高嫦娥[1]（2021）在《PD-1基因敲除T细胞治疗结直肠癌的有效性及其体内安全性评价的临床前研究》文中指出研究背景与目的靶向T细胞抑制性检测点肿瘤免疫治疗是当今生物医学研究的最热点。研究表明,利用单抗药物直接作用于PD-1可以有效地阻断抑制性免疫检测点,激活T细胞,增强T细胞的功能,达到治疗肿瘤的目的。在机体的免疫系统中,肠道由于接触抗原的表面积最大并且免疫细胞数量较多,因而被认为是体内最大的免疫器官[1],发生于结直肠的恶性肿瘤与免疫逃逸有关。本研究利用CRISPR/Cas9技术对T细胞PD-1基因进行靶向敲除,采用小鼠结肠癌模型进行PD-1基因敲除的T细胞的体内抗肿瘤作用及其可能机制研究,采用非人灵长类动物食蟹猴作为实验动物,高度模拟PD-1基因敲除T细胞在体内的安全性评价,以期建立利用CRISPR/Cas9技术靶向T细胞PD-1基因进行肿瘤细胞免疫治疗的策略,进而为临床研究的实施奠定坚实的实验基础。第一章:小鼠PD-1基因敲除T细胞治疗结直肠癌的有效性及其机制研究第一部分:小鼠PD-1基因敲除T细胞的建立及其体外抑制肿瘤的作用[方法]在GENEBANK数据库中查找获得小鼠PD-1基因序列,设计靶向小鼠PD-1基因的sgRNA,构建靶向PD-1基因的PX458敲除载体,经扩增、酶切鉴定及测序验证,获得正确的CRISPR/Cas9-sgRNA表达载体。分离获得小鼠外周血PBMC,富集细胞数量为1×107,加入敲除PD-1基因的PX458敲除载体5μg,采用Lonza-4D电转仪进行电转染,48h后检测转染效率,采用PCR技术和T7E1酶切验证PD-1基因的敲除。体外培养结直肠癌细胞株CT-26,分为:阴性对照组:CT-26细胞组、PD-1基因敲除T细胞组,实验组:CT-26与PD-1基因敲除T细胞共培养组,CT-26与未经PD-1基因敲除的T细胞及PD-1单抗共培养组。绘制各组细胞生长曲线,细胞杀伤检测试剂盒检测PD-1基因敲除的T细胞的杀伤能力,通过流式细胞术检测T淋巴细胞亚群比例的变化及体外分泌细胞因子的水平变化。[结果]成功获得了靶向小鼠PD-1基因敲除的sgRNA,构建靶向小鼠PD-1基因sgRNA/Cas9表达载体,建立小鼠PD-1基因敲除T细胞,对其体外特性进行检测,结果显示:流式细胞仪检测PD-1基因敲除T细胞CD3、CD4、CD8比例无明显变化;PD-1基因敲除T细胞与结直肠癌细胞株CT-26在不同效靶比作用下体外抑制肿瘤效应结果显示:各组细胞生长曲线示:与其他两组相比,CT-26与PD-1基因敲除T细胞共培养组,CT-26与未经PD-1基因敲除T细胞及PD-1单抗共培养组,72小时细胞活率明显下降,与其他两组相比,CT-26与PD-1基因敲除T细胞共培养组,CT-26与PD-1基因敲除T细胞及PD-1单抗共培养组,与肿瘤细胞共培养后:IFN-γ、TNF-α、IL-2的水平增加。[结论]建立了稳定的体外定向敲除T细胞抑制性免疫检测点PD-1的技术,获得了小鼠同种异体PD-1基因敲除T细胞,体外实验显示,可抑制肿瘤细胞的生长,为体内抗肿瘤的研究奠定了基础。第二部分:小鼠PD-1基因敲除T细胞治疗结直肠癌的有效性及可能机制[方法]培养结直肠癌细胞株CT-26,制备小鼠结直肠癌移植瘤模型;实验分组分别为模型对照组（经尾静脉注射PBS）、阴性对照组（经尾静脉注射未经基因敲除的T细胞）、PD-1基因敲除T细胞组（经尾静脉注射PD-1基因敲除的T细胞）、PD-1单抗组（经尾静脉注射PD-1单抗）,观察结直肠癌移植瘤模型中各组小鼠体重,活动度,生存期等,绘制小鼠生存率曲线;处死各组中小鼠,分别取肝,肺和肠等组织进行病理学分析;分离MLNs、脾脏淋巴细胞,采用流式细胞仪检测MLNs、脾脏CD4+,CD8+T细胞,Treg细胞比例,ELISA法检测MLNs、血清中肿瘤免疫相关细胞因子的分泌水平变化。[结果]与模型对照组相比较,同种异体PD-1基因敲除T细胞可抑制结直肠癌荷瘤小鼠原位移植瘤的生长及向肝脏和肺部的转移,延长了小鼠的存活时间。PD-1基因敲除T细胞回输结直肠荷瘤小鼠,ELISA结果显示,与同模型对照组、阴性对照组相比较,PD-1基因敲除T细胞回输组MLNs和血清中IFN-y,TNF-α和IL-12的水平增加,IL-6无明显变化,IL-17水平减少。在结直肠癌小鼠PD-1基因敲除T细胞回输后,PD-1敲除组小鼠的CD44+CD62L-记忆T细胞比例明显提升,CD4+FoxP3+调节性T细胞比例降低。[结论]同种异体PD-1基因敲除T细胞在结直肠癌中显示出体内抑制肿瘤转移的作用,且可能通过依赖CD8+T细胞在结直肠癌中发挥抗肿瘤作用。第二章:食蟹猴PD-1基因敲除T细胞体内安全性评价第一部分:食蟹猴PD-1基因敲除T细胞的建立及其生物学特性[方法]在GENEBANK数据库中搜索食蟹猴PD-1基因序列,设计靶向食蟹猴PD-1基因的sgRNA,构建靶向PD-1基因的PX458敲除载体,经扩增、酶切鉴定及测序验证,获得正确的sgRNA表达载体;分离培养食蟹猴PBMC,采用Lonza-4D电转仪进行电转染,48h后检测转染效率,采用PCR技术及T7E1酶切鉴定PD-1基因的敲除。在细胞因子刺激下诱导食蟹猴T细胞增殖,定期观察细胞形态变化及集落形成并计数,绘制食蟹猴PD-1基因敲除T细胞生长曲线,FACS检测食蟹猴PD-1基因敲除T细胞周期、凋亡,CCK-8法检测食蟹猴PD-1基因敲除T细胞增殖,以及食蟹猴PD-1基因敲除T细胞表面特征分子的表达,通过ELISA法检测食蟹猴PD-1基因敲除T细胞分泌的IFN-γ、TNFα、IL-10、IL-6、IL-2水平。[结果]成功获得了靶向食蟹猴PD-1基因敲除的sgRNA,构建靶向食蟹猴PD-1基因的敲除重组表达载体sgRNA/Cas9,成功培养了食蟹猴PD-1基因敲除的T细胞,细胞生长周期为28天,生长曲线呈S形,符合Logistic生长曲线。CCK-8法检测结果显示,与未经敲除PD-1基因的T细胞相比较,PD-1基因敲除的T细胞增殖未受到抑制,生长曲线基本与未经敲除PD-1基因的T细胞相同;流式细胞仪检测T细胞表型无改变,具有杀伤性作用的CD8+T细胞所占比例有所升高;细胞周期及凋亡检测结果显示:与未经敲除PD-1基因的T细胞相比较,PD-1基因敲除的T细胞G0/G1期,S期,G2/M期比例两者无统计学差异,早期凋亡、死亡细胞比例两者无统计学差异。ELISA法对细胞因子IFN-γ、TNFα、IL-10、IL-6、IL-2进行检测,结果显示:PD-1基因敲除的T细胞释放细胞因子与相同培养条件下,未进行PD-1敲除的T细胞释放细胞因子量统计学无差异。[结论]抑制性检查点基因PD-1的破坏导致PD-1表达的降低,但在体外培养期间不影响PD-1基因敲除T细胞的活力、PD-1基因敲除T细胞特征标志物的表达、PD-1基因敲除T细胞凋亡和PD-1基因敲除T细胞周期,且扩增的PD-1基因敲除T细胞也不影响具有细胞因子表达的能力,为其体内安全性评价奠定基础。第二部分:食蟹猴PD-1基因敲除T细胞体内安全性评价[方法]多次富集PD-1基因敲除T细胞后,经静脉回输入食蟹猴体内,参照人细胞因子诱导的淋巴细胞回输有效剂量（2×107/kg）,溶解于100ml 0.9%氯化钠注射液中,对照组经静脉注射100ml/（kg·次）0.9%氯化钠注射液,每3d上午同一时间给药1次,共给药3次,分别在回输后4h,24h,48h,1w,2w,3w,4w直到100天抽取外周血,流式细胞仪检测CD3,PD-1的表达,观察各组食蟹猴体重,活动度等一般情况,监测血常规、血生化,ELISA法检测各组食蟹猴Th1:IL-2、IL-12、IFN-γ;Th2:IL-4、IL-10;炎症细胞因子:TNF-α、IL-1β、IL-6等细胞因子水平的变化,并分别取肝、肺、骨髓、脾脏、胸腺、甲状腺、垂体、肾上腺、睾丸等组织进行病理学分析,观察其毒性反应。[结果]将PD-1基因敲除的T细胞回输到食蟹猴体内,PD-1基因敲除的T细胞未显示出对其体重、活动度等一般情况的影响,血液学检查指标:白细胞数、单核细胞数与对照组相比,均未出现明显变化;生化学检查指标:总蛋白、白蛋白、球蛋白、总胆红素、直接胆红素、间接胆红素、谷草转移酶、谷丙转移酶、尿素氮、肌酐等与对照组相比,均未出现明显变化;组织病理学分析显示没有与输注的PD-1基因敲除T细胞相关的损伤;流式细胞术监测外周血中PD-1基因敲除的T细胞的体内持久性为两个月。[结论]我们的研究结果证明了食蟹猴用于评估PD-1基因敲除T细胞免疫治疗安全性的效用,并为基于T细胞的过继免疫治疗提供了新的策略。
侯坤[2]（2021）在《IL-4诱导小胶质细胞向M2表型极化对缺血性卒中的影响及其机制研究》文中研究说明背景和目的:小胶质细胞是神经系统的固有免疫细胞,在中枢神经系统多种疾病的发生、发展中扮演重要的角色。缺血性脑卒中发生后,受缺血部位微环境的动态变化的影响,小胶质细胞的不同极化表型对损伤的发展和神经恢复的结局是至关重要的。既往研究发现,人为将M1型小胶质细胞诱导成M2型小胶质细胞细胞,可减轻短暂性脑缺血小鼠模型的梗死面积并促进神经功能恢复。小胶质细胞具有不同的极化表型,可以解释小胶质细胞在同一疾病的作用双重性。因此,有目的地抑制小胶质细胞由M2型向M1型极化,或诱导M1型向M2型极化,或降低M1型/M2型的比值,是缺血性脑卒中治疗的重要研究方向之一。IL-4主要由活化的T细胞产生,对体内多种免疫细胞均有调节作用。IL-4可刺激巨噬细胞和小胶质细胞向抗炎表型转化,从而抑制炎症进展,促进组织修复并发挥神经保护作用。目前,IL-4已应用于脑出血、脊髓损伤、癫痫、阿尔兹海默病等诸多神经系统疾病的研究。本研究拟探讨IL-4在缺血性卒中的治疗价值。方法:1、构建大鼠脑缺血再灌注（transient middle cerebral artery occlusion,t MCAO）模型,分假手术组与模型组,ELISA法检测大鼠外周血TNF-α、IFN-γ、IL-4、TGF-β和BDNF等炎症因子的变化。免疫荧光检测大鼠小胶质细胞极化表型的变化。取脑梗死患者和健康成人对照的外周血,ELISA法检测上述炎症因子的变化。2、构建大鼠t MCAO模型,分为假手术组、模型组、IL-4组和IL-4+AS1517499组。3天后予神经功能评分。取大鼠外周血,检测炎症因子的变化。处死大鼠,TTC染色,计算梗死容积,免疫荧光检测大鼠小胶质细胞极化表型的变化,TUNEL染色检测缺血半暗带组织细胞凋亡,Nissl染色法检测缺血半暗带神经元损伤。3、培养HAPI小胶质细胞系,对小胶质细胞进行氧糖剥夺（oxygen glucose deprivation,OGD）处理,分为Control组、OGD组、OGD+IL-4组、OGD+IL-4+AS1517499组。ELISA法检测细胞培养上清中IL-1β,IL-2,TNF-α,IL-10,TGF-β,BDNF等炎症因子的变化。Western blot检测JAK1、p-JAK1、STAT6、p-STAT6的表达水平变化。免疫荧光染色,检测小胶质细胞系极化表型的变化。荧光微球法检测小胶质细胞内吞能力的变化。4、培养RN-C神经元细胞系,建立神经元OGD培养模型,与预处理后的小胶质细胞共培养,分为Control组,OGD组,IL-4组,IL-4+AS1517499组。流式细胞术评价RN-C的凋亡,Western blot法检测RN-C凋亡相关蛋白的表达。5、统计分析使用Graph Pad Prism9进行。连续变量以“均数±标准差”表示,两组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析。神经功能评估采用非参数检验（Kruskal-Wallis检验）,多组间比较采取Dunn’s多组比较,P<0.05被认为有统计学差异。结果:1、与健康对照相比,脑梗塞患者血液中IFN-γ、TNF-α、TGF-β、BDNF和IL-4均明显升高,其中IFN-γ、TNF-α、BDNF和IL-4梗塞后第一天升高最明显,梗塞后第三天开始下降,但仍明显高于健康对照。2、相较于假手术组,模型组大鼠外周血中IFN-γ、TNF-α和IL-4水平均上升,BDNF水平下降。给予IL-4后,IL-1β,IL-2,TNF-α水平下降,IL-10,TGF-β,BDNF水平上升,联合给予IL-4+AS1517499后,IL-1β,IL-2,TNF-α水平上升,IL-10,TGF-β,BDNF水平下降。3、与假手术组相比,模型组缺血半暗带中小胶质细胞活化增加,M1与M2表型均增加。给予IL-4后,M2表型小胶质细胞增多,给予IL-4+AS1517499后,M2表型小胶质细胞减少。4、相较于假手术组,各模型组均出现明显的脑梗死。与模型组相比,给予IL-4后,脑梗死容积减少,联合给予IL-4+AS1517499后,大鼠脑脑梗死容积增加。5、TUNEL染色法检测细胞凋亡,与假手术组相比,模型组缺血半暗带细胞凋亡明显增加,给予IL-4后,细胞凋亡显着减少,同时给予IL-4+AS1517499后,凋亡明显增加。尼氏染色法检测神经元修复情况,与假手术组相比,模型组神经元尼氏小体明显减少,给予IL-4后尼氏小体增加,给予IL-4+AS1517499后,尼氏小体减少。6、与正常组和OGD组相比,给予IL-4后,CD163表达上升,给予IL-4+AS1517499后,CD163表达下降。与正常组和OGD组相比,给予IL-4后,小胶质细胞JAK1磷酸化（p-JAK1）增加、STAT6磷酸化（p-STAT6）增加,给予STAT6磷酸化抑制剂AS1517499后,JAK1磷酸化水平无变化,STAT6磷酸化水平降低。与正常组和OGD组相比,给予IL-4后,IL-1β、IL-2、TNF-α表达显着下调,IL-10,TGF-β,BDNF表达显着上升。给予IL-4+AS1517499后,IL-1β、IL-2、TNF-α表达上升,IL-10,TGF-β,BDNF表达下降。7、与正常组和OGD组相比,给予IL-4后,小胶质细胞的内吞能力增加,给予AS1517499后,内吞作用降低。8、在小胶质细胞、神经元共培养模型中,与Control组相比,OGD组RN-C细胞明显增加,IL-4处理后,RN-C的凋亡明显减少,凋亡蛋白表达下调,与IL-4组相比,IL-4+AS1517499组凋亡增加,凋亡蛋白表达增加。结论:1、IL-4通过JAK1-p JAK1-STAT6-p STAT6信号通路促进小胶质细胞向M2表型极化。2、IL-4促进小胶质细胞向M2表型极化,对缺血性卒中大鼠发挥神经保护作用。3、给予IL-4后,小胶质细胞分泌的促炎因子（IL-1β,IL-2,TNF-α）下降,抗炎因子（IL-10,TGF-β,BDNF）上升,吞噬能力增强,进而减少神经元凋亡与损伤,发挥神经保护作用。
马骥[3]（2021）在《盐酸小檗碱外用对糖尿病创面愈合的作用及机制研究》文中研究表明目的:糖尿病慢性难愈性创面修复异常主要表现为新生血管及胶原沉积减少、炎症反应时间延长、氧化应激增强等。盐酸小檗碱（Berberine hydrochloride,BBR）具有降血糖、降血脂、改善胰岛素抵抗及抗炎、抗氧化等药理作用,对糖尿病及其并发症治疗具有一定作用。本研究拟通过动物及细胞实验探讨盐酸小檗碱外用对糖尿病创面愈合的作用及主要机制。方法:1.应用STZ腹腔注射SD大鼠（220g-260g）诱导糖尿病大鼠模型,采用背部全层皮肤切除法制备糖尿病大鼠全层皮肤缺损创面模型。大鼠随机分为正常对照组（NC组）、空白对照组（DM组）、药物溶剂组（BBRSolvent）、药物低剂量组（LBBR）、药物高剂量组（HBBR）,观察创面愈合一般情况及创面面积的变化。在创面愈合过程的第3,8,12,16天切取创面组织进行分析。采用HE和MASSON染色观察创面形态学的变化。ELISA法检测创面晚期糖基化终末产物（AGEs）的生成和堆积。Western Blotting检测创面RAGE受体和Ⅰ型胶原的表达水平。免疫荧光染色检测创面成纤维细胞增殖和凋亡水平。2.分离提取人真皮来源成纤维细胞（HDFs）并鉴定其Vimentin蛋白表达情况。体外制备糖基化白蛋白（AGEs-HSA）,检测其浓度;细胞实验分为对照组,AGEs-HSA组,HSA组,摸索其对HDFs的作用效果及合适的作用浓度。检测RAGE受体的蛋白表达;进一步检测细胞凋亡相关指标,并检测Caspase家族蛋白以明确AGEs-HSA诱导细胞凋亡的信号通路;检测线粒体凋亡信号通路中相关指标的改变,包括Bax/Bcl-2,线粒体膜电位,细胞色素C等,同时检测细胞内ROS的含量。3.探讨BBR是否可以调控AGEs-HSA对成纤维细胞的作用。细胞分为对照组,AGEs-HSA处理组,HSA处理组,BBR溶剂组、低剂量BBR及高剂量BBR处理组。首先通过细胞增殖实验（CCK-8法）及细胞毒性实验（LDH法）摸索合适的BBR浓度;检测RAGE受体的蛋白水平,并通过TUNEL,流式细胞术等方法检测细胞凋亡水平;进一步检测细胞内ROS水平,并通过ROS激活剂代替BBR的方式探索ROS是否为BBR的作用靶点;检测线粒体凋亡信号通路中相关指标的改变,包括线粒体膜电位,细胞色素C,Caspase-9和Caspase-3的蛋白表达等。结果:1.应用STZ腹腔注射SD大鼠后,糖尿病大鼠血糖明显高于正常大鼠。与NC组相比,DM组大鼠创面愈合延迟（P<0.05）,出现血管生成减少,炎症消散延迟,成纤维细胞及基质沉积减少等特征。BBR可有效促进胶原纤维的增生与成熟,加速创面新生上皮的覆盖。同时,BBR可促进肉芽组织的生长,提高创面愈合率,缩短愈合时间。2.在糖尿病创面愈合的过程中,AGEs处于不断生成和堆积的状态。BBR可抑制糖尿病创面中AGEs的生成和堆积,降低创面中RAGE受体的过度表达。同时,BBR可提高糖尿病创面中Ⅰ型胶原的表达,促进创面细胞外基质的沉积。此外,盐酸小檗碱可提高糖尿病创面中成纤维细胞的增殖能力,降低成纤维细胞的凋亡水平。3.人真皮来源成纤维细胞分离及生长情况良好;150μg/mL以内的AGEs-HSA可以呈剂量依赖性地诱导成纤维细胞凋亡,相同浓度下HSA溶液对成纤维细胞无明显促凋亡作用。AGEs-HSA可以上调RAGE受体蛋白表达水平,增加剪切形式的Caspase-9的表达,进一步实验发现AGEs-HSA可以增加Bax/Bcl-2的比值,引起线粒体膜电位丢失,促进细胞色素C的释放,提示其主要影响线粒体凋亡信号通路。同时,AGEs-HSA可以增加细胞内ROS的水平。4.BBR在75μg/mL浓度以内时,可呈剂量依赖性地拮抗AGEs-HSA的作用,促进细胞增殖,抑制细胞凋亡,降低其细胞毒性。BBR不影响成纤维细胞RAGE受体的表达。BBR可以下调细胞内ROS的水平,提示其可能通过调控ROS发挥拮抗AGEs-HSA的作用。BBR可以调控线粒体凋亡信号通路相关的指标,包括增加线粒体膜电位,减少细胞色素C释放入胞浆,下调Caspase-9和Caspase-3的活化水平。结论:1.盐酸小檗碱外用可有效促进糖尿病大鼠创面的愈合。高浓度的盐酸小檗碱效果更为显着。BBR可抑制糖尿病创面中晚期糖基化终末产物的生成,提高糖尿病创面中成纤维细胞的增殖活性,降低成纤维细胞的凋亡水平。2.AGEs-HSA可以通过结合RAGE受体,激活ROS/细胞色素C/Caspase-9/Caspase-3的线粒体凋亡信号通路,诱导人真皮来源成纤维细胞凋亡,从而影响糖尿病创面的愈合;BBR可以抑制细胞内ROS的生成,阻断AGEs-HSA对线粒体凋亡信号通路的激活,从而逆转AGEs-HSA对成纤维细胞的作用。
蔡开智[4]（2021）在《TSP-1通过PERK/eIF2α通路诱导人黏液表皮样癌MC-3细胞系钙网蛋白暴露的机制研究》文中指出目的:研究血小板反应蛋白1（Thrombospodin-1,TSP-1）诱导人黏液表皮样癌MC-3细胞系发生免疫原性死亡（Immunogenic cell death,ICD）,进一步探讨TSP-1能否通过PERK/e IF2α信号通路诱导人黏液表皮样癌MC-3细胞钙网蛋白（Calreticulin,CRT）的暴露。方法:1.选取黏液表皮样癌MC-3细胞系作为研究对象,采用CCK-8筛选MC-3细胞最适接种密度,绘制MC-3细胞生长曲线,同时检测TSP-1最佳作用浓度及作用时间;2.采用流式细胞术Annexin V/PI双染色法检测不同实验分组细胞凋亡情况,镜下观察空白对照组、TSP-1作用组、紫杉醇（Paclitaxel,PTX）作用组、TSP-1+PTX作用组细胞形态学变化;3.将细胞分为空白对照组、PTX作用组、TSP-1作用组、TSP-1+PERK抑制剂（Protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase inhibitor,ISRIB）作用组、TSP-1+PTX作用组,采用流式细胞术检测各组细胞中CRT表达的变化;4.通过免疫荧光、Western blot、QPCR等实验方法检测MC-3细胞系中PERK、e IF2α、CRT的表达情况;5.上述实验均独立重复3次,实验结果采用Graph Pad prism8.0统计软件分析,统计结果采用均数±标准差表示,多组之间的比较采用多样本均数的单因素方差分析,两组之间的比较采用独立样本的t检验;P<0.05为差异具有统计学意义。结果:MC-3细胞系按照2×104/m1的接种密度,可在第六天达到生长平台期,符合实验要求;进一步采用CCK-8实验检测TSP-1的细胞毒性,结果显示0.1μmol/L为最佳作用浓度,作用72 h为最佳检测点;流式细胞术、免疫荧光染色、Western blot、QPCR实验结果均提示:TSP-1可以诱导MC-3细胞系中钙网蛋白CRT的暴露,与空白对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）,而与阳性对照组比较差异无统计学意义（P<0.05）,实验结果还表明TSP-1作用于MC-3细胞系72 h后,伴随CRT同步表达上调的还有PERK及e IF2α的表达上调（P<0.05）;TSP-1与经典ICD诱导剂PTX联用可显着加强上述实验过程,PERK、e IF2α、CRT上调比单独用药明显（P<0.05）;而加入ISRIB作用72 h后,结果显示PERK、e IF2α、CRT均表达下调,差异有统计学意义（P<0.05）。结论:TSP-l蛋白能诱导黏液表皮样癌MC-3细胞系发生免疫原性细胞死亡,这一过程伴随着损伤相关分子模式CRT的暴露,并可能与PERK/e IF2α信号通路的激活有关。
刘丹丹[5]（2021）在《基于定量化学蛋白质组学研究雷公藤红素抗缺血性脑卒中的靶点》文中认为实验目的:本研究从细胞水平和动物水平,基于合成的雷公藤红素探针（celastrol-prob,cel-p）,联合串联质谱标签（Tandem Mass Tag,TMT）标记、细胞热转变分析（Cellular Thermal Shift Assay,CETSA）、免疫荧光（immunofluorescence,IF）、蛋白免疫印迹（western blotting,WB）等实验技术研究了活性天然产物雷公藤红素（celastrol,cel）对体内外脑缺血再灌注（ischemic-reperfusion,I/R）损伤的神经保护作用,并探索了其可能的靶点及机制,为合理开发利用天然产物celastrol提供了有力的科学支撑。实验方法:细胞水平1.提取原代新生Sprague-Dawley大鼠皮层神经元细胞体外培养并通过IF方法检测其纯度。建立原代神经元细胞氧糖剥夺（oxygen glucose deprivation,OGD）模型体外模拟脑I/R损伤,并用cell counting kit-8（CCK-8）方法确立OGD模型的最佳造模时间。采用CCK-8方法确认celastrol及合成的cel-p对神经元细胞的半数抑制浓度（50%inhibiting concentration,IC50）、是否具有体外神经保护性、最佳给药剂量及给药时间。2.采用 SDS polyacrylamide gel electrophoresis（SDS-PAGE）凝胶电泳方法,研究cel-p对原代神经元细胞的蛋白质组反应谱和生物结合效率,并验证是否与母体化合物celastrol竞争性结合位点相同。采用IF和cel-p点击化学（click chemistry reaction）实验方法,研究cel-p在原代神经元细胞中随时间的定位。3.基于TMT标记,采用亲和标签的pull-down实验和液相色谱-串联质谱（Liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS/MS）的实验方法检测 cel-p在原代神经元细胞上结合的以及被竞争掉的靶蛋白。对cel-p结合的靶蛋白进行分析,分析celastrol作用于原代神经元细胞发挥神经保护性的可能靶点。4.根据分析结果,选取可信度较高的HMGB1蛋白进行验证。采用pull-down及SDS-PAGE凝胶电泳方法,研究celastrol是否可以与cel-p竞争性结合HMGB1蛋白。采用CETSA实验,研究celastrol是否可以增强HMGB1蛋白的热稳定性。5.采用WB和IF实验方法,研究建立原代神经元OGD模型后,celastrol对HMGB1、HSP70和NF-κB p65蛋白表达的影响。通过检测细胞培养上清中的HMGB1蛋白,研究模型组HMGB1蛋白随时间延长分泌的变化以及celastrol对HMGB1蛋白的分泌量的影响。6.采用重组人HMGB1、HMGB1 A box和B box蛋白,结合SDS-PAGE凝胶电泳方法和click chemistry reaction研究cel-p是否结合了 HMGB1蛋白的半胱氨酸位点。cel-p 是否减少了 B box 与 Toll 样受体 4（Toll like receptor4,TLR4）、晚期糖基化终末产物受体（receptor for advanced glycation end products,RAGE）的结合,从而使其失去致炎作用。cel-p是否通过结合HMGB1蛋白抑制了其升高小鼠巨噬细胞样细胞系RAW 264.7细胞TNF-α分泌的能力。动物水平1.采用线栓法建立雄性成年Sprague-Dawley大鼠大脑中动脉阻断（Middle cerebral artery occlusion,MCAO）模型体内模拟脑I/R损伤,以依达拉奉注射剂（edaravone injection,eda,6 mg/kg）为阳性对照,确认 celastrol（1 mg/kg）是否具有体内神经保护性。在MCAO模型1.5 h后拔出线栓进行再灌注,再灌注后Sham组及Model组腹腔注射1 mL生理盐水,M+cel组腹腔注射celastrol（lmg/kg）,M+eda 组尾静脉注射 edaravone（6 mg/kg）,然后分别于 24 h、48 h各给药一次,共三次。24 h、48 h、72 h进行Zea-Longa法行为学评分,72 h后取出大鼠脑组织进行 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride（TTC）染色。2.在72 h后,每组取四只大鼠,经PBS、4%多聚甲醛灌流后取脑组织进行脱水、石蜡包埋,切片后对皮层组织神经元进行尼氏染色分析,对HMGB1、HSP70和NF-κB p65蛋白进行IF分析。每组取四只大鼠,分离患侧大脑中皮层组织对HMGB1、HSP70和NF-κB p65蛋白进行WB分析,进一步体内验证celastrol发挥神经保护性的靶点和机制。实验结果:细胞水平1.提取的原代神经元细胞纯度大于90%,可用于其他的实验研究。CCK-8方法确立OGD模型的最佳造模时间为缺糖缺氧4 h,celastrol与cel-p的IC50相近（celastrol IC50=2.06±0.52 μM,cel-p IC50=2.24±0.59 μM）,均具有明显的神经保护性。最佳给药剂量为0.1-0.8 μM,最佳给药时间为OGD模型后立即连续给药48 h。因此,合成的cel-p与母体化合物celastrol具有等效性,可代替原药用于后续靶点研究。2.采用SDS-PAGE凝胶电泳方法证实,对于原代神经元细胞,cel-p具有较高的生物结合效率,在低至0.8μM浓度下产生明显可见的条带,并与原药celastrol 8 ×（6.4 μM）竞争条件下具有相同的结合位点。采用IF方法和click chemistry reaction实验证实,cel-p可以在4 h内从细胞胞浆进入胞核,因此可用于标记胞浆和胞核的蛋白。3.采用TMT标记、pull-down和LC-MS/MS的方法检测cel-p在原代神经元细胞上结合的以及被竞争掉的靶蛋白。对cel-p结合的靶蛋白进行分析,发现共鉴定蛋白1405个,其中为高可信度的蛋白120个。4.根据分析结果,选取可信度较高的HMGB1蛋白进行验证。采用pull-down及SDS-PAGE凝胶电泳方法,证实celastrol可以与cel-p竞争性结合HMGB1蛋白,因此可进一步展开生物学实验以探究celastrol在细胞水平的作用靶点。采用CETSA实验,证实celastrol与HMGB1结合明显增强了 HMGB1的热稳定性。5.采用WB实验方法,证实建立原代神经元细胞OGD模型后,celastrol不能影响HMGB1的整体表达以及胞浆胞核的表达,明显升高了 HSP70的表达,降低了 NF-κB p65的表达。采用IF技术,证实cel-p与HMGB1蛋白具有共定位现象,对HMGB1、HSP70、NF-κB p65的影响趋势与WB结果一致。通过检测OGD模型组细胞培养上清中的HMGB1蛋白发现,模型组HMGB1蛋白随时间延长逐渐分泌出去到培养基中,在24 h以后达到高峰。而celastrol在OGD模型后给药48 h并没有减少培养基中HMGB1蛋白的分泌量。由以上结论我们推测,celastrol可能无法影响HMGB1蛋白的出入核和分泌,而是通过直接结合HMGB1蛋白使其失去致炎活性。6.采用重组人HMGB1蛋白,证实cel-p可以结合HMGB1蛋白,并且可以竞争性抑制已知的HMGB1蛋白抑制剂（甘草次酸、二甲双胍）与HMGB1的结合。N-Hex-5-ynyl-2-iodoacetamide（IAA-yne）与二硫键型 HMGB1 蛋白的结合可以被celastrol几乎全部抑制,用Dithiothreitol（DTT）还原HMGB1二硫键后,celastrol同样可以几乎全部抑制IAA-yne与HMGB1蛋白的结合。由此可知,celastrol可以结合二硫键型HMGB1蛋白的106位半胱氨酸,也可以结合全还原型HMGB1蛋白的23、45、106位半胱氨酸。采用重组人A box和B box蛋白,证实cel-p与Abox、B box的结合几乎不能被2-iodoacetamide（IAA）抑制,而IAA-yne与A box、B box的结合可以被celastrol几乎全部抑制。因此,celastrol除了结合HMGB1蛋白的半胱氨酸,还有其他的结合位点。Celastrol明显抑制了HMGB1引起的RAW 264.7细胞TNF-α分泌。此外,celastrol可明显抑制HMGB1 B box与TLR4、RAGE受体的结合,因此使其失去致炎活性。动物水平1.各组大鼠在MCAO后72 h进行TTC染色病理学分析显示,M+cel和M+eda组的大鼠脑组织损伤侧梗死体积相较于Model组显着降低（p<0.05）。神经功能缺损评分（Zea-Longa）显示,M+cel和M+eda的大鼠在MCAO 24 h、48 h和72 h时间点均显着降低神经功能缺损评分,改善运动功能和行为。因此,TTC染色、Zea-Longa法行为学评分结果表明,celastrol 1 mg/kg体内同样具有神经保护性。2.尼氏染色结果显示,相较于Model组大鼠,M+cel和M+eda组大鼠皮层神经元细胞尼氏小体数量显着增多,排列紧密。WB和IF实验结果表明,celastrol几乎不能影响HMGB1的表达水平,但是明显升高了 HSP70的表达,降低了 NF-κB p65,结果与体外实验趋势一致。因此,celastrol通过作用于HSP70和NF-κB p65在体内发挥抗炎作用和神经保护性。结论:由以上可知,celastrol对体内外脑缺血再灌注损伤均具有明显的神经保护性,一是通过直接结合HMGB1蛋白,使其不能与TLR4、RAGE受体结合,从而失去致炎作用,二是提高细胞或者组织HSP70的表达,降低NF-κB p65的表达而发挥抗炎作用。
左天[6]（2021）在《竹节参皂苷Ⅳ和Ⅴ诱导人肝癌细胞HepG2凋亡的分子机制研究》文中提出肝癌是目前人类因癌症而死亡的最主要癌症类型,临床中关于肝癌治疗的手段主要是手术切除、化疗、放疗等,但治疗效果不理想。中药材由于自身特有的优势在抗肝癌的应用与研究上具有极大的潜力。竹节参作为珍贵药用中药材在我国民间有悠久的历史,其主要生物活性成分是竹节参皂苷。竹节参皂苷IV、V是总多竹节参皂苷中最具代表性的两种齐墩果烷型皂苷,主要提取自竹节参的根茎部位。目前已知竹节参皂苷具有抗炎、抗心血管疾病、保护肝脏等功效,然而关于竹节参皂苷IV、V的药理功能报道却非常少。目的:本研究采用Hep G2细胞（人肝癌细胞）为主要实验对象,在细胞和分子水平上探究竹节参皂苷IV、V对肝癌细胞的影响方式及分子机制。方法:药物处理分为空白组、处理组（竹节参皂苷IV组和竹节参皂苷V组）、阳性对照组（5-氟尿嘧啶组）共四组进行。通过CCK-8实验检测竹节参皂苷IV、V对Hep G2细胞增殖影响;采用细胞划痕实验及transwell侵袭实验检测竹节参皂苷IV、V对Hep G2细胞迁移与侵袭能力的影响;显微镜下观察竹节参皂苷IV、V处理Hep G2细胞后细胞形态变化;通过荧光显微镜检测竹节参皂苷IV、V对Hep G2细胞线粒体膜电位影响;通过流式细胞仪检测竹节参皂苷IV、V对Hep G2细胞凋亡、细胞周期、钙离子浓度的变化;通过荧光定量PCR与Western blot的方法研究竹节参皂苷IV诱导Hep G2细胞凋亡的分子机制。结果:与传统化药5-氟尿嘧啶相比,竹节参皂苷IV、V对人正常肝细胞（THLE-2）没有细胞毒性,而对人肝癌细胞（Hep G2）具有一定的毒性。竹节参皂苷IV、V通过抑制Hep G2细胞增殖、降低其迁移率与侵袭能力来抑制Hep G2细胞正常生理活动。竹节参皂苷IV、V还能够促进Hep G2细胞发生凋亡,导致Hep G2细胞周期阻滞,细胞内钙离子浓度增加以及线粒体膜电位的降低。经竹节参皂苷IV培养的Hep G2细胞,其胞内的P53、BAX、CASPASE-3的m RNA表达水平上调,BCL-2 m RNA表达水平发生下调,Western blot结果显示p53、p21、Cytochrome c、Cleaved Caspase-9、Cleaved Caspase-3表达量增加,Bcl-2表达量降低。结论:竹节参皂苷IV、V具有诱导Hep G2细胞凋亡、导致细胞线粒体膜电位下降、钙离子浓度升高、抑制肝癌细胞的迁移及侵袭生理活动的功能,深入研究发现竹节参皂苷IV能通过线粒体途径和p53相关通路调控Hep G2细胞凋亡。以上研究成果表明,竹节参皂苷具有作为抗肝癌药物研究的潜力。
金永哲[7]（2021）在《Prx Ⅴ在抗肿瘤药物诱导的胃癌细胞凋亡过程中对氧化应激反应的调控作用及机制》文中研究指明胃癌作为引起人类死亡四大癌症之一,对人类的健康状况及生命安全造成了极大的威胁。由于胃癌前期的症状不明显,导致大多数胃癌患者在被诊断出时已经处于疾病的中期或晚期状态。正是这种情况,给胃癌的临床治疗带来了非常大的困难度和复杂性。目前,外科手术切除、放射疗法、化学疗法、靶向疗法和细胞疗法等治疗方法是临床治疗胃癌的主要医学方法。但是由于手术治疗风险大且具有反复性、放疗会对身体正常的组织细胞造成不可逆的损伤、化学药物可能会再治疗癌症的同时产生严重的副作用、细胞治疗手段虽然相对安全可靠,但其高昂的治疗成本和治疗手段相对不成熟的原因,致使胃癌的临床治疗还存在着众多问题。近年来,改变肿瘤局部微环境治疗各类癌症已然成为科学家研究的热点。肿瘤微环境与人体正常内环境的生理活性有很大不同,肿瘤组织的核心部分往往因其大量的细胞增殖长时间处于低氧或缺氧的环境,因此造成癌细胞中的ROS水平急剧上升。细胞内的ROS具有调节细胞的增殖、代谢等作用,与肿瘤的发生与和治疗密切相关。因此,有效地调控癌细胞内ROS水平诱导癌细胞凋亡,是一种治疗胃癌的新的突破口和研究思路。过氧化物还原酶V（Prx Ⅴ）是一种能够清除细胞内ROS并调节细胞凋亡的抗氧化酶,它能降低过氧化氢、烷基过氧化氢和过氧化亚硝酸盐,清除细胞内ROS,维持细胞内氧化还原平衡,减少由细胞内氧化应激引起的氧化损伤,然后激活相关的下游信号通路来调节细胞凋亡。它是过氧化物酶还原酶家族的成员,广泛分布于细胞质、线粒体和过氧化物酶体中,并在多种癌症中异常表达。因此,在本研究中我们利用大黄素和盐酸阿霉素这两种可以引起细胞内ROS水平升高的药物处理人胃癌AGS细胞系,诱导细胞中ROS水平的增加进一步诱导AGS细胞凋亡。同时,我们使用慢病毒载体在基因水平上改变AGS细胞中Prx Ⅴ蛋白水平将其沉默或过表达。为了探究Prx Ⅴ在由于高水平ROS引起的胃癌细胞凋亡过程中的调控作用以及可能存在的作用原理及其机制。第一部分Peroxiredoxin Ⅴ通过ROS/Bc12信号通路抑制大黄素诱导的胃癌细胞凋亡目的:探讨Prx Ⅴ在大黄素诱导胃癌AGS细胞系的细胞凋亡过程中的调控作用。方法:使用DCFH-DA染色通过流式细胞术检测大黄素处理不同时间的AGS细胞中ROS水平的变化。利用Annexin V-FITC和PI双染通过荧光显微照相和流式细胞术检测处理不同时间的大黄素处理AGS细胞凋亡情况,蛋白免疫印迹法检测大黄素在不同时间处理的AGS细胞中Prx家族蛋白的表达变化。然后加入NAC,即用ROS清除剂预处理细胞后,进行流式细胞仪检测细胞凋亡,然后用蛋白免疫印迹法检测Prx家族每个成员在细胞中蛋白表达水平的变化。利用慢病毒载体转染AGS细胞系,构建可以稳定遗传的空白载体组（Mock）、Prx Ⅴ沉默组（shPrx Ⅴ）和Prx Ⅴ过量表达组（Prx Ⅴ-his）细胞系,利用蛋白质免疫印迹法检测细胞转染情况。用流式细胞仪检测大黄素在不同时间和浓度下处理的三种细胞的凋亡变化情况和细胞内ROS的变化。通过蛋白质免疫印迹法检测大黄素处理三种细胞不同时间时细胞凋亡相关蛋白质表达情况。结果:大黄素能够显着降低AGS细胞存活率,同时以时间依赖性和浓度依赖性方式显着提高细胞内活性氧水平诱导胃癌细胞发生凋亡,在此过程中蛋白免疫印迹结果显示Prx Ⅴ的表达具有显着性差异;Prx Ⅴ的过度表达可显着降低大黄素诱导的AGS细胞中ROS的水平。同时,Prx Ⅴ的过表达可以调节促凋亡蛋白Bad和Cleaved-PARP的表达状况,并上调抗凋亡蛋白Bcl2的表达水平。在加入ROS清除剂后细胞内活性氧水平以及细胞凋亡情况明显下降。结论:1.大黄素可以通过增加细胞中ROS的表达水平来诱导AGS细胞凋亡。2.随着大黄素处理时间的增加,AGS细胞中Prx Ⅴ蛋白的表达水平降低。3.Prx Ⅴ表达含量可以调控大黄素诱导AGS细胞凋亡的程度。第二部分沉默Peroxiredoxin Ⅴ基因提高阿霉素诱导的胃癌细胞线粒体依赖性凋亡目的:探究Prx Ⅴ对阿霉素诱导的AGS胃癌细胞凋亡的可能调控作用及其机制。方法:利用慢病毒载体转染AGS细胞系,构建可以稳定遗传的空白载体组（Mock）和Prx Ⅴ沉默组（shPrx Ⅴ）细胞系,利用蛋白质免疫印迹法检测细胞转染情况。利用MTT法检测不同浓度阿霉素处理对两种细胞的细胞存活率的影响,利用Annexin V-PE染色通过流式细胞术和荧光显微照相检测不同时间以及不同浓度的阿霉素处理后两种细胞的细胞凋亡情况,利用DHE染色通过流式细胞术和荧光显微照相检测不同浓度的阿霉素处理后两种细胞内ROS水平的产生情况,利用MitoSOX染色通过流式细胞术和荧光显微照相检测不同浓度的阿霉素处理后两种细胞线粒体内ROS水平的产生情况,利用JC-1染色通过荧光显微照相检测不同浓度的阿霉素处理后两种细胞线粒体膜电位变化情况,通过蛋白质免疫印迹法检测处理不同浓度时,细胞凋亡相关蛋白质的表达情况。结果:Prx Ⅴ基因沉默可能通过加重细胞内ROS的积累而显着增加阿霉素诱导的细胞凋亡。我们还发现,阿霉素诱导的线粒体ROS水平和膜通透性改变在shPrx Ⅴ细胞中明显高于Mock细胞,并且这些现象在加入NAC显着逆转。Prx Ⅴ基因沉默也显着上调了剪切的Caspase 9、3和Bax相关的细胞死亡相关蛋白表达水平。结论:1.沉默细胞内Prx Ⅴ表达水平可以增加AGS细胞对阿霉素药物的敏感性。2.沉默细胞内Prx Ⅴ表达水平会导致细胞内及线粒体内的ROS水平蓄积增加。3.预处理NAC可以有效缓解由于阿霉素引起的细胞凋亡。
李欢[8]（2021）在《LNC001209通过CD36调节PI3K/AKT/mTOR信号通路参与铝致认知功能损害的机制研究》文中研究说明目的:通过动物实验观察铝暴露造成神经细胞凋亡进而导致认知功能障碍的过程中,Lnc001209、CD36及PI3K/AKT/m TOR信号通路中关键分子的改变情况;通过细胞实验探索铝暴露抑制Lnc001209通过CD36调节PI3K/AKT/m TOR信号通路导致神经细胞凋亡的分子机制。方法:一、选择SD（Sprague Dawley）大鼠作为研究对象,按其体质量随机分成4个组,即对照组（生理盐水组）、低剂量组（10μmol/kg麦芽酚铝）、中剂量组（20μmol/kg麦芽酚铝）、高剂量组（40μmol/kg麦芽酚铝）,每组15只,暴露方式为腹腔注射,周期为三个月。观察各组大鼠的基本情况,并计算脑重比;通过电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）检测大鼠脑组织和血浆中铝含量;通过新物体识别和Morris水迷宫实验观察大鼠的空间探索能力和学习记忆能力;通过在体动物海马长时程增强检测技术记录海马CA1区兴奋性突触后电位（f EPSP）;通过Golgi染色实验观察大鼠海马神经元轴突形态和树突棘数量变化情况;通过透射电子显微镜观察大鼠海马神经元细胞凋亡情况、突触及线粒体超微结构;通过逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测大鼠海马组织Lnc001209的表达水平;通过Western blot法检测大鼠海马组织中CD36蛋白的表达情况,检测大鼠海马组织中PI3K、AKT、m TOR蛋白及相应磷酸化蛋白的表达情况。二、选择肾上腺髓质嗜铬瘤分化细胞（PC12细胞）作为研究对象,按照暴露剂量分为四组,即对照组、低剂量组（100μmol/L麦芽酚铝）、中剂量组（200μmol/L麦芽酚铝）、高剂量组（400μmol/L麦芽酚铝）。将各个浓度染毒液的完全培养液100μL加入到对数生长期的PC12细胞,在培养箱孵育24h之后。通过电子显微镜观察PC12细胞铝暴露后细胞形态的变化;通过CCK-8方法检测PC12细胞铝暴露后细胞存活率;通过Annexin V-FITC/PI双染法检测铝暴露后细胞凋亡率;采用RT-PCR检测铝暴露后细胞中Lnc001209的表达水平;对细胞进行Lnc001209 si RNA转染,检测转染效率;通过Western blot法检测转染Lnc001209 si RNA后细胞p-AKT Ser473、p-AKT Thr308、p-p85 Tyr467、p-m TOR Ser2448及CD36蛋白表达情况,流式细胞仪检测细胞凋亡率。三、RNA体外转录与纯化后,进行RNA pull-down实验,检测Lnc001209的结合蛋白;采用质谱鉴定,分析铝暴露后的差异蛋白,通过RNA Pull Down-MS方法验证Lnc001209的互作蛋白为CD36;Western blot法检测铝暴露PC12细胞中CD36蛋白表达水平;采用RT-PCR检测细胞铝暴露后CD36基因表达水平;过表达CD36后观察细胞中p-AKT Ser473、p-AKT Thr308、p-p85 Tyr467、p-m TOR Ser2448蛋白表达水平;过表达CD36后通过Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率。结果:一、实验过程中,对照组大鼠发育正常,毛色较好,活泼好动,低剂量组的大鼠未见明显异常,中、高剂量组大鼠反应能力较差,活动稍微减弱,毛色暗沉,在实验过程中没有动物死亡;各麦芽酚铝暴露组大鼠脑重比随着暴露剂量增加逐渐下降,各组之间的差异具有统计学意义（p<0.05）。ICP-MS检测发现各麦芽酚铝暴露组大鼠的脑铝和血铝含量随着暴露剂量增加逐渐增加,高剂量组升高的最明显,各组间差异有统计学意义（p<0.05）。新物体识别实验发现,各麦芽酚铝暴露组大鼠探索新物体的次数随着暴露剂量增加逐渐减少,新物体象限停留时间逐渐减少,大鼠新物体识别的能力逐渐减弱;水迷宫实验发现,各麦芽酚铝暴露组大鼠到达平台潜伏期随着暴露剂量增加逐渐增加,穿越平台的次数逐渐减少,目标象限停留时间逐渐减少,大鼠的学习记忆功能逐渐降低。LTP结果发现,各麦芽酚铝暴露组大鼠海马CA1区激发电极随着暴露剂量增加逐渐减弱,各组间差异有统计学意义（p<0.05）。高尔基染色发现,各麦芽酚铝暴露组大鼠神经细胞轴突出现串珠样改变情况随着暴露剂量增加逐渐增加,并且树突棘的数量逐渐减少,出现了神经细胞丢失和神经细胞轴突断裂的现象。电子显微镜观察发现,麦芽酚铝暴露中、高剂量组大鼠脑组织神经细胞凋亡情况增加,其中高剂量组较为明显;铝暴露组大鼠海马CA1区神经细胞突触结构突触囊泡减少,突触后致密物变薄,高剂量组最为明显;铝暴露组大鼠海马神经细胞线粒体嵴骨折,其中高剂量组中线粒体出现肿胀。RT-PCR实验发现,铝暴露组大鼠海马Lnc001209表达量随着暴露剂量增加逐渐降低,各组间差异有统计学意义（p<0.05）。Western blot实验结果发现,铝暴露组大鼠海马CD36蛋白表达量随着暴露剂量增加逐渐升高,各组间差异有统计学意义（p<0.05）;大鼠海马PI3K、AKT、m TOR蛋白表达量随着暴露剂量增加逐渐降低;但是p-AKT Ser473、p-AKT Thr308、p-p85 Tyr467、p-m TOR Ser2448表达量随着暴露剂量增加逐渐升高,该通路中蛋白质的活性增强。有研究表明p-AKT活性强烈增强会促进神经细胞凋亡,所以麦芽酚铝暴露可以通过激活PI3K-AKT-m TOR通路造成大鼠神经细胞凋亡,导致突触可塑性损伤,表现为学习记忆功能降低。二、显微镜下观察PC12细胞形态,各麦芽酚铝暴露组细胞数量明显较少,且细胞形态出现变化,胞体变圆,轴突变短,细胞间连接逐渐减少,高剂量组尤为明显。CCK-8检测细胞存活率发现,各铝暴露组细胞活力随着暴露剂量增加逐渐下降,且各组间差异有统计学意义（p<0.05）。流式细胞仪检测PC12细胞凋亡情况发现,麦芽酚铝暴露中、高剂量组PC12细胞凋亡率增加,高剂量组细胞凋亡情况尤为明显,且各组间差异有统计学意义（p<0.05）。RT-PCR结果发现,各麦芽酚铝暴露组PC12细胞Lnc001209的表达量随着暴露剂量增加逐渐降低,且各组间差异有统计学意义（p<0.05）。在麦芽酚铝暴露PC12细胞中转染Lnc001209 si RNA后,发现p-AKT Ser473、p-AKT Thr308、p-p85 Tyr467、p-m TOR Ser244蛋白表达水平升高,麦芽酚铝暴露组蛋白磷酸化水平也升高,麦芽酚铝暴露比抑制Lnc001209对磷酸化蛋白的作用强,铝暴露+抑制Lnc001209组蛋白表达水平升高最明显,且各组间差异有统计学意义（p<0.05）。PC12细胞中转染Lnc001209 si RNA,发现CD36蛋白表达水平升高,铝暴露组CD36蛋白表达水平也升高。细胞凋亡率检测发现,与空白对照组和转染阴性对照组相比,Lnc001209 si RNA、200μmol/L Al（mal）3组和Lnc001209si RNA+200μmol/L Al（mal）3组细胞凋亡率均升高,且各组间差异有统计学意义（p<0.05）。三、RNA体外转录和纯化,琼脂糖凝胶电泳检测结果显示,观察到的条带与Lnc001209预期位置相符,可以进行RNA pull-down实验;Lnc001209 RNA pull-down实验磁珠样本中无明显条带,说明蛋白已洗脱干净,进行下一步质谱分析,实验组扣除对照组后的78个差异蛋白进行生物信息学分析,在所有差异蛋白中CD36的表达差异最为明显（p=0.00075）,还需要进一步验证。RNA pull-down-MS实验发现,正义链探针组洗脱液中可以检测到CD36,而反义链探针组洗脱液中没有检测到CD36蛋白,说明Lnc001209与CD36蛋白存在相互作用关系,进而验证了CD36蛋白是Lnc001209的互作蛋白。Western blot实验结果发现,各铝暴露组PC12细胞CD36蛋白表达量升高,且各组间差异有统计学意义（p<0.05）。RT-PCR实验发现,麦芽酚铝暴露组PC12细胞CD36基因表达量升高。CD36干预实验结果发现,过表达CD36后p-AKT Ser473、p-AKT Thr308、p-p85 Tyr467、p-m TOR Ser244蛋白表达水平均有升高的趋势,该通路被激活,其中AKT磷酸化水平升高最明显,p-AKT活性强烈增强会促进神经细胞凋亡。流式细胞仪检测PC12细胞凋亡情况发现,与空白对照组和转染阴性对照组相比,CD36过表达组、铝暴露组和CD36过表达+铝暴露组细胞凋亡率均升高,且各组间差异有统计学意义（p<0.05）,其中CD36过表达+铝暴露组PC12细胞凋亡率升高最为明显。结论:一、铝暴露可引起大鼠Lnc001209、CD36及PI3K/AKT/m TOR信号通路相关蛋白表达差异,提示铝暴露可能是通过影响该通路造成神经细胞凋亡,进而导致大鼠认知功能损害。二、铝暴露可抑制Lnc001209通过PI3K/AKT/m TOR信号通路造成神经细胞凋亡,提示铝暴露可能是通过影响该通路造成神经细胞凋亡。三、Lnc001209通过CD36调节PI3K/AKT/m TOR信号通路可能参与铝致神经细胞凋亡的过程。
王红霞[9]（2021）在《吉西他滨衍生物SZY-200对人膀胱癌细胞的抗肿瘤作用及机制研究》文中研究表明吉西他滨是一种亲水性的嘧啶核苷类抗癌药物,它通过干扰DNA合成来发挥抗肿瘤作用,是临床上治疗非小细胞肺癌,胰腺癌和膀胱癌等的一线药物。然而,其不稳定性、耐药性和毒性严重限制了其在临床中的应用。因此,对吉西他滨进行合理修饰和改造已成为研究的热点。为了促进吉西他滨的摄取和在细胞中的持续性,已经开发了多种含脂肪酸侧链的吉西他滨衍生物,例如已完成Ⅱ期临床试验的CP-4126。在本论文中,我们研究了一种新型吉西他滨衍生物SZY-200对人膀胱癌细胞的抗肿瘤作用及机制,SZY-200是在吉西他滨糖部分的5’位引入月桂酸（一种饱和中链脂肪酸）而合成。首先,我们以吉西他滨和CP-4126作为对照,通过CCK-8实验检测了 SZY-200 对多种细胞体外增殖的影响。结果发现 SZY-200 能以剂量依赖性方式显着抑制多种癌细胞增殖且对正常细胞具有一定的选择性,相同剂量下三种药物的体外抑制活性相当且对人膀胱癌细胞的毒性较强;同时,虽然我们发现CP-4126水解的产物反油酸和由SZY-200水解产生的月桂酸对正常细胞的增殖无明显差异,但克隆形成实验结果显示,月桂酸能够以剂量依赖的方式显着抑制膀胱癌细胞UM-UC-3的增殖,而反油酸却无抑制作用;进而通过实时荧光定量PCR检测发现hENT1基因在不同细胞中差异化表达,且其表达量与细胞对三种药物的敏感性基本一致。在加入核苷转运体抑制剂（NBMPR）后,我们发现SZY-200和CP-4126是独立于膜运输系统的,即不依赖hENT1协助进入膀胱癌细胞。接着,我们对SZY-200在膀胱癌细胞中发挥抗肿瘤作用的机制进行了探究。PI染色发现SZY-200与吉西他滨和CP-4126均可诱导膀胱癌细胞周期阻滞;Hoechst 33258染色观察到三种药物处理后膀胱癌细胞DNA浓缩致密而深染,细胞核发生了变形、浓缩、碎裂,形成凋亡小体,且凋亡小体的数量随着三种药物的剂量而增加;Annexin V-FITC/PI双染法结果显示三种药物诱导的凋亡程度相当;Western Blotting实验证实了三种药物均可影响膀胱癌细胞周期和凋亡相关蛋白的表达。这些数据表明,三种药物均通过诱导细胞周期阻滞和凋亡来抑制膀胱癌细胞增殖。另外,结果表明三种药物均可显着降低膀胱癌细胞的迁移能力。最后,我们利用BATMAN-TCM数据库预测得到吉西他滨和月桂酸的靶基因,发现其中月桂酸的靶基因PPARG、PTGS2与膀胱癌的发生发展相关;通过GEPIA数据库探究了两个基因在膀胱癌中的生物学意义。实时荧光定量PCR实验表明三种药物处理均可下调膀胱癌细胞中这两种基因的表达。原因可能是这两个基因位于吉西他滨靶基因的下游。总之,这些结果表明SZY-200对膀胱癌细胞增殖的抑制作用与吉西他滨和CP-4126相当,并且与CP-4126一样有望克服hENT1低表达诱导的吉西他滨耐药。本文首次报道了 SZY-200可通过诱导细胞周期阻滞和凋亡来抑制膀胱癌细胞增殖。总之,SZY-200具有与CP-4126相同或更多的优势,将是进一步进行体内研究的理想药物。
杨学亮[10]（2021）在《血根碱对线粒体自噬的抑制作用及其毒性作用研究》文中进行了进一步梳理血根碱（Sanguinarine,SAN）是一种植物来源的苯并菲啶生物碱,具有抗肿瘤、抗炎、杀菌、抗病毒等广泛的生物学活性。线粒体自噬可以调节线粒体质量,淘汰受损线粒体,过高或者过低的线粒体自噬水平都会严重影响细胞正常的机能,线粒体自噬与帕金森疾病、心脏相关性疾病等都有密切关系。为进一步探究血根碱生物活性及其分子机制和其他生物学活性,本文研究了血根碱对线粒体自噬（PINK1/Parkin信号通路）的调节活性及其分子机制,并通过体内斑马鱼模型和细胞模型研究了血根碱对斑马鱼心脏、神经系统和发育的毒性作用,本论文的目标是研究SAN对线粒体自噬的调控作用及其分子机制,以及对神经系统、心脏发育及其他器官的发育毒性。方法与结果:SAN对于线粒体自噬的抑制作用利用羰基氰化物间氯苯腙（CCCP）处理转基因细胞系Hela-PINK1或Hela-Parkin建立细胞自噬模型;通过不同浓度的SAN进行处理,不同时间点在显微镜下观察PINK1和Parkin蛋白在细胞内的定位和表达变化,以确定SAN对于线粒体自噬的处理浓度依赖性和处理时间依赖性。利用蛋白质印迹法（Western Blot）进一步研究了SAN对于自噬标志蛋白LC3B、P62和线粒体外膜受体蛋白TOM20的蛋白表达影响,进一步明确SAN对线粒体自噬的抑制作用及相关分子机制。实验结果表明:CCCP能够引起线粒体自噬,导致PINK1稳定性增加,蛋白表达上调,并向线粒体迁移;增加Parkin蛋白在线粒体上的迁移和定位;同时上调了细胞自噬标志蛋白LC3B、P62以及线粒体外膜蛋白TOM20的表达水平;而SAN处理能够显着的抑制由CCCP诱导的线粒体自噬的发生,抑制PINK1的表达和线粒体定位,并抑制Parkin在线粒体的共定位,并且抑制由CCCP引起的LC3B、P62等表达水平的变化。SAN通过抑制线粒体自噬导致神经毒性选用24 hpf至144 hpf的斑马鱼评估SAN的神经毒性,选择1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP,一种传统的神经损伤造模剂）作为阳性对照,药物处理组分别单独以SAN处理和SAN以及N-乙酰半胱氨酸（N-Acetyl-L-cysteine,NAC,一种ROS抗氧化剂）共处理斑马鱼,并通过显微成像和RT-PCR等方法进行了斑马鱼幼鱼神经元发育检测、脑部血管发育检测、脑部凋亡细胞检测、行为学检测以及神经损伤和线粒体自噬相关基因的基因表达水平检测。除此之外,为了进一步研究SAN的毒性作用机制,我们选用PC12神经细胞,进行SAN的体外毒性研究,我们利用SAN和NAC处理PC12细胞,然后进行了Hoechst33342-PI双染的凋亡检测、Ed U增殖水平检测和ROS活性氧水平检测,除此之外,利用Western Blot检测SAN和NAC处理PC12造成的α-syn、TH、caspase3、PARP、BAX、Bcl2、PINK1、Parkin的蛋白水平变化。结果表明:与空白对照组比较,MPTP阳性对照处理组的斑马鱼神经元发育迟缓并且呈现缺失的现象,脑部细胞凋亡水平上升,血管缺失,线粒体自噬和神经损伤相关基因表达异常;与MPTP处理组比较,SAN处理组具有类似的帕金森疾病症状,且呈现浓度依赖性,而NAC加入后,神经元凋亡水平显着下降,表明ROS参与了SAN诱导的凋亡过程。体外毒性研究结果表明,SAN能够诱导PC12细胞凋亡和ROS水平的提升,增殖能力的下降。而添加NAC后,PC12细胞内ROS水平显着下降,细胞凋亡水也明显降低,这表明ROS介导了凋亡的发生。SAN通过线粒体自噬引发心脏毒性我们使用48 hpf至96 hpf的斑马鱼幼鱼评估了SAN在体内的心脏毒性,使用SAN和NAC处理48hpf斑马鱼,处理至96hpf,随后进行了胚胎发育检测、心脏发育的结构和功能检测、心脏组织病理学切片染色、血细胞染色、心脏部位细胞凋亡检测、肠下静脉（SIVs）发育检测以及利用real-time PCR技术检测了心脏发育、血管生成、凋亡等基因表达水平。为了进一步研究SAN的毒性作用机制,我们选用心肌细胞HL-1细胞系,进行SAN的体外毒性研究。我们利用SAN和NAC处理HL-1细胞,然后进行了Hoechst33342-PI双染的凋亡检测、Ed U增殖水平检测和ROS活性氧水平检测。此外,利用Western Blot检测SAN和NAC处理后,PUMA、caspase3、PARP、BAX、Bcl2、caspase9、p-P38、p-Erk、p-JNK等蛋白表达水平变化。结果表明:SAN可导致心脏发育过程中的结构和功能异常,包括心率下降、红细胞数量减少、血流动力学变化、心肌细胞凋亡、SV-BA距离增加、肠下静脉充血。TUNEL法和AO染色结果表明斑马鱼心肌细胞发生凋亡。RT-PCR结果表明,SAN可以改变在心脏发育和功能中起关键作用的基因的表达水平,如:sox9b,myl7,nkx2.5和bmp10;此外,凋亡相关基因:caspase3,caspase9,bax和bcl2也被SAN改变。体外结果表明:SAN能诱导心肌细胞系HL-1细胞凋亡和ROS水平显着增加。western blotting结果显示MAPK途径（JNK和P38）显着增强,并参与SAN诱导的心脏毒性。我们的发现将更好地了解了SAN对心脏的毒性作用。血根碱引发的斑马鱼发育毒性为了对SAN的毒性作用有更全面的了解,我们利用斑马鱼模型进行了系统性的发育毒性研究,选用了4hpf的斑马鱼进行SAN处理,处理至96hpf后,对发育毒性、死亡率、畸形率、孵化率进行记录,并且进行心脏发育毒性检测、肝脏发育毒性检测、神经元发育检测、行为学检测、抗氧化系统和斑马鱼体内氧化水平检测,斑马鱼体内凋亡细胞检测,以及利用real-time PCR检测了和Nrf2通路、Wnt通路、凋亡、线粒体自噬相关基因表达水平。结果表明:与对照组相比,SAN处理可导致斑马鱼胚胎和幼鱼畸形率显着增加,心包水肿和脊柱弯曲;SAN处理组斑马鱼幼鱼的孵化率和体长显着降低;SAN还影响心脏,肝脏和神经系统的发育。进一步的研究表明,ROS活性氧水平显着增加,总超氧化物歧化酶的活性显着降低,丙二醛浓度显着升高。与对照组相比,在SAN处理组中检测到更多的凋亡细胞。另外,基因表达结果表明,在SAN处理组中,氧化应激,凋亡途径被诱导,而Nrf2和Wnt途径被抑制。综上所述,这些结果将有助于理解由SAN引起的毒性及其潜在的分子机制。
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 研究背景及立题依据 |
| 一、转移性结直肠癌的治疗现状及研究进展 |
| 二、靶向PD-1肿瘤细胞免疫治疗的机制及发展现状 |
| 三、大肠癌发生与肿瘤免疫治疗的关系研究进展 |
| 四、本研究的目的及意义 |
| 参考文献 |
| 第一章、小鼠PD-1基因敲除T细胞治疗结直肠癌的有效性及其机制研究 |
| 第一部分、小鼠PD-1基因敲除T细胞的建立及其体外抑制肿瘤的作用 |
| 材料与方法 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 本部分结果 |
| 1. 靶向PD1基因sgRNA的设计构建及鉴定 |
| 2. PCR扩增和T7E1酶切鉴定 |
| 3. PD-1基因敲除T细胞亚群比例检测 |
| 4. PD-1基因敲除T细胞体外抑制肿瘤细胞生长 |
| 5. PD-1基因敲除T细胞与CT-26细胞株共培养的体外抗肿瘤效应 |
| 6. PD-1基因敲除T细胞与CT-26细胞株共培养的体外细胞因子分泌 |
| 本部分讨论 |
| 本部分结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分、小鼠PD-1基因敲除T细胞治疗结直肠癌的有效性及可能机制 |
| 材料与方法 |
| 1. 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 本部分结果 |
| 1. 结直肠癌小鼠模型中CD8~+细胞中PD-1表达显着升高 |
| 2. 小鼠结直肠癌移植瘤模型的建立 |
| 3. 小鼠CT-26结直肠癌移植瘤模型体内抗肿瘤效应 |
| 4. 小鼠CT-26结直肠癌模型体内抗肿瘤效应可能机制 |
| 本部分讨论 |
| 本部分结论 |
| 参考文献 |
| 第二章、食蟹猴PD-1基因敲除T细胞的体内安全性评价 |
| 第一部分、食蟹猴PD-1基因敲除T细胞的建立及其生物学特性 |
| 材料与方法 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 本部分结果 |
| 1. 食蟹猴外周血T细胞的培养 |
| 2. 食蟹猴PD-1敲除T细胞载体的构建及敲除效率的检测 |
| 3. 食蟹猴PD-1基因敲除对T细胞增殖的影响 |
| 4. 食蟹猴PD-1基因敲除对T细胞亚群的影响 |
| 5. 食蟹猴PD-1基因敲除对T细胞周期的影响 |
| 6. 食蟹猴PD-1基因敲除对T细胞死亡殖的影响 |
| 7. 食蟹猴PD-1基因敲除对T细胞细胞因子分泌的影响 |
| 8. 混合淋巴细胞反应 |
| 本部分讨论 |
| 本部分结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分、食蟹猴PD-1基因敲除T细胞的体内安全性评价 |
| 材料与方法 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 本部分结果 |
| 1. 食蟹猴一般情况 |
| 2. 食蟹猴PD-1基因敲除T细胞体内持续时间的检测 |
| 3. 食蟹猴PD-1基因敲除T细胞体内安全性的评价 |
| 4. PD-1基因敲除T细胞回输对食蟹猴各组织器官的影响 |
| 本部分讨论 |
| 本部分结论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 综述 PDH/PD-L1信号通路及其相关抗肿痛免疫疗法在结直肠癌中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 缺血性脑卒中的疾病负担与临床治疗现状 |
| 1.2 缺血性脑卒中的损伤机制 |
| 1.2.1 细胞兴奋毒性 |
| 1.2.2 氧化应激和硝化应激损伤 |
| 1.2.3 炎症反应 |
| 1.2.4 细胞凋亡 |
| 1.2.5 细胞自噬 |
| 1.3 小胶质细胞广泛参与神经系统疾病的发生、发展 |
| 1.3.1 阿尔兹海默病 |
| 1.3.2 帕金森病 |
| 1.3.3 癫痫 |
| 1.3.4 脊髓损伤 |
| 1.4 小胶质细胞在缺血性脑卒中的研究现状 |
| 1.4.1 缺血性卒中时小胶质细胞上表达的受体和通道蛋白 |
| 1.4.2 缺血性卒中后与小胶质细胞相关性神经损伤的酶类 |
| 1.4.3 靶向小胶质细胞的疗法在缺血性卒中治疗中的应用 |
| 1.4.4 小胶质细胞活动的在体实时呈像 |
| 1.5 IL-4/STAT6信号通路对小胶质细胞的作用 |
| 1.5.1 JAK/STAT信号通路 |
| 1.5.2 小胶质细胞中的IL-4/STAT6信号通路介导神经功能恢复 |
| 第2章 脑梗塞可导致小胶质细胞极化表型和炎症因子的改变 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.2.3 统计分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 缺血性脑卒中患者血液中小胶质细胞相关炎症因子变化 |
| 2.3.2 缺血性脑卒中大鼠血液中小胶质细胞相关炎症因子变化 |
| 2.3.3 免疫荧光检测缺血半暗带小胶质细胞极化情况 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 IL-4对急性脑梗塞大鼠的神经保护作用 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.2.3 统计分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 IL-4对大鼠tMCAO后神经功能缺损的影响 |
| 3.3.2 IL-4对大鼠脑梗死容积的影响 |
| 3.3.3 IL-4对大鼠血液中炎症因子的影响 |
| 3.3.4 IL-4对大鼠缺血半暗带区小胶质细胞极化表型的影响 |
| 3.3.5 IL-4对大鼠缺血半暗带区细胞凋亡的影响 |
| 3.3.6 IL-4对大鼠缺血半暗带区皮层神经元的影响 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 IL-4诱导小胶质细胞向M2表型极化并发挥神经保护作用的机制 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.2.3 统计分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 IL-4对小胶质细胞炎症因子分泌的影响 |
| 4.3.2 IL-4促进小胶质细胞向M2表型极化的分子通路 |
| 4.3.3 IL-4对小胶质细胞极化表型的影响 |
| 4.3.4 IL-4对小胶质细胞内吞能力的影响 |
| 4.3.5 IL-4处理的小胶质细胞对OGD处理的神经元凋亡的影响 |
| 4.3.6 IL-4处理的小胶质细胞对OGD处理的神经元线粒体膜电位的影响 |
| 4.3.7 IL-4处理的小胶质细胞对OGD处理的神经元调亡蛋白表达的影响 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 讨论 |
| 第6章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及科研成果 |
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 文献综述 |
| 1. 创面的修复过程 |
| 1.1 凝血期 |
| 1.2 炎症期 |
| 1.3 增殖期 |
| 1.4 重塑期 |
| 2. 糖尿病创面的修复异常 |
| 2.1 糖尿病创面血管生成减少 |
| 2.2 糖尿病创面炎症消退延迟 |
| 2.3 糖尿病创面氧化应激增强 |
| 3. 糖尿病创面的治疗现状及盐酸小檗碱的应用 |
| 3.1 盐酸小檗碱对葡萄糖代谢的影响 |
| 3.2 盐酸小檗碱对脂质代谢的影响 |
| 3.3 盐酸小檗碱对胰岛素抵抗的影响 |
| 3.4 盐酸小檗碱对血管内皮细胞的影响 |
| 3.5 盐酸小檗碱对炎症反应的影响 |
| 3.6 盐酸小檗碱对氧化应激的影响 |
| 第二部分 盐酸小檗碱外用对糖尿病大鼠创面愈合的作用 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验结果 |
| 2. 实验结果 |
| 2.1 糖尿病大鼠一般状态的观察 |
| 2.2 各组大鼠的血糖变化 |
| 2.3 各组大鼠的体重变化 |
| 2.4 创面模型制备后各组创面愈合情况的观察 |
| 2.5 各组大鼠创面愈合率的比较 |
| 2.6 各组大鼠创面愈合时间的比较 |
| 2.7 各组大鼠创面组织HE染色 |
| 2.8 各组大鼠创面组织Masson染色 |
| 3. 讨论 |
| 4. 小结 |
| 第三部分 盐酸小檗碱外用对糖尿病创面AGEs及成纤维细胞的影响 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2. 实验结果 |
| 2.1 各组大鼠创面AGEs的含量 |
| 2.2 各组大鼠创面胶原及RAGE受体的蛋白表达情况 |
| 2.3 各组大鼠创面中成纤维细胞增殖及凋亡水平的差异 |
| 3. 讨论 |
| 4. 小结 |
| 第四部分 盐酸小檗碱对人成纤维细胞的影响及作用机制 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2. 实验结果 |
| 2.1 AGEs-HSA对糖尿病创面愈合过程中人真皮来源成纤维细胞的影响 |
| 2.2 盐酸小檗碱对AGEs刺激的成纤维细胞的影响及作用机制 |
| 3. 讨论 |
| 4. 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 中英缩略词对照表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 肿瘤细胞免疫原性死亡的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 附件 |
| 病例报告 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英汉缩略语名词对照 |
| 文献综述 雷公藤红素对神经退行性疾病的神经保护作用及主要作用机制 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 实验一 celastrol发挥体外神经保护作用的靶点和通路 |
| 第一节 celastrol及cel-p的体外神经保护性初步探索 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 实验试剂 |
| 1.1.3 实验材料 |
| 1.1.4 实验设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 新生大鼠原代皮层神经元细胞提取 |
| 1.2.2 定期显微镜下观察神经元形态 |
| 1.2.3 IF鉴定大鼠原代皮层神经元特异性及纯度 |
| 1.2.4 神经元OGD模型条件摸索 |
| 1.2.5 CCK-8法确定celastrol及cel-p的IC_(50) |
| 1.2.6 celastrol及cel-p是否具有体外神经保护作用 |
| 1.2.7 统计学方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二节 cel-p具有较高的蛋白标记效率 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 实验试剂 |
| 1.1.3 实验材料 |
| 1.1.4 实验设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 提取大鼠原代皮层神经元细胞进行体外培养 |
| 1.2.2 cel-p蛋白标记效率探究 |
| 1.2.3 click chemistry reaction及SDS-PAGE凝胶分离 |
| 1.2.4 cel-p细胞成像实验 |
| 1.2.5 统计学方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三节 TMT标记结合LC-MS/MS确认celastrol的靶蛋白 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 实验试剂 |
| 1.1.3 实验材料 |
| 1.1.4 实验设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 提取大鼠原代皮层神经元细胞进行体外培养 |
| 1.2.2 pull-down, TMT标记及LC-MS/MS分析 |
| 1.2.3 cel-p的靶标识别及验证 |
| 1.2.4 统计学方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四节 HMGB1是celastrol的直接结合靶蛋白 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 实验试剂 |
| 1.1.3 实验材料 |
| 1.1.4 实验设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 提取大鼠原代皮层神经元细胞进行体外培养 |
| 1.2.2 pull-down及WB实验对HMGB1进行验证 |
| 1.2.3 celastrol对HMGB1蛋白热稳定性的影响 |
| 1.2.4 click chemistry reaction荧光实验 |
| 1.2.5 高浓度celastrol和cel-p作用5h对HMGB1蛋白的影响 |
| 1.2.6 统计学方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第五节 celastrol发挥神经保护性作用的通路 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 实验试剂 |
| 1.1.3 实验材料 |
| 1.1.4 实验设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 提取大鼠原代皮层神经元细胞进行体外培养 |
| 1.2.2 celastrol对正常神经元细胞HMGB1蛋白表达的影响 |
| 1.2.3 celastrol对OGD模型后HMGB1蛋白表达的影响 |
| 1.2.4 celastrol对神经元OGD模型HMGB1/HSP70/NF-κB p65的影响 |
| 1.2.5 IF实验观察celastrol对HMGB1、HSP70、NF-κB p65的影响 |
| 1.2.6 celastrol是否影响上清中HMGB1蛋白表达 |
| 1.2.7 celastrol是否影响HMGB1蛋白的氧化还原性 |
| 1.2.8 统计学方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第六节 celastrol直接结合HMGB1和B box使其失活 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 实验试剂 |
| 1.1.3 实验材料 |
| 1.1.4 实验设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 提取大鼠原代皮层神经元细胞进行体外培养 |
| 1.2.2 重组人A box及B box蛋白纯化及表达 |
| 1.2.3 重组人HMGB1蛋白与celastrol及cel-p反应 |
| 1.2.4 HMGB1抑制剂与cel-p的竞争性结合 |
| 1.2.5 重组人A box及B box蛋白与celastrol及cel-p反应 |
| 1.2.6 RAW 264.7细胞复苏、培养、传代、冻存 |
| 1.2.7 celastrol对HMGB1、B box引起的TNF-α分泌升高的影响 |
| 1.2.8 celastrol对B box与受体结合的影响 |
| 1.2.9 统计学方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 实验二 celastrol对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用及机制研究 |
| 第一节 celastrol的体内药效初步评价 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 实验试剂 |
| 1.1.3 实验材料 |
| 1.1.4 实验设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 实验动物MCAO模型制备 |
| 1.2.2 实验动物分组及给药 |
| 1.2.3 Zea-Longa法评估动物的神经行为缺损 |
| 1.2.4 TTC染色观察大鼠的脑梗死情况 |
| 1.2.5 统计学方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二节 celastrol通过HMGB1,HSP70,NF-κB p65发挥体内神经保护性 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 实验试剂 |
| 1.1.3 实验材料 |
| 1.1.4 实验设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 实验动物MCAO模型制备 |
| 1.2.2 实验动物分组及给药 |
| 1.2.3 大鼠灌流,取脑及脱水 |
| 1.2.4 尼氏染色观察celastrol对尼氏小体的影响 |
| 1.2.5 IF实验观察celastrol对HMGB1、HSP70、NF-κB p65的影响 |
| 1.2.6 WB检测大鼠中皮层HMGB1、HSP70、NF-κB p65表达 |
| 1.2.7 统计学方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 讨论 |
| 全文总结 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间的成果 |
| 致谢 |
| 中医药科技查新报告书 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 前言 |
| 1.1 竹节参的研究进展 |
| 1.1.1 竹节参的概述 |
| 1.1.2 竹节参的药用研究 |
| 1.2 竹节参皂苷的研究进展 |
| 1.2.1 竹节参皂苷的概述 |
| 1.2.2 竹节参皂苷的药理功能 |
| 1.3 肝癌的研究进展 |
| 1.3.1 肝癌的概述 |
| 1.3.2 肝癌的治疗 |
| 1.3.3 中药材用于肝癌治疗研究 |
| 1.4 本文的研究意义及内容 |
| 1.4.1 研究目的 |
| 1.4.2 研究内容 |
| 2 竹节参皂苷Ⅳ、Ⅴ对肝癌细胞增殖、迁移和侵袭影响 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验细胞株 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 配制完全培养基与药物培养基 |
| 2.2.2 细胞培养 |
| 2.2.3 CCK-8实验 |
| 2.2.4 细胞划痕实验 |
| 2.2.5 Transwell小室实验 |
| 2.2.6 统计学分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 竹节参皂苷Ⅳ、Ⅴ对肝癌细胞与正常肝细胞的增殖影响 |
| 2.3.2 竹节参皂苷Ⅳ、Ⅴ抑制肝癌HepG2细胞迁移 |
| 2.3.3 竹节参皂苷Ⅳ、Ⅴ对肝癌HepG2细胞侵袭能力的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 3 竹节参皂苷诱导肝癌细胞凋亡 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验细胞株 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.1.3 实验仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 细胞形态学观察 |
| 3.2.2 Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测 |
| 3.2.3 细胞周期检测 |
| 3.2.4 细胞内钙离子浓度检测 |
| 3.2.5 线粒体膜电位(MMP)检测 |
| 3.2.6 统计学分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 竹节参皂苷Ⅳ、Ⅴ作用后HepG2细胞的形态学观察 |
| 3.3.2 竹节参皂苷Ⅳ、Ⅴ诱导HepG2细胞凋亡 |
| 3.3.3 竹节参皂苷Ⅳ、Ⅴ对 HepG2细胞周期影响 |
| 3.3.4 竹节参皂苷Ⅳ、Ⅴ对细胞钙离子浓度的影响 |
| 3.3.5 竹节参皂苷Ⅳ、Ⅴ对细胞线粒体膜电位的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 4 竹节参皂苷Ⅴ诱导肝癌细胞凋亡的分子机制研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验细胞株 |
| 4.1.2 实验试剂 |
| 4.1.3 实验仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 荧光定量检测P53、BAX、BCl-2、CASPASE-3的表达量 |
| 4.2.3 Western blot检测凋亡蛋白 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 荧光定量PCR |
| 4.3.2 Western bolt |
| 4.4 讨论 |
| 5 总结 |
| 5.1 小结 |
| 5.2 研究的创新点 |
| 5.3 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间研究成果 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词汇 |
| 前言 |
| 第一部分 Peroxiredoxin Ⅴ通过ROS/Bcl2信号通路抑制大黄素诱导的胃癌细胞凋亡 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 实验材料与实验仪器 |
| 1.1.1 细胞株 |
| 1.1.2 实验试剂 |
| 1.1.3 实验材料 |
| 1.1.4 实验仪器 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 细胞培养 |
| 1.2.1.1 细胞复苏、换液 |
| 1.2.1.2 细胞传代 |
| 1.2.1.3 细胞冻存 |
| 1.2.2 细胞转染 |
| 1.2.2.2 AGS胃癌细胞侵染 |
| 1.2.2.3 AGS胃癌转染细胞的筛选 |
| 1.2.3 细胞内ROS检测 |
| 1.2.4 细胞凋亡检测 |
| 1.2.5 蛋白质免疫印迹法 |
| 2.结果 |
| 2.1 大黄素对胃癌细胞内活性氧水平的影响 |
| 2.2 大黄素诱导AGS胃癌细胞凋亡,降低Prx Ⅴ表达水平 |
| 2.2.1 荧光显微镜检测结果 |
| 2.2.2 流式细胞仪检测结果 |
| 2.2.3 Emodin对 AGS细胞内Prxs家族某些蛋白表达水平的影响 |
| 2.3 大黄素诱导的AGS细胞凋亡与细胞内ROS相关 |
| 2.3.1 抑制活性氧后细胞内凋亡水平 |
| 2.3.2 流式细胞仪检测细胞内ROS水平 |
| 2.4 过表达Prx Ⅴ可减少大黄素诱导的AGS细胞凋亡 |
| 2.4.1 慢病毒载体构建Prx Ⅴ敲降、过表达以及空白载体AGS细胞系 |
| 2.4.2 不同浓度大黄素对AGS细胞的影响 |
| 2.4.3 大黄素时间段处理AGS细胞 |
| 2.5 过表达Prx Ⅴ可显着调节大黄素处理AGS细胞凋亡相关蛋白的表达 |
| 2.5.1 蛋白免疫印迹法检测Mock/shPrx Ⅴ/Prx Ⅴ-his的AGS细胞中Bad、cleaved-PARP和Bcl2的表达水平 |
| 3.讨论 |
| 4.结论 |
| 第二部分 沉默Peroxiredoxin Ⅴ基因提高阿霉素诱导的胃癌细胞线粒体依赖性凋亡 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 实验材料与实验仪器 |
| 1.1.1 细胞株 |
| 1.1.2 实验试剂 |
| 1.1.3 实验材料 |
| 1.1.4 实验仪器 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 细胞培养 |
| 1.2.1.1 细胞复苏 |
| 1.2.1.2 细胞换液 |
| 1.2.1.3 细胞传代 |
| 1.2.1.4 细胞冻存 |
| 1.2.2 细胞转染 |
| 1.2.2.1 慢病毒构建 |
| 1.2.2.2 慢病毒侵染 |
| 1.2.2.3 转染细胞的筛选 |
| 1.2.3 细胞内ROS检测 |
| 1.2.3.1 DHE荧光探针检测细胞内活性氧的变化 |
| 1.2.3.2 MitoSOX荧光探针检测细胞线粒体内活性氧的变化 |
| 1.2.4 细胞凋亡检测 |
| 1.2.5 细胞线粒体膜电位检测 |
| 1.2.6 蛋白质免疫印迹法 |
| 1.2.6.1 回收AGS细胞蛋白质样品 |
| 1.2.6.2 检测蛋白质浓度 |
| 1.2.6.3 进行凝胶电泳分离蛋白 |
| 1.2.6.4 脱脂乳进行封闭及一抗,二抗封闭 |
| 1.2.6.5 Western blot成像仪进行照相 |
| 1.2.7 统计分析 |
| 2.结果 |
| 2.1 沉默Prx Ⅴ增加了阿霉素对AGS细胞的细胞毒性作用 |
| 2.1.1 蛋白质免疫印迹法检测结果 |
| 2.1.2 MTT检测结果 |
| 2.2 沉默Prx Ⅴ增加了阿霉素诱导的AGS细胞凋亡及活性氧蓄积 |
| 2.2.1 荧光显微镜、流式细胞术分析结果 |
| 2.2.2 荧光显微镜分析结果 |
| 2.3 沉默Prx Ⅴ增加了阿霉素诱导的AGS细胞线粒体膜通透性、线粒体依赖性凋亡及活性氧 |
| 2.3.1 流式细胞术分析结果 |
| 2.3.2 荧光染色检测结果 |
| 2.4 沉默Prx Ⅴ增加了阿霉素诱导的AGS细胞线粒体膜通透性、线粒体依赖性凋亡及活性氧 |
| 2.4.1 流式细胞术分析结果 |
| 2.5 活性氧是Prx Ⅴ发挥作用的主要靶点之一 |
| 2.5.1 流式细胞术分析结果 |
| 2.5.2 荧光显微镜分析结果 |
| 2.6 活性氧是Prx Ⅴ发挥作用的主要靶点之一 |
| 2.6.1 流式细胞术分析结果 |
| 2.6.2 荧光显微镜分析结果 |
| 2.7 活性氧清除剂有效抑制因沉默Prx Ⅴ引发的细胞凋亡 |
| 2.7.1 蛋白质免疫印迹法分析结果 |
| 3.讨论 |
| 4.结论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录攻读学位期间发表的论文 |
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 常用缩写词中英文对照表 |
| 前言 |
| 第一部分 铝致大鼠认知功能损害过程中造成Lnc001209、CD36及PI3K-AKT-mTOR信号通路相关蛋白差异表达 |
| 1 对象与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 仪器和试剂 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 各组大鼠的基本情况 |
| 2.2 各组大鼠的脑铝和血铝含量 |
| 2.3 各组大鼠行为学测试 |
| 2.4 各组大鼠LTP实验结果 |
| 2.5 各组大鼠脑组织镜下形态结构及细胞凋亡情况 |
| 2.6 各组大鼠海马Lnc001209 的表达情况 |
| 2.7 各组大鼠海马CD36 蛋白的表达情况 |
| 2.8 各组大鼠海马PI3K/AKT/mTOR通路中相关蛋白的表达情况 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第二部分 Lnc001209 通过PI3K-AKT-mTOR信号通路可参与铝致PC12 细胞凋亡 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验细胞 |
| 1.2 仪器和试剂 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 铝暴露引起PC12 细胞形态变化 |
| 2.2 铝暴露引起PC12 细胞活力变化 |
| 2.3 铝暴露引起PC12 细胞凋亡率变化 |
| 2.4 铝暴露PC12 细胞后Lnc001209 的表达量 |
| 2.5 转染Lnc001209 siRNA对 PC12 细胞p-PI3K、p-AKT、p-mTOR的影响 |
| 2.6 转染Lnc001209 siRNA对 PC12 细胞CD36 蛋白的影响 |
| 2.7 转染Lnc001209 siRNA对 PC12 细胞凋亡率的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第三部分 Lnc001209 通过CD36 调节PI3K-AKT-mTOR信号通路可参与铝致PC12细胞凋亡 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验对象 |
| 1.2 仪器和试剂 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 RNA pull-down确定Lnc001209 的相互作用蛋白为CD36 |
| 2.2 铝暴露后PC12 细胞CD36 蛋白表达情况 |
| 2.3 转染CD36对PC12 细胞p-PI3K、p-AKT和 p-mTOR蛋白的影响 |
| 2.4 转染CD36 对PC12 细胞凋亡率的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 铝导致神经毒性作用机制的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 附录 |
| 第1章 前言 |
| 1.1 吉西他滨 |
| 1.1.1 吉西他滨在细胞内的运输和代谢过程 |
| 1.1.2 吉西他滨的应用缺陷 |
| 1.2 基于吉西他滨的结构修饰和新制剂研究 |
| 1.2.1 4'位氨基修饰的吉西他滨衍生物 |
| 1.2.2 5'位羟基修饰的吉西他滨衍生物(CP-4126) |
| 1.2.3 吉西他滨的新型制剂研究 |
| 1.3 脂肪酸 |
| 1.3.1 反油酸 |
| 1.3.2 月桂酸 |
| 1.4 膀胱癌 |
| 1.4.1 非肌肉浸润性膀胱癌 |
| 1.4.2 肌肉浸润性膀胱癌 |
| 1.5 膀胱癌发生发展中的关键基因 |
| 1.5.1 PPARG |
| 1.5.2 PTGS2 (COX-2) |
| 1.6 BATMAN-TCM数据库 |
| 1.7 主要内容及意义 |
| 第2章 SZY-200对膀胱癌细胞的抗肿瘤作用研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 药物与细胞 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.2.3 试剂配制 |
| 2.2.4 主要器材 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞复苏与冻存 |
| 2.3.2 细胞传代 |
| 2.3.3 实时荧光定量PCR |
| 2.3.4 细胞存活率检测 |
| 2.3.5 平板克隆形成实验 |
| 2.3.6 细胞形态观察 |
| 2.3.7 统计学分析 |
| 2.4 结果 |
| 2.4.1 SZY-200对多种癌细胞增殖的影响 |
| 2.4.2 月桂酸和反油酸对膀胱癌细胞增殖的影响 |
| 2.4.3 SZY-200对正常细胞增殖的影响 |
| 2.4.4 月桂酸和反油酸对正常细胞增殖的影响 |
| 2.4.5 SZY-200对膀胱癌细胞形态的影响 |
| 2.4.6 hENT1基因mRNA的表达水平 |
| 2.4.7 hENT1抑制剂NBMPR对药物细胞毒性的影响 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 本章小结 |
| 第3章 SZY-200对膀胱癌细胞的抗肿瘤作用机制研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验试剂 |
| 3.3 Western Blot相关试剂配制 |
| 3.3.1 细胞裂解液 |
| 3.3.2 聚丙烯酰胺凝胶相关试剂 |
| 3.4 主要仪器 |
| 3.5 实验方法 |
| 3.5.1 细胞周期检测 |
| 3.5.2 细胞凋亡检测 |
| 3.5.3 周期和凋亡相关蛋白表达检测 |
| 3.5.4 细胞迁移能力测定 |
| 3.5.5 药物靶基因预测及分析 |
| 3.6 结果 |
| 3.6.1 SZY-200引起膀胱癌细胞周期阻滞 |
| 3.6.2 SZY-200影响细胞周期相关蛋白表达 |
| 3.6.3 SZY-200诱导膀胱癌细胞凋亡 |
| 3.6.4 SZY-200对细胞凋亡相关蛋白表达的影响 |
| 3.6.5 SZY-200降低膀胱癌细胞迁移能力 |
| 3.6.6 膀胱癌相关基因预测及分析 |
| 3.7 讨论 |
| 3.8 本章小结 |
| 第4章 全文总结与展望 |
| 4.1 总结 |
| 4.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩写词 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 血根碱简介 |
| 1.1.1 血根碱的化学性质 |
| 1.1.2 血根碱的研究现状 |
| 1.2 线粒体自噬 |
| 1.2.1 线粒体自噬的功能作用 |
| 1.2.2 细胞自噬及线粒体自噬的研究历程 |
| 1.2.3 线粒体自噬失调导致的相关疾病 |
| 1.3 斑马鱼简介 |
| 第2章 血根碱通过PINK1/Parkin通路抑制线粒体自噬 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验对象 |
| 2.2.2 实验试剂及耗材 |
| 2.2.3 实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 溶液配制 |
| 2.3.2 实验分组以及细胞处理 |
| 2.3.3 PINK1/Parkin荧光成像 |
| 2.3.4 Western blot |
| 2.3.5 统计学分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 SAN抑制了CCCP诱导的线粒体自噬 |
| 2.4.2 SAN通过PINK1/Parkin通路抑制线粒体自噬 |
| 2.5 讨论 |
| 第3章 血根碱导致PC12 神经细胞凋亡并诱发斑马鱼神经损伤的发生 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 实验动物和细胞 |
| 3.2.2 实验试剂 |
| 3.2.3 实验仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 溶液配制 |
| 3.3.2 实验分组及处理 |
| 3.3.3 多巴胺神经元检测 |
| 3.3.4 脑部血管系统发育检测 |
| 3.3.5 斑马鱼TUNEL凋亡染色 |
| 3.3.6 行为学检测 |
| 3.3.7 RNA提取及real-time PCR |
| 3.3.8 Hoechst33342-PI双染凋亡成像检测 |
| 3.3.9 Ed U增殖成像检测 |
| 3.3.10 ROS活性氧成像检测 |
| 3.3.11 Western blot |
| 3.3.12 统计学分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 血根碱对斑马鱼多巴胺神经元发育的影响 |
| 3.4.2 血根碱对斑马鱼脑部血管发育的影响 |
| 3.4.3 血根碱对斑马鱼行为学的影响 |
| 3.4.4 血根碱对斑马鱼线粒体自噬和神经损伤相关基因表达水平的影响 |
| 3.4.5 血根碱对斑马鱼脑部凋亡水平影响 |
| 3.4.6 血根碱对PC12 神经细胞凋亡的影响 |
| 3.4.7 血根碱对PC12 神经细胞增殖的影响 |
| 3.4.8 血根碱对PC12 神经细胞ROS活性氧水平的影响 |
| 3.4.9 血根碱对PC12 神经细胞线粒体自噬和神经损伤相关蛋白表达水平的影响 |
| 3.5 讨论 |
| 第4章 血根碱诱发斑马鱼心脏毒性并导致HL-1 心肌细胞凋亡 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 实验动物和细胞 |
| 4.2.2 实验试剂 |
| 4.2.3 实验仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 溶液配制 |
| 4.3.2 实验分组及处理 |
| 4.3.3 斑马鱼胚胎发育检测 |
| 4.3.4 斑马鱼心脏毒性检测 |
| 4.3.5 斑马鱼组织病理学分析 |
| 4.3.6 斑马血细胞染色(邻联茴香胺染色法) |
| 4.3.7 斑马鱼吖啶橙凋亡染色 |
| 4.3.8 斑马鱼TUNEL凋亡染色 |
| 4.3.9 斑马鱼肠下静脉(SIVs)发育检测 |
| 4.3.10 斑马鱼动脉、静脉血流速度检测 |
| 4.3.11 RNA提取及real-time PCR |
| 4.3.12 HL-1 心肌细胞Hoechst33342-PI双染凋亡成像检测 |
| 4.3.13 HL-1 心肌细胞Ed U增殖成像检测 |
| 4.3.14 HL-1 心肌细胞ROS活性氧成像检测 |
| 4.3.15 Western blot |
| 4.3.16 统计学分析 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 SAN引起斑马鱼心脏毒性 |
| 4.4.2 SAN对斑马鱼心脏形态发育的影响 |
| 4.4.3 SAN对斑马鱼心脏容血、回血能力的影响 |
| 4.4.4 SAN对斑马鱼体内凋亡水平的影响 |
| 4.4.5 SAN对斑马鱼肠下静脉(SIVs)发育的影响 |
| 4.4.6 SAN对斑马鱼动脉、静脉血流速度的影响 |
| 4.4.7 SAN对斑马鱼体内心脏发育、凋亡、造血相关基因表达水平的影响 |
| 4.4.8 SAN对HL-1 心肌细胞凋亡的影响 |
| 4.4.9 SAN对HL-1 心肌细胞增殖的影响 |
| 4.4.10 SAN对 HL-1 心肌细胞ROS活性氧水平的影响 |
| 4.4.11 SAN对 HL-1 心肌细胞凋亡和MAPK信号通路相关蛋白表达水平的影响 |
| 4.5 讨论 |
| 第五章 血根碱通过调节氧化应激、凋亡以及Wnt和 Nrf2 信号通路诱导斑马鱼幼鱼的发育毒性 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 实验动物 |
| 5.2.2 实验试剂 |
| 5.2.3 实验仪器 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 溶液配制 |
| 5.3.2 实验分组及处理 |
| 5.3.3 发育毒性、死亡率、畸形率、孵化率检测 |
| 5.3.4 心脏发育毒性 |
| 5.3.5 肝脏发育毒性 |
| 5.3.6 行为学变化和神经发育毒性 |
| 5.3.7 T-SOD、CAT、MDA水平检测 |
| 5.3.8 斑马鱼ROS活性氧检测 |
| 5.3.9 吖啶橙染色 |
| 5.3.10 TUNEL染色 |
| 5.3.11 RNA提取及real-time PCR |
| 5.3.12 统计学分析 |
| 5.4 结果 |
| 5.4.1 SAN对斑马鱼发育毒性、死亡率、畸形率、孵化率的影响 |
| 5.4.2 SAN处理导致了斑马鱼的心脏毒性 |
| 5.4.3 SAN对斑马鱼的肝脏发育毒性 |
| 5.4.4 SAN处理导致了斑马鱼的神经发育毒性和行为学异常 |
| 5.4.5 SAN处理导致了斑马鱼体内ROS活性氧水平的升高以及T-SOD、CAT、MDA活性变化 |
| 5.4.6 SAN处理导致了斑马鱼的凋亡水平上升 |
| 5.4.7 SAN处理对斑马鱼Wnt、Nrf2 信号通路和凋亡、线粒体自噬相关基因表达水平的影响 |
| 5.5 讨论 |
| 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间主要科研成果 |
| 一、发表学术论文 |
| 二、参与项目 |
| 三、参加会议 |
| 四、获得奖励 |
