人乳腺癌细胞cDNA文库的构建与鉴定

一、人乳腺癌细胞cDNA文库的构建及鉴定（论文文献综述）

樊喻^[1]（2020）在《CD133谱系示踪小鼠第四脑室单细胞转录组测序及可变剪接分析》文中认为大脑细胞类型的复杂性众所周知,只有对中枢神经系统组织中各种成分和细胞类型的相互作用进行彻底了解,才能更好地理解中枢神经系统的生理功能与病理状态。现有的细胞分类方式在标记的选择上限制了细胞类型的分辨率,难以体现中枢神经系统的异质性。单细胞转录组测序技术通过无偏见的获取单细胞使得组织异质性得到最大程度的体现。神经干细胞具有分化为多种中枢神经系统神经元和神经胶质细胞类型的能力。过去十年中,关于成年神经发生的研究主要集中在两个大脑区域,即侧脑室的脑室下区（SVZ）和海马结构的颗粒下区（SGZ）。而鲜少有关于第四脑室的相关研究报道,本实验室前期的工作中发现第四脑室存在可以被VEGF细胞因子激活的静息态神经干细胞。同时现有研究结果表明可变剪接在神经元发育和成熟神经元的功能中均起到关键作用。本课题构建了 CD133谱系示踪小鼠,并对其第四脑室细胞进行Smart-seq2单细胞转录组测序。共捕获96个ZSGreen 阳性单细胞,通过对测序结果进行无监督聚类分析发现第四脑室CD133+干细胞可在生理条件下分化为神经元、室管膜细胞、成熟少突胶质细胞、小胶质细胞、内皮细胞、成髓鞘少突胶质细胞等多个细胞类型,其中成髓鞘少突胶质细胞还可以分为两个亚类。通过对测序结果进行伪时序分析,系统认为内皮细胞与室管膜细胞处于分化早期,神经元、小胶质细胞、成髓鞘少突胶质处于分化晚期。本次测序检测到TSS、TTS、IR、AE、SKIP5种常见可变剪接类型,并且在各细胞类型中TSS与TTS均占比最高,IR占比最少。本次测序同时发现小鼠第四脑室细胞可变剪接存在强异质性,表现为:同一细胞中存在多种可变剪接;同一类型不同细胞的同一基因存在不同可变剪接形式。通过对新可变剪接体的ORF预测、氨基酸序列预测发现有些新的可变剪接体仍具有蛋白编码能力,而有些新的可变剪接体不再具有蛋白编码能力。

王超^[2]（2020）在《水母来源环γ-聚谷氨酸分离纯化及其在构建双重响应性载阿霉素纳米胶束中的运用》文中提出第一部分水母（Jellyfish）属刺胞动物门,是海洋中一类分布广泛、生物总量庞大的无脊椎动物。水母毒素是多肽/蛋白类混合物,主要储存于触手上的一类特化细胞器——刺丝囊（nematocyst）中。由于水母种类、地域分布及捕食对象的不同,其毒素的组成、生物活性也存在一定的差异。为了更好地研究和比较不同种属水母刺丝囊毒性组分的差异,本论文的第一部分以我国近海大规模暴发的发形霞水母（Cyanea capillata,C.capillata）和越前水母（Nemopilema nomurai,N.nomurai）为研究对象,首先构建高质量的水母触手转录组数据库;其次优化这两种水母最主要的捕食性刺丝囊纯化以及毒素提取的方法,进一步利用液相色谱-串联质谱（liquid chromatography-tandem mass chromatography,LC-MS/MS）组学方法对两种水母刺丝囊毒素的蛋白组成进行比较分析。主要结果如下:1.本课题组前期已成功构建C.capillata触手组织cDNA文库,此次利用RNA-seq和de novo组装,基于Illumina Hi SeqTM 2000平台成功构建了N.nomurai触手组织转录组,得到118,243条有效Unigenes序列。使用Blastx算法将组装好的unigenes 与公共数据库（Nr、Swiss-Prot、Pfam、KOG、GO 和 KEGG）进行比对,其中15,927个unigenes得到同源注释。在KOG注释中,25,733个unigenes被分为25个功能类别。GO注释中,26,933个unigenes根据生物学进程、细胞成分和分子功能进行了注释和分组。KEGG注释中,有19,423个unigenes富集于包括机体系统、代谢、遗传信息处理、环境信息处理和细胞过程等不同的功能类别中。2.采用优化后的方法从C.capillata和N.nomurai分离纯化到了两种主要的捕食性刺丝囊,利用光镜和扫描电镜观察其形态学差异,结果发现来自C.capillata的主要是isorhiza型刺丝囊,而来自N.nomurai的主要是mastigophore型刺丝囊。聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）分析刺丝囊内毒素蛋白条带的差异,显示N.nomurai刺丝囊毒素（Nemopilema nomurai nematocyst venom,NnV）中大分子量蛋白（>40 kDa）较C.capillata刺丝囊毒素（Cyanea capillata nematocyst venom,CnV）更多,且 NnV 的蛋白分子量范围更广。CCK8（Cell Counting Kit-8）法检测两种刺丝囊毒素的毒性差异并计算IC50值,结果表明NnV的细胞毒性约为CnV的5倍。3.通过聚丙烯酰胺凝胶电泳-液相色谱-电喷雾质谱（Liquid chromatography-electrospray ionization/tandem mass spectrometry,LC-ESI/MS）联用 的方式,获得 CnV和NnV蛋白组分的初始肽段,在CnV和NnV中分别产生了 189,309和267,286个MS/MS肽段。肽段匹配数据库分别为:C.capillata和N.nomurai触手转录组数据（自建）、Uniprot 动物毒素数据库（Uniprot animal toxin and venom database）、Uniprot分类学刺胞动物门数据库以及通过文献查找的其它已报道的生物毒素信息。通过检索匹配,最终在CnV和NnV中分别鉴定和注释到345和329个蛋白,其中结构蛋白、酶和毒素类蛋白数量最多。经过进一步分析,最终在CnV和NnV中分别鉴定出53和69个毒素相关蛋白。这些毒素亦常见于其他有毒动物,包括一些刺胞动物（Nematostella vectensis,Hydra vulgaris）)、蛇（Gloydius ussuriensis,Naja annulifera）、蜘蛛（Loxosceles intermedia、Lycosa singoriensis）、蝎子（Mesobuthus martensii、Lychas mucronatus）等。4.比较分析后可以将CnV和NnV中共有的蜇伤中毒相关的毒素蛋白大致分为10类:蛋白酶类、磷脂酶、神经毒素、cysteine-rich分泌性蛋白、凝集素、孔道形成毒素、蛋白酶抑制剂、离子通道抑制剂、杀虫活性成分和其他毒素。以上毒素在CnV和NnV之间的构成比例存在明显差异。例如,NnV占比最高的三类毒素是金属蛋白酶、蛋白酶类以及孔道形成毒素,分别占NnV毒素的27.5%、18.8%和8.7%。CnV中最多的三类毒素分别为磷脂酶、神经毒素和蛋白酶类,分别占22.6%、17.0%和 11.3%。该部分结果揭示了我国两种常见的暴发性水母刺丝囊毒素分子的多样性,同时还提示不同水母刺丝囊毒素组分构成比例的不同与其蜇伤效应间可能存在的关系,有望为不同水母蜇伤的治疗提供指导。第二部分在多组学分析结果的指导下,本课题组致力于水母毒素的分离纯化及生物学活性研究。在前期分离纯化过程中,我们发现水母刺丝囊粗毒组分疏水性强、稳定性差（对热不稳定、pH变化敏感）,目前全球也仅有少数几种毒素分子被成功分离、鉴定。但是本课题组在分离纯化NnV的过程中发现了一个有趣现象:从刺丝囊提取的粗毒具有高水溶性,而将粗毒水溶液置于截留分子量为10 kDa的透析袋中,在纯水中透析24 h后发现透析袋内有沉淀产生,即毒素的水溶性明显降低;若将粗毒样品直接进行离子交换、凝胶过滤分离,则发现第一个蛋白洗脱峰均为紫外吸收明显的大峰,而之后的洗脱峰紫外吸收很低。表明刺丝囊毒素易聚合形成絮凝物,大部分蛋白在初期即同时被洗脱,因而分离效果不佳。由此我们推测,水母刺丝囊中存在一类水溶性好、吸附力强、有助于提升毒素蛋白亲水性的小分子物质,对毒素蛋白结构稳定、活性维持起着至关重要的作用。基于上述推测,我们将水母刺丝囊提取液经脱盐、HPLC（high performance liquid chromatography）反相C18柱分离后,ESI-MS检测发现一组相对分子质量等差 129 的系列小分子（依次为:516 Da、645 Da、774 Da、903 Da、1032 Da、1161 Da、1290 Da、1419 Da）。该系列小分子的分子量均为129的倍数（4～11×）,提示是以129为结构单元的聚合物,且该系列聚合物没有起始单元,为均一的聚合。进一步的氨基酸组成分析发现其仅由谷氨酸（glutamic acid,Glu）一种氨基酸组成。Glu的相对分子质量为147,谷氨酸残基相对分子质量为129,要形成分子量为129倍数的分子结构,有两种可能性:①N端是分子内封闭（焦谷氨酸）的肽链;②环谷氨酸。考虑到谷氨酸的特殊性,其可以γ-羧基形成肽键,因此可能的分子结构有4种类型,即环α、环γ、焦谷α、焦谷γ。为了进一步明确其分子结构类型,我们以6个谷氨酸残基组成的6元肽为代表,化学合成了其所有可能的四种结构类型。最终比对确定,该系列小分子是一组环γ-聚谷氨酸（cyclo-y-polyglutamic acid,cyclo-γ-PGA）,分别由4-11个谷氨酸残基组成。我们进一步验证了 cyclo-y-PGA确实具有增加毒素蛋白亲水性和稳定性的作用,且对离体细胞和整体动物均无毒性作用。可见cyclo-γ-PGA具备了优质生物材料的特点,因此本课题第三部分即利用cyclo-y-PGA作为涂层材料包裹纳米胶束,并深入分析cyclo-γ-PGA作为纳米胶束涂层的潜在优势。第三部分常用化疗药物水溶性低、稳定性差、体内循环时间短、缺乏肿瘤靶向性,影响治疗效果,甚至引起严重毒副作用。而纳米载体可以增强药物的肿瘤靶向性,提升药物稳定性并延缓药物释放。本课题第二部分,从水母刺丝囊分离鉴定了一组全新的小分子cyclo-γ-PGA,与链状γ-聚谷氨酸一样存在大量游离羧基,但又具有环肽结构,性能更加稳定。因此,本部分首先以光敏剂原卟啉（Protoporphyrin Ⅸ,PpⅨ）和含二硫键的硫辛酸（alpha lipoic acid,LA）为疏水基团,亲水肽（NLS）为亲水基团,设计制备了双重响应性纳米胶束NLS-LA-PpⅨ。其次,利用从水母刺丝囊分离鉴定到的全新环状小分子cyclo-γ-PGA包裹前期设计合成的载阿霉素（doxorubicin,DOX）纳米胶束,制备cyclo-γ-PGA涂层的载阿霉素纳米胶束NLS-LA-PpⅨ-DOX@cyclo-γ-PGA,评价cyclo-γ-PGA作为生物涂层在提升纳米胶束稳定性以及利用γ-谷氨酰转肽酶（γ-glutamyl transpeptidase,GGT）介导的内吞途径增加细胞对胶束的摄取等方面的优势,明确该纳米胶束的还原/光刺激双重响应性能,并检测其体内外抗肿瘤效应。主要结果如下:1.采用溶剂共挥发法制备纳米胶束,马尔文粒径仪检测显示cyclo-y-PGA涂层后的纳米胶束的粒径稍增大,聚合物分散性指数（polymer dispersity index,PDI）降低,同时电位发生翻转;透射电镜显示加入cyclo-y-PGA后纳米胶束周围出现一圈淡色涂层,胶束呈球形,粒径较均一,以上结果表明cyclo-γ-PGA可以成功包裹于纳米胶束周围。2.cyclo-γ-PGA涂层胶束在高离子浓度以及含血清的培养基条件下,24 h累积释放率较未涂层纳米胶束低,说明cyclo-γ-PGA涂层可以增加纳米胶束在不同介质中的稳定性;类似地,溶血实验显示cyclo-γ-PGA涂层可以减少纳米载体与红细胞相互作用,降低溶血率,加强纳米胶束在血液中的稳定性。3.细胞摄取试验结果表明,cyclo-γ-PGA涂层能够增加细胞对纳米胶束的摄取;进一步利用GGT酶抑制剂GGsTop后证明,cyclo-γ-PGA涂层是通过GGT酶介导的细胞内吞途径来增加细胞对纳米胶束的内化。4.纳米胶束的还原/光刺激双重响应性能研究显示,当纳米胶束处于pH 5.0/10 mM GSH条件（模拟肿瘤细胞内环境）,72 h的累积释放率显着升高,证明纳米胶束具备良好的还原响应特性。光敏效应研究显示,当施加短时光照时,内涵体膜会发生光化学破裂,引发光化学内在化（photochemical internalization,PCI）效应,从而增强纳米胶束的逃逸,促使药物在细胞质内传递。活性氧（reactive oxygen species,ROS）检测结果显示,cyclo-γ-PGA涂层纳米胶束处理后的细胞内ROS含量较游离PpIX以及其他纳米胶束组更高,一方面证明cyclo-γ-PGA涂层增加了细胞对纳米胶束的摄取,另一方面也表明更多的光敏剂进入细胞产生更多单线态氧（singletoxygen,1O2）,为下一步研究纳米胶束光动力治疗奠定了基础。5.体外抗肿瘤研究表明,cyclo-γ-PGA涂层纳米胶束较之非涂层纳米胶束展现出更强的肿瘤细胞杀伤作用。活体成像分析显示cyclo-γ-PGA涂层纳米胶束组展现出良好的肿瘤靶向能力,可以有效减少DOX在其他器官的蓄积,从而降低DOX的毒副作用。体内抗肿瘤试验显示,NLS-LA-PpIX-DOX@cyclo-γ-PGA协同光动力治疗能显着提高DOX的在体肿瘤抑制效果,在显着提高疗效的同时,NLS-LA-PpIX-D6.OX@cyclo-γ-PGA极大地降低了 DOX毒副作用,表现出良好的安全性。总之,本部分研究基于水母刺丝囊来源的新型聚阴离子环状小分子cyclo-γ-PGA,构建了一个在血循环中稳定性良好,具有还原/光刺激双重响应性以及GGT受体靶向功能,化疗与光动力治疗协同作用的聚合物纳米给药体系,为抗肿瘤化疗药物输送体系研究提供新思路。

张丽萌^[3]（2020）在《FHL2对绵羊卵巢颗粒细胞功能的影响及机制研究》文中指出FHL2（four and a half LIM domains protein 2）属于 LIM-Only 蛋白家族中的一员,其作为转录调节子参与基因表达、细胞增殖分化、细胞迁移和凋亡等诸多生理过程,当前研究多集中于人和小鼠。本课题组对连续产多羔和产单羔的绵羊卵巢组织转录组数据分析发现,FHL2在两组中的表达差异显着,推测FHL2对绵羊卵泡发育具有重要调控作用。为证实此推测,本文开展了绵羊不同组织中FHL2基因表达、绵羊卵巢中FHL2基因克隆及生物信息学分析、FHL2基因在绵羊卵巢及颗粒细胞中的表达及定位研究;通过构建FHL2过表达和siRNA干扰两种颗粒细胞模型,研究FHL2对绵羊颗粒细胞生长、类固醇激素分泌及相关基因表达的影响;通过构建绵羊卵巢组织的酵母双杂交CDNA文库,筛选与FHL2互作的宿主蛋白,并进行初步验证。旨在揭示FHL2调控绵羊卵泡发育的分子机制。本研究采用Real-time PCR（RT-PCR）方法检测FHL2基因在绵羊不同组织部位的表达水平;利用分子克隆技术获得绵羊FHL2基因的编码序列,生物信息学分析比较不同物种间序列同源性和进化关系;利用免疫组化技术检测FHL2蛋白在绵羊卵巢组织中的表达分布;采用细胞免疫荧光检测FHL2蛋白在卵巢颗粒细胞中的定位。结果表明:绵羊卵巢中FHL2表达水平高于其它组织,克隆得到的绵羊卵巢FHL2基因CDS为 837bp,编码 279 aa,与GenBank预测序列一致,未发生氨基酸突变,绵羊氨基酸序列与人、牛、猪、马、鸡、狗、猴同源性分别为86%、98.3%、91.7%、89.3%、76.5%、88.2%、86.2%;FHL2主要分布在绵羊卵巢的卵泡（有腔卵泡和无腔卵泡）中,亚细胞定位于卵泡颗粒细胞的细胞质和细胞核中。利用分子克隆技术构建真核过表达载体pcDNA3.1-FHL2,设计合成siRNA 靶向siRNA的干扰序列,转染颗粒细胞后摸索干扰效率,在体外分离培养的绵羊卵巢颗粒细胞中建立超表达和干扰两种卵巢颗粒细胞模型。结果表明:（1）成功构建真核表达载体pcDNA3.1-FHL2,转染至绵羊颗粒细胞后24 h显着提高FHL2的表达;（2）成功合成3条FHL2基因的siRNA,通过RT-PCR和Western Blot检测摸索最佳转染时间和干扰效果,显示siFHL2-2在转染后72 h能够显着降低FHL2的表达。利用AlamarBlueTM HS检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡、细胞周期,ELISA方法检测颗粒细胞雌激素和孕酮分泌变化,RT-PCR检测细胞凋亡（Bcl-2,Bax,p53和Caspase3）、细胞周期（CyclinD1,CyclinB1和p21）以及激素分泌（StAR,3β-HSD,CYP11,CYP19）相关基因的mRNA表达水平。结果表明:通过FHL2过表达模型证实:细胞转染后24 h,与对照组相比,FHL2过表达抑制绵羊卵巢颗粒细胞生长（P<0.01）;正常细胞比例显着降低（P<0.05）,细胞晚期凋亡率升高（P<0.05）,检测细胞凋亡相关基因表达水平,Bcl-2表达水平显着下调（P<0.05）,Bax和Caspase3表达水平上调（P<0.05）,Bcl-2/Bax的比值下调（P<0.01）,促进细胞凋亡;细胞周期G0/G1期和S期细胞的比例降低（P<0.001）,细胞周期因子Cyclin B1表达水平显着下调（P<0.05）;检测生殖激素分泌量及相关基因表达水平,E2和P的分泌量显着降低（P<0.05）,CYP19Al、3β-HSD基因表达水平下调（P<0.05）。通过siRNA干扰模型证实:细胞转染后72 h,与对照组相比,干扰FHL2的表达能够促进绵羊卵巢颗粒细胞生长（P<0.01）,检测细胞凋亡和凋亡相关基因的表达水平,正常细胞比例升高（P<0.05）,细胞晚期凋亡率降低（P<0.05）,Caspase3表达水平下调（P<0.05）,Bcl-2/Bax的比值上调（P<0.05）,抑制细胞凋亡;细胞周期S期和G2/M期细胞的比例升高（P<0.05）,细胞周期因子Cyclin D1和p21表达上调（P<0.05）;检测生殖激素分泌量及相关基因表达水平,E2分泌量升高（P<0.05）,CYP19A1、CYP11A1和StAR基因表达上调（P<0.05）。通过酵母双杂交技术构建绵羊卵巢组织细胞的酵母双杂交文库,构建酵母诱饵质粒pGBKT7-FHL2,利用酵母双杂交文库筛选与FHL2蛋白互作的宿主蛋白。结果表明:成功构建了含有3×108个重组子的绵羊卵巢组织cDNA的酵母双杂交文库,文库滴度为2×107 cfu/mL,以及诱饵载体pGBKT-FHL2,检测诱饵载体无毒性及自激活活性。利用pGBKT7-FHL2诱饵质粒,在酵母文库中筛选出与FHL2互作的蛋白共 1 1 个（RPL31、RPS20、RPS12、COMMD1、AP-1、PLCD1、FOXO1、β-catenin、CREB、NF-κB、CYLD）,Blast比对分析发现这些蛋白主要参与蛋白质合成、基因转录、细胞增殖分化、细胞凋亡及信号通路调控等过程。通过添加外源生长因子TGF-β1,研究在卵巢颗粒细胞中对FHL2的表达水平变化。利用TGF-β1蛋白及几个重要信号通路的抑制剂PI3K（Deguelin）、MEK（Combimetinib）、NF-κB（BAY11-7082）、JNK（SP600125）、MAPK（SB202190）处理体外培养的绵羊颗粒细胞,开展FHL2作用信号通路的试验验证。结果表明:外源添加TGF-β1蛋白使FHL2表达水平上调（P<0.05）,在此基础上,分别添加上述的信号通路抑制剂,结果显示添加PI3K和MARK信号通路抑制剂,导致FHL2表达水平下调（P<0.05）,证实PI3K和MAPK是TGF-β1调控FHL2表达的信号通路。综上所述,绵羊FHL2基因CDS序列全长837 bp,编码279个氨基酸,在卵巢组织中高表达,定位于卵泡颗粒细胞;FHL2影响颗粒细胞的增殖、凋亡、周期和类固醇激素（E2和P）分泌及相关基因表达;筛选获得与其互作蛋白有RPL31、RPS20、RPS12、COMMD1、AP-1、PLCD1、FOXO1、β-catenin、CREB、NF-κB、CYLD共计11个,在绵羊卵泡发育中可能通过互作参与细胞的增殖、凋亡等信号通路过程;PI3K和MAPK是TGF-β1调控FHL2表达的细胞信号通路。

李真真^[4]（2018）在《大白菜富含甘氨酸蛋白BrGRPl的功能初探》文中提出GRPs（Glycine-rich proteins,富含甘氨酸蛋白）,一类结构简单,且富含甘氨酸的高度重复序列组成的一个大家族蛋白,其在植物生长发育、生物防御、非生物胁迫响应等过程中起着重要作用。课题组前期发现一个在pol型细胞质雄性不育和可育植株花蕾中存在表达差异的基因BrGRP1,且在不育花蕾中表达量较高。本试验主要通过cDNA文库构建和筛选、BrGRP1过表达载体构建及遗传转化、转基因植株抗逆性鉴定等研究,初步揭示该基因的生物学功能。主要研究结果如下:（1）以大白菜不育系16C14花蕾为试验材料,采用SMART（switching mechanism at 5’ end of RNA transcript）技术合成 cDNA,利用 DSN（duplex-specific nuclease）对所得cDNA进行均一化处理,之后与pDONRTM/Zeo载体重组并转化DH10B大肠杆菌菌株,构建了大白菜pol型雄性不育花蕾均一化cDNA文库。经检测,文库滴度为3.2×106 cfu/mL,库容量约为1.28×10 cfu,重组率97%,插入片段平均大小1.2kb左右。随机挑选100个阳性菌斑进行测序,冗余度仅为3.7%。（2）以文库质粒为模板,利用特异引物GRP-F/R成功克隆到BrGRP1基因cDNA序列。序列分析表明BrGRP1基因完整的ORF（Open Reading Frame,开放阅读框）为804 bp,编码267个氨基酸,分子量为29.7 kDa,等电点为7.3;其编码的BrGRP1蛋白为非跨膜蛋白,也不是分泌蛋白。与白菜基因组预测基因Bra004066序列相似性为93%,拟南芥At1G6787 基因的相似性为65%。（3）利用无缝克隆技术成功构建过表达载体Cam35S-BrGRP1,进一步进行拟南芥遗传转化。通过抗生素抗性筛选和PCR鉴定共获得7个拟南芥转基因纯系,从中随机选取了三个转基因T3代纯系（GRP1,GRP4和GRP5）进行后续试验。与野生型相比,转基因拟南芥在表型上没有发生变化;qRT-PCR分析表明BrGRP1在转基因拟南芥中高效表达。逆境响应研究表明:0.3μmmol/LABA、100 mmol/LNaCl处理可抑制转基因拟南芥种子萌发和幼苗生长。以上结果表明该BrGRP1基因可能参与ABA信号转导过程及NaCl胁迫响应过程。

高修歌^[5]（2018）在《马度米星铵致鸡原代心肌细胞毒性及毒性机制的研究》文中进行了进一步梳理马度米星铵（maduramicin）是聚醚类抗生素的一种,因其具有抗球虫谱广、效价高、用量少、价格低廉、促进增重且球虫不易产生耐药性等诸多优点,广泛用于防治肉鸡球虫病。但其安全范围极窄,推荐剂量与中毒剂量非常接近,常导致靶动物肉鸡及非靶动物猪、牛、羊、兔和人的中毒,心肌和骨骼肌是其毒性损伤的靶器官,现有研究多见于中毒案例报道和临床病理组织学观察,其引起心肌和骨骼肌毒性损伤的机制尚不清楚,探究马度米星铵如何引起鸡心肌的损伤将为防控马度米星铵导致的肉鸡心脏毒性提供理论支撑,为促进该类药物的合理使用提供参考依据。为此,本文以鸡原代心肌细胞为体外研究模型,首先采用转录组学分析马度米星铵引起的差异表达基因,进一步利用生物信息学分析预测其毒性机制,细胞炎症反应、细胞凋亡、离子紊乱及胞浆空泡化可能是其主要机制,然后对预测机制进行了试验确证,进而阐明了马度米星铵通过巨泡式死亡和细胞凋亡引起鸡原代心肌细胞的严重损伤。主要研究内容如下:1.马度米星铵致鸡原代心肌细胞毒性的转录组学分析为系统揭示马度米星铵引起的鸡心肌毒性机制,本章以鸡原代心肌细胞为体外模型,采用RNA-seq在转录水平解析马度米星铵对鸡心肌细胞转录谱的影响,结合生物信息学分析预测其毒性机制。分别以0、0.05、0.1、0.5、1和5 μg/mL马度米星铵处理鸡心肌细胞24、48和72 h,CCK-8法测定细胞毒性,筛选最佳曝露方案用于RNA-seq分析;0和5μg/mL马度米星铵处理鸡心肌细胞24 h,提取总RNA,在Illumina Hiseq 4000平台进行测序,对原始数据进行过滤得到有效数据,与参考基因组进行比对,并采用FPKM法计算基因表达量;筛选差异表达基因并采用RT-qPCR进行验证,利用GO数据库对差异表达基因进行富集分析,采用KEGG数据库对差异基因进行功能注释。结果显示RNA-seq产生足够的高质量有效数据,与空白对照组比较,5 μg/mL马度米星铵处理鸡心肌细胞24 h共产生1442个显着差异基因,其中810条基因上调表达,632条基因下调表达;RT-qPCR证明RNA-seq所得差异表达基因准确可靠;GO富集结果显示差异基因主要富集到细胞质、能量代谢及胞浆内物质转运等多条生物功能条目;KEGG注释结果表明差异表达基因主要与细胞因子-细胞因子受体相互作用、细胞凋亡、钙离子信号通路及胞浆内空泡形成有关。结果提示,马度米星铵引起的鸡心肌细胞毒性作用可能主要涉及炎症反应、细胞凋亡、胞浆内离子紊乱等多条代谢途径的调控。2.转录组学分析结果的验证为进一步确定马度米星铵致鸡原代心肌细胞毒性的作用机制,本章重点验证RNA-seq和生物信息学分析结果的准确性,开展了一系列验证性试验阐释马度米星铵引起鸡心肌细胞死亡的发生机制。分离培养鸡原代心肌细胞,0～5μg/mL马度米星铵处理细胞12～24 h后,采用ELISA、流式细胞术、Western blot、比色法、透射电子显微镜等方法分析相关炎症因子释放、细胞凋亡、凋亡蛋白表达、胞浆Ca2+水平、Na+-K+/Ca2+-ATP酶活性和胞浆空泡化。结果显示:马度米星铵可以显着提高鸡心肌细胞促炎因子TNF-α和IL-8的释放（P<0.05）,马度米星铵呈浓度依赖性的增加细胞凋亡率（P<0.05）,并显着提高caspase-3的活性（P<0.05）。胞浆内Ca2+水平及心肌细胞Ca2+-ATP酶活性显着增加（P<0.01）,胞浆内过量的Ca2+来源于内质网钙库及胞外介质。马度米星铵导致鸡心肌细胞内空泡增加,空泡呈透明、单层膜、大小不一、基本不含胞浆内容物等特征。以上结果说明:炎症反应、细胞凋亡、胞内离子紊乱及胞浆空泡化共同介导马度米星铵引起的鸡心肌细胞毒性损伤。3.马度米星铵诱导鸡原代心肌细胞凋亡的机制为探究细胞凋亡在马度米星铵诱导鸡原代心肌细胞毒性中的作用,阐述细胞凋亡发生的机制。本章以原代培养的鸡心肌细胞为体外模型,20 μM的z-VAD-fmk和500 mM的NAC预处理细胞1 h后,不同浓度的马度米星铵（0、0.05、0.5和5μg/mL）处理细胞24～72 h,显微镜观察细胞形态改变;MTT法分析细胞活性;DAPI染色观察细胞核形态;Annexin V-FITC/PI染色后采用流式细胞仪检测凋亡率;RT-qPCR分析凋亡基因变化;比色法检测凋亡蛋白活性;JC-1染色后经流式细胞仪和荧光显微镜分析线粒体膜电位变化;DCFH-DA染色后荧光显微镜观察ROS改变;比色法测定胞内GSH的含量。结果显示:不同浓度的马度米星铵处理鸡心肌细胞24 h,细胞损伤严重且细胞活性下降显着（P<0.05）。马度米星铵诱导细胞凋亡率升高,同时caspase-3/8/9基因和蛋白表达水平显着上调（P<0.05）。细胞内线粒体膜电位显着降低（P<0.05）。细胞内ROS水平显着升高,GSH水平显着下降（P<0.05）。z-VAD-fmk预处理可在一定程度削弱马度米星铵诱导的细胞凋亡及鸡心肌细胞毒性。NAC预处理未能减弱马度米星铵引起的细胞凋亡但可降低细胞毒性。综上所述,caspase依赖和非依赖的细胞凋亡途径参与了马度米星铵诱导的鸡心肌细胞死亡,氧化应激加剧了马度米星铵引起的鸡心肌细胞毒性,抑制细胞凋亡和ROS产生一定程度上可削弱马度米星铵诱导的心肌细胞毒性。4.马度米星铵诱导鸡原代心肌细胞发生巨泡式死亡的机制非caspase依赖的细胞死亡方式存在于马度米星铵诱导的鸡心肌细胞毒性作用中,本章进一步解析马度米星铵诱导非凋亡性细胞死亡的形态学特征和分子机制,以期阐明马度米星铵致心肌细胞损伤的机制。以鸡原代心肌细胞为体外研究模型,0、0.05、0.5和5 μg/mL的马度米星铵处理鸡心肌细胞12～72 h,光学显微镜观察胞浆内空泡形态学特征,透射电子显微镜观察空泡的超微结构;以5 μg/mL的马度米星铵处理鸡心肌细胞12 h,采用激光共聚焦显微镜连续观察心肌细胞内空泡形成的规律;以Dextran 488-FITC、ER Tracker、Mito Tracker、Lyso Tracker等荧光探针染色马度米星铵处理12 h的鸡心肌细胞,激光共聚焦显微镜分析胞浆内空泡与胞浆内细胞器的定位关系。以z-VAD-fmk、3-MA、CQ及Bafilomycin A1预孵育鸡心肌细胞1 h,经不同浓度马度米星按处理12～24 h后,光学显微镜或透射电子显微镜观察空泡变化,CCK-8法测定细胞活性变化,琼脂凝胶电泳法观察DNA ladder是否形成,Western blot分析LC3-Ⅰ/Ⅱ、p62、H-Ras、K-Ras、Rac 1等蛋白的表达变化。结果显示,马度米星铵引起鸡心肌细胞出现浓度和时间依赖性的细胞质空泡化现象,胞浆内大量的空泡特征不同于细胞凋亡、自噬等的典型形态学特征,这种空泡来源于细胞巨胞饮,而不是线粒体、内质网或溶酶体的肿胀。z-VAD-fmk和3-MA/CQ不能抑制马度米星铵引起的鸡心肌细胞空泡化,亦不能保护心肌细胞活性（P>0.05）。而Bafilomycin A1可以显着抑制胞浆内空泡的产生且可以显着保护细胞活性（P<0.01）。马度米星铵可以影响LC3-Ⅰ/Ⅱ和p62蛋白的表达,但抑制表达后并不能改善马度米星按引起的细胞损伤。马度米星铵处理鸡心肌细胞后,K-Ras和Rac 1蛋白表达量均显着变化。上述结果表明,马度米星铵可引起不同于凋亡及细胞自噬的巨泡式细胞死亡,这种细胞死亡依赖空泡型H+-ATP酶的活化及Ras-Racl信号通路的参与。综上所述,本文发现马度米星铵可导致鸡原代心肌细胞的毒性损伤,引起鸡原代心肌细胞转录谱的显着改变;差异表达基因主要集中于细胞炎症反应、细胞凋亡、离子紊乱及胞浆空泡化;caspase依赖和非依赖的细胞凋亡途径介导了马度米星铵引起的鸡心肌细胞毒性,巨泡式细胞死亡-methuosis主导了马度米星铵的心肌细胞毒性作用。本研究完善了马度米星铵致鸡心肌损伤的机制,为兽医临床防控马度米星铵心脏毒性提供一定参考依据,具有重要理论和现实意义。

胡玲玲^[6]（2017）在《银环蛇L-氨基酸氧化酶的分离纯化与鉴定》文中指出以蛇入药治疗多种疾病在我国已有相当悠久的历史。银环蛇（Bungarus multicinctus）俗称金钱白花蛇,隶属于脊索动物门、爬行纲、有鳞目、眼镜蛇科、环蛇属。中医学认为金钱白花蛇味甘、咸,性温、有毒,具有祛风、通络、定惊、止痒、止痉的功能。蛇毒是毒蛇的毒腺分泌的毒液,作为一类天然的动物毒素蛋白,其含有多种酶类蛋白、非酶蛋白和其他小分子物质,并具有广泛的生物学活性和药理作用,最明显的特征就是具有极强的毒性。银环蛇蛇毒含有多种活性成分,是复杂的混合物,主要以神经毒素为主。中医历来有“以毒攻毒”的治疗法则,研究表明蛇毒中含有纤溶、促凝、镇痛、抗癌等方面的药理功能成分,具有降压、镇痛、消炎和抗肿瘤作用。目前为止,蛇毒液中的某些活性成分经过修饰和改造已被制成成品药,用于临床上疾病的治疗。近年来,随着高通量测序技术和生物信息学分析技术的发展以及日益成熟,越来越多的科研人员将研究重点转移到动物药中多肽物质的研究与开发上来,动物药成为寻找与开发天然活性药物的源泉。因此,探究银环蛇蛇毒的成分以及其发挥药理作用的活性物质具有极其重要的理论和现实意义。本研究利用Illumia HiseqTM2500技术构建且分析银环蛇的转录组文库。使用Trinity拼接软件对所得到的序列进行De novo拼接,最终共获得63,947条高质量的 Unigene（>200bp）,总长度为 64,485,567 bp,其中最长 Unigene 为 23,902 bp,最短为200 bp,平均长度为1008 bp,N50为1806 bp。通过Blastx搜索五大数据库进行基因功能注释,共有21,900条（34.25%）Unigene在NR数据库中存在着相似序列。在NR库注释中筛选出与毒素有关的Unigene,显示银环蛇蛇毒富含神经毒素。同时,分别有17,987条（28.13%）、13,963条（21.84%）、6981条（10.92%）、15,964 条（24.96%）Unigene 在 SWISSPROT、KOG、KEGG和GO数据库中注释成功。结果表明,构建的银环蛇转录组文库质量较高,筛选获得的毒素相关Unigene为银环蛇功能基因的分子克隆、蛇的药用价值研究奠定了基础。采用三步层析纯化法,即凝胶过滤层析、凝胶过滤层析和阴离子交换层析,从银环蛇粗毒中分离纯化得到一种新的L-氨基酸氧化酶,并命名为Bm-LAAO,每500 mg银环蛇蛇毒中纯化得到4.40 mg的LAAO,约占蛇毒总蛋白质含量的0.88%。纯化得到的Bm-LAAO的总活力为297.81 U,酶的比活力为67.70 U/mg,通过RP-HPLC技术和SDS-PAGE均证实其为均一蛋白。通过肽质量指纹图谱分析发现,本研究分离得到的银环蛇LAAO的蛋白序列与NCBI数据库中银环蛇LAAO的cDNA序列高度相符合。Bm-LAAO是一种糖基化的黄素蛋白酶,在还原条件下,其表观分子质量约为62.5 KDa。大部分的蛇毒LAAO在37℃左右活性最高,然而,Bm-LAAO的反应最适温度为45℃,最适pH分别为8.4。酶动力学研究表明,此酶对疏水性L-氨基酸具有较高的催化活性,且不能催化D-氨基酸的氧化脱氨反应,最好的底物基质是L-Met、L-Leu、L-Phe。研究发现去糖基化的Bm-LAAO的酶活力下降了 54.3%,说明糖基化对银环蛇的酶活性有较大的影响。储存温度同样对Bm-LAAO也很重要,相对而言,-80℃是最佳的储存温度。利用PCR技术,本研究从提取的银环蛇毒腺总RNA中克隆出了Bm-LAAO的cDNA序列,该序列编码一条由496个氨基酸残基组成的成熟肽。并采用蛋白质的同源建模技术,以哈里氏蝮蛇毒LAAO的晶体结构作为模板,预测Bm-LAAO的三维结构。本研究利用抑制肿瘤细胞增殖作用的体外实验对Bm-LAAO的抗肿瘤活性进行测定,采用MTT法测定其对肿瘤细胞和人正常细胞增殖能力的影响,采用显微镜及流式细胞仪观察和检测Bm-LAAO对肿瘤细胞的细胞凋亡作用的影响。在所检测的11种肿瘤细胞株中,Bm-LAAO对人胃癌细胞MGC-803具有最强的增殖抑制活性,其IC50为314 ng/ml;对三种人乳腺癌细胞BT474、MDA-MB-231、MCF-7的IC50分别为378、1213、1480 ng/ml,而对正常人乳腺细胞MCF-10A的IC50为13,556 ng/ml,分别是上述三种人乳腺癌细胞的35.86倍、11.18倍和9.16倍。研究表明,相对于正常细胞,Bm-LAAO对肿瘤细胞具有较强的选择性和细胞毒性。当过氧化氢酶及Bm-LAAO共同作用肿瘤细胞时,细胞活性恢复了 75%,表明在很大程度上,Bm-LAAO对细胞的增殖抑制活性可能是LAAO催化过程中产生的H2O2所致。流式细胞仪分析结果显示Bm-LAAO可以诱导MGC-803和MCF-7细胞凋亡,且呈现剂量依赖性的方式,而过氧化氢酶Catalase可以很大程度上减弱Bm-LAAO诱导的细胞凋亡作用,提示Bm-LAAO诱导的细胞凋亡作用也可能与H2O2的产生有关。综上所述,本研究构建并分析了银环蛇的转录组文库,且克隆得到了Bm-LAAO的基因序列;从银环蛇粗毒中分离纯化得到了 LAAO,并对其体外抗肿瘤作用和诱导细胞凋亡作用的机制进行了初步的研究,这为进一步深入地探讨其作用机制和可能的实际应用奠定了基础。

张磊^[7]（2015）在《黑肥尾蝎（Androctonus bicolor）毒腺转录组与蛋白组学研究及蝎钾通道毒素分子进化分析》文中研究表明黑肥尾蝎（Androctonus bicolor）主要分布在北非地区,是一种具有重要医学价值的蝎种。研究发现,被黑肥尾蝎（A. bicolor）蜇伤会引起疼痛、局部充血、呕吐、肿胀、躁动和低血压等症状,导致小孩心肌和中枢神经系统功能障碍。小鼠皮下注射实验结果表明,该蝎毒液对小鼠半致死剂量为1.21 mg/kg。表明该种蝎子毒素成分独特,具有重要的研究价值。而目前仅从该蝎基因文库克隆到2个α钠通道毒素。为了更好的了解该蝎毒素多肽多样性,我们结合转录组学和蛋白组学对该蝎毒素多肽进行了系统分析。通过构建高质量的黑肥尾蝎（A. bicolor）毒腺cDNA文库,我们获得了730个毒素多肽序列,对这些新毒素多肽进行序列分析得到103个新多肽,3个多肽与其它蝎种分离到的多肽完全一样。根据这些多肽的序列同源性,这些多肽可分为23个不同的家族：钠通道毒素（NaTx）、短链钾通道毒素（ScKTx）、长链钾通道毒素（LcKTx）、钙通道毒素（CaTx）、 Kunitz类型毒素、抗菌肽、防御肽、缓激肽增效肽（BPP）、阴离子肽（BmKa2类似肽）、6种不含二硫键的新型多肽,以及8种分别含1对、2对、3对、5对和6对二硫键的新型多肽。其中钠通道毒素丰度最高,总共获得了24个新的钠通道毒素,占毒素多肽的33.50%,这些新多肽和已知的钠通道毒素同源性在90%-66%之间。除AbNaTx1, AbNaTx2, AbNaTx3, AbNaTx4和AbNaTx18这5个多肽属于α-钠通道毒素外,剩余19个钠通道毒素均属于β钠通道毒素。这些钠通道毒素中,绝大部分含有4对二硫键,三个多肽含有3对二硫键,分别为AbNaTx20, AbNaTx22和AbNaTx24。a钾通道毒素占整体毒素的24.60%,共鉴定了15个新α钾通道毒素,分属于α-KTx3,α-KTx8, α-KTx14, α-KTx16, α-KTx31和α-KTx32六个亚家族,所有鉴定到的这些新α钾通道毒素均含3对二硫键。p钾通道毒素占毒素比例的7.96%,共发现了10个不同的β钾通道毒素,其中AbKTx-6, AbKTx-9, AbKTx-10和AbKTx-11属于β-KTx Ⅰ家族；AbKTx-2, AbKTx-3, AbKTx-5, AbKTx-7和AbKTx-8属于β-KTx Ⅱ家族；AbKTx-1由86个氨基酸残基组成,含3对二硫键,属于β-KTx I家族。鉴定到1个钙通道毒素AbCaTx1,占毒素的0.32%。鉴定到两个阳离子抗菌肽,命名为Androcin18-3和Androcin18-1,分别含有18和24个氨基酸残基。防御肽占蝎毒多肽的3.50%,共发现了4个新防御肽,分别为AbDef-1, AbDef-3, AbDef-4和AbDef-5,其中AbDef-3和AbDef-4成熟肽长度均为56个氨基酸残基,二者存在8个氨基酸差异,序列同源性为86%。有趣的是AbDef-3和AbDef-4在二硫键数目上有所不同,AbDef-3只有3对二硫键,然而AbDef-4却有4对二硫键。AbDef-3和AbDef-4与现有数据库多肽同源性极低,是一类新的防御肽。我们还发现了两个新的缓激肽增效肽,分别命名为AbBpp-1和AbBpp-2,属于NDBP3家族,编号分别为NDBP3.20和NDBP3.21。鉴定到两个新的NDBP6家族成员：Aba-1和Aba-2二者之间同源性为69%,二者的酸性氨基酸所占比例分别为36%和37%,属于典型的阴离子多肽。Kunitz类型毒素占转录组中毒素多肽的4.80%,共发现了5个该类型多肽,分为两个类别。AbKci-2, AbKci-3, AbKci-4和AbKci-5含有6个半胱氨酸,形成3对二硫键,二硫键模式为：X3CX24CX20CCX2CX4C; AbKci-1则含有8个半胱氨酸,形成4对二硫键,二硫键模式为：X4CX8CX15CX7CX12CCX2CX4C。共筛选到9个不含二硫键新型多肽,分为6个不同的类型。AbNtl, AbNt2, AbNt3和AbNt4是一类新的蝎不含二硫键多肽,划分为NDBP8家族,分别编号为NDBP8.1, NDBP8.2, NDBP8.3和NDBP8.4,这4个多肽之间具有较高的序列同源性,值得注意的是它们成熟肽是11个氨基酸RFD （A） RAAE （D） AS （G） PG的重复,重复次数分别为9,7,6和6,多肽的C端均为RFDRAS。 AbNt5, AbNt6和AbNt7在氨基酸组成上存在很大差异,分别代表3类富含不同氨基酸残基的不含二硫键多肽,分别编号为NDBP9.1, NDBP10.1和NDBP11.1。 AbNt5富含甘氨酸和酪氨酸,这两种氨基酸分别占氨基酸残基总数的59.2%和14.3%。AbNt6则富含甘氨酸和丙氨酸,’甘氨酸和丙氨酸分别占总氨基酸残基总数的24.6%和29.8%。AbNt7也富含甘氨酸和酪氨酸,酪氨酸残基所占比例高于甘氨酸,两种氨基酸分别占43.2%和21.6%。AbNt8是一个高度亲水的、富含带电荷氨基酸残基的多肽,带负电氨基酸（谷氨酸和天冬氨酸）和带正电氨基酸（赖氨酸,精氨酸和组氨酸）分别占氨基酸残基总数的19.7%和20.9%,编号为NDBP12.1。 AbNt9富含亲水性氨基酸,具有7个由10氨基酸残基YLPTLQKXNR （K）组成的重复。除了发现了不含二硫键新型多肽,我们也筛选到18个新的含不同数目二硫键多肽。发现了7个仅含一对二硫键的新多肽,分为α-TxC2和β-TxC2两种类型。其中α-TxC2包含AbTxC2l, AbTxC22, AbTxC23, AbTxC24和AbTxC25五个多肽,这5个多肽富含碱性氨基酸残基,精氨酸和赖氨酸分别占总氨基酸残基数的39.6%-37.3%不等,具有共同的二硫键模式X2CX34-43CX3-6。 AbTxC210和AbTxC211属于β-TxC2,富含甘氨酸和酪氨酸,甘氨酸和酪氨酸残基占总氨基酸残基的33.4%,具有保守的二硫键模式CX4CX39。AbTxC4l和bTxC42是两个新的富含精氨酸、含有两对二硫键的碱性多肽。AbTxC61和AbTxC62属于一类有3对二硫键的新型多肽,二者之间有一个氨基酸差异。AbTxC63和AbTxC64占毒蝎转录组毒素多肽的0.64%,也含有6个半胱氨酸,形成3对二硫键,但二硫键模式与AbTxC61和AbTxC62不同。AbAsl, AbAs2和AbAs3是一类与Astakines类似的蝎毒素多肽,含有5对二硫键。AbTxC12l和AbTxC122代表两种不同的含6对二硫键的多肽,二者的二硫键模式分别为X2-5CXCX3-9CX5CX8CXCCX2CX7CX8-9CX5CX13-17CX3-4和X11CX4CX5CX6CX4CX5CX6CX4 CX3CX9CX2CXC。这些新多肽的发现丰富了现有毒素多肽资源,表明了黑肥尾蝎（A.bicolor）毒液多肽具有独特的多样性。我们采用LC-MS/MS方法对黑肥尾蝎（A. bicolor）毒液进行了系统分析。多肽匹配数据库分别为：1) UniProt蛋白数据库与蝎有关序列；2)马氏正钳蝎（M. martensii）基因组所预测的32016条蛋白序列；3)墨西哥雕像木蝎（C. exilicauda）基因组预测的30465条蛋白序列和4)黑肥尾蝎（A. bicolor）转录组测序获得的208条多肽和蛋白序列。从四个不同的数据库中共鉴定到155条可与谱图匹配的不同肽段,与上述4个数据库匹配的肽段数目分别为24,56,18和57。对不同数据库匹配肽段比较,删除冗余匹配肽段,共获得141条唯一肽段。这些匹配的肽段中,绝大部分编码保守细胞组分或蛋白。共从毒液鉴定了16个毒素多肽,包含1个钙通道毒素（AbCaTxl）,1个Kunitz类型毒素（AbKci-5）,3个钾通道毒素（AbKTx-2, AbKTx-6和 AbTx4）,10个钠通道毒素（AbNaTx7, AbNaTx17, AbNaTx12, AbNaTx15, AbNaTx18, AbNaTx2, AbNaTx25, AbNaTx3, AbNaTx6和Ab8）和一个含3对二硫键的新多肽AbTxC61。其中鉴定到的钠通道毒素数目最多,序列覆盖率也相对较高（覆盖率范围18.7%-90.7%）,表明了钠通道毒素是黑肥尾蝎（A. bicolor）毒液丰度最高的毒素类型。值得注意得是,AbTxC6l单个毒素占毒液相对丰度34.39%,表明了该多肽具有重要的生物学功能。这些结果表明黑肥尾蝎（A. bicolor）与旧大陆蝎种马氏正钳蝎（M. martensii）的亲缘关系近于与新大陆蝎种墨西哥雕像木蝎（C. exilicauda）的亲缘关系。不同生理状态蝎毒组分存在差异,不同蝎种的细胞蛋白存在一定的保守性,而不同蝎种在毒素组成上却存在较大的特异性。蝎毒素多肽是蝎进行捕食和防御的重要武器,每种蝎中含有大量的具有不同生物活性的蝎毒素多肽。蝎毒素多肽在结构和功能上具有丰富的多样性,而产生这种多样性的具体机制不明。钾离子通道是现今发现的离子通道中最具多样性的离子通道。研究表明,蝎钾通道毒素能特异性靶向结合不同钾通道,因此是研究钾离子通道结构和功能很好的探针。然而,目前从蝎毒液中分离到的钾通道毒素为数不多,并且蝎毒腺中毒素多肽库的形成机制还知之甚少。在第四章研究中,通过筛选,从东亚钳蝎（M. martensii Karsch）毒腺cDNA文库中发现了三个新的α钾离子通道多肽,分别命名为BmKcugl, BmKcug2和BmKcugx。其中,BmKcugl和BmKcug2属于a-KTxl家族,按照蝎α钾通道毒素分类原则将其分别编号为a-KTxl.14和a-KTxl.15。 BmKcugx则和已发现的蝎钾通道毒素各家族多肽的同源性均低于29%,表明其代表一个新的蝎钾通道毒素类别,a-KTx22,并将其编号为a-KTx22.1。通过PCR扩增,我们获得了一个新多肽基因BmKcuglam序列比对发现BmKcugl和BmKcugla存在6个氨基酸残基差异,表明二者基因通过基因复制产生。对BmKcugla, BmKcug2和BmKcugx基因结构分析发现,BmKcugx基因由两个外显子和一个插入在信号肽编码区的内含子组成,而BmKcugla和BmKcug2基因则由3个外显子和两个内含子构成,这两个内含子分别位于5’UTR和信号肽编码区。对BmKcugla和BmKcug2基因进行序列比对发现,二者基因序列存在80.5%的同源性。BmKcugla和BmKcug2位于信号肽区域的内含子具有相同的5’和3’剪切位点,且二者5’UTR内含子5’剪切位点也一样,仅在3’剪切位点存在差异,我们推测BmKcug2转录本的5’UTR内含子1和外显子2连接处发生了可变剪切现象。对BmKcugla, BmKcug2和BmKcugx转录本丰度比较分析,发现BmKcugla和BmKcug2的转录本比BmKcugx转录本高很多,暗示5’UTR的内含子能显着提高钾离子通道毒素的表达水平。通过前章研究,我们发现蝎α钾通道毒素基因存在内含子数目多态性,且发现5’UTR内含子位于编码框上游25-35 bp位置。在前章研究基础上,我们选择5’UTR长的钾通道毒素,并根据其cDNA设计引物进行基因扩增。对获得的13个不同的钾通道毒素基因进行内含子分析,发现大部分钾通道毒素5’UTR区域含有内含子,如BmTxl, BmKcug2, BmTx4, BmTx3B, BmTx2, BmKcugla, BmP08, sKTx2和 BmTxKS3这9个基因含有两个保守的内含子,而BmK38, BmK39, BmKcugx和abTxl则只包含一个保守的内含子。并对这些多肽的二级结构、二硫键连接模式以及内含子剪切位点进行了分析。系统进化分析结果显示,BmK38, BmK39, BmKcugx和abTxl位于进化树的根部位置,表明这4个多肽相对于其它多肽在进化上较为古老,由于蝎毒素基因是通过共同的祖先通过基因复制以及随后的突变进化产生,因此我们推测BmTxl, BmKcug2, BmTx4, BmTx3B, BmTx2, BmKcugla, BmP08, sKTx2和BmTxKS3在进化过程中,它们的5’UTR区域获得了一个内含子。比较这些多肽转录本相对丰度,发现含两个内含子的多肽丰度普遍高于含一个内含子多肽的丰度,表明新获得的5’UTR内含子能显着增强基因的表达水平,增加了蝎在捕猎和防御过程中单次喷射毒液中这些钾通道毒素的含量,因此我们推测这是蝎子适应环境选择压力的一种策略。综上所述,本研究结合转录组和蛋白组方法,对黑肥尾蝎（A. bicolor）毒液多态性进行了系统研究,共获得了103个新的毒素多肽基因,其中16个多肽进行了蛋白水平鉴定。这是首次对Androctonus属蝎进行转录组分析,揭示了黑肥尾蝎（A. bicolor）蝎毒液多肽独特多样性。这些结果丰富了现有蝎毒素多肽资源库,为Androctonus属蝎蛰伤引起的中毒症状提供了科学解释和依据。对蝎短链钾通道毒素基因结构分析发现了蝎短链a钾通道毒素内含子数目存在多肽性,并且发现了蝎短链a钾通道毒素存在可变剪切和内含子获得现象,为研究蝎毒素进化规律提供了材料。

段志贵^[8]（2012）在《大腹园蛛粗毒的理化性质及毒素组学研究》文中研究指明本文采用电刺激方法采集大腹园蛛粗毒并进行了系统的分析。凝胶电泳及质谱数据显示,该蛛毒包含丰富的蛋白质或多肽成分,其分子量分布在4-45kDa的范围里。蜚蠊腹腔注射该粗毒后显示出明显的中毒症状,且半致死剂量为30.73μg/g。电生理实验结果显示,该粗毒不能阻断小鼠膈神经膈肌的神经肌肉传导。粗毒的酶活分析显示,该粗毒具有几种水解酶的活性,包括透明质酸酶和蛋白质酶活性。所有的实验结果显示,大腹园蛛粗毒含有丰富的生物学活性成分,对其主要的猎物-昆虫有着较强的毒性,而对哺乳动物的毒性极低。电刺激方法能够有效的避免唾液及其他组织液的污染,且能够重复利用蜘蛛资源。为了克隆大腹园蛛毒腺中编码毒素多肽和蛋白质的基因,本文采用了表达序列标签（EST）技术,首次构建了该蛛毒腺的定向全长cDNA文库。随机挑取原始文库的单克隆进行测序,共得到了886个EST序列。通过聚类分析分成246个族,其中49个族属于重叠群（每族都含2个及2个以上的EST）,其他197个族是单态（每族仅含1个EST）。随后利用Emboss软件将所有EST翻译成氨基酸序列,根据动物毒素蛋白质的一般特点,设定毒素的筛选条件为：（1）具有4个或4个以上的半胱氨酸；（2）具有信号肽。结果发现,其中68.7%的EST属于的毒素样转录子；20.2%的EST属于细胞转录子；11.1%的EST属于新的转录子。将所有的EST序列去冗余后得到的毒素转录子编码200个开放读码框（ORF）,即200个前体肽。根据前体肽的差异可以分成15个超家族,包含AVTX-Ⅰ至AVTX-ⅩⅩⅩ共30个家族。200个前体肽能被推导出150个非冗余成熟肽,且在现有的数据库中未发现高度相似性序列。不同的超家族含有半胱氨酸的数量差异明显,最小的仅为4个,最多的高达20个。此外,编码几丁质酶的基因也被检测到。所有结果显示,大腹园蛛蛋白质类毒素与所有已知的动物毒素存在较大的差别,是一些全新的毒素蛋白质。这些毒素序列的发现丰富了动物毒素的结构模式数据库。为了更加全面了解大腹园蛛的蛋白质类毒素的组成,本文通过活体电刺激的方法采集了大腹园蛛的粗毒,并采用组合的蛋白质组学策略来分析这种粗毒,包括两种不同的方法：（i）一维聚丙烯酰胺凝胶电泳后用nanoLC-MS/MS分析；（ii）双向电泳后采用nanoLC-MS/MS分析。凝胶图谱显示,该蛛毒所含蛋白质类成分的分子量主要分布在10到45kDa的范围中,其中三个高丰度的区域分别为10到14kDa、18kDa到26kDa和45kDa,且主要为碱性蛋白质。胶内酶解的多肽经串联质谱分析,得到的质谱数据通过跨物种搜寻的方法共鉴定到71种毒素蛋白质。除了典型的蜘蛛血蓝蛋白质外,几种水解酶被发现存在于这种粗毒中。而且这些水解酶可能与蛛毒的毒性有关。此外,大约有一半以上的高质量的MS/MS数据得不到明显的鉴定结果,这极可能是没有特定的蜘蛛毒素蛋白质数据库的缘故。为了更加全面分析蛋白质组学与转录组学数据,本文首次采用了de novo测序与cDNA文库相结合的方法来鉴定蜘蛛毒素的蛋白质类成分。利用Bruker公司的DataAnalysis4.0软件对来自2DE的胶内酶解样品的未匹配到任何已知多肽的高质量的MS/MS数据进行了denovo测序,二级质谱氨基酸残基的误差设定为±0.015。得到了约2000个高质量的de novo测序结果,去冗余后得到约200个。然后人工将这些序列对转录组得到的毒素样序列进行搜索。肽段完全匹配的限制条件设定为：（1）氨基酸序列完全相同且质量误差为±0.5；（2）对应的cDNA文库序列有合理的酶切位点。结果表明,来自cDNA文库测序的30个毒素样家族中的20个家族被明确鉴定,鉴定率达到66.67%。而且首次在蜘蛛毒素中大规模的检测到毒素突变体及谷氨酸残基的甲酯化修饰。该方法给无完整基因组数据库的物种的蛋白质组学鉴定提供了新的途径。

许婷^[9]（2012）在《近江牡蛎抗类立克次体感染天然免疫分子的生物学研究》文中研究指明2007年2月底至5月底广西养殖的近江牡蛎发生了大面积的死亡,波及广西所有牡蛎养殖区,造成巨大的经济损失。本研究针对此次发病进行了广泛的流行病学调查和取样研究,发现类立克次体的大量感染,造成严重的牡蛎组织病理损伤。我们对该病原进行了组织病理学和超微病理学的研究,并成功地完成了病原的分离纯化和鸡胚培养。在此基础上,为了进一步探讨近江牡蛎抗感染免疫防御反应相关机制,为其病害防治提供理论依据,我们构建了类立克次体刺激后近江牡蛎血淋巴细胞cDNA文库,随机挑选400个阳性克隆进行测序分析,共获得200个基因序列,包括96个已知序列和104个未知序列。其中96个已知基因序列根据其参与的生物学过程大致可分为11类。并从中筛选同种异体移植炎症因子（Ca-AIF1）,高迁移率族蛋白（Ca-HMGB）和三个亲环蛋白家族基因（Ca-CyPA, Ca-CyPB和Ca-PPIL3）,三个补体样基因片段（CaClql, CaClq2and CaC3）共8个基因,运用免疫学、分子生物学和细胞生物学等技术手段结合生物信息学知识,进行了结构分析和相关功能探讨,具体如下：1、Ca-AIF1编码139个氨基酸,包含典型的钙结合EF-hand结构域。同源性比较结果显示Ca-AIF1与其他物种AIF1氨基酸序列相似度为47%-73%。通过表达载体构建,我们在大肠杆菌中成功诱导表达及纯化了Ca-AIF1蛋白并制备了多克隆抗体。Real-time RT-PCR检测组织表达结果表明Ca-AIF1在所有被检组织中均有表达,并且在血淋巴细胞,鳃和性腺组织中表达量显着高于其他组织,预示着该基因可能参与机体免疫防御反应和生殖细胞的增殖分化。进一步免疫荧光检测组织细胞定位结果显示Ca-AIF1主要定位于性腺组织的上皮组织细胞中。随后我们使用real-time RT-PCR和流式细胞仪分析和探讨Ca-AIF1及其抗体在近江牡蛎抗感染免疫反应中的作用和机制。结果显示（1）RLO或LPS （RLO/LPS）刺激后,近江牡蛎单层血淋巴细胞中Ca-AIFl mRNA表达量显着上调,预示着Ca-AIF1参与近江牡蛎免疫炎症反应；（2）纯化的Ca-AIF1重组蛋白能够引起LITAF,Myd88,TGF β显着上调,预示着Ca-AIF1蛋白具有促炎细胞因子作用,能够引起近江牡蛎免疫炎症反应及可能的Myd88介导的信号通路;（3）制备的Ca-AIF1多克隆抗血清能够显着降低RLO/LPS刺激引起的LITAF表达量上调比例,表明Ca-AIF1抗血清能够显着抑制RLO或LPS刺激引起的免疫炎症反应；（4） Ca-AIF1多克隆抗血清能够有效降低RLO/LPS刺激引起的近江牡蛎血淋巴细胞坏死和晚期凋亡比率,提高细胞存活率,进一步表明近江牡蛎AIF1抗体能够有效保护机体抵御革兰氏阴性菌和RLO的感染。2、Ca-HMGB编码203个氨基酸。包含两个典型HMG-box和一个酸性C末端。同源性比较结果显示Ca-HMGB与其他物种HMGB氨基酸序列相似度为34%-55%。Real-time RT-PCR检测组织表达结果表明Ca-HMGB在所有被检组织中均有表达,并且在血淋巴细胞中的表达量显着高于其他组织,预示着该基因可能参与机体免疫防御反应。通过表达载体构建,我们在大肠杆菌成功诱导表达及纯化了Ca-HMGB蛋白并制备了多克隆抗体。运用细胞免疫荧光技术检测RLO刺激前后Ca-HMGB亚细胞定位结果表明,Ca-HMGB在健康近江牡蛎血淋巴细胞的细胞核与细胞质中均有表达,而当RLO刺激12h后Ca-HMGB主要在细胞质中表达。随后我们运用real-time RT-PCR, western blot和流式细胞仪分析和探讨Ca-HMGB及其抗体在近江牡蛎抗感染免疫反应中的作用和机制,结果显示（1）RLO/LPS刺激后,近江牡蛎单层血淋巴细胞中Ca-HMGB mRNA表达量显着上调；（2）RLO刺激后,Ca-HMGB蛋白能被释放到细胞外,参与免疫炎症反应；（3）纯化的Ca-HMGB重组蛋白能够引起除AIF1外,被检测的细胞因子LITAF, Myd88, TGF βmRNA表达显着上调,预示着Ca-HMGB蛋白具有促炎细胞因子作用,能够引起近江牡蛎免疫炎症反应及可能的Myd88介导的信号通路；（4）Ca-HMGB多克隆抗血清能够显着降低RLO/LPS刺激引起的LITAF表达量上调比例,表明Ca-HMGB抗血清能够显着抑制RLO或LPS刺激引起的免疫炎症反应;（5）Ca-HMGB多克隆抗血清能够有效降低RLO/LPS刺激引起的近江牡蛎血淋巴细胞坏死和晚期凋亡比率,提高细胞存活率,进一步表明近江牡蛎HMGB抗体能够有效保护机体抵御革兰氏阴性菌和RLO的感染。3、亲环蛋白基因Ca-CyPA编码165个氨基酸,Ca-CyPB编码217个氨基酸,而Ca-PPIL3编码162个氨基酸。其预测氨基酸序列均包含典型的CyP-PPIase结构域及其特征序列,而Ca-CyPB还包含一个N端信号肽序列。同源性分析结果表明近江牡蛎三个亲环蛋白间的氨基酸序列相似度为35%-48%,而Ca-CyPA与其他物种CyPA氨基酸序列相似度为74-82%,Ca-CyPB与其他物种CyPB基因相似度为57%-70%,Ca-PPIL3与其他物种PPIL3基因相似度为71%-79%。通过表达载体构建,我们在大肠杆菌中成功诱导表达及纯化了Ca-CyPA, Ca-CyPB, Ca-PPIL3蛋白,并制备了多克隆抗体。此外,我们运用real-time RT-PCR技术检测三个亲环蛋白家族组织表达及RLO刺激引起的近江牡蛎血淋巴细胞中的mRNA表达量变化。结果显示,Ca-CyPA、Ca-CyPB、Ca-PPIL3在近江牡蛎所有被检测的组织中均有表达,并且在血淋巴细胞中表达量最高。而在RLO刺激后,三个基因表达量均显着上调,预示着Ca-CyPA、Ca-CyPB、Ca-PPIL3可能参与了近江牡蛎抵抗RLO感染的免疫防御体系。4、三个补体相关基因CaClql, CaClq2和CaC3片段中CaClql和CaClq2包含特征性C1q结构域,属于ClqDC家族蛋白,CaC3包含特征性AA2Mrecep和C345C结构域,属于C3样蛋白。我们运用real-time RT-PCR技术检测三个补体相关基因片段组织表达及RLO刺激引起的近江牡蛎血淋巴细胞中的nRNA表达量变化。结果表明CaClql, CaClq2和CaC3在近江牡蛎所有被检测的组织中均有表达,并且在血淋巴细胞中表达量最高。而在RLO刺激后,三个基因表达量均显着上调,预示着CaClql, CaClq2和CaC3可能参与了近江牡蛎抵抗RLO感染的免疫防御体系。

曹汐汐^[10]（2010）在《RACK1对人乳腺癌增殖、迁移和侵袭转移的影响及相关机制的研究》文中认为前言乳腺癌的发病率和死亡率逐年升高,是严重威胁女性身心健康的恶性肿瘤之一。而乳腺癌的复发和转移是影响其疗效的主要因素。因此,迫切需要寻找一个敏感性好且能较早预测乳腺癌转移的分子生物学标记物及能够抑制其增殖、迁移运动和转移的基因治疗靶点,为临床对乳腺癌的复发和转移做出早期预测提供一定的参考依据,从而有助于及时采取更加有效的治疗措施。人RACK1 （receptor of activated C-kinase 1）定位于人的第5号染色体（5q35.3）,cDNA全长951 bp,其编码的蛋白质分子量为35kDa。有学者在人黑色素瘤、口腔鳞癌等肿瘤中对RACK1与肿瘤转移的关系进行了研究。但该基因与人乳腺癌增殖、迁移运动和侵袭转移的关系究竟如何,以及RACK1与乳腺癌生物学行为的相关性等问题,目前国内外尚未见系统性的研究报道,更无其促进人乳腺癌增殖、迁移运动和侵袭转移的分子机制的研究报道。本课题试图从人乳腺癌细胞株、裸鼠原位（乳垫下）移植瘤模型和人体乳腺癌组织三方面对RACK1表达与乳腺癌生物学行为的相关关系及其作用的分子机制进行研究,以寻找预测人乳腺癌转移的分子生物学标记物及分子治疗的新靶点。故该课题的研究不仅对了解肿瘤的生物学特性具有明显的理论意义,也具有显着的临床价值和社会效益。第一部分从人乳腺cDNA文库中筛选与PI3K plloa相互作用的候选分子及相互作用的验证目的筛选与PI3K p110α相互作用的新候选分子。方法采用酵母双杂交系统以pGBKT7-PIK3CA质粒为钓饵,在人乳腺cDNA文库中筛选。经酵母重新转化验证后,在哺乳动物细胞中使用免疫共沉淀（immunoprecipitation, IP）和免疫荧光（immunofluorescence, IF）共定位的方法确定候选分子RACK1和PI3Kplloα的相互作用。结果以pGBKT7-PIK3CA质粒为钓饵,在人乳腺cDNA文库中筛选出RACK1作为候选分子。在哺乳动物细胞中免疫共沉淀确定两者相互作用,免疫荧光确定两者共定位于胞质。小结成功构建pGBKT7-PIK3CA质粒并以此为钓饵质粒,利用酵母双杂交系统从人乳腺cDNA文库筛选出RACK1,在酵母和哺乳动物细胞中验证了候选分子RACK1与PI3K p110α存在相互作用,并确定其作为进一步研究的对象。第二部分RACK1对人乳腺癌增殖、迁移和侵袭转移的影响目的明确RACK1对人乳腺癌增殖、迁移和侵袭转移的影响。方法采用脂质体介导法将pEGFP-N3-RACK1转染人乳腺癌细胞MCF7和T-47D,以筛选出稳定高表达RACK1的细胞株。采用生长曲线和流式细胞技术研究RACK1对人乳腺癌细胞体外增殖的影响；使用划痕实验和transwell迁移实验研究RACK1对其体外迁移运动能力的影响；应用transwell侵袭实验研究RACK1对人乳腺癌细胞体外侵袭运动能力的影响；同时建立裸鼠原位移植瘤模型,从体内角度研究高表达RACK1对乳腺癌增殖、侵袭转移的影响。结果获得稳定高表达RACK1的MCF7和T-47D细胞株；体外实验表明,与对照组相比,稳定高表达组的细胞倍增时间明显降低,S期的比例明显增高；体外迁移运动和侵袭能力明显提高。在裸鼠移植瘤实验中发现,稳定高表达RACK1细胞组裸鼠乳垫下移植瘤生长较对照组明显加快,肿瘤的体积和重量明显增加,侵袭性明显提高。小结采用脂质体介导法将pEGFP-N3-RACK1成功转染人乳腺癌细胞MCF7和T-47D,获得稳定高表达RACK1的细胞株。高表达RACK1在体内、外均能促进人乳腺癌增殖、迁移运动和侵袭转移潜能。第三部分RACK1对人乳腺癌增殖、迁移和侵袭转移影响的相关机制研究目的阐明RACK1对人乳腺癌增殖、迁移运动和侵袭转移作用的机制。方法采用Western blot的方法检测稳定高表达RACK1的人乳腺癌细胞和相应抑制剂处理后以及RACK1 siRNA干扰人乳腺癌细胞后,细胞周期相关蛋白表达的变化,及PI3K/Akt和MAPK信号通路中关键分子活性的改变；采用IP和IF检测RACK1和RhoA在细胞中的相互作用；采用细胞体外迁移实验检测Rho激酶抑制剂处理后稳定高表达RACK1的人乳腺癌细胞体外迁移能力的改变；采用GTP-Rho pull-down实验检测稳定高表达RACK1的细胞和Rho激酶抑制剂处理后以及RACK1 siRNA干扰后RhoA活性的改变；采用明胶酶谱实验检测稳定高表达RACK1的人乳腺癌细胞和RACK1 siRNA干扰后细胞MMPs活性的改变;采用免疫组织化学（immnohistochemistry, IHC）的方法在体内研究RACK1促进人乳腺癌增殖、侵袭转移能力的体内机制。结果与空载对照组相比,稳定高表达RACK1的人乳腺癌细胞株p-Akt的表达明显上升,细胞周期素cyclin D1和cyclin D3的表达也明显上升,而p21的表达下降。使用PI3K的抑制剂（LY294002,10μM）12、24h后,cyclin D1和cyclin D3的上调被抑制,而p21的表达上升；IP证实RhoA与RACK1存在相互作用,IF显示两者共定位于MCF7和MCF7/ADR的胞质；与溶剂对照组相比,使用Rho激酶的抑制剂Y-27632（10μM）预处理的稳定高表达细胞,其迁移能力明显被抑制；Rho活性检测实验显示与空载对照组相比,稳定高表达细胞中活化的RhoA显着增多,而在使用了RACK1 siRNA或Y-27632后又明显减少；Western blot和明胶酶谱检测结果显示,与对照相比,稳定高表达RACK1的细胞株CD147的表达和MMP2的活性明显上升；裸鼠IHC结果显示,与空白亲本及空载对照组相比,稳定高表达组裸鼠组织中Ki67和MMP2的表达明显上升。小结RACK1通过调节PIK/Akt信号通路的活性及细胞周期相关蛋白p21的下调、cyclin D1和cyclin D3的升高,参与调控人乳腺癌细胞的增殖能力；RACK1通过与RhoA的相互作用及活化RhoA/Rho激酶通路,促进人乳腺癌细胞的迁移运动；RACK1通过调节CD147的表达及MMP2的活性,促进人乳腺癌的侵袭转移能力。第四部分人乳腺癌组织中RACK1的表达及其与临床参数的关系目的阐明人乳腺癌组织中RACK1的表达及其与临床参数的关系。方法采用IHC的方法在160例人乳腺癌组织标本中研究RACK1的表达及其与临床参数的关系。结果RACK1蛋白主要表达在细胞质中；在160例乳腺癌标本中,40例样本表现为癌细胞RACK1表达评分为2级,有54例评分为1级,有66例评分为O级；RACK1的表达与肿瘤大小（P=0.046）、淋巴结转移（P=0.027）、临床分期（P=0.007）和组织学分级（P=0.004）相关；RACK1的表达与Ki67有很强的相关性,经Pearson’s相关分析,两者的相关系数高达0.930,P<0.001；另外,RACK1与RhoA、HER-2呈正相关；与原位癌百分比、ER, PR呈负相关；Kaplan-Meier生存分析揭示,RACK1的高表达与乳腺癌癌患者较短的生存期之间有显着相关性（P<0.001）；单、多因素生存分析显示RACK1蛋白在乳腺癌患者预后分析中是一个独立的有预后意义的分子指标（P=0.006）; RACK1的ROC曲线下的面积为0.833,而其它临床肿瘤分子指标的ROC面积均低于0.80,分别为Ki670.766,ER 0.446,PR0.387和HER-20.689。小结RACK1在乳腺癌患者预后分析中是一个独立的有意义的分子指标；与其他乳腺癌临床常用分子指标相比,RACK1具有更大的优越性和更广阔的应用前景。

二、人乳腺癌细胞cDNA文库的构建及鉴定（论文开题报告）

（1）论文研究背景及目的

此处内容要求：

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例：

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

（2）本文研究方法

调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、人乳腺癌细胞cDNA文库的构建及鉴定（论文提纲范文）

（1）CD133谱系示踪小鼠第四脑室单细胞转录组测序及可变剪接分析（论文提纲范文）

（2）水母来源环γ-聚谷氨酸分离纯化及其在构建双重响应性载阿霉素纳米胶束中的运用（论文提纲范文）

（3）FHL2对绵羊卵巢颗粒细胞功能的影响及机制研究（论文提纲范文）

（4）大白菜富含甘氨酸蛋白BrGRPl的功能初探（论文提纲范文）

（5）马度米星铵致鸡原代心肌细胞毒性及毒性机制的研究（论文提纲范文）

（6）银环蛇L-氨基酸氧化酶的分离纯化与鉴定（论文提纲范文）

（7）黑肥尾蝎（Androctonus bicolor）毒腺转录组与蛋白组学研究及蝎钾通道毒素分子进化分析（论文提纲范文）

（8）大腹园蛛粗毒的理化性质及毒素组学研究（论文提纲范文）

（9）近江牡蛎抗类立克次体感染天然免疫分子的生物学研究（论文提纲范文）

（10）RACK1对人乳腺癌增殖、迁移和侵袭转移的影响及相关机制的研究（论文提纲范文）

四、人乳腺癌细胞cDNA文库的构建及鉴定（论文参考文献）

• [1]CD133谱系示踪小鼠第四脑室单细胞转录组测序及可变剪接分析[D]. 樊喻. 南昌大学, 2020(01)
• [2]水母来源环γ-聚谷氨酸分离纯化及其在构建双重响应性载阿霉素纳米胶束中的运用[D]. 王超. 中国人民解放军海军军医大学, 2020(02)
• [3]FHL2对绵羊卵巢颗粒细胞功能的影响及机制研究[D]. 张丽萌. 河北农业大学, 2020(01)
• [4]大白菜富含甘氨酸蛋白BrGRPl的功能初探[D]. 李真真. 山西农业大学, 2018(01)
• [5]马度米星铵致鸡原代心肌细胞毒性及毒性机制的研究[D]. 高修歌. 南京农业大学, 2018(07)
• [6]银环蛇L-氨基酸氧化酶的分离纯化与鉴定[D]. 胡玲玲. 南京师范大学, 2017(01)
• [7]黑肥尾蝎（Androctonus bicolor）毒腺转录组与蛋白组学研究及蝎钾通道毒素分子进化分析[D]. 张磊. 中国地质大学, 2015(12)
• [8]大腹园蛛粗毒的理化性质及毒素组学研究[D]. 段志贵. 湖南师范大学, 2012(06)
• [9]近江牡蛎抗类立克次体感染天然免疫分子的生物学研究[D]. 许婷. 浙江大学, 2012(08)
• [10]RACK1对人乳腺癌增殖、迁移和侵袭转移的影响及相关机制的研究[D]. 曹汐汐. 复旦大学, 2010(11)