陈媛媛[1]（2021）在《长链非编码RNA SCARNA2介导的DNA损伤修复在结直肠癌放疗敏感性中的作用及机制》文中提出一、背景结直肠癌（Colorectal cancer,CRC）是全球第三大最常见的癌症,尽管早期诊断和干预方面的技术进步已经有效改善了结直肠癌的总体生存率,但鉴于结直肠癌高复发率、高转移性及抗癌治疗的耐受性,晚期结直肠癌患者的预后仍然较差。术前放疗是晚期结直肠癌的常规治疗方法之一,但是近三分之一的结直肠癌患者对放疗表现出低敏感性或者完全抵抗。因此,放疗抵抗仍是治疗结直肠癌面临的主要挑战。在“精准医疗”的时代,探索克服放疗抵抗的新靶点或新分子,是个体化治疗结直肠癌患者的重要工具,对于提高结直肠癌患者的总体生存率有十分重要的意义。DNA损伤反应（DNA damage response,DDR）是一种精确的信号级联系统,可以检测DNA损伤并决定受损细胞的命运,是肿瘤生物学研究的重要领域之一,尤其在肿瘤的放疗敏感性调控中起关键作用。肿瘤细胞产生放疗抗性的重要原因是,癌细胞可以识别电离辐射诱导的DNA损伤,并通过激活各种途径修复这些损伤,癌细胞对DNA损伤具有较高的修复活性,因此对放疗产生高度抵抗。结直肠癌的发生也与癌基因、抑癌基因和DNA修复相关基因突变有关,如KRAS、TP53和BRCA1/2突变等,这些突变会引起基因组不稳定性,促进癌变过程。研究显示,靶向DNA损伤修复可以有效提高结直肠癌对放疗的敏感性,但关于DNA损伤修复的调控机制仍不清楚,研究发现了很多新的调控分子在DDR中发挥关键作用。因此,进一步寻找肿瘤中DNA损伤修复异常激活的新靶点或新分子,对于克服放疗抵抗、提高癌症治愈率具有重要意义。长链非编码RNA（Long noncoding RNA,lnc RNA）可以调节多种生物学过程,如细胞周期、细胞分化、X染色体失活、m RNA选择性剪接、RNA转录和翻译等。多项研究表明,lnc RNA失调是结直肠癌发生的主要因素之一,它通过调控其靶基因的表达,影响结直肠癌中的信号通路、癌细胞转移以及对放疗的敏感性。lnc RNA在DNA损伤修复中具有重要作用,它可以通过直接或间接的转录方式与蛋白质、DNA或RNA相互作用,调控DNA损伤修复。因此lnc RNA通过DNA修复通路调控结直肠癌对放疗的敏感性已经成为临床研究的一个重要领域,探索能够通过DDR通路调节结直肠癌放疗抗性的候选lnc RNA及其分子机制,对于改善结直肠癌患者的临床疗效意义重大。但是,目前大多数lnc RNA在DDR中的功能在很大程度上尚未阐明。ATR是检查点信号通路的中心转导因子,它可被DNA损伤和复制应激激活,在DNA损伤修复、细胞周期调节和细胞凋亡中具有广泛的功能和重要的生理意义。基于我们前期发现DNA损伤修复关键分子ATR具有结合lnc RNA能力的认知前提,本课题以此为切入点,利用RNA免疫共沉淀与高通量测序（RIP-seq）筛选出与ATR结合的lnc RNA,然后通过RIP和RT-PCR验证,筛选出与ATR结合丰度最高的SCARNA2,从DNA损伤修复角度,全面探索了它调控结直肠癌放疗敏感性的具体效应及分子机制,为开发潜在的、预测结直肠癌放疗敏感性的标志物和治疗靶点提供了新的科学依据。二、研究内容及方法（一）Lnc RNA SCARNA2在DNA损伤修复中的作用探讨1、RIP-seq筛选ATR结合的lnc RNA首先选用ATR抗体通过RNA免疫共沉淀方法（RNA Binding Protein Immunoprecipitation,RIP）富集与ATR结合的RNA,通过高通量二代测序筛选与ATR结合的lnc RNA,选取排名前30位的lnc RNA,然后通过RIP和RT-PCR的方法验证它们与ATR的相互作用关系,发现SCARNA2与ATR的结合丰度最高,因此将目标靶分子确定为SCARNA2。通过探究SCARNA2在15种细胞系的基础表达量,确定研究细胞系为结肠癌细胞系HCT116和HT29。2、DNA损伤对SCARNA2表达水平的影响将HCT116和HT29细胞经电离辐射（Ionizing radiation,IR）、DNA损伤诱导剂喜树碱（Camptothecin,CPT）或依托泊苷（Etoposide,ETO）处理后,在不同时间点分别提取细胞的RNA,经反转录和RT-PCR检测SCARNA2转录水平的变化。将HCT116和HT29细胞分别与DDR通路抑制剂（DNA-PKcs抑制剂Nu7441、ATM抑制剂Ku-55933、ATR抑制剂VE-821）孵育后,再分别用IR、CPT或ETO处理细胞后,在SCARNA2响应DNA损伤最明显的时间点提取RNA,RT-PCR检测DDR通路抑制剂对SCARNA2转录水平的影响。3、SCARNA2对DNA损伤修复通路的影响通过慢病毒包装质粒系统构建SCARNA2敲低（sh-SCARNA2）、CRISPR Cas9敲除（sg-SCARNA2）和过表达（SCARNA2-OE）稳转细胞系,通过RT-PCR测定下调和过表达效率。通过彗星电泳检测SCARNA2下调细胞照后的DNA损伤程度;通过免疫荧光的方法检测SCARNA2干扰细胞在照后0、0.5、4、8、12和24 h形成γH2AX和53BP1 foci的动态变化情况。最后通过蛋白凝胶电泳（Western Blot,WB）的方法检测SCARNA2下调细胞经IR、CPT或ETO处理后,DDR通路相关蛋白分子的表达水平变化情况。（二）Lnc RNA SCARNA2对ATR及同源重组修复途径的调控作用及机制1、下调SCARNA2对细胞照后基因转录组的影响取对照组和SCARNA2敲除组细胞,通过RNA-seq检测下调SCARNA2对照后基因转录组的影响。2、SCARNA2对非同源末端连接（Nonhomologous end-joining,NHEJ）和同源重组（Homologous recombination,HR）修复方式的影响通过构建I-Sce I-HR/NHEJ报告基因系统测定SCARNA2下调细胞中NHEJ或HR的修复效率。通过免疫荧光检测下调SCARNA2对细胞核中形成RAD51和RPA2 foci的动态变化过程的影响。3、SCARNA2结合蛋白的筛选与鉴定通过RNA pull down实验筛选HCT116细胞中与SCARNA2结合的蛋白复合物,然后通过质谱检测,筛选与SCARNA2结合的蛋白。4、SCARNA2对ATR与HR通路相关蛋白互作情况的影响通过免疫共沉淀的方法探讨SCARNA2对ATR与HR通路相关蛋白互作及蛋白修饰的影响。（三）Lnc RNA SCARNA2促进DNA损伤修复调控结直肠癌放疗敏感性1、SCARNA2对结肠癌细胞放射敏感性的影响采用SCARNA2下调和过表达细胞系,经IR、CPT、ETO等处理后,通过克隆形成率、CCK-8、Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术以及Western Blot检测SCARNA2对结肠癌细胞存活率、增殖能力和细胞活力、细胞凋亡率及细胞凋亡通路相关蛋白表达水平的影响,进而探究SCARNA2对结肠癌细胞放射敏感性的调控作用。通过流式细胞术和Western Blot检测结肠癌细胞经IR、CPT、ETO等处理后,SCARNA2对细胞周期进程以及周期通路相关蛋白水平变化的影响。2、SCARNA2对裸鼠荷瘤（CDX）模型放射敏感性的影响构建人源肿瘤细胞系裸鼠皮下荷瘤模型（Cell derived xenograft,CDX）,通过测量照后裸鼠皮下荷瘤肿瘤的体积,探究SCARNA2对瘤体细胞增殖能力的影响;通过对肿瘤组织进行TUNEL染色,检测SCARNA2肿瘤细胞的凋亡情况;通过对肿瘤组织进行免疫组化染色,探究SCARNA2对HR通路相关分子蛋白表达水平的影响。通过以上体内实验,探究SCARNA2对裸鼠皮下肿瘤放疗敏感性的调控作用。3、SCARNA2在放疗敏感和抵抗的结肠癌组织中的表达差异通过组织芯片荧光原位杂交（Florescence In-Situ Hybridization,FISH）的方法分别检测临床结直肠癌病人放疗敏感和抵抗的肿瘤组织中,SCARNA2、ATR的表达以及二者共定位情况。具体研究内容及方法见技术路线图（图1）图1.技术路线图三、研究结果:（一）Lnc RNA SCARNA2可以促进结肠癌细胞的DNA损伤修复1、通过RIP-seq筛选出与ATR结合的lnc RNA SCARNA2,它在结肠癌细胞中的基础表达量相对较高,并且以时间依赖性的方式响应由IR、CPT和ETO诱导的DNA损伤应答;当使用ATM和ATR抑制剂后,显着抑制了SCARNA2对DNA损伤的响应,说明DNA损伤诱导的SCARNA2上调受ATM/ATR激酶调控。2、下调SCARNA2会显着加重电离辐射导致的DNA损伤,同时延缓了DNA损伤的修复过程;并且抑制了由IR、CPT或ETO诱导的ATR-Chk1通路的激活。（二）Lnc RNA SCARNA2通过HR通路调控DNA损伤修复1、SCARNA2通过HR通路促进DNA损伤修复,下调SCARNA2可以抑制照后HR通路关键修复分子RAD51和RPA2在损伤位点的募集,进而延缓了DNA损伤修复过程。2、SCARNA2结合蛋白主要富集在细胞周期、DNA损伤修复、DNA复制与合成、RNA转录及翻译等通路。SCARNA2的缺失会对细胞周期、细胞凋亡以及DNA损伤刺激反应的相关基因转录组产生影响。此外,下调SCARNA2可以抑制ATR与HR通路相关蛋白如Top BP1、NBS1、Mre11、Chk1等的相互作用。3、SCARNA2的缺失抑制了ATR下游Chk1靶点的磷酸化,其机制可能与Chk1甲基化或泛素化的修饰方式有关。（三）Lnc RNA SCARNA2通过促进DNA损伤修复通路调控结直肠癌的放疗敏感性1、照射和DNA损伤剂处理后,下调SCARNA2可以降低结肠癌细胞的存活能力、增殖能力和细胞活力;促进细胞凋亡,抑制G2/M周期阻滞。2、通过移植瘤内多点注射sg-SCARNA2慢病毒载体,成功下调了瘤体细胞内SCARNA2的表达水平,发现下调SCARNA2可以抑制照后肿瘤的生长速度、促进肿瘤细胞的凋亡,并抑制照后肿瘤细胞的HR修复通路。3、相较放疗敏感的结直肠癌组织,SCARNA2在放疗抵抗的结直肠癌组织中的表达水平高了80%左右（p<0.00001）。四、结论:本研究通过RIP-seq筛选出与ATR结合的lnc RNA SCARNA2,通过一系列的体内外生物学实验发现SCARNA2与结肠癌细胞的DNA损伤修复和放射敏感性密切相关,SCARNA2的缺失可以抑制结肠癌细胞的DNA损伤修复能力。与DNA损伤诱导剂或IR联合使用,可以促进肿瘤细胞凋亡,增加了结肠癌细胞对放射的敏感性。通过对其具体机制的探讨,发现SCARNA2通过HR修复方式参与DNA损伤修复。缺失SCARNA2抑制了ATR下游靶点Chk1的磷酸化,其机制可能与Chk1发生了甲基化或泛素化修饰有关。同时,下调SCARNA2抑制了CDC25C的磷酸酶活性和Wee1的激活,进而通过影响Cyclin B/CDC2复合物的活性抑制G2/M期阻滞,由此明确SCARNA2通过激活ATR-Chk1-CDC25C/Wee1通路调控细胞周期进程。综上所述,SCARNA2有潜力成为结直肠癌的放疗增敏新靶点。此外,SCARNA2在放疗敏感和抵抗的结直肠癌组织中表达差异显着,也有望作为潜在的结直肠癌放疗预后生物标志物。
路晓梅[2]（2021）在《血脂易感基因EEPD1及其相关miR-320b对脂质代谢和动脉粥样硬化的影响及机制研究》文中研究指明背景近年来我国以动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）为病理基础的冠心病（Coronary Artery Disease,CAD）的发病率和死亡率都居高不下,其中血脂代谢异常是AS的独立危险因素,积极控制血脂水平对于CAD的防治有着重大意义。血脂代谢异常发病机制复杂,受遗传和环境的共同影响,遗传因素在其发病过程中起着重要的作用。其中,单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism,SNP）是最常见的一种人类可遗传变异。在遗传学分析中,由于其分布广泛、遗传稳定性高等特点,SNP作为一类遗传标记得以广泛应用。通过研究以SNP为代表的DNA多态性标记与血脂异常以及心血管疾病的关联性,鉴定出相关的易感基因,进而明确基因型和表型的关系,有助于解析疾病的遗传学机制,指导个体化临床治疗。目前大规模的全基因组关联研究（Genome-wide Association Study,GWAS）和外显子组研究已经报道了 400多个影响血脂水平的基因遗传位点。本课题组既往在50万中国和欧美跨种族人群血脂外显子组研究中发现,核酸内切酶/核酸外切酶/磷酸酶家族结构域1（Endonuclease-Exonuclease-Phosphatase Family Domain Containing 1,EEPD1）基因的rs4302748位点与低密度脂蛋白胆固醇（Low Density Lipoprotein-Cholesterol,LDL-c）水平显着关联(P=2.10×10-8)。EEPD1基因是一种DNA5’端核酸内切酶,参与DNA修复,促进DNA双链断裂处的应激复制叉的重新启动,同时EEPD1通过经典非同源末端连接和微量同源介导末端连接抑制DNA损伤修复。已有研究表明EEPD1通过激活腺苷三磷酸结合盒转运体A1（ATP-binding Cassette A1,ABCA1）促进巨噬细胞胆固醇外流,提示EEPD1可能在脂质代谢的调控中发挥重要作用。目的基于上述人群基因组和功能研究证据,本研究拟深入探讨EEPD1基因在体内和体外对血脂代谢的调节作用,阐明EEPD1基因调控血脂代谢的分子机制,为脂质代谢紊乱以及CAD的防治提供科学证据和潜在干预靶点。方法本研究在人群水平、细胞水平和动物水平,分别主要采用定量聚合酶链反应（Quantitative Polymerase Chain Reaction,qPCR）法、蛋白质印记技术（Western Blot,WB）、CRISPR-Cas9技术等来开展研究。1、miRNA-320b靶向EEPD1调控THP-1来源的巨噬细胞胆固醇外流及AS的作用及机制研究。1)人群水平:结合生物信息学分析和转录组芯片数据筛选靶向EEPD1基因的miRNA。首先应用生物信息学分析发现靶向EEPD1基因的miRNAs,随后结合24例CAD患者和7例正常人外周血单个核细胞RNA的miRNA芯片表达谱,筛选差异表达并且靶向EEPD1的miRNA,最后应用qPCR方法在123例CAD患者以及104例正常对照人群的独立大样本中重复验证miRNA及其靶基因的差异表达。2)细胞水平:双荧光素酶报告基因实验明确miRNA与EEPD1基因的靶向作用,进一步在THP-1来源的巨噬细胞中探索其功能。将构建成功的双荧光素酶报告基因野生型以及突变型的pmirGLO-EEPD1/3’-UTR和pmirGLO-ABCG1/3’-UTR分别与 miR-320b mimics共转染HepG2细胞,通过检测荧光强度的变化来验证EEPD1和ABCG1是否为miR-320b的靶基因。qPCR和WB技术检测THP-1来源的巨噬细胞中miR-320b对EEPD1、ABCG1和ABCA1的表达的影响。进一步用荧光强度法检测miR-320b靶向EEPD1/ABCG1对高密度脂蛋白（High-Density Lipoprotein,HDL）和载脂蛋白A1（Lipid-free Apolipoprotein A1,apoA1）诱导的NBD标记的巨噬细胞胆固醇外流率的影响。3)动物水平:构建腺相关病毒2（Adeno Associated Virus Type 2,AAV2）介导的小鼠巨噬细胞靶向过表达miR-320b体系,探索miR-320b在体内对巨噬细胞胆固醇外流及动脉粥样硬化的影响。Apoe-/-小鼠尾静脉注射AAV2-miR-320b或者AAV2-miR-Control,构建AAV2介导的巨噬细胞靶向过表达miR-320b小鼠体系,高脂饮食喂养14周构建AS模型。收集腹腔巨噬细胞检测apoA1以及HDL诱导的胆固醇外流率,油红O染色检测主动脉脂质沉积,主动脉弓石蜡切片免疫组化检测斑块的细胞组成。2.EEPD1基因在血脂代谢中的作用及机制研究1)细胞水平:在肝细胞中明确EEPD1对脂质代谢相关基因的分子调控机制。应用loss-of-function和gain-of-function策略,在肝细胞HepG2中分别过表达和敲低EEPD1,qPCR以及WB检测脂质代谢相关基因mRNA以及蛋白水平的变化。为了进一步探索EEPD1调控脂代谢基因的分子机制,对肝细胞HepG2敲低EEPD1的样本进行基因表达谱芯片分析,结合GO以及KEGG通路分析筛选差异表达的靶基因,进一步通过免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation,CoIP）技术检测EEPD1可能的靶基因蛋白与蛋白之间的相互作用。2)动物水平:构建EEPD1肝脏过表达以及肝脏特异性Eepd1基因敲除小鼠探索其对血脂水平的影响。C57BL/6小鼠尾静脉注射AAV8-EEPD1并高脂饮食6周,构建AAV8介导的肝脏靶向过表达EEPD1的高脂模型;应用CRISPR-Cas9技术构建肝脏特异性Eepd1基因敲除小鼠,高脂饮食16周。qPCR以及WB检测肝脏血脂代谢有关基因mRNA和蛋白水平的变化,胆固醇和甘油三酯测定试剂盒检测血脂水平,肝脏冰冻切片油红O染色检测脂质沉积。结果1.miR-320b靶向EEPD1调控THP-1来源的巨噬细胞胆固醇外流及AS的作用及机制研究1)人群水平:miR-320b在CAD患者中高表达,ABCG1以及EEPD1基因在CAD患者中低表达。生物信息学分析显示miR-320b可以结合EEPD1/ABCG1基因mRNA的3’-UTR。miRNA芯片表达谱分析结果显示,与健康对照相比,miR-320b的表达水平在CAD患者中显着升高,独立大样本qPCR重复验证实验也证实miR-320b在CAD患者中的差异表达,同时也重复验证ABCG1以及EEPD1基因在CAD患者中低表达。2)细胞水平:ABCG1和EEPD1为miR-320b的靶基因,并且参与巨噬细胞胆固醇外流。双荧光素酶报告基因实验证实ABCG1和EEPD1为miR-320b的靶基因,并且miR-320b通过直接靶向ABCG1和EEPD1的表达,以及通过抑制肝X受体α（Liver X Receptorsα,LXRα）-ABCG1/ABCA1 通路来降低 HDL 和 apoA1 介导的 THP-1 来源的巨噬细胞胆固醇外流。3)动物水平:AAV2介导的小鼠巨噬细胞靶向过表达miR-320b具有促AS的作用。AAV2介导miR-320b在Apoe-/-小鼠巨噬细胞中过表达,腹腔巨噬细胞ABCA1、ABCG1和EEPD1的表达水平显着下降,引起巨噬细胞胆固醇外流率下降。肝脏低密度脂蛋白受体（Low Density Lipoprotein Receptor,LDLR）和ABCA1的表达水平下降,导致血浆LDL-c水平升高,HDL-c水平下降。同时,AAV2-miR-320b通过提高巨噬细胞核因子κB（Nuclear Factor-κB,NF-κB）p65的磷酸化水平,增强巨噬细胞分泌促炎因子单核细胞趋化蛋白-1（Monocyte Chemoattractant Protein-1,MCP-1）、白介素-6（Interleukin-6,IL-6）和趋化因子 5（C-X-C Motif Chemokine Ligand5,CXCL5）。miR-320b在小鼠中的过表达最终增加AS斑块面积和斑块中巨噬细胞含量,促进AS的发生发展。2.EEPD1基因在血脂代谢中的作用及机制研究1)细胞水平:EEPD1通过调节细胞色素P450家族1亚家族B1（Cytochrome P450 Family 1 Subfamily B Member1,CYP1B1）、枯草溶菌素转化酶 9（Proprotein Convertase Subtilisin/Kexin Type 9,PCSK9）和LDLR三者蛋白之间的相互作用调控LDLR的蛋白水平。肝细胞HepG2中敲低EEPD1,PCSK9蛋白水平升高,LDLR蛋白水平下降;过表达EEPD1,PCSK9蛋白水平下降,LDLR蛋白水平升高。进一步的肝细胞HepG2的基因表达谱芯片结果、GO通路以及KEGG通路分析结果显示EEPD1可能调控CYP1B1的表达,qPCR以及WB结果证实CYP1B1是EEPD1的靶基因。CoIP实验结果显示EEPD1通过对CYP1B1、PCSK9和LDLR三者蛋白复合物中PCSK9进行蛋白泛素化修饰来调控PCSK9蛋白水平,进而影响LDLR的蛋白水平。2)动物水平:EEPD1基因调控小鼠血脂水平。C57BL/6小鼠肝脏靶向过表达EEPD1可以通过增加肝脏LDLR蛋白表达水平,降低血浆LDL-c水平;增加LXRα和固醇调控元件结合蛋白lc（Sterol Regulatory Element Binding Protein 1c,SREBP1c）的表达,增加肝脏的脂质沉积,通过抑制肝脏Apoe基因的表达,抑制肝脏的VLDL的分泌,降低血浆的TG水平。肝脏特异性Eepd1基因敲除小鼠肝脏LDLR蛋白水平下降,升高血浆LDL-c水平,抑制LXRα-SREBP1c通路减少肝脏的脂质沉积,同时促进肝脏Apoe基因的表达,促进血浆VLDL的分泌,升高血浆TG水平。结论1)MiR-320b通过靶向调控巨噬细胞EEPD1以及ABCG1的表达,以及抑制LXRα-ABCA1/G1通路从而降低apoA1以及HDL介导的巨噬细胞胆固醇外流。2)AAV2介导的Apoe-/-小鼠巨噬细胞靶向过表达miR-320b通过降低腹腔巨噬细胞EEPD、ABCG1和ABCA1的表达水平抑制腹腔巨噬细胞胆固醇外流,同时可以增强炎症反应,升高血浆LDL-c,降低血浆HDL-c水平,增加AS斑块面积以及斑块中巨噬细胞的含量,发挥促AS的作用。3)EEPD1基因在转录水平调控CYP1B1的表达,并且通过对CYP1B1、PCSK9和LDLR三者蛋白复合物中的PCSK9进行蛋白泛素化修饰调控PCSK9蛋白水平的变化,进而影响LDLR的蛋白水平。4)C57BL6小鼠肝脏靶向过表达EEPD1基因能通过抑制PCSK9蛋白的水平,促进肝脏LDLR蛋白表达,降低血浆LDL-c水平;同时激活LXRα-SREBPlc通路,增加肝脏的脂质沉积,抑制肝脏VLDL的分泌,降低血浆TG水平。反之,肝脏Eepd1基因特异敲除小鼠PCSK9蛋白表达水平升高,肝脏LDLR蛋白表达下降,血浆LDL-c水平升高;同时LXRα-SREBP1c通路被抑制,肝脏的脂质沉积减少,促进肝脏VLDL的分泌,升高血浆TG水平。5)EEPD1基因在调控血脂代谢以及AS中具有重要作用,可能为CAD的防治提供科学证据和潜在干预靶点。
傅雅娟[3]（2020）在《cGAS-STING通路介导OAS-RNaseL系统调控外源基因表达机制的研究》文中进行了进一步梳理外源DNA通过病毒感染或瞬时转染入侵细胞后,经过胞吞、运输、入核等一系列过程,DNA编码的外源蛋白开始在胞内表达。哺乳动物细胞可表达多个DNA传感器来感知入侵的外源DNA,促进I型干扰素（type-I interferons,IFNα/β）的表达和分泌,产生大量的干扰素诱导基因（interferon stimulated genes,ISGs）,是宿主防御的第一道防线。细胞如何通过DNA传感器调控外源基因表达,至今仍未完全阐述清楚。环鸟苷酸-腺苷酸合成酶（cyclicGMP-AMP synthase,cGAS）是一种细胞质DNA传感器,与DNA结合后催化合成内源性第二信使——环化二核苷酸cGAMP（cyclicGMP-AMP,cGAMP）;cGAMP结合并激活接头蛋白STING（stimulator of interferon genes）,STING从内质网转移至高尔基体后刺激TBK1和IKK激酶复合物,从而使转录因子IRF3和NF-κB激活并磷酸化,释放干扰素等其他细胞因子,通过干扰素-α/β受体（interferon-α/βreceptor,IFNAR）将信号传递给下游的JAK/STAT（januskinase/signal transducersand activatorsof transcription）通路,以应对外源DNA的入侵。近期相关研究进展报道外源DNA转入细胞后,多个核酸传感器如DAI（DNA-dependent activator of IFN-regulatory factors）、p204（interferon activated gene 204 protein,IFI16）、DHX9（DEx H-Box Helicase 9）能迅速结合DNA,核酸传感器DDX41（DEAD-Box Helicase 41）、DAI和p204的表达均有上调。同时有研究表明质粒DNA激活的cGAS-STING信号通路可引发细胞的抗病毒状态。前人对调控dsDNA进入细胞后外源基因表达的机制研究不够深入。因此,本论文以质粒作为外源dsDNA为研究对象,深入研究cGAS-STING通路对外源基因表达的调控机制;使用cGAS信号级联反应的抑制剂提高多种细胞系和原代细胞（包括T细胞）的外源基因表达,得到以下结果:（1）dsDNA进入细胞后,激活cGAS-STING先天免疫通路,产生I型干扰素和ISGs,降低外源DNA转录产生的m RNA,从而降低外源基因的表达。为确认质粒DNA进入细胞后特异性激活cGAS-STING通路,本研究通过比较WT和Cgas-/-L929细胞,或比较WT、Cgas-/-、Stinggt/gt C57BL/6小鼠的胚胎纤维细胞,或比较WT、Cgas-/-、Stinggt/gt C57BL/6小鼠肺成纤维细胞之间的GFP阳性细胞表达、下游ISGs表达和外源基因在胞内的m RNA和DNA水平,发现与WT相比,cGAS或STING的缺失使细胞中CXCL10、IFIT1、ISG15等ISGs表达被抑制,GFP阳性细胞或荧光素酶表达显着增多至少2倍,EGFP m RNA水平显着上升但细胞内EGFP DNA水平无显着差异。为验证RNA通路是否也能影响外源基因在细胞内的表达,通过比较WT或Mavs-/-L929细胞的GFP阳性细胞数量,或比较WT和Mavs-/-MEF细胞之间的GFP阳性细胞数量,发现与WT相比,MAVS缺失细胞中的EGFP的GFP阳性细胞数量无显着差异。这些结果进一步支持了cGAS-STING途径在抑制转基因表达中的特定作用。（2）cGAS-STING通路的激活产生大量IFNβ,其通过自分泌方式结合IFNAR受体产生下游ISGs从而抑制外源基因的表达。通过检测HT-DNA或poly（I:C）转染细胞产生的条件培养基对WT L929细胞外源基因表达的影响,发现HT-DNA或poly（I:C）条件培养基的预处理能强烈抑制EGFP蛋白的表达。接着用IFNβ重组蛋白,anti-IFNβ抗体或两者的组合对L929细胞进行了预处理,质粒p EGFP-N1转染L929细胞。结果表明加入IFNβ重组蛋白后L929细胞的EGFP蛋白表达量在24小时和48小时均显着降低,加入anti-IFNβ抗体后,EGFP蛋白表达量和GFP阳性细胞数量均有大幅度回补。最后,用重组IFNβ蛋白,anti-IFNAR1抗体或两者的组合对L929细胞进行了预处理,质粒p CMV-Renilla转染处理后的L929细胞。结果与之前一致,来自转染质粒的海肾荧光素酶的表达被IFNβ抑制,并被IFNAR1中和抗体增强。这些研究结果说明cGAS-STING通路激活产生IFN反应,其通过自分泌方式结合IFNAR受体产生下游ISGs从而抑制外源基因的表达。（3）cGAS-STING通路激活OAS-RNaseL信号通路,激活RNaseL降解外源基因的m RNA,从而降低外源基因的表达。通过RNA-Seq技术进行基因表达谱分析,锁定了ISGs中的OAS-RNaseL家族在外源基因表达调控中的重要作用。接着构建OAS1-/-、OAS2-/-、OAS3-/-和RNaseL-/-BJ-5ta细胞,通过质粒p EGFP-N1或p LVX-m Cherry转染细胞后发现当BJ-5ta细胞中敲除OAS1或OAS3或RNaseL时,外源基因表达量显着提高约1.5到3倍;通过检测下游ISGs和外源基因m RNA水平,发现OAS-RNaseL的缺失不影响cGAS-STING通路激活的IFN及ISGs的应答;OAS1、OAS3和RNaseL敲除细胞中外源基因m RNA转录水平显着提高。即OAS1,OAS3或RNaseL的激活导致m RNA降解和转基因表达受到抑制。为直接检测RNaseL的活性,通过过表达RNaseL-Flag的方法,发现质粒p CMV-RNaseL-Flag作为外源DNA激活cGAS-STING通路导致RNaseL-Flag产生切割RNA活性;而cGAS或STING的缺失时质粒无法激活cGAS-STING通路,导致其RNaseL活性未被激活。通过靶向TBK1小分子抑制剂BX795也可充分抑制RNaseL活性。此部分研究阐明了cGAS-STING通路通过分泌IFNβ影响OAS-RNaseL系统从而调控外源基因表达的机制。（4）靶向cGAS级联信号通路的小分子抑制剂提高原代细胞的外源基因表达通过比较靶向cGAS级联信号通路的小分子抑制剂预处理后的L929细胞,或BJ-5ta细胞,或WT、Cgas-/-、Stinggt/gtMEF细胞阳性细胞数量、下游ISGs表达及外源基因在胞内的m RNA水平,发现靶向STING蛋白的小分子抑制剂C-176、C-178,靶向TBK1蛋白的小分子抑制剂BX795、Amlexanox、MRT67307和靶向JAK1/2和JAK3的小分子抑制剂Ruxolitinib、Tofacitinib分别通过抑制STING、TBK1或者JAK1/2和JAK3的活性,从而阻断cGAS-STING通路及下游ISGs通路,增强外源基因m RNA转录水平,最后提高外源基因在细胞内的表达。（5）靶向cGAS级联信号通路的小分子抑制剂增强原代T细胞外源基因表达原代T细胞的转染仍然是基础研究和基因治疗实践中的巨大挑战。在上述研究发现了靶向cGAS级联信号通路的小分子抑制剂可增强原代细胞外源基因表达的基础上,将这些靶向cGAS级联信号通路的小分子抑制剂预处理激活培养T细胞、新鲜PBMC,发现无论是激活培养T细胞、还是新鲜PBMC、或是na（?）ve静息T细胞,靶向cGAS级联信号通路的小分子抑制剂都能显着降低质粒进入细胞后的ISGs的表达,显着增强其外源基因表达,并且培养18天都不影响细胞的生存状态。这些研究结果证明小分子抑制剂的简单预处理可以克服由cGAS-STING途径的激活引起的T细胞转染的困难。综上所述,在本研究中,我们通过探索cGAS-STING介导的DNA传感通路,研究了控制转基因表达的潜在机制。我们发现质粒DNA通过cGAS-STING通路诱导了干扰素反应,其中OAS-RNaseL抗病毒系统的激活是导致m RNA降解和转基因表达受到抑制的主要因素。使用DNA传感通路的信号级联反应的化学抑制剂可有效解除cGAS-STING通路在多种细胞系和包括T细胞在内的原代细胞中转基因表达的抑制作用。本研究初步揭示dsDNA进入细胞后,外源基因受到调控的分子机制,为DNA将来在转染、基因治疗或DNA疫苗的研究及临床应用奠定了坚实的基础。
王昊天[4]（2020）在《自噬通过影响EHF入核调控胰腺癌细胞干性的机制研究》文中提出背景胰腺癌作为一种恶性程度非常高的消化道肿瘤,具有早期病例难以确诊,缺乏有效治疗手段以及极高的病死率等特点,是名副其实的“癌中之王”。细胞自噬是与凋亡并列的一种真核细胞程序性死亡形式,在胰腺癌乏氧乏血供的特殊肿瘤微环境中,胰腺癌细胞的自噬水平是明显上升的,并可能会通过一些尚未明确的机制影响胰腺癌的发生发展和对药物治疗的反应。本课题组已发现EHF（又名ESE3,是ETS转录家族中的一员）在胰腺癌中起着抑癌转录因子的作用,会负向调控胰腺癌的EMT（上皮间质转化）过程,提示EHF可能和胰腺癌细胞的干性特征也存在负向的关系。在本课题预实验中通过RNA测序发现EHF与P62（又名SQSTM1,中文名为选择性自噬接头蛋白）存在表达上的正相关性,P62的表达又与自噬水平的高低息息相关,而自噬在已有的研究中也被认为会影响肿瘤细胞的干性强弱。但是EHF是否真的会影响胰腺癌细胞的干性表达,以及自噬是否参与了这个过程,并且充当了怎样的角色,这些问题目前尚未有人进行过相关研究。因此,我们设计本实验旨在探讨自噬与EHF是否会影响胰腺癌细胞的干性表达水平,以及二者在这个过程中是否存在关联,并明确其中的作用机制,在此基础上希望可以进一步寻求通过影响自噬与EHF的作用而对胰腺癌的治疗起到促进作用的新方法。方法1.体外培养本课题组常用的6种人源胰腺癌细胞系,并收集它们的蛋白质和RNA,通过Western Blot实验和RT-qPCR实验挑选出EHF表达量相对较低和较高的各两种细胞,随后合成EHF过表达和降表达的病毒液,并对之前筛选出的实验细胞进行EHF表达量的对应稳定过表达和降表达。随后继续通过Western Blot实验和RT-qPCR实验对构建的稳定细胞系进行验证。验证成功后,利用流式细胞术的方法检测胰腺癌细胞中ESA、CD24以及CD44三种指标均为阳性的细胞所占整体细胞的数量百分比,同时利用悬浮细胞成球实验和软琼脂克隆形成实验共同分析胰腺癌细胞中EHF表达水平对胰腺癌细胞干性强弱程度的影响。2.提取EHF过表达细胞系和对照组细胞系的RNA,并送至生物测序公司进行RNA序列测序实验,分析在mRNA水平EHF与P62的表达关系。收集96名在天津医科大学肿瘤医院接受了胰腺癌根治术的患者的肿瘤组织蜡块,利用免疫组化染色实验,通过对组化切片中的染色情况进行评分量化,利用卡方检验分析EHF与P62在肿瘤组织中的表达情况,并收集患者对应的临床病理和预后信息,利用Kaplan-Meier生存曲线分析EHF与P62的表达水平与患者无复发生存及总生存之间的关系,同时观察EHF与P62在细胞中的分布情况。在胰腺癌肿瘤组织标本库中随机挑选8对癌与癌旁的配对组织,并分别提取组织的蛋白质和RNA,利用Western Blot和RT-qPCR实验在组织水平研究EHF与P62之间的关系。提取EHF过表达和降表达细胞系及对应对照细胞系的蛋白质和RNA,同样利用Western Blot和RT-qPCR实验在细胞水平研究EHF与P62之间的关系。最后利用ChIP实验和双荧光素酶报告基因实验探索EHF作为转录因子是否通过转录调控的作用影响P62的表达。3.提取EHF过表达和降表达细胞系及对应对照细胞系的蛋白质和RNA,利用Western Blot和RT-qPCR实验在细胞水平研究EHF与胰腺癌细胞自噬水平之间的关系。4.构建过表达和降表达P62的胰腺癌稳定细胞系,并在此基础上构建EHF和P62同时过表达和降表达的稳定细胞系,连同之前已经构建成功的单独过表达和降表达EHF的稳定细胞系和对照细胞系,分别提取这些细胞系的蛋白质和RNA,利用Western Blot和RT-qPCR实验在细胞水平验证稳系构建效果并进一步探讨EHF和P62的上下游关系。在此基础上利用流式细胞术、悬浮细胞成球实验和软琼脂克隆形成实验分析P62对胰腺癌细胞干性强弱程度的影响以及它对于EHF可能存在的反馈性影响作用。5.利用胰腺癌组织切片和胰腺癌细胞体外爬片分别进行免疫荧光染色实验,通过对EHF和P62的同时染色,观察在组织水平和细胞水平二者在空间上是否存在共定位的关系。通过co-IP实验探究EHF与P62在细胞体内是否存在蛋白质之间的相互作用。利用细胞内的核浆蛋白分离实验分析P62是否会影响EHF在细胞内的分布。通过双荧光素酶报告基因实验探索P62是否会影响EHF的转录调控活性。6.利用GST pull-down实验探究EHF与P62是否在细胞体外存在直接的蛋白之间的相互作用。通过NCBI数据库搜索组成EHF与P62的主要结构域的碱基序列,并针对这些结构域构建附加HA或Flag标签的外源性质粒,通过瞬时转染的方法将包含各结构域及标签蛋白的质粒导入工具细胞293T内,利用co-IP实验和Western Blot实验分析EHF与P62之间的相互作用是由各自的哪个结构域进行承担的。7.利用mTOR抑制剂Rapamycin对胰腺癌细胞进行自噬水平的诱导提高,并利用Western blot实验、GFP-RFP-LC3双标荧光自噬流监测系统以及流式细胞术对自噬诱导情况进行检测。通过Western Blot实验和核浆蛋白分离实验分析在自噬水平升高的情况下对于EHF和P62的总量以及各自在细胞内的分布存在怎样的影响。利用流式细胞术、悬浮细胞成球实验和软琼脂克隆形成实验分析自噬对胰腺癌细胞干性强弱程度的影响。通过双荧光素酶报告基因实验探索自噬是否会影响EHF的转录调控活性。8.在给予Rapamycin诱导自噬的情况下,通过外源瞬时转染P62过表达质粒,构建回复实验模型,并行的通过小干扰RNA分别有效降低P62和EHF的表达量,构建阻断实验模型,利用Western Blot实验和RT-qPCR实验验证模型构建是否成功,并通过Western blot实验、GFP-RFP-LC3双标荧光自噬流监测系统以及流式细胞术对自噬诱导情况进行检测。利用流式细胞术、悬浮细胞成球实验、软琼脂克隆形成实验以及双荧光素酶报告基因实验分析自噬是否确实通过P62-EHF这条通路影响胰腺癌细胞的干性表达水平。9.利用生物信息学的KEGG信号通路分析和GSEA基因富集分析寻找EHF调控胰腺癌细胞干性强弱的信号通路。利用Western Blot实验和RT-qPCR实验对筛选出的通路进行上下游的初步验证。再利用有效的信号通路抑制剂构建阻断实验模型,验证模型构建成功后,利用流式细胞术、悬浮细胞成球实验和软琼脂克隆形成实验分析EHF是否确实通过筛选出的信号通路影响胰腺癌细胞的干性表达水平。10.利用EHF过表达的病毒液,构建胰腺癌鼠源细胞系Pan02过表达EHF的稳定细胞系和空白对照细胞系,并对C57BL/6小鼠进行腹股沟区皮下成瘤实验,随后分别给予生理盐水和明确的自噬抑制剂ULK-101进行治疗,观察分析自噬抑制剂对于胰腺癌的治疗作用以及EHF是否可以成为筛选出更好响应自噬抑制剂治疗的患者的生物标志物。在此基础上利用胰腺癌的PDX细胞进行NGS小鼠的皮下成瘤实验,随后分别给予生理盐水、吉西他滨、自噬抑制剂ULK-101以及吉西他滨和ULK-101合用的治疗,观察分析自噬抑制剂和胰腺癌治疗中常用化疗药联合使用在控制胰腺癌发展中的作用情况。结果1.通过对本课题组常用6种人源胰腺癌细胞系进行EHF表达量的检测,挑选出EHF表达量相对较低的PANC-1和MIA PaCa2细胞构建EHF过表达的稳定细胞系,挑选出EHF表达量相对较高的BXPC-3和SW1990构建EHF降表达的稳定细胞系。通过流式细胞术、悬浮细胞成球实验和软琼脂克隆形成实验可以发现EHF具有负向调控胰腺癌细胞干性特征的能力。2.通过RNA测序结果分析发现,EHF与P62在mRNA水平的表达情况存在正相关性。通过免疫组化染色的结果分析发现,EHF与P62在细胞的核与浆中均有分布,而且二者具有染色强度同增同降的趋势,通过染色后评分的统计学分析证实二者表达量的正相关性也是具有统计学意义的,并且二者均对患者的生存起到了保护的作用。通过在体内胰腺癌肿瘤组织以及体外胰腺癌细胞的蛋白水平和RNA水平进行相关实验检测均提示EHF与P62呈表达量正相关的关系。通过数据库分析,发现在P62基因的启动子区具有EHF可能潜在结合的区域,通过染色质免疫共沉淀实验证实EHF确实会结合到P62的启动子区,通过双荧光素酶报告基因实验证实EHF与P62启动子区的这种空间上的结合会最终增强P62的转录活性。3.EHF并不会影响胰腺癌细胞的自噬水平。4.EHF作为转录因子确实会影响P62的表达水平,但是P62作为下游基因并不会影响EHF的表达。P62同样具有负向调控胰腺癌细胞干性特征的能力,但是其影响能力不如EHF的作用大,考虑P62可能以辅助EHF的作用负向调控胰腺癌细胞的干性特征。5.通过对胰腺癌肿瘤组织的切片和胰腺癌细胞体外爬片分别进行免疫荧光发现,EHF与P62确实在细胞的胞核和胞浆中均有分布,而且二者的表达水平呈正相关性,并且两种蛋白在空间存在共定位表现。通过co-IP实验进一步证实在胰腺癌细胞内EHF与P62存在蛋白质之间的相互作用。利用细胞的核浆蛋白分离实验发现,P62在不影响EHF蛋白总量的情况下会影响EHF在细胞内的分布。6.通过GST pull-down实验证实EHF与P62存在直接的蛋白质相互作用。通过构建组成EHF与P62的各主要结构域的且带有特殊标签蛋白的质粒,并利用转染293T工具细胞后的co-IP实验发现EHF通过PNT结构域与P62的ZZ结构域进行结合。7.通过Western blot实验、GFP-RFP-LC3双标荧光自噬流监测系统以及流式细胞术证实mTOR抑制剂Rapamycin确实可以有效提高胰腺癌细胞的自噬水平。而自噬水平提高后并不会影响EHF的总量但会减少P62的总量进而影响EHF在细胞内的分布,并且会降低EHF的转录调控能力,最终正向调控胰腺癌细胞的干性特征。8.通过回复实验和阻断实验证实自噬通过影响P62-EHF这条通路影响胰腺癌细胞的干性特征是有统计学意义的。9.通过生物信息学分析以及Western Blot实验的验证,EHF确实会负向调控Wnt/β-catenin信号通路的活性,利用阻断实验证实EHF会通过调控Wnt/β-catenin信号通路的活性从而有效的影响胰腺癌细胞的干性特征。10.通过对小鼠动物模型植瘤后的治疗实验发现,自噬抑制剂可以有效控制胰腺癌细胞在体内的发展,这种控制效果在EHF表达量高的肿瘤组织中更为明显,而且自噬抑制剂和传统的胰腺癌化疗用药吉西他滨联合使用呈现出对胰腺癌控制加成的作用。结论1.EHF在胰腺癌中是具有抑癌作用的转录因子,对于患者的生存起到了保护的作用,并且可以负向调控胰腺癌细胞的干性特征。2.EHF可以正向转录调控P62的表达,而P62会通过蛋白质之间直接相互作用的方式影响EHF在细胞核中的分布量进而影响EHF的转录调控活性,最终形成正反馈环共同影响胰腺癌细胞的干性特征。3.自噬通过降低P62的表达量进而减少EHF在细胞核中的分布量,最终通过减弱EHF的转录活性,造成下游Wnt/β-catenin信号通路被激活从而提升胰腺癌细胞的干性特征。4.自噬抑制剂可以有效控制胰腺癌细胞的发展程度,和化疗药物吉西他滨联用效果更佳,EHF过表达的胰腺癌细胞对于这种治疗的响应更为明显。
余骏逸[5]（2019）在《全新lncRNA在血管平滑肌细胞表型转换及心肌肥大中的作用和机制研究》文中研究表明背景:高血压是指动脉收缩压高于130mm Hg和（或）舒张压高于80mm Hg的综合征,是诱发卒中、冠心病、慢性肾病、心衰等多种并发症的重要危险因素,严重影响患者的生活质量并给国民经济造成了沉重的负担。高血压血管重构是引起上述并发症的关键病理始动因素,表现为继发于高血压后的血管内膜新生,中膜增厚,管腔狭窄,弹性降低。当高血压血管重构发生时,位于血管壁中层的平滑肌细胞出现表型转换,即从收缩态细胞表型转变为增殖迁移能力更强的增殖分泌态表型,血管平滑肌细胞表型转换同时也是导致血管瘤、动脉粥样硬化等血管疾病的核心病理基础,但其分子机制尚不明确。同时,高血压也是导致心衰的重要危险因素,随着心脏后负荷的增加,心肌细胞出现病理性肥大,失代偿后心脏收缩舒张功能紊乱最终导致心衰,而目前对于病理性心肌肥大的发生和分子机制的认识十分有限。长链非编码RNA（long non-coding RNA,lnc RNA）是近年来发现并得到广泛关注的一类非编码RNA。lnc RNA是指长度超过200nt的不编码蛋白质的RNA,种类繁多,功能多样,能够参与从转录到蛋白翻译后修饰的众多生物学过程中。lnc RNA在生物发育、疾病的发生中的必要作用逐渐得到揭示,在心血管系统中,lnc RNA在心脏发育、心肌再生、动脉粥样硬化、心肌肥大和心肌梗死等生理病理过程中的作用已有报道,但lnc RNA在高血压血管重构中的作用尚不清楚,而更多的参与心肌肥大的lnc RNA也有待研究。为此本课题分为两部分,通过lnc RNA表达谱芯片分别寻找到参与高血压血管重构和心脏后负荷增高诱导心肌肥大的lnc RNA,并深入研究其分子机制,探索其成为新的治疗靶点的潜能。第一部分lnc PSR通过其非编码转录本及编码Arteridin蛋白的双重作用促进血管平滑肌细胞表型转换方法:第一章:1.1使用lnc RNA-m RNA表达谱芯片检测24周龄自发性高血压大鼠（SHR）和正常血压对照大鼠（WKY）胸主动脉组织中差异性表达的lnc RNA,并使用q RT-PCR验证差异表达的lnc RNA。使用RT-PCR检测差异表达lnc RNA的组织表达特异性,重点关注血管组织特异性表达的lnc RNA Phenotype Switching Regulator（PSR）。使用lnc PSR RNA荧光原位杂交（FISH）分析lnc PSR在血管组织血管平滑肌细胞中的定位,并通过血管平滑肌细胞中FISH及核质分离检测lnc PSR亚细胞定位。1.2使用基因组生物信息学工具分析lnc PSR在大鼠、小鼠和人中的保守性,得到对应的序列信息。收集临床高血压血管重构肠系膜动脉标本,使用q RT-PCR验证人lnc PSR表达水平。1.3在血管平滑肌A10细胞中敲降lnc PSR,使用q RT-PCR及蛋白质免疫印迹（WB）检测收缩态蛋白（α-SMA,α-MHC,Calponin）表达的变化;使用CCK8和Ki-67染色实验检测敲降lnc PSR后A10细胞增殖能力的改变;使用细胞划痕实验和细胞小室Trans-well实验检测敲降lnc PSR后A10细胞迁移能力的改变。1.4构建lnc PSR全身敲除大鼠,使用颈动脉球囊损伤模型诱导在体血管平滑肌细胞表型转换,H&E染色检测血管内膜新生水平,Ki-67染色检测血管平滑肌细胞增殖水平。第二章:2.1使用生物信息学工具分析lnc PSR中潜在的开放阅读框（ORF）,并比较该ORF在大鼠、小鼠、人中的保守性,使用二级结构预测工具分析其可能的二级结构。2.2制作特异性抗体,在大鼠不同组织中检测潜在的蛋白表达,根据组织特异性将该蛋白命名为Arteridin。基于Arteridin序列构建带有标签蛋白的过表达载体,在HEK293细胞中验证表达能力。使用免疫荧光检测内源性Arteridin和过表达Arteridin在细胞中的定位。2.3使用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建Arteridin蛋白敲除大鼠,不影响lnc PSR转录本的表达,检测球囊损伤模型后新生内膜情况。将人Arteridin蛋白过表达于大鼠血管平滑肌细胞,检测Arteridin蛋白功能的保守性。使用人Arterdindin抗体,免疫组化检测高血压血管重构组织中Arteridin表达情况。2.4在大鼠血管平滑肌A10细胞中过表达lncPSR全长序列,qRT-PCR检测对收缩态蛋白转录的影响。通过过表达不同突变载体,q RT-PCR检测对收缩态蛋白转录的影响,明确lnc PSR的功能是来源于转录本还是Arteridin蛋白质。在A10细胞中过表达lnc PSR全长序列ATT突变质粒、Arteridin过表达质粒和si-lnc PSR,使用RNA-seq检测对血管平滑肌细胞转录组的影响,证实lnc PSR转录本及Arteridin蛋白质均能促进血管平滑肌细胞表型转换。第三章:3.1使用Arteridin免疫共沉淀（co-IP）结合蛋白质谱（LC-MS）,在血管平滑肌细胞中寻找到Arteridin的结合蛋白YBX1,使用co-IP验证结合。依据YBX1功能结构域,构建YBX1功能结构域删除的过表达载体,使用co-IP明确YBX1具体哪个结构域负责与Arteridin结合。3.2使用腺病毒在大鼠血管平滑肌A7r5细胞中过表达Arteridin-FLAG和YBX1-HA,使用免疫荧光检测二者共定位,及Arteridin-FLAG过表达前后YBX1-HA细胞质细胞核分布的改变。使用WB检测Arteridin-FLAG过表达前后YBX1-HA细胞质细胞核分布的改变。3.3在A7r5细胞中分别使用si RNA敲降YBX1和用腺病毒过表达YBX1,使用q RT-PCR检测血管平滑肌细胞收缩态蛋白基因的表达;使用TGF-β刺激A7r5细胞后,使用q RT-PCR检测YBX1和lnc PSR m RNA水平的改变,看二者是否受同一信号通路调控;最后在A7r5细胞中过表达Arteridin-FLAG,同时敲降YBX1,明确Arteridin发挥功能是否依赖于YBX1。第四章:4.1在A10细胞、A10细胞过表达Arteridin-FLAG和大鼠胸主动脉组织中使用Arteridin抗体进行染色质免疫共沉淀DNA测序（Ch IP-seq）检测Arteridin结合的DNA。4.2使用双荧光素酶报告基因检测Arteridin对lnc PSR自身转录的调控。并使用q RT-PCR检测Arteridin-FLAG过表达后lnc PSR转录水平的改变。4.3使用RNA免疫共沉淀（RIP）检测lnc PSR转录本能否与Arteridin蛋白和YBX1-HA蛋白结合,以及YBX1结合lnc PSR的功能结构域。结果:第一章血管平滑肌细胞特异性lnc RNA PSR的发现鉴定及其在血管平滑肌细胞表型转换中的作用1.1 lnc RNA-m RNA表达谱芯片筛选出了在SHR和WKY大鼠胸主动脉中差异表达（p<0.05,差异倍数>1.2）的39条lnc RNA,通过q RT-PCR验证差异表达lnc RNA。RT-PCR电泳检测lnc RNA在不同组织表达,NR027983（LOC680254基因）特异性表达于血管组织,作为候选我们将其命名为lnc RNA PSR。RNA FISH结合免疫荧光染色标记主动脉中层血管平滑肌细胞（α-SMA）和内皮细胞（v WF）发现lnc PSR主要分布于血管平滑肌细胞。在大鼠血管平滑肌细胞中,FISH和核质分离检测,发现lnc PSR在细胞核细胞质均有分布,更多表达于细胞质。1.2使用UCSC和ENSEMBL分析lnc PSR的物种间保守性,发现lnc PSR在小鼠（NR027984）和人（NR027982）中均有表达。q RT-PCR检测表明在高血压患者发生血管重构的肠系膜动脉中lnc PSR表达的升高。1.3 lnc RNA表达在4周和14周SHR大鼠胸主动脉组织中不升高,在24周龄SHR大鼠出现升高,即高血压稳定存在之后,提示lnc PSR可能参与了高血压血管重构。血管平滑肌细胞表型转换在血管重构中发挥重要作用,使用si RNA在大鼠胸中动脉A10细胞中敲降lnc PSR,q RT-PCR检测发现收缩态蛋白基因表达表达显着上升,WB检测显示蛋白水平也相应升高,提示血管平滑肌细胞收缩态表型得以维持。使用CCK8实验和Ki-67实验检测了lnc PSR敲降后,在基础状态下或PDGF-BB诱导细胞增殖条件下,A10细胞增殖水平降低。细胞划痕实验和细胞小室Trans-well实验,检测PDGF-BB诱导的细胞增殖,发现敲降lnc PSR后,A10细胞迁移能力减弱。1.4通过CRISPR/Cas9基因编辑技术,我们构建了lnc PSR基因敲除大鼠,发现lnc PSR基因敲除大鼠使用颈动脉球囊损伤诱导的内膜新生显着降低,Ki-67染色提示血管平滑肌细胞的增殖水平下降。第二章lnc PSR转录本和其编码的Arteridin蛋白都能促进血管平滑肌细胞表型转换2.1在lnc PSR序列中发现了一段编码117aa的ORF,该ORF在小鼠中同样存在,在人中为一段106aa的ORF。2.2针对大鼠117aa ORF制作抗体,在大鼠不同组织中使用WB检测内源性表达,发现其在主动脉血管组织中特异性表达,分子量为12.9k Da,我们将这段蛋白命名为Arteridin。构建Arterdin带有FLAG或e GFP标签的过表达载体,使用WB检测在HEK293细胞中成功表达,而突变了ATG的载体没有表达。在大鼠胸主动脉A7r5血管平滑肌细胞中,使用免疫荧光检测Arteridin内源性表达和过表达后的细胞分布,发现Arteridin主要表达在细胞核中。2.3使用CRISPR/Cas-9基因编辑工具,我们在大鼠Arteridin起始密码子后插入T碱基形成提前的终止密码子,从而抑制了Arteridin表达而不影响lnc PSR本身的转录。使用颈动脉球囊损伤诱导内膜新生,与WT大鼠相比,Arteridin敲除大鼠中新生内膜显着降低。我们还将人的Arteridin过表达在大鼠A7r5细胞中,发现收缩态蛋白表达下降,提示Arteridin促进血管平滑肌细胞表型转换功能的保守性。使用针对人106aa的Arteridin抗体,免疫组化检测了高血压血管重构患者肠系膜动脉组织中Arteridin表达升高并定位于新生内膜中。2.4在A10细胞中过表达lnc PSR全长序列降低收缩态蛋白的表达,即促进了VSMCs表型转换。为了进一步明确该作用是来源于lnc PSR转录本还是Arteridin蛋白,我们设计了lnc PSR全长序列ATT突变、Arteridin重组蛋白等载体,发现过表达后均能降低收缩态蛋白的表达,表明lnc PSR转录本和Arteridin蛋白均能促进了VSMCs表型转换。最后我们使用RNA-seq在转录组层面证实了这一结论。第三章Arteridin蛋白通过结合YBX1促进血管平滑肌细胞表型转换3.1在Arteridin co-IP联合LC-MS蛋白质谱检测发现在A10细胞中,与内源性Arteridin和过表达的Arteridin结合信号最强的蛋白是YBX1,co-IP验证了二者的结合。人Arteridin和YBX1的结合同样存在,表明Arteridin与YBX1的结合具有保守性。构建YBX1功能结构域删除的过表达载体:YBX1-Del N-HA,YBX1-Del CSD-HA,及YBX1-Del C-HA,co-IP表明YBX1的C端结构域负责与Arteridin蛋白结合。3.2在A7r5细胞中使用腺病毒过表达了YBX1-HA,和Arteridin-FLAG,免疫荧光染色发现在单独过表达YBX1-HA时,YBX1主要分布在细胞质,而当同时过表达Arteridin-FLAG后,YBX1转位到细胞核,与Arteridin共定位形成核内的聚合体。WB检测细胞核和细胞质蛋白,验证了当Arteridin过表达后,YBX1从细胞质向细胞核的转位。3.3在A7r5细胞中单独使用si RNA敲降YBX1,使用腺病毒过表达YBX1,q RT-PCR检测收缩态蛋白基因表达的改变。发现当敲降YBX1后,α-SMA和Calponin表达上升;当过表达YBX1后,α-SMA和Calponin表达下降,这一结果与干预Arteridin一致。在A7r5细胞中过表达Arteridin-FLAG,同时敲降YBX1,逆转了Arteridin过表达对α-SMA和Calponin表达的抑制,表明Arteridin促进血管平滑肌细胞表型转换的作用是依赖于YBX1的。第四章Arteridin蛋白自身调控lnc PSR转录形成正反馈环路4.1在A10细胞中使用Arteridin抗体进行了染色质免疫共沉淀DNA测序（Ch IP-seq）,发现Arteridin能够结合基因组DNA。而其中、Ch IP-seq中Arteridin能够结合lnc PSR基因启动子区域和第二外显子引起了我们的关注。4.2使用了双荧光素酶报告基因系统构建不同长度的lnc PSR启动子区域和第二外显子,发现Arteridin能够通过调控lnc PSR启动子223-666区段促进lnc PSR转录。在A10细胞中过表达Arteridin-FLAG和Arteridin过表达质粒均能升高lnc PSR m RNA水平。4.3在A10细胞中分别过表达Arteridin-FLAG,YBX1-HA以及YBX1删除功能结构域的质粒,使用RIP检测这些蛋白能否与lnc PSR结合,发现Arteridin和YBX1均能与lnc PSR结合,YBX1的CSD结构域及C端结构域参与结合lnc PSR。结论1.1 lnc PSR是特异性表达于血管平滑肌细胞的具有物种间保守性的lnc RNA,在血管平滑肌细胞表型转换中必不可少;1.2 lnc PSR能够编码一段物种间保守的血管组织特异性表达的蛋白质Arteridin,而lnc PSR通过其RNA转录本和Arteridin蛋白双重作用促进血管平滑肌细胞表型转换;1.3 Arteridin结合YBX1,促进YBX1核转位,Arteridin促进血管平滑肌细胞表型转换依赖于YBX1;1.4 Arteridin通过调控lnc PSR启动子区域,促进lnc PSR转录,形成“自身调控”正反馈环路。同时lnc PSR能够结合Arteridin及YBX1蛋白,是Arteridin-YBX1复合物的组成部分。第二部分lnc RNA Ahit通过结合SUZ12抑制MEF2A转录保护心肌肥大的相关研究方法:第一章:1.1使用lnc RNA-m RNA表达谱芯片检测小鼠主动脉横断面缩窄术（TAC）模型诱导心肌肥大2周后心脏组织中差异性表达的lnc RNA,并使用q RT-PCR验证差异表达的lnc RNA。依据组织表达特异性及差异表达倍数选出其中一个候选lnc RNA Ahit;使用生物信息学工具分析Ahit的物种间保守性和编码潜能;1.2在NRCMs心肌细胞中敲降和过表达Ahit,同时使用PE诱导心肌肥大,检测心肌细胞面积、心肌肥大相关基因的表达;1.3使用AAV9-sh RNA在小鼠体内心肌特异性敲降Ahit,检测其对TAC诱导的心肌肥大的影响,心脏重量、超声检测心功能、WGA染色检测心肌细胞面积、马松染色心肌纤维化。第二章:2.1在NRCMs细胞中敲降和过表达Ahit,q RT-PCR和WB检测邻近基因MEF2A的表达变化;2.2使用RNA FISH和核质分离检测Ahit亚细胞分布;使用cat RAPID预测Ahit与PRC2复合物中蛋白组分的结合;使用RIP和RNA pulldown验证Ahit与SUZ12的结合;2.3在NRCMs中使用Ch IP-PCR检测敲降Ahit后,SUZ12结合MEF2A启动子区域的改变以及H3K27me3结合MEF2A启动子区域的改变。结果:第一章lnc RNA Ahit的发现鉴定及其抑制心肌肥大的作用1.1使用lnc RNA表达谱芯片检测TAC 2周后小鼠心脏差异性表达的lnc RNA,并用q RT-PCR验证。其中lnc RNA 4833412C05Rik在TAC过后显着升高,我们将其命名为anti-hypertrophic interrelated transcript（Ahit）。Ahit具有物种间保守性,在人中的同源lnc RNA为LUNAR1,q RT-PCR检测发现LUNAR1高表达于高血压性心脏病患者的血清。1.2在NRCMs细胞中敲降Ahit会加重PE诱导的心肌肥大及心肌肥大相关基因（ANP,BNP,β-MHC等）的表达;而过表达Ahit,会抑制PE诱导的心肌肥大并降低心肌肥大相关基因的表达。1.3使用AAV9-sh RNA在小鼠心脏中敲降Ahit能够加重TAC诱导的心肌肥大、心功能损伤以及心脏组织纤维化。第二章Ahit结合SUZ12抑制MEF2A基因表达进而保护心肌肥大2.1在NRCMs及小鼠心脏中敲降Ahit,其邻近基因MEF2A表达升高。敲降Ahit同时敲降MEF2A,能够抑制心肌肥大和相关基因表达,提示Ahit促进心肌肥大依赖于MEF2A。2.2 RNA FISH及核质分离实验表明Ahit主要分布在细胞核。使用cat RAPID预测Ahit与PRC2复合物中SUZ12结合能力最强,通过RIP及RNA pulldown证明二者的结合。2.3 SUZ12 Ch IP-PCR表明,在NRCMs细胞中敲降Ahit后,SUZ12结合MEF2A启动子区域减弱;相应的MEF2A启动子H3K27me3水平也降低。结论:1.1 lnc RNA Ahit在TAC刺激后代偿性表达升高;1.2 Ahit能够抑制PE及TAC诱导的心肌肥大;1.3 Ahit通过结合SUZ12诱导MEF2A启动子区域H3K27me3,抑制MEF2A转录,进而抑制心肌肥大。
顾锦涛[6]（2019）在《NF-κB-YY1-miR-103a通路在胶质母细胞瘤放疗抵抗中的作用及机制研究》文中研究说明研究背景脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤,其中胶质母细胞瘤（Glioblastoma,GBM,WHO IV级）在脑胶质瘤中约占54%,具有易复发、侵袭能力强的特点,中位生存期只有12-15个月。由于GBM多呈恶性、浸润性生长,外科手术常常难以彻底切除。放射治疗在GBM的治疗中占有极其重要的地位,术后放疗可以有效杀伤残余肿瘤细胞从而延长患者的无进展生存期和总生存期。对于无法进行手术切除的GBM,也能釆取放疗的方法抑制肿瘤细胞生长,改善患者的临床症状和生活质量,且放疗对脑功能的损害也低于外科手术。然而,较其它类型脑胶质瘤患者,GBM患者的放疗效果往往不是很理想,且更易出现放疗抵抗和肿瘤复发。大量文献研究显示,GBM放疗抵抗的发生可能与DNA损伤修复、胶质瘤干细胞（glioma stem cells,GSCs）、自噬以及肿瘤微环境变化等有关,它是一个多因素多环节共同作用的复杂机制过程。因此,系统阐明参与GBM放疗抵抗的病理机制,对于提高GBM患者的放疗敏感性以及抑制患者复发具有重要的临床意义。研究目的寻找参与GBM放疗抵抗的关键分子及相关通路并阐明其作用机制,为增强GBM患者放疗敏感性以及逆转放疗抵抗提供潜在的药物靶点。研究方法1.首先,利用人源肿瘤异种移植模型（Patient-Derived tumor Xenograft,PDX）构建一种能够反映临床病理特征的放疗抵抗模型,并从中分离出放疗抵抗细胞亚群（Radiation-tolerat persister cells,RTP cells）;2.通过CCK-8、克隆形成、3D侵袭、迁移以及m RNA测序等实验明确RTP细胞的生物学功能;3.对PDX放疗抵抗模型进行mi RNAs的差异筛选,发现mi R-103a是显着下调的mi RNA之一,在RTP细胞和TCGA数据中验证mi R-103a的表达情况;4.利用生物信息学、Western Blot、双荧光素酶报告基因、单细胞凝胶电泳以及干细胞球形成等技术系统阐明mi R-103a在RTP细胞中发挥的功能与分子机制;5.通过生物信息学、表观遗传学、转录因子芯片、染色质免疫共沉淀等技术阐明mi R-103a在RTP细胞中下调的分子机制;6.通过CCK-8、克隆形成、免疫荧光、单细胞凝胶电泳以及干细胞球形成等实验明确NF-κB-YY1-mi R-103a通路在RTP细胞中的功能;7.在临床GBM样本中通过免疫组织化学和mi RNA原位杂交等实验评价NF-κB-YY1-mi R-103a通路与患者放疗敏感性、复发的相关性;8.将mi R-103a制备成能够靶向GBM的纳米粒子,并在原位胶质瘤模型中验证其对放射敏感性的影响。研究结果1.我们成功构建了一种能够反映临床病理特征的GBM放疗抵抗PDX模型,并从中分离出了具有放疗抵抗特性的细胞亚群（RTP）,随后证实放疗抵抗细胞亚群具有更强的恶性表型;2.在放疗抵抗的RTP细胞中DNA损伤修复和GSCs自我更新通路发生了最为显着的变化;3.mi RNA差异筛选发现mi R-103a在RTP细胞中显着下调,并在多种细胞系形成的RTP细胞中证实了筛选结果的准确性,TCGA数据库也证实mi R-103a在GBM中低表达;4.过表达mi R-103a能够增强RTP细胞的放疗敏感性,进一步的研究发现mi R-103a能够直接抑制XRCC3和FGF2的表达,一方面XRCC3能够增强GBM细胞的DNA损伤修复能力,另一方面FGF2可以促进GSCs的自我更新,从而形成mi R-103a对RTP细胞DNA损伤修复和GSCs自我更新能力的双重调节;5.NF-κB和YY1是我们筛选得到的在RTP细胞中被显着激活的转录因子,生物信息学分析显示mi R-103a启动子区存在YY1的结合位点,YY1可以抑制mi R-103a的转录,进一步的研究发现活化的NF-κB可以通过促进YY1的转录激活负向调控mi R-103a的表达;6.NF-κB-YY1-mi R-103a通路通过影响DNA损伤修复和GSCs自我更新介导了RTP细胞在放疗抵抗中的功能;7.GBM样本的免疫组织化学以及原位杂交检测结果显示,P65、YY1、FGF2和XRCC3在复发的GBM患者中显着升高,而mi R-103a在复发的GBM患者中显着降低。Spearman相关性分析显示,mi R-103a与FGF2、XRCC3、YY1以及p65的表达水平均呈负相关,而p65与YY1、FGF2及XRCC3均呈正相关,YY1与FGF2及XRCC3也呈正相关,上述相关性分析进一步证实了NF-κB-YY1-mi R-103a通路在GBM患者样本中的存在;8.转铁蛋白修饰的mi R-103a纳米粒子可以通过血脑屏障靶向原位胶质瘤并增强其放疗敏感性。结论我们成功的构建了一种能够模拟临床病理特征的放疗抵抗PDX模型,随后分离出了具有放疗抵抗特性的RTP细胞,并证实RTP细胞中存在NF-κB-YY1-mi R-103a调节通路,即放射治疗可以诱导NF-κB的持续活化,而活化的NF-κB可以促进YY1的转录激活,YY1通过负向调控mi R-103a上调了XRCC3和FGF2的表达水平,XRCC3增强了细胞的DNA损伤修复能力,FGF2增强了GSCs自我更新能力,最终导致了RTP细胞的放疗抵抗。该通路的发现及其分子机制的阐明为增强GBM放疗敏感性以及逆转放疗抵抗提供了潜在的药物靶点。
陶华[7]（2019）在《沉默HDAC6基因通过HSP90抑制食管癌增殖和转移的作机制研究》文中认为背景:在中国十大最常见的恶性肿瘤中,食管癌排名第六,仅次于胃肠道肿瘤的胃癌,呈现双高特征,即高发病率和高死亡率,而且往往呈区域聚集性。中两部卫生资源匮乏的农村尤其高发,食管癌高额的医疗费用仍是当地居民的上要疾病负担,严重的威胁个人的生命健康及生活质量,给家庭、社会带来巨大的影响。随着现代医疗水平突飞猛进的提高,临床上,食管癌的预防、诊治工作也取得了显着的进展,治疗方案的制定需要综合患者的临床分期、全身情况、当地吹院的条件设备及医疗水平等因素。外科手术仍是目前食管癌最重要的治疗手段,然而,局部晚期食管癌患者的预后并不理想。针对有手术机会的ⅡA-Ⅲ期食管鳞癌,单纯手术切除5年生存率低,有待进一步提高。由于食管癌对化疗和放疗敏感性较差,术后化疗或术后放疗均未能有效提高食管癌患者的预后。早期诊治成为改善食管癌患者预后的关键。然而食管癌的病因和发病机制尚不完全明了,基因突变、染色体重排、转录调控及修饰等基因遗传学的改变在食管癌中无疑发挥着极其重要的作用。因此,寻找食管癌特异性相关基因将可能为食管癌的诊断和治疗提供新的理论依据、成为针对该肿瘤的防治关键。表观遗传调控并不涉及DNA序列改变,是一个动态可逆、可遗传的过程,与诸多疾病的关系密切,组蛋白去乙酸化酶（Histone deacetylase,HDACs）、组蛋白乙酰化转移酶（histone acetylase,HATs）,不仅是维持核心组蛋白去乙酰化和乙酰化两者之间稳态的基础,而且有利于染色质状态的调节。进而影响基因的表达,因此,乙酰化调控是表观遗传学调控最重要的方式之一。蛋白家族HDACs有众多的成员。组蛋白脱乙酰化酶6（HDAC6）因其结构中含有两个且功能上独立的HDAC催化结构域,归属于一种比较特殊的HDACs成员。HDAC6的主要作用是催化乙酰化αα-微管蛋白、热休克蛋白90（Heat shock protein 90,HSP90）等非组蛋白的脱酰化效应。而组蛋白酰基化作用并不受控于 HDAC6活性的特异性抑制。通过去除组蛋白的乙酰基和其他转录调控,HDAC6在肿瘤的形成中起着重要作用。分裂周期中,发生在细胞中的不适当脱乙酰化、从细胞质到细胞核的再分配,都可能导致转录抑制,并且异常基因表达从而诱导肿瘤的发生、发展。当下研究的焦点、热点问题之一就是HDACs及其抑制剂。已有大量的研究表明,抑制HDACs的表达或活性成为治疗恶性肿瘤行之有效的分子靶点。越来越多的研究表明,许多恶性肿瘤包括乳腺癌、口腔鳞癌、白血病、肺癌等组织中HDAC6表达异常,表明其在参与肿瘤的形成中起着不愈言说的作用。HSP90是对许多蛋白质的稳定性和功能起至关重要的分子伴侣蛋白,以维持细胞蛋白质稳态和细胞存活。同样,在肿瘤发生过程中,HSP90对肿瘤发展中不可缺少的多种致癌蛋白的稳定性和功能至关重要。HSP90在食管鳞状细胞癌（Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）细胞系中的表达量较正常的食管上皮细胞的表达量明显增加。HSP90抑制剂能阻断食管癌细胞的增殖效应,该抑制剂如17-烯丙胺-17-脱甲氧格尔德霉素（17-allyamino-17-demethoxygeldanamycin,17-AAG）。当 HDAC6沉默、失活或敲除时,作为HDAC6的底物HSP90,将发生高乙酰化作用,从而造成HSP90活性的丧失。联合抑制HDAC6和HSP90显示很好的协同作用,在人白血病细胞中,HDAC6和HSP90的联合抑制在抗癌活性中具有协同作用。HSP90-HDAC6的药物治疗可能是食管癌的一种有前景的策略。然而,迄今为止,国内外尚罕见有关HDAC6基因通过HSP90抑制食管癌增殖及转移的作用机制的研究报道。目的:1、探讨HDAC6基因在食管癌中的表达及临床意义;2、构建慢病毒载体并制备,该载体携带HDAC6基因并将其靶向沉默,奠定了后续体内、外实验工具的基石,该表达系统的应用,以期验证其进行食管癌基因治疗的有效性;3、探讨慢病毒介导靶向HDAC6基因沉默联合HSP90抑制的功能学（食管癌细胞生物学特性）影响,为食管癌临床治疗的新靶向系统最终应用提供实验依据和科学理论。方法:1、HDAC6在食管癌的表达及临床意义分别采集10例食管癌及癌旁组织,qRT-PCR和Western blot方法检测组织中HDAC6 mRNA及HDAC6蛋白的表达情况。另外选取90例食管癌标本,IHC检测食管癌中组织中HDAC6的表达情况,分析HDAC6的表达与食管癌患者临床病理的关系。2、靶向沉默HDAC6基因慢病毒载体的构建和制备2.1根据HDAC6基因（NM0001130416.1）序列为标靶,通过BLAST 同源性分析,设计、选择两段寡核甘酸序列,长度为21 nt,作为以HDAC6基因为靶点的shRNA片段序列,以该序列为模板,即能合成两对DNA单链片段,并以次为引物,经退火、双酶切后,也同样的把pLKO.1-增强型绿荧光蛋白（enhanced green fluorescence protein,EGFP）质粒进行双酶切,连接、转化两种双酶切后的产物,获得2个质粒:以HDAC6基因为模板,合成了 2对长引物单链DNA片段,退火后双消化,同一双消化质粒pLKO。1-增强型绿色荧光蛋白（增强型绿色荧光蛋白,EGFP）2.2 qRT-PCR和Western blot方法检测食管正常上皮细胞系（HEEC-1）及KYSE140、KYSE170和KYSE180三株ESCC细胞系中HDAC6基因的表达情况,将转染稳定的细胞筛出。获得的质粒分别转染ESCC细胞系（KYSE140、KYSE180）,分别用qRT-PCR和Western blot方法检测HDAC6mRNA和HDAC6蛋白的表达水平,以HDAC6基因为靶点,筛选出沉默表达效应最显着的质粒;基于该质粒,通过基因克隆技术,可将携带有 HDAC6 基因靶向沉默的 shRNA 片段-pLKO.1-shRNA（HDAC6）-EGFP慢病毒包装质粒构建。2.3采用 Invitrogen公司的共转染系统,进行制备慢病毒表达载体系统（Lenti-shRNA（HDAC6）-EGFP）及其相关的质量检测,qRT-PCR 和 Western blot分别检测转染后KYSE140、KYSE180细胞株中HDAC6mRNA和HDAC6蛋白的表达。3、慢病毒介导靶向HDAC6基因沉默联合HSP90抑制表达对食管癌细胞生物学特性的影响3.1靶向HSP90-HDAC6抑制对食管癌细胞生物学特性体外实验采用构建的Lenti-shRNA（HDAC6）-EGFP慢病毒表达载体系统感染食管癌细胞株 KYSE140和 KYSE180。3.1.1 CCK-8法检测沉默HDAC6的表达对食管癌细胞增殖的影响;3.1.2 Transwell法检测沉默HDAC6的表达对食管癌细胞迁移运动的影响;3.1.3 CCK-8法检测不同浓度的HDAC6抑制剂 Tuabasin A对食管癌细胞增殖的影响;3.1.4 Transwell法检测不同浓度的Tuabasin A对食管癌细胞迁移运动的影响;3.1.5 Western blot及免疫荧光法检测HDAC6 siRNA、不同浓度的Tubastatin A对α微管蛋白乙酰化的影响;3.1.6 免疫共沉淀法（co-immunoprecipitation,CO-IP）检测 HDAC6 siRNA、不同浓度Tubastatin A对HSP90蛋白乙酰化的影响;3.1.7 Western blot检测不同浓度的HSP90特异性抑制剂 PU-H71、Tubastatin A对下游蛋白质表达的影响;3.1.8 CCK-8法检测HSP90-HDAC6抑制剂对食管鳞癌细胞增殖的影响;3.1.9 Transwell法检测 HSP90-HDAC6抑制剂对食管癌细胞迁移运动的影响;3.1.10 Western blot检测HSP90-HDAC6抑制剂对下游蛋白质表达的影响。3.2 HSP90-HDAC6抑制剂对裸鼠皮下食管癌细胞移植瘤生长抑制作用的实验研究建立食管癌细胞KYSE140移植瘤模型,接种2周成瘤后,根据治疗方式的不同,按照随机数字法,将裸鼠分为PU-H71组、TubastatinA组、PU-H71+TubastatinA组,并设赋形剂为对照组,进行腹腔注射,观察其对荷瘤裸鼠移植瘤生长、瘤体大体标本、存活情况及下游蛋白表达的影响。结果:1、HDAC6在食管癌的表达及临床意义1.1 qRT-PCR法检测HDAC6mRNA在ESCC组织及癌旁组织中的相对表达量分别为（5.13±3.78）VS（2.12±2.04）。较之于癌旁组织,在ESCC组织中HDAC6 mRNA的相对表达量显着增加,差异明显,组间差异比较具有统计学意义（P<0.05）。1.2 Western Blot法检测HDAC6蛋白在ESCC组织及癌旁组织中的相对表达量分别为（2.35±1.64）VS（1.21±0.57）。HDAC6蛋白在ESCC组织中的相对表达量较癌旁组织的相对表达量明显增加,差异具有统计学意义（P<0.05）。1.3免疫组织化学检测结果显示HDAC6阳性表达位于癌细胞核。90份食管鳞状细胞癌组织标本中,62份HDAC6阳性表达,表达率为68.9%。1.4在ESCC患者中,食管癌患者的临床病理分期及淋巴结转移与HDAC6的表达有关（P<0.05）;而性别、年龄、肿瘤位置、肿瘤直径、肿瘤分化、肿瘤浸润深度与HDAC6的表达无关（P<0.05）。2、靶向沉默HDAC6基因慢病毒载体的构建和制备2.1干扰靶点的设计结果人HDAC6特异性shRNA-1序列（正向序列:CCGGGCAGUUAAAUGAAUUCCAUTTCTCGAGAAATGGAATTCACCCAAC TGCTTTTTC、反向序列:AATTGAAAAAGCAGUUAAAUGAAUUCCAUTTCTCGAGAAATGGAATTCA CCCAACTGC）;人HDAC6特异性shRNA-2序列（正向序列:CCGGGGAGUUAACUGGCAGGCAUTTCTCGAGAAATGCCTGCCAGTTAACT CCTTTTTC、反向序列:AATTGAAAAAGGAGUUAACUGGCAGGCAUTTCTCGAGAAATGCCTGCCAG TTAACTCC）。2.2 测序鉴定重组质粒 pLKO.1-shRNA（HDAC6）-EGFP经BLAST软件分析,重组质粒pLKO.1-HDAC6-shRNA测序结果与原始序列比对,设计序列正确插入载体,并无碱基的缺大、突变、移位,证实合成的实验组与对照组干扰靶点均已成功构建成重组质粒,符合预期设计,载体构建成功。2.3采用共转染策略制备经PCR鉴定的Lenti-shRNA（HDAC6）-EGFP慢病毒表达载体系统,确认构建成功,该慢病毒体系具有可重复性好、高滴度、强感染活性的特点。3、HDAC6 siRNA及HDAC6-HSP90 i对食管癌细胞生物学特性的影响3.1 HDAC6 siRNA及HDAC6-HSP90 i对食管癌细胞生物学特性体外实验3.1.1 CCK-8检测了阴性对照组、干扰靶点1和十扰靶点2 组 ESCC细胞系KYSE140和KYSE180细胞的增殖能力。在两株细胞中,较之于阴性对照组,干扰靶点1和干扰靶点2组的细胞增殖率均明显降低,差异显着,具有统计学意义（P<0.05）。3.1.2 Transwell检测了阴性对照组、干扰靶点1和干扰靶点2组ESCC细胞系KYSE140和KYSE180细胞的迁移运动能力。在两株细胞中,较之于阴性对照组,干扰靶点1和干扰靶点2组的细胞穿膜数均显着减少,差异显着,具有统计学意义（P<0.05）。3.1.3一致地,HDAC6抑制剂Tuabasin A,也能抑制食管癌KYSE140细胞和KYSE180细胞的增殖,并呈剂量依赖性。当Tuabasin A的浓度达到500 nM时,较之于阴性对照组,抑制剂组细胞增殖率明显降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。3.1.4一致地,Tuabasin A也能抑制食管癌KYSE140细胞和KYSE180细胞的迁移运动,并呈剂量依赖性。当浓度达到500 nM时,与阴性对照组比较,抑制组细胞穿膜数均显着减少,差异具有统计学意义（P<0.05）,且在食管癌KYSE140细胞中更为明显（P<0.05）。3.1.5 α-微管蛋白是HDAC6的一个靶点,与细胞运动有关。Western blot法检测结果显示,在KYSE140和KYSE180细胞中,干扰靶点1和干扰靶点2组均较阴性对照组表达量增加,差异显着,有统计学意义（P<0.05）。在KYSE140和KYSE180细胞中,阴性对照组、TuabasinA（100 nM）组、TuabasinA（500 nM）组、Tuabasin A（1μM）乙酰化α微管蛋白的相对表达量逐渐增加,差异比较具有统计学意义（P<0.05）。免疫荧光检测中发现,冷诱导微管破坏后,微管被分解,KYSE140和KYSE180细胞中几乎不能观察到微管。与阴性对照组相比,Tuabasin A处理的细胞中检测到更多微管（P<0.05）。3.1.6免疫共沉淀法检测结果显示,在KYSE140和KYSE180细胞中,乙酰化HSP90蛋白在干扰靶点1和干扰靶点2组均较阴性对照组表达增加,差异显着,有统计学意义（P<0.05）。在HDAC6抑制剂的研究中,呈现一致地结果。在KYSE140和 KYSE180 细胞中,阴性对照组、Tuabasin A（100 nM）组、Tuabasin A（500 nM）组、TuabasinA（1 μM）中HSP90蛋白乙酰化量呈现递增的趋势,组间比较差异明显,具有统计学意义（P<0.05）。3.1.7 HSP90抑制剂PU-H71、Tubastatin A调节蛋白质的表达。在KYSE140和KYSE180细胞中,与对照组相比,PU-H71处理的细胞中EGFR、Akt、磷酸激酶和磷酸化ERK水平降低。在KESE140和KYSE180细胞系中,Tubastatin A治疗还可降低蛋白EGFR、AKT、磷酸化AKT（p-AKT）和磷酸化ERK（p-ERK）的表达水平,但抑制的程度较HSP90抑制剂低（P<0.05）。3.1.8 CCK-8检测结果显示,在KYSE140和KYSE180细胞系中,阴性对照组、单独 Tubastatin A（100 nM）、单独 PU-H71（100 nM）、联合 Tubastatin A（100 nM）+PU-H71（100 nM）组的平均细胞增殖率分别为 100.00%、91.45%、78.26%、62.03%,联合Tubastatin A+PU-H71与单独任一种抑制剂治疗相比显着降低了细胞活力（P<0.05）。3.1.9 Transwell检测结果显示,在KYSE140和KYSE180细胞系中,阴性对照组、单独 Tubastatin A（100 nM）、单独 PU-H71（100 nM）、联合 Tubastatin A（100 nM）+PU-H71（100 nM）组细胞穿膜转移数呈逐渐递减的趋势。较之于阴性对照组,抑制剂组细胞穿膜转移数明显减少,差异有统计学意义（P<0.05）。联合Tubastatin A+PU-H71 治疗与单独任一种抑制剂治疗相比显着降低了细胞迁移运动能力（P<0.05）。3.1.10 Western blot检测结果显示,在KYSE140和KYSE180细胞系中,阴性对照组、单独 Tubastatin A（100 nM）、单独 PU-H71（100 nM）、联合 Tubastatin A（100 nM）+PU-H71（100 nM）组EGFR蛋白、p-AKT蛋白、p-ERK蛋白的表达呈逐渐递减的趋势。较之于阴性对照组,抑制剂组EGFR蛋白、p-AKT蛋白、p-ERK蛋白的表达水平降低,差异显着,具有统计学意义（P<0.05）。两种细胞系的实验结果均致的表明,Tuabasin A和PU-H71联合治疗与单独的Tuabasin A或PU-H71治疗相比,EGFR、p-AKT和p-ERK的蛋白表达水平最低。3.2 HDAC6-HSP90 i对食管癌KYSE140细胞荷瘤裸鼠移植瘤的影响3.2.1裸鼠皮下移植瘤的造模选用人食管鳞状细胞癌KYSE140细胞株裸鼠皮下移植,观测移植瘤不同时间段成瘤的大小。裸鼠腹股沟接种区平均2周左右出现移植瘤,3 周后直径约0.2-0.6 cm,接种的所有动物均存活下来,并在体形成了肿瘤,接种点无发热、红肿、破溃等炎症反应。第3周开始,PU-H71+Tubastatin A注射组裸鼠移植瘤直径均明显低于上述其他三对照组移植瘤的直径,差异显着,具有统计学意义（P<0.05）;第6周开始,PU-H71注射组裸鼠移植瘤直径均低于赋形剂注射组、Tubastatin A注射组移植瘤的直径,差异有统计学意义（P<0.05）。仅在 Tuabasin A（10 mg/kg）和 PU-H71（50 mg/kg）联合注射的裸鼠中观察到显着的肿瘤抑制作用。3.2.2观察裸鼠存活情况及皮下移植瘤大体标本对照组、Tuabasin A组、PU-H71组裸鼠活动少,精神状态、食欲差,嗜睡等,而PU-H71组+Tuabasin A组裸鼠活动多,精神状态好,食欲佳。联合PU-H71+Tuabasin A注射显着抑制肿瘤生长,有利于改善裸鼠的生存质量。Tuabasin A和PU-H71联合注射组移植瘤体积较小,瘤体周围能看到较明显完整的包膜形成,形状较规整,有清楚的界限,无明显浸润、粘连的现象,能较完整的剥离肿瘤组织。而瘤体内注射赋形剂、TuabasinA组的裸鼠中,移植瘤的体积则较大,瘤体组织与周围无明显的界限,边缘毛糙,瘤体周围无完整的包膜形成,更有甚至,表面皮肤将受累。3.2.3 HSP90-HDAC6抑制剂对荷瘤裸鼠移植瘤下游蛋白表达的影响荷瘤裸鼠移植瘤中,赋形剂注射对照组、单独Tubastatin A（100 nM）注射组、单独 PU-H71（100 nM）注射组、联合 Tubastatin A（100 nM）+PU-H71（100 nM）注射组瘤体中EGFR蛋白、p-AKT蛋白、p-ERK蛋白的表达呈逐渐递减的趋势。较之于阴性对照组,抑制剂组EGFR蛋白、p-AKT蛋白、p-ERK蛋白的表达水平降低,差异显着,比较具有统计学意义（P<0.05）。与其他三组相比,TuabasinA（10mg/kg）和PU-H71（50 mg/kg）联合注射组裸鼠移植瘤中EGFR、p-AKT和p-ERK蛋白表达水平最低。此外,IHC 分析也显示,Tuabasin A（10 mg/kg）+PU-H71（50 mg/kg）联合注射组可显着抑制荷瘤裸鼠移植瘤中EGFR蛋白的表达。结论:1、HDAC6高表达于食管癌组织中,促进食管癌的发生、发展,有望作为食管癌治疗的重要靶点。2、采用共转染策略制备,成功的将慢病毒穿梭质粒载体构建后,制备了 HDAC6基因靶向沉默表达的Lenti-shRNA（HDAC6）-EGFP重组慢病毒载体,经PCR鉴定和Western blot检测方法,确认构建成功,该慢病毒体系具有可重复性好、高滴度、强感染活性的特点,为进一步开展HDAC6基因的食管癌治疗临床前研究提供了必须的实验工具。3、HSP90作为HDAC6的底物,其配体的活性部分能够被HDAC6介导的脱乙酰化效应激活。构建的HDAC6基因靶向沉默慢病毒载体通过RNAi在体外可有效抑制食管癌细胞系KYSE140和KYSE180的增殖和细胞迁移运动能力,沉默HDAC6之后,HSP90的脱乙酰化效应随着沉默,表现出HSP90的乙酰化过度,从而导致HSP90配体活性散失,两者联合抑制具有协同作用。联合HDAC6抑制剂（TubastatinA）和HSP90抑制剂（PU-H71）与单独任一种抑制剂治疗相比显着降低了食管癌细胞系KYSE140和KYSE180的增殖、细胞迁移运动能力及EGFR、p-AKT和p-ERK的蛋白水平。4、食管癌KYSE140细胞荷瘤裸鼠移植瘤造模成功,HSP90-HDAC6抑制剂显着的抑制肿瘤的生长,有利于改善裸鼠的生存质量,HSP90-HDAC6抑制剂显着降低裸鼠移植瘤中EGFR、p-AKT和p-ERK蛋白表达水平。5、靶向沉默HDAC6基因可能通过HSP90的过度乙酰化有效阻断食管癌中细胞信号传导通路EGFR、p-AKT及p-ERK表达谱的变化,开辟了阐述食管癌发病机制的全新分子生物学学说,临床应用前景呈现出一片大好的趋势。
张亚冉[8]（2017）在《SIRT2基因对牛前体脂肪细胞分化的作用及其转录调控机制研究》文中研究指明Sirtuins家族是调控动物生长发育、衰老及新陈代谢等多方面功能的一组烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+）依赖的蛋白去乙酰化酶,是当今长寿与衰老、癌症及代谢紊乱疾病等相关领域的研究热点。哺乳动物Sirtuins家族包括7个成员,命名为SIRT1-SIRT7;它们有不同的亚细胞定位和功能。其中Sirtuin 2（SIRT2）主要位于胞浆,其通过作用于下游不同的靶蛋白底物在多个生理过程中发挥作用,包括脂肪细胞分化、脂肪酸氧化、胰岛素抵抗和葡萄糖异生等。但目前关于牛SIRT2基因对前体脂肪细胞分化的作用及其转录调控机制仍不清楚。本研究旨在利用腺病毒介导的过表达和干扰技术,从细胞和分子水平研究牛SIRT2基因对前体脂肪细胞分化的作用。通过利用生物信息学方法及双荧光素酶报告载体系统,分析牛SIRT2基因的启动子特征和活性,寻找牛SIRT2基因的核心启动子区域。在此基础上借助于定点突变、电泳迁移率变动分析（electrophoretic mobility shift assay,EMSA）和染色质免疫沉淀（chromatin immunoprecipitation,ChIP）技术,研究SIRT2基因的转录调控机制。主要研究成果如下:（1）克隆获得秦川牛SIRT2基因1173 bp的CDS区,共编码390个氨基酸。构建了牛SIRT2基因的腺病毒过表达载体,经过在HEK 293 A细胞系中包装和扩繁后得到高滴度腺病毒Ad-SIRT2。（2）利用HEK 293 A细胞系,筛选得到一条靶向干扰牛SIRT2基因的干扰效率为的74.7%的shRNA,命名为shRNA-1002。将其与腺病毒骨架载体重组后,在HEK 293A细胞系中包装和扩繁,获得高滴度重组腺病毒Ad-shRNA-1002。（3）利用酶消化法培养获得牛原代前体脂肪细胞。Real-time PCR检测病毒的有效性,结果表明,在牛前体脂肪细胞中Ad-SIRT2处理组比Ad-CMV-NC对照组的SIRT2mRNA表达量提高了316.3倍（P<0.01）,而Ad-shRNA-1002处理组比Ad-shRNA-NC对照组的SIRT2 mRNA表达量降低了68.3%（P<0.01）,表明Ad-SIRT2和Ad-shRNA-1002可分别成功介导牛SIRT2基因的过量表达和沉默。（4）油红O染色结果显示,在牛前体脂肪细胞中过量表达SIRT2基因,抑制细胞中脂滴的积累及前体脂肪细胞的分化。相反,干扰SIRT2基因,促进脂肪细胞中脂滴的累积及前体脂肪细胞的分化。（5）牛前体脂肪细胞诱导分化4 d时,real-time PCR检测过表达和干扰SIRT2基因后调控脂肪细胞分化的关键转录因子及脂滴代谢关键基因的表达情况。结果显示,过量表达SIRT2基因后,转录因子C/EBPα（CCAAT/enhancer-binding proteinα）和PPARγ（peroxisome proliferator-activated receptorγ）mRNA的表达量显着降低（P<0.05）。另外,PPARγ通路下游的脂滴代谢关键基因FABP4（fatty acid binding protein 4）、FAS（fatty acid synthase）和LPL（lipoprotein lipase）的表达量也显着下调（P<0.05）。反之,干扰SIRT2基因后,C/EBPα和PPARγmRNA的表达量显着上调,同样PPARγ通路下游的脂滴代谢关键基因FABP4、FAS和LPL的表达量也显着上调（P<0.05）。但是,不论过表达还是干扰SIRT2对转录因子C/EBPβ、C/EBPδ和SREBP1（sterol regulatory element binding protein 1）的表达无显着影响（P>0.05）。（6）利用5’末端cDNA快速扩增法,发现牛SIRT2基因存在多个转录起始位点,将位于翻译起始位点（ATG）上游85 bp处的鸟嘌呤残基“G”指定为“+1”,与GenBank提供的SIRT2 mRNA参考序列（NM001113531.1）的5’末端位点一致。（7）克隆获得牛SIRT2基因2017 bp（-1956/+61）的5’侧翼序列。5’末端逐段缺失片段的荧光素酶活性分析结果表明牛,牛SIRT2基因的核心启动子区位于-178/+4。生物信息学预测发现,核心启动子区-178/+4存在E2F1、SP1、YY1和XBP1等转录因子结合位点。但没有发现典型的真核启动子元件TATA box和CAAT box,即SIRT2启动子为无TATA box的启动子。（8）通过定点突变转录因子YY1结合位点,发现牛SIRT2基因启动子活性下降约60%（P<0.01）。进一步利用EMSA和ChIP技术分别在体外和体内证实YY1转录因子能够与牛SIRT2基因核心启动子区结合。以上研究结果表明,YY1促进牛SIRT2基因的转录。综上所述,牛SIRT2基因抑制前体脂肪细胞的分化。YY1通过结合于SIRT2核心启动子区正向调控牛SIRT2基因的转录活性。同时,根据之前报道以及本研究结果,绘制了一张YY1、SIRT2通路和PPARγ之间的调控网络草图。总之,本研究结果为解析牛SIRT2基因在牛脂肪细胞分化中的作用提供了科学依据,并在此基础上揭示了SIRT2的启动子特征和转录调控机制,拓宽了脂肪细胞分化相关基因的调控网络。研究结果不仅为深入研究及理解动物脂肪形成和沉积的复杂分子机理提供了理论依据,也为选育高品质肉牛良种奠定了一定的理论基础。
潘昱[9]（2016）在《杆状病毒-腺相关病毒融合病毒介导核素报告基因监测干细胞移植的研究》文中提出目的:在活体条件下实现无创和定量的干细胞监测对优化干细胞移植治疗具有重要意义。本研究通过构建和制备新型的杆状病毒（BV）-腺相关病毒（AAV）融合病毒（BV-AAV）,探讨以此作为转基因载体介导核素报告基因进行干细胞移植监测的可行性,并进一步利用睡美人转座子基因（SB100×）改良BV,评估其介导报告基因进行长期显像的潜力。方法:将增强型绿色荧光蛋白（eGFP）报告基因或人钠碘同向转运体（hNIS）报告基因,构建于一组AAV来源的末端反向重复序列（ITRs）之间,以此制备BV-AAV（分别命名为BIeV和BIhV）。利用BIeV感染大鼠骨髓来源的间充质干细胞（rBM-MSCs）和人脐带血来源的间充质干细胞（hUCB-MSCs）等多种干细胞,测定感染效率、转基因表达水平和持续时间,以及对干细胞的细胞毒性/增殖的影响等。在对BIhV感染的干细胞摄取125I-的特性进行体外研究后,将感染的干细胞移植入裸鼠体内进行hNIS核素报告基因显像。在此基础上引入SB100×以改良BV,利用含不同结构的BV感染肿瘤细胞,经体外对比实验来检验SB100×延长转基因表达时间的功能,并进一步分别利用含eGFP或胰高血糖素样肽-1受体（GLP-1R）报告基因的SB100×改良BV病毒（BSeNV或BSGNV）介导报告基因进行肿瘤细胞移植后的长期显像研究;同时利用含GLP-1R报告基因的BV-AAV（BIGV）感染hUCB-MSCs,并进行移植后的报告基因显像监测。结果:通过杆状病毒表达系统可较快速地制备高滴度病毒（均在108 pfu/mL以上）。体外研究显示,BIeV感染rBM-MSCs和hUCB-MSCs后,介导表达eGFP的阳性细胞比例（eGFP+%）在病毒感染复数（MOI）为200时分别可达到84.25±1.38%和76.73±3.75%,eGFP+%分别在19 d或11 d内逐渐降至10%以下,且BV-AAV对两者的感染未表现出细胞毒性和对细胞增殖的影响。BIhV感染的rBM-MSCs和hUCB-MSCs均可在体外摄取125I-,且均在30 min达到摄取最高峰,该125I-摄取可被高氯酸钠抑制。此外,体外相关性研究显示BIhV感染的干细胞数量与其摄取的125I-放射性计数呈显着的相关性（分别为R2=0.9026和R2=0.9940）。经125I-显像剂和小动物micro-SPECT/CT显像表明,BIhV感染的两类干细胞移植部位均清晰显像,靶/本比高,移植部位放射性信号在120 min内逐渐降低。进一步构建和制备含不同结构的BV并感染肿瘤细胞（FTC-133细胞和U87细胞）,通过流式细胞术等方法对比研究表明,经SB100×改良BV感染和药物筛选获得的肿瘤细胞系（FTC-133-eN细胞和U87-eN细胞）可表达eGFP达180 d;将U87-eN细胞移植入裸鼠后的小动物荧光显像表明,移植部位的细胞可通过eGFP报告基因显像进行35 d的长期监测;将筛选获得的稳定表达GLP-1R的肿瘤细胞系（FTC-133-GN细胞）移植入裸鼠后,经[18F]AlF-NOTA-MAL-Cys39-exendin-4显像剂和小动物micro-PET显像同样获得50 d的GLP-1R报告基因显像监测,肿瘤移植部位清晰显像,靶/本比高,显像剂注射后120 min内未见明显的肿瘤移植部位放射性信号降低;同时,利用携带GLP-1R报告基因的BV-AAV（BIGV）感染hUCB-MSCs,移植后进行小动物micro-PET显像同样可见较理想的显像效果。结论:BV-AAV对rBM-MSCs和hUCB-MSCs的感染效率较高,且无细胞毒性,可介导hNIS报告基因显像监测移植的干细胞,因此利用BV-AAV介导核素报告基因监测干细胞移植具有可行性。同时,经SB100×改良的BV可以介导报告基因长期表达,从而实现移植细胞的长期体内监测;此外,GLP-1R核素报告基因显像效果理想,是具有发展潜力的核素报告基因显像系统。
石朔[10]（2016）在《基于脑胶质瘤骨髓间充质干细胞靶向介导双基因治疗的可视化研究》文中提出目的构建并制备血管特异性启动子（Tie2）及早期生长应答因子1（Egr1）启动下人源性纤溶酶原5（K5）及人钠碘同向转运体（NIS）Lv-Tie2-K5-Egr1-NIS及其对照组Lv-Tie2-K5-Egr1-GFP及Lv-Tie2-GFP-Egr1-NIS慢病毒。分别感染骨髓间充质干细胞（BMSC）获得稳定干细胞系BMSC-K5-NIS、BMSC-K5-GFP及BMSC-GFP-NIS,体外实验探讨Tie2及Egr1启动子的特性及K5、NIS蛋白的功能。体内实验通过SPECT及micro-SPECT/CT观察BMSC作为细胞载体靶向肿瘤迁移的特性、在肿瘤内存活时间及Egr1启动子的功能。治疗实验分为5组,实验组BMSC-K5-NIS细胞,对照组BMSC-K5-GFP、BMSC-GFP-NIS、BMSC细胞,sham组等量PBS,尾静脉注射到荷瘤裸鼠体内。每只裸鼠给予放射性核素188Re,通过动物光学显像及生存时间变化观察各组对颅内脑胶质瘤的治疗作用。Micro-SPECT/CT及免疫荧光组织学检测观察188Re治疗前后骨髓间充质干细胞在脑胶质瘤内的存活情况。方法应用基因重组技术构建并制备Lv-Tie2-K5-Egr1-NIS、Lv-Tie2-K5-Egr1-GFP及Lv-Tie2-GFP-Egr1-NIS慢病毒,感染BMSC,获得稳定干细胞系BMSC-K5-NIS、BMSC-K5-GFP及BMSC-GFP-NIS。Western blot分析K5及NIS蛋白在各细胞系中的表达;动态摄碘观察NIS蛋白的功能和特性。用含188Re的培养液培养BMSC-K5-NIS,Western blot确定188Re诱导NIS蛋白表达的最佳时间及最佳浓度。用CM-Dil荧光活细胞染色液标记HUVEC细胞,不同比例与BMSC-GFP-NIS共培养,流式分析BMSC-GFP-NIS中GFP的平均荧光强度变化。将各干细胞系的培养液与HUVEC共培养,通过克隆实验及transwell细胞迁移实验观察各培养液对HUVEC生长及迁移的影响。用携带荧光素酶报告基因luciferase的慢病毒GV260感染U87细胞,获得稳定U87-Luc细胞系。构建体侧及颅内脑胶质瘤模型,将5×105BMSC-GFP-NIS细胞经尾静脉注入荷瘤裸鼠体内。18.5MBq 131I或188Re对肿瘤进行辐照诱导,SPECT及micro-SPECT/CT观察BMSC-GFP-NIS肿瘤内迁移特性及Egr1启动子的功能,同时观察BMSC-GFP-NIS在肿瘤内的存活时间。构建颅内U87-Luc脑胶质瘤模型,治疗实验分为5组,各组尾静脉分别注射:BMSC-K5-NIS、BMSC-GFP-NIS、BMSC-K5-NIS、BMSC细胞;sham组:等量PBS。每只裸鼠给予37MBq的188Re,隔天1次,共2次。不同时间动物光学显像观察不同组的裸鼠颅内脑胶质瘤大小变化,同时观察不同组裸鼠生存时间的变化。188Re治疗前后micro-SPECT/CT及免疫荧光观察BMSC-GFP-NIS在颅内脑胶质瘤内的存活情况。结果成功构建稳定干细胞系BMSC-K5-NIS,BMSC-K5-GFP及BMSC-GFP-NIS。Western blot显示BMSC-K5-NIS,BMSC-K5-GFP中有K5蛋白表达;BMSC-K5-NIS及BMSC-GFP-NIS中有NIS蛋白表达,且可动态摄碘。0.925MBq/ml 188Re诱导BMSC-K5-NIS 36h NIS蛋白的表达最高。BMSC-GFP-NIS与HUVEC共培养后,平均绿色荧光强度增高（p<0.01）。克隆实验及transwell实验表明,BMSC-K5-NIS及BMSC-K5-GFP培养液可明显抑制HUVEC细胞克隆形成（p<0.01）及细胞迁移（p<0.01）。成功构建U87-Luc细胞系及荷瘤裸鼠模型。BMSC-GFP-NIS细胞经尾静脉注入荷瘤裸鼠,SPECT及SPECT/CT显像发现经131I或188Re辐照后肿瘤部位放射性摄取增加。随着移植时间的延长,裸鼠脑胶质瘤部位及肺组织放射性摄取逐渐降低。体内治疗实验分为5组,经188Re治疗后BMSC组及sham组荷瘤裸鼠肿瘤生长迅速,裸鼠在短时间内死亡;而BMSC-GFP-NIS组及BMSC-K5-GFP组荷瘤裸鼠肿瘤生长均受到一定程度的抑制,且裸鼠生存时间延长;BMSC-K5-NIS实验组荷瘤裸鼠的肿瘤生长抑制明显,生存时间得到延长。188Re治疗前125I micro-SPECT/CT显像观察发现BMSC-GFP-NIS移植后,颅内脑胶质瘤部位125I摄取增高。188Re治疗后颅内脑胶质瘤部位无125I摄取,未进行治疗的裸鼠脑胶质瘤部位125I放射性摄取仍保持较高水平。免疫荧光检测发现188Re治疗前,BMSC-GFP-NIS均匀分布于颅内脑胶质瘤部位,治疗后无BMSC-GFP-NIS分布于脑胶质瘤部位。结论BMSC可携带治疗基因（Lv-Tie2-K5-Egr1-NIS）靶向定位肿瘤组织。与HUVEC细胞共培养后,Tie-2可增加下游基因GFP的表达。188Re可激活Egr1,启动NIS基因表达,促进188Re靶向摄取,形成正反馈,使肿瘤组织摄取足量188Re,达到188Re和K5蛋白的双重靶向抑瘤作用。NIS基因既可作为治疗基因用于脑胶质瘤的治疗,作为报告基因实时监测细胞载体BMSC,同时其有可能作为BMSC细胞载体的安全基因提高其体内应用的安全性,为脑胶质瘤辅助治疗及疗效评估提供新方法。
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 LncRNA SCARNA2在DNA损伤修复中的作用探讨 |
| 一、材料与方法 |
| (一)实验材料 |
| 1、实验细胞 |
| 2、主要实验试剂 |
| 3、主要实验仪器及耗材 |
| 4、抗体信息 |
| (二)实验方法 |
| 1、~(60)Co-γ射线照射 |
| 2、细胞培养与处理 |
| 3、总RNA的提取、纯化及质量评估 |
| 4、RNA的反转录 |
| 5、实时荧光定量PCR(RT-PCR) |
| 6、RNA结合蛋白免疫沉淀(RIP) |
| 7、RIP-seq生信分析 |
| 8、SCARNA2下调(敲低/敲除)和过表达细胞系的构建 |
| 9、蛋白凝胶电泳(Western Blot) |
| 10、中性彗星电泳(Comet Assay) |
| 11、免疫荧光(Immunofluorescence,IF) |
| 12、统计方法 |
| 二、实验结果 |
| (一)ATR结合lncRNA的筛选与验证 |
| 1、RNA免疫共沉淀及高通量测序 |
| 2、ATR结合lncRNA的筛选与验证 |
| (二)SCARNA2的染色体定位及二级结构预测 |
| (三)SCARNA2在不同肿瘤细胞系中表达 |
| (四)结肠癌细胞在应答IR和 DNA损伤诱导剂时SCARNA2转录水平的变化 |
| 1、SCARNA2可以响应IR诱导的DNA损伤 |
| 2、SCARNA2可以响应CPT和 ETO诱导的DNA损伤 |
| (五)DDR通路抑制剂对SCARNA2表达水平的影响 |
| (六)SCARNA2下调和过表达细胞系的构建与验证 |
| (七)下调SCARNA2显着增加结肠癌细胞受到照射后的DNA损伤程度 |
| (八)下调SCARNA2显着抑制照后结肠癌细胞的DNA损伤修复过程 |
| (九)SCARNA2对DNA损伤修复信号通路的影响 |
| 1、下调SCARNA2可以抑制照后DNA损伤修复通路的激活 |
| 2、下调SCARNA2可以抑制由CPT和 ETO诱导的DNA损伤修复通路的激活 |
| 三、讨论 |
| 第二部分 LncRNA SCARNA2对ATR及同源重组修复途径调控作用及机制 |
| 一、材料与方法 |
| (一)实验材料 |
| 1、实验细胞 |
| 2、主要实验试剂 |
| 3、主要实验仪器及耗材 |
| 4、质粒信息 |
| 5、抗体信息 |
| (二)实验方法 |
| 1、真核RNA-seq测序 |
| 2、构建I-Sce I-HR/NHEJ报告基因系统 |
| 3、RNA pull down-MS |
| 4、蛋白免疫共沉淀(IP) |
| 5、其他方法 |
| 二、实验结果 |
| (一)敲除SCARNA2对照后基因转录组的影响 |
| 1、文库质检 |
| 2、基因表达相关性分析 |
| 3、基因差异表达分析 |
| 4、差异表达基因的GO富集分析 |
| 5、差异表达基因的KEGG富集分析 |
| (二)SCARNA2主要通过HR通路修复DNA损伤 |
| (三)下调SCARNA2可以抑制照后HR通路关键修复分子RAD51和RPA2 的募集 |
| (四)SCARNA2结合蛋白的筛选与鉴定 |
| (五)下调SCARNA2可以影响ATR与 HR通路相关蛋白的互作 |
| (六)下调SCARNA2抑制了ATR下游Chk1靶点的磷酸化 |
| 三、讨论 |
| 第三部分 LncRNA SCARNA2促进DNA损伤修复通路调控结直肠癌放疗敏感性 |
| 一、材料与方法 |
| (一)实验材料 |
| 1、实验细胞 |
| 2、实验动物 |
| 3、主要实验试剂 |
| 4、主要实验仪器及耗材 |
| 5、SABER-ISH探针信息 |
| 6、抗体信息 |
| (二)实验方法 |
| 1、克隆形成率 |
| 2、细胞凋亡 |
| 3、细胞增殖/细胞活力 |
| 4、细胞周期 |
| 5、构建裸鼠皮下荷瘤(CDX)模型 |
| 6、移植瘤体内注射慢病毒载体方法 |
| 7、荷瘤裸鼠放射处理 |
| 8、石蜡切片制作实验 |
| 9、石蜡切片免疫组化实验 |
| 10、石蜡切片荧光TUNEL实验 |
| 11、组织芯片荧光原位杂交(FISH) |
| 12、其他方法 |
| 二、实验结果 |
| (一)下调SCARNA2可以降低由IR和 DNA损伤剂诱导的细胞存活率 |
| (二)下调SCARNA2可以增加照射和DNA损伤剂诱导的细胞凋亡 |
| (三)下调SCARNA2可以降低照射后结肠癌细胞的增殖能力和细胞活力 |
| (四)下调SCARNA2可以显着抑制结肠癌细胞经照射和DNA损伤剂诱导的G2/M期阻滞 |
| (五)SCARNA2对结直肠癌荷瘤模型放射敏感性的影响 |
| 1、构建裸鼠皮下荷瘤模型 |
| 2、移植瘤内多点注射慢病毒模型构建成功 |
| 3、下调SCARNA2可以抑制照后裸鼠皮下肿瘤细胞的增殖 |
| 4、下调SCARNA2可以促进照后结肠癌肿瘤细胞的凋亡 |
| 5、下调SCARNA2可以抑制照后结直肠癌肿瘤组织的HR修复 |
| (六)SCARNA2在放疗敏感和抵抗的结直肠癌组织中表达差异显着 |
| 三、讨论 |
| 全文总结及展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附图 |
| 附表一、RIP-seq数据分析软件及参数列表 |
| 附表二、RIP-seq数据库信息 |
| 附表三、RNA-seq测序质量预处理结果 |
| 附表四、ATR结合相关lncRNA列表(前100 位) |
| 附表五、RNA-seq:sg-ctrl(CON vs IR)差异基因(下调) |
| 附表六、RNA-seq:sg-ctrl(CON vs IR)差异基因(上调) |
| 附表七、RNA-seq:sg-SCARNA2(CON vs IR)差异基因(下调) |
| 附表八、RNA-seq:sg-SCARNA2(CON vs IR)差异基因(上调) |
| 附表九、RNA pulldown-MS鉴定的差异蛋白列表 |
| 文献综述 lncRNA在DNA损伤诱导的细胞周期检查点激活中的作用及机制 |
| 参考文献 |
| 在读期间科研成果 |
| 致谢 |
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 microRNA-320b靶向EEPD1调控巨噬细胞胆固醇外流与动脉粥样硬化的作用及机制研究 |
| 一、研究目的与内容 |
| 1.研究目的 |
| 2.研究内容 |
| 二、材料与方法 |
| 1.主要试剂与仪器设备 |
| 1.1 主要试剂 |
| 1.2 主要实验仪器和设备 |
| 2.冠心病病例对照分析研究对象 |
| 2.1 microRNA表达谱芯片样本 |
| 2.2 验证样本中病例组和对照组研究对象的基本信息 |
| 2.3 人群数据收集及检测 |
| 3.主要实验方法 |
| 3.1 外周血单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cells,PBMCs)的分离 |
| 3.2 人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endohelial Cells,HUVECs)的分离 |
| 3.3 细胞培养与传代 |
| 3.4 细胞复苏与冻存 |
| 3.5 细胞总RNA的提取 |
| 3.6 细胞总蛋白的提取 |
| 3.7 蛋白质印记法(Western Blot) |
| 3.8 siRNA转染细胞 |
| 3.9 腺病毒感染细胞及过表达效率分析 |
| 3.10 腺相关病毒的构建以及体内外表达效率的分析 |
| 3.11 双荧光素酶Dual-Luciferase报告基因载体构建 |
| 3.12 荧光素酶Luciferase报告基因实验 |
| 3.13 胆固醇外流率检测 |
| 3.14 细胞内脂质的测定(油红O染色) |
| 3.15 动物模型的建立 |
| 3.16 腹腔巨噬细胞提取和培养 |
| 3.17 酶联免疫吸附(ELISA) |
| 3.18 肝脏组织蛋白质和RNA的提取 |
| 3.19 主动脉全长油红O染色 |
| 3.20 主动脉弓冰冻切片油红O染色 |
| 3.21 主动脉弓石蜡切片CD68/SMC免疫组化染色 |
| 3.22 主动脉弓石蜡切片胶原纤维染色 |
| 4.主要软件和生物信息网站 |
| 4.1 生物学软件 |
| 4.2 生物信息学网站 |
| 5.统计分析方法 |
| 三、实验结果 |
| 1.冠心病miRNA芯片表达谱以及大样本人群验证结果 |
| 1.1 miRNA芯片中冠心病患者以及健康对照的基本信息 |
| 1.2 芯片样本中可能结合EEPD3'-UTR的microRNA的相对表达水平 |
| 1.3 大样本冠心病病例对照PBMCs中差异表达microRNA以及基因的表达水平 |
| 2.hsa-miR-320b在细胞水平的功能探索 |
| 2.1 hsa-miR-320b在不同细胞中的表达水平 |
| 2.2 生物信息学分析miR-320b序列及与ABCA1/ABCG1/EEPD1的关系 |
| 2.3 双荧光报告素酶基因检测miR-320b与ABCA1/ABCG1/EEPD1基因mRNA的3'-UTR结合情况 |
| 2.4 miR-320b对THP-1来源的巨噬细胞ABCA1/ABCG1/EEPD1基因表达的调节作用 |
| 2.5 miR-320b在THP-1来源的巨噬细胞分化为泡沫细胞中的表达水平的变化 |
| 2.6 miR-320b对THP-1来源的巨噬细胞胆固醇外流的调控作用 |
| 2.7 miR-320b对THP-1来源的巨噬细胞胆固醇摄入率的影响 |
| 2.8 miR-320b对THP-1来源的巨噬细胞的胆固醇的酯化水平影响 |
| 3.AAV2介导的Apoe~(-/-)小鼠巨噬细胞靶向过表达miR-320b体系的建立 |
| 3.1 AAV2介导的Apoe~(-/-)小鼠巨噬细胞靶向过表达miR-320b对胆固醇外流率以及胆固醇外流相关基因蛋白水平的影响 |
| 3.2 AAV2介导的Apoe~(-/-)小鼠巨噬细胞靶向过表达miR-320b对血脂水平以及肝脏血脂代谢相关基因在蛋白水平的影响 |
| 3.3 AAV2介导的Apoe~(-/-)小鼠巨噬细胞靶向过表达miR-320b对血浆炎症因子以及相关基因蛋白水平的影响 |
| 3.4 AAV2介导的Apoe~(-/-)小鼠巨噬细胞靶向过表达miR-320b对主动脉脂质沉积的影响 |
| 3.5 AAV2介导的Apoe~(-/-)小鼠巨噬细胞靶向过表达miR-320b对主动脉弓斑块细胞成分的影响 |
| 四、讨论 |
| 研究特色和创新性：人群数据、分子功能学研究以及动物实验模型有机结合 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 EEPD1基因在血脂代谢中的作用及机制研究 |
| 一、研究目的与内容 |
| 1. 研究目的 |
| 2. 研究内容 |
| 二、材料与方法 |
| 1.主要试剂与仪器设备 |
| 1.1 主要试剂 |
| 1.2 主要实验仪器和设备 |
| 2.主要实验方法 |
| 2.1 细胞的培养 |
| 2.2 细胞总RNA的提取以及qPCR引物序列以及siRNA的序列 |
| 2.3 细胞总蛋白的提取以及蛋白质印记 |
| 2.4 siRNA的转染 |
| 2.5 ELISA酶联免疫吸附实验 |
| 2.6 腺病毒的感染以及过表达效率分析 |
| 2.7 免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,CoIP)技术 |
| 2.8 肝脏特异性Eepd1基因敲除小鼠(Eepd1-fl/fl;Alb-Cre/+)小鼠的构建 |
| 2.9 组织脂质的提取 |
| 2.10 肝脏线粒体的分离 |
| 2.11 肝脏谷草转氨酶AST和谷丙转氨酶ALT含量的测定 |
| 2.12 游离脂肪酸的测定 |
| 3.生物信息学网站 |
| 4.统计分析方法 |
| 三、实验结果 |
| 1.细胞水平探索肝细胞HepG2中EEPD1对血脂代谢的影响 |
| 1.1 肝细胞HepG2中EEPD1对血脂代谢有关基因表达的影响 |
| 1.2 基因芯片实验筛选EEPD1的靶基因及其作用通路 |
| 1.3 HepG2中EEPD1调控LDLR表达水平的分子机制探索 |
| 2. 建立AAV8介导的肝脏靶向过表达EEPD1基因的小鼠高脂模型 |
| 2.1 C57BL/6小鼠的基本信息 |
| 2.2 AAV8介导的肝脏靶向过表达EEPD1小鼠高脂模型肝脏脂质代谢相关基因以及血脂水平的变化 |
| 2.3 AAV8介导的肝脏靶向过表达EEPD1小鼠高脂模型肝脏脂肪酸代谢的变化 |
| 2.4 AAV8介导的肝脏靶向过表达EEPD1小鼠高脂模型血浆VLDL-C水平及VLDL分泌相关基因表达水平的变化 |
| 2.5 AAV8介导的肝脏靶向过表达EEPD1小鼠高脂模型血浆谷草转氨酶AST和谷丙转氨酶ALT含量的变化 |
| 3. 肝脏特异性Eepd1基因敲除小鼠血脂异常研究 |
| 3.1 肝脏特异性Eepd1基因敲除小鼠(Eepd1 fl/fl;Alb-Cre/+)基因型的鉴定 |
| 3.2 实验动物的一般情况 |
| 3.3 肝脏特异性Eepd1基因敲除小鼠肝脏脂质代谢相关基因以及血脂水平的变化 |
| 3.4 肝脏特异性Eepd1基因敲除小鼠肝脏脂肪酸代谢的变化 |
| 3.5 肝脏特异性Eepd1基因敲除小鼠血浆VLDL-C水平及VLDL分泌相关基因表达水平的变化 |
| 3.6 肝脏特异性Eepd1基因敲除小鼠血浆谷草转氨酶AST和谷丙转氨酶ALT含量的变化 |
| 四、讨论 |
| 1.体外探索EEPD1基因对脂代谢相关基因表达的调控作用 |
| 2.体内探索EEPD1基因对脂代谢相关基因表达的调控作用 |
| 3.EEPPD1基因对肝脏脂肪酸代谢的影响 |
| 本研究的特色和创新性 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 巨噬细胞在动脉粥样硬化中作用的研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 绪论 |
| 1.1 先天免疫信号通路 |
| 1.1.1 Toll样受体 |
| 1.1.2 细胞质RNA识别通路 |
| 1.1.3 细胞质DNA识别通路 |
| 1.2 cGAS-STING通路及下游通路 |
| 1.2.1 OAS-RNaseL家族 |
| 1.2.2 PKR蛋白 |
| 1.3 国内外研究进展及研究意义 |
| 1.3.1 加深DNA受体对调控外源基因表达的机制的理解 |
| 1.3.2 生物研究及基因治疗临床应用 |
| 第1章 cGAS-STING通路的激活抑制外源基因表达 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 实验材料和方法 |
| 1.2.1 菌株和载体 |
| 1.2.2 细胞系 |
| 1.2.3 实验动物 |
| 1.2.4 主要试剂 |
| 1.2.5 主要仪器 |
| 1.2.6 主要溶液配制 |
| 1.2.7 质粒的转化 |
| 1.2.8 质粒的提取(大量提取) |
| 1.2.9 小鼠胚胎纤维细胞(MEF)的分离 |
| 1.2.10 小鼠肺成纤维细胞的分离 |
| 1.2.11 细胞培养、转染 |
| 1.2.12 Mavs~(-/-)L929细胞株的构建 |
| 1.2.13 流式细胞分析细胞转染EGFP-N1效率 |
| 1.2.14 RT-qPCR检测基因mRNA表达水平 |
| 1.2.15 qPCR检测细胞内基因DNA水平 |
| 1.2.16 蛋白免疫印迹检测蛋白表达 |
| 1.2.17 荧光素酶报告基因的检测 |
| 1.2.18 数据统计与分析 |
| 1.3 实验结果与分析 |
| 1.3.1 cGAS或STING敲除完全抑制IFN及下游ISG表达 |
| 1.3.2 cGAS或STING敲除显着提高外源基因在细胞内的表达 |
| 1.3.3 MAVS基因敲除不影响外源基因在细胞内的表达 |
| 1.3.4 抑制cGAS-STING通路提高外源DNA转录的mRNA水平 |
| 1.4 讨论 |
| 第2章 质粒DNA诱导产生的IFN免疫反应抑制外源基因的表达 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料和方法 |
| 2.2.1 细胞系 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.2.3 HT-DNA或Poly(I:C)条件培养基刺激L929细胞实验 |
| 2.2.4 IFNβ重组蛋白和anti-IFNβ中和抗体刺激L929细胞实验 |
| 2.2.5 IFNβ重组蛋白和anti-IFNAR1中和抗体刺激L929细胞实验 |
| 2.3 实验结果与分析 |
| 2.3.1 HT-DNA或poly(I:C)产生的条件培养基显着抑制外源基因蛋白表达 |
| 2.3.2 IFNβ重组蛋白显着抑制外源基因蛋白表达,anti-IFNβ抗体可回补IFNβ重组蛋白降低的外源基因表达水平 |
| 2.3.3 IFNβ重组蛋白和anti-IFNβ抗体不影响细胞内EGFP DNA水平,IFNβ显着抑制外源基因mRNA转录水平,该过程可被anti-IFNβ抗体回补 |
| 2.3.4 IFNβ重组蛋白显着抑制外源基因蛋白表达,anti-IFNAR1抗体可回补IFNβ重组蛋白降低的外源基因表达水平 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 OAS-RNaseL介导外源质粒的mRNA降解 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料和方法 |
| 3.2.1 菌株和载体 |
| 3.2.2 主要试剂 |
| 3.2.3 主要溶液配制 |
| 3.2.4 Pkr~(-/-) L929细胞株的构建 |
| 3.2.5 RNA-Seq技术检测L929细胞基因表达谱 |
| 3.2.6 CRISPR/Cas9技术构建OAS1~(-/-)、OAS2~(-/-)、OAS3~(-/-)和RNaseL~(-/-) BJ-5ta细胞株 |
| 3.2.7 荧光素酶报告基因检测或流式细胞技术对比WT、OAS1~(-/-)、OAS2~(-/-)、OAS3~(-/-)和RNaseL~(-/-) BJ-5ta细胞株的外源基因表达情况 |
| 3.2.8 RNaseL蛋白免疫沉淀实验 |
| 3.2.9 RNaseL蛋白切割RNA活性检测 |
| 3.2.10 BX795抑制cGAS-STING激活的RNaseL蛋白活性 |
| 3.2.11 Western blot技术检测预处理条件培养基的WT、RNaseL~(-/-) BJ-5ta细胞株外源基因表达实验 |
| 3.3 实验结果与分析 |
| 3.3.1 PKR敲除不影响外源基因在细胞内的表达 |
| 3.3.2 RNA-Seq检测外源质粒进入细胞后变化表达谱 |
| 3.3.3 OAS1~(-/-)、OAS2~(-/-)、OAS3~(-/-)和RNaseL~(-/-) BJ-5ta细胞的构建 |
| 3.3.4 OAS-RNaseL敲除不影响ISGs的表达 |
| 3.3.5 OAS1~(-/-)、OAS3~(-/-)和RNaseL~(-/-) BJ-5ta细胞外源基因表达量显着提高 |
| 3.3.6 外源质粒激活RNaseL蛋白切割RNA的活性 |
| 3.3.7 BX795抑制cGAS-STING激活的RNaseL蛋白活性 |
| 3.3.8 条件培养基的添加不影响RNaseL~(-/-) BJ-5ta细胞的外源基因表达 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 靶向cGAS级联信号通路的小分子抑制剂提高原代细胞的转染效率 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料和方法 |
| 4.2.1 主要试剂 |
| 4.2.2 主要溶液配制 |
| 4.2.3 CCK-8法测定小分子抑制剂对细胞活率影响的实验 |
| 4.2.4 靶向STING蛋白小分子抑制剂C-176、C-178对WT、Cgas~(-/-)、Sting~(gt/gt) MEF细胞外源基因表达影响的实验 |
| 4.2.5 靶向TBK1蛋白的小分子抑制剂BX795、MRT67307、Amlexanox和靶向JAK1/2和JAK3的小分子抑制剂Ruxolitinib、Tofacitinib对L929细胞外源基因表达影响的实验 |
| 4.2.6 靶向TBK1蛋白的小分子抑制剂BX795、MRT67307和靶向JAK1/2和JAK3的小分子抑制剂Ruxolitinib、Tofacitinib对L929,或BJ-5ta细胞,或WT、Cgas~(-/-)、Sting~(gt/gt) MEF细胞外源基因表达影响的实验 |
| 4.3 实验结果与分析 |
| 4.3.1 靶向cGAS级联信号通路的小分子抑制剂细胞毒性的评估 |
| 4.3.2 靶向STING蛋白小分子抑制剂C-176、C-178提高细胞外源基因的表达 |
| 4.3.3 靶向STING蛋白小分子抑制剂C-176、C-178抑制细胞ISGs的表达,增强外源基因的mRNA转录水平 |
| 4.3.4 靶向TBK1蛋白的小分子抑制剂BX795、MRT67307、Amlexanox和靶向JAK1/2和JAK3的小分子抑制剂Ruxolitinib、Tofacitinib抑制细胞ISGs的表达,增强外源基因的mRNA转录和表达水平 |
| 4.4 讨论 |
| 第5章 靶向cGAS级联信号通路的小分子抑制剂在提高T细胞外源基因表达中的应用 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验材料和方法 |
| 5.2.1 细胞系 |
| 5.2.2 主要试剂 |
| 5.2.3 主要仪器 |
| 5.2.4 健康人外周血淋巴细胞PBMC的分离及培养 |
| 5.2.5 靶向cGAS级联信号通路的小分子抑制剂对激活T细胞外源基因表达影响的实验 |
| 5.2.6 靶向cGAS级联信号通路的小分子抑制剂对新鲜PBMC及其中静息na(?)ve T细胞外源基因表达影响的实验 |
| 5.2.7 检测靶向cGAS级联信号通路的小分子抑制剂对CD3+T细胞ISGs表达 |
| 5.3 实验结果与分析 |
| 5.3.1 靶向cGAS级联信号通路的小分子抑制剂增强激活培养T细胞外源基因表达 |
| 5.3.2 靶向cGAS级联信号通路的小分子抑制剂不影响激活CD3+T细胞的细胞活率 |
| 5.3.3 靶向cGAS级联信号通路的小分子抑制剂提高激活CD3+T细胞外源基因转录水平,抑制ISGs表达 |
| 5.3.4 靶向cGAS级联信号通路的小分子抑制剂增强PBMC和na(?)ve静息T细胞外源基因表达 |
| 5.3.5 靶向cGAS级联信号通路的小分子抑制剂提高CD3+T细胞外源基因转录水平,抑制ISGs表达 |
| 5.4 讨论 |
| 第6章 结论 |
| 附录 1 缩略词表 |
| 附录 2 RNA-Seq 差异基因列表 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间承担的科研任务与主要成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、EHF负向调控胰腺癌细胞的干性特征 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 细胞系 |
| 1.1.2 主要抗体 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 主要耗材 |
| 1.1.5 主要仪器设备 |
| 1.1.6 主要试剂的配制 |
| 1.1.7 实验方法及步骤 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 EHF在不同胰腺癌细胞系中的基础表达量不同 |
| 1.2.2 成功构建EHF过表达和降表达的稳定细胞系 |
| 1.2.3 EHF负向调控胰腺癌细胞的干性特征 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 二、EHF正向转录调控P62在胰腺癌中的表达 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 细胞系 |
| 2.1.2 组织标本 |
| 2.1.3 主要抗体 |
| 2.1.4 主要试剂 |
| 2.1.5 主要耗材 |
| 2.1.6 主要仪器设备 |
| 2.1.7 主要试剂的配制 |
| 2.1.8 实验方法及步骤 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 RNA测序结果显示EHF与P62的mRNA表达量呈正相关 |
| 2.2.2 EHF与P62在组织标本中的表达量呈正相关并且是患者预后的保护因素 |
| 2.2.3 EHF与P62在组织蛋白和RNA水平的表达量呈正相关 |
| 2.2.4 EHF与P62在细胞蛋白和RNA水平的表达量呈正相关 |
| 2.2.5 EHF直接调控P62的转录翻译 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 三、EHF不影响胰腺癌细胞的自噬水平 |
| 3.1 对象和方法 |
| 3.1.1 细胞系 |
| 3.1.2 主要抗体 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.1.4 主要耗材 |
| 3.1.5 主要仪器设备 |
| 3.1.6 主要试剂的配制 |
| 3.1.7 实验方法及步骤 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 EHF与P62在细胞蛋白和RNA水平的表达量呈正相关 |
| 3.2.2 EHF不影响胰腺癌细胞的自噬水平 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 四、P62辅助EHF负向调控胰腺癌细胞的干性特征 |
| 4.1 对象和方法 |
| 4.1.1 细胞系 |
| 4.1.2 主要抗体 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.1.4 主要耗材 |
| 4.1.5 主要仪器设备 |
| 4.1.6 主要试剂的配制 |
| 4.1.7 实验方法及步骤 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 EHF会正向影响P62的表达量而P62不会影响EHF的表达量 |
| 4.2.2 P62同样可以负向调控胰腺癌细胞的干性特征,但是影响能力弱于EHF |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 五、P62以蛋白互作的方式影响EHF在细胞内的分布 |
| 5.1 对象和方法 |
| 5.1.1 细胞系 |
| 5.1.2 组织标本 |
| 5.1.3 主要抗体 |
| 5.1.4 主要试剂 |
| 5.1.5 主要耗材 |
| 5.1.6 主要仪器设备 |
| 5.1.7 主要试剂的配制 |
| 5.1.8 实验方法及步骤 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 EHF与P62无论是在组织水平还是细胞水平均存在空间上的共定位 |
| 5.2.2 EHF与P62在细胞内存在蛋白之间的相互作用 |
| 5.2.3 P62在不影响EHF总量的情况下影响了EHF在细胞内的分布 |
| 5.2.4 P62通过影响EHF进入细胞核的数量最终影响了EHF的转录调控活性 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 六、EHF通过PNT结构域与P62的ZZ结构域直接结合 |
| 6.1 对象和方法 |
| 6.1.1 细胞系 |
| 6.1.2 主要抗体 |
| 6.1.3 主要试剂 |
| 6.1.4 主要耗材 |
| 6.1.5 主要仪器设备 |
| 6.1.6 主要试剂的配制 |
| 6.1.7 实验方法及步骤 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 EHF与P62存在直接的蛋白相互作用 |
| 6.2.2 成功构建带有标签的EHF与P62全长及各自主要结构域的质粒 |
| 6.2.3 带有HA标签的EHF蛋白与带有Flag标签的P62蛋白依然存在相互作用 |
| 6.2.4 EHF通过PNT结构域与P62蛋白发生相互作用 |
| 6.2.5 P62通过ZZ结构域与EHF蛋白发生相互作用 |
| 6.2.6 EHF的PNT结构域与P62的ZZ结构域直接发生相互作用 |
| 6.2.7 通过竞争性抑制结合实验证实PNT结构域与ZZ结构域的重要性 |
| 6.2.8 突变掉PNT或ZZ结构域将阻断EHF与P62之间的相互作用 |
| 6.2.9 突变掉PNT或ZZ结构域将阻断P62影响EHF在细胞内分布的作用 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 小结 |
| 七、自噬通过降低P62的表达影响胰腺癌细胞的干性特征 |
| 7.1 对象和方法 |
| 7.1.1 细胞系 |
| 7.1.2 主要抗体 |
| 7.1.3 主要试剂 |
| 7.1.4 主要耗材 |
| 7.1.5 主要仪器设备 |
| 7.1.6 主要试剂的配制 |
| 7.1.7 实验方法及步骤 |
| 7.2 结果 |
| 7.2.1 自噬水平提高后会降低P62的表达但不会影响EHF的含量 |
| 7.2.2 自噬水平提高后会通过降低P62的表达来影响EHF在细胞内的分布 |
| 7.2.3 自噬通过减少EHF进入细胞核的数量最终降低了EHF的转录调控活性 |
| 7.2.4 自噬可以正向调控胰腺癌细胞的干性特征 |
| 7.3 讨论 |
| 7.4 小结 |
| 八、通过回复和阻断实验证实自噬—P62—EHF通路的意义 |
| 8.1 对象和方法 |
| 8.1.1 细胞系 |
| 8.1.2 主要抗体 |
| 8.1.3 主要试剂 |
| 8.1.4 主要耗材 |
| 8.1.5 主要仪器设备 |
| 8.1.6 主要试剂的配制 |
| 8.1.7 实验方法及步骤 |
| 8.2 结果 |
| 8.2.1 通过诱导自噬后回复P62证实自噬确实通过影响P62的含量最终调控胰腺癌细胞的干性特征 |
| 8.2.2 通过阻断P62的实验证实自噬确实通过影响P62的含量最终调控胰腺癌细胞的干性特征 |
| 8.2.3 通过阻断EHF的实验证实自噬确实通过EHF的介导最终调控胰腺癌细胞的干性特征 |
| 8.3 讨论 |
| 8.4 小结 |
| 九、EHF通过下调Wnt/β-catenin通路影响胰腺癌干性表达 |
| 9.1 对象和方法 |
| 9.1.1 细胞系 |
| 9.1.2 主要抗体 |
| 9.1.3 主要试剂 |
| 9.1.4 主要耗材 |
| 9.1.5 主要仪器设备 |
| 9.1.6 主要试剂的配制 |
| 9.1.7 实验方法及步骤 |
| 9.2 结果 |
| 9.2.1 通过生物信息分析发现Wnt/β-catenin通路会介导EHF对胰腺癌细胞干性特征的调控作用 |
| 9.2.2 在胰腺癌细胞中EHF的表达水平与Wnt/β-catenin通路的活性呈负相关 |
| 9.2.3 成功构建阻断Wnt/β-catenin通路的细胞模型 |
| 9.2.4 外源性阻断Wnt/β-catenin通路可以有效的抑制由于EHF水平降低所造成的胰腺癌细胞上调的干性特征 |
| 9.3 讨论 |
| 9.4 小结 |
| 十、EHF高表达是提高抗自噬治疗效果的标记 |
| 10.1 对象和方法 |
| 10.1.1 细胞系 |
| 10.1.2 实验动物 |
| 10.1.3 主要抗体 |
| 10.1.4 主要试剂 |
| 10.1.5 主要耗材 |
| 10.1.6 主要仪器设备 |
| 10.1.7 主要试剂的配制 |
| 10.1.8 实验方法及步骤 |
| 10.2 结果 |
| 10.2.1 成功构建EHF过表达的Pan02稳定细胞系 |
| 10.2.2 自噬抑制剂ULK-101可以有效抑制肿瘤的发展并且在EHF表达水平高的细胞中表现出了更强的抑瘤作用 |
| 10.2.3 ULK-101与吉西他滨联用可以提高动物模型中胰腺癌的治疗效果 |
| 10.3 讨论 |
| 10.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 综述 细胞自噬及其与肿瘤关系的研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 缩略语表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一部分 lnc PSR通过其转录本及编码Arteridin蛋白的双重作用促进血管平滑肌细胞表型转换及其分子机制研究 |
| 前言 |
| 第一章 血管平滑肌细胞特异性lncRNA PSR的发现鉴定及其在血管平滑肌细胞表型转换中的作用 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 实验材料 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 结果 |
| 1.5 讨论 |
| 1.6 小结 |
| 第二章 lncPSR转录本和其编码的Arteridin蛋白都能促进血管平滑肌细胞表型转换 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.4 结果 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 Arteridin蛋白通过结合YBX1 促进血管平滑肌细胞表型转换 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.4 结果 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 Arteridin蛋白自身调控lncPSR转录形成正反馈环路 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.4 结果 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第一部分 全文总结 |
| 第二部分 lnc RNA Ahit通过结合SUZ12 抑制MEF2A转录保护心肌肥大的相关研究 |
| 前言 |
| 第五章 lncRNA Ahit的发现鉴定及其抑制心肌肥大的作用 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.4 结果 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 小结 |
| 第六章 Ahit发挥分子支架作用结合SUZ12 抑制MEF2A基因表达进而抑制心肌肥大 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 实验材料 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.4 结果 |
| 6.5 讨论 |
| 6.6 小结 |
| 第二部分 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 编码-非编码RNA及其在心血管系统中的作用研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在读期间发表的文章与科研成果 |
| 致谢 |
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 第一部分 GBM放疗抵抗PDX模型的构建及鉴定 |
| 引言 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 miR-103a在放疗抵抗中的作用及机制 |
| 引言 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第三部分 NF-κB-YY1对miR-103a的调控作用及机制 |
| 引言 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第四部分 miR-103a纳米粒子对GBM的治疗作用 |
| 引言 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 HDAC6基因在食管癌中的表达及临床意义 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 组织来源及患者资料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 1.4 主要方法 |
| 1.5 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 HDAC6 mRNA在食管癌组织及癌旁组织中的表达水平 |
| 2.2 食管癌组织及癌旁组织中的HDAC6蛋白的表达水平 |
| 2.3 免疫组织化学检测结果 |
| 2.4 食管癌组织中HDAC6的表达水平与食管癌临床病理特征关系 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二章 靶向沉默HDAC6基因shRNA慢病毒载体的构建和制备 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 细胞株 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 载体及细胞 |
| 1.4 主要仪器及耗材 |
| 1.5 主要溶液配制 |
| 1.6 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 干扰靶点设计结果 |
| 2.2 重组质粒pLKO.1-HDAC6-shRNA测序鉴定 |
| 2.3 HDAC6 mRNA在食管鳞状细胞癌系中的表达 |
| 2.4 HDAC6蛋白在食管鳞状细胞癌系中的表达 |
| 2.5 慢病毒干扰后KYSE140和KYSE180细胞中HDAC6 mRNA和蛋白的表达 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 HDAC6 siRNA及HDAC6-HSP90 i对食管癌细胞生物学特性的影响 |
| 第一节 HDAC6 siRNA及HDAC6-HSP90 i对食管癌细胞的体外实验研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 主要方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 沉默HDAC6的表达抑制食管癌细胞增殖 |
| 2.2 沉默HDAC6的表达抑制食管癌细胞的迁移运动 |
| 2.3 HDAC6抑制剂Tuabasin A抑制食管癌细胞增殖 |
| 2.4 HDAC6抑制剂Tuabasin A抑制食管癌细胞迁移运动 |
| 2.5 HDAC6siRNA及Tubastatin A增加α微管蛋白的乙酰化作用 |
| 2.6 HDAC6siRNA及Tubastatin A增加HSP90的乙酰化作用 |
| 2.7 HSP90抑制剂和TubastatinA调节下游蛋白质的表达 |
| 2.8 HSP90-HDAC6抑制剂对食管鳞癌细胞增殖的影响 |
| 2.9 HSP90-HDAC6抑制剂对食管鳞癌细胞迁移的影响 |
| 2.10 HSP90-HDAC6抑制剂对下游蛋白表达的影响 |
| 第二节 HDAC6siRNA及HDAC6-HSP90 i对食管癌细胞的体内实验研究 |
| 1 材料及方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 裸鼠皮下移植瘤模型建立 |
| 2.2 HSP90-HDAC6抑制剂对荷瘤裸鼠移植瘤下游蛋白表达的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 HSP90相关性抑制剂的研究进展 |
| 参考文献 |
| 英文缩略词表 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
| 攻读博士学位期间参编的书籍 |
| 攻读博士学位期间获得奖项 |
| 作者简历 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 脂肪组织与脂肪细胞的研究进展 |
| 1.2.1 脂肪组织的分类、功能及分布 |
| 1.2.2 脂肪细胞的种类和特点 |
| 1.2.3 脂肪组织和脂肪细胞的起源 |
| 1.2.4 脂肪发生 |
| 1.2.5 研究脂肪细胞分化的细胞模型 |
| 1.3 前体脂肪细胞分化的转录因子 |
| 1.3.1 C/EBPs |
| 1.3.2 PPARγ |
| 1.3.3 SREBP-1c/ADD |
| 1.3.4 其他转录因子 |
| 1.4 Sirt2 与脂肪细胞分化 |
| 1.4.1 哺乳动物Sirtuins家族简介 |
| 1.4.2 SIRT2 调控脂肪细胞分化研究进展 |
| 1.5 SIRT2 基因转录调控研究进展 |
| 1.6 基因功能的研究方法 |
| 1.6.1 表达载体系统 |
| 1.6.2 RNA干扰 |
| 1.7 基因转录调控分析方法 |
| 1.7.1 确定转录起始位点的方法 |
| 1.7.2 缺失和突变 |
| 1.7.3 电泳迁移率调变动分析 |
| 1.7.4 染色质免疫共沉淀 |
| 1.8 本研究的目的、意义和内容 |
| 1.8.1 研究目的和意义 |
| 1.8.2 研究内容 |
| 第二章 牛SIRT2 基因重组腺病毒过表达载体的构建及病毒包装 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 主要仪器 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 组织样 |
| 2.1.4 载体 |
| 2.1.5 细胞和菌 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 牛脂肪组织总RNA的提取及反转录 |
| 2.2.2 克隆SIRT2 基因CDS序列引物的设计与合成 |
| 2.2.3 SIRT2 完整CDS区的克隆 |
| 2.2.4 胶回收PCR扩增获得的SIRT2 基因CDS区 |
| 2.2.5 SIRT2 基因的亚克隆 |
| 2.2.6 重组穿梭载体pAdTrack-CMV-SIRT2 的构建与鉴定 |
| 2.2.7 pAd-SIRT2 腺病毒骨架载体的构建与鉴定 |
| 2.2.8 重组腺病毒Ad-SIRT2 的包装、扩繁和病毒滴度测定 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 脂肪组织总RNA的提取 |
| 2.3.2 牛SIRT2 基因CDS区的克隆与鉴定 |
| 2.3.3 pAdTrack-CMV-SIRT2 重组质粒的鉴定 |
| 2.3.4 pAd-SIRT2 重组病毒过表达载体的鉴定 |
| 2.3.5 重组腺病毒Ad-SIRT2 的包装、扩繁及病毒滴度测定 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 总RNA的提取 |
| 2.4.2 牛SIRT2 基因克隆 |
| 2.4.3 牛SIRT2 基因重组腺病毒过表达载体的构建与病毒包装 |
| 2.4.4 腺病毒滴度的测定 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 牛SIRT2 基因sh RNA序列的筛选与干扰腺病毒的包装 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 主要仪器 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 载体 |
| 3.1.4 细胞和菌 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 靶向牛SIRT2 基因的shRNA序列的设计与合成 |
| 3.2.2 pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA的构建与鉴定 |
| 3.2.3 psi CHECKTM-Ⅱ-SIRT2 表达载体的构建 |
| 3.2.4 有效干扰SIRT2 基因shRNA序列的筛选 |
| 3.2.5 pAd-shRNA病毒重组子的构建及鉴定 |
| 3.2.6 腺病毒的包装、扩增及滴度测定 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA表达载体的构建 |
| 3.3.2 SIRT2 基因的克隆与psiCHECKTM-II-SIRT2表达载体的构建 |
| 3.3.3 有效sh RNA序列的筛选 |
| 3.3.4 pAd-shRNA-1002 重组腺病毒载体的鉴定 |
| 3.3.5 Ad-shRNA-1002 腺病毒的包装、扩增及滴度测定 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 shRNA的设计与合成 |
| 3.4.2 有效干扰shRNA序列的筛选 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 过表达和干扰SIRT2 基因对牛前脂肪细胞分化的影响 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 主要仪器 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 组织样 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 牛前体脂肪细胞的分离和培养 |
| 4.2.2 病毒最佳感染复数(Multiplicity Of Infection,MOI)的确定 |
| 4.2.3 重组腺病毒Ad-SIRT2和Ad-shRNA-1002 有效性的鉴定 |
| 4.2.4 过表达和干扰SIRT2 基因对牛前体脂肪细胞分化的影响 |
| 4.2.5 统计分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 牛原代前体脂肪细胞的分离培养 |
| 4.3.2 MOI值的确定 |
| 4.3.3 病毒有效性的鉴定 |
| 4.3.4 油红O染色结果 |
| 4.3.5 Real-time PCR检测SIRT2、脂肪细胞分化及脂质代谢关键基因m RNA表达情况 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 Real-time PCR引物的检测 |
| 4.4.2 过量表达及干扰SIRT2 基因对牛前体脂肪细胞分化的作用 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 牛SIRT2 基因启动子活性分析 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 主要仪器 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 载体 |
| 5.1.4 细胞和菌 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 5'RACE确定牛SIRT2 基因的转录起始位点 |
| 5.2.2 克隆牛SIRT2 基因5’上游基本启动子区域 |
| 5.2.3 SIRT2 基因基本启动子序列生物信息学分析 |
| 5.2.4 牛SIRT2 基因基本启动子序列系列缺失片段的扩增 |
| 5.2.5 pGL3-SIRT2 promoter重组载体的构建及鉴定 |
| 5.2.6 启动子系列缺失片段的活性分析 |
| 5.2.7 统计分析 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 牛SIRT2 基因的转录起始位点 |
| 5.3.2 PCR扩增牛SIRT2 基因2 KB左右启动子区域 |
| 5.3.3 SIRT2 基因启动子进化保守序列分析 |
| 5.3.4 牛SIRT2 启动子区域Cp G岛预测结果 |
| 5.3.5 牛SIRT2 基因5’调控区系列缺失片段的扩增 |
| 5.3.6 重组质粒pGL3-SIRT2 promoter的鉴定 |
| 5.3.7 SIRT2 启动子系列缺失片段活性分析 |
| 5.3.8 SIRT2 核心启动子序列转录因子结合位点分析 |
| 5.4 讨论 |
| 5.4.1 牛SIRT2 基因转录起始位点的确定 |
| 5.4.2 牛SIRT2 基因启动子序列的扩增及活性分析 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 转录因子YY1 对牛SIRT2 基因的转录调控作用 |
| 6.1 材料 |
| 6.1.1 主要仪器 |
| 6.1.2 主要试剂 |
| 6.1.3 质粒 |
| 6.1.4 细胞和菌 |
| 6.2 方法 |
| 6.2.1 生物信息学分析 |
| 6.2.2 YY1 结合序列定点突变的双荧光素酶报告系统分析 |
| 6.2.3 电泳迁移率变动分析(Electrophoretic Mobility Shift Assays,EMSA) |
| 6.2.4 染色质免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP) |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 生物信息学分析预测的保守的YY1 转录因子结合位点 |
| 6.3.2 YY1 转录因子的生物信息学分析 |
| 6.3.3 YY1 结合位点突变对SIRT2 启动子活性的影响 |
| 6.3.4 EMSA验证YY1 体外结合于SIRT2 启动子上 |
| 6.3.5 ChIP验证YY1 体内结合于SIRT2 启动子上 |
| 6.4 讨论 |
| 6.4.1 生物信息学分析YY1 结合位点及YY1 转录因子的保守性 |
| 6.4.2 YY1 结合位点正向调控SIRT2 基因的转录活性 |
| 6.4.3 YY1 转录因子结合于SIRT2 基因启动子上 |
| 6.5 小结 |
| 第七章 结论及创新点 |
| 7.1 结论 |
| 7.2 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩写词对照表 |
| 绪论 |
| 第一部分 杆状病毒-腺相关病毒融合病毒介导人钠碘同向转运体报告基因监测大鼠骨髓间充质干细胞移植治疗的研究 |
| 1.引言 |
| 2.材料和方法 |
| 2.1.主要设备和仪器 |
| 2.2.主要试剂和材料 |
| 2.3.pFB-CMV-hNIS-ITR质粒DNA的构建 |
| 2.4.获取pFBGFPR和 pFB-CMV-hNIS-ITR bacmid DNA |
| 2.5.BV-AAV的制备及滴度测定 |
| 2.6.rBM-MSCs的分离、培养和鉴定 |
| 2.7.BV-AAV感染rBM-MSCs后的体外实验研究-非放射性实验部分 |
| 2.8.BIhV感染rBM-MSCs后的体外实验研究-放射性实验部分 |
| 2.9.BIhV感染rBM-MSCs后的体内显像实验研究 |
| 2.10.使用软件及统计学方法 |
| 3.结果 |
| 3.1.pFB-CMV-hNIS-ITR质粒DNA的构建 |
| 3.2.BIeV和 BIhV病毒的制备及空斑实验测定滴度 |
| 3.3.rBM-MSCs的分离、培养和鉴定 |
| 3.4.BV-AAV感染rBM-MSCs后的体外实验研究-非放射性实验部分 |
| 3.5.BIhV感染rBM-MSCs后的体外实验研究-放射性实验部分 |
| 3.6.BIhV感染rBM-MSCs后的体内显像实验研究 |
| 4.讨论 |
| 第二部分 杆状病毒-腺相关病毒融合病毒介导人钠碘同向转运体报告基因监测人类干细胞移植治疗的研究 |
| 1.引言 |
| 2.材料和方法 |
| 2.1.主要设备和仪器 |
| 2.2.主要试剂和材料 |
| 2.3.Bac-eGFP病毒(BeV)的构建和制备 |
| 2.4.人类干细胞的培养和鉴定 |
| 2.5.BV-AAV感染人类干细胞后的体外实验研究-非放射性实验部分 |
| 2.6.BIhV感染hUCB-MSCs后的体外实验研究-放射性实验部分 |
| 2.7.BIhV感染hUCB-MSCs后的体内显像实验研究 |
| 2.8.使用软件及统计学方法 |
| 3.结果 |
| 3.1.pFB-eGFP质粒DNA的构建及Be V病毒的制备 |
| 3.2.人类干细胞的培养 |
| 3.3.BV-AAV感染人类干细胞后的体外实验研究-非放射性实验部分 |
| 3.4.BIhV感染hUCB-MSCs后的体外实验研究-放射性实验部分 |
| 3.5.BIhV感染hUCB-MSCs后的体内显像实验研究 |
| 4.讨论 |
| 第三部分 睡美人转座子延长杆状病毒介导报告基因表达及体内监测的研究 |
| 1.前言 |
| 2.材料和方法 |
| 2.1.主要设备和仪器 |
| 2.2.主要试剂和材料 |
| 2.3.多种结构BV的制备和哺乳动物细胞G418 药物最佳筛选浓度的检测 |
| 2.4.不同结构的BV感染哺乳动物细胞后的体外生物学特性研究 |
| 2.5.BSeNV感染哺乳动物细胞后的体内显像研究 |
| 2.6.BSGNV或 BIGV感染哺乳动物细胞后的体内显像研究 |
| 2.7.使用软件及统计学方法 |
| 3.结果 |
| 3.1.质粒的构建和不同结构BV的制备 |
| 3.2.不同结构的BV感染哺乳动物细胞后的体外生物学特性研究 |
| 3.3.BSeNV介导e GFP报告基因进行长期显像的研究 |
| 3.4.BSGNV或 BIGV介导GLP-1R核素报告基因显像的研究 |
| 4.讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩写索引 |
| 绪论 |
| 参考文献 |
| 第一部分 重组慢病毒Lv-Tie-2-K5-Egr1-NIS的制备及鉴定 |
| 研究背景 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 骨髓间充质干细胞介导双基因靶向肿瘤治疗的体外研究 |
| 研究背景 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 骨髓间充质干细胞靶向脑胶质瘤的光学及核素报告基因显像 |
| 研究背景 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 骨髓间充质干细胞介导双基因靶向脑胶质瘤治疗的体内研究 |
| 研究背景 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录及申请课题 |
