磷脂酰肌醇 3-激酶是趋化因子信号传导的关键信使

一、磷脂酰肌醇3激酶是趋化因子信号转导的关键信使（论文文献综述）

张亮^[1]（2021）在《基于中医象思维探讨肾衰饮干预慢性肾功能衰竭大鼠的机制研究》文中指出目的:基于中医象思维研究肾衰饮对慢性肾功能衰竭大鼠TLR4/MyD88/NF-κB信号通路、Fas/Fas L介导的凋亡途径、PI3K/Akt信号通路的影响,探讨该方防治慢性肾功能衰竭的作用机制。材料与方法:选取6周龄SPF级健康雄性SD大鼠84只,随机抽取12只大鼠为正常组,其余72只为造模组。造模组大鼠应用腺嘌呤（200mg/（kg·d））灌胃3周建立慢性肾功能衰竭大鼠模型,将造模成功大鼠再随机分为模型组、肾衰饮组、尿毒清组、P13K抑制剂组（LY组）及肾衰饮+LY组。正常组和模型组予0.9%Nacl溶液8ml/（kg·d）灌胃。肾衰饮组给予中药复方汤剂肾衰饮煎剂按生药量33.3g/（kg·d）灌胃。尿毒清组给予尿毒清颗粒以2.25g/（kg·d）浓度灌胃。LY组给予腹腔注射P13K抑制剂（LY294002）稀释液50mg/kg,周一次。肾衰饮+LY组在给予肾衰饮煎剂按生药量33.3g/（kg·d）灌胃基础上腹腔注射LY294002稀释液50mg/kg,周一次。以上各组大鼠均连续用药4周。各组分别留取大鼠血清及肾组织,检测各项指标。实验一:观察大鼠一般状态,肉眼观察肾脏外观形态,光镜下观察大鼠肾组织病理改变及TUNEL染色法检测凋亡细胞情况。全自动生化分析仪检验大鼠血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）水平。酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平。实验二:免疫印迹法（Western Blot法）和免疫组织化学法检测大鼠肾脏组织TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表达情况。实验三:Western Blot法检测肾脏组织Fas、Fas L、Caspase8、Caspase3蛋白表达情况。实验四:Western Blot法检测肾脏组织Akt、磷酸化Akt（p-Akt）蛋白表达情况。结果:1肾衰饮对慢性肾功能衰竭大鼠肾脏形态学及肾功能的影响1.1肾衰饮对慢性肾功能衰竭大鼠一般状态的影响正常组:精神状态良好,毛色光泽,较少有脱毛现象,活动正常,反应灵活,每日进食量及饮水量均正常,垫料气味较淡,大鼠便质如常排便未见异常。模型组:体重明显下降,精神状态萎靡,毛色干枯晦暗,并出现脱毛现象,反应迟钝,活动减少,进食量减少,饮水量增加,垫料气味臭秽,稀便。尿毒清组:体重不同程度下降,精神状态萎靡,毛色干枯、脱落,精神中度萎靡,反应略有迟钝,活动减少,进食量减少,饮水量增多,垫料气味臭秽,稀便。肾衰饮组:体重不同程度下降,精神轻度萎靡,毛色干枯脱毛现象较轻,反应尚可,活动度尚可,进食量尚可,饮水量略增加,垫料气味臭秽,可见便质如常排便未见异常。1.2肾衰饮对慢性肾功能衰竭大鼠肾脏形态学的影响1.2.1肾衰饮对慢性肾功能衰竭大鼠肾脏组织外观形态的影响与正常组比较,其余各组大鼠肾脏体积均不同程度的增大,其中模型组改变最为明显,尿毒清组其次,最后为肾衰饮组。与正常组比较,模型组大鼠肾脏组织表面均呈弥漫性细颗粒状改变,凹凸不平,被膜粘连,不易剥离,且外观颜色均明显发白,肉眼观察外观颜色发白程度:模型组>尿毒清组>肾衰饮组>正常组。沿肾门纵行剖开,除空白组外各组肾组织切面处均可见肾皮质不同程度变薄,且皮髓质界限欠清晰,其中模型组最明显,其他各组肉眼观察无明显区别。1.2.2肾衰饮对慢性肾功能衰竭大鼠体质量及肾指数的影响各组大鼠实验前及造模第1周体质量比较无明显差异;与正常组比较,第2周、第3周造模组大鼠体质量明显降低（P<0.05）;治疗期间:第1周:与正常组比较,模型组、尿毒清组和肾衰饮组大鼠体质量明显降低（P<0.01）;第2周和第3周:与正常组比较,模型组与尿毒清组大鼠体质量明显降低（P<0.05）,肾衰饮组无明显差异;与模型组比较,尿毒清组和肾衰饮组大鼠体质量无明显差异;第4周:与正常组比较,模型组、尿毒清组和肾衰饮组大鼠体质量明显降低（P<0.01）,肾指数明显升高（P<0.01）,与模型组比较,尿毒清组和肾衰饮组大鼠体质量明显升高（P<0.05）,肾指数降低（尿毒清组P<0.01,肾衰饮组P<0.05）,尿毒清组与肾衰饮组大鼠体质量、肾指数比较无明显差异。1.2.3肾衰饮对慢性肾功能衰竭大鼠肾脏病理学的影响苏木精-伊红（HE）染色结果:正常组可见肾小球、肾小管、系膜结构正常,间质未见增宽,无炎性细胞浸润。模型组可见肾小球囊腔变大,部分肾小管萎缩,小管的管壁薄厚不匀,肾小管上皮细胞弥漫空泡变性,成纤维细胞增多,系膜细胞增生明显,肾小球周围可见大量炎性细胞浸润。尿毒清组可见肾小管上皮细胞空泡变性减轻,系膜细胞轻度增生,部分区域伴有炎性细胞浸润。肾衰饮组可见成纤维细胞减少,系膜细胞轻度增生,部分区域伴有炎性细胞浸润。肾衰饮组在肾小管上皮细胞空泡变性及系膜细胞增生程度均低于尿毒清组。1.3肾衰饮对慢性肾功能衰竭大鼠血清Scr、BUN水平的影响与正常组比较,模型组血清Scr、BUN水平明显升高（P<0.01）;与模型组比较,尿毒清组和肾衰饮组血清Scr、BUN水平均明显降低（P<0.01）,尿毒清组和肾衰饮组比较无统计学差异。2肾衰饮对慢性肾功能衰竭大鼠肾脏细胞凋亡情况的影响TUNEL染色后显微镜下观察:正常组大鼠肾脏组织中细胞正常,未见阳性细胞;模型组大鼠肾脏细胞凋亡数量明显增多,且主要分布在髓质区;尿毒清组和肾衰饮组大鼠肾脏细胞凋亡指数较模型组降低（P<0.01）;尿毒清组和肾衰饮组相比差异无统计学意义。3肾衰饮对慢性肾功能衰竭大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平的影响ELISA法检测大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平:与正常组比较,模型组大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α表达水平明显升高（P<0.01）;与模型组比较,尿毒清组和肾衰饮组大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α表达水平均明显降低（P<0.01）;与尿毒清组比较,肾衰饮组大鼠血清IL-6、TNF-α表达水平降低（P<0.05）。4肾衰饮对慢性肾功能衰竭大鼠肾脏组织TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表达水平的影响Western blot法检测肾脏组织内TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表达水平:与正常组相比,模型组大鼠肾脏组织中TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表达水平均明显升高（P<0.01）;与模型组比较,尿毒清组和肾衰饮组大鼠肾脏组织中TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表达水平均明显降低（P<0.01）,尿毒清组和肾衰饮组比较无统计学差异。免疫组织化学法检测各组大鼠肾脏组织TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表达情况:光镜下观察,正常组肾脏组织TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表达为阴性,模型组TLR4、MyD88、NF-κB蛋白呈强阳性表达,尿毒清颗粒和肾衰饮干预后均能不同程度的减少TLR4、MyD88、NF-κB蛋白的表达（P<0.01）,且两组之间无明显差异。5肾衰饮对慢性肾功能衰竭大鼠肾脏组织Fas、Fas L、Caspase8、Caspase3蛋白表达的影响Western blot法检测肾脏组织Fas、Fas L、Caspase8、Caspase3蛋白表达:与正常组比较,模型组大鼠肾脏组织Fas、Fas L、Caspase8、Caspase3蛋白表达水平显着增高（P<0.01）;与模型组比较,尿毒清组和肾衰饮组大鼠肾脏组织Fas、Fas L、Caspase8、Caspase3蛋白表达水平均明显降低（P<0.01）;尿毒清组和肾衰饮组相比差异均无显着性意义。6肾衰饮对慢性肾功能衰竭大鼠肾脏组织PI3K/Akt信号通路蛋白表达的影响各组大鼠肾脏组织Akt蛋白表达无明显差异。与正常组比较,模型组大鼠肾脏组织p-Akt蛋白表达水平降低（P<0.01）,p-Akt/Akt比值降低（P<0.01）;与模型组比较,P13K抑制剂组（LY组）大鼠肾脏组织p-Akt蛋白表达水平显着降低（P<0.01）,p-Akt/Akt比值显着降低（P<0.01）;与LY组比较,肾衰饮+LY组大鼠肾脏组织p-Akt蛋白表达水平明显升高（P<0.01）,p-Akt/Akt比值显着升高（P<0.01）。结论:1基于中医象思维,根据肾藏象的病理之象,提出脾肾虚损是慢性肾功能衰竭发生和发展的病理基础,是产生毒邪的根源;毒邪（湿毒、痰毒、瘀毒）是加重病情进展恶化及迁延不愈的重要外因,证属本虚标实。2拟“抗毒、解毒、排毒”三法于一方,肾衰饮健脾益肾扶正以抗毒;祛湿涤痰化瘀以解毒;通腑泄浊以排毒,攻补兼施。3根据以上病因病机、治则治法,实验研究表明:（1）肾衰饮能够明显改善腺嘌呤诱导的慢性肾功能衰竭模型大鼠的一般状态及肾功能,减轻肾脏组织病理损伤,抑制肾脏炎症反应和细胞凋亡,进一步抑制肾脏纤维化,达到治疗慢性肾功能衰竭的目的;（2）肾衰饮能够降低腺嘌呤诱导的慢性肾功能衰竭模型大鼠肾脏组织TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表达,从而抑制炎症反应,减轻肾脏炎性损伤;（3）肾衰饮能够降低腺嘌呤诱导的慢性肾功能衰竭模型大鼠Fas、Fas L、Caspase8、Caspase3蛋白表达水平,对肾脏细胞凋亡起到抑制作用;（4）肾衰饮可能通过激活PI3K/Akt信号通路,进一步抑制其下游的效应靶点Fas L来抑制慢性肾功能衰竭大鼠肾脏细胞凋亡。

王洋洋^[2]（2021）在《基于脊髓CXCL1-CXCR2内吞途径探讨针刺对CFA小鼠镇痛作用的研究》文中进行了进一步梳理目的:针刺虽然作为一种镇痛策略被广泛应用于临床之中,但其镇痛的生物学机制尚未完全阐明,故阐明其机制,有助于提高临床疗效和国际推广。因此,本研究通过探索针刺对完全弗氏佐剂（Complete Freund’s Adjuvant,CFA）小鼠镇痛效应的影响,利用磷酸化蛋白组学技术筛选小鼠脊髓组织参与针刺镇痛的可能关键蛋白及重要信号通路,同时基于本团队前期研究发现脊髓趋化因子CXC配体1（CXC chemokine ligand 1,CXCL1）及其受体趋化因子CXC受体2（CXC chemokine receptor 2,CXCR2）介导针刺镇痛,但具体机制尚不明确,故综合磷酸化蛋白组学分析的结果,进一步探索针刺介导脊髓CXCL1-CXCR2发挥镇痛作用的可能分子机制。方法:首先,通过3种不同的造模剂量以及2种不同的手针针刺方法以热辐射痛和机械痛作为主要效应指标,优选合适剂量的小鼠炎性痛模型和手针针刺方法用于针刺镇痛研究,并用免疫印迹（Western Blotting,WB）和酶联免疫吸附测定法（Enzyme-linked immunosorbent assay,Elisa）分别检测脊髓致痛物质环氧合酶2（Cyclo-oxygen-ase 2,COX2）、前列腺素E2（Prostaglandin E2,PGE2）含量,明确针刺镇痛效应。其次,在针刺镇痛有效的基础上利用磷酸化蛋白组学技术筛选筛选脊髓部位参与针刺镇痛的关键蛋白和重要通路。最后,结合前期针刺CXCL1升高,CXCR2降低镇痛的研究基础,对筛选出的内吞通路进行验证,分别采用Elisa检测脊髓CXCL1含量,采用WB检测脊髓CXCR2、Rab5、Rab11、Rab7、Lamp1含量,采用免疫荧光双标染色检测脊髓组织CXCR2与神经元（Neu N神经元细胞的标记物）、Rab7、Lamp1共定位情况。结果:1.针刺对CFA小鼠镇痛效应影响的实验研究（1）不同造模剂量结果:不同造模剂量（20μL、50μL、100μL）均能降低小鼠热辐射痛和机械痛阈值（P<0.01）,诱导小鼠炎性痛模型。但综合热辐射痛和机械痛结果50μL模型组整体较平稳,故选用50μL的造模剂量。（2）不同针刺方法结果:热辐射痛显示与盐水组相比,模型组、针刺（1）组和针刺（2）组在造模后24h-7天热辐射痛阈值均降低（P<0.05或P<0.01）;与模型组相比,在针刺治疗1-7天,针刺（1）组、针刺（2）组热辐射痛阈值升高（P<0.01或P<0.05）;与针刺（2）组相比,针刺（1）组在第1、2天热辐射痛阈值升高（P<0.05或P<0.01）。机械痛显示与盐水组相比,模型组在造模后24h-7天机械痛阈值降低（P<0.05或P<0.01）,针刺（1）组在造模后第1、7天机械痛阈值降低（P<0.01）,针刺（2）组在造模后第1、3、6、7天机械痛阈值降低（P<0.05或P<0.01）;与模型组相比,在针刺干预治疗后,针刺（1）组在第2、4、7天机械痛阈值升高（P<0.05或P<0.01）,针刺（2）组在第2、7天机械痛阈值升高（P<0.05或P<0.01）;针刺组之间比较无统计学意义（P>0.05）。综合考虑,与模型组相比,针刺（1）组较针刺（2）组的痛阈值升高更明显,且天数更多,因此采用针刺（1）组用于后期研究。（3）脊髓COX2、PGE2结果:脊髓COX2蛋白含量结果显示各组之间比较均无统计学差异（P>0.05）;PGE2蛋白含量结果显示与盐水组相比,模型组升高（P<0.05）,与模型组相比,针刺组降低（P<0.05）。2.基于脊髓磷酸化修饰蛋白组学的针刺镇痛关键蛋白及通路筛选结果（1）针刺具有镇痛效应:与盐水组相比,造模后1-5天,模型组和针刺组的热辐射痛和机械痛在造模后阈值均降低（P<0.01）;与模型组相比,在针刺干预治疗后1-5天,造模侧热辐射痛和机械痛阈值均升高（P<0.05或P<0.01）。（2）蛋白差异修饰分析结果:不同组间比较,差异修饰的蛋白和位点为:模型组VS盐水组上调403个磷酸化位点,对应301个蛋白,下调439个磷酸化位点,对应339个蛋白;针刺组VS模型组上调432个磷酸化位点,对应318个蛋白,下调363个磷酸化位点,对应273个蛋白;针刺组VS盐水组上调424个磷酸化位点,对应298个蛋白,下调434个磷酸化位点,对应322个蛋白。（3）差异修饰蛋白GO功能注释显示,在模型和针刺状态下蛋白参与的生物进程主要与细胞进程,生物调节,刺激反应,发育代谢以及信号传递有关;细胞组成主要位于细胞膜、细胞器、大分子复合物、膜关闭内腔;分子功能主要与结合功能和催化活性相关,同时也与分子功能调节、结构分子活性、运输活动相关。（4）KEGG富集和聚类分析结果:在模型状态下,KEGG富集和聚类分析显示与疼痛相关的通路有4条:c AMP信号通路、缝隙连接、轴突导向、钙信号通路;在针刺状态下,KEGG富集和聚类分析显示与疼痛相关的通路有2条:内吞信号通路、GABA能神经突触信号通路。（5）差异修饰蛋白互作关系结果:在模型和针刺状态下,蛋白功能主要与生物运输和内吞相关。3.针刺调节脊髓CXCL1-CXCR2内吞通路结果（1）脊髓CXCL1-CXCR2内吞通路蛋白变化结果:与盐水组比,模型组CXCL1蛋白含量呈上调趋势,无统计学差异（P>0.05）,与模型组比,针刺组升高（P<0.05）。CXCR2、Rab5、Rab11、Rab7、Lamp1蛋白含量结果显示各组（盐水、模型和针刺）之间均无统计学差异（P>0.05）。（2）免疫荧光双标染色结果:通过半定量分析,CXCR2与Neu N共表达率结果显示各组（盐水、模型和针刺）之间均无统计学差异（P>0.05）,CXCR2与Rab7共表达率和CXCR2与Lamp1共表达率与模型组相比,在针刺后都呈上调趋势,但无统计学差异（P>0.05）。结论:1.针刺双侧足三里穴对CFA炎性痛小鼠具有镇痛效应。2.脊髓部位参与针刺镇痛的关键磷酸化蛋白功能主要与结合功能和催化活性相关,并参与生物调节、运输、内吞等多种生物过程;与针刺镇痛相关的通路主要有内吞信号通路、GABA能神经突触信号通路。3.尚不能证明CXCL1-CXCR2内吞信号通路是脊髓CXCL1参与针刺镇痛的下游信号通路,有待于用多种方法进一步确认。

杨柳^[3]（2021）在《组蛋白H3K9乙酰化修饰通过调控Pik3ca转录参与阿霉素诱导的H9c2细胞凋亡》文中进行了进一步梳理目的:在阿霉素诱导的H9c2细胞模型中,我们评估了组蛋白H3K9乙酰化修饰对Pik3ca转录水平的影响以及Pik3ca通过诱导大鼠H9c2细胞凋亡的作用机制。研究方法:建立阿霉素诱导的H9c2细胞模型:实验分为:对照组（加入等量的完全培养基培养细胞8小时）,阿霉素组（1u M阿霉素培养细胞8小时）。采用CCK8及流式细胞术（Annexin V-FITC/PI）实验检测H9c2细胞活性和凋亡情况,蛋白质免疫印迹（Western blot）检测Bcl2,BAX,Cleaved-caspase3蛋白的表达情况。ChIP-Seq检测Pik3ca启动子区域组蛋白H3K9乙酰化水平。ChIP-q PCR检测H3K9ac抗体富集到的Pik3ca启动子区域片段的水平。应用实时定量聚合酶链式反应（rt-PCR）和Western blot实验方法检测Pik3ca的表达水平。细胞免疫荧光和Western blot检测Pik3ca si RNA的转染效率。细胞计数试剂盒（Cell Counting Kit8,CCK8）检测细胞活性,流式细胞术（Annexin V-FITC/PI）检测细胞凋亡率。Western blot检测H9c2细胞中PI3K,P-AKT,AKT,Bcl2,BAX和Cleaved-caspase3蛋白表达水平。结果:用1uM阿霉素培养H9c2细胞8小时,CCK8和流式细胞术实验表明H9c2细胞发生明显的凋亡,Bcl2蛋白表达下降,BAX和Cleaved-caspase3蛋白表达增加。ChIP-Seq测序分析发现阿霉素组与对照组相比,Pik3ca启动子区组蛋白H3K9乙酰化水平显着增加,同时应用ChIP-QPCR进一步证明了在阿霉素组中,H3K9ac抗体富集的Pik3ca启动子区域的片段明显高于对照组。实时定量聚合酶链式反应和Western blot实验结果表明相对于对照组,阿霉素组中Pik3ca的m RNA和蛋白的表达量升高,同时PI3K,P-AKT蛋白表达量升高。沉默Pik3ca后,CCK8和流式细胞术发现心肌细胞凋亡明显减少,在Western blot结果中,PI3K,P-AKT,Bcl2蛋白表达水平升高,AKT蛋白表达水平不变,BAX,Cleaved-caspase蛋白表达水平下降。结论:综上所述,在阿霉素诱导的H9c2细胞中,Pik3ca启动子区组蛋白H3K9乙酰化水平显着升高并促进了Pik3ca的转录。Pik3ca通过激活PI3K/AKT信号通路促进了阿霉素诱导H9c2细胞的凋亡,为阿霉素性心肌病的研究提供了新的理论基础。

孙冠聪,焦丹,谢忠奎,周平,杨果^[4]（2021）在《PI3K/AKT通路在动物葡萄糖代谢中的研究进展》文中研究说明葡萄糖代谢稳态对维持动物健康水平至关重要。磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase,PI3K）是受体酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase, RTK）和G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptor, GPCR）共同调控的下游效应因子。它能够磷酸化磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol, PI）上肌醇环的D3羟基,生成第二信使磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PI-3,4,5-P3, PIP3）。PIP3的生成可以促使蛋白激酶B（protein kinase B,AKT/PKB）在细胞膜处募集并诱导其变构激活,活化的AKT可以通过调节下游靶标的活性来调控机体的葡萄糖代谢过程和其他生物学功能。鉴于PI3K/AKT信号通路在动物机体葡萄糖代谢以及人类2型糖尿病（type2 diabetes mellitus, T2DM）等疾病中的重要调控作用,该文就PI3K/AKT信号通路及相关重要调控因子的生物学功能与分子机制进行综述。

张坤^[5]（2021）在《脂肪因子分泌和炎症微环境交互作用驱动肥胖脂肪组织胰岛素抵抗的机制研究》文中研究表明第一部分血清Glypican4、Proeurotensin和脂联素等脂肪因子与肥胖脂肪组织胰岛素抵抗的相关性研究[研究目的]肥胖症已俨然成为全球公共卫生健康问题之一,形势十分严峻,对人类健康和寿命产生巨大影响。脂肪组织胰岛素抵抗是全身胰岛素抵抗的前奏,早于肝脏和骨骼肌胰岛素抵抗的发生,是2型糖尿病重要的病理生理基础。脂肪组织是机体重要的内分泌器官,分泌多种脂肪因子参与糖脂代谢。其中新型脂肪因子Glypican4（磷脂酰肌醇蛋白聚糖4,GPC4）、糖基磷脂酰肌醇特异性磷脂酶D（Glycosylphosphatidylinositol-specificphospholipase D,GPLD1）、Proneurotensin（前神经降压素,PNT）和经典脂肪因子脂联素（Adiponectin,ADP）均与肥胖症及糖脂代谢密切相关。但它们是否与脂肪组织胰岛素抵抗相关,目前尚无相关文献报道。因此,本课题旨在研究不同糖代谢状态的肥胖症患者的上述脂肪因子血清水平的变化,并进一步分析其与脂肪组织胰岛素抵抗的关系。[研究方法]将北京协和医院内分泌科肥胖门诊221名肥胖患者,依据胰岛素及血糖水平分组。正常胰岛素:稳态模型评估的胰岛素抵抗指数（homeostasis model assessment of insulin resistance,HOMA-IR）<2.6;正常血糖:空腹血糖（fasting blood glucose,FBG）<6.1 mmol/L 和餐后 2 小时血糖（2h-postprandial blood glucose,2hPBG）<7.8 mmol/L;糖耐量受损:FBG<6.1 mmol/L,7.8mmol/L≤2hPBG<11.1 mmol/L;糖尿病:FBG≥7.0 mmol/L或2hPBG ≥11.1 mmol/L。共分为以下4组:正常胰岛素正常血糖组（normal insulin,NI,n=66）、高胰岛素正常血糖组（hyperinsulinemia,HI,n=50）、糖耐量受损组（impaired glucose tolerance,IGT,n=63）和糖尿病组（diabetes mellitus,DM,n=42）。体检中心37名体检正常的受试者作为正常对照组（normal controls,NC,n=37）。用酶联免疫法（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）测定血清脂肪因子（GPC4、GPLD1、PNT和ADP）水平;用脂肪组织胰岛素抵抗指数（Adiposetissue insulin resistance index,Adipo-IR）（空腹游离脂肪酸（free fatty acids,FFA）X 空腹胰岛素（fasting insulin,FINS））评估脂肪组织胰岛素敏感性;采用单因素方差分析和Bonferroni事后分析对多组间连续资料进行比较;探讨脂肪因子（GPC4、GPLD1、PNT和ADP）与各临床参数间的相关性采用Pearson相关分析;进一步采用多重线性回归分析上述脂肪因子的独立影响因素;最后,按脂肪因子水平（GPC4、GPLD1和ADP）进行分组采用二元logistic回归分析它们与脂肪组织胰岛素抵抗的关系。[研究结果]1.各亚组Adipo-IR水平:胰岛素抵抗人群（HI、IGT和DM组）Adipo-IR明显高于胰岛素敏感人群（NC和NI组）（P<0.05）。与NC组的Adipo-IR比较,HI 组增加了 3.2 倍,IGT 组增加了 2.1 倍,DM 组增加了 4.1 倍（9.27[6.22,13.71],6.77[3.91,10.64],11.09[7.52,18.02]vs 2.19[1.26,3.28],P<0.05）。2.各亚组脂肪因子水平:肥胖人群（NI、HI、IGT和DM组）血清GPC4水平较正常体重人群（NC 组）显着升高（1.93±0.34 ng/mL,2.27±0.58 ng/mL,2.21±0.60 ng/mL,2.49±0.67 ng/mL vs.1.70±0.33 ng/mL,P<0.05）,分别升高了 13.53%,33.53%,30.00%和46.47%;且胰岛素抵抗肥胖人群（HI,IGT和DM组）的血清GPC4水平较胰岛素正常的肥胖人群（NI组）也显着升高（P<0.05）。肥胖人群（NI、HI、IGT和DM组）血清GPLD1水平较正常体重人群（NC组）显着升高（12.48±4.67 ug/mL,15.14±4.47 ug/mL,13.63±5.40 ug/mL,15.47±4.92 ug/mL vs.8.87±2.37 ug/mL,P<0.05）,分别升高了 40.70%,70.69%,53.66%和 74.41%;同时,HI和DM组血清GPLD1水平较NI组也显着升高（P<0.05）。另外,IGT组血清 PNT 水平较 NC 组升高（45.02±10.38 pg/mL vs.38.15±7.31 pg/mL,P<0.05）。而NI、HI和DM组血清ADP水平较NC组显着降低（17.77±6.68 μg/mL,15.53±6.41 μg/mL,14.3 1 ±6.09 μg/mL vs.20.49±6.74 μmL,P<0.05）,DM 组水平最低,与 NC、NI、IGT 组比较,分别降低了 30.16%、19.47%、23.93%（P<0.05）。3.脂肪因子与临床变量相关性分析:在所有研究受试者中,血清GPC4水平与体重指数（body mass index,BMI）（r=0.266）、腰围（waist circumference,WC）（r=0.306）、舒张压（diastolic blood pressure,DBP）（r=0.151）、谷丙转氨酶（alanine transaminase,ALT）（r=0.352）、谷草转氨酶（aspartate aminotransferase,AST）（r=0.307）、尿酸（uric acid,UA）（r=0.152）、甘油三酯（triglyceride,TG）（r=0.234）、FFA（r=0.201）、FINS（r=0.254）、HOMA-IR（r=0.256）、Adipo-IR（r=0.359）、脂联素校正的稳态模型评估的胰岛素抵抗指数（homeostasis model assessment of adiponectin,HOMA-AD）（r=0.247）和 GPLD1（r=0.464）呈正相关,与改良的定量胰岛素敏感性检测指数（Revised quantitative insulin sensitivity check index,Revised-QUICKI）（r=-0.279）呈负相关关系（P<0.05）。血清GPLD1水平与年龄（r=0.146）、BMI（r=0.303）、WC（r=0.278）、收缩压（systolic blood pressure,SBP）（r=0.201）、DBP（r=0.205）、ALT（r=0.232）、AST（r=0.237）、总胆固醇（total cholesterol,TC）（r=0.268）、TG（r=0.300）、FFA（r=0.239）、FINS（r=0.245）、HOMA-IR（r=0.241）、HOMA-AD（r=0.260）和Adipo-IR（r=0.336）呈正相关,与高密度脂蛋白胆固醇（high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C）（r=-0.158）和Revised-QUICKI（r=-0.264）呈负相关（P<0.05）;血清 PNT 水平与年龄（r=0.128）、TC（r=0.123）、TG（r=0.128）呈正相关（P<0.05）;血清 ADP 水平与年龄（r=0.210）、性别（r=0.303）、HDL-C（r=0.336）和 Revised-QUICKI（r=0.390）呈正相关,与 BMI（r=-0.174）、WC（r=-0.263）、SBP（r=-0.146）、DBP（r=-0.208）、ALT（r=-0.223）、AST（r=-0.143）、UA（r=-0.291）、TG（r=-0.386）、FFA（r=-0.264）、FINS（r=-0.304）、FBG（r=-0.205）、2hPBG（r=-0.192）、HOMA-IR（r=-0.330）、Adipo-IR（r=-0.373）、HOMA-AD（r=-0.739）、GPC4（r=-0.187）和 GPLD1（r=-0.180）呈负相关（P<0.05）。4.脂肪因子的独立危险因素分析:多重线性回归分析,结果显示在所有研究受试者中,GPLD1（β=0.559）、Adipo-IR（β=0.190）和 UA（β=0.128）是血清 GPC4 的独立影响因素（P<0.05）,其中GPLD1是最主要的独立影响因素;TG（β=0.467）,GPC4（β=0.208）,Adipo-IR（β=0.197）和年龄（β = 0.107）是血清 GPLD1 的独立影响因素（P<0.05）,其中TG是GPLD1最主要的独立影响因素;TG（β=0.140）和年龄（β=0.122）是血清PNT的独立影响因素（P<0.05）,TG是PNT最主要的独立影响因素;Adipo-IR（β=-0.183）、HDL-C（β=0.173）、性别（β=0.145）、TG（β=-0.190）和年龄（β=0.151）是血清ADP的独立影响因素（P<0.05）,其中Adipo-IR是ADP重要的独立影响因素。Adipo-IR与GPC4、GPLD1和ADP均独立相关。5.不同血清GPC4、GPLD1和ADP水平与脂肪组织胰岛素抵抗的风险:二元Logistic回归分析显示,所有受试者依据血清GPC4水平进行三等分分组（低GPC4 组≤1.81 ng/mL;中等 GPC4 组:1.82-2.18 ng/mL;高 GPC4 组:≥2.19 ng/mL）,以低GPC4组为参照（reference=1.00）,在校正年龄、性别、BMI、SBP、AST、FBG、TC、TG、HDL-C后,高GPC4组人群患脂肪组织胰岛素抵抗的风险是低 GPC4 组的 2.974 倍（OR=2.974,95%CI 1.262-7.011,P=0.013）,表明血清GPC4水平升高是发生脂肪组织胰岛素抵抗的危险因素。同样的,依据血清GPLD1水平进行三等分分组（低GPLD1组:≤10.71μg/mL;中等GPLD1组:10.72-15.05 μg/mL;高 GPLD1 组:≥15.06 μg/mL）,以低 GPLD1 组为参照（reference=1.00）,在校正年龄、性别、BMI、SBP、AST 和 FBG 后,高 GPLD1组人群患脂肪组织胰岛素抵抗的风险是低GPLD1组的3.568倍（OR=3.568,95%CI 1.545-8.239,P=0.003）。然而,当进一步校正 TC、TG 和 HDL-C 后,高GPLD1组人群患脂肪组织胰岛素抵抗风险增加的趋势消失,表明高GPLD1组人群发生脂肪组织胰岛素抵抗可能是建立在血脂异常的基础上的。另外,将所有受试者依据血清ADP水平进行三等分分组（低ADP组:≤12.99μg/mL;中等ADP 组:13.00-19.84 μg/mL;高 ADP 组:≥19.85 μg/mL）。以高 ADP 组为参照（reference=1.00）,校正年龄、性别和BMI后,低ADP组人群患脂肪组织胰岛素抵抗的风险是高 ADP 组的 2.266倍（OR=2.266,95%CI 1.080-4.755,P=0.040）。然而继续校正SBP、AST、FBG、TC、TG和HDL-C后,该趋势消失,表明血清ADP水平降低与脂肪组织胰岛素抵抗风险的增加,是建立在其他糖脂代谢异常基础上的。[研究结论]1.Adipo-IR从NGT到IGT和DM的自然病程中呈进行性升高,提示脂肪组织胰岛素抵抗参与糖尿病的整个发病过程。2.血清GPC4水平在肥胖尤其伴有胰岛素抵抗的肥胖患者中显着升高,血清GPLD1的变化趋势与血清GPC4一致,且GPLD1是GPC4最主要的独立影响因素,支持GPLD1切割GPC4的假说。高GPC4水平人群发生脂肪组织胰岛素抵抗的风险明显增加,血清GPC4是中国北方汉族人群脂肪组织胰岛素抵抗的生物标志物。3.血清PNT与脂质代谢密切相关,但与脂肪组织胰岛素抵抗无关。4.血清ADP水平与糖脂代谢相关指标密切相关,与脂肪组织胰岛素抵抗呈负相关。第二部分脂肪因子分泌和炎症微环境交互作用驱动脂肪细胞胰岛素抵抗的机制研究[研究目的]肥胖症及其相关代谢疾病严重影响着人类的健康和生活质量。脂肪组织胰岛素抵抗是肥胖症的病生理基础。脂肪因子分泌失调和脂肪组织慢性炎症是脂肪组织胰岛素抵抗发生的最主要的两种机制,两者之间相互影响。本课题第一部分已证实肥胖症患者血清Glypican 4（GPC4）和Neurotensin（NT）水平较正常体重人群显着升高。既往研究证实脂联素（ADP）具有显着的抗炎作用,而新型脂肪因子GPC4和NT是否也会对脂肪组织的炎症产生影响尚不清楚。因此,本研究模拟肥胖时体内真实状态,建立脂肪细胞和巨噬细胞不接触共培养体系,探讨在棕榈酸（Palmiticacid,PA）诱导的情况下GPC4、NT和ADP对巨噬细胞炎症的影响。[研究方法]1.脂肪细胞和巨噬细胞共培养后,脂肪因子和炎症因子分泌的变化3T3-L1前脂肪细胞分别在6孔板和Transwell小室中被诱导分化成熟。同时,RAW264.7巨噬细胞也被分别培养在6孔板和Transwell小室。然后,将培养脂肪细胞的Transwell小室移入培养巨噬细胞的6孔板中,同时将培养巨噬细胞的Transwell小室移入培养脂肪细胞的6孔板中,进行不接触共培养24h,分别收集Tanswell小室和6孔板中的细胞,提取总RNA,利用RT-qPCR方法检测脂肪细胞GPC4、NT、ADP、胰岛素受体底物1（IRS-1）和葡萄糖转运蛋白4（Glut 4）mRNA的表达水平和巨噬细胞炎症因子肿瘤坏死因子α（TNFα）,单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）,白细胞介素-6（IL-6）和IL-10 mRNA的表达水平。共培养体系的培养上清液被收集,脂肪因子（GPC4、ADP和NT）和炎症因子（TNFα、MCP-1、IL-6和IL-10）的分泌量通过ELISA法被检测。2.PA诱导对脂肪细胞和巨噬细胞细胞因子分泌功能的影响（1）PA诱导3T3-L1脂肪细胞:3T3-L1前脂肪细胞被诱导分化成熟,使用不同浓度梯度的PA（100 μM,200μM,400μM）作用6h、12h和24h,收集细胞,提取总RNA,利用RT-qPCR检测脂肪细胞脂肪因子GPC4、NT和ADP mRNA的表达水平和与胰岛素敏感性相关基因IRS-1和Glut4 mRNA的表达水平。此外,上述条件下的细胞培养上清液被收集,脂肪因子（GPC4、NT和ADP）的分泌量通过ELISA法被检测。对照组采用0.2%BSA诱导脂肪细胞6h、12h和24h。（2）PA诱导RAW264.7巨噬细胞:采用不同浓度梯度的PA（100μM,200 μM,400 μM）作用RAW264.7巨噬细胞6h、12h和24h后,收集巨噬细胞,提取总RNA,通过RT-qPCR检测炎症因子（TNFα、MCP-1、IL-6和IL-10）mRNA的表达水平。同时,培养上清液被收集,上述炎症因子在培养基中的分泌量通过ELISA法被检测。对照组采用0.2%BSA诱导巨噬细胞6h、12h和24h。3.脂肪细胞与巨噬细胞间的相互影响:（1）PA诱导的巨噬细胞对脂肪细胞脂肪因子的影响:用400μM PA作用Transwell小室中的RAW264.7巨噬细胞24h后,更换为胎牛血清培养基,与6孔板中培养的3T3-L1脂肪细胞进行不接触共培养24h;对照组共培养前采用0.2%BSA作用Transwell小室中的巨噬细胞24h。用RT-qPCR测定巨噬细胞TNFα MCP-1、IL-6和IL-10 mRNA的表达水平;并检测脂肪细胞GPC4、NT、ADP、IRS-1和Glut4mRNA的表达水平。同时,提取共培养的上清液,采用ELISA法测定培养上清中脂肪因子（GPC4、ADP和NT）和炎症因子（TNFα、MCP-1、IL-6和IL-10）的蛋白水平。（2）PA诱导的脂肪细胞对巨噬细胞炎症因子的影响:3T3-L1脂肪细胞被培养于Transwell小室,RAW264.7巨噬细胞被培养于6孔板中。其他步骤同上3（1）。4.GPC4、NT和ADP对PA诱导的巨噬细胞炎症的影响:（1）GPC4对PA诱导的巨噬细胞炎症的影响:小鼠GPC4重组蛋白采用不同浓度梯度（1,10,100 ng/mL）作用PA（400 μM）诱导的RAW264.7巨噬细胞6h、12h和24h,对照组为400 μMPA诱导的RAW264.7巨噬细胞。用RT-qPCR测定巨噬细胞TNFα、MCP-1、IL-6和IL-10 mRNA的表达水平。同时,培养上清液被收集,上述炎症因子在培养基中的分泌量通过ELISA法被检测。（2）NT对PA诱导的巨噬细胞炎症的影响:采用不同浓度的小鼠NT重组蛋白（1,10,100 μg/mL）作用 PA（400μM）诱导的 RAW264.7 巨噬细胞 6h,12h 和 24h,方法同4（1）。（3）ADP对PA诱导的巨噬细胞炎症的影响:采用不同浓度的小鼠ADP重组蛋白（0.5,1,2 μg/mL）作用 PA（400μM）诱导的 RAW264.7 巨噬细胞 6h,12h 和 24h,方法同4（1）。[研究结果]1.脂肪细胞和巨噬细胞共培养后,脂肪因子和炎症因子分泌的变化3T3-L1脂肪细胞和RAW264.7巨噬细胞共培养24h后。共培养的脂肪细胞与单独培养的脂肪细胞比较,GPC4和NT mRNA的表达分别增加了 0.7倍和2.2倍（P<0.05）,ADP mRNA 的表达下降了 55.0%（P<0.05）,Glut4 mRNA 的表达降低了34.0%（P<0.05）,IRS-1 mRNA的表达有下降趋势,但差异无统计学意义。共培养的巨噬细胞与单独培养的巨噬细胞比较,TNFα、IL-6和IL-10 mRNA的表达分别增加了 1.6倍、2.0倍和2.4倍（P<0.05）,MCP-1 mRNA的表达有升高趋势,但差异无统计学意义。交换共培养体系上下两层的细胞类型再进行共培养,细胞因子表达与第一种共培养方式细胞因子变化趋势相一致。共培养细胞培养上清中除MCP-1外,其他因子的蛋白水平的变化与其mRNA的变化相一致。提示脂肪细胞和巨噬细胞间可通过细胞因子的旁分泌作用而相互影响。2.PA诱导对脂肪细胞和巨噬细胞细胞因子分泌功能的影响（1）PA诱导3T3-L1脂肪细胞:采用不同浓度的PA（100μM,200μM,400μM）诱导3T3-L1脂肪细胞6h、12h和24h。作用6h时,不同浓度的PA组ADP mRNA的表达均较对照组降低（P<0.05）,GPC4和NT mRNA的表达有增高趋势,但差异无统计学意义。作用12h时,400μMPA组ADP mRNA的表达量较对照组下降了 40.8%（P<0.05）,NTmRNA 的表达增加了 0.6 倍（P<0.05）。作用 24h 时,400μM PA 组GPC4和NT mRNA的表达量较对照组分别增加了 1.1倍和1.5倍（P<0.05）,ADP mRNA的表达量降低了 30.1%（P<0.05）。400μM PA组作用不同时间（6h、12h和24h）时,IRS-1 mRNA的表达量较对照组分别下降了 44.6%,39.8%和36.0%（P<0.05）;作用12h和24h时,Glut4mRNA的表达量分别下降了 39.8%和38.2%（P<0.05）。细胞培养上清中GPC4,ADP和NT分泌蛋白变化与其mRNA的变化趋势与相一致。（2）PA诱导RAW264.7巨噬细胞:采用不同浓度的PA（100μM,200μM,400μM）诱导 RAW264.7 巨噬细胞 6h、12h 和 24h。400μMPA 组作用 6h 时,TNFα、MCP-1,IL-6和IL-10 mRNA的表达较对照组分别升高1.0倍、7.5倍、3.6倍和3.4倍（P<0.05）;作用12h时,上述炎症因子mRNA的表达量较对照组分别升高3.8倍、11.6倍、4.9倍和3.3倍（P<0.05）;作用24h时,上述炎症因子mRNA的表达分别增加了 5.5倍、7.4倍、7.7倍和6.9倍（P<0.05）。TNFα和MCP-1 mRNA的表达量在400μM PA 组显着高于 100μM PA 组和 200μM PA 组（P<0.05）,而 IL-6 和 IL-10 mRNA在400μM PA组的表达量高于100μM PA组（P<0.05）,提示PA对巨噬细胞炎症因子的影响呈剂量依赖性。400μM PA组诱导24h时,TNFα、IL-6和IL-10 mRNA的表达量显着高于作用6h时（P<0.05）,MCP-1 mRNA的表达水平在作用12h时最高（P<0.05）,提示PA影响巨噬细胞炎症因子存在时间依赖性。细胞培养上清中TNFα、MCP-1和IL-6蛋白的变化与其mRNA的变化趋势相一致,而IL-10蛋白水平无明显升高。3.脂肪细胞与巨噬细胞间的相互影响:（1）PA诱导的巨噬细胞对脂肪细胞脂肪因子的影响:首先400μM PA诱导RAW264.7巨噬细胞24h,再与3T3-L1脂肪细胞共培养24h（实验组）。巨噬细胞TNFα、MCP-1、IL-6和IL-10mRNA的表达较对照组分别增加2.3倍、1.5倍、2.5倍和1.6倍（P<0.05）。脂肪细胞GPC4和NT mRNA的表达较对照组分别增加4.0倍和 0.7 倍（P<0.05）,ADP mRNA 的表达降低了 21.2%（P<0.05）,Glut4 mRNA 的表达水平减少了 56.1%（P<0.05）,IRS-1 mRNA的表达水平有下降趋势,但差异无统计学意义。三组脂肪细胞（单独培养组、对照组、实验组）比较,GPC4和NT mRNA的表达水平进行性增加（P<0.05）,对照组和实验组较单独培养组GPC4分别增加了1.6倍和6.9倍,NT分别增加了 1.6倍和3.6倍;实验组ADP mRNA的表达显着低于其他两组,较单独培养组减少了 54.0%,较对照组减少了 40.3%（P<0.05）;IRS-1 mRNA的表达水平进行性下降（P<0.05）,对照组和实验组较单独培养组分别下降了54.0%和72.0%（P<0.05）;实验组Glut4 mRNA表达较单独培养组减少了 34.3%（P<0.05）。培养上清中GPC4和NT的分泌蛋白水平在上述三组中呈进行性升高（P<0.05）,而ADP的分泌量呈进行性下降（P<0.05）。（2）PA诱导的脂肪细胞对巨噬细胞炎症因子的影响:交换共培养体系上下两层的细胞类型。PA（400μM）诱导3T3-L1脂肪细胞24h,与RAW264.7巨噬细胞共培养24h（实验组）。脂肪细胞GPC4和NT mRNA的表达较对照组分别增加了 2.6倍和 1.6 倍（P<0.05）,ADP mRNA 的表达降低了 43.3%（P<0.05）。此外,IRS-1 mRNA的表达水平降低了 22.1%（P<0.05）,Glut4mRNA的表达水平有下降趋势,但差异无统计学意义。巨噬细胞TNFα、MCP-1、IL-6和IL-10mRNA的表达较对照组分别增加了 0.7倍、0.6倍、1.0倍和0.8倍（P<0.05）。三组巨噬细胞（单独培养组、对照组、实验组）比较,TNFα、IL-6和IL-10 mRNA的表达水平呈渐进性升高（P<0.05）,对照组、实验组较单独培养组TNFα分别增加了 1.6倍和3.7倍,IL-6增加了 2.0倍和4.6倍,IL-10增加了 2.4倍和5.7倍;实验组MCP-1 mRNA表达高于其他两组,较单独培养组和对照组分别增加了 0.5倍和0.4倍（P<0.05）。细胞培养上清中TNFα、MCP-1、IL-6和IL-10的分泌蛋白水平在上述三组中均呈进行性升高（P<0.05）。4.GPC4、NT和ADP对PA诱导的巨噬细胞炎症因子的影响:（1）GPC4对PA诱导的巨噬细胞炎症因子的影响:GPC4重组蛋白（l,10,100 ng/mL）作用 PA（400μM）诱导的 RAW264.7 巨噬细胞 6h、12h 和 24h。100ng/mLGPC4作用6h时,TNFα、MCP-1、IL-6和IL-10mRNA的表达水平较对照组分别增加2.0倍、0.8 倍、0.7 倍和 0.5 倍（P<0.05）;作用 12h 时,TNFα、MCP-1 和 IL-10mRNA的表达水平较对照组分别增加1.1倍、0.4倍和0.4倍（P<0.05）;作用24h时,TNFα、IL-6和IL-10 mRNA的表达水平较对照组分别增加0.3倍、0.6倍和0.5倍（P<0.05）。细胞培养上清中上述炎症因子分泌蛋白水平的变化与其mRNA的变化相一致。（2）NT对PA诱导的巨噬细胞炎症因子的影响:NT重组蛋白（1,10,100μg/mL）作用 PA（400μM）诱导的巨噬细胞 6h、12h 和 24h。100μg/mLNT 作用 6h、12h、24h时,TNFα、MCP-1、IL-6和IL-10 mRNA的表达水平均较对照组显着增加,TNFα分别增加了 0.7倍、0.3倍和0.4倍（P<0.05）,MCP-1增加了 1.6倍、0.3倍和0.9倍,IL-6 增加了 0.7倍、1.3 倍和 1.9倍,IL-10增加了 2.0倍、0.7倍和 0.9倍（P<0.05）。细胞培养上清中炎症因子蛋白水平的变化与其mRNA的变化相一致。（3）ADP对PA诱导的巨噬细胞炎症因子的影响:ADP重组蛋白（0.5,1,2 μg/mL）作用 PA（400μM）诱导的 RAW264.7 巨噬细胞 6h、12h 和 24h。2μg/mLADP 作用 6h时,TNFα和IL-10 mRNA的表达水平较对照组分别增加了 1.7倍和2.1倍（P<0.05）,MCP-1和IL-6mRNA的表达水平分别下降了 70.3%和42.7%;作用12h时,TNFα、MCP-1和IL-6mRNA的表达较对照组分别下降了 42.5%、78.4%和41.3%（P<0.05）,IL-10mRNA 的表达水平增加了 1.2 倍（P<0.05）;作用 24h 时,TNFα、MCP-1 和 IL-6mRNA的表达水平分别下降了 38.7%、86.2%和45.8%（P<0.05）。细胞培养上清中炎症因子蛋白水平的变化与其mRNA的变化相一致。[研究结论]1.脂肪细胞和巨噬细胞共培养,通过细胞因子间的旁分泌作用而相互影响,加重脂肪组织炎症状态。2.PA诱发脂肪细胞胰岛素抵抗,促进GPC4和NT的表达和分泌,抑制ADP的表达和分泌。3.PA激活巨噬细胞炎症反应,影响炎症因子的表达和分泌。4.PA通过促进脂肪细胞和巨噬细胞细胞因子的分泌而增强细胞间的相互作用,进而加重脂肪组织炎症状态。5.GPC4和NT重组蛋白加剧PA诱导的巨噬细胞的炎症,而ADP重组蛋白减缓PA诱导的巨噬细胞的炎症。

徐安乐^[6]（2021）在《维生素E对珍珠龙胆石斑鱼生长和免疫的影响及其相关机制的研究》文中研究指明维生素E对大部分水产动物而言,是一种必须营养素,在机体中不能自主合成,必需通过外源补充。研究表明,饲料配方中维生素E缺乏或过量均会对某些鱼造成不利的影响。研究水产动物维生素E的需求量在水产动物健康可持续养殖发展中具有重要意义。本研究以珍珠龙胆石斑鱼（Epinephelus fuscoguttatus♀×Epinephelus lanceolatus♂）为研究对象,从生理生化、组织学观察以及转录组学水平分析了维生素E在珍珠龙胆石斑鱼生长和免疫方面所起的作用,具体结果如下:（1）设计了6个不同浓度的维生素E饲料（高效液相色谱法实测VE值:12.10,32.15,45.17,75.72,135.78,263.37 mg/kg）开展84天的养殖试验（后简称养殖试验）,得出:135.78 mg/kg左右的维生素E能显着提高珍珠龙胆石斑鱼（平均初重:20.48±0.20 g）增重率、存活率、促进免疫器官的生长发育,以及改善肌肉品质;可维持肝脏、肌肉以及血清中维生素E含量的动态平衡,供应机体生长需求,同时能降低血脂含量,维持机体健康;可以提高血清、头肾、脾脏和肝脏的免疫能力以及抗氧化能力,提高肠道和肝脏对营养物质的吸收,降低脂质过氧化反应。对照组和135.78 mg/kg试验组在生长性能和免疫性能上存有显着性差异。与此同时,与其他组织相比,在消化性能上,肝脏和前肠对维生素E影响的反应更为敏感,在免疫方面,头肾对维生素E影响的反应更为敏感。以增重率为评估指标做拟合曲线分析维生素E的最适添加量为130.13 mg/kg。（2）135.78 mg/kg的维生素E能维持肝细胞结构和功能稳定,促进肠道组织生长和维持其完整性,促进头肾分泌免疫相关的物质来提高机体免疫,通过调节脾脏的淋巴细胞数量,促进鱼类非特异性免疫。（3）开展哈维氏弧菌感染试验（后简称细菌感染试验）。设置对照组和最适维生素E添加量组饲料（VE实际含量分别为10.38和132.15 mg/kg）养殖珍珠龙胆石斑鱼（平均体重:80.48±3.30 g）,周期70天,随后,用半致死剂量哈维氏弧菌（8.86×106CFU/ml）注射感染石斑鱼,观察7天,比较细菌感染前后试验组与对照组在血清、肝脏、头肾和脾脏上的免疫和抗氧化方面的变化,得出维生素E能提高机体抗氧化能力和抗病能力。组织学观察进一步得出维生素E在保护肝脏、头肾和脾脏抗细菌感染中发挥了重要作用。（4）养殖试验mRNA分析结果表明,维生素E诱导肝脏、前肠和头肾分别产生了366、69和9023个差异表达基因。这些差异表达基因,在肝脏中主要可富集到与细胞凋亡,肝组织代谢和肝组织免疫相关的通路上,在前肠组织中,则主要富集到了与代谢相关的通路上,在头肾组织中,主要富集到了与免疫相关的通路上。（5）细菌感染试验的mRNA分析结果显示,鱼摄食适量的维生素E能通过提高肝脏中的代谢补偿以抵抗哈维氏弧菌的侵袭,而缺乏维生素E的鱼,在哈维氏弧菌侵袭后,其炎症和病变会进一步加剧;摄食适量维生素E的鱼在经过哈维氏弧菌侵袭后,其头肾免疫相关通路被高度激活,在免疫防御机制中发挥重要作用,而维生素E摄入量不足,可能会导致自身免疫疾病,在受哈维氏弧菌侵袭后,头肾会出现病理性引诱某些酶类分泌和某些基因上调。（6）养殖试验的miRNA分析结果表明,维生素E可能主要通过调节mi R-34-x来影响肝脏组织的代谢和免疫;通过调节mi R-122-x和mi R-735-x来维持肠道健康,为肠道正常消化吸收营养物质提供良好的内环境;通过调节mi R-1357-x和miRNA-31-x来影响头肾的免疫和抗氧化能力。细菌感染试验的miRNA分析结果表明,维生素E可能通过调节mi R-1246-x、mi R-1260-x、mi R-7133-x（和y）、mi R-29-x（和y）以及mi R-122-x等的差异表达来影响头肾免疫能力。（7）养殖试验的miRNA-mRNA分析结果表明,维生素E可调控mi R-551-x、mi R-3604-x和mi R-193-y的上调以及mi R-883-y、novel-m0222-3p和mi R-34-x的下调来维持肝脏细胞功能,提高肝脏代谢能力和免疫能力;通过调节mi R-31-x、mi R-735-x和mi R-1357-x等（均下调）影响头肾的免疫和抗氧化能力,同时也会调控一些novel miRNA如novel-m0200-5p、novel-m0183-3p和novel-m0184-5p（均下调）等影响免疫过程。细菌感染试验的miRNA-mRNA关联分析得出,维生素E可能主要通过影响mi R-1260-x、mi R-7133-x（和y）和mi R-1246-x等的上调以及mi R-129-x、mi R-122-x和mi R-735-x等的下调来调控头肾抗哈维氏弧菌的感染。综上,维生素E在珍珠龙胆石斑鱼生长和免疫方面有重要调节作用。本研究从一定程度上揭示了维生素E的促生长和提高免疫的功能实质以及丰富了珍珠龙胆石斑鱼的生物信息学资料。

王婉玉,吕晓希,胡卓伟,刘姗姗^[7]（2021）在《趋化因子及其受体在乳腺癌中的研究进展》文中提出趋化因子是一类具有趋化活性的细胞因子,参与调节机体的免疫应答和炎症反应。它们作为一种多功能介质,不仅影响免疫细胞向肿瘤浸润,在肿瘤的生长、血管生成和侵袭转移等方面也发挥重要作用,是目前肿瘤治疗的重要靶点。本文回顾了趋化因子参与调控的信号通路,分析了趋化因子在乳腺癌发生发展中的作用机制,总结了近年来趋化因子及其受体相关的乳腺癌靶向药物,并对趋化因子在抗乳腺癌治疗中的作用进行了展望。

许知礼^[8]（2021）在《白色念珠菌通过激活炎症信号途径在小鼠模型中诱导急性肺损伤的研究》文中研究表明研究背景白色念珠菌是一种常见于健康成人胃肠道、泌尿生殖道、口腔、皮肤和呼吸道的共生微生物,也是人类和其他哺乳动物的一种机会性真菌病原体。在多种条件下,如HIV/AIDS感染、广谱抗生素的过度使用、先天性免疫缺陷疾病、化疗和免疫抑制治疗,它可以从良性共生生物转变为致病病原体。据统计分析1997年至2016年期间侵入性念珠菌病仍主要由白色念珠菌感染引起。大约?的肺部念珠菌病患者需要入住重症监护病房或机械通气,与非白色念珠菌感染相比,总体住院死亡率显着升高。而且下呼吸道念珠菌定植会增加医院获得性肺炎发生率、增加耐药细菌感染风险,免疫受损患者合并念珠菌定植预后更差。支气管肺念珠菌病是侵入性念珠菌病的重要组成部分,但组织学证明的肺炎很少。因此,白色念珠菌导致肺损伤的机制有待于动物实验的进一步研究。目前研究发现,白色念珠菌感染会增加宿主促炎细胞因子和趋化因子的表达,抑制炎症信号通路可显着保护啮齿动物免受炎症诱导的急性肺损伤。核因子-κB（NF-κB）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）、信号转导和转录激活因子（STATS）通路是重要的炎症信号通路。然而,这些炎症信号通路是否参与小鼠白色念珠菌感染所致的急性肺损伤以及免疫抑制是否加重小鼠肺损伤仍需进一步探讨。研究目的1、探讨腹腔内注入地塞米松联合环磷酰胺是否可成功建立免疫抑制动物模型。2、探讨气道注入白色念珠菌是否可成功建立感染动物模型。3、探讨白色念珠菌感染是否诱导正常和免疫抑制小鼠急性肺损伤。4、探讨白色念珠菌感染导致正常和免疫抑制小鼠急性肺损伤的可能炎症机制。实验方法（1）白色念珠菌混悬液的制备取白色念珠菌标准菌株（ATCC SC5314）在YPD培养基30℃中培养过夜,使用倍比稀释涂布平板法将白色念珠菌混合配制成混悬液,调整菌量约为106～107CFU/ml。（2）免疫抑制动物模型建立地塞米松（Dexa,10mg/kg）i.p每天1次×10d,环磷酰胺（Cy,150 mg/kg）i.p每天1次×1d,成功制成免疫抑制模型;对照组于相同时间给予同等剂量生理盐水腹腔内注射。（3）感染动物模型建立免疫抑制模型建立次日,CA组和Dex A+Cy+CA组小鼠腹腔注射10%水合氯醛（0.3m L/100g）后气管内注入50μl白色念珠菌混悬液。Control组和Dexa+Cy组小鼠麻醉后气管内注入50μl生理盐水。（4）流式细胞术Control组和Dexa+Cy组小鼠麻醉后利用眼球采血留取外周血行流式细胞术检查评估免疫抑制情况。（5）组织学白色念珠菌感染后6h处死所有小鼠,右肺上叶组织行组织培养,部分肺组织10%福尔马林浸泡,脱水石蜡包埋,切片HE染色和PAS染色。（6）ELISA法检测血清炎性因子IL-17、IL-6、IL-1β水平。RT-PCR法检测肺组织中IL-6、TGF-β、Kc和Mcp-1 m RNA水平。Western-blotting检测NF-κB、MAPK、PI3K/AKT和STAT3信号通路的蛋白表达。采用免疫组织化学方法检测NF-κBp65、NF-κBp50和p-STAT3的阳性核定位。（7）生存分析Control组、Dexa+Cy组、CA组和Dex A+Cy+CA组小鼠每组10只,动物死亡观察至白念珠菌感染后7d。研究结果1、腹腔内注射Dexa+Cy成功建立小鼠免疫抑制模型。雄性BALB/c小鼠腹腔内注射Dexa+Cy后表现为精神倦怠、萎靡,不喜活动,不嗜食水,毛发蓬乱,体重下降。小鼠外周血流式细胞术显示淋巴细胞比例下降,CD4+T和CD8+T细胞下降、CD4+T/CD8+T比值下降,免疫抑制模型构建成功。2、气管内注入白色念珠菌混悬液成功建立小鼠白色念珠菌感染模型。肺组织石蜡切片PAS染色显示肺组织内可见白色念珠菌孢子,肺组织培养可见白色念珠菌生长,白色念珠菌感染动物模型构建成功。3、白色念珠菌气管注入6小时后导致急性肺损伤,免疫抑制加重肺损伤。肺组织病理学Dexa+Cy组肺系数较Control组无统计学差异。CA组肺系数较Control组相比略有增加（P<0.05）。Dexa+Cy+CA组肺系数较Dexa+Cy组明显增加（P<0.01）。HE染色观察Control组和Dexa+Cy组显微镜下见肺泡结构完整,无炎症细胞浸润。CA组HE染色显微镜下见肺泡腔及间质可见大量炎症细胞浸润,伴有肺泡壁增厚。Dexa+Cy+CA组显着加重了小鼠肺中白色念珠菌诱导的炎症细胞浸润和肺泡壁增厚。4、白色念珠菌感染上调正常和免疫抑制小鼠肺部炎症因子和趋化因子的表达。正常和免疫抑制组小鼠白色念珠菌感染后,肺组织中炎症因子IL-6和TGF-βm RNA和趋化因子Kc和Mcp-1 m RNA显着增加。进一步测定血清IL-17、IL-6和IL-1β水平,CA组和Dexa+Cy+CA组三者水平显着升高,其中Dexa+Cy+CA组中IL-17和IL-1β水平较CA组进一步增高。5、白色念珠菌感染激活小鼠肺中NF-κB信号。核因子抑制蛋白IκBα在四组中表达水平无差异,但p-IκBα水平在白色念珠菌感染后显着升高。CA组肺NF-κB p50和p65的水平显着增加,免疫抑制后NF-κB p50和p65水平进一步增加。进一步分析肺NF-κB p50和p65的核移位发现NF-κB p50和p65的核移位主要在正常和免疫抑制小鼠的肺上皮细胞和间质细胞中,免疫抑制增加了白色念珠菌感染后κB p50和p65细胞核阳性的数量。研究结果显示白色念珠菌感染激活小鼠肺中NF-κB信号诱导急性肺损伤。6、白色念珠菌感染激活小鼠肺中MAPKs信号通路。研究显示四组之间肺p38、ERK1/2和JNK表达水平无差异。白色念珠菌感染对p-ERK1/2和p-JNK蛋白表达没有影响,但可显着诱导肺p38磷酸化,提示白色念珠菌感染可能通过MAPK-p38通路介导急性肺损伤。7、白色念珠菌感染激活小鼠肺中PI3K/Akt信号通路。研究发现正常和免疫抑制组小鼠肺中的p-Akt水平在白色念珠菌感染后明显上调的,提示白色念珠菌感染可以激活肺中的PI3K/Akt信号通路。8、白色念珠菌感染激活小鼠的肺STAT3信号通路。本课题分析了肺组织中的STAT3信号。结果发现白色念珠菌感染显着诱导肺STAT3磷酸化,免疫抑制小鼠的肺p-STAT3水平进一步升高。白色念珠菌感染后肺组织中ROR-γt和ROR-α水平显着升高。免疫抑制小鼠中p-STAT3细胞核阳性的数量增加。结果显示白色念珠菌感染可能活化小鼠的肺STAT3信号通路。研究结论（1）腹腔内注射Dexa+Cy成功建立小鼠免疫抑制模型。（2）气管内注入白色念珠菌混悬液成功建立小鼠白色念珠菌感染模型。（3）白色念珠菌感染上调正常和免疫抑制小鼠肺部炎症因子和趋化因子的表达。（4）白色念珠菌气道内注入可能通过激活NF-κB,MAPKs,PI3K/Akt和STAT3信号通路诱导急性肺损伤。免疫抑制可能通过激活部分炎症信号通路（NF-κB、STAT3）加重急性肺损伤。

王昂^[9]（2021）在《基于生物信息学的弥漫型胃癌与肠型胃癌多组学多维度差异比较研究》文中指出研究背景胃癌是中国第三、世界第四的致死癌症,是一个普遍性的健康问题。目前,病理学诊断依旧是胃癌诊断“金标准”。在临床中应用最广泛的病理分型主要有两种分类方式:一种是由Lauren提出的弥漫型胃癌（Diffuse gastric cancer,DGC）和肠型胃癌（Intestinal gastric cancer,IGC）的分类,另一种是由WHO提出的组织学分类。对于Lauren分型中的IGC,P.Correa提出了 IGC的分阶段演变过程,即慢性炎症、肠化生、异型增生、胃癌这一过程。虽然这对IGC的早期诊治起到了关键的作用,但只是在形态学上进行了详细分类,对于难发现且预后较差的DGC,目前仍然没有较好的癌前分期学说支持。肿瘤组织中肿瘤细胞自身可以发生多个层次的变化,如基因突变、DNA拷贝数变异、RNA转录差异、蛋白表达差异等。目前认为肿瘤的发生是由于多因素共同作用形成的。不同肿瘤其变化的形式也是不尽相同。关于DGC和IGC中肿瘤细胞的多重差异,我们还缺乏深入了解,有待深入研究。肿瘤微环境对肿瘤发生发展具有重要影响。在正常情况下,胃黏膜由上皮组织、间质组织及黏膜肌组成。其中间质组织主要由成纤维细胞和平滑肌细胞组成,也含有免疫炎性细胞,如淋巴细胞、浆细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞等。这些免疫细胞在细胞因子、趋化因子等诱导作用下被募集至胃黏膜固有层,在肿瘤免疫过程中发挥重要作用。深入了解DGC和IGC不同胃黏膜免疫微环境的变化状态能够揭示其在两类胃癌发生发展中的重要作用,从而可为DGC和IGC的预警预后及免疫治疗提供重要的理论参考依据。随着技术的进步,单细胞测序在肿瘤研究中日益发挥重要作用。拟时序分析通过对单细胞测序结果中的细胞表达进行降维排序,找到细胞发生发展过程中相似的细胞,进一步对这些相似的细胞进行分类,可以追踪细胞分化轨迹及发展规律。目前,关于胃癌组织发生的单细胞测序研究已有报道,但是聚焦DGC和IGC起源的研究尚未见报道。综上,本研究拟采用多种生物信息学分析手段,从肿瘤细胞自身特性,肿瘤微环境及肿瘤组织学发生等方面对DGC和IGC进行多组学多维度差异比较分析,旨在系统阐明DGC与IGC多组学差异化分子表型特征,为不同组织学类型胃癌精准诊治提供理论基础。研究目的1.通过对TCGA数据库中胃癌病例的多组学对比分析,明晰DGC和IGC在基因组、表观基因组、转录组、蛋白组等多种组学层面的差异。2.通过对TCGA数据库中胃癌病例的免疫细胞浸润程度及趋化因子、细胞因子表达程度的关联分析,明晰DGC和IGC在免疫微环境层面的差异。3.通过对公共数据库中单细胞测序结果的挖掘分析,明晰DGC和IGC细胞起源的差异,进一步阐明不同类型胃癌的组织发生过程。研究方法1.病例来源下载 TCGA（The Cancer Genome Atlas）数据库中胃癌（Stomach adenocarcinoma,STAD）的临床数据,在临床数据中提取有明确Lauren分型诊断的病例数据进行分析。通过筛选,在突变数据中DGC 65例,IGC 187例。在DNA拷贝数变异数据中DGC 64例,IGC 189例。在DNA甲基化数据中DGC 60例,IGC 162例。在mRNA数据中DGC 66例,IGC 181例。长链非编码RNA（Longnon-coding RNA,lncRNA）数据提取自 mRNA 数据,病例数同 mRNA数据中的病例数一致。在微小RNA（microRNA,miRNA）数据中DGC 66例,IGC 181例。在蛋白数据中DGC 60例,IGC 159例。单细胞测序数据使用 Sathe 等（https://dna-discovery.stanford.edu）及 Zhang 等（GSE134520）的Cell Ranger输出数据进行深度挖掘分析,病例包括:非萎缩性胃炎（Non-atrophic gastritis,NAG）3 例、慢性萎缩性胃炎（Chronic atrophic gastritis,CAG）3 例、肠上皮化生（Intestinal metaplasia,IM）6 例、早期胃癌（Early gastric cancer,EGC）1 例、进行期胃癌 4 例（Advancedgastric cancer,AGC）,其中包括DGC 2例、IGC 2例。2.DGC与IGC多组学差异比较a)突变差异分析使用maftools包对DGC和IGC的突变数据进行比对和可视化。基于oncodriveCLUST算法鉴定癌症驱动基因。与癌症体细胞突变目录（Catalogue Of Somatic Mutations In Cancer,COSMIC）v2 突变特征差异进行比对,得到IGC和DGC突变特征差异。b)DNA拷贝数差异分析使用重要像差基因分析（Genomic Analysis of Important Aberrations,GAIA）方法对检测结果进行分析,通过对比正常基因得到IGC和DGC组织DNA拷贝数变异信息。c)DNA甲基化差异分析使用Illumina Human Methylation450K芯片测试结果对IGC与DGC的甲基化结果进行比对。d)ncRNA表达差异分析利用TCGAEnsembl数据库（v75）提取lncRNA信息,并进行下游分析。使用TCGAbiolinks包对lncRNA的原始计数（rawcount,RC）进行差异分析。由于miRNA数据量较少,采用TCGA数据结果,直接使用edgeR包进行差异分析。e)转录组学差异分析对TCGA下载的mRNA的RC数据进行使用TCGAbiolinks包标准化处理,然后使用edgeR包进行差异分析。f)蛋白表达差异分析对TCGA数据库中蛋白表达数据使用limma方法进行差异分析。g)功能富集分析使用clusterProfiler包进行GO、KEGG、GSEA功能富集分析。h)多组学联合及归因分析对于DGC和IGC的差异基因,使用GDCRNATools建立ceRNA网络,并使用cytospace进行可视化。对于在蛋白表达网络分析中的基因,使用starbase数据库对比其相应的miRNA,然后寻找miRNA对应的lncRNA,最后对比spearman相关分析结果确认其ceRNA 网络是否成立。根据蛋白所在通路及使用limma对蛋白表达数据进行比对后的结果,结合mRNA差异表达,建立蛋白—mRNA表达相关网络。使用多组学因素分析（Multi-Omics Factor Analysis,MOFA）进行多组学联合及归因分析。对因子进行解析并确认相关基因与相关功能。3.DGC与IGC免疫微环境差异分析a)免疫细胞浸润差异分析使用28种免疫细胞的元基因作为基因集对不同类型胃癌样本的mRNA基因进行单样本基因集富集分析（single-sample gene set enrichment analysis,ssGSEA）,得到28种免疫细胞在DGC和IGC中的浸润程度。b)白介素、趋化因子及受体表达差异分析提取35种白介素、56种趋化因子及趋化因子受体表达量（logCPM）,通过Mann-Whitney U test 比较DGC和IGC中各种细胞因子的表达差异。c)免疫细胞与趋化因子、细胞因子联合分析使用最小二乘回归方法对免疫浸润细胞、趋化因子、白介素进行交联分析。首先选择全部趋化因子作为自变量、每种免疫浸润细胞分别作为因变量,然后使用全部的免疫浸润细胞作为自变量,每种白介素分别作为因变量进行分析,建立趋化因子—免疫浸润细胞—白介素交互模型。4.基于单细胞测序的胃癌组织发生分析a)单细胞测序结果均一化处理、聚类分析及细胞鉴定。使用Seurat中的标准方法进行均一化,然后对细胞进行聚类,最后得到28种细胞。根据细胞所在病变类型以及标志基因进行细胞鉴定。b)拟时序分析使用Monocle3对Seurat均一化后的细胞进行聚类,然后对每个聚类中细胞进行排序,分析拟时序路径。我们对包含DGC细胞和IGC细胞两个亚群使用扩散映射（diffusion map）进行分析。c)转绿因子活性分析使用SCENIC对每种细胞的转录因子活性进行分析。d)不同胃黏膜状态中细胞间相互作用分析使用Cellchat对在不同胃黏膜状态中细胞之间的相互作用进行分析。根据数据库中的对于配体受体的标记以及各个配体受体在细胞中的表达情况,将每种胃黏膜状态下的细胞在相互作用过程中所扮演的功能角色分为:供体（Sender）、受体（Receiver）、中介体（Mediatior）、干预体（Influencer）四类。同时对这四类功能在各个细胞中的重要程度（Importance）进行评价。e)不同胃黏膜状态中胃黏膜上皮细胞通路分析对DGC细胞、IGC细胞、干细胞1（S1）、干细胞2（S2）、吸收细胞以及杯状细胞中预测活性大于0.7的转录因子,以及通过ChatCell计算后,在各个胃黏膜状态中以上述细胞作为受体且重要程度大于0.7的配体受体通路中受体基因合并后,使用KEGG数据库进行富集分析。研究结果第一部分弥漫型胃癌与肠型胃癌多组学差异比较1.DGC与IGC基因组学差异分析1.1突变差异分析1.1.1突变类型与特征差异DGC和IGC两种胃癌的点突变中最常见者皆为C-T转换突变;两者的片段突变类型也基本趋同,即,缺失（Del）最常见,其次为插入（Ins）。癌症体细胞突变目录（COSMIC）是对众多肿瘤突变基因总结归类,将肿瘤突变类型分为30种。通过和COSMIC的突变特征比对,我们发现DGC出现4种突变特征,分别为COSMIC特征1（Signture 1,余弦近似:0.953）、COSMIC特征17（Signture 17,余弦近似:0.976）、COSMIC 特征 6（Signture6,余弦近似:0.973）、COSMIC特征4（Signture 3,余弦近似:0.783）;IGC出现3种突变特征分别为:COSMIC 特征 10（Signture 10,余弦近似:0.897）、COSMIC 特征 17（Signture 17,余弦近似:0.791）、COSMIC 特征 6（Signture 6,余弦近似:0.953）。1.1.2突变基因差异对比DGC和IGC突变数据,排在前10位的差异突变基因是:CDH1、FBN1、RELN、DNAH3、NEB、PCLO、FAT3、USH2A、MYO16、COL22A1。DGC和IGC突变率最高的前10位基因并不完全相同。DGC为:TTN、CDH1、CSMD3、TP53、MUC16、SPTA1、FAT4、ARID1A、CSMD1、PIK3CA,而 IGC 为:TTN、MUC16、TP53、LRP1B、FAT4、SYNE1、PCLO、HMCN1、FLG、ARID1A。其中两者相同的基因为:TTN、TP53、MUC16、FAT4、ARID1A。1.1.3突变联动性差异很多癌症中的基因在突变模式中表现出强烈的同现性或排他性。在DGC和IGC中突变的联动性均主要以同现关系为主,在DGC中突变基因发生联动性个数少于IGC。有少数突变之间出现排他性:在IGC中TP53基因同RELN、LRP2、PIK3CA、USH2A、KMT2D、OBSCN、ARID1A 及 MUC16 出现了排他性;在DGC 中 CDH1基因同DNAH5、LRP1B及CSMD3出现排他性。1.1.4驱动基因突变差异基于oncodriveCLUST算法鉴定癌症驱动基因,DGC中可能的驱动基因为SPECC1 和 PLOD3,IGC 中可能的驱动基因为 MYBL1、ZHF330、DAZAP1、DXX39B、SERPIN1 和 TVP23A。1.1.5通路节点基因突变差异TCGA工作组鉴定了 10条同癌症相关的通路,本文对各个通路进行了富集。其中TGF-β通路节点基因在IGC中突变率100%（7/7）,在DGC中突变率同样是100%（7/7）;DGC中突变率少于IGC。1.1.6突变基因富集分析使用GO与KEGG数据库对DGC和IGC突变差异基因进行功能富集,结果发现使用KEGG数据库富集未富集出相关功能。使用GO富集生物学过程（BP）前三位功能为:化学突触传递的调节、突触信号转导的调控、β-catenin/TCF复杂结合;GO富集分子功能（MF）前三位功能为:皮质细胞骨架、胞质区、电压门控钙通道复合物;GO富集细胞组分（CC）前三位功能为:钙离子跨膜转运蛋白活性、钙通道活性、电压门控钙通道活性。1.2 DNA拷贝数变异差异分析1.2.1 DNA拷贝数变异差异基因DGC中DNA拷贝数变异的基因共145个,其中扩增124个,缺失21个;IGC中DNA拷贝数变异的基因共7992个其中插入3908个,缺失4084个。DGC中前十位 DNA 拷贝数突变基因为:RN7SL5P（Del）、C12orf77（Amp）、LRMP（Amp）、CENPUP2（Amp）、C ASC1（Amp）ETFRF 1（Amp）、KRAS（Amp）、RNU4-67P（Amp）、LMNTD1（Amp）、TUBB4BP1（Amp）。IGC 中 DNA 拷贝数突变基因较多,FDR 值最小值相同基因超过10个,本文没有列出。1.2.2 DNA拷贝数差异基因富集分析对于DNA拷贝数变异基因进行功能富集。在DGC中,KEGG富集前三位通路为:黑色素瘤、胃癌、肌动蛋白细胞骨架调节。在IGC中,GO富集BP前三位为:对其他生物体防御、细菌防御、细胞杀伤;GO富集MF前三位为:丝氨酸型内肽酶抑制剂活性、味觉受体活性、苦味受体活性;KEGG富集到的前三位为:细胞因子与其受体的相互作用、卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒感染及乙型肝炎。2.DGC与IGC表观基因组学差异分析2.1 DNA甲基化差异分析对DGC和IGC的DNA甲基化状态进行差异比较,一共有599个甲基化位点出现差异,这些位点位于411个基因及基因间区中。其中,在DGC中高甲基化位点462个,高甲基化基因328个;在IGC中高甲基化位点137个,高甲基化基因83个（详见正文表1）。2.2 DNA甲基化差异基因功能富集分析对DGC和IGC甲基化差异基因进行功能富集,结果发现使用KEGG数据库富集未富集出相关功能。使用GO富集BP前三位功能为:腺体发育、细胞-基质粘附的调节、蛋白质定位于膜的正调控;GO富集MF前三位功能为:肌动蛋白细胞骨架、电压门控钾通道复合物、钾通道复合物;GO富集CC前三位功能为:RNA聚合酶Ⅱ近端启动子序列-特异性DNA结合、近端启动子序列特异性DNA结合、DNA结合转录激活剂活性,RNA聚合酶Ⅱ特异性。2.3非编码RNA（ncRNA）表达差异分析对DGC和IGC的miRNA表达进行了差异比较,结果发现logFC绝对值大于2的基因共57个,在DGC中高表达4个,在IGC中高表达53个。对DGC和IGC的lncRNA表达进行了差异比较,结果发现logFC绝对值大于2的基因共24个,在DGC中高表达8个,在IGC中高表达16个（详见正文表2,3）。3.DGC与IGC转录组学差异分析3.1 mRNA表达差异分析对DGC和IGC进行了 mRNA表达差异比较,结果发现logFC绝对值大于2的差异基因共415个,其中在DGC中高表达基因共233个,在IGC中高表达基因共182个（详见正文表4）。3.2 mRNA表达差异基因富集分析对这些差异表达mRNA进行功能富集,GO富集BP前三位为:肌肉系统成长过程、细胞外结构构建、肌肉收缩;GO富集MF前三位功能为:受体调节活性、受体配体活性、硫化物结合;GO富集CC前三位为:细胞外基质、含胶原的细胞外基质、内质网腔;KEGG富集前三位为:磷脂酰肌醇3激酶信号通路、胰腺分泌、蛋白消化吸收。4.DGC与IGC蛋白组学差异分析对DGC和IGC的蛋白表达进行了差异比较,共87个蛋白表达出现差异,在DGC中高表达46个,在IGC中高表达41个（详见正文表5）。5.多组学参数联合分析与归因分析5.1 DNA甲基化和mRNA表达联合分析联合分析DGC和IGC的DNA甲基化差异和mRNA表达差异,结果发现8个甲基化位点同mRNA表达出现联动表现,其中在DGC中高甲基化低表达基因为MEIS1,在IGC中高甲基化低表达的基因为SGK2、APOH、TMED6、SERPINA10、HNF4A。5.2 ceRNA网络分析将本文分析发现的差异lncRNA、miRNA、mRNA与数据库中已知可结合的lncRNA、miRNA、mRNA 相比对,结果发现 lncRNAPVT1 可同 hsa-mir-106a、hsa-mir-106b、hsa-mir-17、hsa-mir-20a、hsa-mir-20b、hsa-mir-519d、hsa-mir-93 互相作用,而这些miRNAs又可同POLQ、PARD6B、HMGA2、CDC25A互相作用,提示上述lncRNA-miRNA-mRNA之间存在ceRNA调控网络。5.3 DGC与IGC相关通路差异表达蛋白多维调控网络分析对比DGC和IGC的蛋白表达结果,发现在DGC中,DNA损伤反应信号通路、上皮间质转化信号通路、激素A/B（Hormone A/B）信号通路、活化酪氨酸激酶信号通路、结节性硬化复合物-雷帕霉素靶蛋白信号通路中的蛋白表达更加活跃;而在IGC中,细胞周期信号通路中的蛋白表达更加活跃。通过多维调控网络分析发现DNA损伤反应通路在DGC中活跃是由于BRCA2、Chk1 在 DGC 中高表达,而在DGC 中 BRCA2 受 hsa-mir-369、hsa-mir-488、XIST、NEAT 1、HCG18 调控,CHEK1 受 hsa-mir-195、hsa-mir-497、P VT1、SNHG1、SNHG12、HCG18调控。上皮间质转化通路在DGC中活跃是由于Collagen Ⅳ、E-Cadherin在DGC中高表达,而在DGC中CDH1主要受突变影响,COL6A1受MEG3影响,关COL6A2 受 HSPA7、KCNQ1OT1、FBXL21、PCDHB18、TUG1、PCDHB9、RPLP0P2、ANKRD26P1、ZFP92、ZDHHC8P1、CIDECP、ZSCAN12P1、CASC2、H19、C4orf10、GATS.1、UBE2Q2P1、OR2A9P 影响,COL6A3 受 ACTN3、HSPA7、PCDHB18、TUG1、PCDHB9、ZNF702P、RPLP0P2、ZFP92、ZSC AN12P1、C ASC2、H19、GATS.1、FAM35B2、OR2A9P影响。激素A通路在DGC中活跃是由于ERalpha、PR在DGC中高表达,而ESR1受XIST、KCNQ1OT1、MEG3影响。激素B通路在DGC中活跃是由于AR、Bcl-2在DGC中高表达,而在DGC中BCL2受KCNQ1OT1、POLR2J4、NEAT1、HCG18、MIAT影响。活化酪氨酸激酶通路在DGC中活跃是由于EGFRpY1173和HER3pY1289在DGC中高表达,而在DGC中EGRF高表达,但未找出相关miRNA、lncRNA。结节性硬化复合物-雷帕霉素靶蛋白通路在DGC中活跃是由于4E-BP1pS65与RictorpT1135在DGC中表达量较高。在DGC和IGC中EIF4BP1 受 GAS5 影响,RPS6 受 hsa-let-7d、hsa-mir-1224、hsa-mir-125a、hsa-mir-212、hsa-mir-3187、hsa-mir-652、hsa-mir-744、SNHG1、SNHG12 影响。细胞周期通路在IGC 中活跃是由于 CDK1、CyclinB1、CyclinE1、CyclinE2、PCNA 在 IGC 中表达量较高,而在IGC中CDK1受SNHG3、DLEU1、TUG1影响。CCNE1受SNHG1、HCG18 影响,CCNE2 受 hsa-mir-30a 影响。5.4多组学参数归因分析对全部入组分析获得的63例DGC和175例IGC的多组学数据参数进行归因分析,包括突变基因10725个、DNA拷贝数变异基因3086个、甲基化位点373333个、miRNA基因799个、mRNA基因14202个、差异表达蛋白218种。通过分析得到各个参数与Lauren分型（DGC/IGC）的相关程度,其中相关程度最高者为DNA甲基化、相关程度最低者为基因突变。第二部分弥漫型胃癌与肠型胃癌免疫微环境的差异比较1.免疫浸润细胞差异比较DGC和IGC两组间免疫细胞浸润程度的异同。结果显示在IGC中浸润程度较高且有显着性统计学差异的免疫细胞包括:活性CD8 T细胞（Activated CD8 T cell）、CD56dim 自然杀伤细胞（CD56dim natural killer cell）、中央记忆 CD8 T 细胞（Central memory CD8 T cell）、效应记忆 CD8 T 细胞（Effector memory CD8 T cell）、幼稚树突细胞（Immature dendritic cell）、巨噬细胞（Macrophage）、骨髓来源的抑制性细胞（Myeloid-derived suppressor cells,MDSC）、自然杀伤 T 细胞（Natural killer T cell）、调节 T 细胞（Regulatory T cell）、Ⅱ型辅助 T 细胞（Type 2 T helper cell）。而在DGC中浸润程度较高且有显着性统计学差异的免疫细胞包括:活性B细胞（Activated B cell）、活性树突细胞（Activated dendritic cell）、γδ T 细胞（Gamma delta T cell）、幼稚 B 细胞（Immature B cell）、记忆 B 细胞（Memory B cell）、自然杀伤细胞（Natural killer cell）、髓样树突细胞（Plasmacytoid dendritic cell）、17 型辅助 T 细胞（Type 17 T helper cell）。2.趋化因子配体及受体基因差异对比DGC和IGC趋化因子及受体的表达差异,结果发现共28个趋化因子及受体出现了统计学差异。其中,在DGC中高表达的趋化因子及受体有:CCL2、CCL3、CCL18、CCL20、CCL21、CCL25、CCL26、CXCL2、CXCL4、CXCL7、CXCL11、CXCL13、XCL2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7、CCR8、CXCR3;在IGC 中高表达的趋化因子及受体有:CCL1、CCL8、CCL13、CXCL5、CXCL10、CX3CL1、XCL1、CCR1、CXCR2。3.白介素基因表达差异对比DGC和IGC细胞因子的表达差异,结果发现白介素中有20个出现表达差异,其中在DGC中高表达的白介素有:IL12B、IL13、IL17A、IL17F、IL22;在IGC 中高表达的白介素有:IL1B、IL4、IL5、IL7、IL16、IL17B、IL17D、IL18、IL21、IL24、IL26、IL27、IL32、IL33、IL34。4.免疫浸润细胞与趋化因子、细胞因子联合分析在IGC中,正向相关性较高的趋化因子与免疫浸润细胞有:CCL1、CCL5、CCL4、CXCL16与CD56dim自然杀伤细胞;CX3CL1、CCL8与嗜酸性粒细胞（Eosinophil）;CXCL2与肥大细胞（Mast cell）;CCL21与活性B细胞;CCL3与效应记忆CD4 T细胞（Effector memeory CD4 T cell）;CX3CL1与自然杀伤T细胞。正向相关性较高的免疫浸润细胞与细胞因子有:17型辅助T细胞与IL23A、IL17A、IL13;自然杀伤T细胞与IL11、IL15;髓样树突细胞与IL13、IL17A;调节T细胞与IL11、IL15;γδ T细胞与IL6。在DGC中,正向相关性较高的趋化因子与免疫浸润细胞有:CCL4、CCL11与自然杀伤细胞;CCL14、CXCL9与髓样树突细胞;CCL11、CCL3、CCL5与嗜酸性粒细胞;CXCL10、CCL20、CXCL1与CD56dim自然杀伤细胞。正向相关性较高的免疫浸润细胞与细胞因子有:嗜酸性粒细胞、调节T细胞、自然杀伤细胞、幼稚B细胞与TXLNA;自然杀伤T细胞与IL10、IL26;自然杀伤细胞与IL17F;调节T细胞与IL10、IL15;γδ T细胞与IL32。第三部分基于单细胞测序的弥漫型胃癌与肠型胃癌组织发生学研究1.不同胃黏膜状态中胃黏膜上皮单细胞测序图谱对单细胞测序结果进行分析后,利用细胞特征基因共分离出29种细胞,其中上皮细胞15种,间质细胞14种（特征基因见正文表13）。在使用OLFM4作为干细胞特征基因对细胞进行标记时,我们发现有一部分细胞高表达OLFM4,但是在UMAP图中这部分细胞和其他干细胞位置较远,认为这部分细胞是一种干细胞的亚型,所以将这部分干细胞命名为干细胞2（Stemce112,S2）,而将其余干细胞命名为干细胞 1（Stem cell1,S1）。对细胞进行分类后发现从NAG到EGC及AGC,细胞主要以胃小凹上皮细胞（Pit cell）、基底腺粘液细胞（Basal gland mucous cell,BGM）、干细胞1为主,同时干细胞的占比逐渐增多,在EGC中干细胞1占比最高。在DGC和IGC中,干细胞的占比降低,免疫相关细胞占比升高。2.胃黏膜上皮细胞的拟时序分析使用Monocle3对全部细胞进行聚类分析,然后进行拟时序分析。我们发现有两个聚类块分别包含DGC细胞（PartA）和IGC细胞（PartB）。据此虽然可以看出有分化轨迹,但是不易确认细胞所在状态的先后顺序,所以我们进一步使用扩散映射（diffusionmap）进行分析。结果发现PartA主要包含S2干细胞、杯状细胞、肠型内分泌细胞、D细胞、G细胞和DGC细胞。发现S2、杯状细胞的大部分以及DGC细胞三者出现细胞聚集的位置距离较近,而肠型内分泌细胞、D细胞两者出现细胞聚集的位置距离较近,G细胞集出现细胞聚集的位置与其他细胞距离较远。PartB主要包含主细胞、基底腺粘液细胞、S1干细胞、祖细胞（Progenitor cell）、胃小凹上皮细胞、吸收细胞（Entercoty）以及IGC细胞。这其中主细胞、BGM两者出现细胞聚集的位置距离较近,S1、祖细胞两者出现细胞聚集的位置距离较近、胃小凹上皮细胞、IGC细胞、吸收细胞三者出现细胞聚集的位置距离较近。通过分析发现,S2和杯状细胞及DGC细胞分化相近,S1和吸收细胞及IGC细胞分化相近。3.不同胃黏膜上皮细胞转录因子活性分析使用SCENIC方法对各种细胞的转录因子活性进行了鉴定,选取了预测活性大于0.7的转录因子作为在该细胞中发挥功能的转录因子。我们分析出S1、S2、吸收细胞、杯状细胞、DGC细胞、IGC细胞中具有活性的20个转录因子,其中有10个转录因子（GEBPD、ELF4、KLF5、MAFG、MAZ、PRDM1、SMARCA4、SREBF2、SRF、YY1、ZNF143）在不同胃黏膜上皮细胞中均有活性。在具有细胞特异性的活性转录因子中,我们关注到活性转录因子GATA6仅存在于S2、杯状细胞和DGC中;CEBPG存在于S1、吸收细胞、杯状细胞、IGC细胞中;KLF4存在于S1、吸收细胞、杯状细胞、DGC细胞、IGC细胞中;TBX3存在于S1、吸收细胞中;活性转录因子ELF3、HNF4A、MXD1仅存在于吸收细胞中;SUZ12存在于IGC细胞中;RB1存在于S1、S2、杯状细胞、DGC细胞、IGC细胞中;CD59存在于S1、S2、吸收细胞、杯状细胞中;CDX1存在于吸收细胞、杯状细胞、DGC中。4.不同胃黏膜状态中细胞间配体-受体相互作用分析进一步,我们使用Cellchat分析不同胃黏膜状态中细胞之间的相互作用,对每种细胞在相互作用过程中所发挥的功能进行评价。在DGC中,DGC细胞作为供体或受体（Sender或Receiver）且重要程度大于0.7的配体受体通路有:类胰岛素生长因子（IGF）信号通路、巨噬细胞迁移抑制因子（MIF）信号通路、中期因子（MK）信号通路、血小板衍生因子（PDGF）信号通路、多效生长因子（PTN）信号通路。在IGC中,IGC细胞作为供体或受体且重要程度大于0.7的配体受体通路有:分化簇抗原CD40信号通路、Fas受体配体（FASLG）信号通路、IGF信号通路、MIF信号通路、MK信号通路、PDFG信号通路、PTN信号通路、肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体（TRAIL）信号通路。对比DGC及IGC中重要的配体受体通路,我们发现IGF信号通路、MIF信号通路、MK信号通路、PDGF信号通路、PTN信号通路在DGC和IGC中同样发挥重要作用。不同的是,在DGC中,MIF信号通路主要发挥作用者为MIF-（CD74+CXCR4）,而在IGC中,主要发挥作用者为MIF-（CD74+CD44）。MK信号通路中,MDK-SDC4在DGC中的贡献要大于在IGC中的贡献。PDFG信号通路中PDGFA-PDGFRA在DGC中的贡献大于在IGC的贡献,而PDGFA-PDGFRB在IGC中的贡献大于在DGC中的贡献。在PTN信号通路中,PTN-SDC4在DGC中的贡献要大于在IGC中的贡献5.不同胃黏膜状态中胃黏膜上皮细胞通路分析利用KEGG数据库,我们对非萎缩性胃炎（NAG）、慢性萎缩性胃炎（CAG）、肠上皮化生（IM）、早期胃癌（EGC）、进行期胃癌（AGC）包括DGC和IGC等不同胃黏膜状态中胃黏膜上皮细胞通路进行了富集分析。在NAG及CAG状态下,没有呈现符合要求的结果。在IM状态中,S1富集到了磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶信号通路、癌症蛋白聚糖通路、丝裂原活化蛋白激酶信号通路、人乳头瘤病毒感染、Rap1信号通路、粘着斑通路、肌动蛋白细胞骨调节通路、细胞外基质受体相互作用通路、乳腺癌通路、造血细胞谱系通路。吸收细胞富集到了利什曼病通路、肺结核通路、Rap1信号通路、肌动蛋白细胞骨调节通路、百日咳病毒通路、补体和凝血级联通路、造血细胞谱系通路、Th17细胞分化通路、吞噬体通路、JAK-STAT信号通路。值得提出的是,IM状态中可见DGC细胞存在（详见正文表14）,功能富集结果显示DGC细胞富集到了人巨细胞病毒感染、病毒蛋白与细胞因子及受体作用通路、弓形虫病通路。在早期胃癌EGC状态中,干细胞富集到了细胞因子-细胞因子受体相互作用通路、MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路、肿瘤蛋白多糖、TGF-β信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化、造血细胞谱系、调节干细胞多能性的信号通路、粘附连接、补体和凝血级联信号通路。在进行期胃癌中,干细胞1富集到了 PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、粘着斑通路、肿瘤蛋白多糖、EGFR酪氨酸激酶拮抗剂（EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance）通路、肝癌（Hepatocellularcarcinoma）通路、粘附连接通路、黑色素瘤（Melanoma）通路、ErbB信号通路、非小细胞肺癌通路。GCI富集到了肝癌通路、粘着斑通路、人乳头瘤病毒感染通路、黑色素瘤通路、胶质瘤通路、致心律失常性右室心肌病（Arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy）通路、细胞外基质受体相互作用、肥厚性心肌病（Hypertrophic cardiomyopathy）通路、小细胞肺癌（Small cell lung cancer）通路、扩张型心肌病（Dilated cardiomyopathy）通路。在进行期胃癌IGC状态中,S1富集到了磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶信号通路、癌症蛋白聚糖通路、丝裂原活化蛋白激酶信号通路、粘着斑通路、EGFR酪氨酸激酶拮抗剂通路、肝癌通路、粘附链接通路、黑色素瘤通路、非小细胞肺癌通路、ErbB信号通路。IGC富集到了细胞外基质受体相互作用通路、细胞粘附分子通路、粘着斑通路、癌症蛋白聚糖通路、人乳头瘤病毒感染、致心律失常性右室心肌病通路、肥厚性心肌病通路、扩张型心肌病通路、致病性大肠杆菌感染通路、疟疾通路。在进行期胃癌DGC状态中,S1富集到了磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶信号通路、癌症蛋白聚糖通路、丝裂原活化蛋白激酶信号通路、ErbB信号通路、粘着斑通路、EGFR酪氨酸激酶拮抗剂通路、乳腺癌通路、膀胱癌通路、前列腺癌通路、内分泌抗性通路。结论1.弥漫性胃癌与肠型胃癌在基因组学、表观基因组学、转录组学层面均存在差异,而在蛋白表达层面未见明显差异。弥漫型胃癌的基因、表观基因层面改变相对较少,转录层面改变相对明显。在弥漫型胃癌中DNA损伤反应、信号通路、上皮间质转化信号通路、激素A/B信号通路、活化酪氨酸激酶信号通路、结节性硬化复合物-雷帕霉素靶蛋白信号通路中的蛋白表达更加活跃;而在肠型胃癌中细胞周期信号通路中的蛋白表达更加活跃。多组学参数归因分析模型显示与Lauren分型相关程度最高的参数为DNA甲基化,相关程度最低参数为基因突变。2.弥漫性胃癌与肠型胃癌的免疫微环境可能由不同类型的免疫细胞主导,即弥漫性胃癌中以T细胞免疫浸润为主,而肠型胃癌中则以B细胞免疫浸润为主。本研究通过最小二乘回归方法建立了趋化因子-免疫细胞-细胞因子相关性模型。在DGC中,CCL4可以趋化自然杀伤细胞浸润癌组织,自然杀伤细胞在癌组织中释放IL-17F,进而刺激其他细胞因子产生。3.干细胞2、杯状细胞和弥漫性胃癌细胞基因表达模式相似,干细胞1、吸收细胞和肠型胃癌细胞基因表达模式相似,肠上皮化生不仅是肠型胃癌的癌前病变,也可能与弥漫性胃癌的发生密切相关。胃上皮细胞在各种不同疾病状态下有活性的转录因子以及重要的受体-配体通路具有明显差异,DGC细胞富集到的主要通路与病毒感染密切相关。

郑杰^[10]（2020）在《高糖诱导HUVECs基因差异表达的生物信息学分析》文中指出目的 高糖诱导的内皮功能障碍被认为是糖尿病相关心血管并发症的始作俑者。本研究通过生物信息学分析高糖诱导的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）基因差异表达,筛选出与糖尿病内皮细胞功能障碍相关的基因,从而探究这些基因在糖尿病相关心血管疾病中的作用机制。方法 从GEO数据库下载数据集GSE49524和GSE87295,两个数据集中都包括了健康妊娠女性和妊娠期糖尿病女性的HUVECs;使用R软件和Perl软件对两个数据集进行矩阵注释、合并及校正;使用R软件（limma软件）筛选出差异基因;应用DAVID软件对差异基因进行生物信息学分析。用Ⅰ型胶原酶从新生儿脐带中消化分离出原代HUVECs,接种并传代培养（2-4代细胞用于实验）。用细胞计数试剂盒-8法和流式细胞术分别测定对照组（5.5mmol/L葡萄糖）、高糖组（30.5mmol/L葡萄糖）、甘露醇等渗组（30.5mmol/L甘露醇）的HUVECs的增殖活性和早期凋亡率。提取对照组和高糖组干预48h后的HUVECs总RNA送至广州基迪奥生物科技有限公司分别对样品中的coding RNA、nc RNA进行表达量分析,并进行nc RNA-coding RNA的关联分析。使用R软件和Perl软件对基因芯片结果进行矩阵注释、合并及校正;之后用R软件（limma软件）筛选出差异基因;并应用DAVID软件对差异基因进行生物信息学分析。使用STRING数据库分析差异基因编码蛋白的相互作用,随后应用Cytoscape软件中的MCODE插件进行分析,筛选出可能的关键基因。结果1.GEO数据库生物信息学分析:共筛选出168个差异表达基因（DEGs）,包括96个上调基因和72个下调基因。基因本体（GO）分析表明,这些DEGs富集在血管新生的调控、内皮细胞增殖分化的调控及内皮细胞迁移的调控等生物过程。京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析表明,DEGs富集在细胞外基质-受体相互作用、局灶性粘连、蛋白质的消化吸收、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信号通路、胞外信号调节激酶信号通路等。2.高糖诱导的HUVECs基因芯片生物信息学分析:共筛选出568个DEGs,包括267个上调基因和301个下调基因。GO分析表明,差异基因富集在血管舒张调节、B细胞活化、利用细胞内钙源进行钙介导的信号传导、干扰素-γ分泌的正调控、白细胞介素1β分泌的阳性调控、细胞趋化性等生物过程。KEGG通路分析表明,差异基因富集在血小板聚集、细胞粘附、胰岛素分泌等信号通路。STRING数据库分析筛选出1-磷酸鞘氨醇（S1P）、趋化因子受体4（CXCR4）、尾加压素Ⅱ（UII）等可能与高糖对内皮细胞损伤有关的关键基因。结论高糖可能是通过细胞外基质-受体相互作用、细胞粘附、血管舒张调节、干扰素-γ分泌的正调控、白细胞介素1β分泌的阳性调控、细胞趋化性、血小板聚集等生物功能,以及磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信号通路、胞外信号调节激酶信号通路、鞘氨醇激酶-S1P-S1PR信号通路、基质细胞衍生因子1/CXCR4信号通路、UII及其受体（GPR14）信号通路等的作用来调控内皮细胞的功能障碍。

二、磷脂酰肌醇3激酶是趋化因子信号转导的关键信使（论文开题报告）

（1）论文研究背景及目的

此处内容要求：

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例：

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

（2）本文研究方法

调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、磷脂酰肌醇3激酶是趋化因子信号转导的关键信使（论文提纲范文）

（1）基于中医象思维探讨肾衰饮干预慢性肾功能衰竭大鼠的机制研究（论文提纲范文）

（2）基于脊髓CXCL1-CXCR2内吞途径探讨针刺对CFA小鼠镇痛作用的研究（论文提纲范文）

（3）组蛋白H3K9乙酰化修饰通过调控Pik3ca转录参与阿霉素诱导的H9c2细胞凋亡（论文提纲范文）

（4）PI3K/AKT通路在动物葡萄糖代谢中的研究进展（论文提纲范文）

（5）脂肪因子分泌和炎症微环境交互作用驱动肥胖脂肪组织胰岛素抵抗的机制研究（论文提纲范文）

（6）维生素E对珍珠龙胆石斑鱼生长和免疫的影响及其相关机制的研究（论文提纲范文）

（7）趋化因子及其受体在乳腺癌中的研究进展（论文提纲范文）

（8）白色念珠菌通过激活炎症信号途径在小鼠模型中诱导急性肺损伤的研究（论文提纲范文）

（9）基于生物信息学的弥漫型胃癌与肠型胃癌多组学多维度差异比较研究（论文提纲范文）

（10）高糖诱导HUVECs基因差异表达的生物信息学分析（论文提纲范文）

四、磷脂酰肌醇3激酶是趋化因子信号转导的关键信使（论文参考文献）

• [1]基于中医象思维探讨肾衰饮干预慢性肾功能衰竭大鼠的机制研究[D]. 张亮. 辽宁中医药大学, 2021(02)
• [2]基于脊髓CXCL1-CXCR2内吞途径探讨针刺对CFA小鼠镇痛作用的研究[D]. 王洋洋. 天津中医药大学, 2021(01)
• [3]组蛋白H3K9乙酰化修饰通过调控Pik3ca转录参与阿霉素诱导的H9c2细胞凋亡[D]. 杨柳. 中国医科大学, 2021(02)
• [4]PI3K/AKT通路在动物葡萄糖代谢中的研究进展[J]. 孙冠聪,焦丹,谢忠奎,周平,杨果. 生命科学, 2021(05)
• [5]脂肪因子分泌和炎症微环境交互作用驱动肥胖脂肪组织胰岛素抵抗的机制研究[D]. 张坤. 北京协和医学院, 2021(02)
• [6]维生素E对珍珠龙胆石斑鱼生长和免疫的影响及其相关机制的研究[D]. 徐安乐. 集美大学, 2021(01)
• [7]趋化因子及其受体在乳腺癌中的研究进展[J]. 王婉玉,吕晓希,胡卓伟,刘姗姗. 药学学报, 2021(06)
• [8]白色念珠菌通过激活炎症信号途径在小鼠模型中诱导急性肺损伤的研究[D]. 许知礼. 安徽医科大学, 2021(01)
• [9]基于生物信息学的弥漫型胃癌与肠型胃癌多组学多维度差异比较研究[D]. 王昂. 中国医科大学, 2021(02)
• [10]高糖诱导HUVECs基因差异表达的生物信息学分析[D]. 郑杰. 福建医科大学, 2020(02)