抑癌基因和癌基因在卵巢癌中的表达及预后

一、抑癌基因、癌基因在卵巢癌的表达及其预后（论文文献综述）

朱静^[1]（2020）在《PRR11基因在卵巢癌中的生物学功能及其机制研究》文中研究说明背景介绍卵巢癌是严重危害女性身心健康的生殖系统肿瘤之一,其发病率相比其他的妇科恶性肿瘤（如宫颈癌、子宫内膜癌）略低。据数据统计显示,全球每年新增卵巢癌发病人数超过52万人,仅在我国每年卵巢癌新增患病人数即超过13万人。并且卵巢癌还是全球范围内致死率较高的恶性肿瘤之一,是妇科肿瘤中致死率最高的肿瘤,近些年来,卵巢癌的发病率与死亡率仍呈不断上升趋势。卵巢癌恶性程度很高,在发病早期并无典型的临床症状,术前也不易鉴别肿瘤的恶性程度与组织类型,因而在确诊时已往往处于晚期,错失最佳的治疗时机。同时由于卵巢癌具有易扩散、易腹腔转移、易复发、耐药率高等特点,卵巢癌患者的总体预后极差,尤其是III-IV期患者,5年生存率仅有25%～30%左右。在过去的20年,基于肿瘤根治手术、肿瘤减灭术治疗、多项辅助药物联合化疗和放射治疗等技术在临床上的应用为患者带来了新的希望,然而,总体存活率仍然较低,且化疗产生的耐药性,亦给患者带来严重的毒、副作用。因此,针对卵巢癌的恶性转移、复发、耐药等分子机制的深入研究,探索早期检测筛选的方法和更有效的晚期治疗策略,仍是当前基础肿瘤学研究的热点。近年来,随着分子生物学的发展,已发现抑癌基因突变或失活（P53、BRCA、ARID1A）、癌基因的异常激活（Ras、Her2、c-fms）以及表观遗传学的改变（甲基化水平、组蛋白修饰）与卵巢癌的恶性临床表型,肿瘤细胞的远处转移以及复发等恶性生物学行为密切相关。富含脯氨酸蛋白（Proline-rich Protein 11,PRR11）基因是新近发现的一种候选癌基因,PRR11作用靶标范围极其广泛,包括膜蛋白受体、粘附分子,生长因子和转录因子等,在肿瘤发生及恶性进展中发挥着重要作用。PRR11对恶性肿瘤影响的研究最早始于肺癌,有报道显示PRR11参与调控肿瘤细胞周期进展。靶向敲低PRR11表达后可引起核糖核苷酸还原酶RRM1和RRM2表达下调,DNA合成速率降低,导致细胞周期阻滞于S期,进而促使细胞增殖能力显着降低。PRR11广泛地表达于消化道恶性肿瘤组织标本中,表达率由高到低依次为食管鳞癌,胃癌,十二指肠癌,结直肠癌,肝癌,是判断患者预后的重要指标。此外,PRR11还可通过调节胃癌、肝癌等多种恶性肿瘤上皮细胞的间质转型,促进肿瘤细胞的局部浸润和远处转移。然而,在国内外文献中,尚未发现PRR11在卵巢癌的表达以及在卵巢癌中的生物学功能的相关研究报道,为此,在本课题中,通过临床取材分别获得51例卵巢癌组织以及51例卵巢正常上皮细胞标本,在组织水平上,分析PRR11的表达与分布,并探讨其与患者临床病理参数之间的关系;此外,进一步在体外实验中对PRR11在卵巢癌发生发展中的作用及机制进行初步的探索,为卵巢癌临床治疗提供新思路和新靶点。第一部分PRR11在卵巢癌组织中的表达及其临床意义目的:本部分旨在探讨PRR11在卵巢癌临床样本中的表达及分布,并分析PRR11表达与卵巢癌临床病理参数的相关性,初步探讨PRR11在卵巢癌疾病进展中的意义。方法:1.分别采用Real-time PCR、蛋白免疫印迹检测临床收集的51例卵巢癌组织和51例正常卵巢上皮细胞中PRR11 m RNA与蛋白水平的变化;2.应用免疫组织化学法检测PRR11蛋白在卵巢癌组织中的表达及定位,根据PRR11蛋白表达强度分组,进一步分析其与患者临床特征（年龄、组织学分级、淋巴结转移、FIGO分期和组织学类型等）的相关性。3.使用Kmplotter分析PRR11表达与卵巢癌患者预后的相关性。结果:1.与正常的卵巢上皮细胞标本相比较,卵巢癌组织中PRR11在m RNA和蛋白水平呈高表达状态;2.在卵巢癌细胞中,PRR11蛋白主要定位于细胞浆中;临床病例资料分析发现PRR11表达高低与卵巢癌FIGO分期（P=0.026）、淋巴结转移（P=0.029）之间呈正相关,与患者年龄（P=0.649）、组织学分级（P=0.803）和组织学类型（P=0.869）无相关性。3.PRR11高表达卵巢癌患者的总生存期明显低于低表达组患者。结论:卵巢癌组织中高表达的PRR11水平与患者临床恶性表型（FIGO分期,淋巴结转移）呈正相关,高表达的PRR11卵巢癌患者具有较短的生存期,预后越差,PRR11可能作为一个不良预后指标,参与了卵巢癌的疾病进展。第二部分PRR11在卵巢癌细胞中的表达及对卵巢癌细胞增殖能力的影响目的:本部分旨在分析敲低或过表达PRR11基因后对卵巢癌细胞增殖能力的影响及可能机制。方法:1.采用蛋白免疫印迹法分别检测人正常卵巢上皮细胞I0SE80、人卵巢癌细胞系Caov3、SKOV3、OVCAR3和HO-8910中PRR11蛋白的表达。2.设计、合成靶向敲低PRR11的小干扰RNA,采用脂质体LipofectamineTMRNAIMAX转染入人卵巢癌HO-8910细胞中,分别采用Real-time PCR和蛋白免疫印迹法观察PRR11在m RNA和蛋白水平的干扰效率。3.体外构建PRR11过表达重组载体,采用脂质体LipofectamineTM 2000转染入人卵巢癌Caov3细胞中,分别采用Real-time PCR和蛋白免疫印迹观察PRR11 m RNA和蛋白水平的过表达效率。4.分别采用CCK-8、克隆形成实验分析敲低PRR11表达后对卵巢癌细胞HO-8910增殖及克隆形成能力的影响。5.分别采用CCK-8、克隆形成实验过表达PRR11基因后对卵巢癌Caov3细胞增殖及克隆形成能力的影响。6.蛋白免疫印迹法检测沉默或过表达PRR11对细胞增殖相关基因c-myc、细胞周期蛋白cyclin D1表达的影响。结果:1.与人正常卵巢上皮细胞I0SE80相比,PRR11在四种卵巢癌细胞中均呈高表达趋势;其中,PRR11蛋白表达水平在Caov3细胞系中最低,在HO-8910细胞系中最高。2.RNAi敲低PRR11基因表达后,显着抑制HO-8910细胞的增殖及克隆形成能力。3.过表达PRR11基因可显着促进Caov3细胞增殖及克隆形成能力。4.RNAi沉默PRR11基因表达后,HO-8910细胞中增殖相关基因c-myc、细胞周期蛋白cyclin D1蛋白表达明显降低。5.过表达PRR11基因后,Caov3细胞中增殖相关基因c-myc、细胞周期蛋白cyclin D1蛋白表达明显增加。结论:PRR11在卵巢癌细胞中呈高表达趋势,PRR11可能通过正调控增殖相关蛋白c-myc、cyclin D1表达促进卵巢癌细胞的恶性增殖。第三部分PRR11对卵巢癌细胞侵袭及迁移能力的影响目的:本部分旨在探讨敲低或过表达PRR11基因对卵巢癌细胞侵袭及迁移能力的影响及可能机制。方法:1.分别采用Transwell侵袭与迁移实验分析敲低PRR11表达后对卵巢癌细胞HO-8910侵袭与迁移能力的影响。2.分别采用Transwell侵袭与迁移实验分析过表达PRR11基因后,对卵巢癌Caov3细胞侵袭与迁移能力的影响。3.蛋白免疫印迹法检测敲低或过表达PRR11基因,对金属基质蛋白酶MMP-2、金属基质蛋白酶抑制剂TIMP-2表达的影响。结果:1.RNAi敲低PRR11基因表达后,HO-8910细胞的侵袭、迁移能力显着降低,金属基质蛋白酶MMP2表达明显下调、金属基质蛋白酶抑制剂TIMP-2表达升高。2.过表达PRR11基因后,Caov3细胞的侵袭、迁移能力显着增加,金属基质蛋白酶MMP2表达明显上调、金属基质蛋白酶抑制剂TIMP-2表达降低。结论:在卵巢癌中,高表达的PRR11可能通过调节MMP2/TIMP-2比率,促进卵巢癌细胞的侵袭迁移能力。第四部分PRR11调控卵巢癌细胞生物学行为的机制研究目的:本部分旨在分析PRR11调控卵巢癌细胞增殖、侵袭迁移能力变化的分子机制。方法:1.蛋白免疫印迹法检测沉默PRR11后,HO-8910细胞中Akt、p-Akt、细胞总β-catenin和细胞核内β-catenin表达水平变化。2.Caov3细胞转染PRR11过表达重组载体,并添加PI3K特异性抑制剂LY294002后,蛋白免疫印迹检测Caov3细胞中Akt、p-Akt、细胞总β-catenin和细胞核内β-catenin的表达变化,并分别采用CCK8法、克隆形成实验及Transwell实验检测Caov3细胞增殖、克隆形成及侵袭迁移能力的变化。结果:1.RNAi敲低PRR11基因表达后,HO-8910细胞中Akt活性明显降低,细胞总β-catenin和细胞核β-catenin表达明显减少。2.过表达PRR11基因后,Caov3细胞中Akt活性明显增加,细胞总β-catenin表达增加,β-catenin细胞核转入增加,细胞增殖、侵袭迁移能力明显增加;当加入抑制剂LY294002后,Akt活性明显降低,细胞总β-catenin表达减少,细胞核β-catenin转入减少,Caov3细胞增殖、侵袭迁移能力受到抑制。结论:在卵巢癌中高表达的PRR11可能通过激活PI3K/Akt信号,促进β-catenin核转位继而调控肿瘤细胞的恶性增殖、侵袭迁移能力。

闫欢^[2]（2020）在《基因修饰卵巢癌细胞株的构建及PTK2对卵巢癌细胞生物学行为影响的研究》文中研究说明研究背景卵巢癌（ovarian cancer）是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一,世界范围内,其发病率在发达国家为9.1/10万,在发展中国家为5.0/10万,死亡率居妇科恶性肿瘤之首。卵巢上皮性癌（ovarian epithelial cancer）占卵巢癌的85～90%,在早期诊断时,卵巢癌患者可以采用手术联合化疗药物治疗,5年生存率接近90%,由于卵巢癌的频繁复发和转移,晚期患者5年生存率降至30%左右。肿瘤的起始和进展与多种抑癌基因失活或者促癌“诱导”基因的过度激活密切相关。近年来,分子靶向治疗发展迅猛,以分子靶向药物治疗为代表的生物治疗模式可以从分子水平调控肿瘤进展,为改善卵巢癌患者预后带来希望。因此,迫切需要探索卵巢癌发生和转移相关的分子机制,探究卵巢癌分子靶向治疗的潜在靶点,提高卵巢癌患者早期诊断率。抑癌基因p53位于17号染色体17p13.1的位置,p53是人类癌细胞中突变率最高的基因。以往的研究发现,p53功能缺陷(p53-/-)在诱导小鼠卵巢上皮细胞发生转化,使其获得肿瘤细胞的形态和功能中发挥重要作用。促癌基因c-Myc位于8号染色体8q24.21位点,在早期应答中发挥重要作用。c-Myc过表达可使细胞出现无限增殖、分化以及恶性转化。研究发现,约30%的卵巢肿瘤存在c-Myc扩增。蛋白酪氨酸激酶（protein tyrosine kinase,PTK2）,又称局灶性粘附激酶（focal adhesion kinase,FAK）,位于染色体8q24.3位点。PTK2在人类多种实体瘤中表达上调,发挥着促癌的作用。研究发现,PTK2过表达与p53突变在人乳腺癌中高度相关,PTK2 N端结构域与p53 N端反式激活结构域可相互作用。PTK2和c-Myc协同调控肿瘤细胞侵袭,抑制整合素/PTK2信号轴和c-Myc可以协同调控卵巢癌恶性生物学行为。有趣的是,我们分析了癌症基因组图谱（the cancer genome atlas,TCGA）,发现在同一组卵巢浆液性癌患者中,包括PTK2、c-Myc和p53在内的三种基因同时发生异常改变,其中88%的卵巢癌患者p53基因发生突变,45%的卵巢癌患者c-Myc基因上调或扩增,同时,超过60%的卵巢癌患者PTK2上调或扩增。因此,我们提出猜想,在p53功能缺陷(p53-/-)的小鼠卵巢上皮细胞中,将癌基因c-Myc和PTK2同时过表达（p53敲除+c-Myc过表达+PTK2过表达）,是否可以促使卵巢上皮细胞发生转化,使其获得卵巢癌恶性生物学功能,是否可以模拟卵巢癌的发生和进展过程,形成卵巢癌细胞?如果该细胞株构建成功,希望能广泛应用于人类卵巢上皮性癌起始和转移的分子机制研究。本研究试图通过基因修饰构建一种小鼠卵巢癌细胞株。课题组利用CRISPR/Cas9系统敲除p53基因,构建了p53敲除质粒,同时构建了c-Myc和PTK2过表达质粒,本研究利用慢病毒载体系统包装质粒并将修饰后的目的基因,以单个或组合方式转染小鼠卵巢上皮细胞,观察其细胞功能性改变,将具有潜在肿瘤生成作用的细胞株种植到小鼠卵巢组织内,建立小鼠卵巢癌模型,进一步观察其在小鼠体内的成瘤效果和肿瘤转移情况。卵巢癌的分子靶向治疗近年来引起人们的广泛关注以及深入研究。基于本课题以上研究,我们看到PTK2在卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭中发挥重要作用,那么,以PTK2为治疗靶点的研究将指导我们更好地理解卵巢癌发生和发展的过程,为卵巢癌的分子靶向治疗带来新的思路。GSK2256098是一种靶向抑制PTK2激酶活性以及Y397位点磷酸化的小分子抑制剂。本研究利用CRISPR/Cas9系统敲除PTK2基因,同时选用GSK2256098靶向抑制PTK2 Y397位点的磷酸化,首次评估敲除和靶向抑制PTK2对卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭等细胞生物学行为的影响及可能机制,以及对卵巢癌小鼠原位移植瘤形成和转移的作用。通过以上研究,希望为卵巢癌的分子靶向治疗及分子机制研究提供研究基础和理论支持。本课题分为三个部分,对以上内容进行探讨。第一部分基因修饰小鼠卵巢癌细胞株的构建目的本部分旨在构建小鼠卵巢癌细胞株,并利用该细胞株建立小鼠卵巢原位移植瘤模型进行功能验证。材料与方法1.材料1.1细胞株:C57BL/6小鼠卵巢上皮细胞,购自美国Cell Biologics公司。1.2质粒:在实验前期,课题组成功构建了p53基因敲除质粒、c-Myc基因过表达质粒以及PTK2基因过表达质粒。1.3动物:选用4周大小的NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/Sz J（NSG）免疫缺陷雌性小鼠,购自Jackson实验室。2.方法2.1将成功构建的质粒进行转化和提取,利用慢病毒载体系统包装p53敲除质粒、c-Myc过表达质粒以及PTK2过表达质粒。2.2建立稳定转染细胞株及分组将包装后的质粒以单个、两两组合、三者组合的形式分别转染正常小鼠卵巢上皮细胞,共分为8组:p53敲除组(p53-/-组)、c-Myc过表达组（c-Myc组）、PTK2过表达组（PTK2组）、p53敲除+c-Myc过表达组(p53-/-+c-Myc组)、p53敲除+PTK2过表达组(p53-/-+PTK2组)、PTK2过表达+c-Myc过表达组（PTK2+c-Myc组）、p53敲除+c-Myc过表达+PTK2过表达组(p53-/-+c-Myc+PTK2组)以及空质粒载体转染组（对照组）。Western blot方法检测8组细胞p53、c-Myc以及PTK2蛋白水平。2.3 MTT方法、单层细胞克隆形成试验和软琼脂细胞克隆形成试验检测8组基因修饰小鼠卵巢上皮细胞增殖能力和细胞克隆形成能力。细胞迁移和侵袭实验检测8组基因修饰细胞迁移和侵袭能力。2.4筛选出具有潜在肿瘤生成能力的基因修饰细胞株,将该组细胞种植到免疫缺陷NSG小鼠卵巢组织,观察其成瘤效果及转移情况。2.5采用SPSS 22.0进行统计分析,结果统计采用（x±s）表示,进行正态性检验,两组比较采用独立样本t检验,超过两组采用单因素方差分析。以α=0.05为检验水准。结果1 PTK2、c-Myc和p53蛋白在基因修饰小鼠卵巢上皮细胞株的表达与对照组（0.06±0.02）相比,PTK2蛋白在PTK2组（1.22±0.11）、PTK2+c-Myc组（1.11±0.11）、p53-/-+PTK2组（0.86±0.09）及p53-/-+c-Myc+PTK2组（1.34±0.16）基因修饰细胞株表达水平升高,差异均具有统计学意义（P<0.001）。与对照组（0.08±0.02）相比,c-Myc蛋白在c-Myc组（0.56±0.04）、PTK2+c-Myc组（1.01±0.12）、p53-/-+c-Myc组（0.76±0.09）及p53-/-+c-Myc+PTK2组（1.23±0.15）基因修饰细胞株表达水平升高,差异均具有统计学意义（P<0.001）。与对照组（0.45±0.05）相比,p53蛋白在p53-/-组（0.01±0.01）、p53-/-+c-Myc组（0.02±0.01）、p53-/-+PTK2组（0.03±0.01）及p53-/-+c-Myc+PTK2组（0.04±0.01）基因修饰细胞株表达水平下降,差异均具有统计学意义（P<0.001）。2基因修饰小鼠卵巢上皮细胞增殖能力与对照组及其他6组基因修饰细胞相比,p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞增殖能力显着上升,差异具有统计学意义（P<0.01）。与对照组相比,p53-/-+PTK2组、p53-/-+c-Myc组及PTK2+c-Myc组细胞增殖能力上升（P<0.01）。与对照组相比,p53-/-组、c-Myc组及PTK2组细胞增殖能力在整个测定期内均无统计学差异（P>0.05）。3基因修饰小鼠卵巢上皮细胞克隆形成结果与对照组（4.33±1.53）及其他6组基因修饰细胞相比,p53-/-+c-Myc+PTK2组单层细胞克隆形成数量（93.67±6.11）显着增加（P<0.001）。与对照组（4.33±1.53）相比,p53-/-组（15.00±0.07）、p53-/-+PTK2组（23.33±3.06）及p53-/-+c-Myc组（36.00±2.65）单层细胞克隆形成数量增加,差异有统计学意义（P<0.01）。与对照组相比,PTK2+c-Myc组、PTK2组及c-Myc组单层细胞克隆形成数量无明显增加,差异无统计学意义（P>0.05）。与对照组（6.67±1.53）及其他6组基因修饰细胞相比,p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞软琼脂中克隆形成数量显着增加（82.67±6.81）,差异有统计学意义（P<0.001）。与对照组相比,其他6组基因修饰细胞软琼脂中克隆形成数量无明显增加,差异无统计学意义（P>0.05）。4基因修饰小鼠卵巢上皮细胞迁移和侵袭结果与对照组（16.00±1.00）及其他6组基因修饰细胞相比,p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞迁移数量（85.33±5.03）显着增加,差异有统计学意义（P<0.001）。与对照组（16.00±1.00）相比,p53-/-+PTK2组（26.00±2.00）和p53-/-+c-Myc组（34.00±3.60）细胞迁移数量增加（P<0.01）。与对照组（16.00±1.00）相比,p53-/-组（15.33±1.53）、PTK2组（14.00±2.00）、c-Myc组（18.67±2.08）及PTK2+c-Myc组（17.33±1.53）细胞迁移数量无明显增加,差异无统计学意义（P>0.05）。与对照组（11.00±1.00）及其他6组基因修饰小鼠卵巢上皮细胞株相比,p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞侵袭数量（60.30±6.11）显着增加,差异有统计学意义（P<0.001）。与对照组（11.00±1.00）相比,p53-/-组（20.33±2.52）、PTK2+c-Myc组（21.00±3.46）、p53-/-+PTK2组（20.67±3.06）及p53-/-+c-Myc组（21.00±2.65）细胞侵袭数量增加（P<0.05）。与对照组（11.00±1.00）相比,PTK2组（12.33±0.58）和c-Myc组（14.00±1.00）细胞侵袭数量无明显增加,差异无统计学意义（P>0.05）。5基因修饰小鼠卵巢上皮细胞株的筛选诱发小鼠原代细胞发生转化,使其获得肿瘤细胞特征,能在悬浮状态下成簇生长是本研究能否成功的关键。p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞增殖能力、细胞克隆形成能力、迁移能力、侵袭能力显着高于对照组和其他6组基因修饰细胞株（P<0.01）。虽然p53-/-+PTK2组和p53-/-+c-Myc组单层细胞克隆形成、细胞侵袭和迁移数量高于对照组（P<0.05）,然而p53-/-+PTK2和p53-/-+c-Myc组软琼脂细胞克隆形成数量与单基因修饰组相比,无统计学差异（P>0.05）,而p53-/-+c-Myc+PTK2组软琼脂细胞克隆形成数量显着多于其他各组（P<0.001）。软琼脂中克隆形成试验结果可以反应细胞锚定非依赖性生长能力,即悬浮状态下细胞成簇生长能力,可以作为评判细胞是否具有肿瘤生长特性的金标准。结果说明只有p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞获得了肿瘤细胞锚定非依赖性生长的特性。因此,我们认为在8组基因修饰组合细胞中,p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞具有潜在成瘤能力,本课题筛选出p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞株进行小鼠卵巢原位移植瘤模型构建。6荧光素酶基因标记小鼠卵巢上皮细胞利用慢病毒载体包装荧光素酶基因,分别转染正常小鼠卵巢上皮细胞和p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞株,传代培养后测定细胞荧光强度值,结果显示两组细胞的荧光值均大于106,说明荧光素酶基因已经整合到小鼠细胞DNA中,可以进行后续移植瘤模型的构建。7基因修饰p53-/-+c-Myc+PTK2细胞在NSG小鼠成瘤将p53-/-+c-Myc+PTK2细胞在显微镜下种植到NSG小鼠单侧卵巢组织,构建小鼠卵巢原位移植瘤模型。每周进行荧光强度值监测,12周后可以观察到基因修饰p53-/-+c-Myc+PTK2小鼠卵巢组织形成肿瘤。处死小鼠,发现基因修饰p53-/-+c-Myc+PTK2小鼠出现血性腹水。剥离卵巢,发现卵巢组织周围出现肿瘤组织。查看肿瘤转移情况,发现p53-/-+c-Myc+PTK2组小鼠出现广泛腹腔转移,转移的脏器包括肝脏、脾脏和肠等。结论本部分成功构建了p53-/-+c-Myc+PTK2细胞株,并应用p53-/-+c-Myc+PTK2细胞株成功建立了小鼠卵巢癌模型,模拟了卵巢癌体内形成和转移的过程,该细胞株有望用于卵巢癌发生和发展的分子机制研究。第二部分PTK2在卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭中的作用研究目的研究PTK2在卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭等生物学行为中的作用。材料与方法1材料1.1细胞株:SKOV3、OVCAR8细胞购于美国菌种中心。1.2质粒:PTK2基因敲除质粒。2方法2.1统计分析Kaplan Meir Plot数据库PTK2在卵巢癌组织中的表达情况及与预后的关系;采用免疫荧光方法检测卵巢癌组织及癌旁组织中PTK2的表达。2.2利用慢病毒载体包装PTK2基因敲除质粒。建立PTK2基因敲除质粒稳定转染细胞株,对照组为空质粒转染组。同时采用小分子抑制剂GSK2256098抑制PTK2关键激活位点（p-FAK）Y397,进行靶向抑制PTK2活化,对照组为DMSO对照。2.3敲除PTK2或使用GSK2256098抑制PTK2活性后,MTT方法、细胞克隆形成实验检测细胞增殖、克隆形成能力变化情况。Transwell迁移/侵袭实验检测细胞迁移和侵袭能力变化情况。2.4统计方法见第一部分。结果1 PTK2在卵巢癌组织中高表达且与卵巢癌患者预后相关PTK2高表达组患者生存期显着低于PTK2低表达组（P<0.05）。PTK2在肿瘤细胞胞浆中强染色,与癌旁组织相比,PTK2在卵巢癌组织中高表达。2敲除PTK2或使用GSK2256098抑制PTK2活性后,降低卵巢癌细胞中PTK2蛋白及磷酸化水平敲除PTK2基因,在SKOV3和OVCAR8细胞系中均检测不到PTK2的表达。检测GSK2256098对PTK2的主要激活位点Y397的抑制效果,GSK2256098给药浓度分别为0、5、10、20、40μmol/L,作用时间24 h。与对照组相比,当GSK2256098浓度为40μmol/L时对卵巢癌细胞中p-FAK抑制效果显着,差异具有统计学意义（P<0.001）。3敲除PTK2或使用GSK2256098抑制PTK2活性后,降低卵巢癌细胞的增殖能力与敲除对照组相比,卵巢癌SKOV3和OVCAR8细胞的增殖能力在PTK2敲除组显着降低（P<0.05）。与加药对照组相比,卵巢癌SKOV3和OVCAR8细胞的增殖能力在GSK2256098组显着降低（P<0.05）。4敲除PTK2或使用GSK2256098抑制PTK2活性后,降低卵巢癌细胞的克隆形成能力与敲除对照组（75.67±5.50）、（46.33±6.50）相比,PTK2敲除组SKOV3和OVCAR8细胞单层克隆形成数量（18.67±4.50）、（11.00±4.60）显着降低（P<0.05）。与加药对照组（53.67±4.16）、（34.00±4.00）相比,GSK2256098组SKOV3和OVCAR8细胞单层克隆形成数量（17.00±4.00）、（13.7±4.04）显着降低（P<0.05）。5敲除PTK2或使用GSK2256098抑制PTK2活性后,降低卵巢癌细胞的迁移和侵袭能力与敲除对照组（106.30±8.50）、（39.67±8.08）相比,PTK2敲除组SKOV3和OVCAR8细胞迁移数量（43.70±8.50）、（20.67±4.51）显着降低（P<0.05）。与加药对照组（73.33±8.02）、（55.00±7.21）相比,GSK2256098组SKOV3和OVCAR8细胞迁移数量（27.67±3.51）、（28.00±7.00）显着降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。细胞侵袭实验结果表明,与敲除对照组（79.33±6.03）、（42.00±4.58）相比,PTK2敲除组SKOV3和OVCAR8细胞侵袭数量（19.00±2.00）、（23.00±3.00）显着降低（P<0.05）。与加药对照组（80.30±8.96）、（36.33±5.69）相比,GSK2256098组SKOV3和OVCAR8细胞侵袭数量（22.67±2.52）、（18.33±2.52）显着降低（P<0.05）。结论PTK2在卵巢癌中发挥促癌作用;PTK2敲除或靶向抑制降低了卵巢癌细胞的增殖、克隆形成、迁移和侵袭能力;PTK2有望成为卵巢癌的早期治疗靶点。第三部分PTK2在卵巢癌小鼠原位移植瘤形成和转移中的作用研究目的研究PTK2在卵巢癌小鼠原位移植瘤形成和转移中的作用。材料与方法1材料动物:实验选用4周大小的NSG免疫缺陷雌性小鼠。2方法2.1敲除PTK2基因后,构建人卵巢癌SKOV3细胞NSG免疫缺陷小鼠原位移植瘤模型,每周使用Xenogen在体成像系统监测肿瘤生长和转移情况。2.2将人卵巢癌细胞OVCAR8种植到小鼠卵巢组织,随机分成两组,一组采用GSK2256098治疗（灌胃,75 mg/kg/d,每周治疗5天,共4周）,另一组采用DMSO进行对照治疗,每周使用Xenogen在体成像系统监测肿瘤生长和转移情况。2.3统计方法同第一部分。结果1 PTK2敲除后抑制卵巢癌小鼠原位移植瘤形成和转移与敲除对照组相比,PTK2敲除组卵巢肿瘤组织平均最大荧光强度值显着降低（P<0.001）。分离肿瘤组织,与敲除对照组相比,PTK2敲除组小鼠卵巢肿瘤组织重量显着降低（P<0.001）。对照组小鼠肝脏、脾脏和肠等多个器官均出现肿瘤组织转移,而PTK2敲除组小鼠未发现肿瘤组织转移情况。2抑制PTK2活性后降低卵巢癌小鼠原位移植瘤形成和转移与治疗对照组相比,GSK2256098治疗组小鼠卵巢肿瘤组织平均最大荧光强度值显着降低（P<0.001）。分离小鼠肿瘤组织,与治疗对照组相比,GSK2256098治疗组小鼠原位卵巢肿瘤组织重量显着降低（P<0.001）。治疗对照组出现肝脏、脾脏及肠肿瘤组织转移,而GSK2256098治疗组未发现肿瘤组织转移现象。结论PTK2敲除或靶向抑制降低卵巢癌小鼠原位移植瘤的形成和转移能力

刘翔宇^[3]（2020）在《miR-195-5p在卵巢癌中的作用与机制研究》文中提出背景:卵巢癌是女性生殖系统三大恶性肿瘤之一,其发病率低于宫颈癌、子宫内膜癌,但卵巢癌的病死率显着高于另外两种肿瘤。在过去十年中卵巢癌的治疗方法虽有所发展,但由于早期阶段卵巢癌患者没有明显的症状,患者就诊时多已发生肿瘤的局部播散及远处转移,故卵巢癌患者的5年总生存率仍然较低,仅为30%-40%。卵巢癌的发生和发展是一个多阶段的过程,近年来,越来越多的研究表明micro RNA（miRNA）在卵巢癌的进展和转移等过程中发挥重要的调节作用,参与了肿瘤细胞增殖、凋亡、血管生成、迁移、侵袭和转移等过程,其中miR-195-5p被证实与多种肿瘤有关,但在卵巢癌中的作用及机制鲜有报道。目的:本研究旨在探究miR-195-5p能否调控卵巢癌的恶性生物学行为,进而深入分析可能的分子机制,即miR-195-5p通过调节下游靶基因影响卵巢癌的增殖、转移,从而为卵巢癌的治疗提供新策略,为卵巢癌提供新的预后预测指标。方法:1、收集天津医科大学附属肿瘤医院2017年10月至2018年12月之间卵巢癌患者行手术切除的上皮性卵巢癌组织标本共50例,同时收集正常卵巢组织标本50例,并培养正常卵巢细胞系（IOSE80）、卵巢癌细胞系（SKOV3、OVCAR3、A2780、ES-2）,通过实时定量PCR（q RT-PCR）技术观察、分别比较miR-195-5p在卵巢癌组织与正常卵巢组织、卵巢癌细胞系与正常卵巢细胞系中的表达情况。2、在miR-195-5p表达水平相对低的SKOV3细胞系中利用慢病毒构建稳定过表达miR-195-5p的细胞株,在miR-195-5p表达水平相对高的A2780细胞系中转染miR-195-5p inhibitor抑制内源性miR-195-5p表达,采用MTT、克隆形成、Ed U等细胞学实验观察miR-195-5p对卵巢癌细胞系增殖能力的影响;采用Transwell、划痕实验等方法观察miR-195-5p对卵巢癌细胞迁移能力的影响;通过流式细胞学技术,分析卵巢癌细胞系中过表达miR-195-5p后细胞周期的分布特点;通过小鼠体内成瘤实验,观察过表达miR-195-5p后小鼠体内移植瘤的生长情况。3、采用生物信息学方法预测miR-195-5p调控的靶基因,采用双荧光素酶报告系统分析miR-195-5p与其潜在靶基因--细胞分裂周期相关蛋白4（Cell Division Cycle-Associated protein 4,CDCA4）的靶向调控关系。q RT-PCR方法检测miR-195-5p和CDCA4在miR-195-5p过表达卵巢癌细胞系及对照组中的表达,同方法对比miR-195-5p和CDCA4在miR-195-5p低表达卵巢癌细胞系及对照组中的表达。Western Blotting方法检测miR-195-5p过表达/低表达卵巢癌细胞系中CDCA4的表达水平。在SKOV3细胞中采用Western Blotting方法检测miR-195-5p过表达组、miR-195-5p及CDCA4均过表达组、control三组中cyclin D1、p16的表达,细胞功能学实验明确三组细胞增殖能力的差异。4、q RT-PCR技术检测上皮性卵巢癌组织中miR-195-5p的表达水平、免疫组化方法检测卵巢癌组织中CDCA4的表达水平,分析miR-195-5p、CDCA4表达水平与卵巢癌临床病理学特征的关系;采用Kaplan-Meier法进行生存分析。结果:1、miR-195-5p在卵巢癌组织及卵巢癌细胞系中的表达下调卵巢癌组织中miR-195-5p的表达显着低于在正常卵巢组织中的表达,差异有统计学意义（P<0.001）,与卵巢正常细胞系（IOSE80）相比,miR-195-5p在卵巢癌细胞系中的表达均降低,差异有统计学意义（P<0.01）。2、miR-195-5p抑制卵巢癌细胞的增殖、迁移体外实验显示,过表达miR-195-5p可抑制卵巢癌细胞的增殖及迁移;流式细胞学检测结果显示miR-195-5p的过表达可使细胞周期阻滞在G1期,减慢了其细胞周期进程。体内实验表明:过表达miR-195-5p的小鼠种植瘤,其体积及重量较对照组均降低。3、在卵巢中CDCA4是miR-195-5p的靶基因Starbase数据库显示CDCA4是miR-195-5p的潜在靶基因,继而使用双荧光素酶报告系统发现CDCA4 3’-UTR的活性能被miR-195-5p降低,进一步结合使用位点突变技术发现miR-195-5p结合位点突变的CDCA4 3’-UTR活性不能被miR-195-5p降低。卵巢癌细胞系中CDCA4的表达水平与miR-195-5p呈负相关,miR-195-5p通过对CDCA4的调节作用抑制卵巢癌细胞的增殖及迁移,过表达CDCA4后可逆转miR-195-5p对卵巢癌细胞的抑制增殖作用。4、miR-195-5p、CDCA4表达水平与卵巢癌临床病理学特征的关系miR-195-5p在卵巢癌中的表达水平与有无淋巴结转移、组织学分级、FIGO分期有关,CDCA4在卵巢癌中的表达与病灶大小、组织学分级有关,miR-195-5p高表达的卵巢癌患者预后较好,CDCA4高表达的卵巢癌患者预后更差,miR-195-5p、FIGO分期是上皮性卵巢癌患者的独立预后因素。结论:上述研究表明:miR-195-5p在卵巢癌组织及卵巢癌细胞系中呈下调表达,miR-195-5p能够抑制卵巢癌细胞的增殖和迁移能力,并且证实miR-195-5p可下调其靶基因CDCA4的表达从而抑制卵巢癌细胞的增殖、使细胞周期阻滞在G1期。在卵巢癌组织中miR-195-5p、CDCA4的表达与卵巢癌的组织学分级、生存状况等呈现显着的相关性。综上所述,miR-195-5p/CDCA4轴提供了一种解释卵巢癌疾病进展的机制,可成为卵巢癌诊断、治疗的潜在靶点,为卵巢癌临床治疗提供理论依据。

薛云^[4]（2020）在《SP1、KLF4和P21在卵巢上皮性癌的表达及意义》文中进行了进一步梳理目的:分析卵巢上皮性癌组织中SP1、KLF4和P21的异常表达情况及相关性,并分析三者表达与卵巢上皮性癌临床病理的关系,以寻找有效的卵巢上皮性癌的早期诊断及预后评估的指标。方法:收集2011-06～2015-08期间在我院妇科行手术切除治疗的卵巢上皮性癌患者48例的手术标本。另外收集同期在我院行手术治疗的卵巢良性肿瘤、交界性肿瘤各30例（浆液性、黏液性各15例）及因良性病变（如输卵管卵巢脓肿,子宫腺肌病合并严重子宫内膜异位症、严重的盆腔粘连等）行卵巢切除术的正常卵巢组织标本40例作为对照。采用SP免疫组化法检测标本中的SP1、KLF4和P21阳性表达情况,分析三者的关系及其与临床病理类型的关系,并分析三者对卵巢上皮性癌患者预后的影响。结果:（1）卵巢上皮性癌组织的SP1阳性率（72.9%）显着高于正常卵巢组织（7.5%）、卵巢良性肿瘤（6.7%）、卵巢交界性肿瘤（13.3%）（P<0.05）;卵巢上皮性癌组织的KLF4阳性率（29.2%）显着低于正常卵巢组织（87.5%）、卵巢良性肿瘤（86.7%）、卵巢交界性肿瘤（80.0%）（P<0.05）;卵巢上皮性癌组织的P21阳性率（25.0%）显着低于正常卵巢组织（67.5%）、卵巢良性肿瘤（66.7%）、卵巢交界性肿瘤（60.0%）（P<0.05）。（2）经Spearman等级相关分析显示SP1与KLF4、P21表达均呈负相关（r=-0.519,-0.481,P<0.01）;KLF4与P21表达呈正相关（r=0.462,P<0.01）。（3）Ⅲ～Ⅳ分期的SP1阳性表达率显着高于Ⅰ～Ⅱ分期（P<0.05）,Ⅲ～Ⅳ分期的KLF4、P21阳性表达率低于Ⅰ～Ⅱ分期（P<0.05）;随着分化程度的降低,SP1阳性表达率逐渐升高（P<0.05）,KLF4、P21阳性表达率逐渐下降（P<0.05）;有淋巴结转移的SP1阳性表达率显着高于无淋巴结转移者（P<0.05）,有淋巴结转移的KLF4、P21阳性表达率低于无淋巴结转移者（P<0.05）。（4）采用Kaplan-Meier法对患者进行生存分析,结果显示SP1、KLF4、P21阳性表达患者生存时间分别为10～60个月（中位时间40个月）、30～65个月（中位时间59个月）、30～65个月（中位时间60个月）;SP1、KLF4、P21阴性表达患者生存时间分别为25～65个月（中位时间60个月）、10～52个月（中位时间40个月）、10～52个月（中位时间40个月）。SP1阳性表达患者生存时间显着短于阴性表达患者（P<0.05）;KLF4、P21阳性表达患者生存时间显着长于阴性表达患者（P<0.05）。结论:（1）相比于正常卵巢组织、卵巢良性肿瘤、卵巢交界性肿瘤,卵巢上皮性癌中SP1蛋白阳性表达明显升高,KLF4、P21蛋白阳性表达明显降低。（2）卵巢上皮性癌组织中SP1蛋白表达与KLF4、P21蛋白表达呈负相关,KLF4蛋白表达与P21蛋白表达呈正相关。（3）SP1、KLF4、P21蛋白表达与卵巢上皮性癌病理分期、分化程度及淋巴结转移有关。（4）SP1蛋白表达异常升高,KLF4、P21蛋白表达下调均会导致卵巢癌患者生存时间缩短,因此,通过检测其表达水平有利于卵巢上皮性癌早期诊断和预后疗效评估。SP1、KLF4、P21基因也可能成为卵巢癌治疗的新靶点。

魏娜^[5]（2020）在《P53、vimentin、Ki-67的表达及血清CA125变化与上皮性卵巢癌预后分析》文中研究说明目的此次研究运用免疫组化的方法检测标本中P53、vimentin、Ki-67的表达,并记录血清CA125变化,探讨各影响因素对上皮性卵巢癌的预后影响,为患者的诊疗及预后评估提供理论依据。方法选取2000年2018年就诊于华北理工大学附属医院曾行肿瘤细胞减灭术并具有完整临床资料的上皮性卵巢癌患者114例为研究对象,随访观察预后。免疫组化法检测P53、vimentin、Ki-67的表达;电化学荧光法测定血清CA125水平。应用SPSS 22.0进行数据统计分析,单因素生存分析的比较应用Kaplan-Meier法检验,组间生存曲线比较采用Log-rank检测;多因素生存分析采用多因素COX模型。P<0.05为差异有统计学意义。结果1截止到2020年随访结束,观察到复发34例,死亡42例,平均DFI为3.43年,平均PFS为4.06年,平均OS为4.74年。2单因素分析:P53、vimentin、Ki-67、3程化疗后血清CA125值转归倍数、组织分化、临床分期、手术彻底性、复发类型与患者的无瘤生存时间、无进展生存时间及总生存时间密切有关（P<0.05）。P53、vimentin、Ki-67表达阳性患者与表达阴性患者的中位DFI、中位PFS、中位OS相比明显缩短。3程化疗后血清CA125值转归倍数较大患者的中位DFI、中位PFS、中位OS明显长于转归倍数较小者。高分化患者长于低分化中位DFI、中位PFS、中位OS。临床分期越晚患者的中位DFI、中位PFS、中位OS较临床分期较早的患者明显缩短。手术不彻底患者的中位DFI、中位PFS、中位OS较手术彻底的上皮性卵巢癌患者明显缩短。铂敏感复发患者的中位DFI、中位PFS、中位OS均明显长于铂耐药复发患者。术前CA125值、年龄、病理类型不能影响EOC患者预后（P>0.05）。3多因素分析:P53、vimentin、Ki-67、3程化疗后CA125值转归倍数、组织分化、临床分期、手术彻底性、复发类型是影响患者的DFI、PFS及OS的独立危险因素。P53、vimentin、Ki-67水平升高,死亡风险增加,血清CA125值转归倍数升高死亡风险降低。结论1 P53、vimentin及Ki-67阳性表达患者的复发时间及生存时间短于表达阴性患者,预后较差。2 3程化疗后CA125值转归倍数越小患者的复发时间及总生存时间较转归倍数较大患者明显缩短。图9幅;表11个;参130篇。

石鸿玉^[6]（2020）在《MIIP在上皮性卵巢癌组织的表达及对SKOV3细胞增殖和侵袭的影响》文中指出卵巢肿瘤是常见的妇科肿瘤,可发生于任何年龄。其中上皮性卵巢癌是最常见的卵巢恶性肿瘤组织学类型,约占卵巢肿瘤的50%～70%,主要包括浆液性癌、粘液性癌、子宫内膜样癌和透明细胞癌。上皮性卵巢癌其发病率位于妇科恶性肿瘤第三位,死亡率却位于妇科恶性肿瘤之首位。其预后较差的主要原因是是缺乏早期的检测方法、晚期患者缺乏有效治疗方法和出现的高耐药率。由于发病早期无明显的临床症状,70%以上的卵巢癌患者因腹痛腹胀就诊时已为晚期,其特征是盆腹腔内出现广泛转移伴腹水的聚积,使病情进展迅速。侵袭和转移是卵巢癌患者死亡的主要原因,是对治疗构成主要障碍的重要步骤。因此,探讨卵巢癌的侵袭和转移分子机制,寻求有效的靶向治疗是上皮性卵巢癌的研究重点之一。迁移侵袭抑制蛋白（migration and invasion inhibitory protein,MⅡP）基因又称侵袭抑制蛋白45（Ⅱp45）基因,它是位于染色体1p36.22上的一种抑癌基因,可编码由388个氨基酸组成的一种高亲水性蛋白质,并且预测分子量为45kDa。最近的研究证实,MⅡP可通过PI3K/AKT、NF-kB、Rac-1等多种信号通路参与介导肿瘤细胞的增殖与转移。已有相关报道,MⅡP在子宫内膜癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、乳腺癌、胶质瘤等多种恶性肿瘤中低表达,上调MⅡP表达后可明显抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭及转移。NF-kB（nuclear factor-kB）是由两种主要亚基p65和p50所构成的一种诱导相关基因转录的转录因子。NF-kB信号通路激活后可调控多种基因的表达,如:细胞间粘附分子-1（ICAM-1）、血管细胞粘附分子-1（VCAM-1）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等,这些细胞因子已被报道在多个水平上对恶性肿瘤的发生有显着的作用,包括促进生长、增殖、侵袭、转移和血管生成。目的检测MⅡP在不同卵巢组织的表达水平,探讨MⅡP对卵巢癌SKOV3细胞株增殖和侵袭能力的影响,并研究MⅡP是否通过NF-kB信号通路发挥作用。方法1.分别采用免疫组化SP法和qRT-PCR法检测45例上皮性卵巢癌组织和25例正常卵巢组织中MⅡP蛋白阳性表达率及MⅡPmRNA相对表达量,并分析MⅡP与上皮性卵巢癌临床病理特征间的相关性。2.培养卵巢癌SKOV3细胞株,用过表达质粒pcDNA3-MⅡP转染的SKOV3细胞作为实验组、空载体质粒pcDNA3转染的SKOV3细胞作为阴性对照组,未转染质粒的SKOV3细胞作为空白对照组。采用qRT-PCR法和Western blot法检测三组细胞中MⅡPmRNA相对表达量和MⅡP蛋白表达水平,验证过表达载体质粒的转染效果。3.采用CCK-8法和Transwell法检测MⅡP对卵巢癌SKOV3细胞株增殖和侵袭能力的影响。4.采用Western blot法检测三组细胞中p65、p-p65和ICAM-1蛋白表达水平。结果1.上皮性卵巢癌组织中NⅡP蛋白阳性表达率为31.1%,明显低于正常卵巢组织76.0%,两者之间差异具有统计学意义（P<0.001）。2.在上皮性卵巢癌组织中FIGO Ⅰ+Ⅱ期MⅡP蛋白阳性表达率明显高于Ⅲ+Ⅳ期,其蛋白阳性表达率分别为44.0%和15.0%;在淋巴结清扫中,有淋巴结转移组明显低于无淋巴结转移组,其蛋白阳性表达率分别为23.8%和64.3%。上皮性卵巢癌组织中MⅡP蛋白阳性表达率与FIGO分期和有无淋巴结转移有关,差异具有统计学意义（P<0.05）。而与年龄、组织学分级、病理类型无关（P>0.05）。3.上皮性卵巢癌组织和正常卵巢组织中MⅡPmRNA相对表达量分别为0.969±0.380、2.439±0.991。上皮性卵巢癌组织MⅡPmRNA相对表达量低于正常卵巢组织,差异具体统计学意义（P<0.01）。4.细胞实验中,实验组、阴性对照组和空白对照组细胞中MⅡPmRNA相对表达量分别为5.856±0.646、1.236±0.116、1.077±0.150;MⅡP蛋白相对表达量分别为 78.336±5.059、40.338±6.656 和 38.050±1.098。实验组细胞中 MⅡPmRNA 相对表达量和MⅡP蛋白表达水平明显高于阴性对照组和空白对照组,差异具有统计学意义（P<0.001）。说明过表达质粒pcDNA3-MⅡP有效上调了卵巢癌SKOV3细胞中MⅡP的表达,可用于后续实验。5.相对于阴性对照组细胞和空白对照组细胞而言,实验组细胞增殖能力明显受到抑制,且随时间的延长增殖能力降低,差异具有统计学意义（P<0.01）。6.实验组、阴性对照组及空白对照组细胞24小时穿膜细胞数分别为:94.200±15.834、149.800±7.949 和 163.600±4.037。实验组细胞穿膜细胞数明显少于阴性对照组和空白对照组细胞,差异具有统计学意义（P<0.001）。7.实验组、阴性对照组和空白对照组细胞中p-65蛋白相对表达量分别为:76.027±3.256、78.273±3.272、80.200±4.409,差异无统计学意义（P>0.05）;p-p65蛋白相对表达量分别为:38.284±4.284、61.768±3.661、63.567±3.577,实验组细胞中p-p65蛋白表达量明显低于阴性对照组和空白对照组,差异具有统计学意义（P<0.01）。ICAM-1 蛋白相对表达量为:41.577±2.347、65.643±5.142、68.621±4.715,实验组细胞中ICAM-1相对表达量明显低于阴性对照组和空白对照组,差异具有统计学意义（P<0.05）。结论1.MⅡP在上皮性卵巢癌组织低表达,且MⅡP蛋白阳性表达与FIGO分期和有无淋巴结转移相关。提示MⅡP的低表达可能促进了上皮性卵巢癌的发生发展。2.过表达MⅡP明显抑制卵巢癌SKOV3细胞的增殖和侵袭能力。MⅡP可被视为卵巢癌的抑癌基因,可能成为上皮性卵巢癌治疗的潜在靶点。3.MⅡP可能通过NF-kB信号通路参与上皮性卵巢癌细胞的增殖和转移。

沈佩烨^[7]（2020）在《内分泌相关泌尿生殖肿瘤的癌变机制与潜在治疗策略研究》文中研究表明内分泌相关的泌尿生殖肿瘤主要包括神经内分泌瘤和生殖内分泌瘤两大类,本文将分别从这两大类探索内分泌相关的泌尿生殖肿瘤的发病机制及潜在治疗策略。本论文的第一部分探索了泌尿系统的神经内分泌肿瘤,膀胱神经内分泌瘤是一种主要起源于尿路上皮多能干细胞的肿瘤,其中以膀胱小细胞癌的恶性程度最高。由于其发病率较低,约占所有膀胱恶性肿瘤的1%。因此,目前对膀胱小细胞癌的研究非常有限,其基因组特征,发病机制和治疗方法还未充分研究清楚。在本研究中,我们收集了12例膀胱小细胞癌临床样本,对其进行全基因组,全外显子组和转录组的测序。通过分析基因组测序结果发现,膀胱神经内分泌瘤的突变图谱与尿路上皮癌极为相似,提示二者具有相同的起源。通过对突变特征的分析,发现膀胱神经内分泌瘤与年龄因素和APOBEC密切相关。同时,在一例样本中还发现其肿瘤形成与已被证实能引起尿路上皮癌的马兜铃酸具有明显相关。基因突变和拷贝数变异影响了细胞中三条主要信号调节通路的基因,包括P53/RB1通路,RTK通路和表观遗传调节通路。转录组测序分析我们发现,肿瘤组织的基因表达谱显着区分于正常组织。同时,在肿瘤样本中鉴定出一些新的异常基因融合,如PVT-ERBB2,发生融合之后能够显着上调编码HER2受体的ERBB2基因的表达。结合以上的测序结果提供的线索,我们对其形成的机制进行研究,发现在尿路上皮癌细胞中同时敲除TP53和RB1能够诱导其通过谱系转化为具有神经内分泌特征的癌细胞,导致其对靶向药物敏感性降低,引起耐药。本研究首次采用多种二代测序的方法绘制了膀胱神经内分泌瘤的基因特征图谱,揭示了膀胱神经内分泌瘤的分子特征和致病因素,为其治疗策略的开发提供依据。本论文的第二部分探索了生殖内分泌肿瘤,卵巢癌作为生殖内分泌肿瘤的一种,其致死率位于妇科肿瘤首位。在过去的几十年中,卵巢癌的标准治疗手段几乎没有突破性进展,导致其致死率居高不下。因此,研究和开发新的治疗策略对于卵巢癌的临床治疗显得尤为重要。卵巢癌的基因组具有低频突变的特点,针对肿瘤特异性驱动突变位点进行药物抑制的方法因此并不适用;癌症基因组图谱联盟（The Cancer Genome Atlas,TCGA）的大样本组学分析表明,几乎所有高级别浆液性卵巢癌（卵巢癌的主要病理类型）都具有大规模的染色体拷贝数变异,是其主要的致病分子机制。由于基因拷贝数的变化不会引起其编码蛋白的序列和功能异常,而是通过对基因和蛋白表达水平的调控促进和维持肿瘤恶性发展,因此我们推断卵巢癌可能对于基因复制和转录具有独特的依赖性。我们采用CRISPR-Cas9基因敲除方法,筛选了3’转录终止复合物核心的23个成员在卵巢癌中的作用,发现CPSF家族基因对卵巢癌细胞增殖尤为重要。敲除CPSF家族中的WDR33,CPSF1,CPSF2和CPSF3能够在体内和体外实验中显着抑制卵巢癌细胞增殖。进一步对CPSF复合体中各成员之间的关系进行分析,发现WDR33对于维持整个复合体的稳定起到了关键作用。采用光漂白等技术发现WDR33能够形成相分离促进CPSF复合体的组装和功能的行使。RNAseq分析结果显示敲除WDR33,CPSF1,CPSF2和CPSF3能够导致染色质组装相关的功能性m RNA表达降低,RNA终止位点切割异常,发生拖尾,从而致使细胞死亡。敲除WDR33,CPSF1,CPSF2和CPSF3后RNA切割障碍,进一步导致其结合在DNA上无法脱离而形成Rloop,引起细胞DNA损伤增加。由于DNA损伤修复依赖PARP等通路,因此在WDR33,CPSF1,CPSF2和CPSF3敲除的细胞中使用PARP抑制剂能够进一步促进肿瘤细胞死亡。以上研究结果表明,转录终止复合体CPSF家族在卵巢癌的发展中起到了关键作用,其中以WDR33,CPSF1,CPSF2和CPSF3尤为重要,靶向其能够显着抑制卵巢癌细胞的增殖,同时,与PARP抑制剂联合具有协同致死作用。本研究增加了对转录终止复合物在卵巢癌中作用机制的认识,并指出CPSF复合物可能成为一个潜在的治疗靶标。

邵文静^[8]（2019）在《LncRNA DLEU1调控子宫内膜癌发展进程的作用及机制研究》文中研究表明子宫内膜癌（endometrial carcinoma,EC）是绝经期及围绝经期女性常见的生殖系统恶性肿瘤、位居第二位,在发达国家女性恶性肿瘤中占据第四位[1],近年来EC新发病例人数及死亡人数成倍增加[2-4],威胁着全世界妇女的健康。中国国家癌症中心统计分析结果显示,随着人们生活模式的改变、饮食结构的调整以及激素类食品药品的无意识暴露,子宫内膜癌的发病率呈逐年上升且发病年龄呈年轻化趋势,严重影响了老年妇女的健康寿命及育龄期妇女的生殖健康,给家庭及社会带来重大的影响[5]。子宫内膜癌的发生发展是环境因素和遗传变异相互作用的结果,涉及多种基因和转录因子的差异性表达、细胞信号转导通路调节异常以及细胞微环境稳态失衡等一系列因素,不同的病理改变和分子特征决定了EC患者的风险水平和预后情况。长链非编码RNAs（long non-conding RNA,LncRNAs）是一类不能编码蛋白质、转录长度超过200个核苷酸的RNA分子,可通过参与表观遗传、转录及转录后途径调控靶基因的表达[6,7],与多种肿瘤的增殖、迁移及侵袭过程有关。一些异常表达的LncRNAs在子宫内膜癌生物学过程中发挥原癌基因的作用[8-10],促进肿瘤的病程进展。DLEU1是一种定位于人染色体13q14.2-q14.3区域、高度保守的LncRNA,又称为淋巴细胞白血病缺失基因1（deleted in lymphocytic leukemia 1）,在多种实体肿瘤中(如骨肉瘤[11]、胶质瘤[12]、肝细胞癌[13]及膀胱癌[14]等)呈高水平表达;在女性生殖系统肿瘤如宫颈癌[15]、子宫内膜癌[16]及卵巢癌[17]中,DLEU1同样发挥着重要的作用。在卵巢上皮来源恶性肿瘤中[17],DLEU1可能作为竞争性内源性RNA（ceRNA）海绵吸附miRNA、消除miRNA表达及作用进而对靶基因表达进行调控,对肿瘤细胞的增殖活性、EMT过程、迁移及侵袭能力起促进作用,在肿瘤中可能存在着DLEU1-miRNA-mRNA调控轴作用机制。众多研究结果显示,miR-490能够通过调控下游靶基因表达发挥其抑癌基因的功能,从而影响如胶质瘤[18]、前列腺癌[19]、肝细胞癌[20]、卵巢癌[21]及乳腺癌[22]等恶性肿瘤的发生和发展。SP1是一种核转录因子,是一种序列特异性的DNA结合蛋白,SP1在肿瘤的生长和转移过程中通过调控癌基因、抑癌基因、细胞周期调节因子和生长相关细胞信号转导通路等参与了肿瘤细胞增殖、凋亡、新生血管、迁移及侵袭等过程[23-26],在小细胞肺癌[23]、宫颈癌[24]、子宫内膜癌[25]及乳腺癌[26]等多种恶性肿瘤中发挥着重要的作用。在卵巢癌[170]、子宫内膜癌[225]、宫颈癌[172]、乳腺癌[173]及肝细胞癌[171]等多种实体肿瘤中SP1本身的表达水平也受到包括miRNA在内的多种上游转录因子及细胞信号转导通路的调控。在不同的肿瘤中,不同的miRNA作为上游因子靶向调控SP1,通过影响SP1的表达进而影响肿瘤细胞的恶性生物学行为及病情进展。有研究报道显示DLEU1在EC中呈高水平表达[16],但DLEU1在EC中的准确表达模式、生物学功能以及潜在的分子机制尚不清楚。因此,本研究探讨在EC中DLEU1通过消除miR-490的表达及作用进而调控靶基因SP1的转录,旨在解明子宫内膜癌中可能存在DLEU1-miR-490-SP1调控轴作用机制。目的:本研究为解明调控子宫内膜癌发展进程的分子机理,通过研究DLEU1在子宫内膜癌表达水平及其与临床病理改变及预后的相关性分析;DLEU1表达水平对子宫内膜癌细胞恶性生物学行为的影响;miR-490在DLEU1调控子宫内膜癌细胞恶性生物学行为过程中所发挥的作用以及DLEU1通过DLEU1-miR-490-SP1调控轴促进子宫内膜癌细胞恶性生物学行为的作用机制,为临床极早从分子水平遏制子宫内膜癌的发展进程提供研究依据。方法:1.采用qRT-PCR法检测EC组织及正常子宫内膜组织,HHUA、KLE、Ishikawa、ECC-1子宫内膜癌细胞株及正常子宫内膜细胞中DLEU1表达情况。2.利用shRNA基因干扰技术抑制Ishikawa细胞DLEU1表达,MTT、流式细胞技术、Transwell小室实验、Western blot等方法检测Ishikawa细胞增殖活性、细胞凋亡情况、细胞的迁移及侵袭能力、凋亡以及EMT过程相关蛋白表达情况。3.采用qRT-PCR法检测EC组织及正常子宫内膜组织,HHUA、KLE、Ishikawa、ECC-1子宫内膜癌细胞株及正常子宫内膜细胞中miR-490表达情况。4.采用qRT-PCR法检测sh-DLEU1基因干扰抑制Ishikawa细胞DLEU1表达后miR-490的表达情况。5.利用miR-490 inhibitor抑制Ishikawa细胞miR-490表达及作用,MTT、流式细胞技术、Transwell小室实验、Western blot等方法检测Ishikawa细胞增殖活性、细胞凋亡情况、细胞的迁移及侵袭能力、凋亡以及EMT过程相关蛋白表达情况。6.荧光素酶报告基因技术检测miR-490的靶基因及其结合位点。7.利用si RNA基因干扰技术抑制Ishikawa细胞SP1表达,MTT、流式细胞技术、Transwell小室实验、Western blot等方法检测Ishikawa细胞增殖活性、细胞凋亡情况、细胞的迁移及侵袭能力、凋亡以及EMT过程相关蛋白表达情况。结果:1.DLEU1在子宫内膜癌中表达情况及其与临床病理改变及预后的相关性（1）DLEU1在EC组织中表达水平（3.17±0.92）显着高于正常子宫内膜组织（0.97±0.43）（P<0.05）。（2）DLEU1在HHUA（2.74±0.22）、KLE（3.45±0.46）、Ishikawa（3.77±0.25）、ECC-1（2.52±0.24）细胞株中表达水平显着高于正常子宫内膜细胞（0.98±0.12）（P<0.05）,其中在Ishikawa细胞株中表达水平最高。（3）DLEU1在EC组织中呈高水平表达,在晚期、高级别子宫内膜癌中呈高表达趋势。2.DLEU1表达对子宫内膜癌细胞恶性生物学行为的影响（1）sh-DLEU1转染Ishikawa细胞后,DLEU1表达水平（0.38±0.18）与sh-NC组（0.98±0.15）相比明显下降（P<0.05）。（2）与sh-NC组相比,DLEU1表达水平下降后Ishikawa细胞增殖活性明显降低（P<0.05）;细胞凋亡率百分比明显增高（P<0.05）;促凋亡相关蛋白（Bax、cleaved-caspase-3及cleaved-caspase-9）表达增加,抑制凋亡相关蛋白（Bcl-2）表达减少;细胞迁移及侵袭能力降低（P<0.05）;EMT过程减弱（E-cadherin蛋白表达增加,N-cadherin、Snail及Vimentin蛋白表达减少）。3.DLEU1通过消除miR-490表达及作用调控子宫内膜癌细胞恶性生物学行为（1）sh-DLEU1转染Ishikawa细胞后,miR-490表达水平（3.33±0.30）与sh-NC组（0.99±0.15）相比明显升高（P<0.05）。（2）miR-490在EC组织中（0.54±0.28）表达水平显着低于正常子宫内膜组织（0.92±0.41）（P<0.05）;miR-490在HHUA（0.57±0.11）、KLE（0.35±0.11）、Ishikawa（0.24±0.08）、ECC-1（0.56±0.12）子宫内膜癌细胞株中表达水平显着低于正常子宫内膜细胞（0.97±0.14）（P<0.05）,其中在Ishikawa细胞株中表达水平最低。（3）与sh-DLEU1组相比,miR-490表达及作用受到抑制后Ishikawa细胞增殖活性升高（P<0.05）;细胞凋亡率百分比降低（P<0.05）;促凋亡相关蛋白（Bax、cleaved-caspase-3及cleaved-caspase-9）表达减少,抑制凋亡相关蛋白（Bcl-2）表达增加;细胞迁移及侵袭能力增强（P<0.05）;EMT过程增强（E-cadherin蛋白表达减少,N-cadherin、Snail及Vimentin蛋白表达增加）。4.DLEU1通过DLEU1-miR-490-SP1轴调控子宫内膜癌细胞恶性生物学行为的作用机制（1）荧光素酶报告基因检测结果显示,在Ishikawa细胞中,野生型SP1-3,UTR质粒与miR-490 mimic质粒共转染后细胞的荧光素酶表达量（0.43±0.09）较mimic control组（0.96±0.16）表达量明显降低（P<0.05）;突变型SP1-Mut 3,UTR质粒与miR-490 mimic质粒共转染后细胞的荧光素酶表达量（0.96±0.08）与mimic control组（0.97±0.09）接近（P>0.05）。（2）与control组相比较,增强miR-490表达及作用后Ishikawa细胞中SP1mRNA（0.47±0.13）（P<0.05）及SP1蛋白表达水平降低,抑制miR-490表达及作用后Ishikawa细胞中SP1 mRNA（2.95±0.21）（P<0.05）及SP1蛋白表达水平升高。（3）与miR-490 inhibitor组相比,抑制SP1表达后Ishikawa细胞增殖活性降低（P<0.05）;细胞凋亡率百分比升高（P<0.05）;促凋亡相关蛋白（Bax、cleaved-caspase-3及cleaved-caspase-9）表达增加,抑制凋亡相关蛋白（Bcl-2）表达减少;细胞迁移及侵袭能力降低（P<0.05）,EMT过程减弱（E-cadherin蛋白表达增加,N-cadherin、Snail及Vimentin蛋白表达减少）。结论:1.DLEU1在子宫内膜癌组织及细胞中呈高水平表达,并且在晚期及高级别子宫内膜癌组织呈现更高比率的高水平表达;表明DLEU1作为癌基因参与了子宫内膜癌的发生发展过程。2.DLEU1增强了子宫内膜癌细胞增殖活性及抑制了其凋亡水平;增强了子宫内膜癌细胞的迁移、侵袭能力及促进EMT过程。证明DLEU1对子宫内膜癌细胞的恶性生物学行为起正性调节作用。3.在子宫内膜癌中DLEU1与miR-490存在负性调节关系。miR-490在子宫内膜癌组织及细胞中呈低水平表达,证明miR-490作为抑癌基因参与了子宫内膜癌的发生发展过程。4.抑制miR-490表达及作用可以使抑制DLEU1表达后子宫内膜癌细胞恶性生物学行为的“遏制状态”解除,证明DLEU1通过海绵吸附miR-490、消除miR-490表达及作用促进子宫内膜癌细胞恶性生物学行为。5.在子宫内膜癌Ishikawa细胞中miR-490靶向调控SP1,结合位点是3,UTR端,miR-490对SP1起负性调控作用。6.DLEU1通过DLEU1-miR-490-SP1调控轴促进子宫内膜癌细胞恶性生物学行为及子宫内膜癌病变进展。

杨茗钫^[9]（2019）在《Capn4在卵巢癌中的生物学功能及其对顺铂化疗敏感性影响的机制研究》文中研究表明卵巢癌是妇科常见恶性肿瘤之一,因其起病较隐匿、转移性强、预后差,发病率和死亡率均位居妇科恶性肿瘤前列。近年来,随着卵巢癌的诊断和治疗方法的新进展使早期发现的患者长期存活率有了较明显改观。然而,由于卵巢癌临床症状不明显,大多数患者被诊断时已为已有卵巢癌盆腔转移或淋巴转移,患者预后极差,且死亡率高,5年生存率低于40%。目前,卵巢癌细胞减灭术及手术后辅以铂类药物联合紫杉醇为主的一线化疗是卵巢癌临床治疗的标准方案,但随着肿瘤药物化疗敏感性的降低及耐药情况增加,现行的卵巢癌临床化疗效果却不甚理想。尽管许多临床医生和研究学者都在寻求更有效的新治疗手段和治疗药物中进行了许多有益的探索和尝试,然而卵巢癌患者的生存率依然未获得有效改观。因此,在不同层面对卵巢癌发生发展进行相关研究,寻找到特异性强的基因靶点、有效的治疗手段和治疗药物迫在眉睫。钙蛋白酶（Calpains）是一种高度保守的钙依赖型非溶酶体半胱氨酸蛋白酶家族,其选择性催化参与各种细胞过程（包括迁移、运动、增殖和凋亡）特异性底物蛋白的水解。目前,已有15种钙蛋白酶表型在哺乳动物中被鉴定。其中,Capn4作为钙蛋白酶蛋白水解系统中重要的小调节亚基,在维持钙蛋白酶-1（Calpain-1）和钙蛋白酶-2（Calpain-2）稳定性和活性中具有极其重要的作用。诸多研究证实钙蛋白酶在多种恶性肿瘤中高表达,且与肿瘤患者的恶性程度和预后关系密切。然而,在本研究实施前尚未见学者对Capn4在卵巢癌组织中的表达及其具体机制进行全面和深入的研究。无法了解Capn4在卵巢癌发生发展及预后中可能承担的角色,其是否可作为卵巢癌潜在的预后和早期诊断或早期治疗的基因靶点值得深入研究。因此,我们本研究目的旨在考察Capn4在卵巢癌组织中的表达情况,阐明Capn4表达与卵巢癌患者临床病理特征及患者预后的相关性,探讨其在卵巢癌细胞增殖、凋亡、侵袭以及迁移中的作用及可能的分子机制,并进一步研究Capn4对卵巢癌顺铂化疗敏感性的影响及相关作用机制,以期明确Capn4在提高卵巢癌顺铂化疗药物的敏感性,改善患者预后的作用,最终为以Capn4的靶向治疗提供更多新的实验依据。第一部分Capn4在卵巢癌组织中的表达及其预后相关性研究目的:检测Capn4基因在卵巢癌组织中的表达水平,分析Capn4在卵巢癌组织中表达差异与卵巢癌患者临床病理特征之间的关系,并考察其与卵巢癌患者的预后相关性。方法:选择在南昌大学第一附属医院收治确诊并进行手术切除、病理诊断确诊为卵巢癌的组织标本113例作为研究组,癌旁正常组织35例作为对照组,采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）、Western-blot及免疫组化的实验方法,分别检测Capn4的mRNA、蛋白的表达水平以及阳性表达情况;采用卡方检验方法分析Capn4表达与临床病理参数之间的相关性,并通过对入选卵巢癌患者进行5年总生存期随访;运用Kaplan-Meier生存曲线分析Capn4表达情况与无疾病进展生存期及总生存期之间的关系;运用单因素及多因素Cox回归分析方法确定Capn4表达能否作为卵巢癌患者总生存期预后的危险因素。结果:与癌旁正常组织比较,卵巢癌组织中Capn4的mRNA及蛋白表达水平均显着升高（p<0.05）,卵巢癌组织中高表达组Capn4表达显着高于低表达组（P=0.0054）;卡方检验分析结果显示Capn4表达水平与卵巢癌患者临床病理参数FIGO分期、远处转移、肿瘤分级呈正相关（P<0.05）;Kaplan-Meier生存曲线分析证实Capn4表达与卵巢癌患者无疾病进展生存期及总生存期之间呈负相关,Capn4高表达的卵巢癌患者预后较差（P=0.006）;Cox回归分析发现Capn4的表达可以作为卵巢癌患者预后的一个独立危险因素（HR=2.157,95%CI:1.091-3.138,P=0.014）。结论:Capn4在卵巢癌组织中异常表达与卵巢癌恶性程度成正相关,且与患者的不良预后关系密切,Capn4可作为卵巢癌患者预后的独立危险因素。第二部分Capn4对卵巢癌生物学行为的影响及机制研究目的:观察和评估Capn4对卵巢癌细胞的增殖、凋亡、侵袭及迁移等生物学行为产生的影响,并探讨其可能的作用机制。方法:采用qRT-PCR方法检测Capn4在不同级别的卵巢癌细胞（A278、SKOV3、OVCAR-3）与正常卵巢上皮细胞HOSEPIC的表达情况;采用瞬时转染技术干扰SKOV3、OVCAR-3细胞系中Capn4的表达,应用qRT-PCR、Western-blot方法检测稳定转染干扰RNA后Capn4在卵巢癌细胞中的干扰表达效率;运用MTS实验、克隆形成实验、细胞侵袭实验、划痕实验、流式细胞术等实验方法,检测卵巢癌细胞株中Capn4-siRNA瞬时干扰后Capn4的表达,分别观察和评价Capn4对卵巢癌细胞的增殖、侵袭以及迁移的影响;并进一步采用Western blot方法检测Capn4干扰表达后与细胞周期、凋亡、侵袭、迁移相关蛋白的表达情况,以探索其对生物学行为影响可能的分子机制。结果:与正常卵巢上皮细胞比较,在不同卵巢癌细胞（A278、SKOV3、OVCAR-3）中Capn4表达均显着升高（P<0.05）;在卵巢癌SKOV3、OVCAR-3细胞中瞬时转染干扰序列Capn4-siRNA后,与空白组比较,Capn4-siRNA组中Capn4表达显着下调（P<0.05）;体外细胞实验研究发现经瞬时转染Capn4-siRNA干扰序列后,Capn4抑制表达能显着降低卵巢癌细胞增殖和细胞克隆能力,并促进卵巢癌细胞的凋亡;Capn4抑制表达可降低卵巢癌细胞中细胞周期相关蛋白Cyclin-D1、CDK4、p-Rb的表达,使细胞周期阻滞在G0/G1。Capn4抑制表达可影响基质金属蛋白酶MMP2、MMP9以及上皮间质转化相关蛋白Vimentin、E-cadherin的表达,使卵巢癌细胞的上皮间质转化过程受阻,抑制其侵袭迁移。结论:Capn4在卵巢癌细胞中高表达;干扰Capn4的表达可显着降低卵巢癌细胞的增值、侵袭与迁移能力,促进细胞凋亡。第三部分Capn4影响卵巢癌顺铂化疗敏感性的研究目的:初步探讨Capn4表达对卵巢癌顺铂化疗敏感性的影响及其可能的作用机制。方法:运用siRNA瞬时干扰技术沉默卵巢癌细胞（SKOV3、OVCAR-3）中Capn4的表达,采用MTS实验方法检测并评估Capn4对卵巢癌中顺铂化疗敏感性,并使用流式细胞术对其结果进行验证;采用western-blot方法对Capn4影响顺铂在卵巢癌化疗药物敏感性的作用机制进行检测和初步探讨。结果:干扰卵巢癌细胞（SKOV3、OVCAR-3）中Capn4的表达后,和对照组相比,卵巢癌细胞增殖能力显着下降,顺铂的IC50值明显降低,差异具有显着性（P<0.05）。随后的流式细胞术检测结果显示,相对于对照组,Capn4抑制表达后顺铂导致的卵巢癌细胞凋亡数目明显的增加;此外,顺铂对Capn4的表达呈现浓度和时间双重依赖性。Capn4抑制可导致凋亡相关蛋白Caspase-3及Bax蛋白的上调表达,Bcl-2及核苷酸切除修复相关蛋白ERCC1的表达降低,从而提高了顺铂在卵巢癌细胞中的化疗敏感性。结论:Capn4抑制表达可提高顺铂在卵巢癌细胞（SKOV3、OVCAR-3）中的药物敏感性,其可能的作用机制是通过Capn4的表达影响肿瘤细胞凋亡相关蛋白Caspase-3、Bax、Bcl-2及核苷酸切除修复相关蛋白ERCC1表达。

陈骞^[10]（2019）在《AKT/mTOR介导的ARL4C稳定性促进PTEN缺失型胶质母细胞瘤的侵袭能力》文中进行了进一步梳理原发性胶质母细胞瘤（glioblastoma,GBM）是颅内恶性程度最高的一类脑肿瘤,约占所有预后不良脑肿瘤的90%。GBM目前以手术治疗为主,辅以放化疗,但胶质母细胞瘤细胞具有高侵袭能力,临床上大部分GBM患者五年生存率不足5%。PTEN变异或缺乏（人第10号染色体缺失磷酸酶）的GBM约占所有GBM的40%,相对于PTEN非缺失型GBM,其预后更差。PTEN缺失型的GBM具有更强的侵袭表型。本文以PTEN缺失型GBM获得高侵袭能力的原因和机制为主要切入点,为PTEN缺失型GBM的分子靶向治疗提供理论基础和治疗靶点。ARL4（ADP-核糖基化样因子4）家族,是一类小G蛋白,其组员包括ARL4A,ARL4C和ARL4D,主要功能是介导细胞的扩散和迁移。因此,ARL4家族被认为是肿瘤发生、发展的关键基因家族。最近有文献报道,在胶质瘤中,ARL4D的表达高低与PTEN的状态密切相关。但进一步研究显示,U87-MG细胞过表达ARL4D后,肿瘤细胞的恶性生物学行为无明显改变,表明ARL4D过表达对GBM的进展无影响。ARL4A突变易发生在脉络丛乳头状瘤和非典型乳头状瘤中。文献报道ARL4C参与包括大肠癌、肺癌和平滑肌肉瘤细胞的迁移、侵袭和增殖,因此被认为是治疗大肠癌肺癌等的治疗靶点。但在卵巢癌中的研究发现,其在卵巢癌中充当抑癌基因,抑制卵巢癌的发生、发展。上述结果表明,ARL4家族在肿瘤中的作用与肿瘤类型有关,其在GBM中的作用及其机制尚不清楚,有待进一步研究。本研究发现,ARL4家族中的ARL4C在PTEN缺失型GBM的发生发展中至关重要。机制上,我们发现在PTEN缺失型GBM中存在有AKT/mTOR信号通路异常激活,从而抑制了ARL4C蛋白泛素化和降解。更重要的是,过表达ARL4C可以部分逆转由于PTEN过表达对肿瘤进展抑制的影响。通过微阵列分析和GST-Pull down法进一步研究表明,ARL4C通过活化RAC1信号通路促进瘤细胞的伪足生成,从而促进其侵袭能力。我们通过对GBM患者临床样本免疫组化染色分析发现,PTEN与ARL4C表达呈负性相关,且PTEN缺失ARL4C高表达患者的预后更差。因此,本研究结果提示,ARL4C是介导PTEN缺失型GBM恶性生物学行为的关键分子,同时它也可能成为原发性PTEN缺失型GBM提供了新的预后标记物和潜在治疗靶点。主要的结果、结论如下:1.高表达ARL4C的PTEN缺失型GBM患者预后更差。1.1 ARL4C在PTEN缺失型GBM中高表达。通过Western blotting检测了ARL4A,ARL4C和ARL4D在PTEN缺失型和PTEN野生型GBM手术切除组织样本和细胞中的表达情况。结果显示,ARL4C的表达与PTEN呈负性相关;ARL4A和ARL4D与PTEN的表达无相关性。通过免疫组化染色检测了128例胶质母细胞瘤样本中PTEN和ARL4C的表达并评分分析,结果表明ARL4C和PTEN之间存在显着的负相关（P=0.021）。1.2 ARL4C的表达水平与患者临床病理参数Ki67等密切相关。通过x-tile统计软件相关风险分析确定了免疫组化评分的分段值,此分段值用于区分ARL4C低表达和高表达患者。卡方检验结果显示,ARL4C与增殖指数Ki67呈正相关（P=0.020）。与患者年龄（P=0.534）、性别（P=0.912）、肿瘤位置（P=0.100）、KPS评分（P=0,623）及EGFR突变状态（P=0.232）无相关性。在对64例胶质母细胞瘤患者ARL4C和MGMT甲基化状态的检测结果未发现二者有明显的相关性。上述结果表明ARL4C是与GBM增殖密切相关的分子。1.3 ARL4C联合PTEN可作为原发性GBM判断预后的标记物。采用Kaplan-meier对128例GBM患者的生存期进行分析,结果显示,ARL4C高表达、PTEN低表达的GBM患者的总生存期（OS）（P=0.0030）和无进展生存期（PFS）（P=0.0025）显着缩短。对371例来自TCGA-数据库的原发性胶质母细胞瘤患者的生存分析结果一致,即,ARL4C高表达PTEN低表达患者的OS（P=0.0288）和PFS（P=0.0069）比其余分组患者要短。单因素（P=0.004）和多因素分析（P=0.0011）结果显示,联合检测ARL4C与PTEN能够作为预测GBM的独立预后指标。以上数据均证明胶母细胞中ARL4C的表达与PTEN的状态有关,并且两者联合能够有效判断病人预后。2.在PTEN缺失型GBM中,AKT/mTOR通路异常激活能够维持ARL4C的稳定性。2.1 PTEN缺失型GBM通过AKT/mTOR信号通路调控ARL4C表达。已有文献报道,PTEN缺失导致AKT/mTOR持续磷酸化,从而激活信号通路中的关键分子。为了研究PTEN和ARL4C间的关系,我们在PTEN缺失型GBM细胞（U87-MG,GBM-1;GBM-2）中过表达PTEN,细胞中ARL4C和p-AKTs473水平明显降低,但在ARL4C低表达的GBM细胞（GBM-3 LN-220）中过表达ARL4C后,PTEN的表达水平无变化。在PTEN非缺失型GBM细胞（GBM-3 LN-229）中敲低PTEN,发现ARL4C和p-AKTs473表达水平显着升高。此外,AKT抑制剂MK2206或mTOR抑制剂CCI-779可显着降低PTEN缺失型GBM细胞（U87-MG GBM-1,GBM-2）中ARL4C的表达。上述结果表明,在GBM细胞中,PTEN可通过AKT/mTOR信号通路调控ARL4C的表达,而ARL4C并不能反馈性调控PTEN的表达。2.2 AKT/mTOR信号通路维持GBM细胞ARL4C的稳定性。进一步研究发现,AKT或mTOR抑制剂处理GBM细胞后,ARL4C mRNA水平无明显变化,这表明AKT/mTOR信号通路可能通过翻译后修饰介导ARL4C的表达。为了检验AKT/mTOR对ARL4C蛋白翻译后的调控能力,我们使用放线菌酮CHX来检测AKT抑制剂MK2206处理前后及mTOR抑制剂CCI-779处理前后,细胞ARL4C的半衰期。我们发现AKT和mTOR抑制剂均显着缩短了ARL4C的半衰期。大量文献表明泛素化是影响蛋白质降解的主要原因。我们在细胞培养基中加入蛋白酶体抑制剂MG-132,发现AKT抑制剂MK-2206或mTOR抑制剂CCI-779引起的ARL4C水平降低能够被蛋白酶体抑制剂MG132部分恢复。当AKT抑制剂MK-2206或mTOR抑制剂CCI-779处理后,ARL4C蛋白的泛素化水平明显增加,这表明AKT/mTOR信号通路参与了GBM细胞ARL4C的泛素化降解。3.ARL4C在PTEN缺失型GBM的进展中发挥了至关重要的作用。3.1 PTEN/ARL4C在原发性GBM的进展中起着重要作用。在PTEN野生型GBM细胞中过表达ARL4C,我们发现ARL4C过表达能够部分克服PTEN对瘤细胞侵袭和迁移的抑制作用。此外,体内动物实验结果表明,ARL4C过表达部分克服了PTEN过表达对GBM细胞体内生长的抑制作用。ARL4C过表达部分抵消了PTEN过表达引起的肿瘤侵袭能力的抑制,同时也抑制了由PTEN过表达引起的荷瘤鼠生存时间的延长。上述结果均表明,ARL4C在PTEN缺失型胶质母细胞的恶性进展中发挥着重要作用。3.2下调或过表达ARL4C均可显着改变GBM细胞的侵袭性。在PTEN缺失型GBM细胞（GBM-1,GBM-2和U87-MG）中下调ARL4C,瘤细胞的运动能力明显降低。在PTEN野生型GBM细胞（GBM-3和LN229）中过表达ARL4C可显着提高细胞的迁移性。3.3 ARL4C促进了GBM细胞的增殖活性。在3D细胞培养模型中,抑制ARL4C表达可显着降低GBM细胞的Ki67增殖指数。此外,在ARL4C-下调的荷瘤鼠中Ki-67增殖指数显着降低,提示ARL4C参与GBM细胞的增殖。3.4 ARL4C下调表达可显着抑制PTEN缺失型GBM细胞的体内成瘤能力,并延长荷瘤鼠的生存时间。颅内小动物成像检测结果显示,颅内移植入下调ARL4C的GBM细胞其成瘤能力显着低于对照组。ARL4C下调GBM细胞所形成的荷瘤鼠存活时间较对照组明显延长,且移植瘤的侵袭能力明显降低。移植瘤组织切片进行免疫组化染色,发现GTP-RAC1,MMP2的表达量明显降低。4.ARL4C通过RAC1介导伪足的生成,促进瘤细胞的侵袭能力。4.1 ARL4C与GBM细胞的伪足形成有关。在原代GBM细胞中下调ARL4C后,与对照组细胞相比,伪足阳性细胞率显着降低;过表达ARL4C,伪足阳性细胞率显着增加。4.2 ARF6/RAC1是ARL4C介导GBM细胞伪足形成的关键途径。基因芯片分析显示,ARF6作为一种可以激活RAC1亚基β-pix的蛋白,在差异性基因集与肌动蛋白合成的基因集中数值最大。同时我们评估了过表达或者下调ARL4C对RAC1活性的影响,发现过表达ARL4C后增加了该细胞中RAC1的活性,下调ARL4C减少了该细胞中RAC1的活性。4.3 ARL4C/RAC1通路介导GBM细胞伪足生成。在细胞培养基中加入25μM RAC1抑制剂后,活化的RAC1表达水平明显降低。且RAC1抑制剂可抑制过表达ARL4C引起的侵袭能力和相应的伪足生成。表明,RAC1是ARL4C调控伪足生成和细胞侵袭的重要的下游靶分子。以上研究成果表明ARL4C/RAC1轴参与PTEN缺失型GBM的生长与侵袭密切相关。结论:1.在原发性胶质母细胞瘤中,ARL4C的高表达与PTEN的缺失呈正性相关2.PTEN通过抑制AKT/mTOR信号通路从而促进了ARL4C的泛素化降解。3.体外和体外实验证明PTEN/ARL4C轴在胶母细胞的的侵袭与增殖是非常重要的,说明ARL4C是PTEN缺失型胶母的治疗靶点。4.ARL4C通过ARF6/RAC1信号通路促进了细胞伪足的生成。5.ARL4C不仅能够作为原发性胶母的判断预后的标记物,更能够与PTEN联合检测诊断原发性胶质母细胞瘤病人的预后。

二、抑癌基因、癌基因在卵巢癌的表达及其预后（论文开题报告）

（1）论文研究背景及目的

此处内容要求：

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例：

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

（2）本文研究方法

调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、抑癌基因、癌基因在卵巢癌的表达及其预后（论文提纲范文）

（1）PRR11基因在卵巢癌中的生物学功能及其机制研究（论文提纲范文）

（2）基因修饰卵巢癌细胞株的构建及PTK2对卵巢癌细胞生物学行为影响的研究（论文提纲范文）

（3）miR-195-5p在卵巢癌中的作用与机制研究（论文提纲范文）

（4）SP1、KLF4和P21在卵巢上皮性癌的表达及意义（论文提纲范文）

（5）P53、vimentin、Ki-67的表达及血清CA125变化与上皮性卵巢癌预后分析（论文提纲范文）

（6）MIIP在上皮性卵巢癌组织的表达及对SKOV3细胞增殖和侵袭的影响（论文提纲范文）

（7）内分泌相关泌尿生殖肿瘤的癌变机制与潜在治疗策略研究（论文提纲范文）

（8）LncRNA DLEU1调控子宫内膜癌发展进程的作用及机制研究（论文提纲范文）

（9）Capn4在卵巢癌中的生物学功能及其对顺铂化疗敏感性影响的机制研究（论文提纲范文）

（10）AKT/mTOR介导的ARL4C稳定性促进PTEN缺失型胶质母细胞瘤的侵袭能力（论文提纲范文）

四、抑癌基因、癌基因在卵巢癌的表达及其预后（论文参考文献）

• [1]PRR11基因在卵巢癌中的生物学功能及其机制研究[D]. 朱静. 中国人民解放军陆军军医大学, 2020(07)
• [2]基因修饰卵巢癌细胞株的构建及PTK2对卵巢癌细胞生物学行为影响的研究[D]. 闫欢. 郑州大学, 2020(02)
• [3]miR-195-5p在卵巢癌中的作用与机制研究[D]. 刘翔宇. 天津医科大学, 2020(06)
• [4]SP1、KLF4和P21在卵巢上皮性癌的表达及意义[D]. 薛云. 青岛大学, 2020(01)
• [5]P53、vimentin、Ki-67的表达及血清CA125变化与上皮性卵巢癌预后分析[D]. 魏娜. 华北理工大学, 2020(02)
• [6]MIIP在上皮性卵巢癌组织的表达及对SKOV3细胞增殖和侵袭的影响[D]. 石鸿玉. 郑州大学, 2020(02)
• [7]内分泌相关泌尿生殖肿瘤的癌变机制与潜在治疗策略研究[D]. 沈佩烨. 上海交通大学, 2020(01)
• [8]LncRNA DLEU1调控子宫内膜癌发展进程的作用及机制研究[D]. 邵文静. 吉林大学, 2019(02)
• [9]Capn4在卵巢癌中的生物学功能及其对顺铂化疗敏感性影响的机制研究[D]. 杨茗钫. 南昌大学, 2019(01)
• [10]AKT/mTOR介导的ARL4C稳定性促进PTEN缺失型胶质母细胞瘤的侵袭能力[D]. 陈骞. 中国人民解放军陆军军医大学, 2019(03)