4 HP-β-CD对水相中氧传质的影响 |
| 2.4.5 重组菌R10-kshA转化植物甾醇 |
| 2.4.6 新金分枝杆菌NwIB-R10、R10-kshA和NwIB-yV环糊精体系转化植物甾醇 |
| 2.4.7 发酵罐水平甾醇转化 |
| 2.5 本章小结 |
| 第3章 硝酸盐用于调控甾醇转化过程胞内氧化还原水平 |
| 3.1 序言 |
| 3.2 实验材料和方法 |
| 3.2.1 菌种和培养基 |
| 3.2.2 实验药品 |
| 3.2.3 菌体浓度测定 |
| 3.2.4 硝酸盐浓度测定 |
| 3.2.5 硝酸盐标准曲线 |
| 3.2.6 底物和产物测定 |
| 3.2.7 胞内氧化还原水平测定 |
| 3.3 实验设计方案 |
| 3.3.1 硝酸盐对甾醇侧链降解的影响 |
| 3.3.2 硝酸盐浓度测定 |
| 3.3.3 氧化还原水平测定 |
| 3.3.4 底物和产物测定 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 菌体生长情况 |
| 3.4.2 使用硝酸盐对甾醇转化的影响 |
| 3.4.3 硝酸盐浓度测定 |
| 3.4.4 氧化还原水平测定 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 其他调控胞内氧化还原水平的策略 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料和方法 |
| 4.2.1 菌株、质粒和基因 |
| 4.2.2 培养基 |
| 4.2.3 实验药品 |
| 4.2.4 实验仪器 |
| 4.2.5 氧化还原水平测定 |
| 4.2.6 新金分枝杆菌NwIB-R10-vgb重组菌构建 |
| 4.2.7 新金分枝杆菌R10-vgb胞内VHb活性测定 |
| 4.2.8 分枝杆菌转化植物留醇即代谢分析 |
| 4.3 试验设计方案 |
| 4.3.1 分批补料对还原性产物积累的影响 |
| 4.3.2 外源电子受体对还原性产物积累的影响 |
| 4.3.3 R10-vgb转化植物甾醇 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 分批补料对还原性产物积累的影响 |
| 4.4.2 外源电子受体对还原性产物积累的影响 |
| 4.4.5 重组菌R10-vgb转化植物甾醇 |
| 4.5 本章小结 |
| 第5章 总结与展望 |
| 5.1 课题总结 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 硕士期间发表论文情况 |
| 附录 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 甾体药理作用 |
| 1.2 甾体的研究进展 |
| 1.3 微生物转化甾体概述 |
| 1.3.1 微生物转化甾体的特点 |
| 1.3.2 微生物转化甾体的方法 |
| 1.3.3 微生物转化甾体的反应类型 |
| 1.4 雄甾-4-烯-3,17-二酮的制备途径 |
| 1.4.1 薯蓣皂苷元途径 |
| 1.4.2 微生物转化途径 |
| 1.5 雄甾-4-烯-3,17-二酮的微生物转化 |
| 1.6 本课题的立题依据 |
| 第2章 雄甾-4-烯-3,17-二酮转化菌株的筛选 |
| 2.1 材料与仪器 |
| 2.1.1 菌株 |
| 2.1.2 培养基 |
| 2.1.3 底物的配制 |
| 2.1.4 药品与试剂 |
| 2.1.5 仪器与设备 |
| 2.2 实验原理与方法 |
| 2.2.1 转化菌筛选原理 |
| 2.2.2 转化菌筛选方法 |
| 2.2.3 转化产物的检测方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 雄甾-4-烯-3,17-二酮转化菌株的初筛 |
| 2.3.2 雄甾-4-烯-3,17-二酮转化菌株的复筛 |
| 第3章 菌株A35b转化雄甾-4-烯-3,17-二酮的研究 |
| 3.1 材料与仪器 |
| 3.1.1 菌株 |
| 3.1.2 培养基 |
| 3.1.3 底物的配制 |
| 3.1.4 药品与试剂 |
| 3.1.5 仪器与设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 扩大培养获得转化产物方法 |
| 3.2.2 转化产物的检测方法 |
| 3.2.3 菌丝体干重的测定 |
| 3.2.4 转化率的计算 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 转化产物的分离 |
| 3.3.2 转化产物的纯化 |
| 3.3.3 转化产物的理化性质及化学结构解析 |
| 3.3.4 菌株A35b转化条件的优化 |
| 3.4 小结与讨论 |
| 第4章 菌株A35b的鉴定 |
| 4.1 材料与仪器 |
| 4.1.1 菌株 |
| 4.1.2 实验试剂 |
| 4.1.3 培养基和常用试剂的配制 |
| 4.1.4 仪器与设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 形态鉴定 |
| 4.2.2 分子鉴定 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 菌株A35b的菌落特征 |
| 4.3.2 菌株A35b的微观形态特征 |
| 4.3.3 18SrDNA序列扩增与测序 |
| 4.3.4 ITS序列扩增与测序 |
| 4.3.5 发育树构建与分析 |
| 4.4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 甾体化合物 |
| 1.1.1 甾体化合物概述 |
| 1.1.2 甾体药物 |
| 1.2 甾体化合物的微生物转化 |
| 1.2.1 甾体化合物微生物转化的发展史 |
| 1.2.2 甾体化合物微生物转化的特点 |
| 1.2.3 甾体化合物微生物转化的类型 |
| 1.3 微生物降解甾醇侧链合成甾体药物中间体 |
| 1.3.1 甾体药物中间体 |
| 1.3.2 微生物甾醇侧链降解的原料来源 |
| 1.3.3 甾醇侧链降解微生物 |
| 1.3.4 微生物甾醇侧链降解的分子机制 |
| 1.4 甾醇微生物转化合成甾体药物中间体研究进展 |
| 1.4.1 甾体药物中间体产生菌的筛选和诱变选育 |
| 1.4.2 甾体微生物转化的新工艺 |
| 1.4.3 甾体微生物转化的代谢改造 |
| 1.5 研究意义和主要研究内容 |
| 1.5.1 研究意义 |
| 1.5.2 研究内容 |
| 第二章 诱变菌株M. neoaurum JC-12 高产ADD的分子机理解析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验仪器 |
| 2.2.2 主要试剂与培养基 |
| 2.2.3 菌株、质粒和引物 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 新金色分枝杆菌基因组DNA的提取 |
| 2.3.2 目的基因PCR反应扩增和产物回收 |
| 2.3.3 重组质粒的构建 |
| 2.3.4 感受态细胞的制备和转化 |
| 2.3.5 重组枯草芽孢杆菌的构建 |
| 2.3.6 重组枯草芽孢杆菌中KSDD的表达及纯化 |
| 2.3.7 重组枯草芽孢杆菌SDS-PAGE及蛋白浓度的测定 |
| 2.3.8 KSDD酶活力测定与动力学参数分析 |
| 2.3.9 新金色分枝杆菌中ksdd基因敲除和功能回补 |
| 2.3.10 AD和植物甾醇转化分析 |
| 2.3.11 分析方法 |
| 2.4 实验结果与讨论 |
| 2.4.1 M.neoaurum ST-095 和M.neoaurum JC-12中ksdd的基因克隆及序列分析 |
| 2.4.2 枯草芽孢杆菌重组质粒pMA5-ksdd_Ⅰ和pMA5-ksdd_Ⅱ的构建与转化 |
| 2.4.3 重组菌B. subtilis 168/pMA5-ksdd_Ⅰ和B. subtilis 168/pMA5-ksdd_Ⅱ蛋白表达 |
| 2.4.4 氨基酸突变对KSDD活性的影响 |
| 2.4.5 氨基酸突变对KSDD催化AD合成ADD的影响 |
| 2.4.6 氨基酸突变对KSDD在植物甾醇转化过程中的影响 |
| 2.4.7 氨基酸突变影响KSDD活性的蛋白结构分析 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 M. neoaurum JC-12 胆固醇氧化酶酶学性质及功能验证 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 实验仪器 |
| 3.2.2 主要试剂与培养基 |
| 3.2.3 菌株、质粒和引物 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 新金色分枝杆菌基因组DNA的提取 |
| 3.3.2 目的基因PCR反应扩增和产物回收 |
| 3.3.3 重组质粒的构建 |
| 3.3.4 感受态细胞的制备和转化 |
| 3.3.5 重组菌的构建 |
| 3.3.6 重组菌中ChoM的表达及纯化 |
| 3.3.7 重组菌SDS-PAGE及蛋白浓度的测定 |
| 3.3.8 ChoM酶活力测定 |
| 3.3.9 重组ChoM酶学性质研究 |
| 3.3.10 重组枯草芽孢杆菌全细胞转化胆固醇合成 4-胆甾烯3酮 |
| 3.3.11 分析方法 |
| 3.4 实验结果与讨论 |
| 3.4.1 M. neoaurum JC-12 中choM的基因克隆及序列分析 |
| 3.4.2 枯草芽孢杆菌重组质粒pMA5-choM1和pMA5-choM2的构建与转化 |
| 3.4.3 重组菌B. subtilis 168/pMA5-choM1和B. subtilis 168/pMA5-choM2蛋白表达 |
| 3.4.4 重组ChoM的蛋白纯化 |
| 3.4.5 重组ChoM的最适反应pH和pH稳定性 |
| 3.4.6 重组ChoM的最适反应温度和温度稳定性 |
| 3.4.7 金属离子和EDTA对重组ChoM的影响 |
| 3.4.8 重组ChoM的动力学分析 |
| 3.4.9 重组枯草芽孢杆菌转化胆固醇合成 4-胆甾烯3酮的研究 |
| 3.4.10 ChoM2在M. neoaurum JC-12 中的过量表达 |
| 3.4.11 ChoM2的过量表达对M. neoaurum JC-12 转化植物甾醇合成ADD的影响 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 M. neoaurum JC-12 甾酮C27单加氧酶功能鉴定及应用 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 实验仪器 |
| 4.2.2 主要试剂与培养基 |
| 4.2.3 菌株、质粒和引物 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 新金色分枝杆菌基因组DNA的提取 |
| 4.3.2 目的基因PCR反应扩增和产物回收 |
| 4.3.3 重组质粒的构建 |
| 4.3.4 感受态细胞的制备和转化 |
| 4.3.5 重组大肠杆菌的构建 |
| 4.3.6 重组大肠杆菌中SMO的表达及纯化 |
| 4.3.7 重组蛋白浓度测定及SDS-PAGE分析 |
| 4.3.8 SMO酶活力测定方法 |
| 4.3.9 重组SMO酶学性质研究 |
| 4.3.10 M. neoaurum ATCC 25795 中Smo基因的敲除和功能回补 |
| 4.3.11 Smo基因敲除菌株和功能回补菌株的表型差异分析 |
| 4.3.12 M. neoaurum JC-12 中SMO的过量表达 |
| 4.3.13 分析方法 |
| 4.4 实验结果与讨论 |
| 4.4.1 不同新金色分枝杆菌甾醇代谢分析 |
| 4.4.2 M. neoaurum中Smo的基因克隆及序列分析 |
| 4.4.3 重组菌E. coli BL21/p ET28a-Smo1 ， E.coli BL21/p ET28a-Smo2和E.coliBL21/pET28a-Smo3的蛋白表达与纯化 |
| 4.4.4 重组SMO的功能鉴定研究 |
| 4.4.5 重组SMO的酶学特性研究 |
| 4.4.6 M. neoaurum ATCC 25795 中SMO的基因敲除和功能回补 |
| 4.4.7 SMO的基因缺失对新金色分枝杆菌甾醇代谢的影响 |
| 4.4.8 SMO的过量表达对M. neoaurum JC-12 转化植物甾醇合成ADD的影响 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 代谢工程改造M. neoaurum JC-12 合成甾体药物中间体ADD及其发酵工艺研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 实验仪器 |
| 5.2.2 主要试剂与培养基 |
| 5.2.3 菌株、质粒和引物 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 新金色分枝杆菌基因组DNA的提取 |
| 5.3.2 目的基因PCR反应扩增和产物回收 |
| 5.3.3 重组质粒的构建 |
| 5.3.4 感受态细胞的制备和转化 |
| 5.3.5 M. neoaurum JC-12 中ksh A1基因敲除 |
| 5.3.6 重组新金色分枝杆菌JC-12_(S2-choM2-ksdd)的构建与表达 |
| 5.3.7 重组菌JC-12_(S2-choM2-ksdd)中相关酶活力测定 |
| 5.3.8 5-L发酵罐中重组菌JC-12_(S2-choM2-ksdd)转化植物甾醇放大研究 |
| 5.3.9 分析方法 |
| 5.4 实验结果与讨论 |
| 5.4.1 Ksh A1基因敲除菌株Mutksh A1的构建 |
| 5.4.2 KSH酶活性的缺失对植物甾醇转化的影响 |
| 5.4.3 菌株Mutksh A1中共表达ChoM2，SMO2和KSDD的菌种构建与表达 |
| 5.4.4 重组菌株JC-12_(S2-choM2-ksdd)对植物甾醇转化合成ADD的影响 |
| 5.4.5 不同碳源对重组菌株JC-12_(S2-choM2-ksdd)菌体生长的影响 |
| 5.4.6 多阶段发酵策略提高重组菌株JC-12_(S2-choM2-ksdd)合成ADD的能力 |
| 5.5 本章小结 |
| 第六章 新金色分枝杆菌转化植物甾醇合成睾酮的初探 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 实验材料 |
| 6.2.1 实验仪器 |
| 6.2.2 主要试剂与培养基 |
| 6.2.3 菌株、质粒和引物 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 17β-hsd3密码子优化及全基因合成 |
| 6.3.2 酵母基因组DNA的提取 |
| 6.3.3 目的基因PCR反应扩增和产物回收 |
| 6.3.4 重组质粒的构建 |
| 6.3.5 感受态细胞的制备和转化 |
| 6.3.6 重组毕赤酵母的构建与验证 |
| 6.3.7 重组毕赤酵母的诱导表达、纯化及酶学表征 |
| 6.3.8 17β-HSD3和G6PDH的酶活测定方法 |
| 6.3.9 胞内辅因子NADPH/NADP~+水平测定 |
| 6.3.10 重组P. pastoris/17β-HSD3~P-G6PDH全细胞转化AD合成TS的条件优化 |
| 6.3.11 重组M. neoaurum ZADF-4/17β-HSD3~M的构建及甾醇转化 |
| 6.3.12 分析方法 |
| 6.4 实验结果与讨论 |
| 6.4.1 重组毕赤酵母P. pastoris/17β-HSD3~P-G6PDH的构建 |
| 6.4.2 密码子优化提高 17β-HSD3在毕赤酵母中的表达 |
| 6.4.3 重组 17β-HSD3的纯化及酶学性质研究 |
| 6.4.4 17β-HSD3和G6PDH在毕赤酵母中功能性共表达 |
| 6.4.5 17β-HSD3和G6PDH共表达对重组毕赤酵母胞内NADPH/NADP~+含量及TS合成的影响 |
| 6.4.6 重组菌P. pastoris/17β-HSD3~P-G6PDH全细胞转化AD合成TS的条件优化 |
| 6.4.7 分批补料策略提高重组菌TS的产量 |
| 6.4.8 重组菌M. neoaurum ZADF-4/17β-HSD3~M转化植物甾醇合成TS的初探 |
| 6.5 本章小结 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 课题展望 |
| 论文创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录: 作者在攻读博士学位期间发表的论文 |
