杜娟,张栋,张睿,陈雨,伊洁,吴洁,窦亚玲,杨卓,叶阿里,孔令君,甘勇,杨启文[1]（2021）在《2013—2018年北京协和医院4种常见性传播疾病病原体检出情况》文中指出目的探究北京协和医院诊治的疑似性传播疾病（sexually transmitted diseases, STD）患者沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis, CT）、解脲支原体（Ureaplasma urealyticum,UU）、生殖支原体（Mycoplasma genitalun,MG）及淋病奈瑟球菌（Neisseria gonorrhoeae,NG）感染情况,旨在为临床诊治提供依据。方法回顾性收集2013年1月—2018年12月北京协和医院疑似STD患者的送检标本（包括尿液标本及生殖道拭子标本）。采用实时荧光核酸恒温扩增检测技术检测样本中CT、UU、MG、NG,并计算其阳性率。结果 2013—2018年,共接收CT、UU、MG、NG检测标本12 804份。4种病原体阳性率由高至低依次为UU（42.88%,4833/11 271）、CT（8.43%,905/10 739）、MG（5.44%,231/4246）、NG（3.78%,338/8932）;合并感染以UU+CT（4.13%,402/9725）、UU+MG（1.98%,74/3745）较常见。女性患者UU阳性率均高于同年龄段男性患者,CT、NG、MG阳性率低于同年龄段男性患者。除女性患者NG、UU单一感染外,4种病原体单一感染率及合并感染率（UU+CT、UU+MG）均以≤20岁患者最高。NG、MG阳性率整体呈下降趋势,CT、UU阳性率呈小范围波动。男性患者中,尿道拭子标本NG阳性率明显高于尿液标本（12.37%比5.27%,P<0.001）;女性患者中,宫颈拭子标本UU阳性率明显高于尿液标本（61.78%比54.74%,P<0.001）,CT阳性率低于尿液标本（6.16%比7.73%,P=0.022）。结论 2013—2018年北京协和医院诊治疑似STD患者中,4种常见病原体阳性率由高至低依次为UU、CT、MG、NG;UU+CT、UU+MG是常见的合并感染类型;≤20岁患者病原体阳性率较高;不同类型标本中病原体检出率存在差异。
刘经纬[2]（2021）在《应对淋病一线药物耐药的策略初探 ——头孢曲松耐药克隆的快速检测及庆大霉素的药物敏感性研究》文中进行了进一步梳理第一部分 头孢曲松耐药淋球菌的分子生物学研究第一节 头孢曲松耐药淋球菌临床分离株的基因分型[目的]头孢曲松是淋病治疗时最后的一线经验性药物。本研究对中国常规淋球菌耐药监测中发现的头孢曲松高水平耐药的BJ16148克隆,进行基因分型研究。[方法]采用纸条梯度扩散法检测该头孢曲松耐药株,对阿奇霉素、大观霉素、四环素、环丙沙星和头孢克肟的最低抑菌浓度（Minimum Inhibitory Concentratio n,MIC）,同时使用淋球菌多抗原测序分型、多位点测序分型和淋球菌耐药位点测序分型进行基因型别的鉴定。[结果]此头孢曲松MIC为0.5mg/L的BJ16148菌株,阿奇霉素的MIC为0.25mg/L,大观霉素的MIC为16mg/L,四环素的MIC为4mg/L,环丙沙星的MIC为>32mg/L,头孢克肟的MIC为lmg/L。经过分子分型鉴定,多抗原测序分型为3435型,多位点测序分型为1903型,淋球菌耐药位点测序分型为233型,其中头孢曲松耐药相关的penA基因为60型。[结论]本研究发现的头孢曲松高水平耐药的淋球菌菌株与2015年日本发现的头孢曲松耐药的FC428克隆同源。第二节 头孢曲松耐药淋球菌克隆的检测技术建立[目的]目前在全球多个地区已发现了同一型别的头孢曲松耐药株,本研究建立一种能快速识别此耐药淋球菌克隆的分子检测方法。[方法]采用实时荧光PCR的原理,针对淋球菌porA和penA两段基因上的特定序列进行检测技术的建立开发,并验证和评估双检方法的可行性和检测限。[结果]本研究建立的双检方法可检测出相应的基因片段,对淋球菌和头孢曲松耐药克隆的检测限约为160拷贝/反应。[结论]本研究建立了一种能同时检测淋球菌和全球传播的头孢曲松耐药克隆快速的双检方法。此方法有较好的检测效能,可开展下一步的评测实验。第三节 头孢曲松耐药克隆的分子检测方法的比较[目的]比较四种针对头孢曲松耐药克隆的分子检测方法的准确性和临床适用场景。[方法]根据文献的描述,分别建立检测耐药流行株的普通探针法,锁核酸（Locked Nucleic Acid,LNA）探针法和高分辨率熔解曲线（High Resolution Melting,HRM）法。选取国内已发现的18例阳性样本和分属不同penA基因型别的51例阴性样本,评估四种检测方法的准确性。[结果]四种方法的敏感性都为100%。探针方法检测阴性样本时,LNA探针法产生较多假阳性结果,普通探针法次之,双检方法中未出现假阳性。HRM法中,所有阳性样本的熔解温度介于78.25℃至78.95℃,小于阴性样本最低的熔解温度79.35℃,可将熔解温度设定为79℃以区分头孢曲松耐药克隆。[结论]四种方法都能较准确的检测出全球传播的头孢曲松耐药的淋球菌克隆。在大批量筛查检测时推荐采用HRM法,在临床快速检测时推荐采用双检方法。第二部分 淋球菌对庆大霉素的药物敏感性监测第一节 大连地区淋球菌对庆大霉素敏感性的初步研究[目的]在淋球菌耐药形势严峻的背景下,为了提供一种新的治疗选择,本研究初步检测了大连地区收集的淋球菌临床分离株的敏感性特征。[方法]选取2016-2018年,大连市皮肤病医院收集的120株淋球菌临床分离株,采用琼脂稀释法测定对庆大霉素的最低抑菌浓度。用Kruskal-Wallis H检验统计3年间的MIC是否存在差异。[结果]120株淋球菌中未发现对庆大霉素耐药的分离株,其中103株（85.8%）对庆大霉素敏感（MIC≤4mg/L）,17株（14.2%）对庆大霉素中敏（MIC为8mg/L）。3年间的淋球菌菌株对庆大霉素的MIC变化无统计学意义。[结论]大连地区收集的淋球菌临床分离株,对庆大霉素的敏感性较高,且不随年份变化。可扩大样本量检测,以了解庆大霉素在我国的临床应用潜力。第二节 中国淋球菌对庆大霉素敏感性的横断面研究[目的]本研究评估我国的淋球菌临床分离株,对庆大霉素的敏感性,以及庆大霉素和与头孢曲松、阿奇霉素和大观霉素等抗生素的药敏状态之间的关系。[方法]本研究采用琼脂稀释法,检测了中国7个省或直辖市的470株淋球菌临床分离株,对四种抗生素的最低抑菌浓度,并分析不同药物敏感性之间的关联。[结果]庆大霉素的MIC介于1mg/L至8mg/L,未发现耐药株。19（4.0%）株对头孢曲松耐药,73（15.5%）株对阿奇霉素耐药。7株淋球菌同时对头孢曲松和阿奇霉素耐药,其中6株对庆大霉素敏感性高。庆大霉素的MIC和各抗生素的耐药状态之间不存在关联。[结论]体外药物敏感性研究发现我国淋球菌对庆大霉素的敏感性较高,可开展下一步的临床试验以评估治疗效果。此外,我国淋球菌对一线治疗用药头孢曲松和（或）阿奇霉素的敏感性逐渐降低,亟需监测敏感性变化情况。
高芃[3]（2020）在《肿瘤基因突变高通量测序检测参考物质制备平台的建立及其应用研究》文中进行了进一步梳理恶性肿瘤是导致我国居民死亡的主要原因之一,严重威胁着我国人民的健康。随着精准医学的不断发展,通过基于肿瘤患者的基因突变谱来制定个性化的治疗方案,已成为临床肿瘤诊疗至关重要的一部分。由于对肿瘤突变位点研究的不断深入以及个体化医学的快速发展,临床分子检测技术也在不断更新。高通量测序（High-throughput sequencing,HTS）即下一代测序（Next generation sequencing,NGS）的出现,使得肿瘤多个基因突变同时大批量检测成为可能。但相较于传统的分子检测方法,NGS检测更为复杂,无论是操作步骤繁多的“湿实验”还是生物信息学分析流程的“干实验”,任何一个环节出现问题,都可能导致不可靠的检测结果。为了确保基因突变检测结果的准确性,临床实验室必须选取合适的参考物质用以建立完整的质量管理体系,其中包括对实验室自建检测（Laboratory developed tests,LDTs）的性能确认（Validation）、商品化试剂盒的性能验证（Verification）、进行室内质量控制（Internal quality control,IQC）以及定期参加室间质量评价（External quality assessment,EQA）或能力验证（Proficiency testing,PT）。目前对于肿瘤基因突变NGS检测参考物质的制备,还没有统一的标准。然而,来源于患者样本的参考物质难以大批量获取且肿瘤组织间或肿瘤组织内具有异质性,无法对基于NGS的肿瘤基因突变检测进行全面的性能评估,也无法满足实验室检测质量保证的需求。为解决这个难题,本研究建立了肿瘤基因突变NGS检测参考物质制备平台。通过使用该平台,制备了一种易于生产且来源于同一基因组背景并具有不同等位基因突变频率（Variant allele frequency,VAF）的肿瘤基因突变NGS检测参考物质（见第一部分）。经该平台制备的参考物质具有以下优势:第一,参考物质可同时适用于只测肿瘤组织（“tumor-only”）的小肿瘤基因突变检测盘（panel）及肿瘤正常配对（“tumor-normal”）的大肿瘤基因突变检测盘（panel）。具体来讲,我们将细胞系提取的人基因组DNA（Genome DNA,gDNA）为模板DNA,使用重叠延伸PCR（Overlap extension PCR,OE-PCR）技术定点诱变产生了多种具有相同基因组背景但含有不同突变位点的DNA片段,将其与gDNA按照一定比例均匀混合制备为肿瘤基因突变样本,该样本可独立作为参考物质适用于“tumor-only”的检测模式。而未经诱变的gDNA作为正常配对样本,与肿瘤基因突变样本一起作为参考物质用于“tumor-normal”的检测模式。第二,本研究中选取的背景细胞系是已知基因组序列信息的GM12878细胞系,因此本研究中的正常配对样本,即GM12878细胞系提取的gDNA也可单独用于临床实验室的常规基因突变检测来验证结果的准确性。第三,经本平台制备的参考物质中可覆盖多种突变类型,且各突变的VAF%可自行设置。在本研究中,通过该制备平台我们共构建了 15种含有肿瘤突变位点的DNA片段,突变类型覆盖了单核苷酸变异（Singlenucleotidevariant,SNV）、短片段插入或缺失突变（Insertion and deletion,InDel）以及拷贝数变异（Copy number variation,CNV）。这些DNA片段经菌液PCR电泳验证、Sanger测序验证,均证明含有准确的突变位点,经限制性内切酶酶切回收最终获取了含突变位点的DNA片段。随后我们通过计算gDNA及每个含突变位点DNA片段的拷贝数浓度,根据每个突变预先设定的VAF%,计算出每个含突变DNA片段的加入体积。第四,参考物质的均一性及稳定性均良好。第五,该参考物质不仅适用于基于NGS的基因突变检测过程的评估,还可作为IQC样本应用于其他常规的基因突变检测方法,如扩增突变阻滞系统(Amplification refractory mutation system,ARMS-PCR,数字 PCR（Digital PCR,dPCR）及实时荧光定量 PCR（Real-time quantitative PCR,qPCR）等的评估。室间质量评价是监测各临床实验室检测能力的一种方式,也是临床实验室质量管理的重要方面。通过对实验室回报的室间质评结果进行全面评估,可以发现实验室进行基于NGS的肿瘤基因突变检测包括“湿实验”、“干实验”及突变解读中存在的问题,帮助临床实验室进行改进及全面优化,从而为临床医生提供准确可靠的基因突变检测报告。为了评估不同临床实验室的肿瘤基因突变NGS检测及突变解读水平,2017年国家卫生健康委临床检验中心开展了肿瘤基因突变NGS检测室间质量评价活动（见第二部分）。该室间质量评价在2017年上半年及下半年各开展一轮,分别针对非小细胞肺癌和乳腺癌这两种在肿瘤靶向治疗应用中最为常见的肿瘤类型。通过第一部分中建立的肿瘤基因突变NGS检测参考物质制备平台,分别制备了针对非小细胞肺癌基因突变NGS检测参考物质样本盘和乳腺癌基因突变NGS检测参考物质样本盘。每个样本盘中均包含1个正常配对样本和6个肿瘤基因突变样本。非小细胞肺癌基因突变NGS检测参考物质样本盘中覆盖了 SNV、InDel和融合基因等突变类型,而乳腺癌基因突变NGS检测参考物质样本盘则覆盖了 SNV、InDel以及CNV等突变类型。每个样本的浓度均大于30ng/μL,且核酸总量至少为750ng,可以满足各类NGS平台、各种靶向捕获方法及各种文库制备方法的要求。样本盘中大部分突变的VAF%设置在10%至45%之间,满足大部分实验室的检测能力水平,同时在个别样本中加入了少量VAF%小于5%的低频突变用以评价实验室在检测识别低频突变的能力。此外,样本盘中覆盖了不同等级临床意义的突变,包括具有明确临床意义的突变,潜在临床意义的突变及临床意义未知的突变。我们随后将样本盘发放给参加该室间质量评价的实验室,各实验室在规定时间内回报突变检测结果及完整报告。我们通过对实验室回报的突变检测过程、突变检测结果及突变解读信息进行统计分析,从而探究各临床实验室在突变检测及突变解读方面存在的问题。全国共有102家临床实验室报名参加本次室间质量评价活动,其中有效回报结果的实验室为89家。在非小细胞肺癌基因突变NGS检测室间质量评价中,实验室总体合格率为62.9%（56/89）,其中仅有48家（53.9%,48/89）的实验室突变结果检测全部正确,还有5家临床实验室（5.6%,5/89）的室间质评成绩为0分。乳腺癌基因突变NGS检测室间质量评价的成绩有所提高,总体合格率为87.6%（78/89）,其中检测全部正确的实验室为76家（85.4%,76/89）,但仍有1家实验室（1.1%,1/89）的成绩为0分。通过分析实验室回报的突变检测结果,我们发现假阳性、假阴性的错误较常出现。如在非小细胞肺癌基因突变NGS检测室间质评中,有三家实验室均报告超过20个的假阳性结果。而假阴性结果往往出现在临床意义不明确的突变中,且以采用基于杂交捕获方法的Illumina测序平台的实验室最为常见。我们还发现,临床实验室对于检测复杂的短片段插入-缺失突变的能力相对较弱,如ERBB2（NM004448.3）:c.2326delGinsTTAT（p.Gly776delinsLeuCys）,该突变在两个室间质评样本中的正确检出率仅为67.9%（57/84）和69.0%（58/84）。其次,实验室精准识别短片段插入-缺失突变碱基位置的能力也有待提高,如导致EGFR（NM005228.3）:c.22352249de115（p.Glu746Ala750del）和 ERBB2（NM004448.3）:c.22632277de115（p.L755T759delLRENT）的错误回报结果的原因大多是实验室对于缺失部位碱基的识别发生移位、错位。此外,部分临床实验室的突变回报结果还体现出其对突变正确命名方式的忽视,实验室应严格按照人类基因组变异学会（Human genome variation society,HGVS）基因突变命名规则对突变进行标准化命名。经过本次两轮室间质评,各临床实验室通过查找自己在“湿实验”操作步骤或“干实验”生物信息学分析流程中的不足之处并加以改进,致使第二轮的室间质评成绩有了很大的提高。这也说明开展肿瘤基因突变NGS检测室间质评活动可以帮助临床实验室进行质量改进,完善其质量管理体系。我们还对各临床实验室的突变解读过程进行了分析。在非小细胞肺癌基因突变NGS检测室间质评中,我们主要对突变检测结果正确且检测范围一致的34家临床实验室反馈的突变解读信息,包括数据库信息、各突变临床意义分类结果及提交的靶向药物信息等方面进行了分析。结果表明,除EML4 exon 13-ALK exon 20和EGFR c.22352249deIGGAATTAAGAGAAGC（p.Glu746Ala750del）这两个临床意义明确且有明确靶向药物的突变外,其他突变的临床意义分类结果及靶向药物信息均出现不一致的情况。我们分析了导致这种情况的原因,主要是以下两个方面:第一,某些实验室在进行突变解读时并未参考美国国家食品药品监督管理局（Food and drug administration,FDA）或权威指南中所提及的内容,导致所涵盖的临床证据不充分,因此当该类突变进行临床意义分级及提交靶向药物信息时,其结果会出现问题。第二,各临床实验室通过使用不同组合方式的公共数据库或自建数据库的方式来获取突变临床证据。由于每种类型的数据库根据其数据库特征仅提供有限且不同的突变信息,因此使用不同类型的公共数据库的实验室可能会产生不同级别的突变临床证据,从而导致突变解读结果的不一致。在乳腺癌基因突变NGS检测室间质评中,我们主要对临床实验室反馈的靶向药物信息的准确性和充分性进行了汇总和评价。结果显示,实验室提供的靶向药物信息存在不准确的情况,主要在于某些实验室提供了一些对某些特定突变显示出低疗效的药物。其次,有些实验室还提交了一些与其检测突变不相符的靶向药物信息。此外,实验室提供靶向药物信息也存在不充分的情况。通过与Ion Torrent Oncomine Knowledgebase Reporter v.3.1.0系统提供的靶向药物信息相比,没有任何一家实验室可以完全覆盖该系统中展示的所有靶向药物信息。61.8%（21/34）的实验室仅提供了少于10种的靶向药物,分析原因主要在于实验室只提供经指南或FDA批准的药物,而忽略了临床试验中的药物信息。临床实验室应从突变的临床有效性和临床可操作性来进行突变临床意义的评价及提供靶向药物信息。因此,本研究提供了一种突变解读流程,通过整合癌症变异解读指南中不同级别的临床证据,从不同类型的数据库和文献中获取突变信息,以进行准确的突变分类并提供准确且全面的靶向药物信息。综上所述,本研究建立了一个肿瘤基因突变NGS检测参考物质制备平台,以简单、精准、经济的方式成功地制备了肿瘤基因突变NGS检测的参考物质,其具有可按照预先设定的突变位点及VAF%进行大批量制备、具有相同的已知序列基因组背景、均一性稳定性良好等优点。该参考物质不但适用于“tumor-only”的小肿瘤基因突变检测panel,也适用于“tumor-normal”大肿瘤基因突变检测panel,可同时评估基于NGS的肿瘤基因突变检测的“湿实验”操作部分以及生物信息学分析的“干实验”部分。通过开展两轮肿瘤基因突变NGS检测室间质量评价活动,各实验室在第一轮室间质评中发现问题,查找自己在检测流程中的不足之处并加以改进,致使第二轮的室间质评成绩有了很大的提高。说明通过室间质量评价可以帮助临床实验室进行质量改进,完善其质量管理体系。此外,基于NGS的肿瘤基因突变检测不仅应确保准确的突变检测结果,还应对突变进行准确且全面的解读。实验室应通过结合不同类型的数据库,采集不同等级的临床证据,从而准确地划分突变的临床意义等级以及提供准确且充分的靶向药物信息,为临床医生提供可靠且全面的基因突变检测报告,这对实现“精准医学”至关重要。本研究的创新性主要有:（1）通过使用OE-PCR技术对gDNA进行定点诱变的方法,建立了一个易于快速准确生产且来源于同一基因组背景并具有不同突变类型、不同VAF%的肿瘤基因突变NGS检测参考物质的通用制备平台,并且这样制备的参考物质不但适用于“tumor-only”的小肿瘤基因突变检测panel,也适用于“tumor-normal”大肿瘤基因突变检测panel;（2）采用该平台研制的肿瘤基因突变NGS参考物质,第一次在全国范围内正式开展肿瘤基因突变NGS检测室间质量评价活动,通过对各实验室的室间质量评价结果进行全面比较,发现了临床实验室在基于NGS的肿瘤基因突变检测及突变解读过程中存在的问题,从而有助于各临床实验室改进及全面优化突变检测及解读流程,为临床医生提供准确且全面的基因突变检测报告,有助于临床实验室肿瘤基因突变NGS检测的规范化和标准化;（3）除了上述的室间质量评价外,采用本研究的平台制备的肿瘤基因突变NGS检测参考物质还可用于LDTs的性能确认、对商品化试剂盒的性能验证和IQC等。
孙卫华[4]（2019）在《皖北汉族人群TSHR、CTLA-4及FCRL3单核苷酸多态性与Graves病的关联研究》文中研究指明研究背景Graves病（Graves’ disease,GD）是由遗传、免疫与环境因素共同作用的器官特异性自身免疫性疾病,以神经、循环、消化等系统兴奋性增高和代谢亢进为主要表现,是引起甲状腺功能亢进症最主要的病因,其发病机制至今尚未明了。GD患者体内免疫功能异常,产生了针对促甲状腺激素受体（thyrotropin receptor,TSHR）的抗体即促甲状腺激素受体抗体（thyrotropin receptor antibody,TRAb）,TRAb是一组多克隆抗体,分为兴奋型的甲状腺刺激抗体（thyroid stimulating antibody,TSAb）和封闭型的甲状腺阻断性抗体（thyroid blocking antibody,TBAb）,TSAb是GD的主要自身抗体,几乎所有GD病例中都存在TSAb,而且疾病的严重程度与TSAb水平有关。TSAb与TSH竞争性地结合TSHR,并具有TSH类似的生物学功能,启动细胞内的级联反应,刺激和兴奋甲状腺,使甲状腺组织增生,这种刺激作用不受垂体TSH调节,失控的持续刺激致使甲状腺病理性地合成与分泌过量的甲状腺激素。TSHR作为自身免疫性甲状腺疾病（autoimmune thyroid diseases,AITD）的特异基因在GD易感基因中是独特的,TSHR是第一个被检测到与GD相关的非主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex,MHC）基因,这反映了 TSHR在GD发病机制中的重要性。TSHR所编码的蛋白不仅与GD的临床表现有关,也是GD自身免疫反应的直接靶点。因此,TSHR基因一直处于研究的焦点。TSHR基因位于14号染色体q31上,由10个外显子组成,编码一个G蛋白偶联受体,该受体在调节甲状腺生长、发育和功能方面发挥着核心作用。在过去十几年中,由于测量技术的发展使得在大量个体中检测数百个标记物的遗传变异得以实现,大大促进了常见遗传变异与复杂疾病之间的联系。全基因组关联研究（genome-wide association studies,GWAS）技术应用于大规模病例对照研究,使与疾病相关的易感基因的发现和单核苷酸变异的识别成为可能。GWAS的发展进一步建立起易感基因与GD之间强有力的关联。GD的易感基因除了TSHR和甲状腺球蛋白这些特异的甲状腺基因外还有一类为免疫调节基因,如叉头翼状螺旋转录因子（forkhead winged helix transcription factor p3,Foxp3）,CD25,CD40,细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（cytotoxic T lymphocyte antigen 4,CTLA-4）,FC受体样基因 3 FC receptor-like 3（FCRL3）,人类白细胞抗原（human leukocyte antigen,HLA）等。FOXP3和CD25在建立外周耐受中起到重要作用,而CD40、CTLA-4和HLA基因在T淋巴细胞活化和抗原表达中起关键作用。FCRL3编码免疫球蛋白受体超家族成员,在T细胞、B细胞及NK细胞等免疫细胞均有表达,参与调节免疫,在自身免疫疾病的发病中发挥作用。这些免疫调节基因的多态性,对GD的易感性有重要影响。免疫调节基因中的单核苷酸多态性可能在功能上阻碍中枢和外周耐受的正常发育,并改变免疫突触中T细胞与抗原呈递细胞（antigen presenting cells,APCs）的相互作用。因此,研究基因多态性对阐明GD的发生与发展以及临床表型的差异,易感与耐受,药物治疗的敏感性和预后及指导个体化治疗等方面具有重要意义。本研究首次在皖北汉族人群中对近年来GWAS发现的TSHR、CTLA-4、FCRL3三种GD易感基因位点在较大规模人群中进行联合检测,并对TSHR基因内含子1上和CTLA-4上易感位点及FCRL3易感位点与GD进行关联分析。这些易感位点可能在疾病发病中发挥重要的作用,探讨TSHR、CTLA-4及FCRL3单核苷酸多态性与Graves病的相关性为揭示GD的发病机制及未来进一步开展易感基因功能学研究提供理论基础。研究目的1.探讨TSHR内含子 1 区段的rs179247,rs2284722,rs12101261,rs4903964,rs2300525和rs1 7111394六个SNP位点与GD易感性的相关性2.探讨CTLA-4基因rs231804,rs1024161,rs231726和rs10197319四个SNP位点与GD易感性的相关性3.探讨FCRL3基因rs3761959 SNP与GD易感性的相关性4.分析各易感基因位点的假阳性报告率和三种基因间的交互作用研究方法以皖北地区汉族人群为研究对象,采用病例对照研究,GD病例组597例和正常对照组620例,蚌埠医学院第一附属医院内分泌科门诊收集相关临床资料,所有研究对象签署知情同意书,采集外周静脉全血,提取DNA,在Fluidigm EP1平台上应用Taqman探针分别对TSHR内含子1区段的六个SNP位点、CTLA-4基因四个SNP位点以及FCRL3基因rs3761959位点进行基因分型,分析各基因型与等位基因在两组中的分布,各位点单核苷酸多态性与GD易感性的关联分析,以及连锁不平衡和基因单体型与GD的关联分析,并对相关易感位点计算假阳性报告率以及分析各位点基因型与病例组临床表现的关系。统计学分析:定量资料描述采用x±s,定性资料描述采用百分率或构成比;t检验和卡方检验分别比较定量资料与定性资料的组间差异;二分类单因素和多因素logistic回归模型分析各SNP位点病例组和对照组中基因型与等位基因分布及各SNPs与GD的关系,计算OR值及95%置信区间评估各位点基因型与GD发病间的关系;等级资料采用秩和检验,卡方检验分析各位点基因型与GD临床表现的关系,以上统计学分析均运用SPSS 19.0软件完成;应用Haploview4.2软件对基因的SNP位点在对照人群中的分布是否符合Hardy-Weinberg平衡进行检验,并对各位点组成的单体型与GD的关系进行分析;基因-基因之间的交互作用采用广义多因子降维模型（Generalized Multifactor Dimensionality Reduction,GMDR）进行分析。所有检验均为检验水准α=0.05的双侧检验,P<0.05则差异有统计学意义。结果:1.在对照组人群中,TSHR内含子1区段的六个位点的基因型分布均符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律（P>0.05）。对于rs179247,rs2284722,rs12101261,rs4903964和rs17111394位点,相应的等位基因或基因型在两组间的分布,差异有统计学意义（P<0.05）。六个SNP位点与GD的关联分析,结果显示:rs179247等位基因G、rs12101261等位基因C、rs4903964等位基因G在全人群、男性人群及女性人群中与GD的发病呈负相关关系;rs179247G等位基因携带者患GD的风险分别是A等位基因携带者的0.57,0.56,0.57倍;rs12101261C等位基因携带者患GD的风险分别是T等位基因携带者的0.58,0.58,0.58倍;rs4903964G等位基因携带者患GD的风险分别是A等位基因携带者的0.58,0.60,0.58倍。rs2284722等位基因A与rs17111394等位基因C在全人群及女性人群中与GD的发病呈正相关关系,rs 2284722A等位基因携带者患GD的风险分别是G等位基因携带者的1.34,1.47倍;rs17111394C等位基因携带者患GD的风险分别是T等位基因携带者的1.29,1.37倍。rs2300525等位基因C仅在女性人群中与GD的发病呈正相关关系,C等位基因携带者患GD的风险是T等位基因携带者的1.25倍。rs179247,rs2284722,rs12101261 和rs4903964构成的单体型中单体型AGTA、AATA 与GD的发病风险呈正相关关系（OR=1.27,95%CI=1.07-1.50,P=0.005;OR=1.45,95%CI=1.21-1.75,P<0.001）;单体型GGCG、GACG与GD的发病风险呈负相关关系（OR=0.56,95%CI=0.46-0.67,P<0.001;OR=0.40,95%CI=0.18-0.92,P=0.031）。rs2300525和rs17111394构成的单体型CC与GD的发病风险呈正相关关系（OR=1.32,95%CI=1.08-1.60,P=0.006）。TSHR各基因位点基因型与GD甲状腺肿、突眼及TRAb间相关性无统计学意义（P均>0.05）。2.在对照组人群中,CTLA-4基因四个SNP位点的基因型分布均符合Hardy-Weinberg 遗传平衡定律（P>0.05）。rs231804,rs1024161 和 rs10197319 位点的等位基因或基因型在两组间的分布没有差异（P>0.05）;rs231726位点的基因型在两组间的分布没有差异（P>0.05）。rs231726位点等位基因在病例组和对照组的分布差异有统计学意义（X2=4.47,P=0.035）。rs231726等位基因G在全人群中与GD的发病风险呈负相关关系,G等位基因携带者患GD的风险是A等位基因携带者的0.83倍。未发现rs231804、rs1024161位点与GD发病风险之间相关。rs231804,rs1024161和rs231726构成的四种单体型中AAA与GD的发病风险呈正相关关系（OR=1.21,95%CI=1.02-1.43,P=0.029）,其他单体型均未发现与GD的发病风险相关。CTLA-4各基因位点基因型与GD甲状腺肿、突眼及TRAb间相关性无统计学意义（P均>0.05）。3.FCRL3 rs3761959位点各基因型在对照组及病例组的分布差异无统计学意义（χ2=0.278,P=0.598）;两组等位基因差异无统计学意义（χ2=0.187,P=0.666）;FCRL3 rs3761959位点SNPs与GD的关联分析结果显示在全人群、男性人群及女性人群中,显性模型、隐性模型、杂合模型及纯合模型均未发现rs3761959位点SNPs与GD发病风险之间存在相关关系（P均>0.05）;4.易感基因rs179247、rs12101261、rs4903964假阳性报告率均小于预设临界值0.2。GDMR软件分析TSHR基因与CTLA-4基因及FCRL3基因间的交互作用,交叉验证一致性最佳者仅为单因素模型中rs179247模型,其训练平衡精度为0.59,测试集平衡精度为0.59,交叉验证一致率为10/10,但P>0.05。结论:1.TSHR内含子 1 区段的rs 179247,rs2284722,rs 12101261,rs4903964,和rs 17111394 SNP位点与GD易感性相关,rs179247G、rs12101261C、rs4903964G等位基因及单体型GGCG、GACG为GD的保护因素;rs2284722A、与rs17111394C等位基因及单体型AGTA、AATA是GD的发病易感因素。2.CTLA4基因rs231726 SNPs与GD易感性相关,等位基因A是GD发病的危险因素,rs231804,rs1024161和rs231726构成的四种单体型中AAA是GD易感的危险因素。3.FCRL3 rs3761959位点单核苷酸多态性与GD易感性无关。4.rs179247、rs12101261、rs4903964 位点 SNPs 可能与 GD 真实关联;TSHR 基因与CTLA-4基因、FCRL3基因间无交互作用。
何学虎,梁小燕,董洁,赵倩颖,赵玥,郭雅琪,师志云,张玉英,赵志军[5]（2019）在《2013至2017年4542例泌尿生殖系感染者NG、CT和UU感染特点分析》文中指出探讨淋球菌（NG）、沙眼衣原体（CT）和解脲脲原体（UU）三种性传播疾病（STD）病原体在宁夏泌尿生殖系感染者中的感染状况,为临床防治提供参考。选取2013年1月至2017年12月在宁夏医科大学总医院就诊的患者4 542例,其中男性3 561例,女性981例,应用实时荧光PCR法检测上述病原体,并分析结果。3种病原体总感染率为26.51%（1 204/4 542）,NG、CT、UU单一病原体感染率分别为26.31%、15.21%和35.70%,男、女感染率分别为23.48%和37.51%,感染率有性别差异（P<0.01）,NG、CT感染率男性显着高于女性,UU感染率女性显着高于男性;混合感染率为3.32%（151/4 542）,男、女混合感染率分别为3.82%和1.53%,主要以CT+UU为主,NG+UU次之;从年龄分布来说,男性≤20岁年龄段感染率最高,女性21～30岁年龄段感染率最高;5年来NG、CT和UU感染率呈上升趋势。泌尿生殖系感染者中NG、CT、UU感染情况严重,男性易感NG和CT,女性易感UU,同时,混合感染也较常见,提示应同时检测多种病原体以防漏检。
张春红[6]（2019）在《人体微量营养素缺乏风险关联SNP高通量微流体芯片方法研究与初步应用》文中研究表明背景:继限制性酶切片断长度多态性和短串联重复序列之后,单核苷酸多态性位点（single-nucleotide polymorphism,SNP）以遗传标记密度高、稳定性高、分型检测易于实现自动化的特点成为第3代多态性标记,在遗传诊断,遗传风险评估、连锁不平衡图谱和遗传关联分析等人类基因组学研究领域显示了强大的应用前景。人体存在营养素需要量个体化遗传特征,通过研究导致功能和表型改变的编码区和调控区的个体化SNP信息,可以基于SNP分析对个体化营养素缺乏风险进行评估和干预,通过基于正常人群和缺乏人群的流行病学观察及人群SNP基因分型检测,可以建立人群SNP基因型频率分布特征,获得与营养素缺乏风险高度关联的SNP位点公共数据库,从而实现基于个体差异或人群差异特征的精准营养干预。为此,探索快速、准确、高通量的SNP基因分型技术以及基于SNP检测对人体营养缺乏风险进行评估的研究必要而迫切。目的:一、研究建立人体微量营养素缺乏风险关联SNP高通量微流体芯片方法通过文献荟萃分析筛选提取营养相关联的SNPs,优化血液和唾液样本DNA自动化提取程序,建立适宜的引物设计方法,采用微流体芯片技术,建立微流体芯片营养SNP的检验方法,实现对营养不良风险的评估。二、微流体芯片方法的初步应用采用人群对微流体芯片方法进行测试,初步分析基因型数据的地域分布特征,并与生化数据进行关联分析,研究营养SNPs的检验方法在微量营养素缺乏风险评估中应用的可行性。方法:采用自动化提取工作站建立血液和唾液样本的DNA提取流程,采用竞争性等位基因PCR原理设计引物,纳入了 52个与维生素A,D,E,B6,B2,叶酸,钙,铁,锌和硒微量营养素缺乏易感性关联较大的SNP位点,SNP检索和纳入原则是在中国生物医学文献数据库、中国期刊全文数据库、万方数据库、重庆维普中文科技期刊全文数据库,PubMed数据库和Web of Science中检索从建库至2017年6月25日发表的相关文献,检索主题词分别为“single nucleotide polymorphism or SNP”and“vitamin A,D,E,B6,B12,FA,Ca,Iron,Zn,Se”和“单核苷酸多态性”和“维生素A,D,E,B6,B12,叶酸,钙,铁,锌和硒”。同时手工检索文献,并辅以文献追踪法收集更多相关文献。建立创新性SNP微流体芯片检测方法,并对如下指标进行评估:（1）防交叉污染能力的测试:奇数反应孔中预点引物混合液,偶数反应孔中不点制无引物混合液。另外,采用凝胶电泳试验对芯片对应反应孔中的溶液进行检测。试验重复操作六次。（2）引物特异性分型能力和准确性评估:先将52个SNP位点对应的引物混合液分别预点于不同的反应孔中,待引物混合液干燥后再将156个不同的DNA样本预点于不同的反应孔中,室温静止30 min使得芯片干燥,DNA样本的浓度为10 ng/μl,随后将PCR预混液注入到进样通道中。所有的芯片分型检测结果均与对应的二代测序（NGS）分型结果进行比较。试验重复操作六次。（3）适宜DNA反应浓度检测:先将52个SNP位点对应的引物混合液分别预点于不同的反应孔中,再将52个不同的DNA样本中每个样本都按照1 ng/pl,5ng/μl,10ng/μl和15ng/μl进行四个浓度梯度稀释。试验重复操作六次。（4）重现性检测:先将52个SNP位点对应的引物混合液分别预点于不同的反应孔中,重现性试验采用一个DNA样本进行检测。试验重复操作六次。（5）临床血液样本多种营养素缺乏风险筛查评估应用:采用所建立的成熟的芯片分型检测方法,随机选取六个临床样本进行评估应用。先将52个SNP位点对应的引物混合液分别预点于不同的反应孔中,随后按照芯片检测流程进行检测,并对检测结果进行分析。（6）血液中提取的DNA与唾液中提取的DNA在芯片上分型结果的比较:分别获得三个人的血液DNA样本,来自于同样的三个人的唾液DNA样本。先将52个SNP位点对应的引物混合液分别预点于不同的反应孔中,随后按照芯片检测流程进行检测,并对检测结果进行分析。（7）运用二代测序方法对芯片分型结果进行验证,设计二代测序所需引物序列,目的扩增片段长度约300～450 bp,包含该SNP位点。目的片段的扩增,序列测定工作均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。运用建立的高通量微流体芯片基因分型检测方法,对1130份血细胞样本进行了基因分型检测,对每份样本检测与人体微量营养素维生素A,D,E,B6,B12,叶酸,钙,铁,锌和硒等微量营养素缺乏风险高度关联的143个SNP遗传标记物。该143个SNP位点的纳入原则同上所述。铁营养素相关生化指标与SNP位点易感性分析中,CRP>10 mg/l的人被排除在这项研究之外。体内铁储量采用如下公式进行计算:体内铁储量（Body iron,BI,mg/kg）=-[log（sTfR*1000/SF）-2.8229]/0.1207。由于数据缺失量小于5%,对连续变量中的缺失数据采用现有数据把原始数据中的缺失数值模拟出来。采用Q-Q图和Shapiro检验数据是否符合正态分布,若不符合正态分布,则采用扭曲线性混合模型（Warped linear mixed model,Warped-LMM）对生化指标数据进行变换。扭曲线性混合模型是在标准混合线性模型的基础上建立起来的一种分析方法,允许在进行遗传分析的同时适应表型变换,应用在生化指标变量中,以改善其与正态分布的配合度,因为SF和sTfR浓度呈正偏态分布。采用R软件包进行PCA、Kinship和SNP位点之间连锁不平衡分析,分析候选SNP位点的特征。如有种群结构的存在,采用FaST-LMM模型（Factored spectrally transformed linear mixed models）进行关联分析,首先采用连续变量探索基因多态性位点与各种营养素之间的关联性,随后再采用分类变量对所有的表型数据和基因型数据进行关联分析。SF的分组标准:参照《WST 465-2015人群铁缺乏筛查办法》将铁缺乏的标准设定为SF<25 ng/ml,当CRP≤5 mg/1时,当SF<25 μg/1时判定为铁缺乏组,当SF≥25 μg/1时判定为正常人群;当CRP>5 mg/1时,当SF<32μg/1时判定为铁缺乏组;当SF≥25μg/1时判定为正常人群。sTfR的分组标准:sTfR<4.4 mg/1时为铁缺乏组,sTfR≥4.4mg/1时判定为正常人群。参照《WS/T600—2018人群叶酸缺乏筛查方法》将叶酸（FA）的缺乏标准设定为FA<4 ng/ml时为叶酸缺乏组,FA≥4 ng/ml时判定为正常人群。同型半胱氨酸（HCY）和维生素B12的缺乏标准参照检测试剂盒上提供的数据:HCY≥10μM时为病例组,HCY<10μM时判定为正常人群。B12的分组标准:B12<425 pg/ml时为B12缺乏组,B12>425 pg/ml时判定为正常人群。采用卡方检验分析不同基因型以及等位基因在民族之间的分布差异,采用方差分析分析不同基因以及等位基因携带人群的各种生化指标的分布情况。根据P值0.05的阈值确定是否有统计学意义。结果:一、建立了 SNP高通量微流体芯片方法和人体微量营养素缺乏风险检测方法,包括3个主要流程:建立了自动化DNA提取流程,通过对带有凝胶的血细胞、EDTA抗凝全血、离心去血清后的血细胞、新鲜唾液、唾液保存液保存的唾液样本和口腔拭子采集的口腔黏膜细胞等各种样本的提取效果比较,结果显示96份新鲜唾液获取的DNA浓度为150.02±50.97 ng/μl,OD260/280为1.80±0.15,OD260/280为1.50±0.21。从新鲜唾液中获取DNA含量理想,DNA降解程度低,提取方法简单,应作为唾液标本采集的首选,是开展营养基因组学人群研究的有效方法。分析并应用了竞争性等位基因特异PCR扩增设计方法。建立了人体微量营养素缺乏风险关联SNP微流体芯片检测标准化流程,对方法的评估结果显示应用物理性阻断技术实现了相邻反应孔间的零交叉污染。本研究将5 ng/μl和15 ng/μl分别作为血液和唾液来源的样本的适宜DNA反应浓度检测下限值。芯片平台上相同样本精密度为0.67%～26.06%,相同位点的重复结果上没有太大的差异。该研究在重现性方面显现出良好的实验结果,无论在芯片内还是在芯片间,重现性均良好。六个临床样本多种营养素缺乏风险筛查彩色图谱直观显示出多种营养素缺乏风险,以及单一营养素缺乏风险程度,同时也表明个体在营养素缺乏风险程度上各有其独特性。通过分析三个个体血液和唾液两种来源的DNA样本在微流体芯片上的52个SNP位点分型结果,并且与二代测序结果进行比较,结果显示三个个体血液和唾液两种来源的DNA样本在芯片上的52个位点分型结果完全一致,与二代测序的结果也完全一致。二、对143个MDR-SNPs位点地域分布特征及关联分析进行了初步探索主成分分析（PCA分析）结果显示了存在群体遗传结构。对主成分1和主成分2与种群间关系的方差分析结果为P<1.36e-14,表明143个SNP位点存在显着的民族差异。这与样本的最初个体信息吻合,也进一步印证了本研究中采用的基因分型技术的准确性良好。采用函数snpgdsPCACorr分析了主成分中前三个成分与SNP位点之间的关系,结果表明:3号染色体上的基因多态性位点与其他染色体上的多态性位点均呈现显着的差异,主成分分析PC1中显示位于RAB6B基因上的rs2280673解释效度在25%以下,位于TF基因上的rs1799852解释效度为25-500%,位于RBP2基因上的rs2118981位点和SRPRB基因上的rs1830084位点解释效度在50-75%之间,位于TF基因上的rs1358024,rs1525892,rs 1880669,rs381]647,rs3811658,rs6794945,rs7638018,rs8177248八个多态性位点的解释效度为75%以上。采用卡方检验分析不同基因型以及等位基因在民族之间的分布差异,采用方差分析分析不同基因以及等位基因携带人群的各种生化指标的分布情况,获得了大量具有统计学意义的位点。结论:本研究建立了人体微量营养素缺乏风险关联SNP微流体芯片检测方法,主要包括构建了适合于大规模流行病学研究的唾液基因组自动化DNA提取方法,建立了竞争性等位基因特异PCR扩增引物设计方法,建立了一种高通量微流体芯片基因分型检测方法,并采用1130人的小样本对方法进行了初步测试应用。
陈康宁,高轲,李荣欣,董治龙[7]（2018）在《核酸扩增试验在淋病诊断和治疗中的研究进展》文中进行了进一步梳理淋病是一种由淋病奈瑟菌感染引起的性传播疾病,临床表现主要为泌尿生殖道感染,如不及时诊断和治疗往往会引起严重的并发症。实验室的检测在淋病的诊断和治疗中具有十分重要的作用。近年来,随着PCR技术的迅速发展,快速、敏感、特异性高的核酸扩增试验已经成为实验室检测的重要手段。本文就核酸扩增试验在淋病诊断和治疗后诊断的最新研究进展加以综述,期盼能够为淋病的诊疗提供新的方法。
夏阳[8]（2016）在《非编码RNA调控非小细胞肺癌发展过程的机制研究》文中研究指明背景:肺癌是最常见、危害性最大的恶性肿瘤之一。NSCLC（Non-Small-Cell Lung Cancer,非小细胞肺癌）占肺癌的大多数。尽管肺癌的诊疗已取得了很大的进步,但是仍有部分肺癌患者在确诊时已处于肺癌晚期,无法选择手术治疗,其预后不容乐观。因此,研究新颖的肿瘤标志物作为NSCLC治疗靶标是极其必要的。研究发现98%的基因组是不具有蛋白编码功能的,这些缺乏蛋白编码功能的RNA 被统称为 ncRNAs（non-coding RNAs,非编码 RNAs）。各类 ncRNAs 的发掘及其作用机制研究日益深入,催生了以其为靶点的治疗学研究。miRNAs（microRNAs,微小核糖核酸）是一类长约22个核苷酸的单链RNA分子,参与生长发育、细胞分化和肿瘤发展等重要过程。lncRNAs（longnon-coding RNAs,长链非编码RNAs）属于一种多样化的ncRNAs,通过调控基因的表达参与多种不同的生物学过程,包括细胞印迹,组蛋白编码调控和肿瘤细胞增殖扩散。ncRNAs在NSCLC发展过程中扮演着怎样的角色,是否可以作为有价值的肿瘤标志物,这些问题对肺癌患者的诊断和治疗及其预后判断都是至关重要的,然而这一系列重要的问题仍旧需要不断去探索研究。目的:本研究重点探索三个 ncRNAs（miR-638,miR-204 和 lncRNA Meg3）在 NSCLC发展过程中的作用及其潜在的分子机制。此外,以meta分析（荟萃分析）的形式讨论另一个ncRNA（let-7）是否能预测不同肿瘤患者的预后情况。方法:第一部分和第二部分:RT-PCR检测NSCLC癌组织和对应癌旁组织中miR-638（miR-204）和SOX2（SIX1）的表达情况,并结合临床资料进行统计学分析。选取A549和SPCA1细胞,瞬时转染mimics（模拟物）和inhibitor（抑制剂）分别过表达和低表达miR-638（miR-204）,并采用Tranwell、MTT（CCK8）和流式分析实验检测细胞侵袭转移、增殖和凋亡情况。选用生物信息学预测分析和Dual Luciferase reporter assay（双荧光素酶报告基因法）检测miR-638（miR-204）与SOX2（SIX1）的3’-UTR区域的靶向结合和调控作用。采用Western blot法检测EMT相关分子标志物的表达变化。第三部分:慢病毒载体构建稳定过表达lncRNA Meg3的A549/DDP细胞,siRNA法构建沉默lncRNA Meg3的A549细胞,并通过MTT、流式分析实验检测IC50、细胞周期和凋亡情况。采用Western blot法检测Wnt/β-catenin通路中相关基因的表达变化。选用RT-PCR检测接受过顺铂等化疗药物治疗的晚期肺癌患者血浆样本中lncRNA Meg3的表达变化。第四部分:在PubMed,EMBASE和ISI Web of Science三个数据库中搜索大量文献,进行meta分析研究。从而,提取集中风险比率（HRs）和相应的95%可信区间（CI）,并按照不同的肿瘤类型和种族划分进行亚组分析。结果:第一部分:1)miR-638低表达和SOX2高表达与NSCLC患者的肿瘤组织大小、转移和分期有关。2)miR-638低表达促进细胞侵袭转移和增殖的能力,miR-638高表达抑制细胞侵袭转移和增殖的能力。3)miR-638可与SOX2的3’-UTR区域结合并调控SOX2的表达。下调SOX2可部分废除因miR-638低表达引起的促细胞侵袭转移和增殖效应。4)miR-638可调控EMT相关分子标志物的表达。第二部分:1)在NSCLC中,miR-204表达降低,SIX1表达升高,并与肿瘤组织大小、转移和分期相关。2)miR-204可以与SIX1的3’-UTR区域结合并调控SIX1的表达来影响细胞侵袭转移和增殖能力。同时,下调SIX1可以部分逆转因miR-204低表达引起的促细胞增殖和侵袭转移的作用。3)miR-204的差异表达可调控EMT相关分子标志物的表达。第三部分:1)lncRNAMeg3在耐药细胞A549/DDP中表达量低于其在A549细胞中的表达量。2)lncRNAMeg3高表达可使A549/DDP细胞重新具有顺铂耐药性。3)lncRNAMeg3低表达降低A549细胞对顺铂耐药的敏感性。4)lncRNA Meg3通过调控Wnt/β-catenin通路相关的基因来参与肿瘤细胞周期停滞和细胞凋亡增多的过程。第四部分:1)此meta分析共搜集1757例多种不同肿瘤患者的数据资料,let-7低表达的HR为1.80（95%CI:1.18-2.76）。其中,肺癌患者let-7低表达的HR为 1.99（95%CI:1.17-3.40）。2)按种族类型进行亚组分析,发现亚洲人合并HR为1.61（95%CI:0.84-3.11）,非亚洲人合并HR为 1.94（95%CI:1.11-3.39）。结论:总而言之,我们的研究结果说明:（1）miR-638低表达可以诱导EMT,并通过靶向调控SOX2来促进NSCLC细胞侵袭转移和增殖的能力。（2）miR-204通过靶向调控SIX1来扮演一个肿瘤抑制因子的作用。（3）lncRNA Meg3在肺癌患者对顺铂药物耐药性的过程中起着非常重要的作用。（4）let-7低表达可以预测肿瘤患者预后不良,尤其是肺癌患者。
张静,王海滨,时宇[9]（2015）在《STD门诊患者沙眼衣原体、解脲支原体、淋球菌与人乳头瘤病毒感染情况分析》文中研究说明目的了解本地区STD门诊患者沙眼衣原体（CT）、解脲支原体（UU）、淋球菌（NG）与人乳头瘤病毒（HPV）感染情况,从而指导临床诊断与用药。方法采用聚合酶链式反应（PCR）结合Taqman技术,对采集自来院就诊STD门诊患者的女性宫颈口分泌物、男性尿道口分泌物及相关尿液标本中的特异性DNA核酸片段进行荧光PCR检测。结果 CT、UU、NG、HPV四种病原体总感染率分别为7.49%、42.92%、3.11%和3.06%,除HPV外其它三种病原菌感染率存在性别差异;其中以UU感染率居首位,女性明显高于男性;二重感染率为5.76%,三重感染率为0.83%,未见四重感染,其中以CT和UU二重感染最常见;不同年龄段感染情况显示,以40岁以下年龄段感染率最高。结论将HPV纳入泌尿生殖感染检测很重要;通过本研究也发现,无论单一病原体感染还是混合感染,除HPV外均存在明显的性别分布差异,而且两种感染的性别分布相一致;40岁以下年龄段为主要传染源和高危人群,应作为性传播疾病防治工作的重点;双重感染和三重感染较常见,应引起高度重视;目前未发现四重感染。
龙彦,刘畅,孙媛媛,赵晓涛,魏丽惠[10]（2014）在《泌尿生殖道感染患者淋病奈瑟菌、沙眼衣原体和解脲脲原体感染临床分析》文中提出目的了解泌尿生殖道感染患者淋病奈瑟菌（NG）、沙眼衣原体（CT）和解脲脲原体（UU）的感染现状及其特点。方法应用实时荧光聚合酶链反应（PCR）检测630例（男性274例,女性356例）泌尿生殖道感染患者泌尿生殖道分泌物的NG、CT和UU核酸,并对其中108例患者行单纯疱疹病毒（HSV）检测,82例行人乳头瘤病毒（HPV6/11/16/18）检测。结果在630例患者中,NG、CT和UU的阳性检出率分别为3.2%（20/630）、9.8%（62/630）和47.1%（297/630）,HSV的阳性检出率为2.8%（3/108）,HPV6/11/16/18的阳性检出率为8.7%（8/92）,其中男性NG、CT和UU的阳性检出率分别为5.1%（14/274）、10.9%（30/274）和21.5%（59/274）,女性分别为1.7%（6/356）、9.0%（32/356）和66.9%（238/356）,女性UU阳性检出率明显高于男性（P<0.01）,男性NG阳性检出率明显高于女性（P<0.05）;男性和女性患者中,NG阳性检出率均以<30岁组（7.4%,7/94;3.5%,4/115）较高,男性CT阳性检出率以>40岁组（17.5%,7/40）最高,女性以<30岁组（17.3%,18/104）最高,UU在不同性别各年龄组比较,差异均无统计学意义（P>0.05）;CT+UU双重感染的阳性检出率最高,为8.2%（31/379）,NG+UU+CT双重感染检出率为1.6%（6/379）,HPV 6/11+NG、HPV 6/11+CT混合感染各1例,HSV-Ⅰ/Ⅱ伴UU感染2例。结论泌尿生殖道感染患者NG、CT和UU阳性检出率不尽相同,其中以UU最高,且女性阳性检出率高于男性,两种及以上病原体混合感染较为常见,临床应注意进行多种病原体的检测。
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
| 1 材料与方法 |
| 1.1 研究样本 |
| 1.2 研究方法 |
| 1.2.1 样本采集与保存 |
| 1.2.2 样本检测 |
| 1.3 偏倚控制 |
| 1.4 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 患者一般临床资料 |
| 2.2 4种病原体单一感染情况及年龄/性别分布 |
| 2.3 4种病原体合并感染情况及年龄/性别分布 |
| 2.4 4种病原体阳性率随时间变化趋势 |
| 2.5 不同类型标本4种病原体阳性率比较 |
| 3 讨论 |
| 3.1 4种病原体单一感染 |
| 3.2 合并感染 |
| 3.3 不同类型标本间4种病原体阳性率比较 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部 头孢曲松耐药淋球菌的分子生物学研究 |
| 第一节 头孢曲松耐药淋球菌临床分离株的基因分型 |
| 引言 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二节 头孢曲松耐药淋球菌克隆的检测技术建立 |
| 引言 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三节 头孢曲松耐药克隆的分子检测方法的比较 |
| 引言 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 淋球菌对庆大霉素的药物敏感性监测 |
| 第一节 大连地区淋球菌对庆大霉素敏感性的初步研究 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二节 中国淋球菌对庆大霉素敏感性的横断面研究 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文小结 |
| 论文相关综述 全球淋球菌对抗菌药物耐药监测网络的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附件 |
| 庆大霉素治疗淋病及药物敏感性监测的进展 |
| 淋球菌对阿奇霉素耐药现状及耐药机制的研究进展 |
| 论文相关论着 |
| 在读期间已发表的文章 |
| 在读期间参与的科研项目 |
| 改良的微量稀释法用于淋球菌药敏检测的多中心评估研究 |
| 深圳市2010-2017年淋球菌药敏和分子流行病学监测 |
| 在读期间参加的会议和培训班 |
| 在读期间参加的现场实习 |
| 致谢 |
| 英文缩略词 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 肿瘤基因突变高通量测序检测参考物质制备平台的建立 |
| 前言 |
| 1. 材料和方法 |
| 1.1 实验材料和试剂配制 |
| 1.1.1 实验仪器 |
| 1.1.2 实验耗材 |
| 1.1.3 实验试剂 |
| 1.1.4 溶液配制 |
| 1.1.5 细胞系 |
| 1.1.6 宿主细菌和克隆载体 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 肿瘤基因突变NGS检测参考物质制备平台的建立 |
| 1.2.1.1 建立肿瘤基因突变NGS检测参考物质制备平台的总体技术路线 |
| 1.2.1.2 肿瘤基因突变NGS检测参考物质样本盘的设计 |
| 1.2.1.3 肿瘤基因突变NGS检测参考物质样本盘中目的基因的选择 |
| 1.2.2 细胞培养 |
| 1.2.2.1 细胞复苏 |
| 1.2.2.2 细胞换液 |
| 1.2.2.3 细胞计数及传代 |
| 1.2.2.4 细胞冻存 |
| 1.2.2.5 细胞系基因DNA的提取及浓度测定 |
| 1.2.3 制备含肿瘤体细胞突变位点的DNA片段 |
| 1.2.3.1 突变位点引物设计 |
| 1.2.3.2 第一轮PCR |
| 1.2.3.3 第二轮PCR |
| 1.2.3.4 构建重组质粒 |
| 1.2.3.5 重组质粒验证 |
| 1.2.3.6 酶切回收含突变位点的DNA片段 |
| 1.2.4 肿瘤基因突变NGS检测参考物质模拟样本盘的制备 |
| 1.2.4.1 肿瘤基因突变NGS检测参考物质模拟样本中gDNA及突变片段拷贝数计算 |
| 1.2.4.2 肿瘤基因突变NGS检测参考物质模拟样本稀释及制备 |
| 1.2.4.3 肿瘤基因突变NGS检测参考物质样本盘的制备 |
| 1.2.5 肿瘤基因突变NGS检测参考物质样本盘在不同NGS平台验证 |
| 1.2.5.1 Ion Torrent PGM平台靶向测序验证 |
| 1.2.5.2 Illumina Hiseq 2500平台靶向测序验证 |
| 1.2.6 肿瘤基因突变NGS检测参考物质均一性及稳定性探究 |
| 1.2.6.1 肿瘤基因突变NGS检测参考物质均一性探究 |
| 1.2.6.2 肿瘤基因突变NGS检测参考物质稳定性探究 |
| 2. 结果 |
| 2.1 HEK293T、1-F8-G9、GM12878细胞系的培养、细胞系基因组DNA提取及浓度测定 |
| 2.1.1 HEK293T、1-F8-G9、GM12878细胞系的培养 |
| 2.1.2 HEK293T、1-F8-G9、GM12878细胞系基因组gDNA的提取及浓度测定 |
| 2.2 含肿瘤基因突变位点的DNA片段结果 |
| 2.2.1 肿瘤基因突变位点的设计 |
| 2.2.2 肿瘤基因突变引物设计结果 |
| 2.2.3 含突变位点重组质粒的验证结果 |
| 2.2.3.1 单克隆菌落菌液PCR及电泳验证 |
| 2.2.3.2 重组质粒Sanger测序验证结果 |
| 2.2.4 酶切回收含突变位点的DNA片段结果 |
| 2.2.4.1 重组质粒提取结果 |
| 2.2.4.2 酶切回收含突变的DNA片段浓度及电泳图 |
| 2.3 肿瘤基因突变NGS检测参考物质模拟样本盘制备 |
| 2.3.1 gDNA及含突变位点DNA片段拷贝数计算结果 |
| 2.3.1.1 人基因组细胞系gDNA拷贝数浓度计算结果 |
| 2.3.1.2 含肿瘤突变位点的DNA片段拷贝数浓度计算结果 |
| 2.3.2 含突变位点的DNA片段拷贝数稀释及加入体积的计算 |
| 2.3.2.1 含突变位点的DNA片段拷贝数稀释 |
| 2.3.2.2 含肿瘤基因突变的DNA片段加入体积 |
| 2.3.3 肿瘤基因突变NGS检测参考物质样本盘配制 |
| 2.3.3.1 非小细胞肺癌基因突变NGS检测参考物质样本盘的配制 |
| 2.3.3.2 乳腺癌基因突变NGS检测参考物质样本盘的配制 |
| 2.4 肿瘤基因突变NGS检测参考物质样本盘在不同NGS平台参考物质验证结果 |
| 2.4.1 Ion Torrent PGM平台验证结果 |
| 2.4.1.1 非小细胞肺癌基因突变NGS检测参考物质样本盘在Ion TorrentPGM平台的验证结果 |
| 2.4.1.2 乳腺癌基因突变NGS检测参考物质样本盘在Ion Torrent PGM平台的验证结果 |
| 2.4.2 Illumina Hiseq 2500平台验证结果 |
| 2.4.2.1 非小细胞肺癌基因突变NGS检测参考物质样本盘在IlluminaHiseq 2500平台的验证结果 |
| 2.4.2.2 乳腺癌基因突变NGS检测参考物质样本盘在Illumina Hiseq 2500平台的验证结果 |
| 2.5 参考物质均一性及稳定性结果 |
| 2.5.1 参考物质均一性验证结果 |
| 2.5.2 参考物质稳定性验证结果 |
| 3. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 肿瘤基因突变高通量测序检测室间质量评价 |
| 前言 |
| 1. 材料和方法 |
| 1.1 实验方法 |
| 1.1.1 肿瘤基因突变NGS检测室间质量评价方案 |
| 1.1.2 肿瘤基因突变NGS检测室间质量评价临床实验室回报内容 |
| 1.1.3 肿瘤基因突变NGS检测室间质量评价检测结果的评价原则 |
| 1.1.4 统计学分析 |
| 2. 结果 |
| 2.1 肿瘤基因突变NGS检测室间质量评价结果 |
| 2.1.1 临床实验室测序平台使用情况 |
| 2.1.2 临床实验室NGS仪器使用情况 |
| 2.1.3 临床实验室靶向捕获方法使用情况 |
| 2.1.4 临床实验室靶向测序检测基因盘情况 |
| 2.1.5 临床实验室肿瘤基因突变NGS检测室间质评成绩情况 |
| 2.2 临床实验室的肿瘤基因突变NGS检测能力分析 |
| 2.2.1 非小细胞肺癌基因突变NGS检测室间质评的实验室检测能力分析 |
| 2.2.2 乳腺癌基因突变NGS检测室间质评的实验室检测能力分析 |
| 2.3 临床实验室的肿瘤基因突变NGS检测突变解读结果分析 |
| 2.3.1 非小细胞肺癌基因突变NGS检测室间质评的实验室突变解读结果分析 |
| 2.3.2 乳腺癌基因突变NGS检测室间质评的实验室突变解读结果分析 |
| 3. 讨论 |
| 参考文献 |
| 论文综述 Comprehensive elaboration of database resources utilized in next generationsequencing-based tumor somatic mutation detection |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1 pMD18-T载体信息 |
| 附录2 构建的含突变位点的DNA序列 |
| 附录3 Ion AmpliSeq Cancer Hotspot panel v2扩增子panel覆盖的基因列表 |
| 附录4 Illumina Hiseq 2500平台使用自制杂交捕获panel覆盖的基因列表 |
| 附录5 2017年全国肿瘤体细胞基因突变高通量测序检测生物信息学分析室间质评活动安排及注意事项(第一轮) |
| 附录6 2017年全国肿瘤体细胞基因突变高通量测序检测生物信息学分析室间质评活动安排及注意事项(第二轮) |
| 附录7 2017年全国肿瘤体细胞突变高通量测序检测室间质量评价测定结果回报表(第一轮) |
| 附录8 2017年全国肿瘤体细胞突变高通量测序检测室间质量评价测定结果回报表(第二轮) |
| 致谢 |
| 个人简介 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词及中文对照 |
| 前言 |
| Graves病的易感基因及其研究进展 |
| 参考文献 |
| 第一部分 TSHR基因多态性与GD易感性关联分析 |
| 1 前言 |
| 2 —般临床资料和方法 |
| 3 结果 |
| 4 图表 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 CTLA-4基因多态性与GD易感性关联分析 |
| 1 前言 |
| 2 —般临床资料和方法 |
| 3 结果 |
| 4 附表 |
| 5 讨论 |
| 6. 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 FCRL3基因rs3761959单核苷酸多态性与GD易感性的关联分析 |
| 1. 前言 |
| 2 一般临床资料和方法 |
| 3. 结果 |
| 4 附表 |
| 5. 讨论 |
| 6. 结论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 易感基因假阳性报告率与基因间相互作用 |
| 1 易感基因的假阳性报告率 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 结论 |
| 2 基因间交互作用分析 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2. 5 结论 |
| 参考文献 |
| 总结 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| English paper 1 |
| English Paper 2 |
| 学术论文评阅及答辩情况 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验材料 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 仪器与设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 标本采集及保存 |
| 1.2.2 核酸提取 |
| 1.2.3 试剂准备及加样 |
| 1.2.4 PCR扩增 |
| 1.2.5 结果分析 |
| 1.2.6 统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 NG、CT、UU总体感染情况 |
| 2.2 NG、CT、UU混合感染类型及分布 |
| 2.3 不同年龄段间感染NG、CT、UU阳性率比较 |
| 2.4 不同年份间感染NG、CT、UU阳性率比较 |
| 3 讨 论 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一章 从血液和唾液中自动化提取DNA方法的优化 |
| 1 材料与方法 |
| 2 各种样本DNA提取方法的评估 |
| 3 统计方法 |
| 4 结果 |
| 5 讨论 |
| 第二章 竞争性等位基因特异性PCR引物设计方法 |
| 1 引物设计原理 |
| 2 设计方法 |
| 3 SNP纳入原则 |
| 4 引物设计结果 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 第三章 人体微量营养素缺乏风险关联SNP高通量微流体芯片方法的建立 |
| 1 材料和方法 |
| 2 微流体芯片检测方法的评估 |
| 3 统计方法 |
| 4 血液中提取的DNA在芯片上的评估结果 |
| 5 唾液中提取的DNA在芯片上的评估结果 |
| 6 讨论 |
| 7 结论 |
| 第四章 MDR-SNPs位点地域分布特征及关联分析初探 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 全文讨论 |
| 创新点 |
| 结论 |
| 未来工作计划 |
| 参考文献 |
| 综述 单核苷酸多态性基因分型技术与人类营养风险评估 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
| 发表文章 |
| 1 NAAT在淋病诊断中的应用 |
| 2 NAAT在淋病治疗后诊断中的应用 |
| 3 NAAT在淋病诊疗中应用的探讨 |
| 4 NAAT在淋病诊疗中应用的展望 |
| 缩略词 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 miR-638低表达可以诱导EMT,并通过靶向调控SOX2来促进NSCLC细胞的增殖和侵袭转移能力 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 第二部分 抑癌基因miR-204调控SIX1基因参与非小细胞肺癌的发展过程 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 第三部分 低表达的IncRNA Meg3通过激活Wnt/β-catenin通路来增加肺癌细胞对顺铂的耐药性 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 第四部分 Meta分析: let-7低表达可以预测多种不同肿瘤患者预后不良 |
| 1 引言 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 材料与方法 |
| 1病历资料 |
| 2标本采集 |
| 3仪器和试剂 |
| 4统计学方法 |
| 结果 |
| 1 CT、UU、NG和HPV总体感染情况分析 |
| 2 CT、UU、NG和HPV分类感染情况和性别分布比较分析 |
| 3 CT、UU、NG和HPV分类感染情况和年龄分布比较分析 |
| 讨论 |
| 资料与方法 |
| 一、研究对象 |
| 二、主要仪器与试剂 |
| 三、方法 |
| 1. 标本采集: |
| 2. 煮沸裂解法提取病原体DNA: |
| 3. 实时荧光PCR技术检测NG、CT、UU、HSV和HPV核酸: |
| 四、统计学处理 |
| 结果 |
| 一、NG、CT、UU、HSV和HPV阳性检出率比较 |
| 二、不同年龄组UU、NG和CT的阳性检出率比较 |
| 三、各组病原体的混合感染情况 |
| 讨论 |
| 一、各种病原体的阳性检出率比较 |
| 二、NG、CT及UU的年龄分布 |
| 三、各病原体混合感染的特点 |
