张波[1]（2021）在《Notch信号通路在MEHP影响SH-SY5Y细胞增殖和迁移中的作用及其机制》文中研究指明邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯[di-（2-ethylhexyl）phthalate,DEHP]作为最常用邻苯二甲酸酯（phthalate esters,PAEs）类的增塑剂,广泛存在于环境介质中,可通过呼吸、饮食和皮肤接触等途径进入婴幼儿体内。进入体内的DEHP可在肝脏和小肠细胞中首先水解并通过其他代谢产物邻苯二甲酸单-2-乙基己酯[mono-（2-ethylhexyl）phthalate,MEHP]对机体产生毒性作用。神经母细胞瘤（neuroblastoma,NB）是最常见的小儿颅外恶性肿瘤,严重危害儿童的生命健康。一些环境内分泌干扰物能够促进神经母细胞瘤的增殖和迁移。DEHP作为一种具有神经毒性作用的环境内分泌干扰物可能影响神经母细胞瘤的增殖和迁移,但其作用机制尚不清楚。本研究通过体外培养神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y细胞并给予MEHP暴露,明确MEHP暴露对SH-SY5Y细胞增殖和迁移的影响;通过抑制Notch信号通路,探讨Notch信号通路在MEHP暴露影响SH-SY5Y细胞增殖和迁移中的作用机制,可为防治神经母细胞瘤和DEHP的健康损害提供科学依据。第一部分 MEHP对SH-SY5Y细胞增殖的影响及其机制目的:明确MEHP对SH-SY5Y细胞增殖、周期和凋亡的影响,探讨细胞周期和细胞凋亡关键基因在其中的作用。方法:SH-SY5Y细胞采用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基常规培养。给予SH-SY5Y细胞梯度浓度MEHP暴露,CCK8法检测SH-SY5Y细胞存活率;根据CCK8结果确定染毒剂量与实验分组为空白对照组、溶剂对照组（0.1%DMSO）、低剂量组（10μM MEHP）、中剂量组（50μM MEHP）、高剂量组（250μM MEHP）,暴露时间为12h和24h。采用流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡情况;实时荧光定量PCR方法检测细胞周期、凋亡关键基因C-MYC、Cyclin D1、CDK4、P27、Bax、Bcl-2 m RNA表达水平;western blot方法检测细胞周期、凋亡关键蛋白C-MYC、Cyclin D1、CDK4、P27、Bax、Bcl-2的表达水平。采用IBM SPSS 24.0进行统计分析,MEHP暴露组和对照组多组间差异比较采用单因素方差分析（One Way ANOVA）,组间两两比较采用LSD检验法（Least-Significant Difference）,非正态数据采用秩和检验。检验水准为α=0.05。结果:1.MEHP暴露12h和24h后,各染毒剂量组SH-SY5Y细胞存活率均明显高于对照组（P<0.05）;随着暴露时间的增加,32、64、128、250、500和1000μM MEHP组细胞存活率明显升高（P<0.05）。2.MEHP暴露12h和24h后,MEHP暴露组G1期细胞数量均显着减少（P<0.05）,MEHP组细胞S期细胞百分比增加（P<0.05）。3.MEHP暴露12h和24h,MEHP暴露组SH-SY5Y细胞凋亡水平显着减低（P<0.05）;且24h组250μM MEHP暴露组细胞凋亡水平低于12h组（P<0.05）。4.MEHP暴露12h和24h后,中、高剂量组C-MYC、Cyclin D1 m RNA和蛋白表达水平升高（P<0.05）;CDK4和P27的m RNA和蛋白表达水平无明显变化（P>0.05）。5.MEHP暴露12h和24h后,中、高剂量组SH-SY5Y细胞Bax m RNA和蛋白表达水平降低（P<0.05）;Bcl-2 m RNA和蛋白表达水平升高（P<0.05）。结论:1.MEHP暴露可以调节SH-SY5Y细胞周期、抑制细胞凋亡,促进SH-SY5Y细胞增殖。2.MEHP暴露能够上调细胞周期关键蛋白C-MYC、Cyclin D1的表达,加速细胞周期,促进SH-SY5Y细胞增殖。3.MEHP暴露能够调节细胞凋亡相关基因Bcl-2和Bax的表达,抑制SHSY5Y细胞凋亡,促进神经母细胞瘤增殖。第二部分 MEHP对SH-SY5Y细胞迁移的影响及其机制目的:明确MEHP对SH-SY5Y细胞迁移的影响,探讨细胞迁移关键基因和趋化因子在其中的作用。方法:SH-SY5Y细胞培养和实验分组与染毒同第一部分。采用ELISA法检测趋化因子VEGF、PDGF、TGF-β1和CXCL-8分泌水平;划痕实验检测细胞迁移水平;transwell侵袭实验检测细胞的侵袭能力;实时荧光定量PCR方法检测细胞迁移关键基因E-Cadherin、N-Cadherin、SNAIL、TWIST、Vimentin、HIF-1α、GPR81和Versican m RNA表达水平;western blot方法检测细胞迁移关键蛋白表达水平。结果:1.MEHP暴露可增加SH-SY5Y细胞的迁移距离,MEHP暴露24h后,细胞的迁移距离显着增加（P<0.05）。2.MEHP暴露可增加SH-SY5Y细胞的侵袭能力,中、高剂量MEHP暴露组细胞侵袭能力显着升高（P<0.05）。3.MEHP暴露可增加SH-SY5Y细胞的VEGF、PDGF以及TGF-β1的分泌水平,且24h组VEGF、PDGF和TGF-β1水平显着高于12h组（P<0.05）。4.MEHP暴露12h和24h后,中、高剂量组SH-SY5Y细胞E-Cadherin基因m RNA和蛋白表达水平显着低于对照组和DMSO组（P<0.05）;高剂量组NCadherin基因m RNA和蛋白表达水平显着高于其余各组（P<0.05）;与12h暴露组相比,24h高剂量组SH-SY5Y细胞N-Cadherin m RNA的表达水平升高（P<0.05）;中剂量组Vimentin基因m RNA和蛋白表达水平显着升高（P<0.05）,高剂量组Vimentin基因m RNA和蛋白表达水平显着高于对照组、DMSO组和低剂量组;与12h暴露组相比,24h各剂量组Vimentin m RNA的表达水平升高（P<0.05）;中、高剂量组SNAIL基因m RNA和蛋白表达升高（P<0.05）;中、高剂量MEHP暴露组HIF-1α基因m RNA和蛋白表达水平显着升高（P<0.05）,与12h暴露组相比,24h高剂量组SH-SY5Y细胞HIF-1αm RNA的表达水平更高（P<0.05）;中、高剂量MEHP暴露组Versican基因m RNA和蛋白表达水平显着高于对照组和DMSO组（P<0.05）,与12h暴露组相比,24h高剂量SHSY5Y细胞Versican m RNA的表达水平升高（P<0.05）。结论:1.MEHP暴露可促进SH-SY5Y细胞迁移和侵袭。2.MEHP暴露可调控迁移关键基因E-Cadherin、N-Cadherin、SNAIL、Vimentin、HIF-1α和Versican的表达,促进SH-SY5Y细胞迁移和侵袭。3.MEHP暴露可能通过上调趋化因子VEGF、PDGF和TGF-β1的分泌,增强SH-SY5Y细胞的迁移能力。第三部分 MEHP对SH-SY5Y细胞Notch信号通路的影响目的:明确MEHP对SH-SY5Y细胞Notch信号通路的影响,探讨Notch信号通路蛋白表达水平与SH-SY5Y细胞增殖和迁移以及相关基因表达的关系。方法:实验分组与染毒同第一部分。实时荧光定量PCR方法检测细胞Notch信号通路基因m RNA表达水平;western blot方法检测细胞Notch信号通路基因的蛋白表达水平。采用Pearson相关分析检验Notch信号通路蛋白表达与SH-SY5Y细胞增殖、迁移及其相关蛋白的相关性。结果:1.MEHP暴露可增加中、高剂量组SH-SY5Y细胞Notch-1、Notch-2、Notch-3、Notch-4、Dll-1和Jagged-2 m RNA表达水平,降低Dll-4 m RNA表达水平（P<0.05）。2.MEHP暴露可增加中、高剂量组SH-SY5Y细胞Notch-1、Notch-2、Notch-3和Jagged-2蛋白表达水平,降低Dll-4蛋白表达水平（P<0.05）。3.MEHP暴露12h和24h后,SH-SY5Y细胞周期和细胞凋亡水平与Notch-1、Jagged-2和Dll-4等蛋白表达水平显着相关（P<0.05）。4.MEHP暴露12h和24h后,细胞周期关键蛋白CDK4表达水平与Dll-1蛋白表达水平显着相关（P<0.05）;Cyclin D1和C-MYC蛋白表达水平与Notch-1、Notch-2、Notch-4、Jagged-2、Dll-1和Dll-4蛋白表达水平显着相关（P<0.05）。MEHP暴露12h和24h后,凋亡相关蛋白Bax的表达水平与Notch-1、Notch-4和Dll-4蛋白表达水平显着相关,Bcl-2的表达水平与Dll-4蛋白表达水平显着相关（P<0.05）。5.MEHP暴露12h和24h后,SH-SY5Y细胞迁移和侵袭能力与Notch-1、Jagged-2、Dll-1和Dll-4蛋白表达水平显着相关（P<0.05）。6.MEHP暴露12h和24h后,细胞迁移相关蛋白E-Cadherin表达水平与Notch-1和Jagged-2蛋白表达水平显着相关（P<0.05）;N-Cadherin蛋白表达水平与Notch-1、Jagged-2蛋白表达水平显着相关（P<0.05）;SNAIL蛋白表达水平与Notch-4、Jagged-2和Dll-4蛋白表达水平显着相关（P<0.05）;Vimentin和HIF-1α蛋白表达水平与Notch-1、Jagged-2和Dll-4蛋白表达水平显着相关（P<0.05）;Versican蛋白表达水平与Notch-1、Notch-4和Jagged-2蛋白表达水平显着相关（P<0.05）。7.MEHP暴露12h和24h后,趋化因子VEGF的表达水平与Notch-2和Dll-4蛋白表达水平显着相关（P<0.05）;PDGF的表达水平与Notch-1、Notch-4、Dll-1和Jagged-2蛋白表达水平显着相关（P<0.05）;TGF-β1的表达水平与Notch-3和Dll-4蛋白表达水平显着相关（P<0.05）;CXCL-8的表达水平与Jagged-2蛋白表达水平显着相关（P<0.05）。结论:1.MEHP暴露可上调Notch信号通路中Notch-1、Notch-2、Notch-3、Jagged-2的蛋白表达水平,下调Dll-4的蛋白表达水平。2.MEHP暴露所致SH-SY5Y细胞的增殖和迁移与Notch通路蛋白表达密切相关。3.Notch信号通路可能通过调节细胞增殖和迁移关键基因的表达在MEHP促进SH-SY5Y细胞增殖和迁移中发挥作用。4.Notch信号通路可能通过调节细胞趋化因子的分泌在MEHP促进SHSY5Y细胞迁移中发挥作用。第四部分 Notch信号通路在MEHP影响SH-SY5Y细胞增殖和迁移中的作用及其机制目的:明确Notch信号通路在MEHP促进SH-SY5Y细胞增殖和迁移中的作用及其机制。方法:采用DAPT抑制Notch信号通路表达,western blot方法检测Hes-1蛋白表达水平,检测Notch信号通路的抑制效率。暴露剂量与实验分组为空白对照组、溶剂对照组（0.1%DMSO）、DAPT组（50μM DAPT）、MEHP组（250μM MEHP）和MEHP+DAPT组（50μM DAPT+250μM MEHP）,暴露时间为24h。Western blot方法检测细胞Notch信号通路抑制后细胞增殖和迁移相关蛋白表达水平,其余实验方法同第一部分。数据处理与分析方法同第一部分。结果:1.SH-SY5Y细胞DAPT暴露后24h后,各剂量组（0、5、10、25、50、100μM DAPT）细胞存活率无明显变化（P>0.05）;经50μM DAPT处理的SH-SY5Y细胞内Hes-1蛋白表达水平显着降低（P<0.05）,Notch信号通路被有效抑制。2.DAPT可显着逆转MEHP所致SH-SY5Y细胞S期细胞数量增多。3.细胞凋亡结果显示,MEHP组和DAPT+MEHP组细胞凋亡水平显着降低（P<0.05）。4.细胞迁移情况结果显示,MEHP组和DAPT+MEHP组细胞迁移距离显着增加（P<0.05）;与MEHP组相比,DAPT+MEHP组细胞迁移距离降低,差异无统计学意义（P>0.05）。5.细胞侵袭结果显示,MEHP组和DAPT+MEHP组细胞侵袭水平显着增加（P<0.05）,与MEHP组相比,DAPT+MEHP组细胞侵袭水平降低,差异无统计学意义（P>0.05）。6.趋化因子结果显示,MEHP组和DAPT+MEHP组细胞VEGF、PDGF、TGF-β1和CXCL-8水平显着增加（P<0.05）;且DAPT+MEHP组细胞VEGF和TGF-β1水平显着低于MEHP组（P<0.05）。7.细胞周期和凋亡相关蛋白结果显示,MEHP组和DAPT+MEHP组细胞C-MYC、Bcl-2蛋白表达水平升高,Bax蛋白表达水平显着降低（P<0.05）;DAPT+MEHP组C-MYC、Cyclin D1、Bcl-2蛋白表达水平显着低于MEHP组（P<0.05）。8.细胞迁移相关蛋白结果显示,MEHP组和DAPT+MEHP细胞Vimentin、SNAIL、HIF-1α和Versican蛋白表达水平显着升高（P<0.05）;MEHP组和DAPT+MEHP组细胞E-Cadherin蛋白表达水平显着降低（P<0.05）;DAPT+MEHP组HIF-1α和N-Cadherin蛋白表达水平显着低于MEHP组（P<0.05）。结论:1.Notch信号通路能在MEHP促进SH-SY5Y细胞增殖和迁移中起正向调控作用。2.Notch信号通路可能通过调节细胞周期关键蛋白Cyclin D1、C-MYC,抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,在MEHP影响SH-SY5Y细胞增殖中发挥作用。3.Notch信号通路可能通过调节细胞迁移关键蛋白N-Cadherin的表达在MEHP影响SH-SY5Y细胞迁移中发挥作用。4.Notch信号通路可能影响肿瘤细胞趋化因子VEGF和TGF-β1的分泌在MEHP影响SH-SY5Y细胞迁移中发挥作用。
李媛媛[2]（2021）在《MicroRNAs及其相关因子在扁平苔藓发病中的作用》文中研究指明目的:越来越多的证据表明micro RNAs（miRNAs）在炎症和自身免疫性疾病的发病机制中起着重要作用,是一个有吸引力的治疗靶点。以往有关miRNAs与扁平苔藓相关性的研究主要集中在口腔扁平苔藓（OLP）上,而对皮肤扁平苔藓（LP）的研究相对较少。本研究主要检测miRNA-137、miRNA-125b、miRNA-138及其下游靶蛋白环氧化酶-2（COX-2）蛋白、B细胞淋巴瘤-2（Bcl-2）蛋白、基质金属蛋白酶-2（MMP-2）、细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）在皮肤扁平苔藓（LP）中的表达,并探讨其在发病机制中的意义。方法:采用RT-PCR方法检测miRNA-137、miRNA-125b、miRNA-138在扁平苔藓和正常皮肤组织中的表达。ELISA法检测扁平苔藓及正常皮肤组织中COX-2、Bcl-2、MMP-2、cyclin D1和p53的表达水平。结果:我们研究结果显示:与正常组相比,LP患者组织标本中COX-2（p=0.034）、Bcl-2（p=0.018）、MMP-2（p=0.032）、Cyclin D1（p=0.027）、P53（p=0.031）的表达显着升高;miRNA-137（p=0.037）、miRNA-125b（p=0.033）、miRNA-138（p=0.016）的表达显着下调。Spearman秩相关分析显示,miRNA-137与COX-2呈负相关（r=-0.244,P=0.035）;miRNA-125b与Bcl-2呈负相关（r=-0.256,P=0.027）,但与MMP-2的相关性差异无统计学意义（P=0.056）;miRNA-138的表达与cyclin D1（r=-0.248,P=0.032）和p53（r=-0.264,P=0.022）呈负相关。结论:miRNA-137、miRNA-125b、miRNA-138通过调节其靶蛋白在LP的发病机制中发挥重要作用,有望成为LP分子治疗的潜在工具。
杜华珊[3]（2021）在《STING对宫颈癌增殖、迁移和侵袭能力的作用及机制的研究》文中研究表明研究背景:宫颈癌是最常见的妇科癌症之一。每年全球大约有57万新发病例,31万死亡病例。大约95%的宫颈癌病例是由高危人类乳头瘤病毒（HPV）的持续感染引起的。尽管已有预防高危型HPV的疫苗,宫颈癌对妇女来说仍然是一场健康危机。因此,有必要为宫颈癌的预防和治疗提供新的视角。干扰素基因刺激因子（STING）是一种跨膜蛋白,是细胞质DNA传感通路的重要分子。越来越多的证据表明,STING通路除了能保护宿主免受多种致病性攻击外,在癌症中也起着至关重要的作用。在结直肠癌、卵巢癌、黑色素瘤中,与抗肿瘤T细胞启动和I型干扰素相关的STING信号被严重抑制以逃避免疫监视。STING在胃癌组织中低表达,与肿瘤大小、肿瘤浸润深度、淋巴转移、临床病理分期和生存率有关。敲除STING可促进胃癌细胞的增殖、克隆形成、迁移和侵袭。此外,多项研究表明,STING激动剂可以作为单药或联合手术治疗、放化疗、免疫治疗发挥抗肿瘤作用,弥补传统疗法的不足。研究目的:目前,尚不清楚STING在宫颈癌发生发展过程中的具体作用。本研究检测了人角质形成细胞、宫颈上皮永生化细胞以及四种宫颈癌细胞系中STING的表达情况。通过构建沉默STING和过表达STING的稳定转染宫颈癌细胞系,进行细胞生物学行为实验探讨STING对于宫颈癌细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响和相关调控机制。此外,通过构建裸鼠皮下移植瘤模型进行体内实验对体外实验的结果进行验证,为宫颈癌预防和宫颈癌复发或转移的治疗提供新的思路。研究方法:第1部分:STING对宫颈癌增殖、迁移、侵袭能力影响的体外实验1、通过qRT-PCR及蛋白质免疫印迹实验检测体外培养的人角质形成细胞Ha Ca T、宫颈上皮永生化细胞H8、四种宫颈癌细胞系（He La、Si Ha、C33A、Ca Ski）的STING m RNA和蛋白表达情况;2、构建沉默STING的sh RNA慢病毒载体。选择He La、Si Ha细胞系作为沉默STING的转染细胞系。设计构建STING基因的过表达慢病毒载体,转染C33A细胞系。鉴定稳定转染细胞系中STING的表达情况;3、通过CCK8实验、平板克隆实验、细胞划痕实验和Transwell小室实验探究STING对于宫颈癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力的影响。第2部分:STING调控宫颈癌细胞生物学行为信号通路的探索1、下调STING表达后,采用蛋白质免疫印迹实验检测β-catenin的总蛋白、活化蛋白以及核蛋白中的含量,检测Wnt通路下游靶基因（cyclin D1,c-Myc,MMP9）表达水平;2、上调STING表达后,采用蛋白质免疫印迹实验检测β-catenin的总蛋白、活化蛋白以及核蛋白中的含量,检测Wnt通路下游靶基因（cyclin D1,c-Myc,MMP9）表达水平;3、应用免疫共沉淀实验检测STING是否与β-catenin结合;4、下调STING表达的同时联用β-catenin通路抑制剂,采用蛋白质免疫印迹实验检测β-catenin的总蛋白、活化蛋白以及核蛋白中的含量,检测Wnt通路下游靶基因（cyclin D1,c-Myc,MMP9）表达水平;5、下调STING表达的同时联用β-catenin通路抑制剂,通过CCK8实验、平板克隆实验和Transwell小室实验探究下调STING表达对宫颈癌生物学行为的影响能否被β-catenin通路抑制剂所逆转。第3部分:沉默STING对宫颈癌细胞增殖能力影响的体内实验1、使用vector He La、sh STING-He La细胞系构建裸鼠皮下移植瘤模型,探究移植瘤沉默STING对裸鼠体重影响;2、通过测量裸鼠移植瘤体积和绘制肿瘤生长曲线验证下调STING表达对于宫颈癌细胞体内增殖能力的影响;3、肿瘤组织进行HE染色,探究下调STING表达是否影响肿瘤组织病理形态;4、肿瘤组织进行免疫组化染色,验证沉默STING的He La细胞在体内成瘤后是否仍保持沉默STING的特征;5、通过免疫组化染色Ki67探究沉默STING对于移植瘤增殖能力的影响。研究结果:第1部分:1、qRT-PCR及蛋白质免疫印迹实验显示在人角质形成细胞、宫颈上皮永生化细胞、4种宫颈癌细胞系中STING表达水平有差异。与正常细胞相比,HPV阴性宫颈癌细胞系C33A中的STING表达降低,其余三种HPV阳性宫颈癌细胞系（He La、Si Ha、Ca Ski）STING表达升高;2、成功合成了靶向STING的sh RNA并筛选出干扰效率最高的sh RNA片段。成功构建并验证沉默STING基因的He La和Si Ha稳转细胞系的STING蛋白、m RNA水平与对照组相比均存在显着统计学差异。STING过表达慢病毒载体构建成功,成功构建并验证过表达STING基因的C33A稳转细胞系的STING蛋白、m RNA水平与对照组相比均存在显着统计学差异;3、STING表达下调后,He La及Si Ha细胞增殖、克隆形成、迁移和侵袭能力增强。过表达STING基因后,C33A细胞体外增殖、克隆形成、迁移和侵袭的能力明显下降。第2部分:1、沉默STING后,Western blot显示β-catenin蛋白总表达量及活化的β-catenin蛋白表达量、细胞核β-catenin蛋白含量明显增加,Wnt通路下游靶基因（cyclin D1,c-Myc,MMP9）表达水平也随之升高;2、STING过表达后,Western blot显示β-catenin蛋白总表达量及活化的β-catenin蛋白表达量、细胞核β-catenin蛋白含量明显减少,Wnt通路下游靶基因（cyclin D1,c-Myc,MMP9）表达水平也随之明显降低;3、免疫共沉淀实验显示内源性STING可与β-catenin结合;4、沉默STING的同时联用β-catenin通路抑制剂,显示β-catenin蛋白总表达量及活化的β-catenin蛋白表达量、Wnt通路下游靶基因（cyclin D1,c-Myc,MMP9）表达水平与单纯沉默STING组比较明显降低;5、沉默STING的同时联用β-catenin通路抑制剂显示细胞体外增殖速度、克隆形成能力、迁移和侵袭的能力明显低于单纯沉默STING组。第3部分:1、裸鼠接种移植瘤后,sh STING-He La组裸鼠体重呈低于vector-He La组趋势,但趋势无统计学意义;2、sh STING-He La组肿瘤体积和生长速度明显大于对照组;3、HE染色显示vector-He La组形成的肿瘤病灶中细胞排列紧密、胞核深染、细胞形态呈卵圆形;sh STING-He La组形成的肿瘤病灶中细胞排列紊乱、血管组织较丰富;4、免疫组化染色显示体外构建的sh STING-He La细胞系成瘤后,STING低水平表达特征保留;5、免疫组化染色显示sh STING-He La组Ki67表达水平高于vector He La组Ki67表达水平。研究结论:1、不同类型的宫颈癌细胞STING表达水平不同,但STING的细胞生物学作用相同。STING可抑制宫颈癌细胞增殖、迁移、侵袭,在宫颈癌的发生发展中起抑癌基因作用;2、STING下调宫颈癌Wnt/β-catenin信号通路中总β-catenin蛋白、活化β-catenin蛋白、核β-catenin蛋白以及Wnt通路下游靶基因（cyclin D1,c-Myc,MMP9）蛋白表达水平;3、Wnt/β-catenin通路抑制剂ICG001可显着逆转沉默STING导致的宫颈癌细胞中Wnt/β-catenin通路相关蛋白质的表达上调。4、Wnt/β-catenin通路抑制剂ICG001可显着逆转沉默STING导致的宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的上调。5、STING通过抑制Wnt/β-catenin信号通路抑制宫颈癌的发生发展。6、沉默STING对宫颈癌细胞体内增殖能力有促进作用。
邵长春[4]（2021）在《脂多糖在肝再生及其促进肝癌发生中的作用机制研究》文中提出研究背景及目的肝癌是严重威胁人类健康的恶性肿瘤之一,在全球肿瘤发病率中位居第六位,死亡率高达第三位。在中国,肝癌发病率更是高居第5位,死亡率仅次于肺癌,位居第2位。目前手术切除依然是肝癌的首选治疗方案,但肝癌术后5年复发率高达70%,因而肝癌术后复发成为影响肝癌患者手术疗效的重要瓶颈。究其原因还是对肝癌发生的机制尚不明确。目前研究结果显示肝再生与肝癌发生密切相关。肝脏具有强大的再生功能,病毒感染、酗酒、手术切除等造成肝损伤的同时会启动肝脏再生反应,促进肝脏结构及功能恢复。当损伤因素持续存在,肝细胞出现严重坏死、凋亡、衰老时,会激活肝脏中的前体细胞或者胆管细胞,参与肝脏再生修复。目前也有研究表明肝细胞具有较强的表型可塑性,在肝损伤再生修复过程中,肝细胞可以去分化形成肝前体样细胞或者转分化形成胆管细胞。有研究表明持续损伤的慢性炎症微环境会诱导再生的细胞出现基因突变、表观遗传学改变等,导致细胞发生恶性转化形成肿瘤起始细胞,最终可能导致肝癌发生。在慢性肝损伤基础上予以肝部分切除,可以加速损伤的肝细胞逃脱损伤诱导的细胞周期阻滞,促进基因突变在细胞中累积,最终导致细胞增殖失控,促进肝癌发生。也有研究表明肝再生过程中诱导产生的多种细胞因子、生长因子等在促进肝脏再生修复的同时,可能也会激活异变期的细胞,加速细胞增殖,促进细胞恶性转化。因而炎症损伤微环境、肝脏再生、肝癌发生三者紧密联系,但是前两者在肝癌发生过程中的具体作用及机制不清,需要进一步研究探讨。LPS/TLR4/NF-κB信号通路是介导炎症免疫信号的重要通路,在生理功能稳态维持、疾病发生发展过程中扮演着重要作用。生理情况下,来自于胃肠道的血液通过门静脉入肝,其中含有大量肠道细菌产生的脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）,经过肝脏解毒代谢后被清除,抑制LPS对机体造成的损伤。也有研究表明LPS对机体可能发挥正向调节作用,参与细胞干性维持及肝脏再生。LPS可以维持胚胎干细胞及内皮前体细胞干性表型,维持细胞自我更新;在肝再生过程中,LPS可促进肝营养因子及细胞因子分泌,促进肝细胞增殖及肝再生。在慢性肝损伤情况下,肠道屏障功能破坏,导致肠道细菌移位,肝脏中LPS大量增加,可促进肝脏慢性炎症损伤,甚至导致肝癌发生。基于以上研究背景,我们拟在正常生理状态下,通过体内外实验分析LPS与肝脏门静脉区细胞干性之间的关系,及LPS在细胞干性维持中的作用机制研究;接着在小鼠肝大部分切除后再生模型中分析LPS是否可以通过调控细胞干性参与肝脏再生,及LPS调控肝再生的下游关键靶分子;最后分析肝脏再生与肝癌发生之间的关系,以及LPS下游关键靶分子在肝癌发生过程中的作用及机制,期望揭示肝再生与肝癌发生之间的内在联系,为肝癌预防、治疗提供新的理论基础。第一部分:正常生理状态下脂多糖对肝细胞干性的影响及机制研究研究目的:肝脏具有强大的再生能力,而肝脏再生修复与细胞干性密切相关。目前研究表明肝小叶门静脉区肝胆管细胞交界处细胞干性相对较高,而门静脉区肝细胞接触大量含有脂多糖的门静脉血,同时多项研究结果表明LPS与细胞干性维持密切相关。本部分拟探讨LPS对肝细胞干性的影响及调控机制。研究方法:1.通过免疫组织化学染色及免疫荧光染色分析干性分子在肝小叶中的定位,鲎试剂检测门静脉血以及下腔静脉血中LPS的浓度,分析两者之间的相关性;2.利用抗生素清除肠道来源的LPS,并结合TLR4-/-转基因小鼠,通过蛋白质印迹实验及免疫组织化学染色实验分析肝脏干性指标的变化,明确LPS对细胞干性的调控作用;3.在体外实验中用LPS处理小鼠正常肝细胞系AML12,通过细胞成球、克隆形成、实时荧光定量PCR、蛋白质印迹实验分析LPS对肝细胞干性的影响;4.在重编程体系中加入LPS,通过实时荧光定量PCR、蛋白质印迹、免疫荧光实验分析LPS对肝细胞重编程能力的影响;5.通过体外肝向及胆向诱导分化实验,分析LPS处理后的肝细胞分别向肝向及胆向分化能力的变化;利用Fah-/-小鼠肝损伤模型,分析LPS处理的肝细胞在体内肝向及胆向的分化能力;6.在肝细胞中干扰TLR4表达后,通过细胞成球、蛋白质印迹实验分析LPS是否通过TLR4调控细胞干性;7.利用蛋白质印迹实验检测LPS处理的肝细胞中YAP1的表达变化;在肝细胞中通过腺病毒干扰YAP1表达,通过蛋白质印迹、免疫荧光、细胞成球、克隆形成实验分析YAP1是否介导LPS对细胞干性的调控;8.在WT及TLR4-/-小鼠中通过肝门静脉结扎模型,分析肝门静脉结扎后肝脏中YAP1及干性分子表达变化与LPS的相关性。结果:1.肝脏中Sox9+细胞定位于肝门静脉区,并且LPS在门静脉血中浓度明显高于中央静脉血;在用抗生素清除肠道来源的LPS或TLR4-/-小鼠中,肝脏中Sox9表达降低;2.LPS处理肝细胞后,细胞成球能力、克隆形成能力、多潜能分子及干性分子表达增加;3.在肝细胞中干扰TLR4及YAP1后,可以抑制LPS对肝细胞干性的促进作用;4.小鼠门静脉肝左叶分支结扎后,结扎侧肝叶组织中LPS浓度降低,YAP1及Sox9表达也相应降低;未结扎侧肝叶中LPS浓度增加,YAP1及Sox9表达相应增加。结论:研究结果提示门静脉区高浓度的LPS在维持门静脉区细胞干性中可能发挥重要作用,体内外实验结果提示LPS可通过激活TLR4,上调肝细胞中YAP1表达,进而增强肝细胞干性,而且LPS处理后的肝细胞具有明显的肝向和胆向分化能力,参与肝脏损伤修复。但LPS是如何调控YAP1的激活,其机制有待进一步研究。第二部分:肝再生过程中脂多糖对肝细胞干性的影响及机制研究研究目的:肝再生是肝脏损伤后的重要病理生理特征,对于肝脏内环境稳态的维持具有重要作用。既往研究表明肝细胞具有较强表型可塑性,可以去分化形成具有肝前体细胞特征的Sox9+HNF4α+肝细胞,参与肝损伤后再生修复。另外LPS与细胞干性及肝脏再生密切相关。本部分拟在小鼠肝大部分切除后再生模型中分析LPS是否可以通过调控肝细胞干性,诱导肝细胞转变为Sox9+HNF4α+肝细胞参与肝脏再生,及LPS调控Sox9+HNF4α+肝细胞激活,参与肝脏再生的分子机制。研究方法:1.通过蛋白质印迹、免疫荧光、免疫组织化学染色实验分析肝再生过程中干性分子表达变化情况;2.腺病毒干扰Sox9表达后,通过免疫组织化学实验、肝体重比恢复情况,分析Sox9+HNF4α+肝细胞在肝再生过程中的作用;3.将野生型小鼠Fah+肝细胞注射到Fah-/-小鼠体内构建小鼠嵌合肝脏模型,然后进行肝大部分切除,通过免疫荧光染色分析肝再生过程中Sox9+HNF4α+肝细胞是否来源于Fah+肝细胞;4.通过比较肝大部分切除前后门静脉血中LPS浓度变化,以及体外LPS刺激肝细胞实验、TLR4-/-小鼠肝大部分切除模型分析LPS/TLR4信号通路激活情况,及其与Sox9+HNF4α+肝细胞变化的相关性;5.通过NF-κB通路PCR芯片筛选参与肝再生的关键分子,通过蛋白质印迹实验、免疫荧光实验进行验证;6.通过构建关键分子的转基因敲除小鼠,在肝大部分切除后再生模型中分析关键分子对Sox9+HNF4α+肝细胞激活及肝再生的影响;7.在TLR4-/-小鼠中通过腺相关病毒在肝脏中过表达关键分子,在肝大部分切除后再生模型中分析LPS/TLR4通路是否通过关键分子调控Sox9+HNF4α+肝细胞激活及肝再生;8.通过实时荧光定量PCR、蛋白质印迹、免疫荧光、免疫组化、Chip-PCR、蛋白质免疫共沉淀等,分析关键分子对Sox9的调控作用及其机制。结果:1.小鼠肝大部分切除后肝再生早期Sox9+HNF4α+肝细胞数量增加;干扰Sox9表达,可以抑制肝细胞增殖及肝体重比恢复;肝再生过程中增加的Sox9+HNF4α+肝细胞可能来源于成熟肝细胞去分化;2.肝再生早期LPS/TLR4信号通路激活,TLR4缺失后可以抑制肝再生早期Sox9+HNF4α+肝细胞数量增加、抑制肝细胞增殖及肝体重比恢复;3.肝再生早期LPS/TLR4通路激活,上调Bcl3表达;Bcl3缺失后,可以抑制肝再生早期Sox9+HNF4α+肝细胞激活以及肝再生;4.肝细胞中Bcl3通过与YAP1结合,抑制YAP1泛素化降解,促进YAP1入核,转录激活Sox9表达。结论:在小鼠肝大部分切除后再生模型中,研究发现肝再生早期成熟肝细胞可去分化形成具有高增殖潜力及干性特征的Sox9+HNF4α+肝细胞,参与肝脏再生。机制上证实肝大部分切除后再生早期,肝脏门静脉血中LPS浓度增加,可以通过TLR4上调肝细胞中Bcl3表达,增加的Bcl3进一步通过抑制YAP1泛素化降解,促进YAP1核定位,转录激活Sox9表达,进而诱导肝细胞转变为Sox9+HNF4α+肝细胞参与肝脏再生。第三部分:肝再生在肝癌发生中的作用及机制研究研究目的:手术切除是原发性肝癌首选的治疗方式,但是术后高复发成为限制患者预后的重要因素。研究表明肝再生与肝癌发生密切相关,但是具体机制尚不明确。本部分拟探讨肝部分切除后肝再生与肝癌发生的关系,以及Bcl3在其中的作用及机制。研究方法:1.在大鼠及小鼠DEN诱导肝癌发生过程中进行肝大部分切除术,分析肝大部分切除后再生对肝癌发生的影响;2.通过免疫组织化学染色分析在DEN诱导肝癌发生过程中,肝大部分切除后再生对肝前体细胞激活的影响;3.通过蛋白质印迹实验分析在肝癌发生过程中Bcl3表达变化;构建Bcl3转基因敲除小鼠,分析Bcl3缺失后对肝癌发生及肝前体细胞激活的影响;4.通过免疫组织化学染色、实时荧光定量PCR、蛋白质印迹实验分析在DEN诱导肝损伤情况下,肝部分切除后再生早期,肝前体细胞激活及染色体不稳定性相关基因的表达变化;5.通过裸鼠肝癌移植瘤模型分析Bcl3过表达对肝癌细胞增殖的影响;6.通过蛋白质印迹、蛋白质免疫共沉淀实验分析去泛素化酶USP7对Bcl3表达的影响;通过蛋白质半衰期实验、泛素化酶实验分析去泛素化酶USP7抑制剂P5091对Bcl3表达的影响;7.在小鼠原发性肝癌模型及裸鼠肝癌移植瘤模型中,使用P5091治疗,分析Bcl3表达变化及对肝癌发生发展的影响;8.在人肝癌及癌旁组织标本中分析Bcl3和Sox9表达的相关性,及其与肝癌患者预后的关系。结果:1.在DEN诱导的肝癌发生过程中,肝大部分切除后再生可以促进肝癌发生;2.肝再生促进肝癌发生过程中Bcl3表达及肝前体细胞激活增加;3.Bcl3缺失抑制肝前体细胞激活及肝再生对肝癌发生的促进作用;4.在DEN诱导肝损伤基础上,肝大部分切除后肝再生早期肝前体细胞激活,细胞中染色体不稳定性相关基因表达增加;5.去泛素化酶USP7在肝癌发生过程中表达增加,可以通过与Bcl3结合,稳定Bcl3表达;6.去泛素化酶USP7抑制剂P5091促进Bcl3泛素化降解,抑制Bcl3表达;7.P5091抑制原发性肝癌模型中肝癌发生、Bcl3表达;P5091抑制裸鼠肝癌移植瘤模型中肝癌细胞增殖;8.在人肝癌组织标本中Bcl3与肝前体细胞标志Sox9表达呈现正相关关系,并且其表达水平越高,患者预后相对较差。结论:在DEN诱导肝癌发生过程中,肝大部分切除后肝再生可促进肝癌发生;肝大部分切除后再生可上调Bcl3表达,促进肝前体细胞激活;在损伤微环境及再生压力下,激活的肝前体细胞染色体不稳定性增加,可能导致肝前体细胞发生恶性转化,最终导致肝癌发生;临床病人标本中发现Bcl3及肝前体细胞标志Sox9在肝癌组织中表达增加,两者呈现正相关关系,并且Bcl3及Sox9高表达与肝癌患者不良预后密切相关。
赵泽亮[5]（2020）在《外泌体负载的miR-187-3p对血管瘤干细胞普萘洛尔耐药性影响的机制研究》文中研究表明目的:血管瘤是以血管内皮细胞增殖及新生血管形成为生物学基础的血管源性肿瘤,是最常见婴幼儿良性血管性肿瘤。自2008年以来,口服普萘洛尔已逐渐成为治疗血管瘤的首选手段。但一小部分血管瘤患者存在对普萘洛尔耐药现象。普萘洛尔耐药的IH被定义为对普萘洛尔没有预期的治疗反应,即以2 mg/kg/d口服普萘洛尔至少4周后,IH在增殖期持续生长或增殖后期IH不消退。目前,对血管瘤普萘洛尔耐药的产生原因尚不清楚。在高等真核生物中,mi RNA是基因转录后表达调控的关键因素,mi RNA常具有多个靶标基因,靶向、细胞特异性外泌体递送可将mi RNA的副作用降到最低,并可提高其在单个受体细胞内的浓度。mi R-187-3p是一种新型的、与癌症相关的mi RNA,先前报道其在不同恶性肿瘤中起促进或抑制作用。但是,目前尚不清楚mi R-187-3p在血管瘤发生及发展中的作用。本课题选择成人脂肪间充质干细胞外泌体作为mi R-187-3p的载体,通过改变血管瘤干细胞内的mi R-187-3p水平,探究mi R-187-3p对血管瘤干细胞产生影响的分子机制和信号通路,从而研究mi R-187-3p改变对血管瘤干细胞普萘洛尔耐药性的影响。材料与方法:本研究分为基础和临床研究两部分。在基础研究部分中,收集血管瘤标本,采用q RT-PCR对mi R-187-3p的表达进行分析,找出mi R-187-3p与血管瘤耐药性之间的相关性。同时,在体外构建稳转的成人脂肪间充质干细胞,提取负载mi R-187-3p的成人脂肪间充质干细胞的外泌体,通过透射电镜、蛋白质免疫印迹等技术对外泌体进行表征鉴定,然后分离、鉴定、培养血管瘤干细胞,通过多向分化实验、管腔形成实验等对血管瘤干细胞进行表征鉴定,检测mi R-187-3p改变对血管瘤干细胞普萘洛尔耐药性的影响。在临床研究部分,选择纳入增殖期血管瘤患者276例,比较分析口服普萘洛尔与阿替洛尔治疗血管瘤的疗效和安全性。结果:血管瘤干细胞中的mi R-187-3p表达水平远高于正常皮肤成纤维细胞。进一步分析发现,对普萘洛尔耐药患者的血管瘤干细胞的mi R-187-3p表达水平显着低于对普萘洛尔敏感者。增殖期血管瘤患者血浆中的mi R-187-3p表达水平远低于正常对照。mi R-187-3p在普萘洛尔耐药患者血浆中的表达水平远低于普萘洛尔敏感患者。将来自于转染Cy3-pre-mi R-187-3p的成人脂肪间充质干细胞外泌体与血管瘤干细胞共培养一段时间后,激光共聚焦显微镜下可见:在血管瘤干细胞的细胞质中检测到绿色PKH67信号和红色mi R-187-3p信号,以及Cy3-mi R-187-3p信号与PKH67在血管瘤干细胞中的共定位信号。外泌体负载的mi R-187-3p抑制Hem SCs的普萘洛尔耐药性,NIPBL是Hem SC中mi R-187-3p的直接靶标,NIPBL下调抑制Hem SCs的普萘洛尔耐药性,重新引入NIPBL消除了mi R-187-3p对Hem SCs普萘洛尔耐药性的影响。临床回顾研究发现,口服普萘洛尔或阿替洛尔治疗血管瘤具有相似的疗效和耐受性（P>0.05）,未出现严重药物不良反应。与普萘洛尔相比,对大脑的潜在不良反应可能更少。结论:本研究证实,mi R-187-3p表达水平与血管瘤对普萘洛尔的耐药性呈负相关。外泌体负载的mi R-187-3p可在血管瘤干细胞间进行运输传递;NIPBL的表达在血管瘤组织中下调,mi R-187-3p通过靶向作用于NIPBL,增强血管瘤干细胞对普萘洛尔的敏感性,表明mi R-187-3p可作为血管瘤治疗的一种新的预后指标和潜在靶标。临床回顾研究发现,口服普萘洛尔或阿替洛尔治疗血管瘤具有相似的疗效和耐受性,未出现严重药物不良反应。与普萘洛尔相比,阿替洛尔的优点是给药剂量较低,对大脑的潜在不良反应可能更少。因此,阿替洛尔有望成为治疗血管瘤的首选方案之一。
张青玲[6]（2020）在《NQO1基因及阿苯达唑对皮肤鳞状细胞癌增殖、凋亡、侵袭迁移的影响及机制研究》文中研究指明研究背景:皮肤鳞状细胞癌（CSCC）是常见的皮肤恶性肿瘤之一,发病率高,具有一定的侵袭及转移能力,严重影响患者生活质量。常见发病危险因素为紫外线（UV）辐射、病毒感染、机体免疫状态等。目前治疗方法有手术切除、激光和冷冻治疗、放射治疗及药物治疗等,但部分患者疗效欠佳。NAD（P）H脱氢酶1（NQO1）是一种器官中广泛分布的黄素酶,以NAD（P）H为供体,催化醌类化合物的双电子还原为对苯二酚类化合物。据报道,NQO1基因缺失,易使小鼠受到氧化应激的影响,发展为肿瘤。也有报道称NQO1敲除可减少胶质母细胞瘤细胞的增殖,而过度表达则增加细胞增殖。基于上述不同的观点,NQO1被认为同时具有抗癌和致癌作用,这取决于不同的条件和细胞种类。由于皮肤鳞状细胞癌的发生发展与紫外线诱导的氧化应激密切相关,我们推测NQO1可能在鳞状细胞癌中起作用。阿苯达唑是一种驱虫药,但近期研究表明阿苯达唑具有抗肿瘤（如非小细胞肺癌、转移性黑色素瘤等）活性,但阿苯达唑对皮肤鳞状细胞癌细胞的作用及其作用机制的影响尚不清楚。因此,本文拟对NQO1基因及阿苯达唑对皮肤鳞状细胞癌增殖、凋亡、侵袭迁移的影响及机制进行研究,进一步揭示皮肤鳞状细胞癌的发生机制,为阿苯达唑临床应用奠定理论基础。第一部分NQO1对皮肤鳞状细胞癌增殖侵袭转移的影响及机制研究目的:检测NQO1基因对皮肤鳞状细胞癌增殖、侵袭迁移的影响,并探讨其机制,为研究鳞癌的发病机制和寻求有效诊断治疗靶点提供新的思路。方法:1.NQO1表达水平检测收集皮肤鳞状细胞癌患者肿瘤组织及肿瘤周围正常组织,进行免疫组化染色,评估鳞癌组织及正常皮肤组织中NQO1表达水平;用western blot方法检测人皮肤细胞如表皮角质形成细胞、人皮肤成纤维细胞以及鳞癌细胞SCC12和SCC13中NQO1蛋白表达水平。2.重组腺病毒的构建通过逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）等获得NQO1基因过表达或敲除的重组腺病毒。3.NQO1过表达或敲除对皮肤鳞癌细胞生物学行为的影响细胞生长实验用于评估NQO1对CSCC增殖的影响;平板克隆形成实验用于评估NQO1以及阿苯达唑对CSCC细胞平板克隆形成能力的影响;细胞侵袭实验和Wound-healing细胞划痕实验检测对CSCC细胞迁移侵袭能力的影响;4.机制研究western blot方法检测NQO1过表达或敲除对细胞增殖相关调节蛋白如Cyclin D1、Cyclin E、SOX2等表达影响,对E-cadherin、snail等EMT相关分子标志影响,以及EMT相关信号通路标志性分子如AKT、JNK和p38 MAPK等的磷酸化水平的影响,从而揭示NQO1对CSCC增殖、侵袭迁移影响的机制:用深红色染料检测细胞内ROS水平,用于评估NQO1对细胞内ROS水平的影响。结果:1.NQO1在皮肤鳞状细胞癌中的表达NQO1在CSCC损伤区几乎没有检测到或部分检测到。在CSCC病变周围的免疫细胞中可观察到NQO1免疫反应性。与角质形成细胞和成纤维细胞相比,皮肤鳞状细胞癌细胞（SCC12和SCC13）和皮肤细胞中NQO1蛋白水平略低。2.NQO1过表达或敲除对皮肤鳞癌细胞生物学行为的影响细胞生长实验:NQO1过表达导致CSCC细胞系（SCC12和SCC13细胞）细胞增殖显着降低,而NQO1敲除则增加了细胞增殖;与细胞增殖实验结果相似,NQO1降低了SCC12和SCC13细胞的克隆形成活性;细胞侵袭实验:NQO1过表达显着降低了SCC细胞侵袭能力,而NQO1敲除增加了CSCC细胞侵袭;Woundhealing细胞划痕实验:NQO1过表达减少细胞迁移,而NQO1敲除增加细胞迁移。3.NQO1对CSCC细胞增殖相关调节因子的影响NQO1过表达显着降低了细胞增殖相关调节因子如Cyclin D1、Cyclin E等的水平,NQO1敲除增加了这些细胞增殖相关调节因子的水平。4.NQO1对上皮-间质转化（EMT）相关分子标记的影响NQO1过表达使CSCC细胞E-cadherin水平升高,N-cadherin、Vimentin、Snail、Slug水平略有下降,而NQO1敲除略微降低了CSCC细胞E-cadherin的水平,而增加了其他分子的水平。5.NQO1对上皮-间质转化（EMT）相关细胞内信号通路的影响NQO1过表达轻微地降低了CSCC细胞磷酸化AKT、JNK和p38MAPK的水平,而NQO1敲除则增加了磷酸化AKT、JNK和p38MAPK的水平。6.NQO1对CSCC细胞内ROS水平的影响NQO1过表达明显降低了CSCC细胞内ROS水平,NQO1的敲除导致了CSCC细胞内ROS水平显着升高。结论:NQO1可抑制CSCC增殖、侵袭迁移;NQO1抑制皮肤鳞状细胞癌细胞增殖可能与调节增殖相关调节蛋白如细胞周期蛋白D1（CyclinD1）、细胞周期蛋白E（CyclinE）及p63等水平有关;NQO1可抑制CSCC细胞的侵袭迁移,其机制可能与调控E-cadherin、N-cadherin、波形蛋白（Vimentin）、Snail、slug等上皮间质转化（EMT）相关分子标记的表达水平有关;NQO1对皮肤鳞状细胞癌上皮-间质转化（EMT）的影响与降低EMT相关细胞内信号通路中AKT、JNK和p38mapk等的磷酸化水平有关;NQO1可降低CSCC细胞内ROS的水平。第二部分阿苯达唑对皮肤鳞状细胞癌的抗肿瘤作用及机制研究目的:研究阿苯达唑对皮肤鳞状细胞癌的抗肿瘤作用及机制。方法:1.通过MTT实验评估阿苯达唑对CSCC细胞的细胞毒性及凋亡的影响。2.通过TUNEL染色及Western blot检测阿苯达唑对CSCC细胞凋亡的影响。3.机制研究通过TOPflash实验检测阿苯达唑对CSCC细胞Wnt/β-catenin信号通路活性的影响;Westernblot及MTT实验检测阿苯达唑对内质网应激的影响;平板克隆形成实验、MTT实验及Western blot方法检测阿苯达唑对CSCC干细胞特性的影响。结果:1.阿苯达唑对皮肤鳞状细胞癌细胞凋亡的影响MTT实验显示,在阿苯达唑浓度大于等于0.2μm时可降低SCC12和SCC13细胞的生存能力;Tunel检测显示,与DMSO处理对照组相比,阿苯达唑处理组超过浓度大于等于0.5μm时凋亡细胞明显增加;Western blot示阿苯达唑诱导CSCC细胞凋亡且呈剂量依赖性。2.阿苯达唑对皮肤鳞状细胞癌的特异性作用使用正常的人表皮角质形成细胞进行对比试验显示,阿苯达唑剂量超过0.2μM时可诱导SCC13细胞凋亡,而在阿苯达唑剂量超过1.0μM仍未能诱导人表皮角质形成细胞凋亡。3.阿苯达唑对皮肤鳞状细胞癌细胞内质网应激的影响阿苯达唑增加了SCC12和SCC13细胞内质网应激诱导凋亡相关信号分子半胱天冬酶-4和半胱天冬酶-12水平。内质网应激抑制剂4-PBA预处理抑制了阿苯达唑诱导的CHOP和半胱天冬酶-12的活化。4.阿苯达唑对皮肤鳞状细胞癌细胞干细胞特性的影响阿苯达唑在无毒剂量0.05μM和0.1μM时能显着降低SCC12和SCC13细胞的克隆形成能力,导致TOPflash活性降低;这些数据一致,Western blot显示阿苯达唑处理使Wnt/β-连环蛋白明显减少。结论:阿苯达唑可诱导皮肤鳞状细胞癌细胞的凋亡;阿苯达唑诱导CSCC细胞凋亡具有特异性;阿苯达唑诱导CSCC细胞内质网应激;阿苯达唑能作用于Wnt/β-连环蛋白信号通路,降低CSCC的干细胞特性。
姚舜[7]（2020）在《AAMP调控非小细胞肺癌细胞增殖和转移的分子机制》文中研究说明研究背景AAMP（Angio-associated Migratory Cell Protein）最初在造血系统细胞中发现,它含有两个immunoglobulin样结构域,一个肝素结合序列和一个WD40重复结构域。富含WD40结构域的蛋白在信号转导、表观遗传修饰、蛋白质降解、基因表达调节、DNA损伤修复和细胞周期调控等多方面起着重要作用,这也预示着AAMP很可能也在多种细胞活动中起着调控作用。同时,AAMP的亚细胞分布较为广泛,在细胞外基质、细胞膜和细胞质基质中均能检测到表达,这也同样说明AAMP很可能是个多功能蛋白。AAMP在多种细胞中均有表达,如内皮细胞、滋养层细胞和活化T淋巴细胞等,它在促进血管内皮细胞黏附迁移和免疫调节等过程中发挥重要作用。和正常组织相比,AAMP在肿瘤细胞中往往高表达,这引起了人们的研究兴趣,但目前AAMP在肿瘤中的作用还不十分清楚,更多功能还有待深入探究。增殖作为基本生命活动之一在个体生长和繁殖等多方面都起着重要作用。增殖过程是一个循环的周期活动,称作细胞周期,在细胞中严格受控。肿瘤细胞增殖过程发生异常,导致其可以无限增殖,形成肿瘤组织,最终影响机体正常生理功能。因此,深入探索肿瘤细胞增殖失控的机理对潜在靶点的发现和药物研发至关重要。EGFR是一个重要的酪氨酸激酶受体,它可以激活包括RAS-ERK1/2、PI3K-AKT、PLCγ和SRC等多条信号通路,进而促进细胞存活、增殖和抗凋亡等,最终对个体生长发育起着重要作用。在EGFR激活及失活过程中,二聚化的形成和解聚起着重要的“开关”作用,当EGFR发生突变导致其持续二聚化而不能解聚后,便会引起肿瘤发生。尽管有大量研究,调控EGFR二聚化的机理仍不十分明确,还需进一步探索。EGFR突变常见于非小细胞肺癌细胞（NSCLC cells）,最常见的为19外显子部分缺失和L858R点突变,这两处突变使得EGFR持续活化,促进肿瘤细胞增殖。针对突变EGFR的靶向药物EGFR酪氨酸激酶抑制剂EGFR TKI已广泛应用于临床,尽管前期疗效显着,但长期治疗的病人绝大多数对该药物产生耐受。耐药的原因多种多样,其中60%耐药患者是因为发生了 T790M的点突变。因此,寻找更为有效的治疗靶点意义重大。除了无限增殖的能力,肿瘤的另一大特点是具备转移能力,这也是癌症患者致死的主要原因。转移主要包括迁移和侵袭两大过程,而迁移和侵袭的进行依赖伪足的形成。伪足的形成和消失依赖于细胞骨架的解聚和组装,其中,主要成分之一的微丝起着重要作用。微丝的解聚和组装是一个复杂的动态变化过程,包括成核、延伸、稳定和解聚等过程,期间离不开众多蛋白参与,GTPase便是一类重要的调控蛋白。GTPase蛋白家族中研究最多的是RAC、CDC42和RHO,其中CDC42参与到微丝的成核和延伸阶段,另外,CDC42-PAK-LIMK-CFL信号通路也参与到微丝的稳定过程中。GTPase蛋白有活化和失活两种形式,GTP结合可激活GTPase,而GDP结合则使其失活,GTPase蛋白在两种状态之间的切换也受到多种蛋白的调控,包括GEF、GAP和GDI等,其中GAP蛋白是GTP酶激活蛋白,促进GTP水解为GDP,对GTPase起着负调控的作用。由于转移过程十分复杂,目前人们对其调控机制并不十分清楚,深化对转移的认识并寻找抑制转移的靶点是亟待解决的问题。实验方法和结果通过Kaplan-Meier Plotter数据库分析发现,在肺癌患者中,AAMP表达水平与病人的生存率呈负相关,说明AAMP在肺癌中起着重要作用。接下来,我们以NSCLC细胞为实验材料进行了探究。在NSCLC细胞系中敲低AAMP,经过长期培养发现,AAMP敲低后细胞增殖速度减慢,为进一步明确AAMP是否影响增殖,我们在NSCLC细胞中敲低和过表达AAMP,并进行倒置相差显微镜和高内涵活细胞工作站持续拍照、EdU掺入实验、SRB细胞存活分析和平板克隆形成实验。同时,利用慢病毒感染方法成功构建了稳定敲低AAMP的H1792细胞系,在免疫缺陷的B-NSG小鼠中进行了异种瘤移植实验,长期饲养小鼠并观察其成瘤情况。通过数据统计分析,上述实验结果均显示AAMP确实能够促进NSCLC细胞的增殖、存活及成瘤能力。接下来,我们探究了 AAMP的调控机制。在4种NSCLC细胞系Calu-1、H1792、H1299 和 H157 中敲低 AAMP 的表达,Western Blot 结果显示,AAMP敲低后,CCND1的表达水平下降,细胞的增殖能力减弱。随后的平板克隆和EdU实验结果显示,当回复CCND1的表达后,AAMP的敲低便不会抑制细胞增殖。这说明AAMP敲低后,通过下调CCND1的表达水平,进而抑制细胞增殖。接下来,Western Blot实验表明,当在Calu-1和H1792细胞中敲低AAMP后,ERK1/2的磷酸化受到了抑制,而在A549和H460细胞中过表达AAMP后,ERK1/2的磷酸化水平增强。同时,使用MEK抑制剂U0126抑制ERK1/2的活化后,AAMP上调CCND1的能力受到了抑制。上述实验表明,在NSCLC细胞中,AAMP可激活ERK1/2-CCND1信号轴,最终促进细胞增殖。那么,AAMP是如何促进ERK1/2的活化呢?通过查找资料发现,AAMP与EGFR很可能存在相互作用。随后,我们进行了免疫共沉淀（co-immunoprecipitation,co-IP）实验进行验证,结果显示 AAMP 与 EGFR 的胞内结构域相互作用。为进一步探究AAMP和EGFR结合的意义,我们在Calu-1和H1792中敲低AAMP的表达,在H460和A549中过表达AAMP,WB实验表明AAMP的敲低对EGFR蛋白水平没有影响,但能抑制EGFR活性位点Y1173的磷酸化以及下游ERK1/2信号通路的活化,而过表达AAMP后,则结果相反。在异种瘤移植实验中,和对照组相比,由稳定敲低AAMP的H1792细胞系形成的体内肿瘤中,EGFR信号通路同样受到抑制。随后的回补实验表明,EGFR的过表达能恢复由AAMP敲低引起的ERK1/2磷酸化下调。上述体内外实验结果表明,AAMP能够与EGFR相互结合并通过激活EGFR来激活ERK1/2,从而促进细胞增殖。接下来,通过免疫共沉淀实验发现,AAMP的敲低能抑制EGFR的二聚化,说明AAMP通过促进二聚化来发挥对EGFR的激活作用。AAMP可激活EGFR,那么EGFR对AAMP是否存在反馈性调控?随后,在EGFR野生型细胞系H1299、H1792以及EGFR突变型细胞系H1650和HCC827中敲低EGFR的表达,在A549和H1792中过表达EGFR持续激活型质粒,WB结果可以看出,EGFR的敲低或过表达对AAMP的水平均没有影响,说明EGFR对AAMP的表达并无直接的影响。EGFR突变常发生于NSCLC患者中,突变的EGFR可不依赖配体的存在而持续活化。尽管针对EGFR突变设计了靶向药物,但耐药的产生大大削弱了药物疗效。AAMP既然可参与EGFR活化过程中,那么其表达水平的下调是否可增强靶向药物TKI的疗效呢?接下来在EGFR突变且耐药细胞系H1975中敲低AAMP表达并加药物icotinib处理,通过流式细胞术、Western Blot和SRB实验检测细胞的凋亡率和存活率,实验结果表明AAMP的敲低能减弱H1975对icotinib的耐药性。随后的co-IP实验表明AAMP和EGFR胞内段的ATP结合区相互作用,并且与突变的EGFR结合更为紧密。由于TKI同样结合于EGFR的ATP结合位点,因此,我们提出假说,当EGFR突变后,AAMP与之结合能力增强,一方面进一步促进EGFR的二聚化活化,另一方面,AAMP可能与TKI竞争性的和EGFR的ATP结合区结合,进一步抑制了 TKI与EGFR的嵌合,从而增强了肿瘤细胞的TKI耐药。另外,EGFR活化后还表现出对化疗药物的耐药,那么是否AAMP也会影响化疗药物对NSCLC细胞的杀伤呢?通过相关实验发现,在EGFR野生型细胞系H1792和Calu-1细胞系中敲低AAMP的表达并加化疗药物doxorubicin处理,WB和流式细胞术均检测到细胞凋亡率增加,而在H460和A549细胞中过表达AAMP,细胞凋亡减少。上述结果说明AAMP能增强NSCLC细胞的耐药能力。在探究AAMP敲低对NSCLC表型影响的过程中,通过划痕和侵袭实验发现AAMP的敲低还能抑制NSCLC细胞迁移及侵袭。下一步,我们就相关机制进行了探索。细胞运动离不开伪足的形成,AAMP是否影响该过程呢?在NSCLC细胞系Calu-1中敲低AAMP,在H460中过表达AAMP,使用TRITC-phalloidin对微丝骨架进行荧光标记,结果发现,AAMP能够促进肿瘤细胞丝状伪足的形成。以上实验表明,AAMP能够通过调控伪足的形成来影响细胞迁移和侵袭。伪足的形成受到细胞骨架的调控,多种GTPase蛋白均参与其中。co-IP实验发现,AAMP和CDC42存在相互结合。利用CDC42活性检测试剂盒检测AAMP敲低和过表达情况下CDC42的活性情况,结果发现,AAMP的敲低能抑制CDC42激活,而过表达后则促进CDC42活化。表明AAMP对CDC42的活性有一定的调控作用。CDC42有着多种活性调节蛋白,其中GAP和GEF作用重大。通过co-IP实验发现,AAMP和CDC42的负调控蛋白ARHGAP1存在相互结合,并且在H460和A549细胞中通过co-IP实验发现,AAMP能够抑制ARHGAP1和CDC42的结合,这说明AAMP可通过抑制ARHGAP1和CDC42的结合来促进CDC42的活化。研究结论综上所述,本研究发现:1.AAMP能够促进NSCLC细胞增殖、克隆形成及体内成瘤。AAMP通过和EGFR结合促进其二聚化进而激活下游ERK1/2信号通路,ERK1/2的活化能够上调CCND1的表达,最终促进了肿瘤细胞增殖。2.AAMP能够增强肿瘤细胞对EGFR-TKI和化疗药物的抗药性。3.AAMP通过抑制ARHGAP1和CDC42的结合来激活CDC42,进而促进丝状伪足的形成,最终促进了肿瘤细胞的迁移和侵袭。这些研究结果为更深入的理解非小细胞肺癌细胞增殖和迁移的具体机制,开发新的肿瘤治疗靶点提供了理论依据。
陈雷[8]（2020）在《MEGF6、KLF13和BTF3L4在仿刺参肠再生过程中的作用及调控机制》文中研究说明仿刺参（Apostichopus japonicus）是我国黄、渤海主要的经济类棘皮动物。当它遇到敌害生物伤害性刺激、攻击或不良自然环境影响时,会表现出特殊的防御行为——“吐脏”,即将大部分消化道及与之相连的组织器官（呼吸树、性腺等）泄出,在适宜时再生出一套内脏。然而,如果环境条件持续恶劣、或者是幼参发生吐脏,往往引起大量死亡,给水产业造成巨大损失。海参类的这种特殊的再生特征,也引起了医学界再生医学研究领域的关注。关于再生的分子调控机制研究,已经有一些报道,但有关MEGF6、KLF13和BTF3L4对仿刺参再生过程的调控机制,目前还未见报道。MEGF6为多功能表皮生长因子,含有和表皮生长因子（EGF）相近的结构和功能特征,往往有30余个EGF样结构域。MEGF6在促进胚胎发育、维持机体内环境稳态方面起关键作用,表现在调控细胞生长、迁移等。KLF13为基础转录因子,广泛分布于生物细胞中,其C端为DNA结合域,有3个保守的Cys2/His2（C2H2）锌指结构。KLF13通过锌指结构结合靶基因启动子、增强子区富含CACCC盒或GC盒的DNA序列,以此激活转录表达,发挥调控细胞增殖、分化、周期进程等作用。BTF3为基础转录因子,具有典型的NAC结构域,BTF3普遍存在于多种动、植物及微生物中,具有双重身份:?属于基本转录因子,与RNA聚合酶II结合,参与调控基因转录;?属于NAC家族,通过与蛋白结合防止错误折叠,调节蛋白合成与降解。本文以仿刺参为实验材料,利用高通量测序技术（BGISEQ-500平台）构建了仿刺参肠再生5d、10d的转录组;采用RACE技术克隆了Aj-megf6、klf13、btf3l4的基因全长;采用IF技术确定了Aj-MEGF6、KLF13和BTF3L4的亚细胞定位;采用q PCR法分析了Aj-megf6、klf13、btf3l4以及egfr、wnt6基因m RNA在肠再生过程中的表达模式;利用WB技术分析了Aj-MEGF6、KLF13和BTF3L4以及通路相关作用蛋白（EGFR、SNAI2、CDH1、CREB1、CDK2、Cyclin D1、WNT6、BMI1）在肠再生过程中的表达变化,并研究了调控机制。Aj-MEGF6、KLF13和BTF3L4在肠再生过程中的调控机制研究对探索仿刺参再生机理具有较为重要的理论意义,对预防或避免仿刺参苗种培育、养成过程中因吐脏而造成死亡或减产具有潜在的应用价值。本研究的实验结果如下:1、获得对照组、再生5d组、再生10d组的Clean Reads分别为43811752条、42987312条、43507122条,与基因组、基因集的平均比对率分别为44.35%、28.36%;共检测到表达的基因为27766个。相比对照组,再生5d组有5255个基因上调,3849个基因下调;再生10d组有4179个上调,4780个下调。在再生5d、10d组中,megf6、klf13、btf3l4均显着上调。2、Aj-megf6基因c DNA全长是5665bp,编码1604个氨基酸,含37个EGF样的结构域;预测Aj-MEGF6相对分子量为172.5k Da;有信号肽,是分泌蛋白;为亲水性、非跨膜蛋白;有53个磷酸化位点;亚细胞定位预测该蛋白52.2%在细胞核,17.4%在线粒体,8.7%在细胞膜,8.7%在细胞质,4.3%在分泌系统囊泡,4.3%在高尔基体,4.3%在细胞外。通过MEGF6氨基酸多序列比对,发现仿刺参与其它18种生物的序列相似性为38.59～49.07%,其中与紫球海胆的最相似;NJ系统进化树表明,仿刺参与紫球海胆、长棘海星聚为一支,该结果符合仿刺参的分类及进化地位。Aj-klf13基因c DNA全长是2496bp,编码284个氨基酸,含3个C2H2锌指结构域;预测Aj-KLF13蛋白相对分子量为32.5k Da;该蛋白无信号肽,不是分泌蛋白;为亲水性、非跨膜蛋白;有26个磷酸化位点;亚细胞定位预测该蛋白95.7%在细胞核,4.3%在液泡。通过KLF13氨基酸序列比对,发现仿刺参与其它19种生物的序列相似性为35.64～49.83%,其中与紫球海胆的最相似;NJ系统进化树表明,仿刺参与紫球海胆、长棘海星聚为一支。Aj-btf3l4基因c DNA全长是1099bp,编码161个氨基酸,有NAC结构域;预测Aj-BTF3L4相对分子量为17.9k Da;该蛋白无信号肽,不是分泌蛋白;为亲水性、非跨膜蛋白;有5个磷酸化位点;亚细胞定位预测该蛋白56.5%在细胞核,26.1%在线粒体,13.0%在细胞质,4.3%在囊泡分泌系统。通过BTF3L4氨基酸序列比对,发现仿刺参与其它14种生物的序列相似性为54.55～58.43%,其中与紫球海胆的最相似;NJ系统进化树表明,仿刺参与紫球海胆聚为一支。3、在肠再生过程中,Aj-megf6、klf13、btf3l4、egfr和wnt6基因m RNA水平的表达模式相似,即先升高再下降。从3d开始上升,6～12d时到达峰值（分别为对照组水平的126.47、53.36、4.19、5.32、8.32倍）,15～21d时下调至对照组水平。4、通过IF的亚细胞定位结果显示,Aj-MEGF6主要分布在细胞质和细胞外,与生物信息学预测的结果（主要在细胞核）是不同的;Aj-KLF13、BTF3L4主要在细胞核,和生物信息学预测的相同。5、Aj-MEGF6、KLF13、BTF3L4、EGFR、WNT6蛋白的表达模式与基因m RNA的相似,即为先升高再下降的趋势。从3d开始上升,6～12d时到达峰值（分别为对照组水平的9.32、1.64、1.26、3.89、3.59倍）,15～21d时下调至对照组水平。相关作用蛋白SNAI2、CREB1、CDK2、Cyclin D1、BMI1在肠再生过程中的表达模式与Aj-MEGF6、KLF13、BTF3L4基本一致,分别在6～12d时到达峰值,然后逐渐下调;而CDH1的变化趋势与之相反,即呈先下降再升高,在6d时达最低点。6、MEGF6是ECM的主要成分之一,能调控维持组织的完整性。仿刺参肠再生过程中MEGF6、EGFR高表达,促进二者结合,通过Tgfβ/Smad信号途径介导来上调SNAI2。SNAI2可诱导Cyclin D1高表达;WNT6高表达,在激酶参与下,也可引起Cyclin D1上调表达,有助细胞增殖。而KLF13是Cyclin D1启动子的有效激活因子,且激活过程可以被GATA4增强,促进Cyclin D1转录表达。同时,CREB可与Cyclin D1中的CRE序列结合,促进基因转录,上调Cyclin D1基因表达。CDKs可与Cyclin结合成异二聚体,以其活性催化底物磷酸化,促进细胞周期进行。同时SNAI家族也是CDH1的抑制因子之一,当SNAI2高表达,CDH1受到抑制后,会诱导EMT,促进细胞增殖及转移。BTF3作为BMI1的上游,其高表达可抑制BMI1的泛素化降解,而BMI1作为可以控制胚胎干细胞多能性和早期胚胎发育的关键调节因子,可介导Wnt等通路,同样促进EMT,调控细胞更新。而间充质细胞的自我更新和多向分化潜能,是发育、伤口愈合的基础。仿刺参肠系膜增厚处的这种细胞为肠腔上皮再生提供了细胞来源,细胞再经分裂、增殖实现仿刺参肠组织的再生重建。
李园园[9]（2019）在《NEK5和PTHLH在小鼠卵母细胞成熟和着床前胚胎发育中作用的研究》文中研究指明哺乳动物卵母细胞成熟和着床前胚胎发育对子代遗传物质的传递和后代的繁殖具有重要的意义。研究发现,NEK5和PTHLH在有丝分裂过程中发挥重要的作用,本文对NEK5和PTHLH在小鼠卵母细胞成熟和着床前胚胎发育中作用及作用机制进行探讨。本研究主要开展的工作和结果如下:（1）NEK5在小鼠卵母细胞成熟和着床前胚胎发育中作用的研究本文对NEK5在小鼠卵母细胞成熟和着床前胚胎发育过程中的表达、定位和功能进行研究。通过Western blotting检测NEK5在小鼠卵母细胞成熟过程中的表达情况,NEK5在GV～MII期均有表达,在GV期的表达水平最高。将体外转录获得的Myc-Nek5 m RNA以400 ng/μl的浓度注射到GV期卵母细胞中,通过用anti-Myc抗体进行免疫荧光染色检测NEK5的定位。结果显示,NEK5在GV期定位于细胞质中,在GVBD期定位于染色体周围,在Pro-MI～MII期定位在纺锤体上。为了研究NEK5在小鼠卵母细胞成熟过程中的作用,将Nek5 si RNA（small interfering RNA）注射到GV期卵母细胞中以敲降Nek5的表达。研究结果显示,Nek5的敲降导致小鼠卵母细胞的GVBD率降低,CDK1的活性降低,卵母细胞减数分裂恢复失败,但不影响CDC25B易位到卵母细胞的生发泡。进一步研究发现,Wee1B的敲降和cyclin B1的过表达可以挽救Nek5敲降导致的卵母细胞的减数分裂恢复失败,但Cdc25的过表达不能挽救Nek5敲降导致的卵母细胞的减数分裂恢复失败。也对NEK5在卵母细胞减数分裂中/后期转换中的作用进行研究。研究结果显示,Nek5的敲降导致小鼠卵母细胞减数分裂第一极体排出率降低,使卵母细胞被阻滞在第一次减数分裂的MI期,导致卵母细胞纺锤体的长度变短和面积减小以及纺锤体组装检验点蛋白Bub3在着丝粒的持续定位。除此之外,本文还对NEK5在小鼠着床前胚胎发育过程中的表达和功能进行了研究。通过Western blotting检测了NEK5在小鼠着床前胚胎发育过程中的表达,通过将Nek5 si RNA注射到1-cell期胚胎中敲降Nek5的表达研究NEK5在小鼠着床前胚胎发育过程中的作用。研究结果显示,NEK5在着床前胚胎发育的各个阶段均有表达,在囊胚期的表达水平最高,Nek5的敲降导致大多数胚胎停滞在2-cell期,严重阻碍小鼠着床前胚胎的发育。本项研究首次证明,NEK5在小鼠卵母细胞成熟和着床前胚胎发育过程中发挥重要的作用。（2）PTHLH在小鼠卵母细胞成熟和着床前胚胎发育中作用的研究前期研究发现,Pthlh的敲降对小鼠卵母细胞成熟过程没有影响,PTHLH在着床前胚胎发育过程中发挥重要的作用,但是PTHLH影响小鼠着床前胚胎发育过程中囊胚形成、转录因子/多能性基因表达以及组蛋白乙酰化修饰的调控机制并不清楚。本研究着重探讨了PTHLH影响小鼠着床前胚胎发育的作用机制。首先,本研究通过显微注射的方法对小鼠着床前胚胎中的Pthlh进行敲降,发现Pthlh的敲降导致囊胚形成率的降低,与之前的研究结果一致。其次,还对各时期的胚胎发育进行统计观察发现,Pthlh的敲降导致2-cell、4-cell、8-cell和morula期的胚胎发育率均显着降低。桑椹期胚胎细胞数目的统计结果显示,Pthlh的敲降导致桑椹期胚胎细胞数目的显着降低。通过RT-PCR分别检测Pthlh敲降的着床前各时期胚胎中Ccnd1和Akt1/2的m RNA水平,应用Western blotting和免疫荧光方法检测Pthlh敲降的着床前各时期胚胎中cyclin D1、AKT和p-AKT（Thr308）的蛋白水平。Western blotting结果显示,Pthlh的敲降导致2-cell、4-cell、8-cell和morula期胚胎中cyclin D1和p-AKT（Thr308）的蛋白水平显着降低。免疫荧光结果也显示,Pthlh的敲降导致cyclin D1和p-AKT（Thr308）的荧光强度的降低。RT-PCR结果显示,Ccnd1、Akt1和Akt2的m RNA水平没有明显变化。通过RT-PCR检测Pthlh敲降的着床前各时期胚胎中Hdac4的m RNA水平,通过Western blotting和免疫荧光方法检测Pthlh敲降的着床前各时期胚胎中HDAC4的蛋白水平和定位情况。Western blotting和RT-PCR结果显示,Pthlh的敲降对2-cell、4-cell、8-cell和morula期胚胎中HDAC4的蛋白水平和m RNA水平没有影响。免疫荧光结果显示,Pthlh的敲降导致着床前胚胎细胞核中HDAC4的增加。通过RT-PCR和Western blotting检测Pthlh敲降胚胎中β-catenin、RUNX2、CDK4和E2F的表达水平。结果显示,Pthlh的敲降对胚胎中β-catenin、RUNX2和CDK4的蛋白表达没有影响,但导致转录因子E2f的m RNA水平显着降低。此外,还通过在GV期卵母细胞和1-cell胚胎中注射外源的MycPthlh m RNA进行Pthlh的过表达。结果显示,Pthlh的过表达对小鼠卵母细胞成熟和着床前胚胎发育没有影响。本项研究首次证明PTHLH通过AKT/cyclin D1通路和HDAC4的核易位参与调控小鼠着床前胚胎发育过程中胚胎卵裂、囊胚发育、多能性基因的表达以及组蛋白的乙酰化修饰。此外,还证明Pthlh过表达不影响小鼠卵母细胞成熟和着床前胚胎发育。综上所述,本研究首次发现NEK5和PTHLH在小鼠卵母细胞成熟和着床前胚胎发育中发挥重要的作用。本文对深入理解哺乳动物卵母细胞成熟和早期胚胎发育分子机制具有重要意义,为开展大动物研究提供借鉴和指导,为人类健康提供理论基础。
姜云瀚[10]（2019）在《活化的β-catenin通过上调ECT2促进缺氧诱导多倍体心肌细胞胞质分裂的研究》文中提出研究背景与意义:心血管疾病导致心肌细胞死亡是最终引起心功能衰竭的根本原因。预防心肌细胞损伤和促进心肌再生是理想的措施。近年来关于心脏干细胞研究的质疑,使得心肌再生的研究陷入了困境。心肌肥厚性生长中,心肌细胞形成多核多倍体细胞。而胞质分裂障碍是关键原因,其确切机制尚不清楚。β-catenin是细胞周期调控的关键因子。有研究报道β-catenin能促进心肌细胞进入细胞周期,但β-catenin对胞质分裂的作用不清楚。本研究着重研究调控β-catenin对多倍体心肌细胞胞质分裂的作用及可能分子机制,探索多倍体心肌细胞在心肌损伤修复和再生中的作用。研究方法:第一部分:紫绀型与非紫绀型先心病患者心肌细胞的多倍体情况和细胞周期情况的差异研究本研究通过新桥医院伦理委员会批准。2014年10月至2016年10月在新桥医院心血管外科的20名符合纳入标准并同意参加本研究的患者（10名紫绀型先心病患者和10名非紫绀型先心病患者）纳入研究。诊断主要依据我院术前心脏彩超结果或CT结果,并在术中证实。纳入标准:需行右室流出道疏通术的先心病患者;四肢血氧饱和度（SpO2）差异≤2%;年龄<18岁;排除多次行心脏手术和其他系统疾病。患者分组依据是术前未氧疗时动脉SpO2。SpO2≥95%的患者为非紫绀组,SpO2≤85%的患者为紫绀组。1.免疫荧光检测两组患者心肌细胞的核数和横截面积,pH3阳性、Aurora B阳性和kif20a阳性心肌细胞的情况。2.流式检测两组心肌细胞倍体数。第二部分:缺氧调节心肌细胞周期活性诱导多倍体化的初步机制研究建立动物缺氧模型:将12只8周大C57BL/6J雄性小鼠随机分为缺氧组（n=6）和常氧组（n=6）。缺氧组小鼠在缺氧仓（氧浓度为9.9%-10.1%）中饲养4周,常氧组在常氧下饲养4周。建立细胞缺氧模型:原代新生大鼠心肌细胞分为缺氧组（n=6）和常氧组（n=6）。缺氧组细胞置于缺氧细胞培养箱（94%N2,5%CO2,1%O2,37℃）培养48h。常氧组细胞置于细胞培养箱（74%N2,5%CO2,21%O2,37℃）培养48h。1.免疫荧光比较体外和体内实验两组心肌细胞倍体数、核数、核倍体数、多倍体分布情况,以及Ki67阳性、pH3阳性、Aurora B阳性和kif20a阳性心肌细胞的情况。2.流式检测体外和体内实验两组心肌细胞核的倍体数。第三部分:缺氧抑制β-catenin的基因调控活性参与缺氧心肌细胞多倍体化的机制研究建立动物缺氧模型和细胞缺氧模型。处理方法同第一部分。1.生物信息学分析找出多倍体和二倍体心肌细胞的差异基因,并进行GO分析和KEGG分析,找出可能的关键调控基因。2.Western Blot（WB）检测临床标本、体外和体内实验的两组β-catenin和HIF-1α的在胞核和胞浆的表达情况。免疫荧光验证β-catenin在胞核水平的变化。3.RT-qPCR检测体外和体内实验两组β-catenin下游靶基因cyclin d1的转录情况。4.免疫共沉淀检测体外实验缺氧组β-catenin,HIF-1α和TCF4三者的相互作用。第四部分:活化的β-catenin调控心肌细胞细胞周期活性促进心肌细胞二倍体化的初步研究建立动物干预模型:将18只8周大C57BL/6J雄性小鼠随机分为激动剂组（n=6）,抑制剂组（n=6）和对照组（n=6）。在缺氧3周后,根据缺氧仓内小鼠体重,每天分别给激动剂组、抑制剂组和对照组小鼠腹腔内注射2 mg/kg的激动剂CHIR99021,1.75mg/kg的抑制剂IWR-1和等体积的DMSO,注射一周。建立细胞干预模型:按照感染复数为10计算合适的病毒量,将过表达腺病毒Adβ-catenin（过表达组）,沉默腺病毒Adshβ-catenin（沉默组）,空腺病毒AdGFP（对照组）转染至原代新生大鼠心肌细胞,再缺氧48h。1.WB检测β-catenin在胞核和胞浆的含量变化,验证体外和体内实验的干预效果。RT-qPCR检测β-catenin下游靶基因的转录情况。2.免疫荧光比较体外和体内实验心肌细胞倍体数、核数、核倍体数和多倍体分布情况、心肌细胞横截面积,以及Ki67阳性、pH3阳性、Aurora B阳性和kif20a阳性心肌细胞的情况。3.流式检测体外和体内实验心肌细胞核的倍体数。4.CCK8和心肌细胞计数分别检测体外和体内实验心肌细胞数量变化。5.小动物心导管检测小鼠心脏功能变化。第五部分:活化的β-catenin上调ECT2促进四倍体心肌细胞胞质分裂参与心肌再生的机制研究建立动物干预模型和细胞干预模型。处理参照第四部分。1.WB和RT-qPCR分别检测Ect2的转录和表达情况。2.生物信息学预测Ect2非编码区上TCF4的结合位点,染色体免疫共沉淀-qPCR（ChIP-qPCR）验证TCF4在Ect2非编码区的结合位点。3.免疫荧光检测ECT2,Anillin和MgcRacGAP三者的定位情况,明确ECT2对Anillin的作用。4.流式检测分选的四倍体心肌细胞的倍体数。研究结果:第一部分:紫绀型与非紫绀型先心病患者心肌细胞的多倍体情况和细胞周期情况的差异研究1.收集患者的一般情况:非紫绀组（4名男性,6名女性）性别组成和紫绀组（5名男性,5名女性）无统计学差异（P>0.05）。紫绀组年龄（6.65±8.83岁）和非紫绀组（3.52±3.6岁）无统计学差异（P>0.05）。非紫绀组血氧饱和度高于紫绀组（97.50±1.63%vs 68.57±11.37%,P<0.05）2.紫绀组心肌细胞的平均细胞核数多于非紫绀组（1.29±0.20 vs 1.03±0.01,P<0.05）;紫绀组心肌细胞的平均倍体数多于非紫绀组（3.61±0.03c vs 2.28±0.18c,P<0.05）;紫绀组心肌细胞的平均核倍体数大于非紫绀组（2.34±0.09c vs 2.04±0.05c,P<0.05）;紫绀组心肌细胞的横截面积大于非紫绀组（相对于非紫绀组的相对面积1.64±0.10 vs 0.98±0.10,P<0.05）。3.紫绀组pH3阳性心肌细胞比例高于非紫绀组（11.38±2.41%vs 2.64±1.69%,P<0.05）;紫绀组Aurora B阳性心肌细胞比例与非紫绀组无明显差异（0.38±0.44%vs0.10±0.25%,P>0.05）;紫绀组kif20a阳性心肌细胞比例与非紫绀组无明显差异（0.19±0.24%vs 0.44±0.36%,P>0.05）。第二部分:缺氧调节心肌细胞周期活性诱导多倍体化的初步机制研究1.动物缺氧实验的情况:缺氧组心脏重量与体重比值大于常氧组（5.22±0.48 vs4.38±0.08 mg/g,P<0.05）,而心脏重量与胫骨长度比值小于常氧组（3.63±0.32 vs 4.73±0.42 mg/mm,P<0.05）。缺氧组肺脏重量与体重的比值大于常氧组（9.44±0.33 vs 6.01±0.14 mg/g,P<0.05）,肺脏重量与胫骨长度的比值与常氧组无明显差异（6.55±0.21 vs 6.48±0.58 mg/mm,P>0.05）。2.动物缺氧实验中,缺氧组心肌细胞的平均细胞核数多于常氧组（2.04±0.09 vs1.64±0.09,P<0.05）;缺氧组心肌细胞的平均倍体数多于常氧组（4.96±0.37c vs 3.40±0.47c,P<0.05）;缺氧组心肌细胞的平均核倍体数多于常氧组（2.96±0.05c vs 2.48±0.04c,P<0.05）。缺氧组心肌细胞的横截面积比常氧组大（相对于常氧组的相对面积1.91±0.28 vs 0.95±0.25,P<0.05）;缺氧组Ki67阳性心肌细胞比例高于常氧组（5.15±1.78%vs 1.04±1.61%,P<0.05）;缺氧组pH3阳性心肌细胞比例高于常氧组（1.28±0.56%vs 0±0%,P<0.05）;缺氧组Aurora B阳性心肌细胞比例与常氧组无明显差异（0±0%vs 1.87±3.23%,P>0.05）;缺氧组kif20a阳性心肌细胞比例与常氧组无明显差异（0.45±0.91%vs 0.93±1.07%,P>0.05）。3.细胞缺氧实验中,缺氧组心肌细胞的平均细胞核数多于常氧组（1.16±0.06 vs1.04±0.03,P<0.05）;缺氧组心肌细胞的平均倍体数多于常氧组（6.05±0.71c vs 4.55±0.19c,P<0.05）;缺氧组心肌细胞的平均核倍体数多于常氧组（2.20±0.07c vs 2.02±0.03c,P<0.05）。缺氧组心肌细胞的横截面积比常氧组大（相对于常氧组的相对面积1.61±0.23 vs 1.00±0.10,P<0.05）;缺氧组Ki67阳性心肌细胞比例高于常氧组（18.81±11.37%vs 6.99±3.32%,P<0.05）;缺氧组pH3阳性心肌细胞比例高于常氧组（6.67±4.3%0 vs 2.29±2.47%,P<0.05）;缺氧组Aurora B阳性心肌细胞比例与常氧组无明显差异（0±0%vs 0.55±1.75%,P>0.05）;缺氧组kif20a阳性心肌细胞比例与常氧组无明显差异（0±0%vs 0.28±0.85%,P>0.05）。第三部分:缺氧抑制β-catenin的基因调控活性参与缺氧心肌细胞多倍体化的机制研究1.多倍体心肌细胞与二倍体比有420个差异基因,功能集中在细胞周期和细胞分裂。β-catenin调控约1/5的细胞周期和细胞分裂的基因。2.临床标本上,紫绀组胞核内β-catenin的含量高于非紫绀组（0.74±0.17 vs 0.42±0.12,P<0.05）;紫绀组胞核内HIF-1α的含量高于非紫绀组（0.71±0.06 vs 0.33±0.05,P<0.05）。3.动物缺氧实验中,缺氧组胞核内β-catenin的含量高于常氧组（2.86±0.57 vs 0.98±0.29,P<0.05）;缺氧组胞核内HIF-1α的含量高于常氧组（2.79±0.96 vs 0.82±0.53,P<0.05）;缺氧组Cyclin D1转录水平与常氧组无明显差异（0.85±0.25 vs 1.01±0.08,P>0.05）。4.细胞缺氧实验中,缺氧组胞核内β-catenin的含量高于常氧组（1.04±0.11 vs 0.43±0.19,P<0.05）;免疫荧光提示β-catenin定位在胞核。缺氧组Cyclin D1转录水平与常氧组无明显差异（0.92±0.11 vs 1.01±0.11,P>0.05）。5.缺氧下,β-catenin与HIF-1α的结合比与TCF4明显（相对于HIF-1α结合组的灰度值1.00±0.16 vs 0.37±0.09,P<0.05）。第四部分:活化的β-catenin调控心肌细胞细胞周期活性促进心肌细胞二倍体化的初步研究1.在体外实验,β-catenin过表达组核内β-catenin含量高于β-catenin沉默组和对照组（1.20±0.11 vs 0.53±0.08 vs 0.77±0.10,P<0.05）;β-catenin过表达组Cyclin D1转录水平高于β-catenin沉默组和对照组（4.53±0.90 vs 1.19±0.40 vs 0.97±0.13,P<0.05）。2.在体内实验,β-catenin激动剂组核内β-catenin含量高于β-catenin抑制剂组和对照组（1.17±0.10 vs 0.85±0.21 vs 0.71±0.12,P<0.05）;β-catenin激动剂组Cyclin D1转录水平高于β-catenin抑制剂组和对照组（3.72±0.45 vs 0.99±0.30 vs 1.15±0.25,P<0.05）。3.在体外实验,β-catenin过表达组心肌细胞的平均细胞核数低于β-catenin沉默组和对照组（1.07±0.04 vs 1.25±0.09 vs 1.22±0.09,P<0.05）;β-catenin过表达组心肌细胞的平均倍体数低于β-catenin沉默组和对照组（2.33±0.05c vs 4.77±0.09c vs 4.01±0.12c,P<0.05）;β-catenin过表达组心肌细胞的平均核倍体数低于β-catenin沉默组和对照组（2.02±0.03c vs 2.23±0.08c vs 2.19±0.14c,P<0.05）;β-catenin过表达组心肌细胞的大小与对照组没有明显区别（0.91±0.29 vs 1.73±0.41 vs 0.99±0.08,P>0.05）;β-catenin过表达组Ki67阳性心肌细胞比例高于β-catenin沉默组和对照组（48.14±19.07%vs 4.34±4.86%vs 8.23±6.38%,P<0.05）;β-catenin过表达组p H3阳性心肌细胞比例高于β-catenin沉默组和对照组（35.92±12.89%vs 2.30±2.97%vs 3.95±4.60%,P<0.05）;β-catenin过表达组Aurora B阳性心肌细胞比例高于β-catenin沉默组和对照组（8.27±3.64%vs 1.46±2.70%vs 0.33±0.98%,P<0.05）;β-catenin过表达组kif20a阳性心肌细胞比例高于β-catenin沉默组和对照组（4.26±1.08%vs 0.24±0.68%vs 0.18±0.52%,P<0.05）;β-catenin过表达组心肌细胞数量多于β-catenin沉默组和对照组（CCK8的OD为0.82±0.06 vs 0.68±0.03 vs 0.66±0.03,P<0.05）。4.在体内实验,β-catenin激动剂组心肌细胞的平均细胞核数低于β-catenin抑制剂组和对照组（1.96±0.06 vs 2.13±0.07 vs 2.15±0.17,P<0.05）;β-catenin激动剂组心肌细胞的平均倍体数低于β-catenin抑制剂组和对照组（4.69±0.61c vs 6.19±0.61c vs 6.19±0.59c,P<0.05）;β-catenin激动剂组心肌细胞的平均核倍体数低于β-catenin抑制剂组和对照组（2.38±0.07c vs 2.61±0.10c vs 2.91±0.10c,P<0.05）;β-catenin激动剂组心肌细胞的大小与对照组无统计学差异（0.77±0.13 vs 1.12±0.17 vs 1.12±0.23,P>0.05）;β-catenin激动剂组Ki67阳性心肌细胞比例高于β-catenin抑制剂组和对照组（17.16±3.43%vs 5.04±1.00%vs 2.95±2.76%,P<0.05）;β-catenin激动剂组p H3阳性心肌细胞比例高于β-catenin抑制剂组和对照组（32.51±13.27%vs 12.78±5.93%vs6.44±3.57%,P<0.05）;β-catenin激动剂组Aurora B阳性心肌细胞比例高于β-catenin抑制剂组和对照组（1.90±0.15%vs 0±0%vs 0±0%,P<0.05）;β-catenin激动剂组kif20a阳性心肌细胞比例高于β-catenin抑制剂组和对照组（1.42±0.34%vs 0±0%vs 0±0%,P<0.05）;β-catenin激动剂组心肌细胞数量多于β-catenin抑制剂组和对照组（12.80±1.10*106 vs 9.80±0.41*106 vs 10.53±0.22*106,P<0.05）;β-catenin激动剂组心脏射血分数高于β-catenin抑制剂组和对照组（58.15±3.19%vs 45.04±3.23%vs53.22±2.23%,P<0.05）。第五部分:活化的β-catenin上调ECT2促进四倍体心肌细胞胞质分裂参与心肌再生的机制研究1.体外实验中,β-catenin过表达组胞核内ECT2含量高于β-catenin沉默组和对照组（1.42±0.15 vs 0.34±0.02 vs 0.13±0.02,P<0.05）;体外实验中,β-catenin过表达组ECT2转录水平高于β-catenin沉默组和对照组（2.87±0.33 vs 0.79±0.13 vs 1.05±0.18,P<0.05）;体内实验中,β-catenin激动剂组胞核内ECT2含量高于β-catenin抑制剂组和对照组（1.99±0.17 vs 1.16±0.06 vs 0.85±0.12,P<0.05）;体内实验中,β-catenin激动剂组ECT2转录水平高于β-catenin抑制剂组和对照组（3.03±0.52 vs 0.92±0.46 vs1.02±0.18,P<0.05）。2.TCF4在Ect2第一内含子内有结合位点。3.体外实验中,β-catenin过表达组ECT2与Anillin共定位于肌动蛋白收缩环的比例高于β-catenin沉默组和对照组（3.60±4.87%vs 0±0%vs 0±0%,P<0.05）;β-catenin过表达组ECT2与Mgc Rac GAP共定位于肌动蛋白收缩环的比例高于β-catenin沉默组和对照组（2.76±3.77%vs 0±0%vs 0±0%,P<0.05）。4.在分选的四倍体心肌细胞,β-catenin激动剂组心肌细胞平均倍体数低于对照组（2.93±0.12c vs 2.90±0.07c,P<0.05）。研究结论:1.与非紫绀组比,紫绀组心肌细胞明显多倍体化,以多核化为主;心肌细胞的S期活性增高,G2/M期和胞质分裂活性无明显增高。2.缺氧情况下,β-catenin入胞核,与HIF-1α结合,β-catenin活性受到抑制,进而引起心肌细胞的G1/S期活性增加,而不改变G2/M期和胞质分裂活性,诱导多核多倍体心肌细胞产生。3.缺氧情况下,活化的β-catenin通过上调ECT2,促进ECT2与Anillin结合,正确定位于肌动蛋白收缩环,促进多倍体心肌细胞胞质分裂。
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
| 中文摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 神经母细胞瘤概述 |
| 1.1.1 神经母细胞瘤的现状 |
| 1.1.2 神经母细胞瘤发病机制 |
| 1.1.3 神经母细胞瘤危险因素 |
| 1.2 DEHP与神经母细胞瘤 |
| 1.2.1 DEHP概述 |
| 1.2.2 DEHP对神经母细胞瘤的影响 |
| 1.3 Notch信号通路与神经母细胞瘤 |
| 1.4 DEHP对 Notch信号通路的影响 |
| 第2章 MEHP对 SH-SY5Y细胞增殖的影响及其机制 |
| 2.1 主要仪器和试剂 |
| 2.1.1 主要仪器 |
| 2.1.2 主要材料 |
| 2.1.3 主要试剂配置 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 SH-SY5Y细胞株的体外培养 |
| 2.2.2 MEHP染毒剂量的确定和实验分组 |
| 2.2.3 SH-SY5Y细胞周期检测 |
| 2.2.4 SH-SY5Y细胞凋亡情况检测 |
| 2.2.5 SH-SY5Y细胞周期和凋亡相关基因m RNA表达水平检测 |
| 2.2.6 SH-SY5Y细胞增殖相关蛋白表达水平检测 |
| 2.2.7 数据处理与分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 MEHP暴露对SH-SY5Y细胞增殖的影响 |
| 2.3.2 MEHP暴露对SH-SY5Y细胞增殖相关基因m RNA表达水平的影响 |
| 2.3.3 MEHP暴露对SH-SY5Y细胞增殖相关蛋白表达的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 MEHP暴露对SH-SY5Y细胞增殖的影响 |
| 2.4.2 细胞周期关键基因在MEHP暴露影响SH-SY5Y细胞增殖中的作用 |
| 2.4.3 细胞凋亡关键基因在MEHP暴露影响SH-SY5Y细胞增殖中的作用 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 MEHP对 SH-SY5Y细胞迁移的影响及其机制 |
| 3.1 主要仪器和材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 细胞迁移距离测定 |
| 3.2.2 细胞侵袭能力测定 |
| 3.2.3 细胞趋化因子测定 |
| 3.2.4 细胞迁移相关基因m RNA表达水平检测 |
| 3.2.5 细胞迁移相关蛋白表达水平检测 |
| 3.2.6 数据处理与分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 MEHP暴露对SH-SY5Y细胞迁移的影响 |
| 3.3.2 MEHP暴露对SH-SY5Y细胞迁移相关基因m RNA表达的影响 |
| 3.3.3 MEHP暴露对SH-SY5Y细胞迁移相关蛋白表达的影响 |
| 3.3.4 MEHP暴露对SH-SY5Y细胞趋化因子的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 MEHP暴露对SH-SY5Y细胞迁移的影响 |
| 3.4.2 迁移关键基因在MEHP影响SH-SY5Y细胞迁移中的作用 |
| 3.4.3 肿瘤微环境关键基因在MEHP影响SH-SY5Y细胞迁移中的作用 |
| 3.4.4 趋化因子在MEHP影响SH-SY5Y细胞迁移中的作用 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 MEHP对SH-SY5Y细胞Notch信号通路的影响 |
| 4.1 主要仪器和材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 MEHP对SH-SY5Y细胞Notch信号通路基因m RNA表达的影响检测 |
| 4.2.2 MEHP对 SH-SY5Y细胞Notch信号通路蛋白表达的影响检测 |
| 4.2.3 数据处理与分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 MEHP对SH-SY5Y细胞Notch信号通路基因m RNA表达水平的影响 |
| 4.3.2 MEHP对 SH-SY5Y细胞Notch信号通路蛋白表达水平的影响 |
| 4.3.3 Notch信号通路蛋白表达水平与SH-SY5Y细胞增殖的关系 |
| 4.3.4 Notch信号通路蛋白表达水平与SH-SY5Y细胞迁移的关系 |
| 4.3.5 Notch信号通路蛋白表达水平与SH-SY5Y细胞趋化因子的关系 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 MEHP对 Notch信号通路的影响 |
| 4.4.2 Notch信号通路与细胞增殖的关联性 |
| 4.4.3 Notch信号通路与细胞迁移的关联性 |
| 4.5 小结 |
| 第5章 Notch信号通路在MEHP影响SH-SY5Y细胞增殖和迁移中的作用及其机制 |
| 5.1 主要仪器和材料 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 DAPT对 SH-SY5Y细胞存活率的影响 |
| 5.2.2 Notch信号通路抑制效率检测 |
| 5.2.3 实验分组 |
| 5.2.4 指标检测 |
| 5.2.5 数据处理与分析 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 DAPT剂量确定 |
| 5.3.2 Notch信号通路在MEHP促进SH-SY5Y细胞增殖中的作用 |
| 5.3.3 Notch信号通路在MEHP促进SH-SY5Y细胞迁移中的作用 |
| 5.3.4 Notch信号通路在MEHP影响SH-SY5Y细胞趋化因子中的作用 |
| 5.4 讨论 |
| 5.4.1 Notch信号通路在MEHP促进SH-SY5Y细胞增殖中的作用及机制 |
| 5.4.2 Notch信号通路在MEHP促进SH-SY5Y细胞迁移中的作用及机制 |
| 5.5 小结 |
| 第6章 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 环境内分泌干扰物与儿童神经系统疾病 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1 研究对象 |
| 2 标本处理 |
| 3 实验方法 |
| 4 统计学处理 |
| 结果 |
| 1 研究对象 |
| 2 ELISA法检测结果 |
| 3 RT-PCR检测结果 |
| 4 Spearman相关分析 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 MicroRNAs及其相关因子在扁平苔藓发病中的作用 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间研究成果 |
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第1章 引言 |
| 第2章 综述 cGAS-STING信号在癌症免疫和免疫治疗中的作用 |
| 2.1 CGAS-STING信号通路抗肿瘤机制 |
| 2.1.1 细胞质DNA如何积聚? |
| 2.1.2 cGAS-STING通路消除癌细胞机制 |
| 2.2 CGAS-STING通路在治疗中的应用 |
| 2.2.1 单药治疗 |
| 2.2.2 STING激动剂联合疗法 |
| 2.3 STING免疫疗法:一把双刃剑 |
| 2.4 结论 |
| 第3章 STING对宫颈癌增殖、迁移、侵袭能力影响的体外实验 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 主要仪器设备 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要试剂配制 |
| 3.2 实验流程 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 细胞来源和细胞培养条件 |
| 3.3.2 细胞复苏 |
| 3.3.3 细胞换液 |
| 3.3.4 细胞传代 |
| 3.3.5 细胞冻存 |
| 3.3.6 细胞计数 |
| 3.3.7 Trizol法提取HaCaT、H8、HeLa、SiHa、C33A、CaSki细胞的RNA |
| 3.3.8 RNA逆转录 |
| 3.3.9 定量实时聚合酶链式反应(real-time quantitativepolymerase chain reaction, qRT-PCR) |
| 3.3.10 HaCaT、H8、HeLa、SiHa、C33A、CaSki细胞的蛋白样品制备 |
| 3.3.11 蛋白质免疫印迹实验(Western Blot,WB) |
| 3.3.12 短发夹RNA慢病毒载体的构建及转导 |
| 3.3.13 过表达慢病毒载体的构建及转染 |
| 3.3.14 Trizol法提取vector HeLa、shSTING-Hela、vectorSiHa、shSTING-SiHa、vector C33A、C33A-STING细胞的RNA |
| 3.3.15 RNA逆转录 |
| 3.3.16 定量实时聚合酶链式反应 |
| 3.3.17 vector HeLa、shSTING-Hela、vector SiHa、shSTING-SiHa、vector C33A、C33A-STNG细胞的蛋白样品制备 |
| 3.3.18 蛋白质免疫印迹实验 |
| 3.3.19 宫颈癌细胞增殖实验 |
| 3.3.20 宫颈癌细胞平板克隆实验 |
| 3.3.21 宫颈癌细胞划痕实验 |
| 3.3.22 宫颈癌细胞Transwell小室迁移实验 |
| 3.3.23 宫颈癌细胞侵袭实验 |
| 3.3.24 统计分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 STING在人角质形成细胞、宫颈上皮永生化细胞以及四种宫颈癌细胞系中的表达 |
| 3.4.2 稳定的沉默STING细胞系、STING过表达细胞系的鉴定 |
| 3.4.3 STING沉默或过表达对宫颈癌细胞系细胞增殖和克隆形成的影响 |
| 3.4.4 STING沉默或过表达对宫颈癌细胞迁移能力的影响 |
| 3.4.5 STING沉默或过表达对宫颈癌细胞侵袭能力的影响 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第4章 STING调控宫颈癌细胞生物学行为信号通路的探索 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验设备 |
| 4.1.2 实验试剂 |
| 4.1.3 主要溶液配制 |
| 4.2 实验流程 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 细胞培养、冻存、传代、计数 |
| 4.3.2 总蛋白提取和免疫印迹实验 |
| 4.3.3 核蛋白提取和免疫印迹实验 |
| 4.3.4 免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,co-IP)和免疫印迹实验 |
| 4.3.5 细胞培养、冻存、传代、计数 |
| 4.3.6 总蛋白提取和免疫印迹实验 |
| 4.3.7 CCK8实验 |
| 4.3.8 平板克隆 |
| 4.3.9 Transwell小室迁移 |
| 4.3.10 Transwell小室侵袭 |
| 4.3.11 统计学方法 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 STING对经典Wnt/β-catenin信号通路的作用 |
| 4.4.2 过表达STING对经典Wnt/β-catenin信号通路的影响 |
| 4.4.3 STING调控宫颈癌Wnt/β-catenin信号通路机制探讨 |
| 4.4.4 β-catenin通路抑制剂对沉默STING介导的宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭作用的影响(rescue实验) |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第5章 沉默STING促进宫颈癌细胞增殖的体内实验 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 实验设备 |
| 5.1.2 实验试剂 |
| 5.1.3 主要溶液配制 |
| 5.1.4 实验动物 |
| 5.2 实验流程 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 细胞的复苏、传代及培养 |
| 5.3.2 裸鼠皮下移植瘤模型的建立 |
| 5.3.3 裸鼠体重测量 |
| 5.3.4 裸鼠移植瘤组织大小的测量 |
| 5.3.5 肿瘤组织脱水及包埋 |
| 5.3.6 苏木精和伊红染色技术(Hematoxylin and eosin dyeingtechniques,HE) |
| 5.3.7 免疫组织化学染色技术(Immunohistochemistry,IHC) |
| 5.3.8 统计学方法 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.4.1 沉默STING的宫颈癌细胞移植瘤对裸鼠体重的影响 |
| 5.4.2 沉默STING对裸鼠移植瘤体积的影响 |
| 5.4.3 裸鼠肿瘤组织HE染色结果 |
| 5.4.4 裸鼠肿瘤组织STING免疫组化染色结果 |
| 5.4.5 裸鼠肿瘤组织免疫组化Ki67染色结果 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 小结 |
| 第6章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 正常生理状态下脂多糖对肝细胞干性的影响及机制研究 |
| 一、前言 |
| 二、方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、参考文献 |
| 第二部分 肝再生过程中脂多糖对肝细胞干性的影响及机制研究 |
| 一、前言 |
| 二、方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、参考文献 |
| 第三部分 肝再生在肝癌发生中的作用及机制研究 |
| 一、前言 |
| 二、方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、参考文献 |
| 综述一 肝再生过程中细胞生物学的研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 Bcl3的分子生物学特征及其在炎症免疫、肿瘤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文和参加科研工作情况说明 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 绪论 |
| 第一部分 miR-187-3p表达水平与血管瘤普萘洛尔耐药性的相关性分析 |
| 1 引言 |
| 2 材料 |
| 3 方法 |
| 4 结果 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 第二部分 负载miR-187-3p hAMSCs外泌体的构建 |
| 1 引言 |
| 2 材料 |
| 3 方法 |
| 4 结果 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 第三部分 hAMSCs外泌体负载miR-187-3p对 HemSCs普萘洛尔耐药性影响的机制研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料 |
| 3 方法 |
| 4 结果 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 第四部分 口服普萘洛尔与阿替洛尔治疗IH的效果比较 |
| 1 引言 |
| 2 材料 |
| 3 方法 |
| 4 结果 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表论文 |
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词 |
| 第1章 绪论 |
| 第2章 文献综述 |
| 2.1 流行性学 |
| 2.2 病因及发病机制 |
| 2.2.1 紫外线 |
| 2.2.2 乳头瘤病毒感染 |
| 2.2.3 机体免疫状态 |
| 2.2.4 化学致癌物 |
| 2.2.5 基因突变 |
| 2.2.6 家族史 |
| 2.2.7 其他相关皮肤病 |
| 2.2.8 其他因素 |
| 2.3 治疗 |
| 2.3.1 手术治疗 |
| 2.3.2 激光治疗和冷冻治疗 |
| 2.3.3 靶向治疗 |
| 2.3.4 放射治疗 |
| 2.3.5 基因治疗 |
| 2.3.6 光动力疗法 |
| 2.3.7 其他疗法 |
| 2.4 随访 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 NQO1 对皮肤鳞状细胞癌增殖、侵袭转移的影响及机制研究 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 组织标本及细胞 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要试剂盒 |
| 3.1.4 主要仪器 |
| 3.1.5 实验方法 |
| 3.1.6 统计学分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 NQO1 在皮肤鳞状细胞癌内的表达水平 |
| 3.2.2 NQO1 对细胞增殖和平板克隆形成活性的影响 |
| 3.2.3 NQO1 对细胞增殖相关分子水平的影响 |
| 3.2.4 NQO1 对侵袭和迁移的影响 |
| 3.2.5 NQO1对EMT相关细胞内信号分子的影响 |
| 3.2.6 NQO1对SCC细胞内ROS水平的影响 |
| 3.2.7 NQO1 抑制剂双香豆素对细胞增殖和克隆形成的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 阿苯达唑对皮肤鳞状细胞癌的抗肿瘤作用及机制研究 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 组织标本及细胞 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要试剂盒 |
| 4.1.4 主要实验仪器 |
| 4.1.5 实验方法 |
| 4.1.6 统计学分析 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 阿苯达唑的结构 |
| 4.2.2 阿苯达唑对鳞状细胞癌细胞系的细胞毒作用 |
| 4.2.3 阿苯达唑诱导SCC12和SCC13 细胞凋亡 |
| 4.2.4 阿苯达唑对皮肤鳞状细胞癌的特异性作用 |
| 4.2.5 阿苯达唑诱导CSCC的凋亡与内质网应激有关 |
| 4.2.6 阿苯达唑和内质网应激诱导剂衣霉素对CSCC影响 |
| 4.2.7 阿苯达唑对CSCC和角质形成细胞内质网应激的影响 |
| 4.2.8 阿苯达唑对肿瘤干细胞特性的影响 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 结论 |
| 全文总结及创新点 |
| 参考文献 |
| 在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩略词表 |
| 第一部分 AAMP调控非小细胞肺癌细胞增殖的分子机制研究 |
| 前言 |
| 1. 癌症 |
| 2. 细胞增殖 |
| 3. AAMP (Angio-associated Migratory Cell Protein) |
| 4. EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor) |
| 实验材料与方法 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 实验结果 |
| 1. AAMP表达水平及其和肺癌患者总生存率的关系 |
| 2. AAMP促进NSCLC细胞增殖和克隆形成 |
| 小结1 |
| 3. AAMP促进NSCLC细胞在体内成瘤 |
| 小结2 |
| 4. AAMP通过激活ERK1/2-CCND1信号通路促进细胞增殖 |
| 小结3 |
| 5. AAMP和EGFR存在相互作用 |
| 小结4 |
| 6. AAMP增强NSCLC细胞的耐药性 |
| 小结5 |
| 第二部分 AAMP调控非小细胞肺癌细胞迁移的分子机制研究 |
| 前言 |
| 1. 转移 |
| 2. GTPase家族 |
| 实验材料与方法 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 实验结果 |
| 1. AAMP的敲低抑制NSCLC细胞迁移和侵袭 |
| 2. AAMP促进NSCLC细胞边缘细胞质膜突起的形成 |
| 3. AAMP促进CDC42活化 |
| 讨论 |
| 1. 课题来源 |
| 2. 结论探讨 |
| 3. 创新点 |
| 4. 转化意义 |
| 5. 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 附件 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 综述 |
| 1.1 仿刺参的生物学特征 |
| 1.2 仿刺参的再生特性 |
| 1.2.1 吐脏 |
| 1.2.2 再生 |
| 1.3 仿刺参再生的机制 |
| 1.3.1 再生的机制 |
| 1.3.2 再生的分子机制 |
| 1.4 多功能表皮生长因子6(megf6) |
| 1.5 Krüppel样因子13(klf13) |
| 1.6 基础转录因子3(btf3) |
| 1.7 本研究的目的及意义 |
| 第二章 仿刺参再生早期转录组的构建 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 数据过滤后的reads情况 |
| 2.3.2 参考基因组比对 |
| 2.3.3 参考基因比对 |
| 2.3.4 整体分析 |
| 2.3.5 基因所属转录因子家族分类 |
| 2.3.6 样本相关性分析 |
| 2.3.7 基因表达量分析 |
| 2.3.8 GO注释 |
| 2.3.9 KEGG Pathway分类与富集 |
| 2.3.10 差异表达基因筛选 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 转录组构建 |
| 2.4.2 GO分析 |
| 2.4.3 KEGG Pathway分类与富集 |
| 2.4.4 表达差异相关基因筛选 |
| 第三章 仿刺参megf6基因克隆及在肠再生中的表达分析 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 材料 |
| 3.2.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 EST序列的获得 |
| 3.3.2 3’端序列的获得 |
| 3.3.3 5’端序列的获得 |
| 3.3.4 Aj-megf6 基因c DNA全长 |
| 3.3.5 Aj-megf6 的生物信息学分析 |
| 3.3.6 Aj-MEGF6 的同源性及进化关系 |
| 3.3.7 Aj-megf6 基因在肠再生过程中的表达模式 |
| 3.3.8 Aj-MEGF6 重组蛋白的获得、表达与纯化 |
| 3.3.9 Aj-MEGF6 的免疫荧光定位 |
| 3.3.10 Aj-MEGF6、CDH1与SNAI2 的调控关系 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 Aj-megf6 基因的结构特征 |
| 3.4.2 Aj-megf6 基因在肠再生过程中的表达模式 |
| 3.4.3 Aj-MEGF6 在肠再生过程中的作用机制 |
| 第四章 仿刺参klf13基因克隆及在肠再生中的表达分析 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 材料 |
| 4.2.2 方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 EST序列的获得 |
| 4.3.2 3’端序列的获得 |
| 4.3.3 5’端序列的获得 |
| 4.3.4 Aj-klf13 基因c DNA全长 |
| 4.3.5 Aj-klf13的生物信息学分析 |
| 4.3.6 Aj-KLF13的同源性及进化关系 |
| 4.3.7 Aj-klf13基因在肠再生进程中的表达模式 |
| 4.3.8 Aj-KLF13重组蛋白的获得、表达与纯化 |
| 4.3.9 Aj-KLF13的免疫荧光定位 |
| 4.3.10 Aj-KLF13与CREB1和CDK2 的调控关系 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 Aj-klf13基因的结构特征 |
| 4.4.2 Aj-KLF13的表达定位 |
| 4.4.3 Aj-KLF13在肠再生过程中的作用机制 |
| 第五章 仿刺参btf3l4基因克隆及在肠再生中的表达分析 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 材料 |
| 5.2.2 方法 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 EST序列的获得 |
| 5.3.2 3’端序列的获得 |
| 5.3.3 5’端序列的获得 |
| 5.3.4 Aj-btf3l4 基因c DNA全长 |
| 5.3.5 Aj-btf3l4 的生物信息学分析 |
| 5.3.6 Aj-BTF3L4 的同源性及进化关系 |
| 5.3.7 Aj-btf3l4 基因在肠再生过程中的表达模式 |
| 5.3.8 Aj-BTF3L4 重组蛋白的获得、表达与纯化 |
| 5.3.9 Aj-BTF3L4 的免疫荧光定位 |
| 5.3.10 Aj-BTF3L4与BMI1 的调控关系 |
| 5.4 讨论 |
| 5.4.1 Aj-btf3l4 基因的结构特征 |
| 5.4.2 Aj-BTF3L4 的表达定位 |
| 5.4.3 Aj-BTF3L4 在肠再生过程中的作用机制 |
| 第六章 MEGF6、KLF13和BTF3L4 在仿刺参肠再生过程中的调控机制 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 材料 |
| 6.2.2 方法 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 Aj-egfr、wnt6 基因在肠再生过程中的表达模式 |
| 6.3.2 Aj-EGFR、WNT6 在肠再生过程中的表达模式 |
| 6.4 讨论 |
| 6.4.1 仿刺参肠再生的机制 |
| 6.4.2 MEGF6、KLF13和BTF3L4 在仿刺参肠再生过程中的调控机制 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间发表学术论文情况 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写-中文名称对照表 |
| 第一章 NEKS的研究进展 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 NEKS家族 |
| 1.3 有丝分裂 |
| 1.3.1 有丝分裂起始 |
| 1.3.2 NEKs与胞质分裂 |
| 1.3.3 细胞周期检验点 |
| 1.4 细胞分裂间期 |
| 1.5 减数分裂 |
| 1.6 肿瘤 |
| 第二章 PTHLH的研究进展 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 PTHLH基因 |
| 2.3 PTHLH蛋白和受体 |
| 2.4 细胞增殖 |
| 2.5 癌症 |
| 第三章 NEK5在小鼠卵母细胞成熟和着床前胚胎发育中作用的研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验动物 |
| 3.2.2 显微注射 |
| 3.2.3 过表达质粒的构建及体外转录 |
| 3.2.4 蛋白免疫印迹(Western blotting) |
| 3.2.5 免疫荧光染色 |
| 3.2.6 中期染色体铺片 |
| 3.2.7 实时定量PCR(RT-PCR) |
| 3.2.8 数据分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 NEK5在小鼠卵母细胞成熟过程中的表达和定位 |
| 3.3.2 Nek5的敲降导致小鼠卵母细胞减数分裂恢复的失败 |
| 3.3.3 cyclin B1的过表达可以挽救Nek5敲降导致的卵母细胞减数分裂恢复失败 |
| 3.3.4 Cdc25的过表达不能挽救Nek5敲降导致的卵母细胞减数分裂恢复失败 |
| 3.3.5 Wee1B的敲降可以挽救Nek5敲降导致的卵母细胞减数分裂恢复失败 |
| 3.3.6 Nek5的敲降对小鼠卵母细胞染色体结构的影响 |
| 3.3.7 Nek5的敲降对小鼠卵母细胞第一次减数分裂中/后期转换的影响 |
| 3.3.8 NEK5在小鼠着床前胚胎发育过程中的表达和功能 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 PTHLH在小鼠卵母细胞成熟和着床前胚胎发育中作用的研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验动物 |
| 4.2.2 卵母细胞的采集和培养 |
| 4.2.3 1-cell胚胎的采集和培养 |
| 4.2.4 Pthlh过表达质粒的构建及体外转录 |
| 4.2.5 显微注射 |
| 4.2.6 蛋白免疫印迹(Western blotting) |
| 4.2.7 免疫荧光染色 |
| 4.2.8 实时定量PCR |
| 4.2.9 桑椹期胚胎细胞数目的计数 |
| 4.2.10 数据分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 Pthlh的敲降对小鼠着床前胚胎发育过程中囊胚形成的影响 |
| 4.3.2 Pthlh的敲降对小鼠卵裂期胚胎发育的影响 |
| 4.3.3 Pthlh的敲降对小鼠桑椹期胚胎细胞数目的影响 |
| 4.3.4 Pthlh的敲降对小鼠着床前胚胎发育过程中cyclin D1的影响 |
| 4.3.5 Pthlh的敲降对小鼠着床前胚胎发育过程中p-AKT(Thr308)的影响 |
| 4.3.6 Pthlh的敲降对小鼠着床前胚胎中β-catenin的影响 |
| 4.3.7 Pthlh的敲降对小鼠着床前胚胎G1/S期转换的影响 |
| 4.3.8 Pthlh的敲降对小鼠着床前胚胎中RUNX2的影响 |
| 4.3.9 Pthlh的敲降对小鼠着床前胚胎中组蛋白去乙酰化酶HDAC4 的影响 |
| 4.3.10 Pthlh的过表达对小鼠卵母细胞成熟和着床前胚胎发育过程的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
| 缩略语表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 紫绀型与非紫绀型先心病患者心肌细胞的多倍体情况和细胞周期情况的差异研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 缺氧调节心肌细胞周期活性诱导多倍体化的初步机制研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 缺氧抑制β-catenin的基因调控活性参与缺氧心肌细胞多倍体化的机制研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 活化的β-catenin调控心肌细胞细胞周期活性促进心肌细胞二倍体化的初步研究 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.3 结果 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 活化的β-catenin上调ECT2促进四倍体心肌细胞胞质分裂参与心肌再生的机制研究 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.3 结果 |
| 6.4 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 多倍体心肌细胞的病理生理学意义 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
