潘家钰[1]（2020）在《雌二醇对人晶状体上皮细胞SIRT1/P53通路的影响及其抗凋亡作用研究》文中研究说明目的:通过体外培养人晶状体上皮细胞系HLE-B3,以一定浓度过氧化氢（H2O2）诱导其发生凋亡,模拟年龄相关性白内障的发生机制,观察不同浓度雌二醇（E2）对各组人晶状体上皮细胞增殖、凋亡的情况,及沉默信息调节因子1（SIRT1）、P53、乙酰化P53(Ac-P53)等表达的影响,以探讨E2对H2O2诱导的HLE-B3细胞氧化损伤的保护机制,以及SIRT1/P53通路在其中发挥的作用,为进一步了解E2保护HLECs的机制提供新的思路。方法:1、体外培养人晶状体上皮细胞HLE-B3,分别用不同浓度的H2O2(0μmol.L-1,50μmol.L-1,100μmol.L-1,200μmol.L-1,400μmol.L-1)予以HLE-B3作用不同时间（0h,1h,6h,12h,24h）,根据细胞计数盒8（CCK-8）和流式细胞学结果选择最佳浓度和合适时间。2、体外培养人晶状体上皮细胞HLE-B3,分别用不同浓度的烟酰胺（NAM）(0μmol.L-1,25μmol.L-1,50μmol.L-1,100μmol.L-1,200μmol.L-1)作用于正常培养的HLE-B3,根据CCK-8结果选择NAM最佳作用浓度。3、将HLE-B3随机分成5组:空白对照组,模型组（100μmol.L-11 H2O2）,低浓度E2组(100μmol L-11 H2O2+0.01μmol.L-1E2),中浓度E2组(100μmol.L-1H2O2+0.1μmol.L-1E2),高浓度E2组(100μmol.L-11 H2O2+1μmol.L-1E2),采用CCK-8检测细胞增殖率,流式细胞学检测细胞凋亡率,观察不同浓度E2对HLECs活力及凋亡率的影响,光学显微镜观察细胞生长状态,实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测SIRT1 mRNA、P533 mRNA表达,Western-blot检测SIRT1、P53、乙酰化P53(Ac-P53)蛋白表达,共聚焦免疫荧光检测SIRT1分布及荧光强度。4、将HLE-B3随机分成3组,空白对照组,模型组（100μmol.L-11 H2O2）,NAM组(100μmol.L-11 H2O2+50μmol.L-1NAM),观察各组HLECs细胞形态的变化,采用CCK-8、流式细胞学技术分别检测各组HLECs增殖、凋亡率,Western-blot检测Ac-P53蛋白表达情况。统计学方法:运用SPSS19.0统计学软件对每组实验的数据进行统计分析,多组样本均数之间的比较采用单因素方差分析（ANOVA）,组间两两比较采用LSD-t检验,数据结果用?x±s表示,其中P<0.05认为差异具有统计学意义。结果:1、H2O2和NAM的最佳浓度选择:根据CCK-8和流式细胞学检测的结果,选择100μmol.L-11 H2O2为诱导HLE-B3细胞氧化损伤的最佳浓度,作用时间为12h;50μmol.L-11 NAM是作用于HLE-B3的最佳浓度,作用时间12h。2、CCK-8检测显示:低、中、高浓度E2组的增殖率均高于模型组（均为P<0.05）,NAM组的细胞增殖率低于空白对照组、模型组（均为P<0.05）。3、流式细胞学检查显示:模型组细胞凋亡率高于其它各组（均为P<0.05）,组间凋亡率相比,空白对照组<高浓度E2组<低浓度E2组<模型组（均为P<0.05）,中、低浓度E2组差异无统计学意义（P>0.05）;NAM组的细胞凋亡率较模型组高（P<0.05）。4、RT-qPCR结果显示:SIRT1 mRNA表达随着E2浓度的升高而增加,高浓度E2组>中浓度E2组>低浓度E2组>模型组>空白对照组（均为P<0.05）;空白对照组中P533 mRNA表达低于其它各组（均为P<0.05）,其余各组之间两两比较,差异均无统计学意义（均为P>0.05）。5、Western blot结果显示:SIRT1蛋白表达量随着E2浓度升高其表达依次增加（均为P<0.05）;而Ac-P53在模型组的表达高于空白对照组和各浓度E2组（均为P<0.05）,且低浓度E2组>中浓度E2组>高浓度E2组（均为P<0.05）;空白对照组中P53表达低于其它各组（均为P<0.05）,其余各组之间两两比较,差异均无统计学意义（P>0.05）;NAM组的Ac-P53蛋白过表达,显着高于模型组、空白对照组（均为P<0.05）。6、共聚焦免疫荧光结果示:SIRT1荧光强度在高浓度E2组中最强,组间两两比较,高浓度E2组>中浓度E2组>模型组>空白对照组（均为P<0.05）,低浓度E2组与模型组、中浓度E2组差异无统计学意义（均为P>0.05）,SIRT1主要定位于细胞核。结论:1、生理浓度下的E2能降低HLE-B3凋亡率,对HLECs具有保护作用。2、SIRT1/P53通路参与HLECs氧化损伤后的凋亡过程,并在其中发挥重要作用。3、E2可能通过SIRT1/P53通路发挥对HLE-B3的保护作用,其机制可能是:随着E2浓度的增加,SIRT1表达增强,Ac-P53水平降低,HLE-B3凋亡减少。
周文凯[2]（2020）在《人晶状体上皮细胞中miR-23b-3p通过抑制SIRT1调控细胞凋亡与自噬机制的研究》文中认为目的:年龄相关性白内障是一种主要的致盲眼病而且其发生率呈逐年递增趋势。氧化应激在白内障的致病机制中起到了重要的作用。在氧化应激的作用下,晶状体上皮细胞的凋亡机制被激活,它可以导致晶状体的浑浊并加速白内障的发展。同时在氧化应激条件下细胞自噬机制也被激活。miRNA曾有文献报道与白内障的发生具有相关性,但其具体机制还不是很清楚。本文主要针对氧化应激条件下晶状体上皮细胞中miRNA对于晶状体上皮细胞凋亡及自噬机制的研究。研究方法:本研究选取了眼科就诊并进行白内障手术的患者32人,按年龄分为高低年龄两组,qPCR测量目的miRNA的含量分析差异性;选取人晶状体上皮细胞系,采用过氧化氢制造氧化应激模型,采用质粒转染等方式观察在细胞氧化应激条件下待测miRNA的表达情况,同时采用流式细胞检查分析凋亡及蛋白质免疫印迹方法分析自噬相关蛋白情况,分析其对凋亡与自噬影响;软件预测miRNA的靶基因,并采用荧光素酶实验验证结合位点,设计质粒分组共转染氧化应激细胞系模型观察miRNA通过靶基因调控细胞凋亡与自噬。结果:本研究观察到在过氧化氢处理的白内障组织及晶状体上皮细胞中有miR-23b-3p表达,这说明在此条件下miR-23b-3p表达上调;在氧化应激条件下敲除mi-23b-3p可以导致晶状体上皮细胞凋亡明显减少自噬现象增加;运用生物预测软件我们推测miR-23b-3p可能参与调控沉默信息调控因子1（SIRT1）;荧光素酶实验确认miR-23b-3p可以通过靶向结合SIRT1基因的3,端来抑制其发挥作用。此外miR-23b-3p过表达可以明显降低SIRT1的表达,而降低mi R-23b-3p的表达则可以升高SIRT1的表达,这说明miR-23b-3p可以抑制SIRT1的表达。此外增加SIRT1的表达可以有效抑制miR-23b-3p过表达对于晶体上皮细胞凋亡和自噬的调控。结论:本研究揭示了在氧化应激条件下,晶体上皮细胞内miR-23b-3p通过抑制SIRT1调控细胞凋亡与自噬的机制,为临床治疗白内障提供新的方向。
董媛[3]（2019）在《内质网应激调控晶状体上皮的生物学行为参与白内障发病机制的研究》文中提出研究目的和意义本研究拟通过一系列体内外实验,探索内质网应激（Endoplasmic Reticulum Stress,ERS）对晶状体上皮细胞的增殖、凋亡、上皮-间质转化、胶原沉积、炎症因子表达等生物学行为和过程的影响,初步查明ERS与白内障的关系以及ERS参与白内障发生发展调控的机制。单核甘酸多态性是基因组最常见的遗传多态性形式,对金属基质蛋白酶2（Matrix metalloproteinase 2,MMP-2）基因 rs243865 位点的多态性检测和分析,为白内障遗传易感性与基因多态性的研究提供理论和实验数据,也可能为白内障的临床治疗提供新的手段。本研究丰富了白内障发病机制的研究,为寻找白内障潜在的生物学治疗靶点提供理论和实验支持。对候选基因的多态性分析,也可能为研发治疗药物和治疗手段提供新的思路,具有十分重要的临床意义和社会价值。方法1.将20只8日龄无特殊病原体（Specific pathogen free,SPF）级大鼠随机分为模型组和对照组,模型组大鼠按20 μ mol/kg一次性经腹腔注射亚硒酸钠溶液,隔日注射一次,连续5次,诱导建立硒性白内障大鼠模型,通过裂隙灯观察和病理检查验证造模成功。对照组大鼠腹腔注射等体积的生理盐水,其余操作同模型组。2.体外培养人晶状体上皮细胞,随机分为ERS激活剂组、ERS抑制剂组和对照组,分别给予细胞相应的处理措施。Western Blot检测各组晶状体上皮中ERS标志蛋白葡萄糖调节蛋白78/免疫球蛋白结合蛋白（Glucose regulation protein-78/Binding Protein 1,GRP78/Bip）、激酶 R 样内质网激酶（Protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase,PERK）、活化转录因子（Activating transcription factor 4,ATF4）、CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白（C/EBP-homologous protein,CHOP）的表达水平,以及与晶状体上皮-间质转化相关的蛋白如α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）、钙粘附蛋白E（E-cadherin）、MMP-2表达水平;MTT实验检测细胞增殖情况;流式细胞术检测细胞凋亡;免疫组化检测晶状体上皮中ⅣV胶原沉积情况;ELISA检测炎症因子的表达。3.利用TaqMan-MGB探针对晶状体上皮-间质转化密切相关的MMP-2基因rs243865位点的多态性进行检测和分析,初步探索MMP-2基因多态性与白内障易感性的关系。结果1.用20 μ mol/kg亚硒酸钠溶液经腹腔隔日注射5次,10天即成功在模型组大鼠中诱导出硒性白内障,建模成功率100%;其中晶状体Ⅱ级浑浊2例（20%）,Ⅲ级浑浊3例（30%）,Ⅳ级浑浊3例（30%）,Ⅴ级浑浊1例（10%）,Ⅵ级浑浊1例（10%）。2.HE染色后可见模型组大鼠晶状体正常上皮和异常上皮相间分布,异常上皮可见水肿、形态和大小不一,胞质淡然疏松,有大量空泡,核多形性,细胞间隙增大;纤维粗细不均一、排列无规律,纤维之间有囊泡和水裂,可见扭曲、断裂。3.白内障大鼠晶状体组织中GRP78、p-PERK、ATF4和CHOP蛋白表达水平分别是对照组的（3.89±0.22）倍（p<0.01）、（2.97±0.09）倍（p<0.01）、（2.15±0.17）倍（p<0.01）和（3.11±0.19）倍（p<0.01）。4.ERS激活剂组SRA01/04细胞GRP78、p-PERK、ATF4和CHOP蛋白表达水平分别是对照组细胞的（1.76±0.11）倍（p<0.01）、（3.62±0.17）倍（p<0.01）、（3.35 ± 0.13）倍（p<0.01）和（4.39±0.20）倍（p<0.01）;ERS 抑制剂组细胞GRP78、p-PERK、ATF4和CHOP蛋白表达水平分别是对照组细胞的（0.43 ±0.05）倍（p<0.01）、（0.52±0.08）倍（p<0.01）、（0.32±0.06）倍（p<0.01）和（0.29 ± 0.04）倍（p<0.01）。5.ERS 激活剂组SRA01/04 细胞第 Ohr、12 hr、24 hr、48 hr、72 hr 和 96 hr存活率分别为（102±5）%,（108±9）%,（119±6）%,（134±5）%,（152±8）%,（168±8）%;ERS 抑制剂组 SRA01/04 细胞第 Ohr、12 hr、24 hr、48 hr、72 hr 和 96 hr 存活率分别为（102±4）%,（117 ± 7）%,（130±6）%,（162±7）%,（186±8）%,（209±8）%。ERS 激活剂处理的晶状体上皮细胞生长曲线整体在对照组下方,其中第48 hr、72 hr和96 hr的存活率与对照组有统计学差异（p<0.05）;ERS抑制剂处理的晶状体上皮细胞生长曲线整体在对照组上方,其中第48 hr和72 hr的存活率与对照组相比有统计学差异（p<0.05）。6.ERS激活剂组SRA01/04细胞凋亡率为（15.83±1.07）%,较对照组细胞的（7.94±0.56）%显着升高（p<0.01）;ERS抑制剂处理的SRA01/04细胞凋亡率为（5.05±0.71）%,较对照组细胞降低（p<0.05）。7.ERS激活剂组SRA01/04细胞α-SMA、E-cadherin和MMP-2蛋白表达水平分别是对照组的（2.78±0.13）倍、（0.29±0.09）倍和（1.70±0.08）倍（p均<0.01）;ERS 抑制剂组 SRA01/04 细胞α-SMA、E-cadherin 和 MMP-2 表达水平分别是对照组的（0.17±0.06）倍、（2.89±0.12）倍和（0.20±0.07）倍（p 均<0.01）。8.ERS激活剂组SRA01/04细胞中ⅣV胶原大量沉积,平均光密度为（0.65 ±0.08）,明显高于对照组的（0.23±0.03）（p<0.01）;ERS抑制剂处理组细胞中ⅣV胶原平均光密度为（0.11 ± 0.06）,低于对照组（p<0.05）。9.ERS激活剂组SRA01/04细胞IL-1 β、IL-6、CRP和TNF-lα表达水平分别为（42.53±4.14）ng/ml、（6.17±2.51）ng/ml、（9.27±0.80）mg/L 和（25.22±3.28）ng/ml;ERS 抑制剂组晶状体上皮 IL-1 β、IL-6、CRP 和 TNF-1α表达水平分别为（28.52 ± 5.00）ng/ml、（3.23±2.01）ng/ml、（2.01 ±0.35）mg/L 和（11.17±2.01）ng/ml;对照组晶状体上皮 IL-1 β、IL-6、CRP和 TNF-1α表达水平分别为（30.47 ± 4.83）ng/ml、（4.41±1.74）ng/ml、（2.23±0.29）mg/L 和（15.57±3.08）ng/ml。ERS 激活剂组晶状体上皮IL-1 β、IL-6、CRP和TNF-1α水平高于对照组（p<0.05）,ERS抑制剂组IL-6和TNF-1α水平低于对照组（p<0.05）。10.白内障组CC、CT和TT 3种基因型的检测频率和期望频率分别为62%和57.01%,30%和 39.90%,12%和 7.01%;对照组 CC、CT 和 TT 3 种基因型的检测频率和期望频率分别为72%和70.04%,25%和26.20%,3%和2.40%。经Hardy-Weinberg平衡定律吻合度检验,两组MMP-2基因的rs243865基因型频率分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律（p>0.05）,具有可比性。11.白内障组患者MMP-2基因多态性位点rs243865的GG、GA、AA三种基因型分布人数分别是62例、30例和12例,分别占57.01%、28.85%和11.54%;对照组MMP-2基因多态性位点rs243865的GG、GA、AA三种基因型分布人数分别是72例、25例和3例,分别占72%、25%和3%。三种基因型在两组分布有统计学差异（p<0.05）。12.白内障组患者C和T等位基因分布频率分别为74.04%和25.96%,对照组C和T等位基因分布频率分别为84.50%和15.50%,C/T等位基因在两组的分布频率有差异（p<0.05）。13.对MMP-2基因rs243865的遗传模型分析,白内障组和对照组在加性模型下存在差异（p<0.05）,但隐性模型和显性模型均无显着差异（p>0.05）。结论1.白内障大鼠晶状体组织中存在过度激活的ERS反应,ERS相关蛋白表达水平较正常大鼠明显升高;2.过度激活的ERS能抑制晶状体上皮细胞的增殖、促进细胞凋亡、上皮-间质转化、胶原沉积和炎症反应等生物学行为和过程,对白内障的发生发展有促进作用。3.MMP-2基因的rs243865位点多态性与人类白内障易感性相关。
项敏泓[4]（2019）在《p38介导结膜松驰症的细胞衰老及杞精明目汤的干预研究》文中指出目的:观察p38 MAPK信号通路介导的细胞衰老在结膜松弛症（conjunctivochalasis,CCH）发病中的作用,研究杞精明目汤对p38介导的CCH细胞衰老的保护作用,为CCH发病机制的探索及治疗提供一种新的思路。方法:1.培养CCH结膜成纤维细胞,通过RNA干扰技术构建p38干扰慢病毒载体转染原代分离的CCH成纤维细胞,并用q-PCR和Western blot检测p38α的表达,筛选有效的干扰片段。2.培养CCH和正常人的结膜成纤维细胞,分别用RNA干扰技术和p38抑制剂SB203580处理,分为五组（Control、CCH、CCH+si NC、CCH+siP38、CCH+SB203580）。采用CCK-8检测细胞增殖,β-gal染色检测细胞衰老,流式细胞术检测细胞内活性氧（Reactive oxygen species,ROS）,分光光度计比色法检测超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）活力,q-PCR及Western blot检测p38α、p53、p21、SMP30的表达。3.培养CCH和正常人的结膜成纤维细胞,分别用杞精明目汤颗粒剂和p38抑制剂SB203580处理,分为四组（Control、CCH、CCH+QJMM、CCH+SB203580）,采用CCK-8检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞内ROS,分光光度计比色法检测SOD活力,q-PCR及Western blot检测p38α、p53、p21、SMP30的表达,并应用双荧光素酶报告基因检测杞精明目汤对p38启动子的影响。4.收集40例80眼ⅡⅢ级肝肾阴虚型CCH患者,随机分为杞精明目汤组和人工泪液组,分别采用杞精明目汤联合人工泪液和单纯人工泪液治疗,观察国际眼表疾病指数（OSDI）、泪膜破裂时间（BUT）、基础泪液分泌试验（SIT）,治疗3个月后比较临床治疗效果。对于CCH分级在Ⅲ级及以上,随访3个月及以上,有手术意愿的CCH患者切除松弛结膜组织,冰冻切片行β-gal染色观察。结果:1.RNA干扰后CCH结膜成纤维细胞中p38αmRNA和蛋白表达均显着下调,成功构建了含有靶向p38目的基因的siRNA慢病毒载体。2.β-gal染色显示CCH组结膜成纤维细胞衰老高于Control组（P=0.001）。CCK-8结果显示培养48小时后,CCH组及CCH+si NC组细胞OD值低于Control组,CCH+siP38组及CCH+SB203580组细胞OD值高于CCH组及CCH+si NC组（P均<0.05）。ROS含量CCH组及CCH+si NC组高于Control组,CCH+siP38组及CCH+SB203580组ROS含量均低于CCH组及CCH+si NC组,但高于Control组（P均<0.05）。SOD活力CCH组及CCH+si NC组均低于Control组,CCH+siP38组及CCH+SB203580组SOD活力均高于CCH组及CCH+si NC组（P均<0.01）。CCH组及CCH+si NC组p38α、p53、p21 mRNA表达较Control组上调,SMP30 mRNA表达下调（P均<0.01）;CCH+siP38组及CCH+SB203580组较CCH组及CCH+si NC组p38α、p53、p21 mRNA表达下调,SMP30 mRNA表达上调（P均<0.05）。p38α、p53、p21蛋白在CCH组及CCH+si NC组较Control组表达上调,SMP30蛋白表达下调（P均<0.01）;CCH+siP38组及CCH+SB203580组p38α、p53、p21蛋白较CCH组及CCH+si NC组表达均下调,SMP30蛋白表达上调（P均<0.01）。3.CCK-8结果显示培养24小时后,CCH组细胞OD值低于Control组（P<0.05）。48小时后CCH组细胞OD值低于Control组,CCH+QJMM组及CCH+SB203580组OD值高于CCH组（P均<0.01）。ROS含量CCH组高于Control组,CCH+QJMM组及CCH+SB203580组低于CCH组（P均<0.05）。SOD活力CCH组低于Control组,CCH+QJMM组及CCH+SB203580组高于CCH组（P均<0.01）。CCH组较Control组p38α、p53、p21 mRNA的表达上调,SMP30 mRNA的表达下调;CCH+QJMM组及CCH+SB203580组较CCH组p38α、p53、p21 mRNA的表达下调,SMP30 mRNA的表达上调（P均<0.05）。CCH组较Control组p38α、p-p38α、p53、p21蛋白表达上调,CCH+QJMM组及CCH+SB203580组较CCH组下调（P均<0.01）。SMP30蛋白CCH组较Control组表达下调,CCH+QJMM组及CCH+SB203580组较CCH组表达上调（P均<0.01）。双荧光素酶报告基因检测显示CCH+QJMM组较CCH组含p38启动子的荧光素酶活性降低（P<0.001）。4.临床研究:杞精明目汤组的OSDI评分、BUT、SIT显着优于人工泪液组。治疗3月后需手术治疗的CCH患者人工泪液组7例7眼,杞精明目汤组4例4眼,且杞精明目汤组衰老细胞染色阳性率低于人工泪液组（P=0.013）。结论:1.成功构建含有靶向p38目的基因的siRNA慢病毒载体,为后续研究提供了实验基础。2.结膜松弛症中出现氧化应激损伤,激活p38 MAPK信号通路及其下游的衰老相关因子,细胞增殖减少,导致细胞衰老。沉默或是抑制p38 MAPK信号通路可以下调p38 MAPK及其下游衰老相关因子的表达,缓解氧化应激损伤,促进细胞增殖,从而延缓细胞衰老。3.杞精明目汤可下调p38 MAPK及其下游的衰老相关因子的表达,下调p38MAPK启动子活性,减轻氧化应激损伤,增强结膜成纤维细胞的抗氧化能力,促进结膜成纤维细胞的增殖,从而治疗结膜松弛症。4.杞精明目汤联合治疗结膜松弛症在缓解眼部症状、改善泪膜、促进泪液分泌方面,较单纯人工泪液治疗更为有效。杞精明目汤联合治疗还可以减少结膜松弛症中出现的细胞衰老,可作为除手术治疗之外安全、有效的治疗方案。
刘铁刚[5]（2019）在《不同波长LED光对晶状体影响的初步研究》文中进行了进一步梳理目的:发光二极管光源即LED光源,由于其绿色、环保,光线品质好,光效高,易于维护等优点,广范应用于如室内外照明、交通信号灯、路灯以及电子设备显示屏背光等领域。由于LED光源制造原理与前几代光源显着不同,光线成分相对复杂,因此人们对于LED光的光生物安全性缺乏深入了解。白内障是重要的致盲眼病,年龄相关性白内障疾病发生发展较为缓慢,且机制尚未完全阐明。晶状体为眼内重要屈光介质,经常受到各种光线的侵扰。本实验将利用活体动物实验的方法,探究LED光对于晶状体上皮细胞的影响包括白光LED对于晶状体上皮细胞形态学的影响与细胞内部caspase-3与P21表达的影响。另外,本研究将探究不同峰值波长的LED光对于晶状体内抗氧化酶活性（超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶）的影响以及比较不同峰值波长的LED光照后晶状体内部脂质过氧化反应（丙二醛含量）的程度,以评价LED光致晶状体氧化损伤程度与其峰值波长之间的关系及变化规律。通过以上研究综合评价LED光对于晶状体的影响,并根据实验结果从晶状体光损伤的角度对LED光源的制造与使用提出实用的建议,推动绿色照明工程进行。最后,本研究将针对硫辛酸的抗氧化作用,结合LED蓝光对于晶状体的氧化应激效应,观察硫辛酸对于LED光诱导的晶状体内部氧化-抗氧化系统失衡将产生怎样的作用。方法:本实验分为三个部分。第一部分使用白色LED光（色温为4500K,照度为500勒克斯、1000勒克斯、1500勒克斯）照射活体SD大鼠5天,每天12小时（12h明-12h暗,6:00 a.m.-18:00 p.m.）。使用HE染色观察大鼠晶状体上皮细胞石蜡切片。分别为使用Real-time PCR检测大鼠晶状体上皮细胞内caspase-3与P21waf1/cip1mRNA水平。使用western-blotting检测上皮细胞内caspase-3与P21waf1/cip1蛋白表达水平。使用全自动生化检测仪检测晶状体内SOD、GSH-Px及MDA含量,并进行比较分析。第二部分使用相同照度（500勒克斯）不同峰值波长的LED光（红、绿、蓝）分别照射大鼠晶状体,连续5天,每天12小时（12h明-12h暗,6:00 a.m.-18:00 p.m.）。取大鼠晶状体组织,使用全自动生化检测仪检测晶状体内SOD、GSH-Px及MDA含量,并进行比较分析。第三部分使用与第二部分相同参数时间以及剂量的LED蓝光照射SD大鼠,分别观察给药组与单纯照射组大鼠晶状体内MDA、SOD以及GSH-Px指标的变化。结果:1.HE染色显示对照组大鼠晶状体上皮细胞细胞形态扁平,单层排列,整齐一致。白光LED照射组大鼠晶状体上皮细胞排列紊乱、细胞肿胀,晶状体上皮细胞由正常的单层分布改变为双层甚至多层排列。2.Real-time PCR结果显示对照组、500勒克斯组、1000勒克斯组以及1500勒克斯组caspase-3 mRNA表达倍数分别为1.00、1.77、3.21、5.05,除对照组和500勒克斯组无统计学差异（P>0.05）外,其余各组表达倍数间比较均具有统计学意义（P<0.05）。P21waf1/cip1mRNA表达倍数分别为1.00、1.95、3.11、4.48,除对照组和500勒克斯组无统计学差异（P>0.05）外,其余各组表达倍数间比较均具有统计学意义（P<0.05）。Western-blotting结果显示对照组、500勒克斯组、1000勒克斯组以及1500勒克斯组caspase-3蛋白条带灰度值分别为0.33、0.54、0.72、0.873,各组灰度值间比较均具有统计学意义（P<0.05）。对照组、500勒克斯组、1000勒克斯组以及1500勒克斯组P21waf1/cip1蛋白条带灰度值分别为0.28、0.40、0.53、0.67,各组灰度值间比较均具有统计学意义（P<0.05）。3.HE染色显示蓝光组大鼠晶状体上皮细胞与白光LED光照组类似呈现细胞排列紊乱、肿胀,晶状体上皮细胞由正常的单层分布改变为双层甚至多层排列的形态改变;绿光照射组细胞轻度肿胀,部分区域呈现双层排列形态;红光组大鼠晶状体上皮细胞呈现单层、扁平、排列整齐的正常形态,与对照组一致。4.对照组、红光、绿光、蓝光照射组大鼠晶状体内MDA含量分别约为0.0043 U/mgprot,0.0044 U/mgprot,0.0156 U/mgprot,0.0178 U/mgprot,除红光组与对照组间无统计学差异（P>0.05）外,其余各组间比较均具有统计学差异（P<0.05）。对照组、红、绿、蓝光照射组大鼠晶状体内SOD活力分别约为1.30 U/mgprot、7.93 U/mgprot、3.07 U/mgprot、2.12U/mgprot,各组间比较均有统计学差异（P<0.05）;对照组、红、绿、蓝光照射组大鼠晶状体内GSH-Px活力分别约为1.41 U/mgprot、9.79 U/mgprot、2.69U/mgprot、2.16 U/mgprot,各组间比较均有统计学差异（P<0.05）。5.蓝光照射5天后,未给药组大鼠晶状体内MDA含量为0.02210 U/mgprot,明显高于给予硫辛酸喂食组0.01290 U/mgprot,差异具有统计学意义（P<0.05）;另外,经测定,仅接受蓝光照射的蓝光组大鼠晶状体内SOD活力为2.1212 U/mgprot、GSH-Px活力为2.69610 U/mgprot均明显低于给药组大鼠晶状体内SOD活力（2.9101U/mgprot）以及GSH-Px活力（4.70530 U/mgprot）,差异具有统计学意义（P<0.05）;给药组大鼠晶状体内SOD与GSH-Px活力与空白对照组晶状体内SOD活力（1.3035 U/mgprot）与GSH-Px活力（1.41340 U/mgprot）相比亦显着升高差异具有统计学意义（P<0.05）。结论:1.白色LED光（色温为4500K,照度为500勒克斯）在活体照射下即可以引起晶状体上皮细胞肿胀、排列紊乱等异常形态改变。2.白色LED光（色温为4500K,照度大于500勒克斯）可以引起晶状体内脂质过氧化产物升高,抗氧化酶（SOD、GSH-Px）活力下降,且具有照度依赖性,照度越高的LED光对于晶状体氧化损伤的风险也较大。3.发光二极管所发出的光线光谱波长越短,对大鼠晶状体氧化损伤指标影响越大（MDA升高、SOD、GSH-Px活力下降）,造成晶状体损伤的风险也越大。4.活体动物实验结果表明,高色温LED光对晶状体危害大于低色温LED光。5.在蓝光诱导的晶状体氧化损伤中,硫辛酸可以通过提高SOD与GSH-Px活力拮抗晶状体内部脂质过氧化物的堆积,其对晶状体光氧化损伤可能具有一定的保护作用。
程雅兰[6]（2018）在《Importinα3蛋白在晶状体上皮细胞衰老及凋亡中的作用及其调控机制探索》文中认为年龄相关性白内障是多因素疾病,流行病学显示遗传背景和环境因素各占一半比重,特定的遗传背景（基因缺陷）将增加年龄相关性白内障的易感性。全基因组关联分析（genome-wide association study,GWAS）是目前研究多因素疾病的有力工具,因此前期利用GWAS进行年龄相关性白内障易感基因的筛查,发现了KPNA4基因（karyopherin alpha 4）上2个SNP位点p<10-4,提示KPNA4基因与年龄相关性白内障的高度相关性,可能为其新的疾病易感基因。在importin α 3蛋白与晶状体上皮细胞衰老功能和机制探索中运用Western-Blot技术检测importin α 3蛋白水平变化;并在细胞凋亡的功能及机制研究中,运用质粒转染技术使晶状体上皮细胞过表达KPNA4,通过Western-Blot、细胞免疫荧光等生物学技术检测该基因过表达引起的分子水平的影响及其与凋亡蛋白间的相互作用。研究发现importin α3蛋白是细胞内的转运蛋白,与晶状体上皮细胞衰老及凋亡的调控机制有相关作用,通过转运p53蛋白,进而启动了 p53介导的凋亡信号通路。采用KPNA4特异性敲除的稳定斑马鱼系,通过免疫组化及透射电镜技术发现KPNA4特异性敲除的斑马鱼晶状体中央有异常蛋白聚集形成的混浊区域并且晶状体细胞内线粒体数目增多,体积增大,证明KPNA4基因对于白内障的发生发展有着重要的作用,为今后更深入的对importinα 3蛋白作用机制的研究提供了有力的理论基础,为深入研究年龄相关性白内障的发病机制提供了较好的方向。
陆博,马立威,王欣玲,韩笑,冯莉,姜凌峰,王春霞,张劲松,阎启昌[7]（2018）在《miR-138调控年龄相关性白内障晶状体上皮细胞抗氧化应激作用的机制》文中认为目的:探讨miR-138对年龄相关性白内障晶状体上皮细胞抗氧化应激能力的影响及其作用机制。方法:采用实时定量PCR（RT-q PCR）检测年龄相关性白内障与正常人透明晶状体前囊膜组织中及人晶状体上皮细胞系（SRA01/04）氧化应激模型中miR-138的表达水平。利用2’,7’-二氯荧光黄双乙酸盐（DCFH-DA）荧光探针检测细胞内源性活性氧（reactive oxygen species,ROS）水平。向人晶状体上皮细胞中分别转染miR-138 mimics,mimic controls,miR-138 inhibitors,inhibitor controls 72h后细胞暴露于400μmol/L H2O2 1h,采用RT-qPCR检测p53和Bax的mRNA表达,western blotting检测p53和Bax的蛋白表达水平,MTS法检测细胞增殖活力。结果:与正常对照组相比,年龄相关性白内障晶状体组织中与人晶状体上皮细胞氧化应激模型中miR-138的表达均显着升高,差异有统计学意义（P<0.001）;人晶状体上皮细胞氧化应激模型中内源性ROS的水平明显升高,差异有统计学意义（P<0.001）。相对于对照组,miR-138 mimics组p53和Bax的mRNA、蛋白表达水平均明显升高,细胞增殖活力明显下降,差异有统计学意义（均P<0.001）;miR-138 inhibitors组p53和Bax的mRNA、蛋白表达水平均明显下降,细胞增殖活力显着升高,差异有统计学意义（均P<0.001）。结论:miR-138在年龄相关性白内障囊膜组织中表达上调,通过正调控下游靶基因p53和Bax,下调人晶状体上皮细胞抗氧化应激的能力,抑制人晶状体上皮细胞增殖和修复,从而参与年龄相关性白内障的发生过程。
高蒙[8]（2017）在《以斑马鱼为模式生物研究HSF4调控晶状体发育和白内障形成的机制》文中认为晶状体发生浑浊会引起白内障造成视力损伤。老化、遗传、代谢异常、外伤、辐射、中毒和局部营养不良等可引起晶状体囊膜损伤,使其渗透性增加,丧失屏障作用,或导致晶状体代谢紊乱,使晶状体蛋白发生变性,形成混浊。白内障通常可分先天性和后天性两大类。遗传学研究鉴定出超过20个白内障的致病基因,这些基因大致可以分为以下几类:晶状体蛋白、细胞膜蛋白、缝隙连接蛋白、细胞骨架蛋白、生长因子或转录因子、蛋白降解装置组分。热休克因子4（HSF4）是转录因子,可以转录激活γ-晶状体蛋白、波形蛋白、念珠状纤维蛋白以及DNA酶2等与晶状体发育和功能密切相关的蛋白的表达,但是该基因突变导致白内障形成的具体机制仍然不清楚。因此,在本研究中我们希望通过构建hsf4基因敲除的动物模型,并对其进行研究,探索HSF4调控晶状体发育和白内障形成的机制。本研究采用TALEN技术成功构建了hsf4基因敲除的斑马鱼模型。通过表型分析发现,在斑马鱼中敲除hsf4基因会导致斑马鱼产生先天性白内障。之后通过对hsf4基因敲除斑马鱼进行表型研究发现hsf4基因敲除造成晶状体上皮细胞增多。由于晶状体纤维细胞是由晶状体上皮细胞分化而来的,那么上皮细胞数目增多很可能导致由其分化形成的晶状体纤维细胞数目也增多。之后,通过冰冻切片和免疫荧光实验对晶状体纤维细胞的骨架进行观察,证实以上推测,即敲除hsf4基因后会造成晶状体纤维细胞数目增多,并且异常增多的纤维细胞在晶状体内逐渐积累,最终使得其排布逐渐紊乱。除了对晶状体结构的影响之外,我们还检测了hsf4基因敲除对晶状体纤维细胞分化的影响。发现,敲除hsf4基因以后,无论是初级纤维细胞还是次级纤维细胞的去核过程都受到了显着的影响。并且,通过透射电子显微镜观察发现次级纤维细胞内细胞核、线粒体、胞内体、溶酶体等细胞器不能正常降解。这表明,hsf4对于纤维细胞的终末分化是必需的,在hsf4基因敲除的情况下纤维细胞的终末分化不能正常进行。接下来,我们对hsf4基因敲除造成纤维细胞终末分化异常的分子机制进行了研究。发现在体外培养的人晶状体上皮细胞中过表达HSF4可引起p53在细胞核中聚集。之后,细胞核内的p53转录激活其靶基因Fas和Bax的表达,引起细胞凋亡信号传递激活caspase级联反应,最终引起Caspase3活性增强。并且,HSF4对Fas、Bax、caspase3的调控是依赖于p53的。之后我们利用hsf4基因敲除斑马鱼模型对体外实验的结果进行验证,发现hsf4基因敲除的斑马鱼晶状体中p53和激活型caspase3显着下调。并且,体内回补实验也证实了过表达野生型的hsf4、p53、fas可部分回补由于hsf4基因敲除所造成的细胞去核异常。以上结果表明HSF4可以通过调控p53及其下游的调控因子来调节纤维细胞分化。综上所述,在本研究中我们成功构建了hsf4基因敲除的斑马鱼白内障模型,应用这一模型我们直接观察了hsf4基因敲除斑马鱼先天性白内障发生发展的病理过程,并对hsf4缺陷引起白内障的分子和细胞学机制进行了探索。发现hsf4是晶状体发育和分化过程中的一个非常重要的调控因子,可以通过维持晶状体上皮细胞与纤维细胞之间增殖和分化的平衡,促进纤维细胞的正常分化。在机制方面,我们发现HSF4可以调控p53、Fas、Bax、Caspase3等主要的凋亡相关的调控因子来促进纤维细胞的分化。我们的发现揭示了HSF4参与调控晶状体分化的新的机制,为进一步理解HSF4在晶状体中的生理功能以及白内障发生的分子机制打下了良好的基础。
冯珂[9]（2017）在《Eaf2通过Wnt信号通路抑制氧化应激诱导的人晶状体上皮细胞凋亡的研究》文中指出1前言目前白内障患者导致的眼盲占全世界眼盲患者的50%,现在公认眼内晶状体受到氧化应激的损伤是白内障的主要原因。上皮细胞是氧化应激的主要目标。研究表明,过氧化氢诱导的氧化应激能够刺激人晶状体上皮（HLE）细胞凋亡,还有研究显示除了先天性白内障以外,其他各种类型的白内障发生的细胞学基础都被认为是和细胞凋亡有关。因此通过研究人HLE细胞凋亡的机制可能会为白内障防治提供更多理论依据。2目的研究在氧化应激诱导的HLE细胞的凋亡中Eaf2基因所起的作用和相关分子机制,并进一步探讨Eaf2基因如何通过抑制caspase-3活性、激活Wnt信号通路保护HLE细胞抑制过氧化氢导致的凋亡。3方法3.1细胞培养:在含20%FBS的MEM培养基中培养HLE-B3细胞。培养条件:5%CO2、饱和湿度、37℃。3.2过氧化氢诱导HLE-B3细胞凋亡:将HLE-B3细胞用50μM过氧化氢别处理 4h、8h和 12h。3.3载体构建和细胞转染:构建Eaf2的过表达,Eaf2基因的CDS全长被克隆并连接到pcDNA3.0载体;用Wnt3a干扰载体（Wnt3ashRNA）敲低Wnt3a,Wnt3ashRNA购自SantaCruz生物,同时匹配其NC,shCon（干扰载体空载）。确认Eaf2过表达的细胞,同时转染shWnt3a/shCon。3.4检测分析细胞凋亡:将过氧化氢处理HLEC-B3细胞后,用流式仪检测细胞,计算凋亡率。3.5 RNA提取和RT-PCR分析:采用TRIZOL法从细胞中提取总RNA,将RNA逆转成cDNA,用2-（?）Ct计算方法来比较各组间β-catenin,caspase 3,Eaf2,and Wnt3a mRNA的表达水平。3.6 免疫印迹分析:采用 western blot 检测 β-catenin,caspase 3,Eaf2,and Wnt3a 的蛋白水平。3.7免疫细胞化学:免疫荧光检测Eaf2和Wnt3a在细胞中的定位情况。4结果4.1.构建H202诱导的HLE细胞凋亡的模型。分别用50μM H2O2处理HLE细胞4、8、12小时后,凋亡细胞的比率均显着高于对照组（无H2O2处理组）,并且凋亡率增加具有时间依赖性。RT-PCR和westemBlot结果均显示当细胞暴露于H2O2后,HLE-B3细胞中caspase 3mRNA和蛋白水平均明显上调,并且具有时间依赖性;Eaf2mRNA和蛋白水平显着下调,并且具有时间依赖性。4.2 Eaf2过表达抑制H2O2诱导的HLE细胞凋亡。Eaf2高水平过表达下,凋亡细胞的比例显着降低（p<0.001）,同时LDH释放量显着降低（p<0.05）。RT-PCR和western blot分析显示Eaf2过表达的细胞中,凋亡相关蛋白caspase 3、Bax的mRNA和蛋白水平显着下调;Bcl-2的mRNA和蛋白达水平显着上调,说明Eaf2基因通过调节凋亡相关蛋白的表达而抑制过氧化氢诱导晶状体上皮细胞的凋亡。Eaf2过表达的细胞中Wnt3a和Wnt通路的关键蛋白β-catenin的mRNA和蛋白达水平均显着上调;Wnt通路中的抑制剂GSK3β蛋白水平明显下调,其磷酸化物p-GSK3β蛋白水平明显上调,提示Eaf2 and Wnt3a信号通路有密切的关系。免疫荧光也显示Eaf2过表达细胞中Eaf2和Wnt3a明显上调。4.3 Eaf2通过调控Wnt3a抑制HLE细胞中H202诱导的凋亡转染shWnt3a质粒干扰Wnt3a表达后,即使在Eaf2过表达情况下,HLE-B3细胞凋亡总比率仍显着增加,同时使已经被压抑的LDH释放量增加。RT-PCR和western blot显示Wnt3a敲低后caspase 3、Bax的mRNA和蛋白水平明显上调;Bcl-2的mRNA和蛋白水平明显下调,β-catenin、p-GSK3β的蛋白水平明显下调;GSK3β蛋白水平明显上调。说明Wnt3a被敲低后会影响到Eaf2对于HLE细胞的保护作用,Eaf2是通过调控Wnt3a抑制HLE细胞中H202诱导的凋亡。5.结论5.1 H2O2可以诱导晶状体上皮细胞发生凋亡。5.2在晶状体上皮细胞中可有效地转染Eaf20E质粒及shWnt3a质粒。5.3 Eaf2蛋白对过氧化氢诱导的晶状体上皮细胞的凋亡具有抑制作用。5.4第一次证明Eaf2基因转录产物可以保护HLE细胞免受暴露于过氧化氢导致的氧化应激损害。5.5 Eaf2通过调节凋亡相关蛋白（caspase 3、Bax、Bcl-2）的表达保护HLE细胞,抑制过氧化氢诱导的凋亡。6、Eaf2通过对Wnt3a信号通路的作用抑制过氧化氢导致的氧化应激损害。
陆博[10]（2018）在《氧化应激调控晶状体上皮细胞凋亡机制的研究》文中研究表明目的:白内障作为一种常见的衰老相关疾病,发病率迅速上升。一直以来,白内障发病机制不明确已成为其非手术治疗研究的瓶颈,以往有关白内障发病机制的研究,达成共识的是晶状体上皮细胞凋亡是非先天性白内障形成的共同细胞学基础。在白内障患者中,其前房及晶状体内活性氧的含量明显高于正常人。体外研究证实,相当于白内障患者晶状体内的过氧化氢可导致晶状体上皮细胞凋亡和晶状体混浊,此变化类似于白内障患者眼内的病理表现。小泛素相关修饰物（small ubiquitin related modifier,SUMO）修饰是与泛素化类似的蛋白翻译后修饰形式,在哺乳动物中SUMO家族主要有4个蛋白亚型:SUMO1、SUMO2、SUMO3和SUMO4。在正常情况下,SUMO主要是以非活性前体的形式存在,SUMO修饰就是SUMO共价结合到底物蛋白的赖氨酸残基的蛋白质翻译后修饰。晶状体上皮源性生长因子（PC4 and SFRS1 interacting protein 1,PSIP1）是一种新发现的细胞存活因子,已报道PSIP1在调节各种细胞功能中发挥作用,PSIP1在眼细胞抗应激损伤过程中亦起到重要作用。在晶状体、视网膜、角膜、脉络膜等组织中均可检测到PSIP1的表达,也参与晶状体上皮细胞向纤维细胞分化。本研究首次发现SUMO修饰PSIP1在晶状体上皮细胞对抗氧化应激压力中的重要作用,并进一步探讨其相关机制。方法:利用体外培养人晶状体上皮细胞系（SRA01/04）。建立人晶状体上皮细胞氧化应激模型:利用不同浓度H2O2处理SRA01/04细胞,H2O2浓度分别为100μM,200μM,400μM,800μM和1m M,于37℃,5%CO2及充分饱和湿度的培养箱内处理1h。采用2’,7’-二氯荧光黄双乙酸盐（DCFH-DA）荧光探针检测细胞内源性活性氧（ROS）水平,MTS测定细胞增殖活力,实时定量聚合酶链反应（RT-q PCR）、Western blot、免疫细胞化学染色检测SRA01/04中SUMO1、PSIP1的表达情况及与氧化应激组的差异性表达。免疫共沉淀检测SRA01/04中PSIP1的SUMO1修饰,构建p EGFP-PS IP1真核表达载体,定点突变获得SUMO结合位点突变的PS IP1真核表达载体,构建p GL3Hsp27luc载体,利用脂质体方法转染及共转染质粒进入细胞过表达相应蛋白,双荧光素酶报告基因检测系统检测PSIP1的转录活性。应用SPSS18.0统计分析软件进行统计学分析。数据以均值±标准差表示,进行ANOVA方差分析及独立样本t检验,P<0.05为有统计学意义。结果:1、氧化应激对人晶状体上皮细胞内源性ROS、细胞增值活性、PCNA水平的影响。随着H2O2浓度的升高,细胞内ROS呈逐渐升高趋势（P<0.001）,细胞增殖活性呈逐渐减低趋势（P<0.001）,PCNA表达量逐渐减少。表明过氧化氢引起细胞氧化应激,降低人晶状体上皮细胞增殖活性,引起细胞凋亡。2、氧化应激对人晶状体上皮细胞中SUMO1和PSIP1表达及SUMO化的影响。与对照组相比,在m RNA水平和蛋白水平H2O2处理组SUMO1与PSIP1表达均显着升高（P<0.001）,Western blot显示随着H2O2浓度的升高,PSIP1表达逐渐增加,游离SUMO1逐渐减少,H2O2处理组SUMO1结合蛋白增加。结果表明在人晶状体上皮细胞中SUMO1和PSIP1表达水平在氧化应激条件下均升高,且总体SUMO1修饰增加。3、生理状态下人晶状体上皮细胞中PSIP1可被SUMO修饰。生理状态下人晶状体上皮细胞中内源性的PSIP1可被SUMO修饰,且内源性的PSIP1在生理状态下为单SUMO1修饰。4、p EGFP-PSIP1真核表达载体的构建及表达鉴定。双酶切分析显示,重组质粒被切出约1605bp的片段,与预期目的片断大小相符。测序结果表明合成的PISP1基因序列正确与预期一致,开放读码框正确,无突变。将p EGF-PSIP1转染入人晶状体上皮细胞中,结果显示24h后转染p EGFP-PSIP1细胞表达绿色荧光,与对照组相比转染p EGFP-PSIP1组m RNA水平PS IP1表达显着升高（P<0.001）,蛋白水平PS IP1表达亦显着升高,证实构建的p EGFP-PSIP1真核表达载体能良好的在人晶状体上皮细胞中过表达融合蛋白EGFP-PSIP1。5、氧化应激条件下人晶状体上皮细胞中PSIP1的SUMO1修饰的变化。采用PS IP1抗体免疫沉淀后,用SUMO1抗体进行免疫印迹,结果表明氧化应激减少人晶状体上皮细胞内PSIP1的SUMO化。6、SUMO修饰位点突变的PSIP1真核表达载体的构建及表达检测。选取预测PSIP1蛋白的SUMO修饰位点分值最高的第364位的赖氨酸（K）,利用定点突变技术将PSIP1的K364突变为精氨酸（R）,并构建SUMO修饰位点突变的PSIP1真核表达载体（p EGFP-K364R）。经双酶切和测序结果表明合成的PSIP1基因序列正确与预期一致,开放读码框正确,无非预期的突变。分别转染p EGFP-PSIP1和p EGFP-K364R进入人晶状体上皮细胞,24h后转染p EGFP-PSIP1组和p EGFP-K364R组细胞均表达绿色荧光,Western blot结果显示转染p EGFP-PSIP1组和p EGFP-K364R组均检处p EGFP-PS IP1/p EGFP-K364R条带,表明本研究中构建的p EGFP-K364R真核表达载体能良好的在人晶状体上皮细胞中过表达SUMO位点突变的PSIP1。7、PS IP1的SUMO结合位点鉴定。为明确K364是否为PSIP1的SUMO结合位点,分别共转染p EGFP-SUMO1和p EGFP-PSIP1,p EGFP-SUMO1和p EGFP-K364R进入人晶状体上皮细胞,24h后荧光显微镜观察两组细胞均表达绿色荧光,48h后利用免疫共沉淀技术,显示共转染p EGFP-SUMO1和p EGFP-K364R组未检出p EGFP-SUMO1-p EGFP-PSIP1,表明在人晶状体上皮细胞内SUMO修饰位点突变的PSIP1不与SUMO结合,K364确为PSIP1的SUMO修饰位点。8、人晶状体上皮细胞中SUMO化/去SUMO化对PSIP1的转录活性的影响。向人晶状体上皮细胞中共转染p GL3Hsp27luc,p RL-TK,p EGFP-PSIP1或K364R,进行双荧光素酶报告基因检测。结果显示,与对照组相比野生型PSIP1的表达升高其对Hsp27启动子的转录活性（P<0.001）,SUMO修饰位点突变的PSIP1的表达升高其对Hsp27启动子的转录活性（P<0.001）,与野生型PSIP1相比SUMO化位点突变的PSIP1升高对Hsp27启动子的转录活性（P<0.05）。结果表明在人晶状体上皮细胞中去SUMO化升高PSIP1的转录活性。9、人晶状体上皮细胞中PSIP1的SUMO化/去SUMO化对PS IP1的下游因子的影响。western检测Hsp27、Hsp70及p53的蛋白表达水平结果显示,与对照组（p EGFP-C1）相比野生型PSIP1组Hsp27、Hsp70及p53的蛋白表达升高,与对照组相比SUMO修饰位点突变的PSIP1组Hsp27、Hsp70及p53的蛋白表达升高,与野生型PSIP1相比SUMO化位点突变的PSIP1组Hsp27、Hsp70及p53的蛋白表达升高。10、PSIP1的SUMO化/去SUMO化对人晶状体上皮细胞增殖活性的影响。向人晶状体上皮细胞中共转染野生型PSIP1,SUMO化位点突变的PSIP1（p EGFP-K364R）或p EGFP-C1,转染48h后,采用MTS比色法检测细胞活性。结果显示,与对照组相比转染野生型PSIP1组,细胞增殖活性升高（P<0.001）,与对照组相比转染SUMO修饰位点突变的PSIP1组,细胞增殖活性升高（P<0.001）,与野生型PSIP1组相比转染SUMO修饰位点突变的PSIP1组,细胞增殖活性升高（P<0.001）,结果表明PSIP1的去SUMO化增加人晶状体上皮细胞的增殖活性。11、PSIP1的SUMO化/去SUMO化对人晶状体上皮细胞对抗氧化应激能力的影响。向人晶状体上皮细胞中共转染野生型PSIP1,SUMO化位点突变的PSIP1（p EGFP-K364R）或p EGFP-C1。H2O2处理后与对照组相比转染野生型PSIP1组,细胞增殖活性升高（P<0.001）,与对照组相比转染SUMO修饰位点突变的PSIP1组,细胞增殖活性升高（P<0.001）,与野生型PSIP1组相比转染SUMO修饰位点突变的PSIP1组,细胞增殖活性升高（P<0.05）,结果表明PSIP1的去SUMO化升高人晶状体上皮细胞对抗氧化应激的能力。结论:人晶状体上皮细胞中PSIP1在生理状态下持续被SUMO1修饰,氧化应激发生时激活PSIP1去SUMO化,从而提高PSIP1转录活性,上调其下游转录因子Hsp27等应激相关基因的表达,从而保护细胞对抗氧化应激,维持细胞存活,以对抗白内障的发生。
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 英汉缩略词对照表 |
| SIRT_1 与白内障发生机制的研究进展(综述) |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表论文情况 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分 :miR-23b-3p在年龄相关性白内障组织中的表达情况及其在氧化应激条件下晶体上皮细胞内的表达情况 |
| 1 前言 |
| 1.1 年龄相关性白内障的概述 |
| 1.2 氧化应激与ARC的关系 |
| 1.3 活性氧族概述 |
| 1.4 细胞凋亡与自噬的概念及与氧化应激的关系 |
| 1.5 晶状体上皮细胞自噬与凋亡与ARC的关系 |
| 1.6 miRNA概述 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验所需主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 临床标本 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.1.3 仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 人晶状体上皮细胞的培养以及氧化应激模型建立 |
| 2.2.2 实时定量PCR |
| 2.2.3 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分 :miR-23b-3p在氧化应激条件下调控晶状体上皮细胞自噬与凋亡 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验所需主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 试剂 |
| 2.1.2 仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 人晶状体上皮细胞的培养以及氧化应激模型建立 |
| 2.2.2 细胞转染 |
| 2.2.3 凋亡及自噬相关蛋白验证采用蛋白质印迹试验,具体步骤 |
| 2.2.4 凋亡分析采用流式细胞仪分析,具体步骤 |
| 2.2.5 采用q RTPCR验证转染效率,具体实验步骤见 |
| 2.2.6 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分 :miR-23b-3p与SIRT1的相关性及调控机制研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验所需主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 研究对象 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.1.3 仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 生物信息学预测及分析miR-23b-3p基因的靶基因 |
| 2.2.2 人晶状体细胞系培养模型建立 |
| 2.2.3 荧光素酶实验 |
| 2.2.4 上调及下调目的miRNA及目的基因采用质粒转染方式 |
| 2.2.5 凋亡分析采用流式细胞仪分析 |
| 2.2.6 凋亡及自噬相关蛋白验证采用蛋白质印迹试验 |
| 2.2.7 细胞自噬分析采用免疫荧光镜检,具体方法 |
| 2.2.8 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 绪论 |
| 一、晶状体的一般生理 |
| 二、白内障的类型和发病机制 |
| 三、内质网应激与白内障 |
| 四、本研究的内容和意义 |
| 第一部分 硒性白内障大鼠模型的建立 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要仪器和试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 方法公司 |
| 1.4.1 实验分组 |
| 1.4.2 造模 |
| 1.4.3 实验观察 |
| 1.4.4 晶状体浑浊程度判断依据 |
| 1.4.5 组织病理染色 |
| 1.4.6 统计学分析 |
| 2. 结果 |
| 2.1 大鼠一般情况 |
| 2.2 晶状体浑浊情况观察 |
| 2.3 晶状体HE染色检查 |
| 3. 讨论 |
| 4. 小结 |
| 第二部分 内质网应激对晶状体上皮细胞增殖、上皮-间质转化、胶原沉积、炎症反应等生物学行为的调控作用研究 |
| 1. 材料和方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 细胞系 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 1.5 方法 |
| 1.5.1 大鼠处理 |
| 1.5.2 细胞培养和分组 |
| 1.5.3 组织和细胞总蛋白提取和定量 |
| 1.5.4 Western Blot检测目的蛋白表达 |
| 1.5.5 免疫组化检测IV型胶原沉积 |
| 1.5.6 MTT检测细胞增殖 |
| 1.5.7 流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 1.5.8 ELISA检测炎症因子 |
| 2. 结果 |
| 2.1 Western Blot检测白内障大鼠晶状体中ERS相关GRP78、PERK、p-PERK、ATF4、CHOP的表达水平 |
| 2.2 晶状体上皮细胞培养与活性鉴定 |
| 2.3 Western Blot检测晶状体上皮细胞系ERS相关GRP78、PERK、p-PERK、ATF4、CHOP的表达水平 |
| 2.4 MTT法检测ERS对晶状体上皮细胞增殖的影响 |
| 2.5 流式细胞术检测ERS对晶状体上皮细胞凋亡的影响 |
| 2.6 Western Blot检测ERS对晶状体上皮-间质转化的影响 |
| 2.7 免疫组化检测ERS对晶状体上皮IV型胶原沉积的影响 |
| 2.8 ELISA检测ERS对晶状体上皮炎症因子表达的影响 |
| 3. 讨论 |
| 4. 小结 |
| 第三部分 金属基质蛋白酶多态性与白内障易感性的初步研究 |
| 1. 材料和方法 |
| 1.1 临床病例 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 方法 |
| 1.4.1 收集临床资料 |
| 1.4.2 外周血DNA提取 |
| 1.4.3 基因型检测 |
| 1.4.4 统计学分析 |
| 2. 结果 |
| 2.1 患者一般资料 |
| 2.2 HWE平衡检验 |
| 2.3 MMP-2基因rs243865位点基因型分布 |
| 2.4 MMP-2的C/T等位基因分布频率的比较 |
| 2.5 MMP-2基因rs243865位点遗传模型分析 |
| 3. 讨论 |
| 4. 小结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 英文文章 |
| 在读期间发表论文 |
| 致谢 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 引言 |
| 第一部分 RNA干扰技术构建p38α干扰慢病毒载体 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 主要试剂 |
| 1.1.2 溶液配制 |
| 1.1.3 主要仪器及耗材 |
| 1.1.4 载体及细胞 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 标本的采集与保存 |
| 1.2.2 细胞培养和传代 |
| 1.2.3 实验分组 |
| 1.2.4 慢病毒转染技术 |
| 1.2.5 重组干扰慢病毒包装 |
| 1.2.6 实时荧光定量 PCR 检测(Quantitiative Real-time PCR,q-PCR) |
| 1.2.7 Western blot检测 |
| 1.3 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 RNA干扰质粒的构建 |
| 2.1.1 干扰靶点设计结果 |
| 2.1.2 测序 |
| 2.2 RNA干扰有效靶点的筛选 |
| 2.2.1 RNA干扰后CCH成纤维细胞p38α基因的表达 |
| 2.2.2 RNA干扰后CCH成纤维细胞中p38α蛋白的表达 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 p38介导结膜松弛症细胞衰老的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 主要试剂 |
| 1.1.2 溶液配制 |
| 1.1.3 主要仪器及耗材 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 标本的采集与保存 |
| 1.2.2 细胞培养和传代 |
| 1.2.3 实验分组 |
| 1.2.4 细胞活性试剂盒(Cell counting kit-8, CCK-8)检测 |
| 1.2.5 β-半乳糖苷酶((β-galactosidase,β-gal)染色 |
| 1.2.6 活性氧(reactive oxygen species, ROS)检测 |
| 1.2.7 超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活力测定 |
| 1.2.8 实时荧光定量PCR检测 |
| 1.2.9 Western blot检测 |
| 1.3 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 结膜成纤维细胞生长情况 |
| 2.2 结膜松弛症中细胞衰老的情况 |
| 2.3 p38对结膜成纤维细胞增殖的影响 |
| 2.4 p38对结膜成纤维细胞ROS的影响 |
| 2.5 p38对结膜成纤维细胞SOD的影响 |
| 2.6 p38对结膜成纤维细胞衰老相关基因表达的影响 |
| 2.7 p38对结膜成纤维细胞衰老相关蛋白表达的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 杞精明目汤对p38介导的结膜松弛症成纤维细胞衰老的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 主要试剂 |
| 1.1.2 溶液配制 |
| 1.1.3 主要仪器及耗材 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 标本的采集与保存 |
| 1.2.2 细胞培养和传代 |
| 1.2.3 杞精明目汤颗粒剂的制备 |
| 1.2.4 实验分组 |
| 1.2.5 CCK-8检测 |
| 1.2.6 活性氧(Reactive oxygen species, ROS)含量检测 |
| 1.2.7 超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase, SOD)活力测定 |
| 1.2.8 实时荧光定量PCR检测 |
| 1.2.9 Western blot检测 |
| 1.2.10 质粒构建 |
| 1.2.11 双荧光素酶报告基因检测 |
| 1.3 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 杞精明目汤干预后结膜成纤维细胞的增殖情况 |
| 2.2 杞精明目汤对结膜成纤维细胞ROS的影响 |
| 2.3 杞精明目汤对结膜成纤维细胞SOD的影响 |
| 2.4 杞精明目汤对结膜成纤维细胞衰老相关基因表达的影响 |
| 2.5 杞精明目汤对结膜成纤维细胞衰老相关蛋白表达的影响 |
| 2.6 杞精明目汤对p38启动子活性的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四部分 杞精明目汤对结膜松弛症细胞衰老的临床研究 |
| 1 资料与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 结膜松弛症诊断与分级标准 |
| 1.2.1 诊断标准 |
| 1.2.2 临床分级标准 |
| 1.3 病例入选相关标准 |
| 1.3.1 纳入标准 |
| 1.3.2 排除标准 |
| 1.3.3 剔除标准 |
| 1.3.4 病例脱落及处理 |
| 1.4 材料与仪器 |
| 1.4.1 中药方剂和西药 |
| 1.4.2 主要试验材料与仪器 |
| 1.5 治疗方法 |
| 1.6 分组及随机方法 |
| 1.6.1 样本量的估算及其计算的依据 |
| 1.6.2 随机分组方法 |
| 1.6.3 盲法和对照 |
| 1.7 观察指标 |
| 1.7.1 裂隙灯显微镜检查 |
| 1.7.2 国际眼表疾病指数量表(OSDI) |
| 1.7.3 泪膜破裂时间(BUT) |
| 1.7.4 基础泪液分泌试验(SIT) |
| 1.8 手术方法 |
| 1.9 标本处理及细胞衰老染色 |
| 1.9.1 取材与固定 |
| 1.9.2 切片 |
| 1.9.3 冰冻切片细胞衰老染色 |
| 1.10 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 两组CCH患者治疗前后OSDI评分 |
| 2.2 两组CCH患者治疗前后BUT |
| 2.3 两组CCH患者治疗前后SIT |
| 2.4 两组CCH患者细胞衰老染色 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 创新点 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录一 :文献综述 衰老在祖国医学的认识及其中药研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录二 :在校期间科研成果 |
| 附录三 :参加科研和学术活动 |
| 附件 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、白光LED对于大鼠晶状体的影响的研究 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 主要仪器设备及耗材 |
| 1.1.3 实验方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 HE染色结果 |
| 1.2.2 caspase-3 mRNA与蛋白表达结果 |
| 1.2.3 P21 mRNA及蛋白检测结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 LED光的光生物安全性 |
| 1.3.2 蓝光危害 |
| 1.3.3 LED光活体照射后对晶状体上皮细胞形态的影响 |
| 1.3.4 LED光对晶状体上皮细胞内caspase-3表达的影响 |
| 1.3.5 LED 光对晶状体上皮细胞内 P21~(waf1/cip1)表达的影响 |
| 1.4 小结 |
| 二、不同波长LED光对晶状体氧化损伤的研究 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 主要仪器设备及耗材 |
| 2.1.3 实验方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 晶状体HE染色结果 |
| 2.2.2 晶状体内部MDA含量检测 |
| 2.2.3 晶状体内部SOD活力检测 |
| 2.2.4 晶状体内部GSH-Px活力检测 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 白光LED的光谱组成及光照方案的确定 |
| 2.3.2 LED光与蓝光危害 |
| 2.3.3 氧化应激与白内障 |
| 2.3.4 氧化应激刺激下晶状体内氧化-抗氧化体系失衡 |
| 2.3.5 不同波长的LED光对大鼠晶状体影响的HE染色观察 |
| 2.3.6 不同波长LED光对晶状体内氧化-抗氧化系统的影响 |
| 2.3.7 对于短波长可见光线对晶状体的影响的思考 |
| 2.3.8 关于LED光色温大小与晶状体光损伤效应之间关系 |
| 2.4 小结 |
| 三、硫辛酸对LED光照射后晶状体内MDA含量的影响 |
| 3.1 对象和方法 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 主要仪器设备及耗材 |
| 3.1.3 实验方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 晶状体内MDA、SOD及GSH-Px比较 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 研究白内障发病机制及预防手段的重要意义 |
| 3.3.2 氧化损伤与白内障的预防 |
| 3.3.3 硫辛酸的特性及其抗氧化损伤效应 |
| 3.3.4 硫辛酸的抗晶状体氧化损伤作用 |
| 3.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 LED光源对视觉系统的生物安全性分析 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩略语 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料和方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 作者简历 |
| 0 引言 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 细胞培养和处理 |
| 1.2.2 实时荧光定量PCR (RT-q PCR) |
| 1.2.3 检测细胞内源性活性氧水平 |
| 1.2.4 细胞转染 |
| 1.2.5 细胞增殖活力测定 |
| 1.2.6 Western blotting |
| 2 结果 |
| 2.1 miR-138在年龄相关性白内障晶状体囊膜中的表达升高 |
| 2.2 miR-138在人晶状体上皮细胞氧化应激模型中的表达增加 |
| 2.3 miR-138对人晶状体上皮细胞抗氧化应激的影响 |
| 2.4 miR-138对人晶状体上皮细胞中p53 mRNA和Bax mRNA相对表达量的影响 |
| 2.5 miR-138对人晶状体上皮细胞中p53和Bax蛋白表达的影响 |
| 3 讨论 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 晶状体的结构、功能、发育与分化 |
| 1.2 纤维细胞分化过程中细胞器降解的分子机制 |
| 1.3 白内障及其致病基因 |
| 1.4 白内障致病基因热休克因子4(HSF4)的介绍 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要试剂 |
| 2.2 主要仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 斑马鱼hsf4表达情况分析 |
| 3.2 构建hsf4基因敲除斑马鱼 |
| 3.3 hsf4基因缺陷导致斑马鱼产生先天性白内障 |
| 3.4 在斑马鱼中敲除hsf4基因破坏晶状体内上皮细胞与纤维细胞之间增殖和分化的平衡 |
| 3.5 hsf4基因敲除导致晶状体纤维细胞分化异常 |
| 3.6 HSF4通过调控p53及其下游细胞凋亡相关调控因子Fas、Bax促进纤维细胞分化 |
| 4 讨论 |
| 4.1 hsf4是晶状体的发育和分化过程的重要调节因子 |
| 4.2 HSF4可以通过不同途径稳定p53从而行使调节纤维细胞分化的功能 |
| 4.3 HSF4可以通过调控p53介导的细胞外源和细胞内源凋亡途径来调控纤维细胞的分化 |
| 5 总结与展望 |
| 5.1 全文总结 |
| 5.2 特色与创新 |
| 5.3 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录1 本人攻读博士学位期间发表的论文 |
| 附录2 本文主要缩略词表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 引言 |
| 1.1 晶状体上皮细胞凋亡和白内障 |
| 1.2 Eaf2基因和功能 |
| 1.3 Wnt基因和功能 |
| 第二章 材料和方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 细胞凋亡 |
| 2.3 Western Blot |
| 2.4 real-timePCR |
| 2.5 构建载体 |
| 2.6 LDH检测 |
| 2.7 免疫荧光材料与方法 |
| 2.8 统计方法 |
| 第三章 结果 |
| 3.1 构建过氧化氢诱导的人晶状体上皮细胞HLE-B3细胞凋亡模型 |
| 3.2 过表达Eaf2对于过氧化氢诱导的HLE-B3细胞凋亡的影响 |
| 3.3 Eaf2通过Wnt信号通路调节HLE-B3细胞的凋亡 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 氧化应激诱导人晶状体上皮细胞发生典型调亡 |
| 4.2 Eaf2基因抑制人晶状体上皮细胞凋亡 |
| 4.3 Eaf2通过Wnt信号通路抑制过氧化氢诱导的人晶状体上皮细胞凋亡 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 英文缩略词 |
| 在读期间主要成果 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分 ：氧化应激对人晶状体上皮细胞中SUMO表达的影响 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 研究对象 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 抗体 |
| 2.1.4 实验设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 细胞氧化应激处理 |
| 2.2.3 检测细胞内源性活性氧(ROS)水平 |
| 2.2.4 细胞增殖活力的测定 |
| 2.2.5 Westernblot检测 |
| 2.2.6 RT-PCR检测 |
| 2.2.7 实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR) |
| 2.2.8 免疫细胞化学染色 |
| 2.2.9 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 氧化应激对人晶状体上皮细胞形态的影响 |
| 3.2 不同程度氧化应激对人晶状体上皮细胞内源性ROS水平的影响 |
| 3.3 不同程度氧化应激对人晶状体上皮细胞活性的影响 |
| 3.4 不同程度氧化应激对人晶状体上皮细胞PCNA表达水平的影响 |
| 3.5 氧化应激对人晶状体上皮细胞中SUMO1表达及SUMO化的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分 ：氧化应激条件下人晶状体上皮细胞中PSIP1的SUMO修饰的变化 |
| 6 前言 |
| 7 材料与方法 |
| 7.1 实验材料 |
| 7.1.1 研究对象 |
| 7.1.2 实验试剂 |
| 7.1.3 抗体及载体 |
| 7.1.4 实验设备 |
| 7.2 实验方法 |
| 7.2.1 实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR) |
| 7.2.2 细胞转染 |
| 7.2.3 免疫沉淀 |
| 7.2.4 pEGFP-PSIP1真核表达载体构建 |
| 7.2.5 Westernblot检测 |
| 7.2.6 免疫细胞化学染色 |
| 7.2.7 统计学分析 |
| 8 结果 |
| 8.1 氧化应激对人晶状体上皮细胞中PSIP1表达水平的影响 |
| 8.2 生理状态下人晶状体上皮细胞中PSIP1可被SUMO修饰 |
| 8.3 PSIP1基因的合成及其载体的鉴定 |
| 8.4 pEGFP-PSIP1表达载体的表达鉴定 |
| 8.5 氧化应激条件下人晶状体上皮细胞中PSIP1的SUMO1修饰的变化 |
| 9 讨论 |
| 10 结论 |
| 第三部分 ：PSIP1的SUMO化/去SUMO化对人晶状体上皮细胞增殖活性和抗氧化应激能力的影响 |
| 11 前言 |
| 12 材料与方法 |
| 12.1 实验材料 |
| 12.1.1 研究对象 |
| 12.1.2 实验试剂 |
| 12.1.3 抗体及载体 |
| 12.1.4 实验设备 |
| 12.2 实验方法 |
| 12.2.1 pEGFP-K364R真核表达载体构建 |
| 12.2.2 细胞转染 |
| 12.2.3 免疫共沉淀 |
| 12.2.4 双荧光素酶报告基因检测 |
| 12.2.5 细胞增值活力的测定 |
| 12.2.6 Westernblot检测 |
| 12.2.7 统计学分析 |
| 13 结果 |
| 13.1 SUMO修饰位点突变的PSIP1真核表达载体的构建及检测 |
| 13.2 pEGFP-K364R表达载体的表达鉴定 |
| 13.3 PSIP1的SUMO修饰位点的检测 |
| 13.4 人晶状体上皮细胞中SUMO化/去SUMO化对PSIP1的转录活性的影响 |
| 13.5 人晶状体上皮细胞中SUMO化/去SUMO化对PSIP1的下游分子的影响 |
| 13.6 PSIP1的SUMO化/去SUMO化对人晶状体上皮细胞增殖活性的影响 |
| 13.7 PSIP1的SUMO化/去SUMO化对人晶状体上皮细胞对抗氧化应激能力的影响 |
| 14 讨论 |
| 15 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 在学期间科研成绩 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
