蒋羽清[1]（2019）在《重组腺相关病毒载体介导的miR-21过表达调节调亡因子PDCD4促进神经元轴突再生的研究》文中研究说明第一部分 改良Allen’s法建立大鼠损伤挫伤型脊髓中度损伤模型目的:采用改良Allen’s法建立大鼠挫伤型脊髓中度损伤模型,观察脊髓损伤组、假手术组在脊髓损伤后后肢功能评分（BBB评分）及组织学区别。方法:使用脊髓打击器建立大鼠胸9挫伤型脊髓中度损伤模型,对脊髓损伤后后肢运动功能变化采用BBB评分法评价,βⅢ-tubulin免疫荧光染色对两组脊髓损伤后的组织学变化进行观察。结果:大鼠胸9脊髓挫伤后,假手术组的神经元结构基本完整,形状正常,分布匀称,细胞间质匀称,神经元排列较整齐;而SCI组可见神经元结构欠完整,神经突出基本消失,细胞间质模糊混乱。脊髓损伤组与假手术组的BBB评分差异有统计学意义（p<0.05）。结论:1.成功建立大鼠挫伤型脊髓中度损伤模型;2.BBB评分脊髓损伤组明显低于假手术组。第二部分 大鼠脊髓损伤后miR-21及其凋亡因子PDCD4、PTEN的表达目的:阐明大鼠脊髓损伤后miR-21的基因表达变化及凋亡因子PDCD4、PTEN的表达、时间分布和其在脊髓损伤中的作用。方法:60只成年大鼠,SPF级,体重为200-250g,损伤组采取改良Allen’s法建立大鼠T9挫伤型脊髓损伤模型,假手术组只做椎板切除术,各组造模后4h、8h、1d、3d、7d取材,运用Real-time PCR检测脊髓损伤前后miR-21的表达变化;同时采用Western-blot检测miR-21相关靶基因PDCD4和PTEN的表达,观察miR-21是否通过调控其靶基因PDCD4和PTEN的表达影响脊髓损伤的修复。结果:与假手术组相比,miR-21的表达水平在SCI后4小时、8小时和1天均低于正常组织,各组与假手术组相比均存在统计学差异（P<0.05）;而损伤后3天和7天miR-21的水平则显着高于假手术组（P<0.05）,呈现先降低再升高的变化趋势。PDCD4在损伤后1天表达增加,3天其蛋白表达水平达到高峰,损伤后7天表达水平有所下降。与假手术组相比,损伤后1天和3天PDCD4的表达量与损伤前比较具有统计学差异（P<0.01）。p-PTEN的表达在脊髓损伤后1天最高,损伤后3天表达量有所下降,损伤后7天基本降至损伤前水平;脊髓损伤后1天（P<0.01）和3天（P<0.05）的表达水平与假手术组相比存在统计学差异。p-PTEN在SCI后7天回落至脊髓损伤前的表达水平。结论:在SCI的一周时间内,miR-21表达增高PDCD4和PTEN的表达水平则下降,表明了 miR-21在继发性损伤阶段抑制了凋亡因子PDCD4和PTEN的表达,在促进损伤后修复和抑制胶质疤痕的形成中发挥了重要作用。PDCD4和PTEN的表达与miR-21在脊髓损伤后表达的相关性,表明miR-21能够通过调控凋亡因子抑制胶质疤痕、促进损伤后修复。第三部分 重组腺相关病毒载体介导miR-21过表达通过抑制凋亡蛋白PDCD4促进轴突再生目的采取改良Allen’s法建立大鼠挫伤型脊髓损伤模型,研究重组腺相关病毒载体RAAV-miRNA-21对靶蛋白PDCD4的调节作用以及对神经元轴突生长的影响。方法分离并培养胎鼠脊髓原代神经元。通过hU6-MCS-CMV-EGFP rAAV载体,分别将 rAAV-pri-miRNA-21、rAAV-in-miRNA-21、rAAV-nc-miRNA 感染胎鼠脊髓神经元,通过β-Ⅲ tubulin标记的免疫荧光检测各组神经元轴突生长情况,Western blot检测PDCD4表达。结果在用rAAV-in-miRNA-21转导的神经元培养中,神经元要么延长很短的神经突,要么完全不延长。相比之下,过表达miRNA-21的神经元与正常对照组或nc-miRNA组相比,神经突生长明显增加（图7）。量化所有神经元轴突平均长度结果表明,miRNA-21显着增加所有神经元轴突的平均长度（415±16.7mm）,而对照组（198±11.2mm）和 nc-miRNA 组（185±10.6mm）（p<0.05）。量化最长神经元轴突的平均长度结果表明,miRNA-21显着增加平均长度最长的神经元轴突（234±7.1mm）,而对照组（121±3.9 毫米）和 nc-miRNA 组（109±4.7 毫米）,分别（p<0.04）。Western blot分析显示,与对照组相比,PDCD4表达下降35%（p<0.05）,PTEN蛋白水平无明显变化。结论过表达miR-21通过调节靶蛋白PDCD4的表达,增加神经突的伸展,促进出生后大鼠脊髓神经元的神经突生长。
姚艳玲[2]（2019）在《吸烟对雄性大鼠生殖毒性及子代学习记忆的影响及机制研究》文中研究指明目的:构建不同暴露时间和不同暴露剂量的雄性大鼠吸烟模型,评估吸烟对雄性大鼠的生殖毒性,进一步探讨吸烟引起生殖毒性的分子生物学机制;通过Morris水迷宫实验测定不同性别子代空间学习记忆能力的改变,并在分子生物学层面探讨父代吸烟引起子代学习记忆能力改变的机制。方法:SD大鼠300只（雄性200只,雌性100只）,根据暴露时间随机分为2、4、6、8、12周,每周组又包括空白对照组（新鲜空气即0支/天）、低剂量组（10支/天）、中剂量组（20支/天）及高剂量组（30支/天）,每组10只动物。香烟暴露组雄鼠于吸烟结束前1周分别与未染毒成年雌性大鼠按1∶1合笼,交配时间为一周,怀孕雌鼠自然分娩后连续观察子代生长发育情况,21天后断乳,子代雌雄随机分笼分组,分组方法同父代,每组10只动物,雌雄各半。子代长到7周后结束实验。Morris水迷宫方法测定子代学习记忆能力的变化;HE染色法观察父代睾丸组织和子代海马组织的结构形态;精子涂片法,计算精子数量和精子畸形率;观察和记录雌鼠受孕率和子代出生数量;ELISA法测定父代血清和子代血清中胰岛素样生长因子-1（IGF-1）及瘦素（leptin）的表达水平;测定父代睾丸组织和子代海马组织中SOD活性、MDA含量及GSH-Px活性,测定子代海马组织中NO含量及NOS活性;免疫组织化学法检测Caspase-8、Caspase-3蛋白表达水平;RT-PCR及Western Blot法测定父代睾丸组织中死亡受体Fas/FasL凋亡通路中及wnt/β-catenin增殖通路上相关基因mRNA和蛋白表达水平;子代海马组织中wnt/β-catenin相关基因mRNA和蛋白表达水平。TUNEL法测定子代海马组织中凋亡率。结果:（1）香烟暴露组大鼠,体重增长速度减慢（P<0.05）;不同暴露时间及暴露剂量间父代精子的数量和畸形率差异有统计学意义（P<0.05）;香烟暴露组大鼠随染毒时间及剂量的增加,睾丸组织逐渐出现萎缩,曲细精管间隙逐渐变大,精原细胞细胞排列出现紊乱,甚至出现大范围无精原细胞和精子的曲细精管;雌性大鼠受孕率及子代出生数量明显减少（P<0.05）;香烟暴露组父代大鼠血清中IGF-1和leptin的蛋白表达差异均有统计学意义（P<0.05）;体重变化与IGF-1呈正相关,和Leptin呈负相关。（2）暴露组大鼠睾丸组织中SOD和GSH-Px活性均升高（P<0.05）;MDA含量明显增加（P<0.05）;暴露组大鼠睾丸组织中Fas、FasL、FADD、Caspase-3和Caspase-8基因在mRNA和蛋白水平上表达随着暴露时间的延长和暴露剂量的增加,均出现明显上调（P<0.05）;暴露组大鼠睾丸组织中wnt-2b、β-catenin和GSK-3β基因在mRNA和蛋白表达水平上,均出现明显下调（P<0.05）。（3）暴露组子代体重的增长随着父代暴露时间的延长和暴露剂量的增加而减慢（P<0.05）;雌性子代血清中IGF-1蛋白的含量在除2周高剂量组和12周低剂量组外,其他各暴露组均出现明显的降低（P<0.05）;雄性子代血清中IGF-1蛋白的表达量在除8周低、高剂量组和12周低剂量组外,其他各暴露组均出现明显的降低（P<0.05）。雌性子代血清中Leptin蛋白的表达量在除2周各暴露组、6周中剂量组和8周高剂量组明显增加外（P<0.05）,其他各暴露组均出现明显的降低（P<0.05）;雄性子代血清中Leptin蛋白的含量在除6周中剂量组和8周高剂量组明显增加外（P<0.05）,其他各暴露组均出现降低（P<0.05）。水迷宫实验中,雌性大鼠定位航行实验中潜伏期和游泳总距离变化及空间搜索实验中跨越平台次数变化均不显着;在雄性子代,则表现为潜伏期和游泳总距离总体增加的趋势,同时跨越平台次数也减少（P<0.05）。（4）雌性子代海马组织中总NOS含量除在4周中、高暴露组减少外,其他各暴露组均出现增加,且在2周和12周中剂量暴露组及6周低剂量暴露组差异有统计学意义（P<0.05）;iNOS含量总体水平降低（P<0.05）;NO含量在6周低、中暴露组和8周各暴露组出现明显的增高（P<0.05）;BDNF蛋白含量在8周和12周各暴露组出现明显下调（P<0.05）;SOD活性在各剂量暴露组均明显下调（P<0.05）;GSH-Px活性在各剂量暴露组均明显增加（P<0.05）;Tunel阳性细胞数在各剂量暴露组均明显增加（P<0.05）;β-catenin和GSK-3β在mRNA水平上在各剂量暴露组下调明显下调（P<0.05）;wnt-2b、β-catenin、GSK-3β和磷酸化GSK-3β蛋白表达量,随着暴露时间的延长和暴露剂量的增加上调（P<0.05）。雌雄子代海马组织中Caspase-3阳性细胞数在各剂量暴露组均明显增加（P<0.05）。雄性子代海马组织中总NOS及iNOS含量在各暴露组均明显的增加（P<0.05）;NO含量在各暴露组均出现明显的降低（P<0.05）;BDNF蛋白表达量出现明显的减少（P<0.05）;SOD活性及MDA含量在各剂量暴露组明显的增加（P<0.05）;GSH-Px活性只在4周低、中剂量暴露组和8周中剂量暴露组明显的降低（P<0.05）;Tunel阳性细胞数明显的增加（P<0.05）;wnt-2b和β-catenin在mRNA水平均表达上调（P<0.05）;GSK-3β在mRNA水平表达下调（P<0.05）;wnt-2b、β-catenin、磷酸化β-catenin及磷酸化GSK-3β蛋白表达量均明显上调（P<0.05）;GSK-3β蛋白表达量明显下调（P<0.05）。结论:吸烟引起雄性大鼠睾丸组织结构损伤,精子生成减少,雌鼠受孕率降低,其分子生物学机制可能是吸烟使睾丸组织发生了不可逆性的损伤,损伤机制包括睾丸组织中过度的氧化应激反应,上调的死亡受体Fas/FasL凋亡信号通路和抑制的wnt/β-catenin增殖通路。父代吸烟可导致子代空间学习记忆能力受损,且对雄性子代影响更明显,引起这种表现的可能原因是父代吸烟引起了雄性子代海马组织中氧化和抗氧化系统失衡;BDNF蛋白表达下调;父代吸烟使子代海马组织中凋亡率增加,同时激活了wnt/β-catenin增殖通路,凋亡与增殖之间相抗衡使子代未出现更为明显的学习记忆损伤。
王玉玲[3]（2018）在《Tregs、Fas/FasL系统在帕金森病多巴胺能神经元免疫机制研究》文中提出目的:1)探讨血常规检查值或血细胞比值与帕金森病（PD）风险或发展之间的关系;2)通过检测研新疆PD患者外周血中CD3+%、CD4+%、CD8+%、CD19+%、CD56+%、Fas（%）,Tregs细胞的变化,为神经免疫与PD发病机制关系的研究提供依据;3)研究死亡受体（Fas）和Tregs细胞在帕金森病（PD）动物模型的表达,探讨Fas和Tregs在PD发病机制中的作用。方法:1)回顾性分析453例PD患者和436例对照者的病历资料。所有患者均于2002年6月至2017年7月期间被诊断。帕金森氏症的发生由改良的Hoehn-Yahr量表进行量化。在患者和对照个体中,回顾血常规检查的值,并计算血细胞比值。调整后,将453名PD患者与436名合并症患者匹配的对照个体进行比较。进行条件logistic回归分析以探讨血液价值或比值与PD风险之间的关系。并进行有序逻辑回归分析以探讨值或比率与PD之间的关系;2)应用荧光染色法测定83例维、汉两民族PD患者外周血中CD3+%、CD4+%、CD8+%、CD19+%、CD56+%、Fas（%）,Tregs细胞,并与100例健康对照组进行比较。并分析不同民族间,不同用药,不同病程及HY评分与各细胞亚群变化的相关性;3)6-羟多巴胺（6-OHDA）造模,美多芭进行治疗,设立正常对照组（n=10）、假手术组（n=10）、PD模型组（n=20）和美多芭干预组（n=20）。观察各组大鼠旋转行为,并进行黑质组织提取。用免疫印迹检测Fas、FasL、FoxP3（Tregs）变化,免疫组化检测Fas、FasL、FoxP3（Tregs）、TH变化。结果:1)453例PD患者中,女性203例,平均年龄63岁;在436名对照组中,214名女性,平均年龄为61岁。淋巴细胞与血小板比值,平均红细胞血红蛋白浓度和血小板的平均水平下降,血小板与红细胞比值和血小板分布宽度的增加与PD。中性粒细胞与淋巴细胞比值升高,中性粒细胞与血小板比值下降与PD发生有关。2)与对照组相比,PD患者外周血中CD3+,CD4+,CD8+T淋巴细胞表达明显下降,B淋巴细胞无明显变化,NK细胞、Fas及Tregs细胞表达上升。维、汉两民族间相比,各淋巴细胞数量均无明显变化。服用美多芭组Fas及Tregs细胞低于未服用组,CD3+T淋巴细胞亚群与PD患者年龄、B细胞亚群与PD患者病程相关,Fas及Tregs细胞与HY评分有一定相关性。3)与正常组相比,模型组TH表达减少,Fas、FasL和Tregs细胞在黑质区域的表达增高（P<0.01）。结论:外周血中淋巴细胞变化与PD相关。PD患者外周血的淋巴细胞、NK细胞及Fas表达水平改变。外周血淋巴细胞亚群的变化和Fas可能有助于评估PD的病情进展。Fas和Tregs细胞在黑质纹状体中的异常表达可能在PD发病机制中起着重要的作用。
周吉隆[4]（2017）在《let-7g调控卵泡颗粒细胞凋亡与自噬及卵泡发育过程中自噬的机制研究》文中提出在哺乳动物卵巢发育过程中,卵泡由最初的原始卵泡逐渐发育成初级卵泡、次级卵泡,最终发育成成熟卵泡并排卵。在这个过程中,超过99%的卵泡都将发生退化或者闭锁,造成了雌性动物卵泡资源的极大浪费。最近的研究表明卵泡闭锁是由于卵泡颗粒细胞的凋亡而引起。但是目前对于颗粒细胞凋亡的分子机制尚未深入研究。miRNA是长度约为20-24nt的非编码小RNA,它主要通过结合目的基因的3’非翻译区在转录后水平调控基因的表达。let-7 miRNA家族是继lin-4之后第二个被发现的miRNA,并被证实广泛的参与到了个体生长发育,细胞增殖分化,细胞凋亡,疾病等众多生理、病理学过程中。在卵巢,let-7的失调会引起原始生殖细胞数量的降低,从而导致雌性动物不育。在本实验室先前的研究结果中,let-7g被发现是唯一一个在卵泡闭锁过程中持续上调的let-7家族成员,但是其具体的调控颗粒细胞凋亡,卵泡闭锁的分子机制仍不清楚。自噬是真核细胞中广泛存在的降解/再循环系统,对细胞新陈代谢过程中存在的蛋白质进行降解,更新,这种过程对于维持细胞的自稳态有重要意义。近年来的研究表明,自噬广泛的参与到了颗粒细胞凋亡、卵泡闭锁过程中。同时,有文献证实自噬与let-7g miRNA家族紧密相关,因此let-7g调控自噬很有可能是let-7g调控颗粒细胞凋亡、卵泡闭锁的一条重要途径。因此,有必要在卵泡颗粒细胞中对let-7g调控自噬与颗粒细胞凋亡相关性以及let-7g调控自噬的具体分子机制进行探索。作为最主要的生殖激素之一,FSH在卵泡发育颗粒细胞增殖分化和哺乳动物繁殖过程中起了重要的作用。FSH可以通过自噬维持颗粒细胞内环境稳态,从而促进颗粒细胞存活。本人的研究表明,FSH可以显着上调有腔卵泡（FSH敏感型卵泡）中自噬水平,表明了自噬在FSH诱导的卵泡发育过程中表达上调。另外FSH下游调控的通路中,有很多的分子与细胞自噬凋亡有交联。所以,FSH作为最主要的颗粒细胞存活因子,很有可能通过激活细胞自噬来抑制颗粒细胞的凋亡。本论文采用猪和小鼠的卵巢为研究对象,研究内容主要包括以下几个方面:（1）对猪卵巢颗粒细胞体外培养,过表达let-7g后检测颗粒细胞凋亡水平并对其调控的下游靶基因进行验证;（2）小鼠卵巢颗粒细胞转染let-7g后,检测细胞自噬水平并对其下游靶基因进行验证;（3）对let-7g处理的颗粒细胞用自噬抑制剂阻断自噬后,检测颗粒细胞凋亡水平,进一步确认let-7g诱导的颗粒细胞自噬与凋亡的关系;（4）在体内用FSH注射小鼠,对其自噬信号进行组织定位并检测颗粒细胞中自噬的水平,筛选出最有可能的下游通路;（5）在体外培养的颗粒细胞中模拟体内FSH注射后的细胞环境,对之前筛选出的通路进行小干扰RNA敲减后检测细胞自噬活性变化,进一步验证FSH引起的颗粒细胞自噬下游因子的可靠性;（6）在体内用自噬抑制剂注射小鼠,同时用FSH处理后,通过比较颗粒细胞中自噬相关基因、凋亡相关基因、增值相关基因及颗粒细胞功能相关基因的表达水平,对FSH诱导的细胞自噬对于颗粒细胞凋亡、增殖、功能作用进行初步的探索。根据上述研究内容,得出以下结论:（1）let-7g通过靶向TGFBR1调控猪卵泡颗粒细胞凋亡在体外培养的猪颗粒细胞中过表达let-7g后,颗粒细胞凋亡率增加,并表现出凋亡基因Bax表达水平上升,抗凋亡基因Bcl-2表达下降,caspase-3活性上升,表明了let-7g在猪卵泡颗粒细胞中的促凋亡作用。生物信息学研究发现,TGFBR1是let-7g的一个重要候选靶基因。双荧光素酶活性检测分析发现let-7g显着下调TGFBR13’UTR的荧光活性,而对突变型TGFBR1 3’UTR荧光活性没有影响,说明let-7g可以直接作用并抑制TGFBR1的表达。在颗粒细胞中,let-7g下调TGFBR1的mRNA和蛋白水平,并且对TGFBR1下游重要分子SMAD3的活性具有抑制作用。表明let-7g可以作用于猪卵泡颗粒细胞中的TGFBR1并引起下游信号分子磷酸化水平的变化。而用siRNA、抑制剂抑制TGFBR1后,颗粒细胞凋亡率,Caspase-3的活性显着上升。另一方面,用let-7g inhibitor抑制let-7g后,颗粒细胞凋亡率减少,而此时再用TGFBR1 siRNA进行处理,颗粒细胞的凋亡率又会回升,说明TGFBR1的敲降可以抑制let-7g inhibitor的抗凋亡作用,进一步表明了 let-7g是通过TGFBR1来完成对颗粒细胞凋亡的调控。用TGFβ1激活TGFβ信号通路后,TGFBR1的表达升高,let-7g的表达水平下降,表明TGFβ1可以部分通过let-7g来调控其受体TGFBR1的表达。（2）let-7g通过靶向IGF1R调控小鼠卵泡颗粒细胞自噬let-7g可以使体外培养的小鼠颗粒细胞自噬水平升高,自噬标记物GFP-LC3呈现亮点,LC3-1到LC3-2的转化率升高,p62的降解度升高。利用生物信息学研究发现,在IGF1R的3’UTR区有两个潜在let-7g靶位点。通过双荧光素酶活性检测分析进一步证实let-7g可以直接作用并调控IGF1R的表达。在颗粒细胞中,let-7g抑制IGF1R的mRNA和蛋白水平,并且对IGF1R下游蛋白Akt,mTOR磷酸化水平具有抑制作用。用siRNA干扰IGF1R后,颗粒细胞自噬水平升高,而在let-7g过表达的颗粒细胞中过表达IGF1R后,颗粒细胞的自噬水平又会回归到基础对照组水平,进一步证实了 let-7g通过IGF1R来调节颗粒细胞自噬。（3）let-7g调控的细胞自噬参与了细胞凋亡过程对let-7g过表达的小鼠颗粒细胞凋亡率进行检测,发现颗粒细胞凋亡率升高。而自噬抑制剂可以抑制颗粒细胞的凋亡。同时,颗粒细胞的细胞活力显着下降。在正常细胞中,自噬保持较低的的水平,用于维持细胞内环境稳态,而过度的自噬反而会引起细胞的死亡,也就是Ⅱ型细胞死亡。let-7g通过靶向IGF1R上调颗粒细胞自噬水平,相当于在正常细胞中通过IGF1R-Akt-mTOR信号通路引起自噬,导致了颗粒细胞的凋亡上升。（4）FSH激活的卵泡发育过程伴随着自噬的发生小鼠在腹腔注射FSH后,卵巢有腔卵泡中自噬标记物LC3、溶酶体标记物lysotracker聚集,说明FSH在促进卵泡发育的同时伴随着自噬水平的上调。研究表明PI3K-Akt-mTOR信号通路受到抑制具有时间依赖性,这与自噬的表型一致。进一步研究发现FSH的注射引起了卵巢有腔卵泡低氧和能量不足的问题,表明FSH可能通过氧分压、能量代谢诱导了自噬的产生。（5）低氧是FSH诱导自噬的最大诱因在体内用低氧抑制剂处理小鼠后,注射FSH,细胞的自噬水平相较于FSH注射组显着下降。在体外,通过氯化钴（Cocl2）模拟体内低氧环境,FSH可以上调颗粒细胞的自噬,而低氧诱导因子HIF-1α及其下游通路Bnip3、自噬关键基因Beclin1的siRNA转染后,细胞的自噬水平均有所降低。（6）抑制FSH促进卵泡发育过程中的自噬对颗粒细胞增殖具有负作用在体内用自噬抑制剂注射小鼠,同时用FSH注射后发现,颗粒细胞的凋亡相关基因变化不明显,表明了 FSH可能不是通过自噬来抑制颗粒细胞凋亡。相反,抑制自噬后颗粒细胞增值相关基因CyclinA2,CyclinD2表达下调,揭示了自噬与颗粒细胞的增殖之间互有联系。另外,在体外进行的细胞周期实验中发现FSH促进细胞增殖过程可以被自噬抑制剂氯喹所抑制。氯喹的添加可以使细胞在S期发生阻滞,并且细胞的活力也受到抑制。综上所述,本文研究了 miRNA-let-7g在颗粒细胞凋亡,颗粒细胞自噬和卵泡闭锁中的作用及其调控机制,验证了 let-7g调控颗粒细胞凋亡,自噬的相关信号通路。并证明了 let-7g调控的细胞自噬与细胞凋亡之间的相关性。同时,研究了 FSH在促进卵泡发育,维持颗粒细胞存活过程中自噬的产生,提出了 FSH通过HIF-1α-Bnip3途径上调细胞自噬,并证实了该过程对于颗粒细胞的增殖有负性调控作用。let-7g调控颗粒细胞凋亡,自噬及其相关信号通路的研究,对卵泡颗粒细胞凋亡,自噬的分子机理进行了补充,为减少卵泡闭锁,提高家畜繁殖率、提高雌性动物生殖健康等领域提供了新的策略依据。
江旻清[5]（2016）在《Tuberous Sclerosis Complex-1通过PERK-eIF2α信号通路调节髓鞘形成期少突胶质细胞稳态和存活》文中提出结节性硬化症是一种由于TSC1或TSC2基因突变引起的常染色体显性遗传疾病。在结节性硬化症病人中枢神经系统中的典型特征包括皮质块茎、室管膜下巨细胞星形细胞瘤、白质异常等病症。磁共振扩散张量成像显示结节性病人有髓鞘发育缺陷,临床病理切片也显示病人脑中髓鞘和少突胶质细胞数目都少于健康人。然而导致髓鞘缺陷的发病机理仍不清楚。在蛋白信号通路中,TSC1和TSC2位于哺乳动物雷帕霉素靶蛋白的上游,通过抑制雷帕霉素靶蛋白的小GTP酶Rheb负向调节mTOR信号通路的活性。虽然,研究发现mTOR信号通路对调节少突胶质细胞发育有着重要的功能,但是在结节性硬化症病人中少突胶质细胞缺失和髓鞘形成缺陷的机制尚不清楚,是否与激活mTOR信号通路有关也不明确。本论文通过少突胶质细胞特异性敲除TSC1基因的方法建立结节性硬化症髓鞘缺失小鼠模型。研究在持续激活mTOR信号通路的条件下,少突胶质细胞发育和髓的鞘形成及其机制,探索TSC1-mTOR对少突胶质细胞发育和髓鞘形成的作用,寻找结节性硬化症病人髓鞘缺失的机制和治疗方法。本论文主要分为三个部分。第一部分为绪论与综述。绪论首先阐述了髓鞘和少突胶质细胞在中枢神经的功能及与人类神经系统疾病的相关性。然后从三方面撰写了与本论文研究有关的综述。首先系统回顾了少突胶质细胞的起源、分化、增殖与凋亡的调节机制,以及少突胶质细胞与内质网应激可能的潜在关系。其次,阐述了哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mmTOR）信号通路的调控以及其与细胞内蛋白翻译、内质网应激、胞内转录和脂质合成的关系。并阐述了在结节性硬化症病人中髓鞘缺失的病症,TSC基因与哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路的关系。最后,根据少突胶质细胞与蛋白翻译、脂类合成的潜在联系以及TSC基因与哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路及结节性硬化症之间的联系,提出本论文的研究依据及研究目的。第二部分为实验结果。本论文的实验结果发现：1.在少突胶质细胞中特异性敲除Tsc1基因引起的持续性激活哺乳动物雷帕霉素靶蛋白会导致少突胶质细胞缺失及髓鞘的严重减少。尽管激活哺乳动物雷帕霉素靶蛋白增加了少突胶质前体细胞的增殖比率。在胚胎期和出生早期,少突胶质细胞数目在敲除小鼠中有显着的增加。2.我们通过基因表达谱分析发现,Tscl基因敲除引起敲除小鼠中强烈的通过PERK-eIF2a信号通路调控的内质网应激反应,同时还激活了Fas-JNK凋亡信号通路。通过免疫组化的方法,验证了内质网应激和Fas信号通路是Tscl敲除小鼠中导致少突胶质细胞的凋亡的可能原因。3.通过进一步仔细分析内质网应激反应信号通路,我们发现Gadd34的负反馈调节导致内质网应激反应缺失,引起正在分化的少突胶质细胞凋亡。通过药物guanabenz抑制GADD34-PP1磷酸酶的活性来增强PERK-eIF2a信号通路能够部分恢复Tsel敲除小鼠中的髓鞘缺陷以及少突胶质细胞的凋亡。第三部分为总结和讨论。基于实验结果,本论文研究显示,TSC1-mTOR信号通路在维持少突胶质细胞的胞内稳定有着重要的作用。首次提出内质网应激对结节性硬化症髓鞘缺失病症的潜在机制,为该病的治疗提供了可能的细胞靶点。实验结果也为未来的研究提供了方向,包括mTOR活性和少突胶质细胞的发育的相关性,Fas信号通路调控少突胶质细胞凋亡在TSC发病中的作用等,以利我们更全面的了解TSC的发病机制和寻找治疗靶点。
姚海江[6]（2015）在《基于Wnt、Notch信号通路探讨督脉电针对脊髓损伤后大鼠神经再生的作用机制》文中研究指明1研究目的脊髓损伤（Spinal Cord Injury, SCI）是一种发生于中枢神经系统的严重的创伤性疾病,致残率高,而且发病率逐年上升,给患者、家庭及社会带来了沉重的负担。督脉电针治疗在SCI后神经功能的修复方面有很好的临床疗效,但其机制尚未完全阐明。SCI后神经功能的修复机制主要集中在补充替代凋亡的神经细胞、促进神经轴突的再生及再髓鞘化、改善损伤局部的微环境三个方面。依据本课题组的前期研究发现,督脉电针可以抑制神经细胞凋亡、促进神经细胞修复再生,有效促进SCI后神经功能的恢复。本研究以督脉电针为干预手段,系统观察督脉电针对SCI后损伤部位神经干细胞、神经元细胞、少突胶质细胞、星形胶质细胞的影响情况,以与神经干细胞增殖分化紧密相关而又相互影响的Wnt、Notch信号通路为切入点,深入探讨督脉电针是否可以通过调节Wnt、Notch信号通路实现对SCI后内源性神经干细胞增殖分化的调节,进而促进SCI后神经功能的修复,为SCI的临床治疗提供科学的实验依据。2研究方法本研究为动物实验研究,采用改良式Allen’s打击法复制SCI动物模型。分1d、7d、14d、28d四批次进行,选用SD大鼠,随机分为空白对照组（B组）、空白+电针对照组（BE组）、模型对照组（M组）、假手术组（S组）、电针治疗组（EA组）。EA组选取“大椎”、“命门”二穴进行电针干预,20min/d,治疗至相应天数；BE组,干预方法同EA组；B组、S组、M组,在EA组电针干预的同时,给予相同时间、相同强度的抓取、固定,以保证相同的应激条件,但不进行电针治疗。在28d批次大鼠干预1d、7d、14d、28d后,分别进行体质量监测并采用BBB评分进行神经功能评分,比较不同时间点督脉电针对各组大鼠体质量变化及神经功能恢复情况的影响；在各批次大鼠完成相应干预天数之后,采用HE染色方法观察各组大鼠受损脊髓局部病理改变,比较不同时间点督脉电针对各组大鼠受损脊髓局部病理改变的影响；采用免疫组织化学法检测各组大鼠受损脊髓局部Nestin、NSE、APC、GFAP的表达情况,比较不同时间点督脉电针对各组大鼠受损脊髓局部内源性神经干细胞增殖及分化的影响；采用免疫组织化学方法和Western Blot方法检测各组大鼠受损脊髓局部Wnt1、Wnt3a、β-catenin表达情况,比较不同时间点督脉电针对各组大鼠受损脊髓局部Wnt信号通路的影响；采用免疫组织化学方法和Western Blot方法检测各组大鼠受损脊髓局部Delta1、 Presenilin1、Hes1、Hes5表达情况,比较不同时间点督脉电针对各组大鼠受损脊髓局部Notch信号通路的影响。3研究结果3.1体质量变化结果显示,Day1、Day 7、Day 14、Day28时,与同时间点B组相比,BE组、S组大鼠体质量均无显着性变化（Z>0.05）; Day7、Day 14、Day28时,与同时间点B组相比,M组体质量都显着降低,差异有统计学意义（P<0.01）；经过督脉电针干预,在Day 7、Day 14、Day28时,EA组大鼠的体质量都较同时间点M组大鼠有显着升高,差异有统计学意义（P<0.01）,整体观察,与B组相比,M组、EA组大鼠在SCI后体质量增长趋势都显着降低,而经督脉电针干预后,EA组增长趋势较M组显着提高。3.2 BBB评分结果显示,BE组、S组大鼠BBB评分在Day1、Day7、Day14、 Day 28都同同时间点B组大鼠一样,功能评分都为满分（21分）；M组大鼠的BBB评分在Day1、Day7、Day14、Day28都较同时间点B组大鼠有显着降低,差异有统计学意义（P<0.01）,而EA组大鼠的BBB评分在Day7、Day 14、Day28都较同时间点M组大鼠显着提高,差异有统计学意义（P<0.01）,整体观察,M组、EA组大鼠的BBB评分随着时间的变化都有总体升高趋势,EA组大鼠BBB评分的增长趋势要显着高于M组大鼠。3.3不同时间点各组大鼠脊髓组织受损局部HE染色结果显示,1d、7d、14d、 28d,B组、BE组、S组均可看到脊髓组织中灰质与白质结构完整、分界清晰,前角神经元细胞完整,胞体内可见大而圆的胞核,核仁清晰,尼氏小体丰富,聚集于细胞核周围；SCI后1d,M组的灰质中可见大面积的红细胞渗出,神经元细胞结构被破坏,细胞核模糊不清,伴有有轻度水肿,且数目减少,7d时,灰白质界限消失,损伤中心出现液化性坏死、空洞,可见大量的巨噬细胞、泡沫细胞、胶质细胞,神经元细胞基本消失,14d时,M组灰白质界限隐约可见,有少量神经元细胞,但神经元细胞水肿明显,且有空泡形成,28d时,灰白质界限较为清楚,仍有大量泡沫细胞及炎细胞浸润,神经元细胞水肿明显,且有胶质瘢痕形成；而督脉电针可明显减少神经元细胞的凋亡,减少炎症浸润,抑制胶质瘢痕的形成,促进脊髓组织的修复。3.4不同时间点各组大鼠脊髓组织受损局部内源性神经干细胞增殖分化结果显示,Id、7d、14d、28d,与同时间点B组相比,BE组、S组大鼠脊髓组织中Nestin、 NSE、APC、GFAP表达都无显着差异；1d、7d、14d、28d,与同时间点B组相比,M组大鼠脊髓组织受损局部Nestin表达都显着升高（P<0.01）、NSE、APC表达都显着降低（P<0.01）,在1d、7d、14d时,M组GFAP的表达均较同时间点B组显着升高（P<0.01或P<0.05）；1d、7d、14d、28d,与同时间点M组相比,EA组大鼠脊髓组织受损局部Nestin、NSE表达都显着升高（P<0.01）；与同时间点M组相比,EA组大鼠脊髓组织受损局部APC表达都有升高,但是仅在28d时有显着性差异（P<0.05）; 1d、7d、14d时,与同时间点M组相比,EA组大鼠脊髓组织受损局部GFAP表达都显着降低（P<0.01或P<0.05）。3.5不同时间点各组大鼠脊髓组织受损局部Wnt信号通路相关因子表达结果显示,1d、7d、14d、28d,与同时间点B组相比,BE组、S组大鼠脊髓组织中Wntl. Wnt3a、β-catenin表达都无显着差异；与同时间点B组相比,M组大鼠脊髓组织受损局部Wnt1、Wnt3a、β-catenin表达都显着升高（P<0.01或P<0.05）；与同时间点M组相比,EA组大鼠脊髓组织受损局部Wnt1、Wnt3a、β-catenin表达都显着升高（P<0.01或P<0.05）。3.6不同时间点各组大鼠脊髓组织受损局部Notch信号通路相关因子表达结果显示,1d.7d.14d.28d,与同时间点B组相比,BE组、S组大鼠脊髓组织中Deltal. Presenilinl、Hes1、Hes5表达都无显着差异；与同时间点B组相比,M组大鼠脊髓组织受损局部Delta1、Presenilin1、Hes1、Hcs5表达都显着升高（P<0.01或P<0.05）；与同时间点M组相比,EA组大鼠脊髓组织受损局部Delta1、Presenilin1、HCS1、 Hes5表达都显着降低（P<0.01或P<0.05）。4结论4.1 SCI可以引起大鼠体质量降低、神经功能缺损,而督脉电针可以促进SCI后大鼠体质量及神经功能恢复。4.2督脉电针可明显减少SCI后大鼠损伤局部神经元细胞的凋亡及炎症浸润,抑制胶质瘢痕形成,并促进脊髓组织的修复4.3督脉电针可以促进SCI后大鼠损伤局部内源性神经干细胞的激活和增殖,并促进内源性神经干细胞向神经元细胞和少突胶质细胞分化,同时抑制内源性神经干细胞过度分化为星形胶质细胞；4.4督脉电针可以增加SCI后大鼠损伤局部Wnt1、Wnt3a的表达,进而抑制胞质内β-catenin的磷酸化和泛素化,促进β-catenin的大量积累,从而促进Wnt信号通路的上调,这可能是督脉电针促进SCI后大鼠损伤局部内源性神经干细胞增殖,同时促进内源性神经干细胞向神经元细胞分化的机制之一；4.5督脉电针可以抑制SCI后大鼠损伤局部Notch信号通路配体Delta1的表达,进而抑制细胞内Presenilin1的表达,从而抑制Notch信号通路的过度激活,减少其下游基因Hes1、Hes5的表达,这可能是督脉电针促进SCI后大鼠损伤局部内源性神经干细胞向神经元细胞、少突胶质细胞分化,同时抑制内源性神经干细胞过度分化为星形胶质细胞分化的机制之一。
禹晓东[7]（2010）在《嗅鞘细胞的培养及其生物学特性的实验研究》文中研究指明近年来,脊髓损伤（Spinal cord injury ,SCI）的再生与修复研究取得了很大进展,细胞移植被认为是最有前景的治疗方法之一。嗅鞘细胞（Olfactory ensheathing cells,OECs）因其独特的生物学特性越来越受到人们的注意。OECs移植入受损的脊髓部位后,可以排列成细胞链,引导促进神经元轴突再生通过损伤部位,并可促进多种神经细胞的生长及轴突的延长,研究发现,OECs可成功促进下行传导通路的再生。因此,OECs被认为是细胞移植修复SCI最有希望的种子细胞之一。一、OECs对培养神经元生长状态的影响培养新生SD大鼠脊髓背根神经节神经元（Dorsal root ganglion neurons, DRGn）与成年SD大鼠OECs,将DRGn与不同浓度（8×105/ml、4×105/ml、2×105/ml、105/ml、104/ml）OECs共培养。共培养3天后在倒置相差显微镜下观察神经元生长发育情况;行抗NSE SABC免疫组织化学染色并进行细胞计数;行抗GAP-43免疫荧光染色;同时采用MTT法测定神经元活性。对各组结果进行统计学分析。结果表明:各共培养组神经元生长密度明显高于对照组,神经元胞体大而饱满,突起较长,细胞活性也高于对照组。且在一定范围内，神经元生长密度随共培养的OECs接种密度的增加而增加。但当OECs达到一定密度后（2×105／ml），再增加其接种密度，测量神经元生长密度并不继续随之增高。结论：OECs可明显促进体外培养DRGn的生长，提高细胞活性，且在一定范围内存在密度依赖效应。二、OECs对H2O2诱导神经元凋亡的影响培养新生SD大鼠DRGn与成年SD大鼠OECs。向DRGn培养基内加入终浓度为1mmol／L的H2O2诱导其凋亡，然后立刻与不同密度（104／ml、105／ml、2×105／ml、8×105／ml）的OECs共培养；以及在加入H2O2后的不同时间（0h、4h、8h、12h、24h）与OECs共培养。各组DRGn分别于共培养24h后进行Tunel凋亡染色、流式细胞技术测定细胞凋亡率及MTT法检测细胞活性。结果表明：DRGn培养基中加入H2O2诱导凋亡后，与不同密度OECs共培养24h，检测细胞凋亡率均明显低于对照组，细胞活性明显高于对照组，且随着共培养的OECs接种密度的增加，细胞凋亡率随之降低、细胞活性升高。但当OECs接种密度升高至2×105／ml后，再增加OECs的接种密度，上述指标变化并不明显；DRGn培养基中加入H2O2诱导凋亡，于加入H2O2后不同时间与OECs共培养24h。检测DRGn凋亡率在0h、4h、8h、12h组均明显低于对照组，且随着与OECs共培养时间的推迟，凋亡率随之升高。当加入H2O2后24h再与OECs共培养组，其细胞凋亡率与对照组相比并无明显区别。结论：OECs可明显抑制H2O2诱导的DRGn凋亡，并在一定的范围内存在密度依赖效应与时间依赖效应。三、OECs对体外诱导神经元凋亡相关基因表达的影响培养新生SD大鼠DRGn与成年SD大鼠OECs。向DRGn培养基内加入终浓度为1mmol／L的H2O2诱导其凋亡，然后与密度为2×105／ml的OECs共培养。于共培养24h后采用流式细胞技术测定DRGn细胞凋亡率，RT-PCR及Western blot技术检测DRGn凋亡相关基因FADD、Bcl-2、BAx、Birn、Caspase-3的表达。结果表明：DRGn培养基中加入H2O2后与OECs共培养24h，检测细胞凋亡率明显低于对照组，且共培养组BAx、Bim、Caspase-3的表达量明显下调，Bcl-2表达量明显上调。结论：OECs能通过下调BAx、Bitn表达、上调Bcl-2表达的途径抑制DRGn凋亡。四、OECs移植修复大鼠SCI的试验研究培养成年SD大鼠OECs，培养14d后将其自培养瓶中消化下来，制成细胞悬液，并用Hoechst33342标记。使用改良的Allen打击法制造大鼠T8／9脊髓损伤模型，于损伤同时用微量注射器向损伤脊髓局部注入5ul密度为2×106／ml的OECs细胞悬液。于移植后2w观察OECs的存活状况及其在脊髓实质内的迁移情况；于移植后24h及2w行Tunel凋亡染色观察原始打击区域临近节段脊髓神经细胞凋亡情况；于移植后4w行NSE及GAP43免疫荧光染色观察打击区域神经再生情况；于移植后4w对试验动物行运动功能评分。结果发现：OECs移植后可在损伤部位存活，并在脊髓实质内迁移；Tunel凋亡染色显示移植组原始打击区域临近节段脊髓神经细胞凋亡数量明显低于于对照组；NSE及GAP43免疫荧光染色显示移植组打击区域神经元轴突再生数量明显高于对照组；但试验组及对照组动物运动功能评分无明显区别。结论：OECs移植可明显减轻脊髓空洞及胶质瘢痕的形成，促进轴突再生，抑制SCI后的神经细胞凋亡。五、人嗅粘膜来源嗅鞘细胞的分离、培养与纯化本研究共收集嗅粘膜标本15例，全部来自意外交通或机械事故死亡的成年男性，年龄23-40岁，确认为临床死亡并征得家属同意后，常规碘伏消毒取材区域，无菌条件下，采用硬质鼻内窥镜剥离上鼻甲及中鼻甲内侧的嗅粘膜约5mm3，采用胰蛋白酶消化、差速贴壁法纯化。在培养的第7、14d，使用倒置相差显微镜进行形态学观察；同时行抗NGFR p75免疫荧光染色，鉴定细胞并计算染色阳性细胞率。结果表明：通过纯化及培养，于14d可获得纯度约为75%的OECs，细胞形态以带有细长突起的双极细胞及三极细胞为主，有少量的扁平细胞。结论：自成人嗅粘膜可成功分离纯化出OECs，来源稳定，纯度达到移植要求，为开展自体嗅粘膜OECs移植修复SCI提供了技术与方法。
项荣[8]（2006）在《RTN3/HAP与几种蛋白的相互作用及其功能研究》文中提出asy是本实验室发现的一个内质网定位的凋亡诱发基因,hap（homologue of ASY protein）是从人胚肺cDNA文库中克隆的ASY结合蛋白基因（Li et al,2001;Qi et al,2003）,当时称这一基因为asyip（ ASY interacting protein）。序列分析表明HAP和ASY都属于RTN家族,HAP为RTN3,ASY为RTN4B,也称为NogoB。多年以来,本室已对hap基因的转录调控,HAP蛋白的结构、同源异源聚合作用、凋亡诱发功能和内质网应激等进行了大量的研究,为了进一步研究RTN3/HAP参与的细胞凋亡信号转导途径及网络调控,本论文着重分析了RTN3与几种蛋白的相互作用及其功能,阐述了RTN3参与的多种凋亡信号转导途径和各个途径之间的交叉,也初步论述了RTN3与一个AVSD（ Atrioventricular septal defects）风险致病基因产物的作用及对细胞的增殖和凋亡的影响,初步揭示了RTN3与AVSD之间的分子机制。本室的刘青珍博士曾用酵母双杂交系统筛选出果蝇的FADD（dFADD）能与人的RTN3（hRTN3）相互作用。为了进一步证实人的FADD与RTN3的作用,首先我们构建了二者的真核表达载体,运用免疫共沉淀的方法研究它们的相互作用,结果证实二者在哺乳动物细胞内是可以结合的。内源性的FADD能与内源性的RTN3或过表达的RTN3发生相互作用;而对RTN3和FADD相互作用功能区的鉴定实验说明:RTN3的C-端45个氨基酸和FADD的DD区是二者的结合区,这两个区域的缺失将使两种蛋白不能结合;当内质网定位的RTN3过表达时,FADD被招募到内质网上形成复合物,随后激活了caspase-8,Bid被切割为t-Bid,使Cyto c从线粒体释放出来;激光共聚焦实验证明FADD与RTN3在内质网上存在明显的共定位;衣霉素（tunicamycin,TM）刺激下,内源性的FADD被招募到内质网上与RTN3形成复合物,使FADD在内质网上的分布增多,RTN3与FADD的相互作用能影响TM诱发的细胞凋亡和caspase-8的活化。许多的研究表明,FADD在多种死亡受体介导的凋亡信号转导通路中起着重要的作用,Bid是线粒体凋亡途径的重要因子,我们以前证明,过表达的RTN3将引起内质网应激,内质网Ca2+排空,激活caspase-12,内质网定位的RTN3在内质网凋亡信号途径中十分重要,结合本研究结果,我们认为:以RTN3过表达为中心,细胞凋亡的死亡受体信号途径、线粒体信号途径和内质网途径在此发生了对话,形成细胞凋亡途径的信号网络。与此同时我们还发现NogoB也能与FADD作用,而引起FADD途径相关的Cyto c的释放。另外,在本室研究基础上,本文对RTN3与Bcl-2的相互作用和蛋白定位进行了深入的研究。一直以来,Bcl-2被认为是一个主要在线粒体上起作用的重要的凋亡抑制蛋白,它能与Bcl-2家族中的多种蛋白在线粒体上相互作用。本研究发现RTN3作为一个主要定位在内质网且不属于Bcl-2家族成员的蛋白,不仅能在体外和Bcl-2互相结合,而且,提取细胞的亚细胞组分用于免疫共沉淀实验,结果表明:在哺乳动物细胞中RTN3与Bcl-2结合在内质网上。转染外源的Bcl-2和RTN3到HeLa细胞,流式检测发现,RTN3的过表达会导致细胞凋亡,Bcl-2能抑制由外源的过表达RTN3诱发的细胞凋亡。为了更好的研究二者的相互作用,我们用G418筛选得到了稳定表达Bcl-2的HeLa细胞株（BH4）,在BH4中,无论是瞬时转染RTN3导致的蛋白表达增加,还是衣霉素刺激引起的RTN3表达的上调都能促进Bcl-2的凋亡抑制活性,并且使细胞的凋亡率降低。Bcl-2参与的线粒体凋亡途径与RTN3介导的内质网凋亡途径因为这两种蛋白的相互作用而发生了交联。内质网定位的RTN3通常被认为是一个诱导细胞凋亡的蛋白,我们对它除凋亡以外的生理功能知之甚少。鉴于RTN3在很多组织中的高表达,我们很难想象在没有外界或自身信号刺激的情况下,高表达的RTN3会诱导细胞凋亡。本研究发现在AVSD中起着重要作用的细胞黏附分子――CRELD1 （cysteine rich with EGF like domains 1）作为AVSD2的首个散发性致病风险基因的产物,pull-down实验表明它能在体外和RTN3结合;而细胞免疫共沉淀实验也证明,在CRELD1过表达的情况下,CRELD1能与过表达或内源的RTN3在细胞质膜上发生相互作用,二者的作用改变了RTN3的内质网定位,流式细胞仪检测到细胞表面的RTN3蛋白增多;激光共聚焦结果显示CRELD1与RTN3在细胞质膜上有共定位,二者的结合使RTN3较集中的分布在细胞质膜上;MTT实验发现CRELD1与RTN3的相互作用影响了细胞的生长增殖,RTN3过表达是抑制细胞生长的,而CRELD1的外源性过表达减弱了RTN3对细胞生长的这种抑制;对于过表达RTN3诱发的凋亡,CRELD1与RTN3的作用较大的抑制了细胞凋亡,而衣霉素的刺激能减弱二者的相互作用,使凋亡细胞增多。我们以前的结果证明RTN3的凋亡诱发功能依赖于它的内质网定位,本文的结果表明当RTN3被CRELD1拉离内质网时,细胞的凋亡减弱了,可见RTN3的内质网定位对其凋亡功能的发挥是至关重要的,增加它在内质网的定位会加剧细胞凋亡,而减少它在内质网的分布能部分抑制由RTN3过表达而引起的细胞凋亡。这些结果不仅使我们能更好的了解RTN3,而且为AVSD疾病的分子机制研究提供了较好的线索。
杨晓华[9]（2006）在《骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠脊髓损伤模型后凋亡因子Fas、Fas-L表达变化》文中进行了进一步梳理[目的]：通过静脉移植绿色荧光蛋白转基因小鼠骨髓间充质干细胞治疗大鼠脊髓挫伤模型，观察骨髓间充质干细胞存活迁移情况及凋亡因子Fas和Fas1在移植后不同时点的变化情况，为骨髓间充质干细胞治疗脊髓损伤及机理提供实验室依据。 [方法]1、实验动物分组：成年健康SD雌鼠66只（体重200-250g）随机平均分成11组，每组6只，即空白对照组、损伤对照组（术后1天组、3天组、7天组、14天组和21天组）、绿色荧光蛋白转基因小鼠骨髓间充质干细胞移植治疗脊髓挫伤模型组即细胞移植治疗组（术后1天组、3天组、7天组、14天组和21天组）。2、脊髓挫伤模型制备：用自制改良Allen装置撞击脊髓T12节段，建立脊髓挫伤模型。3、骨髓间充质干细胞的准备和移植：取第5代MSCS，将细胞用生理盐水配成1×107／ml的细胞悬液备用。用10μl微量注射器抽取该细胞悬液10μl，并注入含1ml生理盐水的皮试用注射器内，以备移植使用。在造模完成当即，用已备好细胞悬液的皮试针穿刺尾静脉，注入细胞悬液。术后每天每组行BBB评分及爬网格训练。4、取材和检测：各组动物4％多聚甲醛心内灌注固定，取损伤处尾侧脊髓入4％多聚甲醛后固定，修块，30％蔗糖沉底，恒冷切片机作20μm厚的连续冰冻切片，每隔5片取一片组织进行荧光细胞观察，间隔取片后以行抗Fas、Fas-1抗体免疫组织化学ABC染色。在荧光显微镜下观察细胞移植组荧光细胞。在olympus光学显微镜下对脊髓灰质前角进行阳性细胞计数，利用HPLAS-1000高清晰图文分析系统检测Fas、Fas-1凋亡因子免疫阳性反应物的平均灰度值。应用SPSS11.0软件包进行组间多个样本均数比较的单因素方差分析、q检验。 [结果]1．移植细胞观察结果：在静脉移植后1天、3天、7天、14天、21天均可
宋冬晶[10]（2006）在《针对Fas基因的RNAi对神经细胞缺血再灌注损伤的保护作用》文中进行了进一步梳理神经细胞缺血再灌注损伤是目前研究热点,细胞凋亡是脑缺血再灌注损伤的主要病理生理机制之一,Fas基因表达在细胞凋亡中起重要作用。RNAi技术能特异性地、有效地抑制靶基因的表达。故针对fas基因的RNAi可以降低缺血再灌注损伤时神经细胞的fas基因表达,从而降低凋亡率。目前国内尚无关于fas-RNAi干预神经细胞缺血再灌注损伤后细胞凋亡的研究报道。本实验构建针对fas基因的siRNA质粒,转染经NGF诱导后的鼠PC12细胞,24h后体外模拟法建立神经细胞缺血再灌注损伤模型,并于模拟再灌注后不同时间点检测凋亡相关指标。目的是探讨针对fas基因的RNAi对缺血再灌注损伤后细胞凋亡的影响。本实验分四部分进行。实验一分别于模拟缺血30min,60min,90min,2h,6h等不同时间段后进行模拟再灌注,建立模拟神经细胞缺血再灌注损伤模型,并检测模拟再灌注后0h,3h,6h,12h,24h,72h等时间点的细胞凋亡率和死亡率。摸索一个适当的模拟缺血再灌注时间段,结果提示:在模拟缺血90min组,模拟再灌注损伤后细胞凋亡率高而死亡率相对低,适合进行针对细胞凋亡的基因干预研究。实验二体外模拟缺血90min后模拟再灌注法建立神经细胞缺血再灌注损伤模型,检测模型组与对照组fas、caspase-3基因表达水平及细胞凋亡水平的变化,结果提示:缺血再灌注损伤后,神经细胞fas、caspase-3表达水平增高,fas表达高峰早于caspase-3基因表达高峰,而caspase-3基因表达时间曲线与细胞凋亡水平变化曲线一致。实验三针对fas基因进行siRNA质粒设计与构建,转染NGF诱导的鼠PC12细胞,24h后模拟缺血再灌注损伤,检测fas mRNA、fas蛋白表达水平。结果提示fas-siRNA能明显降低缺血再灌注损伤后神经细胞内fasmRNA、fas蛋白的表达,提示该质粒有能有效抑制fas基因的表达。实验四检测质粒转染及模拟缺血再灌注损伤后,各组细胞caspase-3活性、细胞凋亡水平的变化。结果显示:fas-siRNA转染后caspase-3活性明显降低、细胞凋亡率明显降低,提示fas-siRNA可以下调caspase-3的活化,降低细胞凋亡率,从而起到脑保护的作用。综上,本实验结果提示:应用经NGF诱导的鼠PC12细胞,体外模拟法可有效地建立神经细胞缺血再灌注损伤模型。模拟缺血90min后模拟再灌注损伤,细胞凋亡率高而死亡率相对较低,适合用于基因干预后分子生物学及细胞形态学变化的观察。针对Fas基因的siRNA质粒可有效地抑制Fas基因的表达,降低缺血再灌注损伤后的Fas mRNA和蛋白水平以及caspase-3活性,从而降低细胞凋亡率。本试验的结论:Fas-RNAi可以有效地下调凋亡基因Fas的表达,降低神经细胞缺血再灌注损伤后的细胞凋亡率,从而起到脑保护的作用。
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
| 中文摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 第一部分 改良Allen's法建立大鼠挫伤型SCI模型 |
| 材料与方法 |
| 1.1 实验材料和试剂 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 主要试剂及仪器 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 大鼠脊髓损伤(SCI)模型的构建 |
| 1.2.2 术后动物饲养及护理 |
| 1.2.3 术后观察指标及方法 |
| 1.2.4 组织学观察(标本采集及免疫荧光染色) |
| 1.2.5 统计学处理 |
| 结果 |
| 1.1 大鼠挫伤型SCI模型的成功建立 |
| 1.2 观察生理状态和大鼠运动功能的检测 |
| 1.3 组织免疫荧光染色观察 |
| 讨论 |
| 1. SCI模型动物的选定 |
| 2. 建立SCI模型方法的选定 |
| 3. 致伤节段及损伤程度的选择 |
| 4. 模型效果的评价 |
| 第二章 大鼠脊髓损伤后miR-21及凋亡因子PDCD4、PTEN的表达 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 2.1 实验材料和试剂 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 主要实验仪器 |
| 2.1.3 主要实验试剂 |
| 2.1.4 本实验中使用的引物序列 |
| 2.1.5 主要试剂配置 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 动物分组 |
| 2.2.2 动物模型的制备以及建模后处理同实验一。 |
| 2.2.3 实验样品采集 |
| 2.2.4 实时定量PCR检测脊髓组织中miR-21的表达 |
| 2.2.5 Western Blot检测脊髓组织中PDCD4和PTEN的表达 |
| 2.2.6 实验数据的统计学处理 |
| 结果 |
| 2.1 大鼠脊髓损伤后miR-21的表达 |
| 2.2 大鼠脊髓损伤后PDCD4、PTEN的表达 |
| 讨论 |
| 1. 脊髓损伤的治疗 |
| 2. miRNA在中枢神经系统的作用 |
| 3. miR-21参与疾病的主要机制 |
| 4. PDCD4的结构及功能 |
| 5. PTEN的结构及功能 |
| 第三部分 重组腺相关病毒载体介导miR-21过表达通过抑制凋亡蛋白PDCD4促进轴突再生 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 3.1 实验材料和试剂 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 主要实验仪器 |
| 3.1.3 主要实验试剂 |
| 3.1.4 本实验中使用的引物序列 |
| 3.1.5 本实验中使用的质粒 |
| 3.1.6 主要试剂配置 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 细胞总RNA的提取 |
| 3.2.2 细胞总RNA反转录 |
| 3.2.3 RT-PCR检测细胞样品中miR-21的表达 |
| 3.2.4 脂质体转染实验 |
| 3.2.5 细胞总蛋白质的提取 |
| 3.2.6 细胞总蛋白质含量的测定(BCA法) |
| 3.2.7 大鼠脊髓神经元的分离与原代培养 |
| 3.2.8 rAAV-pri-miR-21感染大鼠脊髓神经元 |
| 3.2.9 大鼠脊髓神经元免疫荧光染色 |
| 3.2.10 Western Blot检测大鼠脊髓神经细胞中PDCD4和PTEN的表达 |
| 3.2.11 荧光素酶报告实验 |
| 3.2.12 实验数据的统计学处理 |
| 结果 |
| 3.1 胎鼠脊髓神经元原代培养及感染率 |
| 3.2 重组腺相关病毒载体成功过表达miR-21 |
| 3.3 miRNA-21过表达对PDCD4、PTEN的影响 |
| 3.4 miR-21过表达可促进轴突再生和突触形成 |
| 3.5 miR-21抑制靶蛋白PDCD4的表达 |
| 讨论 |
| 3.1 脊髓神经元应用rAAV-pri-miR-21的安全性及效果 |
| 3.2 miR-21对脊髓神经元PDCD4和PTEN表达的影响 |
| 3.3 miR-21对脊髓神经元轴突生长的影响 |
| 总结和展望 |
| 一、总结 |
| 二、不足及展望 |
| 参考文献 |
| 综述 MicroRNA-21对脊髓损伤的保护作用机制研究 |
| 1. 前言 |
| 2. 脊髓损伤简介 |
| 2.1 概念 |
| 2.2 MRI诊断 |
| 2.2.1 MRI诊断方法 |
| 2.2.2 MRI在脊髓损伤中的诊断价值 |
| 2.3 脊髓损伤的治疗 |
| 3. MicroRNA-21简介 |
| 3.1 概念 |
| 3.2 在疾病诊疗中的应用 |
| 4. MicroRNA-21对脊髓损伤的保护作用 |
| 4.1 microRNA-21在脊髓损伤中的抗凋亡作用 |
| 4.2 microRNA-21凋亡相关基因在脊髓损伤中的作用 |
| 5. 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间发表的论文和参加的课题 |
| 发表论文 |
| 参加的课题 |
| 英文缩略语表 |
| 致谢 |
| 中英文缩略词对照表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 吸烟对雄性大鼠的生殖毒性 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验材料 |
| 1.3 实验仪器和主要实验试剂 |
| 1.4 实验方法 |
| 1.5 实验步骤 |
| 1.6 统计方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 吸烟对雄性大鼠生殖毒性的机制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验材料 |
| 1.3 实验仪器 |
| 1.4 主要实验试剂 |
| 1.5 实验方法 |
| 1.6 实验步骤 |
| 1.7 统计方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 吸烟对子代生长发育和学习记忆的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验材料 |
| 1.3 实验仪器和主要实验试剂 |
| 1.4 实验方法 |
| 1.5 实验步骤 |
| 1.6 统计方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四部分 吸烟对子代学习记忆的影响机制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验材料 |
| 1.3 实验仪器 |
| 1.4 主要实验试剂 |
| 1.5 实验方法 |
| 1.6 实验步骤 |
| 1.7 统计方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间获得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 导师评阅表 |
| 中英文缩略词对照表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 血常规检查值及血细胞比值与帕金森病的相关分析 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 临床资料 |
| 1.2 入选标准 |
| 1.3 研究方法 |
| 1.4 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 新疆地区维汉民族淋巴细胞亚群、FAS/FASL与帕金森病的相关性研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 临床资料 |
| 1.2 入选标准 |
| 1.3 研究方法 |
| 1.4 技术路线图 |
| 1.5 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 PD模型鼠黑质FAS/FASL及 TREGS检测及分析 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 实验动物与材料 |
| 1.2 研究方法 |
| 1.3 实验步骤 |
| 1.4 技术路线图 |
| 1.5 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间获得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 导师评阅表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语中英文对照表 |
| 上篇 文献综述 |
| 第一章 let-7基因功能研究进展 |
| 1 let-7家族特征 |
| 1.1 let-7的发现 |
| 1.2 let-7的命名 |
| 1.3 let-7的产生 |
| 1.4 let-7序列特点 |
| 2 let-7生物学功能 |
| 2.1 let-7在线虫中的功能 |
| 2.2 let-7在果蝇中的功能 |
| 2.3 let-7在脊椎动物中的功能 |
| 2.4 let-7与早期发育 |
| 2.5 let-7与癌症 |
| 2.6 let-7与神经系统 |
| 2.7 let-7与心肌功能 |
| 2.8 let-7与细胞重编程 |
| 3 let-7的表达调控 |
| 3.1 let-7在转录水平的调控 |
| 3.2 末端尿嘧啶转移酶(TUTases)对let-7的调控 |
| 3.3 Lin28对let-7的负调控 |
| 参考文献 |
| 第二章 细胞凋亡研究进展 |
| 1 细胞凋亡概述 |
| 1.1 细胞凋亡形态及生化变化 |
| 1.2 细胞凋亡途径 |
| 1.3 细胞凋亡相关蛋白 |
| 1.4 细胞凋亡的检测方法 |
| 2 细胞凋亡的作用 |
| 2.1 细胞凋亡与形态发生 |
| 2.2 细胞凋亡与个体发育 |
| 2.3 细胞凋亡与器官功能 |
| 3 细胞凋亡与卵泡闭锁关系研究 |
| 3.1 卵泡发育及闭锁 |
| 3.2 颗粒细胞凋亡与卵泡闭锁 |
| 3.3 卵泡颗粒细胞凋亡的调控 |
| 参考文献 |
| 第三章 自噬的过程、调控及其功能研究 |
| 1 自噬概述 |
| 1.1 自噬的定义 |
| 1.2 自噬的分类 |
| 1.3 自噬的形态学过程 |
| 1.4 自噬的发生机理 |
| 2 自噬的调控 |
| 2.1 自噬的转录调控 |
| 2.2 自噬的转录后调控 |
| 2.3 自噬的翻译后调控 |
| 3 自噬的功能 |
| 3.1 降解产物的利用 |
| 3.2 大分子蛋白和细胞器的清除 |
| 3.3 从细胞质到溶酶体/内涵体 |
| 3.4 隔离/打包 |
| 参考文献 |
| 下篇 试验部分 |
| 第四章 let-7g通过靶向TGFBR1调控猪卵泡颗粒细胞的凋亡 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 let-7g生物信息学分析 |
| 2.2 细胞培养 |
| 2.3 miRNA转染 |
| 2.4 凋亡检测 |
| 2.5 RNA的提取 |
| 2.6 cDNA的反转录 |
| 2.7 实时荧光定量PCR(Quantitative Real Time PCR,qRT-PCR) |
| 2.8 Caspase-3活性检测 |
| 2.9 质粒的构建 |
| 2.10 荧光素酶活性检测 |
| 2.11 Western blot |
| 2.12 siRNA干扰 |
| 2.13 TGF-β1处理细胞及miRNA定量 |
| 2.14 数据分析 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 猪let-7g特征分析 |
| 3.2 let-7g促进猪颗粒细胞凋亡 |
| 3.3 TGFBR1是let-7g靶基因 |
| 3.4 let-7g在颗粒细胞中下调TGFBR1 |
| 3.5 敲减TGFBR1之后,颗粒细胞凋亡率上升 |
| 3.6 let-7g通过靶向TGFBR1调控颗粒细胞凋亡 |
| 3.7 let-7g在颗粒细胞中调控TGFp信号通路 |
| 3.8 let-7g的表达受TGF-β1的调控 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 let-7g通过调控IGF1R诱导小鼠颗粒细胞自噬 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 质粒构建 |
| 2.3 转染 |
| 2.4 GFP-LC3荧光及MDC标记检测 |
| 2.5 Western blot及抗体 |
| 2.6 qRT-PCR检测 |
| 2.7 双荧光素酶活性检测 |
| 2.8 TUNEL检测 |
| 2.9 CCK8检测 |
| 2.10 细胞凋亡检测 |
| 2.11 数据分析 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 let-7g诱导颗粒细胞自噬 |
| 3.2 let-7g靶向IGF1R |
| 3.3 敲减IGF1R促进细胞自噬 |
| 3.4 let-7g下调IGF1R/Akt/mTOR信号通路 |
| 3.5 过表达IGF1R可以抑制let-7g诱导的自噬 |
| 3.6 let-7g诱导的自噬参与到了细胞凋亡过程 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第六章 FSH通过HIF-1α上调小鼠颗粒细胞自噬 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验动物处理 |
| 2.2 免疫组化 |
| 2.3 Western blot及抗体 |
| 2.4 qRT-PCR检测 |
| 2.5 CCK8检测 |
| 2.6 细胞内ROS活性检测 |
| 2.7 细胞内AMPK活性检测 |
| 2.8 小鼠原代颗粒细胞培养 |
| 2.9 细胞转染 |
| 2.10 GFP-LC3检测 |
| 2.11 数据分析 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 FSH促进小鼠颗粒细胞自噬 |
| 3.2 FSH通过Akt/mTOR信号通路调控细胞自噬 |
| 3.3 FSH上调颗粒细胞中HIF-1α,AMPK的水平 |
| 3.4 HIF-1α是FSH调控自噬的关键因子 |
| 3.5 FSH在体外上调HIF-1α调控自噬活性 |
| 3.6 敲减HIF-1α,Beclin1,Bnip3缓解FSH上调的自噬活性 |
| 3.7 颗粒细胞中的自噬与卵泡发育相关 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 创新 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
| 附录 |
| 内容摘要 |
| ABSTRACT |
| 一. 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 少突胶质细胞发育与髓鞘形成 |
| 1.2.1 少突胶质细胞的起源 |
| 1.2.2 信号通路介导的少突胶质细胞分化 |
| 1.2.3 染色体重塑 |
| 1.2.4 少突胶质细胞的增殖和凋亡 |
| 1.2.5 少突胶质细胞与内质网应激反应 |
| 1.3 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路 |
| 1.3.1 mTOR调节蛋白合成和内质网应激反应 |
| 1.3.2 mTOR信号通路调节基因转录 |
| 1.3.3 mTOR与脂类合成 |
| 1.4 结节性硬化症(Tuberous sclerosis)与髓鞘缺失 |
| 1.5 问题的提出：研究纲要 |
| 二. 少突胶质细胞特异性敲除TSC1引发MTOR信号通路依赖性(?)鞘形成障碍 |
| 2.1 Tsc1是少突胶质细胞分化和体内髓鞘形成所必须的 |
| 2.1.1 引言 |
| 2.1.2 材料与方法 |
| 2.1.3 实验结果 |
| 2.2 Tsc1敲除导致中枢神经系统广泛髓鞘形成障碍 |
| 2.2.1 引言 |
| 2.2.2 材料与方法 |
| 2.2.3 实验结果 |
| 2.3 超微结构分析显示Tsc1敲除小鼠中髓鞘缺失 |
| 2.3.1 引言 |
| 2.3.2 材料与方法 |
| 2.3.3 实验结果 |
| 2.4 Tsc1敲除导致mTOR信号通路依赖性少突胶质细胞分化障碍 |
| 2.4.1 引言 |
| 2.4.2 材料与方法 |
| 2.4.3 实验结果 |
| 2.5 讨论 |
| 三. TSC1-MTOR信号通路调控少突胶质细胞扩增与凋亡 |
| 3.1 敲除Tsc1对不同时期少突胶质细胞发育的影响 |
| 3.1.1 引言 |
| 3.1.2 材料与方法 |
| 3.1.3 实验结果 |
| 3.2 Tsc1敲除引发中枢神经系统少突胶质细胞凋亡 |
| 3.2.1 引言 |
| 3.2.2 材料与方法 |
| 3.2.3 实验结果 |
| 3.3 Tsc1敲除引起细胞应激反应和凋亡信号通路的激活 |
| 3.3.1 引言 |
| 3.3.2 材料与方法 |
| 3.3.3 实验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 四. TSC1调控PERK-EIF2A介导的内质网应激反应促进少突胶质细胞的稳态和存活 |
| 4.1 敲除Tsc1在少突胶质细胞中激活内质网应激反应和Fas凋亡信号通路 |
| 4.1.1 引言 |
| 4.1.2 材料与方法 |
| 4.1.3 实验结果 |
| 4.2 激活PERK-eIF2α信号通路调节正在分化的少突胶质细胞存活 |
| 4.2.1 引言 |
| 4.2.2 材料与方法 |
| 4.2.3 实验结果 |
| 4.3 Guanabenz治疗敲除小鼠激活p-eIF2α调节的适应性应激反应保护少突胶质细胞并增强髓鞘形成 |
| 4.3.1 引言 |
| 4.3.2 材料与方法 |
| 4.3.3 实验结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 少突胶质细胞特异性敲除Tsc1引起髓鞘缺失并在分化时期引起应激反应介导的细胞死亡 |
| 4.4.2 激活Fas/JNK介导的细胞凋亡信号通路导致Tsc1敲除小鼠的少突胶质细胞凋亡 |
| 五. 结论与展望 |
| 5.1 总结 |
| 5.2 研究价值 |
| 5.3 待解决的问题与未来研究方向 |
| 5.3.1 mTOR活性水平与少突胶质细胞发育 |
| 5.3.2 Fas调控少突胶质细胞凋亡信号通路的激活 |
| 5.3.3 结节性硬化症病人(TSC)中枢神经系统相关小鼠模型的建立 |
| 参考文献 |
| 后记 |
| 个人简历及科研成果 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 文献综述 |
| 文献综述一 脊髓损伤的现代研究进展 |
| 文献综述二 脊髓损伤后神经再生相关信号通路 |
| 文献综述三 针灸治疗脊髓损伤的研究进展 |
| 参考文献 |
| 第二部分 实验研究 |
| 实验一 督脉电针对脊髓损伤后大鼠行为学及病理学的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 实验二 督脉电针对脊髓损伤后大鼠损伤局部内源性神经干细胞分化的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 实验三 督脉电针对脊髓损伤后大鼠损伤局部Wnt信号通路的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 实验四 督脉电针对脊髓损伤后大鼠损伤局部Notch信号通路的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 附表 |
| 附表1 BBB评分表 |
| 附图 |
| 附图1 各批次各组大鼠受损脊髓局部HE染色 |
| 附图2 各批次各组大鼠受损脊髓局部Nestin表达 |
| 附图3 各批次各组大鼠受损脊髓局部NSE表达 |
| 附图4 各批次各组大鼠受损脊髓局部APC表达 |
| 附图5 各批次各组大鼠受损脊髓局部GFAP表达 |
| 附图6 各批次各组大鼠受损脊髓局部Wnt1表达 |
| 附图7 各批次各组大鼠受损脊髓局部Wnt3a表达 |
| 附图8 各批次各组大鼠受损脊髓局部β-catenin表达 |
| 附图9 各批次各组大鼠受损脊髓局部delta1表达 |
| 附图10 各批次各组大鼠受损脊髓局部Presenilin1色 |
| 附图11 各批次各组大鼠受损脊髓局部Hes1达 |
| 附图12 各批次各组大鼠受损脊椎局部Hes5表达 |
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 正文 |
| 第一部分 嗅鞘细胞对培养神经元生长状态的影响 |
| 一、材料与仪器 |
| 二、方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 附图 |
| 第二部分 嗅鞘细胞对过氧化氢诱导神经元凋亡的影响 |
| 一、材料与仪器 |
| 二、方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 附图 |
| 第三部分 嗅鞘细胞对过氧化氢诱导神经元凋亡相关基因表达的影响 |
| 一、材料与仪器 |
| 二、方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 附图 |
| 第四部分 嗅鞘细胞移植修复大鼠脊髓损伤的试验研究 |
| 一、材料与仪器 |
| 二、方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 附图 |
| 第五部分 成人嗅粘膜嗅鞘细胞的分离、培养与纯化 |
| 一、材料与仪器 |
| 二、方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 附图 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 相关研究进展 |
| 1.1 细胞凋亡（CELL APOPTOSIS） |
| 1.1.1 细胞凋亡概述 |
| 1.1.2 细胞凋亡的病理学意义 |
| 1.1.3 细胞凋亡信号转导途径 |
| 1.1.4 细胞凋亡的网络调控 |
| 1.2 AVSD 疾病与 CRELD1 基因 |
| 1.2.1 AVSD 的分子遗传学概述 |
| 1.2.2 AVSD 的致病风险基因 |
| 1.2.3 AVSD 的发病候选基因 |
| 1.2.4 AVSD 的其他相关基因 |
| 1.3 RETICULON（RTN）家族 |
| 1.3.1 RTN 基因家族的发现及其主要成员 |
| 1.3.2 RTN 的细胞定位和拓扑构象 |
| 1.3.3 RTN 家族成员的相互作用蛋白 |
| 1.3.4 RTN 的功能 |
| 1.4 本研究的背景 |
| 1.4.1 本研究室有关RTN3/HAP 的重要研究成果 |
| 1.4.2 本研究的目的和意义 |
| 第二章 基本实验技术与方法 |
| 2.1 质粒 DNA 的制备和纯化 |
| 2.1.1 质粒 DNA 的小量制备 |
| 2.1.2 质粒DNA 的大量制备 |
| 2.1.3 质粒DNA 的纯化 |
| 2.2. 限制性酶消化 |
| 2.3. DNA 片段回收 |
| 2.3.1 低熔点琼脂糖凝胶法 |
| 2.3.2 玻璃奶（Glass-milk）法 |
| 2.4. DNA 片段和载体的连接 |
| 2.5. 感受态细胞的制备 |
| 2.5.1 冷氯化钙法制备新鲜感受态细胞 |
| 2.5.2 电转化感受态细胞的制备 |
| 2.6. 质粒DNA 的转化 |
| 2.6.1 常规转化法 |
| 2.6.2 质粒的快速转化法 |
| 2.6.3 质粒的电转化法 |
| 2.7 菌种的保存 |
| 2.8 菌落PCR |
| 2.9 PCR 定点诱变（根据 STRATAGENE 的 QUICKCHANGE SITE-DIRECTED MUTAGENESIS KIT 说明，略有改动） |
| 2.10 细胞培养基的配制（以RPMI 1640 为例） |
| 2.11. 细胞传代培养 |
| 2.12 细胞的冻存与复苏 |
| 2.12.1 冻存 |
| 2.12.2 复苏 |
| 2.13 细胞转染 |
| 2.13.1 脂质体转染 |
| 2.13.2 电转染法 |
| 2.14 用原核表达系统表达蛋白 |
| 2.15 NI~（++） 亲和层析法纯化蛋白质 |
| 2.16 抗体的制备 |
| 2.17 GST 树脂 PULL-DOWN 分析 |
| 2.18 免疫共沉淀 |
| 2.19 WESTERN BLOT |
| 第三章 RTN3 与FADD 的相互作用及其细胞凋亡信号转导途径 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 质粒、细胞与试剂 |
| 3.2.2 细胞培养和转染（见第二章） |
| 3.2.3 免疫共沉淀 |
| 3.2.4 流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 3.2.5 激光共聚焦 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 过表达的 RTN3 与过表达的 FADD 在体内的相互作用 |
| 3.3.2 过表达的 RTN3 与内源性 FADD 在细胞内的相互作用 |
| 3.3.3 FADD 与RTN3 相互作用功能区的鉴定 |
| 3.3.4 RTN3 的C-端45 个氨基酸是与 FADD 结合的功能区 |
| 3.3.5 过表达的 RTN3 能招募内源性的 FADD 到内质网上形成复合物 |
| 3.3.6 过表达的RTN3 发动了FADD 依赖型的caspase-8 下游级联事件 |
| 3.3.7 过表达 RTN3 诱发的caspase-9 下游级联事件是部分 FADD 依赖性的 |
| 3.3.8 过表达 NogoB 也能以 RTN3 类似方式与 FADD 作用 |
| 3.3.9 衣霉素刺激下内源性 RTN3 与 FADD 的相互作用及定位 |
| 3.3.10 FADD 与RTN3 的作用能影响TM 诱发的细胞凋亡和caspase8 活化 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 RTN3 与BCL-2 的相互作用以及对细胞凋亡的调控 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 细胞、质粒与试剂 |
| 4.2.2 细胞培养和转染（见第二章） |
| 4.2.3 稳定表达细胞系的构建 |
| 4.2.4 亚细胞组分的制备 |
| 4.2.5 免疫共沉淀 |
| 4.2.6 Pull－Down 实验 |
| 4.2.7 流式细胞术技术 |
| 4.2.8 激光共聚焦 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 RTN3 与Bcl-2 在体外的相互结合 |
| 4.3.2 过表达的 RTN3 与内源性的 Bcl-2 能在细胞内质网上相互结合.. |
| 4.3.3 外源性 Bcl-2 和 RTN3 表达的消长对细胞凋亡的调控 |
| 4.3.4 外源刺激对 RTN3 表达的上调促进了 Bcl-2 的富聚与凋亡抑制功能 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 RTN3 与一种心脏病致病风险基因产物的结合及其对细胞生理的影响 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 质粒与试剂 |
| 5.2.2 Pull－down 实验 |
| 5.2.3 流式细胞技术 |
| 5.2.4 MTT 法检测细胞生长 |
| 5.2.5 细胞培养和转染（见第二章） |
| 5.2.6 稳定表达细胞系的构建 |
| 5.2.7 免疫共沉淀和免疫印迹 |
| 5.2.8 激光共聚焦 |
| 5.2.9 亚细胞组分的制备 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 RTN3 与 CRELD1 的体外相互作用 |
| 5.3.2 过表达的CRELD1 与过表达或内源的RTN3 的体内相互作用 |
| 5.3.3 过表达的 CRELD1 招募内源的 RTN3 到细胞质膜上 |
| 5.3.4 过表达的 CRELD1 与 RTN3 对细胞生长/死亡的影响 |
| 5.3.5 过表达 CRELD1 对过表达 RTN3 诱发的细胞凋亡的影响 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 超表达 RTN3 对细胞凋亡三条经典信号途径的网络调控 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 RTN3 对外界刺激应激的超表达，诱导内质网依赖的细胞凋亡 |
| 6.3 RTN3 诱导的内质网凋亡途径与线粒体途径的CROSS TALKING |
| 6.4 RTN3 诱导的内质网凋亡途径与死亡受体途径的CROSS TALKING |
| 6.5 RTN3 与BCL2 结合抑制了其凋亡诱发活性 |
| 研究总结和创新点 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表和待发表的论文 |
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 综述 |
| 攻读硕士期间发表的文章目录 |
| 英文略缩词表 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 Fas 蛋白介导细胞死亡的机制 |
| 第二章RNAi技术研究进展 |
| 第二篇 实验研究 |
| 第一章 体外模拟法神经细胞缺血再灌注损伤模型制作 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二章 体外模拟缺血再灌注损伤后神经细胞 Fas 基因表达及细胞凋亡 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第三章 Fas siRNA 质粒的构建和鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 2. 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第四章 Fas siRNA在神经细胞缺血再灌注损伤的抗凋亡作用 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间发表论文 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 致谢 |
