一种用于检测博尔纳病病毒的荧光定量巢式RT-PCR方法的建立

一、博尔纳病病毒荧光定量套式RT-PCR检测方法的建立（论文文献综述）

李彬^[1]（2011）在《病毒性脑炎和精神分裂症患者血液BDVp40基因片段的检测》文中研究指明目的探讨贵州省病毒性脑炎（Viralencephalitis, VE）、精神分裂症（Schizophrenia, SCH）患者博尔纳病病毒（Borna disease virus, BDV）的感染情况方法采用荧光定量巢式逆转录酶聚合酶链反应（FQ-nRT-PCR）检测来自贵州省遵义市、铜仁地区及毕节地区68例病毒性脑炎患者、38例精神分裂症患者、84名健康对照者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMCs）中BDVp40基因片段。对阳性扩增产物进行基因序列测定,用软件对基因序列进行同源性分析结果68例病毒性脑炎患者外周血液单个核细胞中检出BDV p40基因片段阳性7例,遵义市6例、毕节地区1例。阳性率为10.29%（7/68）。38例精神分裂症患者外周血液单个核细胞中检出BDV p40基因片段阳性3例,阳性率为7.89%（3/38）,遵义市2例、毕节地区1例。84名健康人外周血液单个核细胞中未检出BDV p40基因片段阳性。病毒性脑炎与健康人比较阳性率有显着性差异,P=0.009；精神分裂症与健康人比较阳性率有显着性差异,P=0.048。基因片段测序及同源性分析结果为：在病毒性脑炎和精神分裂症中检出的BDV p40基因片段阳性产物核苷酸序列一致,同源性100%。病毒性脑炎和精神分裂症患者阳性产物核苷酸序列与GeneBank提供的strain V/FR毒株比较同源性为95%,有5个位点出现一致性沉寂突变（nt276T-C, nt322 T-C, nt348 A-G, nt351 C-T, nt369 C-T）;与H1766病毒株比较同源性为96%,有4个位点出现一致性沉寂突变（nt276T-C, nt322 T-C, nt348 A-G, nt351 C-T）,与He80/FR病毒株比较同源性为98%,有2个位点出现一致性沉寂突变（nt322 T-C,nt348 A-G）。结论贵州省遵义市、毕节地区病毒性脑炎患者检测到BDV-P40基因片段,病毒性脑炎存在BDV感染,病毒性脑炎可能与BDV感染有关。贵州省遵义市、毕节地区精神分裂症患者检测到BDV-P40基因片段,精神分裂症存在BDV感染,精神分裂症可能和BDV感染有关。贵州省遵义市、毕节市的精神分裂症和病毒性脑炎患者BDV-P40基因序列相同,BDV感染可能来自相同的感染源。

金戈^[2]（2011）在《博尔纳病病毒磷蛋白的原核表达和p24片段荧光定量PCR试剂盒的研制开发》文中指出背景及目的:博尔纳病病毒（BDV）是一种嗜神经性的单股负链RNA病毒,BDV的感染宿主包括了大部分温血动物,而根据一些研究认为BDV感染也可能于人类精神疾病有关,在我国和其他国家一些地区动物、精神疾病患者和脑炎患者中均有散在BDV疑似阳性病例报导。BDV基因组含有6个开放式读码框（ORF）,其中ORFⅡ编码磷蛋白（p24）,磷蛋白作为抗原参与血清免疫反应可以检测判断是否有病毒感染存在。此外p24基因由于序列高度保守,并且在检测同等病毒量时其敏感性要高于核蛋白基因,故p24片段是在BDV核酸检测上的主要指标。本研究通过原核表达出磷蛋白,并对其进行纯化和鉴定,以进一步制备抗体和开发相关免疫学检测试剂盒。另一方面在套式荧光定量PCR基础上优化适合p24扩增的PCR缓冲液,同时摸索最佳反应条件,尝试开发BDV p24片段一步法实时荧光定量PCR试剂盒,使之能达到稳定可靠而更简单方便的要求以便可以对样本进行大规模快速筛选,通过流行病学调查来了解该病毒在我国的分布及流行特征,防治将来可能出现大规模的暴发流行,此外在临床检验中可以进一步研究分析BDV和人类神经精神疾病的相关性。方法:1通过RT-PCR方法获得p24基因片段,将目的片段插入到pET-41a原核表达载体中构建重组质粒,转化到BL21大肠杆菌,使用IPTG诱导表达并亲和层析纯化,对诱导表达的磷蛋白进行SDS-PAGE电泳和Western-Blot分析和鉴定。2根据p24片段设计合成引物和探针,通过常规PCR比较选择3种常用酸（盐酸、磷酸和硫酸）所滴定的缓冲液体系,在其基础上选择适合浓度的硫酸铵配制TSS buffer,在TSS buffer中分别加入四甲基氯化铵、Triton X-100、二甲亚砜和甜菜碱这4种常用的PCR添加剂,并确定各自的最佳工作浓度,选择扩增效果较好的添加剂与其他添加剂进行依次组合,寻找最佳的添加剂组合,最后用荧光定量PCR进行对比验证。此外在引物的退火温度、引物和探针的最佳浓度、dNTPs和Mg2+的最佳工作浓度上做出相应的优化,以求试剂盒的扩增效率和标准曲线达到满意的效果。结果:1成功构建pET41a-p24重组质粒,经酶切鉴定和测序后证实序列正确,SDS-PAGE分析目的蛋白表达量占菌体总蛋白30%以上,并且目的蛋白以可溶形式表达,纯化后蛋白纯度达85%左右,对磷蛋白进行Western-Blot鉴定可见可以与p24单克隆抗体特异性结合。2在滴定酸上选择了效果最好的硫酸,配制TSS buffer硫酸铵的最佳终浓度为6mmol/L。在添加剂的优化组合上,1.5mol/L甜菜碱、0.15%Triton X-100、8mmol/L四甲基氯化铵和TSS buffer组合成的TBTT buffer效果最佳,在其与Takara的热启动PCR buffer的对比中,TBTT buffer在扩增效率和标准曲线上明显好于后者,此外退火温度、dNTPs、Mg2+、引物和探针的最佳工作浓度也得以确定。结论:1成功诱导表达出可溶性目的蛋白,经鉴定具有正确的抗原活性,可以进一步制备抗体和建立博尔纳病病毒相关免疫学检测方法。2成功设计了引物,并优化出适合扩增博尔纳病病毒p24模板基因的扩增缓冲液,以及对反应体系进行了摸索调整,使扩增曲线和标准曲线达到了试剂盒要求。

张英英^[3]（2010）在《中国新疆和重庆地区多物种博尔纳病病毒的检测及种系发生分析》文中提出背景博尔纳病病毒（Borna disease virus,BDV）是新发的中枢神经系统感染性病毒,它是一种未分段的有包膜的单股负链RNA病毒,与纤丝病毒科、副粘病毒科和弹状病毒科共同归属于单股负链RNA病毒目（Monnegaviradae）,并针对本病毒特设Borna病毒科Borna病毒属。1895年BDV在德国博尔纳（Borna）小镇的马群中引起爆发流行,因此得名。迄今,关于BDV在自然界中的宿主、全球范围分布及传播途径等不断有了新的发现。最初认为BDV感染仅限于德国和瑞士的马群和羊群,偶见散发病例。近年来,随着更多BDV诊断技术的出现和世界各国对BDV研究的深入,已知的感染动物种类逐年增加。在自然条件下,包括鸡、山羊、兔、驴、美洲驼、羊驼、牛、狗、猫以及鸵鸟等在内的多种温血动物均可能被BDV感染。已有的研究表明人群与动物的BDV感染遍布欧洲、亚洲和美洲等多个地区,估计其实际地理分布可能更广泛。该病毒的传播途径目前仍不清楚,已知的研究发现该病毒可能随感染动物的呼吸道、结膜和粪便分泌物排出,通过鼻腔传播感染其他动物和人类。在我国,Hagiwara K、朱丹、杨爱英、徐平、赵立波、刘庆军、王振海和Chen CH等相继报道在新疆、黑龙江、重庆、宁夏、贵州及台湾的人、马和绵羊等出现BDV的自然感染,说明中国地区动物和人也存在BDV的自然感染,但在不同时间阶段动物和人的BDV自然感染情况及传播来源、传播途径等尚不清楚。目的本研究旨在前期实验的基础上,在国家高技术发展计划（863计划,2006AA02Z196）的支持下,研究中国新疆和重庆地区多物种BDV的自然感染,并分析其种系发生来源,为追查感染源、分析BDV的地理分布和阐明种内和种间传播,为部分神经精神疾病的病因学诊断及其防治提供新的思路和依据。方法1.采用前期开发的Borna病病毒荧光定量PCR诊断试剂盒,采用荧光定量套式逆转录聚合酶链反应（Fluorescence quantitative nested transcription polymerase chain reaction,FQ-nRT-PCR）检测新疆伊犁地区放养的518匹健康伊犁马和200头健康新疆驴外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC）中的BDV p24片段,采用普通逆转录聚合酶链反应（Reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR）来检测同样样本的BDV p40基因片段进行更深层次的验证。本实验所用BDV p24荧光定量PCR诊断试剂盒中的标准品为PMD19质粒,为了排除质粒污染的可能性,同时对所有样本进行了PMD19质粒的检测。检出阳性样本的BDV p24片段序列进入NCBI进行Blast后与GenBank中5个国家7个动物种属33例BDV p24基因序列和前期新疆地区BDV p24片段阳性的伊犁马3例BDV p24基因序列进行比对,分析其核苷酸和氨基酸序列同源性,重建基因系统发生树,分析伊犁马和新疆驴中BDV可能的来源和传播途径。2.采用FQ-nRT-PCR检测重庆地区健康牛、山羊和猪各50例PBMCs中BDV p24片段,采用普通RT-PCR来检测同样样本的BDV p40基因片段进行更深层次的验证。此外为了排除质粒污染的可能性,我们对所有样本进行了PMD19质粒的检测。检出阳性样本的BDV p24片段序列进入NCBI进行Blast后与GenBank中5个国家7个动物种属33例BDV p24基因序列和前期重庆地区BDV p24片段阳性的家鸡、山羊、狗、鸽子、家兔和猪6例BDV p24基因序列进行比对,分析其核苷酸和氨基酸序列同源性,重建基因系统发生树,比较在不同时间阶段BDV自然感染率有无变化;比较在不同物种不同时间阶段种系来源有无不同,从而为进一步探讨BDV的自然感染来源和传播途径打下基础。3.采用FQ-nRT-PCR检测病毒性脑炎（Viral encephalitis,VE）患者20例、非中枢神经系统感染患者52例和健康献血者18例PBMCs中BDV p24片段,采用普通RT-PCR来检测同样样本的BDV p40基因片段进行更深层次的验证。此外为了排除质粒污染的可能性,我们对所有样本进行了PMD19质粒的检测。检出阳性样本BDV p24片段序列进入NCBI进行Blast后与GenBank中5个国家7个动物种属33例BDV p24基因序列和前期重庆地区BDV p24片段阳性的精神分裂症、帕金森病（Parkinson’s disease,PD）、吉兰巴雷综合征（Guillain-Barrésyndrome,GBS）和VE患者4例BDV p24基因序列进行序列和进化分析,分析其核苷酸和氨基酸序列同源性,重建基因系统发生树,比较在不同时间阶段自然感染率有无变化;比较在不同病种不同时间阶段种系来源有无不同,从而为进一步探讨BDV的自然感染来源和传播途径打下基础。结果1.使用FQ-nRT-PCR对新疆伊犁地区动物样本RNA进行BDV p24基因片段检测。结果发现,9例样本BDV p24检测阳性（伊犁马:5/518,0.97%;新疆驴:4/200,2.00%）;检出BDV p40片段阳性9例,与BDV p24阳性结果一致,其余样本均为阴性;在BDV p24和p40检测结果均为阳性的样本中未检出质粒标准品,显示所有检测样本均未发现标准品污染;9例阳性样本BDV p24基因片段的序列完全相同,与BDV标准病毒株Strain V、H1766和He/80等比对,9例阳性样本核苷酸和氨基酸同源相似性分别为94%～100%和82%～100%,其中与He/80株同源性最高为100%;与前期新疆地区伊犁马3例BDV p24基因序列比对,9例阳性样本核苷酸和氨基酸同源相似性分别为99%～100%和96%～100%;本次检测9例阳性样本和前期伊犁马3例阳性样本BDV p24片段序列汇聚德国-瑞士-奥地利-日本-中国新疆混合支系。2.使用FQ-nRT-PCR对重庆地区动物样本RNA进行BDV p24基因片段检测。结果发现,7例样本BDV p24检测阳性（牛:3/50,6.00%;羊:2/50,4.00%;猪:2/50,4.00%）;检出BDV p40片段阳性7例,与BDV p24阳性结果一致,其余样本均为阴性;在BDV p24和p40检测结果均为阳性的样本中未检出质粒标准品,显示所有检测样本均未发现标准品污染;本次实验检测7例牛、山羊和猪阳性样本核苷酸序列和氨基酸序列完全相同,与BDV标准病毒株Strain V、H1766和He/80等比对,7例阳性样本核苷酸和氨基酸同源相似性分别为94%～100%和82%～100%;与前期重庆地区家鸡、山羊、狗、鸽子、家兔和猪6例BDV p24基因序列比对,同源相似性分别为94%～100%和82%～100%;本次检测7例阳性样本BDV p24片段序列和前期检测重庆地区猪的BDV p24片段序列汇聚德国-瑞士-奥地利-日本-中国重庆混合支系,前期检测的家鸡、山羊、狗、鸽子、家兔阳性样本BDV p24基因片段序列形成中国重庆独立支系。3.使用FQ-nRT-PCR对重庆地区人样本RNA进行BDV p24基因片段检测。结果发现,5例样本BDV p24检测阳性（VE患者:3/20,15.00%;脑血管病（Cerebrovascular disease,CVD）患者:2/32,6.25%;GBS患者、癫痫患者、多发性硬化（Multiple sclerosis,MS）患者、PD患者、酒精中毒性脑病和健康献血者均为阴性）;检出BDV p40片段阳性5例,与BDV p24阳性结果一致,其余样本均为阴性;在BDV p24和p40检测结果均为阳性的样本中未检出质粒标准品,显示所有检测样本均未发现标准品污染;与BDV标准病毒株Strain V、H1766和He/80等比对,本次实验检测2例VE患者和2例CVD患者样本核苷酸和氨基酸同源相似性分别为94%～100%和82%～100%;1例VE患者为95%～98%和89%～93%;与前期重庆地区精神分裂症、PD、GBS和VE患者4例BDV p24基因序列比对,2例VE患者和2例CVD患者样本核苷酸和氨基酸同源相似性分别为94%～97%和82%～89%,1例VE患者为95%～100%和93%～100%;本次检测4例阳性样本（2例CVD患者和2例VE患者）BDV p24片段序列汇聚德国-瑞士-奥地利-日本-中国重庆混合支系,另外1例VE患者阳性样本和前期检测的精神分裂症、PD、GBS和VE患者样本BDV p24基因片段序列形成中国重庆独立支系。结论1.中国新疆地区健康伊犁马和新疆驴存在BDV的自然感染。根据种系发生学分析其感染的BDV可能是由于该病毒在德国、瑞士、奥地利、日本和中国各国的相互传播引起。在重新构建的种系发生树分支内部,BDV在伊犁马和新疆驴存在高度的同源性,说明不同宿主之间可能存在动物和动物之间的循环传播。2.中国重庆地区健康牛、山羊和猪中存在BDV的自然感染。根据种系发生学分析,重庆地区动物宿主可能存在地源性BDV独立株和源于外来疫病病原传入的流行株。在不同物种和时期,BDV种系可能不同,可表现为某一种系为主,说明BDV及其宿主可能存在进化和变异的稳定平衡。3.中国重庆地区VE患者和CVD患者中存在BDV的自然感染。根据种系发生学分析,重庆地区人宿主可能存在地源性BDV独立株和源于外来疫病病原传入的流行株,该结论与重庆地区动物一致,不同宿主之间可能存在动物和动物、动物和人类、人类和人类之间的循环传播。

何丰^[4]（2010）在《新疆伊犁地区动物脑内博尔纳病病毒和西尼罗病毒感染的分子流行病学研究》文中研究指明博尔纳病病毒（Borna disease virus,BDV）是一种非分段单股负链RNA病毒,在感染细胞的细胞核内复制和转染。Borna病毒基因组相对分子量为8.9×103,具有6个开放阅读框架,能编码核蛋白（p40）、磷蛋白（p24）、基质蛋白（p16）、非糖基化蛋白（p10）、糖蛋白（p56）和L-多聚酶。其中,p24和p40在宿主细胞含量相对较高,常用于BDV血清学和分子生物学的检测。该病毒具有广泛的感染宿主,能够感染多种哺乳动物,包括马、牛、羊、狗、鼠、兔等。而西尼罗病毒（West Nile virus,WNV）是一种非节段的单股正链RNA黄病毒科,黄病毒属病毒,其核酸编码蛋白包括3种结构蛋白（即核衣壳蛋白（C）、包膜蛋白（E）和前膜蛋白（preM））和7种非结构蛋白（即NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5）。WNV主要传染源是带毒的鸟类,可感染人、马、鸟类等。其传播媒介主要是蚊子（特别是尖音库蚊）,此外人与人之间还可以通过输血、器官移植、哺乳等方式传播。BDV和WNV对中枢神经系统均具有较强的亲和力。若在脑内持续感染,就会出现中枢神经神经系统损害,具有神经症状或体征,如脑炎,脑脊髓炎,癫痫等症状;甚至导致死亡。近年来,世界各地相继爆发SARS,禽流感,甲型H1N1流感病毒的感染,给人类造成极度的恐慌,对社会带来了巨大经济损失。而BDV和WNV在非洲、亚洲、欧洲、澳洲均有感染报道,特别是中东地区,应引起我们的高度重视。新疆伊犁地区地处我国西北边境,古代的“丝绸之路”,又是我国与欧亚大陆的重要交通要塞。随着我国加入世贸组织,对外贸易交流增多,人口来往频繁,BDV和WNV很有可能通过此处传入我国。所以,对新疆伊犁地区动物的脑内博尔纳病病毒和西尼罗病毒感染情况进行调查,了解病毒流行状况,监控病毒感染至关重要。在我国重庆、贵州、宁夏等地区,已经有外周血中检测BDV和WNV的研究报道,但仍缺乏中枢神经系统感染情况的调查。为此,我们采用荧光定量RT-PCR的方法对新疆伊犁地区的马、驴和狗375例脑组织进行BDV p24基因和WNV E基因片段检测。此外,也对100例牧羊犬脑组织和其外周血同时BDV p24检测的阳性率结果进行比较。研究结果表明:⑴.3例伊犁马、4例伊犁驴、9例牧羊犬的脑组织标本和5例牧羊犬外周血标本的BDV p24检测阳性,阳性率分别为1.5%、5.3%、9%、5%;BDV p24扩增产物序列与He/80株的同源性为100%;⑵.外周血单核细胞组和脑组织组BDV p24检测的阳性率差异无统计学意义（P>0.05）;⑶.375例动物脑组织标本的西尼罗病毒E基因片段检测有2例可疑阳性,但经3%凝胶电泳法再次验证后考虑为假阳性。所有待检样本WNV E基因检测均为阴性。总之,本研究结果表明,我国新疆伊犁地区存在BDV的自然感染,并且以荧光定量RT-PCR对外周血单核细胞BDV p24片段的检测应该能够替代脑组织BDV检测,作为大规模BDV脑内感染调查的手段;而目前我国新疆伊犁地区存在西尼罗病毒感染的可能性较小。

刘海军^[5]（2010）在《病毒性脑炎与Borna病病毒感染的相关性研究》文中指出目的探讨博尔纳病病毒感染与病毒性脑炎的相关性。方法采用荧光定量巢式逆转录酶聚合酶链反应检测了34例有精神行为异常的病毒性脑炎患者、40名健康人、120只牛外周血液单个核细胞中BDV p24基因片段。对阳性产物进行基因序列测定,并用软件对氨基酸顺序及同源性分析,总结贵州省及周边部分地区博尔纳病病毒的流行特点。结果有精神行为异常的34例VE患者BDV p24基因片段阳性率为14.71%（5／34）、健康人中未检出（P=0.017<0.05）、牛为4.17%（5／120）。有精神行为异常的病毒性脑炎患者与GeneBank提供的strain V病毒株比较同源性为96.51%,有3个位点出现一致性沉寂突变（nt1650 T-C, nt1671 C-T, nt1674 C-T突变率为3%）,与H1766病毒株比较同源性为97.67%,有2个位点出现一致性沉寂突变（nt1675 C-T, nt1678 T-C突变率为2%）,与He80/FR病毒株比较有3个位点出现一致性沉寂突变（nt1660 T-C, nt1669 A-G, nt1672 C-T突变率为3%）,同源性为96.51%,与C6BV病毒株比较有3个位点出现一致性沉寂突变（nt1659 T-C, nt1668 A-G, nt1671 C-T突变率为3%）,同源性为96.51%,牛BDV p24基因片段的测序结果与GeneBank提供的标准病毒株比较同源性为96.51%～97.67%。与Watanabe Y在小母牛脑组织分离得到的Bo／04W和huP2br病毒株均为2个位点出现一致性沉寂突变（nt1675 C-T, nt1678 T-C突变率为2%）,与马的Strain V病毒株比较有3个位点出现一致性沉寂突变（nt1650T-C, nt1671 C-T, nt1674 C-T突变率为3%）,与H1766病毒株比较有2个位点出现一致性沉寂突变（nt1675 C-T, nt1678 T-C突变率为2%）,与He80/FR病毒株比较在3个位点出现一致性沉寂突变（nt 1660 T-C, nt 1669 A-G, nt 1672 C-T突变率为3%）,但它们所编码的氨基酸没有改变。结论贵州省遵义市部分地区有精神行为异常的病毒性脑炎可能与BDV感染有关；贵州省及周边地区牛群存在BDV感染。

徐鸣明^[6]（2010）在《博尔纳病病毒多种检测方法的比较和细胞水平研究》文中提出背景和目的新发病毒感染疾病是本世纪对人类公共卫生的新挑战,面对突如其来的大规模爆发性新发病毒感染,我们经常束手无策。如果能够在已知的有可能爆发感染的病毒中预先了解病毒的感染机制、预测其爆发的可能性、构建可靠而有效的病毒检测体系以及治疗措施,这些疾病是可以被预防和控制的。博尔纳病病毒（Borna Disease Virus,BDV）属于中枢神经系统感染的新发病毒。一百多年前首次在德国发现时,BDV曾经导致大量马匹发生爆发性脑炎而死亡,因而被认为是烈性病毒。人类中发现的BDV感染病例,引起的是慢性的潜伏感染和精神行为异常。由于BDV有在动物中爆发的先例,不能排除其通过自然变异引起人群爆发感染的可能。更值得关注的是,今年初Nature报道,BDV的核蛋白基因已经部分整合到人类和部分动物的基因组内,该病毒与人类多种疾病的发病有关。建立完善的检测体系是研究BDV关键的第一步,所以在验证和比较BDV的各种检测方法的基础上,构建不同需要下BDV检测方法的组合预案以及运用这些检测方法研究BDV的感染机制意义重大。方法1.将课题组新建立的BDV P40（Neucleoprotein）实时荧光PCR检测方法与早期建立的BDV P24（Phosphoprotein）实时荧光PCR检测方法用持续感染的BDV细胞株进行敏感性、特异性、重复性、稳定性的评估和实际应用。2.构建BDV磷蛋白转染的细胞模型,建立BDV的原位PCR检测方法,与抗体检测方法比较,并在实时荧光PCR检测呈阳性的样本上进行实际应用。3.应用ELISA法检测样本的循环免疫复合物（Circulating immune complexes , CIC）,并与实时荧光PCR、抗体检测结果进行对比。4.比较以上各种方法的特点,建立适合于不同需要的BDV检测组合预案。5.使用原位PCR、ELISA和荧光显微镜在构建的BDV磷蛋白转染的细胞模型上观察BDV P24转染的细胞在转染后各个时期核酸和蛋白的亚细胞定位和表达量。使用MTT检测磷蛋白转染对少突胶质细胞株（Oligodendrocyte, OL）的影响。结果1.两种检测方法敏感性、特异性均好,不同批次试剂的检测结果差异较小,加速破坏实验显示试剂对温度的耐受性好。在两种检测方法的实际应用中对临床病人检测阳性率为3.6%（7/198,P24和P40检测方法）,对动物检测阳性率为猪4.4%（16/360,P24检测方法）和4.2%（15/360,P40检测方法）,马1.7%（9/527,P24检测方法）和1.5%（8/527,P40检测方法）。该检测方法可以作为BDV大规模流行病学调查和实验室研究的可靠工具。2.在OL细胞磷蛋白转染的细胞模型上,建立并验证了原位PCR检测BDV的方法,并在实时荧光PCR检出阳性的病例的外周血淋巴细胞上进行了实际应用。3.使用ELISA（针对CIC）检测发现BDV阳性率为36%,高于RNA检测和抗体检测的阳性率。提示我国BDV以携带形式感染的人群远远高出显性的感染人群。4.通过对以上各种方法的综合比较,建立了针对流行病学调查、临床诊断和感染机制研究的联合检测预案。5.BDV转染的早期磷蛋白主要分布在细胞核,而后期则分布于整个细胞;磷蛋白的核酸始终分布在细胞核内; MTT检测发现BDV磷蛋白对神经胶质细胞的生长具有抑制作用。结论通过比较BDV的实时荧光PCR、原位PCR、抗体、CIC检测方法的特点,根据它们适应的检测范围,建立了不同要求下的BDV检测方法的组合预案。使用相关的检测方法研究BDV的感染机制发现:BDV磷蛋白转染后的亚细胞定位与真病毒感染的过程相似,而且这种转染抑制了OL细胞的生长。

展群岭^[7]（2010）在《博尔纳病病毒分子流行病学研究 ——样本采集病毒检测种系发生分析细胞模型建立试剂盒评价》文中研究指明背景WHO公布2003年席卷全球的SARS爆发流行,涉及32个国家和地区,全球累计病例8 422例,死亡人数919人,病死率约11%。2004年禽流感病毒甲型H5N1在南亚和东南亚爆发流行,致使超过1亿只家禽被捕杀,并传播人类导致感染患者的死亡。2009年4月自墨西哥出现的第一例甲型H1N1流感病毒感染患者至2010年3月,该病毒的大流行已蔓延全球213个国家和地区。2010年4月,WHO公布迄今为止甲型H1N1病毒大流行已造成17 000余人死亡。截至2010年3月31日,中国31个省累计报告甲型H1N1流感确诊病例120 000例,死亡病例超过800例。近7年新发感染性疾病（emerging infectious disease,EID）事件触目惊心,对人类健康、经济发展和社会稳定产生了巨大的影响,使人们对EID积极防控和健全相关公共卫生安全体系产生了许多新的认识,并对EID病原体给予了高度关注。目的本研究通过BDV分子流行病学调查和研究,建立中国西北伊犁地区新发病毒BDV感染动物样本库,获得BDV流行病学资料,了解不同种属动物BDV流行现状,分析BDV可能的种系来源,为制定预防和控制BDV爆发流行预案提供可靠依据,为健全公共卫生安全体系奠定坚实的基础。同时,建立BDV p40-OL细胞模型,为BDV发病机制的蛋白质组学研究提供平台;进一步评价BDV荧光定量PCR诊断试剂盒,为BDV流行病学调查和临床研究提供可靠的检测手段。方法1.根据BDV感染宿主地源特殊性和种属多样性,选择中国西北新疆伊犁地区作为样本采集地点;伊犁马、新疆驴、新疆双峰驼、天山马鹿和不同品种犬作为样本采集动物;外周血和脑组织作为样本采集对象。2.采用FQ-nRT-PCR方法,检测8个品种150例犬PBMCs BDV p24 RNA基因片段。用检测BDV p40 RNA片段和质粒pMD19 BDV H1766 p24标准品验证样本BDV p24阳性产物,排除可能出现的假阳性。验证后的阳性产物进行基因测序、核苷酸和氨基酸序列同源比对以及系统发生学分析。3.在5个种属8个品种873例动物PBMCs中,对伊犁马、新疆驴和哈萨克牧羊犬共检出的19例BDV p24 RNA阳性片段,进行BDV标准株He/80、strain V和H1766比对,分析核苷酸和氨基酸同源相似度,重构基因系统发生树,分析BDV可能的种系来源。4.培养人OL细胞株细胞,用含有BDV p40基因的质粒pEGFP- N1- BDV p40,经脂质体转染OL细胞。通过G418筛选已转染的OL细胞,获得BDV p40蛋白稳定表达的转染态OL细胞。RT-PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒BDV p40基因表达;观察GFP表达、测定IHC和ELISA,鉴定BDV p40蛋白表达。最后,建立稳定表达BDV p40的转染态OL细胞模型。5.试剂盒评价在热稳定性评价方面,将BDV p24荧光定量PCR诊断试剂盒中试剂分装多份一次PCR扩增反应量。随机取出其中2份分别置于25℃和37℃两种温度的恒温水浴箱内进行热处理。处理时间分别选择3 h、6 h、9 h、12 h、24 h、48 h和96 h共7个时间段。在相应温度和热处理时间完成后,对6个浓度梯度的质粒pMD19 BDV H1766 p24标准品进行PCR扩增,扩增产物用琼脂糖凝胶电泳鉴定。通过对PCR反应的CT值和R2值比较,评价试剂盒的热稳定性。在BDV检测信度评价方面,选择定量BDV（+）OL细胞和质粒pMD19 BDV H1766 p24标准品,进行BDV p24基因片段PCR扩增。通过比较两种检测对象检出BDV p24浓度梯度的一致性,评价试剂盒病毒检测结果信度。结果1.在样本采集方面,伊犁地区样本采集动物归属于5个种属8个品种。种属包括伊犁马、新疆驴、新疆双峰驼、天山马鹿和犬;品种有哈萨克牧羊犬、德国牧羊犬、卡罗来纳犬、西伯利亚雪橇犬、波音达猎犬、比格猎犬、德国杜宾犬和斗牛梗犬。样本采集动物数量合计897例,其中伊犁马582例,新疆驴204例,新疆双峰驼4例,天山马鹿1例,哈萨克牧羊犬95例,德国牧羊犬28例,卡罗来纳犬14例,西伯利亚雪橇犬8例,波音达猎犬6例,比格猎犬4例,德国杜宾犬3例,斗牛梗犬2例。样本采集对象为外周血、脑组织和全脑。采集样本的数量为外周血样本897份、脑组织样本1573份和全脑样本43份。2.在病毒检测方面,在8个品种150例犬中,仅哈萨克牧羊犬检出BDV p24片段,阳性率为11.0%（10/91）。基因序列与德国马BDV He/80和德国绵羊BDV S6病毒株同源相似度分别为99.2%和95.7%,氨基酸相似度为100%和89.3%。亲缘关系与He/80最近,其次为S6。3.在种系发生学方面,19例BDV p24核苷酸序列一部分形成伊犁独立支系,其余部分汇聚至伊犁-德国-瑞士混合支系。独立支系与标准病毒株无聚合,核苷酸序列同源相似度为98%,氨基酸序列为100%;德国马He/80汇聚混合支系,核苷酸与氨基酸序列与He/80同源相似度均为100%。4.在细胞模型建立方面,用RT-PCR扩增经pEGFP-N1-BDV p40转染的OL细胞中BDV p40基因核苷酸序列片段,扩增产物在琼脂糖凝胶电泳154 bp处出现一条清晰的条带,其大小与目的片段一致。倒置荧光显微镜观察,OL细胞核GFP表达量明显大于细胞质（细胞核/细胞质=2.43）,证明了BDV p40蛋白核定位的生物学特点。用BDV多克隆抗体和CIC单克隆抗体检测pEGFP-N1-BDV p40、pEGFP-N1和正常OL细胞中BDV p40蛋白表达,结果显示,前者均为阴性,后者均为弱阳性,三者之间无差异。5.在试剂盒评价方面,试剂盒热稳定评价显示,经25℃和37℃热处理后,各温度7个不同时间段BDV p24 PCR反应CT值之间无差异,保持正常PCR扩增效率的热处理持续时间范围为3 h～96 h;25℃和37℃两种温度条件下不同时间段平均R2值之间亦无差异。BDV检测信度评价方面显示,在定量BDV（+）OL细胞（12个浓度梯度即100～10-11）和质粒pMD19 BDV H1766 p24标准品（6个浓度梯度即100～10-5）中,均可检测4个浓度梯度即100、10-1、10-2和10-3,最低检测浓度为10-3。结论1.伊犁地区所采集不同种属和品种的动物血液和脑组织样本量,可基本反映该地区BDV自然感染现状,纳入动物性别和年龄的同质性进一步提高了调查结果的可靠性。在国内外首次建立了马科动物快速开颅全脑采集的新方法。2.伊犁地区可能存在BDV自然感染,哈萨克牧羊犬为BDV贮存宿主,其自然感染阳性率为11.0%;该地区BDV流行病毒株可能与伊犁马BDV He/80的交叉感染和引进德国Saxony美利奴绵羊BDV S6病毒株的输入感染有关。3.首次提出了新疆伊犁河谷动物宿主中可能存在地源性BDV独立种系,形成哈萨克牧羊犬BDV KT078和KT079病毒株;同一种系BDV株在伊犁河谷不同种属动物间的感染,可能源于外来疫病病原体经草原丝绸之路的传播。4.质粒pEGFP-N1-BDV p40转染人OL细胞后BDV p40基因和蛋白在细胞内的稳定表达,建立了转染态BDV p40-OL细胞模型,为探索BDV p40单一病毒蛋白在宿主中的作用和BDV致抑郁症发病机制的蛋白质组学研究提供了有效的手段。5.荧光定量BDV p24诊断试剂盒在一定范围内不受温度（25℃/ 37℃）和在该温度下持续使用时间（3 h～96 h）的限制,具有较好的热稳定性;该试剂盒具有极高的BDV检测信度,可检测宿主细胞中10-3 BDV浓度。

冯裕星^[8]（2010）在《中国西部地区三种嗜神经病毒脑内感染初步流行病学研究》文中进行了进一步梳理目的：调查尼帕病毒（Nipah virus, NiV）和亨德拉病毒（Hendra virus,HeV）在中国西部地区动物中的自然感染及流行情况,以获得我国西部地区NiV和HeV的流行病学资料,评估我国西部地区的生物安全现状。对重庆地区病原体不明的病毒性脑炎患者进行丙型肝炎病毒（Hepatitis C Virus, HCV）正负链RNA片段检测,以研究丙型肝炎病毒与人类病毒性脑炎之间的关系,探究HCV感染在人类神经精神疾病中的作用。方法：1、2007年8月-2007年11月随机抽样采集新疆维吾尔族伊犁哈萨克自治州的伊犁河谷地区和巴音郭楞蒙古自治州巴音布鲁克草原天然牧场放养、未接种NiV疫苗的马匹新鲜脑组织183份、驴新鲜脑组织65份。研磨脑组织,应用Trizol法提取细胞总RNA。用已建立的NiV一步法实时RT-PCR检测方法,对RNA样本进行NiV检测,并提交流行病学调查报告。2、2007年8月-2007年11月随机抽样采集新疆维吾尔族伊犁哈萨克自治州的伊犁河谷地区和巴音郭楞蒙古自治州巴音布鲁克草原天然牧场放养、未接种HeV疫苗的马匹新鲜脑组织183份、驴新鲜脑组织65份。研磨脑组织,应用Trizol法提取细胞总RNA。用已建立的HeV一步法实时RT-PCR检测方法,对RNA样本进行HeV检测,并提交流行病学调查报告。3、2007年6月-2008年10月收集重庆医科大学附一院神经科的病原体不明的病毒性脑炎患者32例,每个患者抽取外周血5ml、脑脊液5ml。使用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞,离心分离脑脊液有核细胞,应用Trizol法提取细胞总RNA。用已建立的HCV巢式荧光定量RT-PCR检测方法,对RNA样本进行HCV正负链RNA片段检测,并提交研究报告。结果：1、NiV一步法实时RT-PCR方法能检测的NiV N基因片段的浓度范围为1.1×102-1.1×107copies/μl。该方法检测HeV N基因及BDV核蛋白基因片段结果为阴性。2、对伊犁地区收集的马脑、驴脑样本进行NiV N基因片段检测,成功进行了一步法实时RT-PCR反应,所有样本荧光扩增曲线均无Takeoff点,曲线平坦,判为阴性结果。3、HeV一步法实时RT-PCR方法能检测的HeV N基因片段的浓度范围为2.6×102-2.6×107copies/μl。该方法检测NiV N基因及BDV核蛋白基因片段结果为阴性。4、对伊犁地区收集的马脑、驴脑样本进行HeV N基因片段检测,成功进行了一步法实时RT-PCR反应,所有样本荧光扩增曲线均无Takeoff点,曲线平坦,判为阴性结果。5、HCV巢式荧光定量RT-PCR检测方法能检测的HCV正负链5’NCR基因片段的浓度范围为7.85×100-7.85×107copies/μl。该方法检测登革热病毒5’NCR基因、NiV N基因及WNV病毒E基因片段结果为阴性。6、对重庆地区收集的病原体不明的病毒性脑炎患者血液及脑脊液样本进行HCV正负链5’NCR基因片段检测,成功进行了一步法实时RT-PCR反应,脑脊液有核细胞和PBMC中HCV 5’NCR正链片段阳性的分别为1例（1/32）和2例（2/32）,负链片段阳性的分别为1例（1/32）和0例（0/32）。结论：1、本课题组前期开发的尼帕病毒一步法Real-time RT-PCR方法敏感性高、特异性好,定量准确,安全快捷,适用于大规模流行病学调查和病毒性疾病检测。2、流行病学初步研究显示目前我国新疆伊犁地区部分马、驴脑组织样本中暂未检测到NiV感染。3、本课题组前期开发的亨德拉病毒一步法Real-time RT-PCR方法敏感性高、特异性好,定量准确,安全快捷,适用于大规模流行病学调查和病毒性疾病检测。4、流行病学初步研究显示目前我国新疆伊犁地区部分马、驴脑组织样本中暂未检测到HeV感染。5、本课题组前期开发的丙肝病毒巢式荧光定量RT-PCR检测方法敏感性高、特异性好,方便快捷,适用于中枢神经系统感染的快速准确检测和定量,为进一步研究HCV感染与神经精神疾病关系奠定基础。6、流行病学初步研究提示目前我国重庆地区部分病毒性脑炎患者外周血及脑脊液中均检出HCV感染,丙肝病毒感染与病毒性脑炎具有相关性。

何丰,冯裕星,孙后超,展群岭,谢鹏^[9]（2010）在《牧羊犬外周血和脑组织博尔纳病病毒检测结果的比较》文中认为目的检测同一牧羊犬外周血和脑组织博尔纳病病毒（BDV）p24片段,比较两者阳性率的差异。方法采用改进的荧光定量套式RT-PCR,对新疆伊犁地区圈养的100只牧羊犬外周血单核细胞（PBMC）和脑组织（BT）同时进行BDV p24基因片段的检测,并对阳性标本采用GFP-p24、pMD-19扩增后电泳验证,排除质粒污染,并克隆测序,用Fisher精确检验和χ2检验分析两者阳性率的差异。结果牧羊犬外周血单核细胞和脑组织BDV p24检测的阳性率分别为5%和9%;PBMC组和BT组BDV p24检测阳性率差异无统计学意义（P>0.05）。结论BDV在脑内持续感染,但以RT-PCR对外周血单核细胞BDV p24片段的检测有可能替代脑组织BDV检测,作为大规模流行病学调查的手段。

刘建^[10]（2010）在《宁夏地区博尔纳病病毒感染的细胞和分子生物学研究》文中进行了进一步梳理目的调查研究宁夏地区绵羊中的BDV的自然感染状况。对阳性检测样本的核苷酸序列进行连接测序,比较分析BDV p24基因序列,建立病毒株的种系发生树,阐明其在宁夏地区绵羊中的自然感染情况及其可能的种系来源;应用转染的OL作进一步的病毒核蛋白的细胞内定位研究,初步探讨病毒的感染和发病机制。方法应用巢式逆转录荧光定量PCR（FQ-nRT-PCR）技术检测中国宁夏地区绵羊脑组织和PBMC中的BDV p24和p40基因片段;对检测BDV p24和p40基因片段均为阳性标本的p24基因片段进行连接、克隆、测序,并应用EMBL、DNASP4.0和MEGA4.0软件分析核苷酸和氨基酸序列同源性相似度,构建Neighbor-Joining基因系统发生树并分析病毒感染的可能来源;对转染的OL应用激光共聚焦显微镜技术和Western blot的方法观察病毒核蛋白在细胞内的表达定位。结果在宁夏地区163只绵羊脑组织和710只绵羊的PBMC中检测到BDV p24和p40阳性基因片段,检出率分别为3.68%（6/163）和1.27%（9/710）;对15例阳性检出标本进行连接、克隆、测序,连同14例前期检测序列基因聚合分析显示核酸之间的同源相似度为96.5%～100%,氨基酸的同源相似度为95.3%～100%。与德国马源性标准株He/80同源相似度较高。构建基因的系统发生树发现宁夏的VE患者、抑郁症患者、绵羊和同德国马、绵羊、奥地利马都各自形成了独立的支系,其余阳性检出序列形成混合支系,其中宁夏的VE患者、牛、绵羊同德国的马、日本的绵羊形成了‘德国-中国（宁夏）-日本’的混合支系;在转染BDV p40基因片段的荧光表达质粒的OL内,激光共聚焦显微镜提示核蛋白存在于细胞浆和细胞膜中;Western blot的结果显示在细胞膜蛋白中存在核蛋白,而在细胞浆中未检测到该蛋白。结论中国宁夏地区绵羊中可能存在BDV的自然感染;宁夏地区人和动物BDV的感染存在区域源性BDV独立株和国外传入基因保守株的多源性;在转染的OL内稳定表达了BDV核蛋白,并将其定位在细胞的结构蛋白中,尤其在细胞膜中含量更为丰富,推断其可能在细胞的信号转导或介导病毒感染入胞过程中发挥关键作用。

二、博尔纳病病毒荧光定量套式RT-PCR检测方法的建立（论文开题报告）

（1）论文研究背景及目的

此处内容要求：

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例：

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

（2）本文研究方法

调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、博尔纳病病毒荧光定量套式RT-PCR检测方法的建立（论文提纲范文）

（1）病毒性脑炎和精神分裂症患者血液BDVp40基因片段的检测（论文提纲范文）

（2）博尔纳病病毒磷蛋白的原核表达和p24片段荧光定量PCR试剂盒的研制开发（论文提纲范文）

（3）中国新疆和重庆地区多物种博尔纳病病毒的检测及种系发生分析（论文提纲范文）

（4）新疆伊犁地区动物脑内博尔纳病病毒和西尼罗病毒感染的分子流行病学研究（论文提纲范文）

（5）病毒性脑炎与Borna病病毒感染的相关性研究（论文提纲范文）

（6）博尔纳病病毒多种检测方法的比较和细胞水平研究（论文提纲范文）

（7）博尔纳病病毒分子流行病学研究 ——样本采集病毒检测种系发生分析细胞模型建立试剂盒评价（论文提纲范文）

（8）中国西部地区三种嗜神经病毒脑内感染初步流行病学研究（论文提纲范文）

（9）牧羊犬外周血和脑组织博尔纳病病毒检测结果的比较（论文提纲范文）

（10）宁夏地区博尔纳病病毒感染的细胞和分子生物学研究（论文提纲范文）

四、博尔纳病病毒荧光定量套式RT-PCR检测方法的建立（论文参考文献）

• [1]病毒性脑炎和精神分裂症患者血液BDVp40基因片段的检测[D]. 李彬. 遵义医学院, 2011(06)
• [2]博尔纳病病毒磷蛋白的原核表达和p24片段荧光定量PCR试剂盒的研制开发[D]. 金戈. 重庆医科大学, 2011(11)
• [3]中国新疆和重庆地区多物种博尔纳病病毒的检测及种系发生分析[D]. 张英英. 重庆医科大学, 2010(02)
• [4]新疆伊犁地区动物脑内博尔纳病病毒和西尼罗病毒感染的分子流行病学研究[D]. 何丰. 重庆医科大学, 2010(05)
• [5]病毒性脑炎与Borna病病毒感染的相关性研究[D]. 刘海军. 遵义医学院, 2010(04)
• [6]博尔纳病病毒多种检测方法的比较和细胞水平研究[D]. 徐鸣明. 重庆医科大学, 2010(04)
• [7]博尔纳病病毒分子流行病学研究 ——样本采集病毒检测种系发生分析细胞模型建立试剂盒评价[D]. 展群岭. 重庆医科大学, 2010(02)
• [8]中国西部地区三种嗜神经病毒脑内感染初步流行病学研究[D]. 冯裕星. 重庆医科大学, 2010(05)
• [9]牧羊犬外周血和脑组织博尔纳病病毒检测结果的比较[J]. 何丰,冯裕星,孙后超,展群岭,谢鹏. 中国人兽共患病学报, 2010(04)
• [10]宁夏地区博尔纳病病毒感染的细胞和分子生物学研究[D]. 刘建. 宁夏医科大学, 2010(02)