魏素芬[1]（2021）在《新型Hedgehog通路抑制剂土荆皮乙酸抑制髓母细胞瘤生长的机制研究》文中认为目的:Hedgehog（Hh）信号通路的异常活化在多种恶性肿瘤的发生及发展中起关键作用,尤其是髓母细胞瘤（Medulloblastoma,MB）。MB是最常见的儿童恶性脑肿瘤之一,其中,Shh亚型MB占所有病例的约30%。目前,MB的治疗仍以手术、全脑全脊髓放疗以及化疗为主。然而,治疗伴随的认知障碍等长期严重不良反应使得人们将目光转移到分子靶向治疗。Smoothened（SMO）是Hh通路上游的关键调控元件,因此SMO已成为Hh通路驱动的MB的新治疗靶点。目前,已有多种SMO抑制剂进入MB临床试验,并在治疗初期取得了良好疗效。然而,由于SMO或下游元件基因突变导致耐药性的出现及肿瘤复发,极大地限制了 SMO抑制剂的临床应用。因此,研发新型、可有效逆转耐药的Hh通路抑制剂显得尤为迫切。土荆皮乙酸（Pseudolaric acid B,PAB）是一种广谱抗肿瘤天然小分子化合物,然而目前关于PAB作用于Hh信号通路或用于治疗MB的相关研究未见报道。因此,本课题旨在探索PAB在体外及体内通过作用Hh信号通路抑制MB生长的抗肿瘤活性及其潜在分子机制。方法:在体外实验中,首先,我们通过MTT法从26个天然抗肿瘤小分子化合物中筛选出对人髓母细胞瘤细胞（DAOY）活性抑制效果最强的药物——PAB;接着,我们选用DAOY细胞、人肺腺癌细胞系（A549、H1299）、人胃腺癌细胞系（BGC-823、SGC-7901、AGS）、人乳腺癌细胞系（MDA-MB-231）、人宫颈癌细胞系（Hela）以及人肝癌细胞系（SMMC-7721、MHCC-97H）共十个肿瘤细胞系,western blotting 法检测细胞 Glil蛋白表达,给予指定浓度PAB处理后,MTT法检测细胞活力。然后,我们将DAOY细胞、原代颗粒神经元前体细胞（Granule Cell Progenitors,GNPs）、提取自Ptch1--自发MB小鼠的原代MB细胞以及3T3/GLI-luc细胞作为研究对象;给予指定浓度的PAB或SMO激动剂SAG处理,部分实验采用SMO抑制剂cyclopamine或vismodegib作为阳性对照;MTT法检测细胞活力,克隆形成实验或EdU掺入实验检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,western blotting法检测凋亡相关蛋白、Glil、cyclin Dl、N-myc以及SMO蛋白表达,肿瘤球形成实验检测细胞成球能力,荧光素酶报告基因检测试剂盒检测GLI转录活性,qRT-PCR法检测Hh通路靶基因表达,siRNA敲低SMO后采用MTT法检测细胞活力,western blotting法检测细胞Glil、cyclin Dl、N-myc及SMO蛋白表达。此外,我们构建了过表达SMO-GFP的NIH3T3细胞、过表达SMO-WT的293T细胞以及分别过表达SMO-WT、SMO-D477G、SMO-W539L的3T3/GLI-luc细胞,给予指定浓度PAB或SAG处理,部分实验采用vismodegib作阳性对照。此外,我们采用分子对接预测PAB与SMO的结合潜力,BODIPY-cyclopamine竞争结合实验检测PAB竞争结合SMO,CETSA实验检测PAB对SMO稳定性的影响,荧光素酶报告基因检测试剂盒检测Hh通路转录因子GLI转录活性,纤毛发生及SMO纤毛定位实验检测纤毛形成和SMO纤毛定位,western blotting检测Gli1蛋白表达。在体内实验中,我们采用提取自Ptch1+-自发MB小鼠的原代MB细胞,构建MB异位移植瘤BALB/c裸鼠模型;肿瘤体积达100 mm3时随机分为4组:溶剂空白对照组、PAB低剂量组（50 mg/kg）、PAB高剂量组（100 mg/kg）、vismodegib组（20 mg/kg）;隔日测量肿瘤体积及小鼠体重,持续给药18天后,取材留取肿瘤组织样本;称量肿瘤质量,western blotting检测凋亡和增殖相关蛋白以及Gli1蛋白,qRT-PCR检测Hh通路靶基因表达,免疫组化法检测Ki-67表达水平,H&E染色观察组织病理形态。结果:在体外实验中,PAB对DAOY细胞表现出极显着的细胞毒效应,而且与其他肿瘤细胞系相比,PAB以极低的浓度特异性杀伤Hh通路高度活化的DAOY细胞（IC50为0.83μM）,同时抑制其克隆形成,并上调其凋亡相关蛋白cleaved-caspase-3及PARP cleavage水平,诱导细胞凋亡;与之相一致的是,PAB同样可抑制原代MB细胞的细胞活性,显着减少EdU 阳性细胞比例,并抑制其肿瘤球形成;然而,当我们采用siRNA敲低SMO后,DAOY细胞增殖能力降低,而且PAB无法有效抑制其增殖能力。在通路活性抑制效应方面,PAB可消除由SAG诱导的GLI荧光素酶报告基因以及Hh通路靶基因Gli1、cyclin D1、N-myc的转录活化;与此同时,PAB可下调DAOY细胞在SAG诱导前后的Gli1蛋白水平,并抑制其Gli1、cyclin D1的转录活性;同样地,PAB可抑制原代MB细胞Hh通路靶基因Gli1、cyclin D1、N-myc的转录水平;与之相一致的是,PAB可下调DAOY细胞及原代MB细胞Hh通路效应蛋白cyclin D1及N-myc的表达水平;而采用siRNA敲低原代MB细胞SMO后,PAB对其Gli1、SMO、cyclin D1及N-my蛋白的下调效应几乎消失。在通路靶点验证方面,虽然PAB对DAOY细胞总SMO蛋白水平并无影响,但是分子对接预测出PAB与SMO结合的两个位点,其中一个位点位于SMO跨膜区域（Transmembrane domain,TMD）的细胞外入口处,另一个则位于TMD的细胞内环区（Intracellular loops,ICLs）中;BODIPY-cyclopamine 竞争结合实验结果表明PAB可与BODIPY-cyclopamine竞争结合SMO TMD中的疏水口袋,而CETSA实验亦证实PAB干预可提高SMO蛋白稳定性;PAB还可抑制细胞纤毛形成,但对SMO纤毛定位并无影响。在逆转耐药方面,PAB对过表达SMO-WT、SMO-D477G及SMO-W539L的3T3/GLI-luc细胞GLI转录活性呈现出相似的抑制效应,同时能下调其Glil蛋白水平;此外,PAB对不同浓度梯度SAG处理下3T3/GLI-luc细胞的GLI转录活性的抑制效应几乎一致。在体内实验中,PAB显着抑制MB异位移植瘤的生长,且对小鼠体重无影响,同时上调其PARP cleavage、cleaved-casepase-3蛋白水平,肿瘤组织H&E染色片中亦观察到核凝集现象;此外,PAB还可下调肿瘤组织中PCNA及Ki-67表达水平;与体外实验相一致的是,PAB可下调肿瘤组织中Glil蛋白水平,并下调其Gli1、cyclin D1、N-myc的 mRNA 水平。结论:本课题探讨了天然小分子化合物土荆皮乙酸抑制髓母细胞瘤生长的潜在分子机制。我们发现PAB可通过抑制Hh通路活性,在体外及体内抑制MB的生长。此外,PAB还可克服由SMO突变引起的SMO抑制剂耐药。通过机制研究,我们发现PAB可同时结合SMO上的两个位点,并抑制纤毛形成,提示PAB可通过多个机制抑制Hh通路的活性。因此,PAB是治疗Hh通路驱动的MB的有效药物,尤其是对SMO抑制剂产生耐药的MB,为新型Hh靶向药物的研发提供了新方向。
周文明[2]（2021）在《miR-155-5p调控线粒体通路髓核细胞凋亡及补肾壮督方的干预研究》文中进行了进一步梳理目的:1.通过建立椎间盘退变模型,观察椎间盘退变情况、髓核细胞凋亡以及miR-155-5p表达量变化情况;2.通过生物信息学预测miR-155-5p的靶基因,借助慢病毒转染以及双荧光素酶检测确定miR-155-5p的靶基因,并检测线粒体信号通路关键因子,进而明确miR-155-5p与线粒体信号通路之间的关系;3.通过补肾壮督方含药血清干预H2O2诱导的髓核细胞,观察髓核细胞凋亡情况,探索miR-155-5p及其靶基因与线粒体信号通路的关系,在细胞层面验证补肾壮督方是否通过上调miR-155-5p,进而通过线粒体信号通路抑制髓核细胞凋亡。4.基于以上实验,探索补肾壮督方干预椎间盘退变大鼠模型是否通过上调miR-155-5p的表达,靶向抑制线粒体信号通路关键因子,进而抑制髓核细胞凋亡,从而改善椎间盘退变。方法:1.将12周龄SPF级雄性大鼠28只,按照随机数字表法,将大鼠划分为2个组别:假手术组、模型组,分配到每个组别14只。其中假手术组只暴露椎间盘不做穿刺,模型组行针刺椎间盘。连续灌胃8周后,取材进行相关检测,包括HE染色观察椎间盘组织退变情况,原位末端转移酶标记技术检测髓核细胞凋亡,qPCR检测miR-155-5p表达改变。2.通过采用生物信息学软件预测miR-155-5p调控的靶基因,并预测Apafl基因3’ UTR是否存在与miR-155-5p结合位点;检测实验各项指标,包括:流式细胞术检测人髓核细胞凋亡、双荧光素酶报告基因检测、qPCR检测基因表达的表达改变、蛋白免疫印迹法检测凋亡蛋白表达量。3.将12周龄SPF级雄性大鼠37只,按照随机数字表法,将大鼠划分为4个组别:正常组、低剂量中药组、中剂量中药组、高剂量中药组。予补肾壮督方灌胃,正常组大鼠给予等量生理盐水灌胃,该过程持续2周;然后进行腹主动脉抽血,分离血清用于后续实验。进行补肾壮督方含药血清干预,检测相关指标,包括透射电镜观察,流式细胞术检测凋亡、蛋白免疫印迹法检测凋亡蛋白表达量、qPCR检测基因表达的表达改变。4.将12周龄SPF级雄性大鼠70只,按照随机数字表法,将大鼠划分为5个组别:假手术组、模型组、低剂量中药组、中剂量中药组、高剂量中药组,分配到每个组别14只。其中假手术组只暴露椎间盘不做穿刺,其余四组均行针刺椎间盘。假手术组及模型组每天灌以3ml生理盐水,剩余低、中、高剂量组分别给予中药溶液灌胃。连续灌胃8周后,取材进行相关检测,包括HE染色观察椎间盘组织退变,原位末端转移酶标记技术检测髓核细胞凋亡,qPCR检测各基因的表达改变,蛋白免疫印迹法检测髓核组织内蛋白表达量的变化。结果:1.miR-155-5p在大鼠椎间盘退变中髓核组织的表达情况（1）各组大鼠椎间盘组织组织病理学评分,与假手术组相比,模型组病理组织学评分显着增高（P<0.05）（2）各组大鼠椎间盘髓核细胞凋亡指数,与假手术组相比,模型组凋亡指数显着增高（P<0.05）。（3）各组大鼠椎间盘髓核细胞miR-155-5p表达量,与假手术组相比,模型组miR-155-5p表达量显着降低（P<0.05）。2.miR-155-5p对人髓核细胞凋亡的作用机制（1）通过生物信息学方法预测,发现人Apaf1的3’-UTR存在miR-155-5p的结合位点,表明miR-155-5p靶向调控Apaf1可能性大。（2）与野生型NC组相比,野生型模拟物组明显降低了 Apaf1的表达（P<0.05）,这表明 miR-155-5p 能结合 Apaf1 3’-UTR,亦即 miR-155-5p 能靶向调控Apaf1的表达。（3）流式检测髓核细胞凋亡指数,通过和正常对照组比较,模型组内的髓核细胞凋亡指数显着增高（P<0.05）;模型组+mimics与模型组+NC 比较显着降低（P<0.05）;模型组+anti-mimics与模型组+NC比较显着增高（P<0.05）。（4）各组髓核细胞miR-155-5p表达表达量,通过和正常对照组比较,模型组内表达量显着减少（P<0.05）;模型组+过表达慢病毒与模型组+对照病毒组比较显着增高（P<0.05）;模型组+干扰病毒组与模型组+对照病毒组比较显着降低（P<0.05）。各组髓核细胞Bcl-2表达量,与正常对照组相比,模型组表达量显着减少（P<0.05）;过表达慢病毒组与模型组+对照病毒组显着增高（P<0.05）,干扰病毒组与模型组+对照病毒组比较明显降低（P<0.05）。各组髓核细胞Cytc及Apaf1表达量,与正常对照组相比,模型组明显增高（P<0.05）;过表达慢病毒组和模型组+对照病毒组相比均明显减少（P<0.05）,干扰病毒组和模型组+对照病毒组比较明显增高（P<0.05）。（5）各组髓核细胞Bcl-2蛋白表达量,与正常对照组相比,模型组表达量显着减少（P<0.05）;过表达慢病毒组与模型组+对照病毒组显着增高（P<0.05）,干扰病毒组与模型组+对照病毒组比较明显降低（P<0.05）。各组髓核细胞Cytc及Apaf1蛋白表达量,与正常对照组相比,模型组明显增高（P<0.05）;过表达慢病毒组和模型组+对照病毒组相比均明显减少（P<0.05）,干扰病毒组和模型组+对照病毒组比较明显增高（P<0.05）。3.补肾壮督方含药血清对髓核细胞线粒体凋亡通路及miR-155-5p的影响（1）透射电镜观察结果:正常组细胞体积正常,胞质均匀,表面微绒毛存在;模型组细胞表现为细胞体积变小,核染色质凝聚、细胞内细胞器集中,处于凋亡晚期阶段的髓核细胞可观察到凋亡小体。低剂量含药血清组可见核染色质边缘化,有不定量的凋亡小体;中剂量含药血清组可见,细胞器清晰,可见少量凋亡小体;高剂量含药血清胞质内未见凋亡小体,细胞体积正常。（2）流式检测髓核细胞凋亡指数,通过和正常对照组比较,模型组内的髓核细胞凋亡指数显着增高（P<0.05）;低、中、高剂量含药血清组与模型组相比较明显降低（P<0.05）;低、中、高3个剂量组之间比较,低、中剂量组差异具有统计学意义（P<0.05）。（3）各组髓核细胞Bcl-2蛋白表达量,与正常对照组比较,模型组Bcl-2的蛋白表达量显着减少（P<0.05）;低、中、高剂量含药血清组与模型组相比较明显增高（P<0.05）;低、高剂量组（P<0.05）及低、中剂量组（P<0.05）存在统计学差异。各组髓核细胞Cytc及Apaf1蛋白表达量,与正常对照组相比,模型组Cytc蛋白表达量明显增高（P<0.05）;低、中、高剂量含药血清组与模型组相比较明显降低（P<0.05）;低、中、高3个剂量组之间比较,三组之间均存在差别（P<0.05）。（4）各组髓核细胞miR-155-5p表达量,各组髓核细胞miR-155-5p表达量,与正常对照组相比,模型组表达量明显降低（P<0.05）;模型组与低、中、高剂量含药血清组比较,低、中、高三组均明显增高（P<0.05）,低、中、高三个组比较,低、中、高三个组别内比较也具有统计学差异（P<0.05）。各组髓核细胞Bcl-2表达量,与正常对照组相比,模型组Bcl-2表达量显着减少（P<0.05）;与模型组相比,中、高剂量含药血清组Bcl-2表达量明显增加（P<0.05）;低、中、高剂量含药血清组之间比较差异均有统计学差异（P<0.05）;各组髓核细胞Cytc及Apaf1表达表达量,与正常对照组相比,模型组显着增加（P<0.05）;与模型组相比,低、中、高剂量含药血清组中Cytc表达量显着减少（P<0.05）,低、中、高剂量含药血清组之间比较差异均有统计学差异（P<0.05）;4.补肾壮督方对大鼠退变髓核组织线粒体凋亡通路及miR-155-5p的影响（1）各组大鼠椎间盘组织组织病理学评分,与假手术组相比,模型组组织病理学评分显着增高（P<0.05）;模型组与低、中、高剂量中药组相比,低、中、高三组均显着降低（P<0.05）,高、中及低、高剂量组之间具有统计学差异（P<0.05）。（2）各组大鼠椎间盘髓核细胞凋亡指数,与假手术组比较,模型组细胞凋亡指数显着增高（P<0.05）;模型组与低、中、高剂量中药组比较,低、中、高三组均显着降低（P<0.05）,低、中、高三个组别内比较也具有统计学差异（P<0.05）。（3）各组大鼠椎间盘髓核细胞miR-155-5p表达量,与假手术组相比,模型组表达量明显降低（P<0.05）;模型组与低、中、高剂量中药组比较,中、高两组组均明显增高（P<0.05）,低、高之间比较具有统计学差异（P<0.05）。各组大鼠椎间盘髓核细胞Bcl-2表达量,与假手术组相比,模型组明显降低（P<0.05）;模型组与中、高剂量中药组比较,中、高两组均明显增高（P<0.05）;低、高剂量组之间比较也具有统计学差异（P<0.05）。各组大鼠椎间盘髓核细胞Cytc表达量,与假手术组相比,模型组明显增高（P<0.05）;模型组与低、中、高剂量中药组比较,低、中、高三组均明显降低（P<0.05）,低、中、高三个组别之间比较也具有统计学差异（P<0.05）。各组大鼠椎间盘髓核细胞Apaf1表达量,与假手术组相比,模型组明显增高（P<0.05）;模型组与低、中、高剂量中药组比较,低、中、高三组均明显降低（P<0.05）,低、高两个组别之间比较具有统计学差异（P<0.05）。（4）各组大鼠椎间盘髓核细胞Bcl-2蛋白表达量,与假手术组相比,模型组明显降低（P<0.05）;模型组与低、中、高剂量中药组比较,低、中、高三组均明显增高（P<0.05）,低、中、高剂量组之间比较也具有统计学差异（P<0.05）。各组大鼠椎间盘髓核细胞Cytc及Apaf1蛋白表达量,与假手术组比较,模型组显着增高（P<0.05）;模型组与低、中、高剂量中药组比较,低、中、高三组均明显降低（P<0.05）,低、中、高三个组别之间比较也具有统计学差异（P<0.05）。结论:1.miR-155-5p的靶基因为Apaf1,过表达及敲低表达miR-155-5p均能影响髓核细胞凋亡,其影响髓核细胞凋亡的机制为通过靶向调控Apaf1参与线粒体凋亡通路。2.补肾壮督方含药血清能够抑制过氧化氢诱导的髓核细胞凋亡,其机制在于通过上调miR-155-5p,下调靶基因Apafl的表达,通过抑制线粒体凋亡通路,进而抑制髓核细胞凋亡。3.补肾壮督方可通过上调miR-155-5p,下调靶基因Apaf1,抑制线粒体凋亡通路,减少髓核细胞凋亡,从而改善椎间盘退变。
任琦[3]（2021）在《对药茯苓-泽泻干预血脂异常痰浊证大鼠AMPK通路和肠道菌群的机制研究》文中研究表明目的:基于“脾主运化”、“脾为生痰之源”的中医理论,在本团队前期研究基础上,以血脂异常痰浊证大鼠为研究对象,采用对药“茯苓-泽泻”干预,研究其化痰降浊、控制血脂的效应,从AMPK信号通路和肠道菌群方面阐明其作用机制,为后续研究提供依据。方法:1.对药“茯苓-泽泻”化学成分鉴定及网络药理学分析采用UPLC-Q-Orbitrap-MS法定性分析对药“茯苓-泽泻”煎剂的主要化学成分,通过在线数据库和文献检索方法检索所鉴定化学成分的靶点,检索血脂异常的疾病靶点。将成分靶点与疾病靶点取交集后构建“化合物--血脂异常疾病靶点”网络图。对网络图进行拓扑分析,探索对药“茯苓-泽泻”降脂的潜在关键成分和作用靶点,利用KOBAS数据库分析关键靶点所富集的KEGG功能通路,应用分子对接技术研究部分化学成分对疾病靶点的作用,挖掘对药“茯苓-泽泻”治疗血脂异常的潜在机制。2.血脂异常痰浊证病证结合大鼠模型的建立与评价将60只SD大鼠按体重随机分为正常组和造模组,造模组造模使用高脂饮食喂养,正常组予以普通饲料喂养作为对照,4周后分析观察大鼠的一般状态（饮食、体重、活动度、大便等）,并检测各组大鼠的血脂四项,依据模型评价标准判定模型成功与否。3.对药“茯苓-泽泻”对血脂异常痰浊证大鼠的降脂疗效按照血清总胆固醇（TC）值将模型大鼠随机分为模型对照组（模型组）、西药对照组（西药组）、对药茯苓-泽泻高、中、低剂量组（茯泽-H组、茯泽-M组、茯泽-L组）5个实验组,每组8只;正常组8只作为空白对照（空白组）。给药4周后,对比分析各组大鼠的一般状态（饮食、体重变化、活动度、大便等）、血清TC、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、血清总胆汁酸（TBA）、血清游离脂肪酸（FFA）、肝内脂质沉积（肝内TC、TG）、肝脏病理变化等指标。4.对药“茯苓-泽泻”对血脂异常痰浊证大鼠AMPK信号通路的影响采用RT-PCR和WB技术检测各组大鼠肝脏中AMPK和下游靶点ACC、SREBP-1C、HMGCR、PCSK9以及PPAR γ的基因及蛋白的表达变化。5.对药“茯苓-泽泻”对血脂异常痰浊证大鼠肠道菌群的影响以16S rDNA技术检测各组大鼠肠道菌群的组成,进行α多样性、β多样性、组间差异物种、功能预测和相关性等分析。结果:1.对药“茯苓-泽泻”化学成分鉴定及网络药理学分析的结果结合文献和数据库比对,对药“茯苓-泽泻”煎剂初步鉴定出45个化学成分,主要包括三萜类、倍半萜、有机酸、黄酮类、氨基酸类、酰胺类、核苷类、甾体类、苷类、酚类、生物碱类、酯类等。网络药理学分析结果显示,对药“茯苓-泽泻”发挥降脂疗效的主要成分可能为齐墩果酸（Oleanolic acid）、圆柚酮（Nootkatone）、阿魏酸（Ferulic acid）、柑桔黄酮（Tangeritin）、异甘草素（Isoliquiritigenin）、蜜桔黄素（Nobiletin）、刺芒柄花素（Formononetin）、（+/-）12（13）-DiHOME、9S,13R-12-Oxophytodienoic acid以及人参皂苷Rg3（Ginsenoside Rg3）,关键靶点显着富集于AMPK、胰岛素、脂肪细胞因子信号通路,胰岛素抵抗和非酒精性脂肪肝等糖脂代谢通路（P<0.05）,其中AMPK信号通路的富集程度最高。分子对接结果提示,齐墩果酸可与AMPKα、PPARy、SREBP1和HMGCR结合形成稳定复合物,与AMPKα的结合最好;阿魏酸和柑桔黄酮可与PPARγ结合形成稳定复合物;人参皂苷Rg3和圆柚酮可与AMPKα结合形成稳定复合物。2.成功复制血脂异常痰浊证病证结合SD大鼠模型4周造模期结束,造模组大鼠出现体胖、纳呆、活动度降低、体毛无光泽、大便粘腻等表现;血脂四项检测显示造模组大鼠血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）值增高、血清高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）值降低,与正常组比较,差异均有统计学意义（P<0.05）,结果提示,成功复制血脂异常痰浊证病证结合SD大鼠模型,符合模型评价标准,提示造模成功。3.对药“茯苓-泽泻”对血脂异常痰浊证大鼠降脂疗效的结果给药期结束,各实验组大鼠的体重均增加,其中茯泽-H组的体重变化率最低,与空白组和模型组比较,差异均有统计学意义（P<0.05）;各给药组大鼠的自主运动总距离均有一定的增加趋势（P>0.05）。药物干预对模型大鼠的进食量无明显影响,提示对药茯苓-泽泻可改善模型大鼠的部分痰浊证症状。给药结束后,对药茯苓-泽泻各剂量组的血清LDL-C和TBA在给药后明显降低（P<0.05）;茯泽-H组的血清HDL-C值在给药后明显增高（P<0.05）;对药各剂量组的血清TC值无明显变化（P>0.05）;对药茯苓-泽泻各剂量组的血清TG和FFA在给药后有一定降低趋势（P>0.05）。肝内脂质及肝指数比较显示,茯泽-H组、茯泽-M组的肝内TC、肝内TG及肝指数在给药后呈降低趋势,但与模型组比较,差异无统计学意义（P>0.05）。各实验组大鼠肝脏HE染色结果显示,模型组呈现严重的脂肪变性,有炎症改变,各药物干预后可改善肝脏的脂肪变性以及炎症状况。以上结果显示:对药茯苓-泽泻能改善血脂异常痰浊证大鼠的血脂异常。4.对药“茯苓-泽泻”对血脂异常痰浊证大鼠AMPK信号通路影响的结果PCR结果显示,给药干预后,对药各剂量组的AMPKα基因表达上调（P<0.05）;对药各剂量组SREBP-1C和PCSK9的基因表达量降低（P<0.05）;茯泽-H、茯泽-M的PPARγ基因表达量较模型组明显降低,（P<0.05）;茯泽-H组的ACC和HMGCR基因表达量明显降低（P<0.05）。WB检测结果显示:给药后,茯泽-H组AMPKα和pAMPKα的蛋白水平增高,茯泽-M组AMPKα的蛋白水平增高（P<0.05）;对药各剂量组的ACC总蛋白水平降低,茯泽-H组、茯泽-M组的pACC蛋白水平增高（P<0.05）;对药各剂量组的SREBP-1C、PCSK9、PPARγ及HMGCR蛋白表达水平给药后明显降低。以上结果提示:对药茯苓-泽泻具有通过调节AMPK信号通路控制血脂异常的效应机制。5.对药“茯苓-泽泻”对血脂异常痰浊证大鼠肠道菌群的影响结果与模型组相比,茯泽-M组大鼠肠道菌群的α多样性显着增高;β多样性分析显示给药后各组大鼠的肠道菌群结构明显不同,其中茯泽-M组的肠道菌群结构与空白组最接近。与模型组相比,对药“茯苓-泽泻”干预主要增加了厚壁菌门、毛螺菌科、克里斯滕森菌科、ChristensenellaceaeR7group的丰度,降低了疣微菌门、阿克曼菌科以及阿克曼菌属的丰度,茯泽-H和茯泽-M组的拟杆菌门、瘤胃菌科丰度增加,茯泽-M组还可增加普雷沃氏菌科、乳酸菌科、乳杆菌属、苏黎世杆菌属、布劳特氏菌属以及约氏乳杆菌的丰度,茯泽-H及茯泽-L组中的拟杆菌属和拟普雷沃菌属等的丰度增加。KEGG功能预测分析显示,对药“茯苓-泽泻”可显着降低脂多糖（LPS）生物合成,胰岛素、AMPK、PI3K-Akt信号通路,类固醇合成等糖脂合成以及炎症相关通路的基因富集,增加丙酮酸代谢、磷酸戊糖途径、脂肪酸的分解、甘油脂代谢以及花生四烯酸等糖脂分解代谢相关通路的基因富集。相关性分析显示:①在门水平,柔壁菌门、拟杆菌门等与血清TC以及肝内TC和TG呈负相关,厚壁菌门、疣微菌门及变形菌门等均与血清TC呈正相关;②在属水平,LachnospiraceaeNK4A136group、unculturedbacteriumoMollicutesRF39、unculturedbacteriumfPrevotellaceae、瘤胃菌科UCG-014 以及普雷沃氏菌属UCG-001与肝内TC和TG、血清TC、FFA呈负相关,Parabacteroides、拟杆菌属、阿克曼菌属等则与肝内TC、血清TC、TG和FFA呈正相关;③在种水平,大肠杆菌和Clostridiumglycyrrhizinilyticum 等与血清 TC、肝内 TG 和 TC 呈正相关,与 HDL-C呈负相关;Romboutsiailealis与血清TC、FFA呈正相关;Akk菌等则与血清TC、TG、FFA及肝内TC呈正相关;单形拟杆菌、产酸拟杆菌和狄氏副拟杆菌等与血清TC、TG、FFA、肝内TG及肝内TC呈正相关。结论:1.对药“茯苓-泽泻”煎剂含有齐墩果酸、圆柚酮、阿魏酸等多种降脂成分,网络药理学提示其可能通过多种途径发挥降脂作用。2.对药“茯苓-泽泻”可降低血脂异常痰浊证大鼠血清中有害脂质,显着改善肝脏脂质沉积,减轻肝脏的脂肪变性及炎性改变,并改善体胖、倦怠等痰浊证症状。3.对药“茯苓-泽泻”可激活AMPK信号通路表达,通过抑制其下游靶点ACC、SREBP-1C、PCSK9、PPARγ、HMGCR的表达,调控胆固醇代谢和脂肪酸代谢,发挥降脂效应。4.对药“茯苓-泽泻”可调控大鼠肠道微生物组成和功能,恢复肠道稳态。
邓之彤[4]（2021）在《畅幽悠治疗功能性便秘的实验和临床研究》文中研究指明目的:通过动物试验研究评价中药食疗配方畅幽悠治疗功能性便秘的效果并且阐明其作用机理。通过前后对照试验比较畅幽悠治疗功能性便秘的临床疗效。探索畅幽悠调节肠道微生态的作用以及治疗功能性便秘的分子生物学机理。为治疗功能性便秘提出一种简便、有效、安全的中药食疗配方。方法:1.畅幽悠对功能性便秘大鼠的疗效研究对30只SD大鼠使用随机数字表法分组,分为空白对照组6只,模型对照组6只,畅幽悠组9只,乳果糖阳性对照组9只。使用复方地芬诺酯制造功能性便秘SD大鼠模型。除了空白对照组外,其余各组均连续20天采用复方地芬诺酯10 mg/kg每天一次灌胃以建立功能性便秘大鼠模型。治疗过程中,继续维持造模药物剂量。成模后按对应组别给药。畅幽悠用量为200 mg/kg。阳性对照组乳果糖用量为3340 mg/kg。采用墨汁对推进实验及粪便含水量检测评价治疗效果。检测粪便菌群结构、结肠组织、血浆的相关指标。2.畅幽悠治疗功能性便秘的临床研究对31例符合标准的功能性便秘患者使用畅幽悠治疗30天,用量为每天3次,每次9g（1包）。采用便秘评分量表衡量患者治疗前、后的疗效。收集患者治疗前后的大便并进行16SrDNA检测。结果:（一）在复方地芬诺酯诱导的功能性便秘SD大鼠模型实验中,口服畅幽悠:1.可明显提高模型动物的粪便含水率,缓解便秘;恢复大鼠受到复方地芬诺酯抑制的肠蠕动功能;作用均与阳性对照物乳果糖相似;2.可修复模型大鼠结肠上皮组织的病理损伤;3.可通过调节血浆中影响肠道蠕动的相关神经递质如胃动素、胃泌素、P物质、血管活性肠肽,促进肠蠕动。4.可调节肠粘膜屏障的通透性,下调Occludin和ZO-1蛋白及其对应的mRNA表达量以及下调水通道蛋白3、水通道蛋白8的表达,增加粪便含水率;5.可调节肠道菌群,增加粪便中产短链脂肪酸的菌属如Blautia,Ruminococcus,Roseburia,Coprococcus,Lachnospira 的相对丰度并且增加粪便中丙酸、丁酸、异丁酸等短链脂肪酸的含量。（二）功能性便秘患者31例口服畅幽悠30天:1.观察到①18例周完全自主排便频率异常的患者经治疗后,有16例排便频率增加;②31例患者经治疗后,有26例患者大便大便性状变软;③31例伴有排便未尽感的患者经治疗后,有26例患者排便未尽感症状缓解;④19例伴有腹痛症状的患者经治疗后,有15例患者腹痛症状缓解;⑤26例伴有腹胀症状的患者经治疗后,有18例患者腹胀症状缓解;⑥24例伴有排便困难的患者经治疗后,18例患者排便困难程度降低。2.把31名患者的大便按照就诊先后顺序进行排序。对治疗前采集的样本,把1号、2号、3号样本进行混样处理。随后对每3个连续标号的样本进行样本混合。最后将28号、29号、30号、31号4个样本混合成1个样本。治疗后采集的样本参照治疗前采集的样本进行样本混合。发现治疗后,患者答辩菌群结构与使用前相比,产短链脂肪酸相关菌属Butyricicoccus、Blautia、Lachnospira、Ruminococcus的相对丰度较使用前显着上升,益生菌Bifidobacterium、Lactobacillus相对丰度亦较干预前显着上升。结论:口服中药食疗配方畅幽悠,可明显恢复大鼠受到复方地芬诺酯抑制的肠蠕动功能,提高模型动物的粪便含水率,缓解便秘;修复模型大鼠结肠上皮组织的病理损伤。作用机理涉及:（1）调节血浆中胃动素、胃泌素、P物质、血管活性肠肽等影响肠道蠕动相关神经递质的水平,促进肠蠕动;（2）下调Occludin和ZO-1蛋白及其对应的mRNA表达量以及下调水通道蛋白3、水通道蛋白8的表达,改善肠粘膜屏障的通透性,增加粪便含水率;（3）增加粪便中Blautia、Ruminococcus等多种短链脂肪酸产生菌属的相对丰度并且增加粪便中丙酸、丁酸、异丁酸等短链脂肪酸的含量,改善肠道菌群微生态。在治疗功能性便秘患者临床试验中,观察到畅幽悠可明显改善便秘症状;并发现疗效与增加短链脂肪酸产生菌属风度、改善肠道菌群微生态相关。因此,畅幽悠是一种对功能性便秘有效的中药食疗配方。畅幽悠是由国家卫生部颁发的药食同源目录中可用作食材的中药组成,在临床试验中,未发现有患者出现严重不良反应和副作用,因此畅幽悠是一种安全性较高的功能性便秘食疗配方。畅幽悠是冲剂,每袋9g的独立包装为患者服用提供了简便性。
高焕佳[5]（2021）在《丹参酮ⅡA对DOCA-salt高血压大鼠的保护作用及其机制研究》文中认为目的:通过复制DOCA-salt高血压大鼠模型,研究丹参酮ⅡA对DOCA-salt高血压大鼠的平均动脉压的影响,研究丹参酮ⅡA对于DOCA-salt高血压大鼠心脏和肾脏炎症反应及氧化应激的作用,为丹参酮ⅡA治疗盐敏感性高血压提供一定的科学依据。方法:（1）中枢给予TNF-α对SD及Dahl大鼠PVN炎症介质表达的影响实验采用成年雄性SD大鼠,体重250g-280g,及周龄相同的Dahl大鼠,大鼠分为两组,予以侧脑室注射250ng TNF-α,对照组注射2.5μL的生理盐水,注射完成3h后处死大鼠,分别用于冰冻切片染色和real-time PCR检测,real-time PCR 检测 PVN 区 IL-6,IL-1β;CCL5、CCL12;iNOS;NF-κB1 的 mRNA 水平。进行免疫荧光染色检测PVN区IL-1β,CCL5,iNOS及NF-κB1的表达情况。（2）丹参酮ⅡA对大鼠原代神经细胞的保护作用培养SD大鼠的原代神经细胞,20ng/ml的TNF-α处理原代神经细胞,进行了不同时间（3h、6h、24h）的时间依赖研究;不同剂量（0.2ng/ml,2ng/ml,20ng/ml）的TNF-α处理6h的剂量依赖研究,检测IL-6、IL-1β、CCL5、CCL12、iNOS、P65 的 mRNA 水平。培养Dah1大鼠的原代神经细胞,使用20ng/mL的TNF-α处理6h,对比Dahl大鼠与SD大鼠的对照组基线水平及TNF-α处理6h后炎症介质基因的表达差异。分别使用不同浓度的丹参酮ⅡA（10uM、20uM、50uM）预处理Dah1大鼠原代神经细胞30min,而后用20ng/ml TNF-α处理,进行了 real time PCR检测,检测IL-6、IL-1β、CCL5、CCL12、iNOS、P65 及 NADPH 氧化酶亚基（Cyba、Cybb）的mRNA水平。使用50uM丹参酮ⅡA预处理SD大鼠原代神经细胞30min,而后用20ng/ml TNF-α处理,固定细胞进行免疫荧光染色检测IL-1β、CCL5、iNOS、pp65的蛋白表达水平。（3）丹参酮ⅡA磺酸钠注射液对DOCA-salt高血压大鼠的保护作用将30只8周龄的SD大鼠随机分为5组,分别为:对照组、模型组、丹参酮ⅡA磺酸钠注射液低剂量组（10mg/kg.d）、丹参酮ⅡA磺酸钠注射液中剂量组（15mg/kg.d）、丹参酮ⅡA磺酸钠注射液高剂量组（25mg/kg.d）,每组各6只。除对照组外,其他大鼠皮下植入DOCA片剂,同日予以1%NaCl+0.2%KCL饮水。对照组及模型组每日给予等体积生理盐水腹腔注射,丹参酮ⅡA磺酸钠注射液低、中、高剂量组每日进行腹腔注射给药。采用智能无创尾动脉血压计测量血压,每周两次。每周测量1次体重。共连续处理21天。第22天使用10%水合氯醛腹腔麻醉,每组1只4%多聚甲醛灌流固定取大鼠肾脏用于HE染色观察大鼠肾脏形态,其余的各组大鼠麻醉后首先称体重,取出大鼠两侧肾脏及心脏,并迅速进行称重,得到肾脏质量与体质量比值、心脏质量与体质量比值;分别对心脏左心室和肾脏进行real-time PCR 检测 IL-6、IL-1β、CCL5、CCL12、p65、TNF-α及 NADPH 氧化酶亚基cyba,cybb的mRNA的表达水平。结果:1.TNF-α中枢给药增加成年SD及Dahl大鼠PVN区炎症介质的mRNA水平,并且Dahl大鼠的炎症反应更为显着TNF-α中枢给药,SD 大鼠和 Dahl-S 大鼠的 CCL5、CCL12、IL-1β、IL-6、iNOS和NF-κB1的表达均显着升高（P<0.05）。与SD大鼠相比,Dahl-S大鼠中CCL12的增加更加显着（Dahl:115倍SD:24倍P<0.05）。与SD大鼠相比,Dahl-S中IL-1β的增加也更高,但没有达到统计学意义（P=0.087）,其他的基因未见显着差异。2.TNF-α处理引发SD及Dahl大鼠原代神经细胞炎症介质基因水平的剂量依赖性和时间依赖性增加,并且在Dahl大鼠原代神经细胞炎症反应更为显着。不同浓度（0.2ng/mL,2ng/mL,20ng/mL）处理 6h 及不同时间（3h,6h,24h）20ng/mL TNF-α处理明显增加 SD 大鼠 IL-1β、IL-6、CCL5、CCL12、iNOS 和 NF-κB1的mRNA水平;TNF-α（20ng/ml）处理6h对比SD及Dahl大鼠的炎症介质基因显示两者的IL-1β、CCL5、iNOS、NF-κB1的基线水平差异即存在统计学意义,6h处理后IL-1β、CCL5、iNOS仍存在统计学差异;TNF-α（20ng/ml）孵育6小时,固定细胞并进行免疫荧光染色,结果表明TNF-α处理显着增加IL-1β、CCL5和iNOS的免疫反应性并促进p65的活化。3.TanⅡA处理大鼠原代神经细胞可以降低由TNF-α处理引发的炎症反应及氧化应激水平。TanⅡA可以降低大鼠原代神经元细胞由TNF-α诱导的炎症反应和氧化应激水平。不同浓度的TanⅡA（10uM、20uM、50uM）预处理可以抑制TNF-α处理引起的p65活化,下调IL-1β、IL-6、CCL5、CCL12,iNOS等炎症介质及NADPH氧化酶亚基（Cyba、Cybb）的mRNA表达。免疫荧光结果表明TanⅡA可以一定程度减弱由TNF-α处理引发的IL-1β、CCL5和iNOS的免疫反应性的增强并抑制p65的活化。4.丹参酮ⅡA磺酸钠注射液可以降低DOCA-salt高血压大鼠的平均动脉压,并减轻心脏及肾脏的炎症反应和氧化应激水平。模型组大鼠血压明显升高,各剂量TanⅡA磺酸钠注射液组均可一定程度上降低平均动脉压。治疗组大鼠与模型组相比心脏质量与体质量比值及肾脏质量与体质量比值降低,表明丹参酮ⅡA磺酸钠注射液可以减轻DOCA-salt大鼠左心室及肾脏的扩张,并且降低心脏左心室及肾脏IL-1β、IL-6、TNF-α、CCL5、CCL12炎症介质的mRNA水平,降低P65的mRNA水平,及NADPH氧化酶亚基Cyba、Cybb的mRNA水平,说明丹参酮ⅡA磺酸钠可以抑制DOCA-salt高血压大鼠心脏左心室及肾脏的炎症反应及氧化应激水平。肾脏HE染色及离体照片显示治疗组较模型组的肾脏病理形态学改变减轻。结论:1.中枢给予TNF-α可以同时激发SD大鼠和Dah1大鼠PVN内炎症反应,且在Dahl盐敏感性高血压大鼠PVN炎症反应更加显着。2.TNF-α激发SD大鼠和Dah1大鼠原代神经细胞的炎症反应和氧化应激,并且在Dahl大鼠原代神经细胞内炎症反应更加显着,TanⅡA预处理可以抑制由TNF-α诱发的p65的活化,抑制IL-1β、IL-6、CCL5、CCL12、iNOS等炎症介质和Cyba、Cybb的表达,从而抑制炎症反应,并可以抑制氧化应激水平。3.TanⅡA磺酸钠注射液可以降低DOCA-salt高血压大鼠的平均动脉压,抑制DOCA-salt高血压大鼠左心室及肾脏p65的表达,抑制IL-1β、IL-6、TNF-α、CCL5、CCL12等炎症介质及Cyba、Cybb的表达,对DOCA-salt高血压大鼠起到保护作用。
莫业南[6]（2021）在《补脾益肾方通过调整肠道微生态影响AhR通路治疗慢性肾脏病的机制研究》文中研究指明目的:广东省中医院肾内科刘旭生教授的经验方补脾益肾方,获得国家专利保护,并在大型多中心随机对照临床研究已证实延缓慢性肾脏病进展疗效确切。但是,补脾益肾方改善肾功能的分子机制目前尚不清楚,限制了我们进一步开发补脾益肾方在临床上的应用。本研究基于“肠肾轴”理论,观察补脾益肾方对5/6肾切除模型大鼠肾功能、肠道菌群、肠道屏障功能、血清代谢物的影响,联合肠道菌群和代谢组学及细胞实验,探讨补脾益肾方延缓慢性肾脏病进展的分子机制,为中药从脾肾论治慢性肾脏病提供新思路。方法:1.动物实验:本研究部分采用5/6肾切除大鼠作为慢性肾脏病模型,大鼠随机分为假手术组（Sham组）、5/6肾切除模型组（5/6Nx组）、低剂量补脾益肾方组（L-BYF组）和高剂量补脾益肾方组（H-BYF组）,Sham组和5/6Nx组予无菌水灌胃,L-BYF和H-BYF分别予低剂量和高剂量的补脾益肾方灌胃,每日1次,灌胃4周,收集血液、尿液、粪便、肾脏及结肠标本,行肾功能、尿蛋白定量、肾脏和肠道病理切片HE染色、肾脏病理切片Masson及PAS染色、western-blot法检测结肠组织紧密连接蛋白Z0-1、Occludin、Claudin-1、免疫因子 IL-22 及 AhR 信号通路分子 AhR、CyP1A1、CyP1B1在肾脏组织中的表达水平、ELISA检测血清炎症因子IL-1 α及IL-6水平、二代16S rDNA测序检测粪便肠道菌群、非靶向代谢组学筛选及分析差异代谢物。2.细胞实验:本研究部分中,以硫酸吲哚酚（Indoxyl sulfate,IS）刺激诱导人近端肾小管上皮细胞（HK-2）损伤为模型,予黄芪甲苷（Astragaloside Ⅳ,ASIV）干预,采用western-blot、流式细胞术、免疫荧光、siRNA瞬时转染等方法检测AhR在IS诱导HK-2细胞氧化损伤以及凋亡中的作用以及抑制AhR信号通路在补脾益肾方发挥肾保护的作用。结果:1.与Sham组大鼠相比,5/6Nx组大鼠的24h尿蛋白定量、血肌酐、尿素氮、IL-6和IL-1 α有明显升高,差异具有显着性意义（P=0.000）。与5/6Nx组比较,H-BYF组大鼠的24h尿蛋白定量、血肌酐、尿素氮以及IL-6均显着下降（P<0.05）,IL-α可见下降趋势,但不具有统计学差异（P>0.05）。HE染色显示,在5/6Nx组大鼠中,肾组织出现明显肾小球结构紊乱,肾小管管腔增大、肾小管萎缩、肾间质纤维化,伴有单核淋巴细胞浸润;在L-BYF组和H-BYF组中,上述病理学损伤减轻,其中以H-BYF组中病理学改善最明显。Masson染色显示,Sham组未见纤维沉积;5/6Nx组有大量的胶原纤维沉积于肾间质中。与5/6Nx组比较,L-BYF组中大鼠肾脏组织中胶原纤维沉积减少,H-BYF组的肾脏胶原纤维沉积减少更为明显。PAS染色显示,Sham组未见明显病理改变;5/6Nx大鼠出现系膜细胞及机制增生、肾小管腔增大、间质纤维化、肾小管萎缩,伴有大量单核淋巴细胞浸润;与5/6Nx组相比,L-BYF组大鼠肾脏病理损伤减轻,H-BYF组大鼠肾损伤缓解更为明显。Western-blot定量结果显示:与Sham组比较,5/6Nx组大鼠的肾脏组织AhR、CyP1A1与CyP1B1的表达水平均显着升高（P<0.05）;与5/6Nx组比较,H-BYF组的肾脏组织AhR、CyP1A1与CyP1B1的表达水平均显着下降（P<0.05）。2.结肠组织病理显示:Sham组大鼠的结肠黏膜组织紧密、炎症细胞较少;5/6Nx组大鼠的结肠组织中,粘膜层出现明显水肿,固有层组织疏松、炎症细胞浸润严重。与5/6Nx模型组相比,L-BYF组和H-BYF组大鼠粘膜层和固有层的水肿情况明显改善,粘膜层中炎性细胞的浸润减少,其中以H-BYF组最为明显。Western-blot定量结果显示:与Sham组比较,5/6Nx组大鼠的结肠组织ZO-1、Occludin、Claudin-1及IL-22表达均显着下降（P<0.05）;与5/6Nx组比较,H-BYF组的ZO-1、Claudin-1及IL-22表达均显着升高（P<0.05）,Occludin表达则呈升高趋势,不具有统计学意义。3.肠道菌群分析结果显示,α-多样性方面,基于OTU水平,5/6Nx组的Shannon指数较H-BYF组高,Simpson指数较H-BYF组低,并具有统计学差异（P=0.0011和P=0.0006）。β-多样性分析方面,基于非加权的距离的PCoA,5/6Nx模型组大鼠与H-BYF组大鼠明显分开,聚成一簇,而L-BYF大鼠则介乎二者之间。物种组成分析方面,在门的水平上,各组大鼠肠道菌群均以拟杆菌门（Bacteroidetes）和厚壁菌门（Firmicutes）为主。在科与属的水平上,使用Lefse分析以筛选差异物种,结果显示:与 5/6Nx 组比较,H-BYF 组大鼠粪便中Prevotella、Phascolarctobacterium和Megamona 的相对丰度升高,Clostridiaceae、Haloplasmataceae、Micrococcaceae、Pseudomonadaceae的相对丰度降低。4.代谢组学结果显示:基于非靶向代谢组学,PLS-DA分析显示H-BYF组与5/6Nx组各自成簇。在阳离子模式下,5/6Nx组和H-BYF组之间的差异代谢物总数为405种（293种上调及112种下调）;在阴离子模式下,5/6Nx组和H-BYF组之间的差异代谢物总数为195种（123种上调及72种下调）。基于KEGG数据库的差异代谢物的代谢途径富集分析确定了 35个代谢途径,其中3个（酪氨酸与色氨酸生物合成、色氨酸代谢、色氨酸介导的炎症因子调节）与色氨酸有关。与5/6Nx组比较,色氨酸代谢的三个途径代谢物IS、犬尿喹啉酸与褪黑素在H-BYF组发生显着变化,IS和KA显着下降,褪黑素显着升高,均具有统计学意义（P<0.05）。Western-blot定量结果显示,与Sham组大鼠比较,5/6Nx组大鼠的肾脏AhR、CyP1A1、CyP1B1表达明显升高,具有显着性差异（P<0.05）;与5/6Nx组大鼠比较,H-BYF组大鼠肾脏AhR、CyP1A1、CyP1B1的表达水平均有升高,而H-BYF组与5/6Nx组之间具有显着性差异（P<0.05）。5.细胞实验:本研究以IS 100ug/mL诱导HK-2细胞损伤为模型,以补脾益肾方的主要成分黄芪甲苷50ug/mL为干预药物,与Normal组比较,IS组中IS刺激细胞后HK-2细胞形态异常,ROS含量升高,线粒体膜电位下降,AhR信号通路分子包括AhR、CyP1A1和CyP1B1表达增加（P<0.05）。与IS组比较,AhR-siRNA+IS组AhR表达减少,线粒体膜电位升高,R0S含量下降,细胞凋亡减少。与AhR-siRNA+IS组相比,AhR-siRNA+IS+ASIV组的细胞AhR表达被抑制,而细胞凋亡无进一步减少。分子对接模拟结果显示黄芪甲苷和AhR分子表面结合得较为紧密,黄芪甲苷结合到AhR的活性位点,与活性位点附近的TYP 239、LEU 253、ASN 244、GLU 243和HIS 153五个氨基酸形成氢键而产生相互作用。结论:1.本研究中,证实补脾益肾方可降低5/6肾切除大鼠的血肌酐和尿素氮,降低蛋白尿水平,缓解肾脏病理损伤。2.基于肠道菌群,研究中发现补脾益肾方调节肠道菌群,减少产毒素菌群等致病菌的相对丰度,增加益生菌的相对丰度,促进短链脂肪酸的产生,促进紧密连接蛋白和IL-22的表达,改善肠道屏障功能。2.基于LC-MS/MS的非靶向代谢组学方法,KEGG富集通路分析提示色氨酸代谢为补脾益肾方改善肾功能的代谢通路之一,补脾益肾方调节色氨酸的代谢,抑制犬尿氨酸途径产生犬尿喹啉酸和吲哚途径产生硫酸吲哚酚,促进5-羟色胺途径产生褪黑素。同时,补脾益肾方抑制肾脏AhR、CyP1A1和CyP1B1的表达。3.体外实验中,AhR的表达是硫酸吲哚酚致肾小管上皮细胞发生氧化应激的重要原因,黄芪甲苷作为补脾益肾方的主要成分,其发挥抑制氧化应激的作用是以AhR为作用靶点。因而补脾益肾方可能通过抑制AhR信号通路以发挥保护肾功能的作用。4.补脾益肾方可能是通过调节肠道菌群,保护肠道屏障,调节色氨酸代谢,尿毒症毒素减少,抑制AhR信号通路,发挥肾保护作用,为中药从脾肾论治慢性肾脏病提供新思路。
钟鹏程[7]（2021）在《艾可清颗粒减轻环磷酰胺心脏毒性的作用及机制研究》文中研究表明目的:作为一线肿瘤化疗药物及强力免疫抑制剂,环磷酰胺（Cyclophosphamide,CTX）广泛应用于多种恶性肿瘤及自身免疫性疾病的治疗。然而,CTX在发挥治疗作用的同时也可引起多种严重不良反应,如骨髓抑制、心脏毒性、肝功能损害、出血性膀胱炎等。此外,在中医药基础科研领域,CTX常被用作复制中医阳虚、血虚证候动物模型的药物。目前针对CTX毒副反应尚无特效药物,预防或缓解CTX化疗导致的毒副反应对于提高肿瘤治疗效果具有重要的临床意义。艾可清颗粒（AKQ）作为广州中医药大学热带医学研究所创制的专利复方,在艾滋病治疗方面已运用多年,具有增强艾滋病患者免疫力、提高生活质量的作用。本课题组认为AKQ扶阳益气、补肾健脾的功效用于CTX引起的气阳两虚、脾肾双亏副作用的“纠偏”,在理论上具有针对性。基于此,本研究以AKQ为研究对象,通过体内、体外实验结合网络药理学分析、代谢组学以及肠道菌群分析,期望达到以下研究目的:1.明确AKQ对CTX引起的正常与荷瘤小鼠的毒性反应是否具有减毒作用及减毒效应的主要靶器官。2.评估AKQ对CTX毒性代谢产物丙烯醛（ACR）诱导的H9c2心肌细胞损伤是否具有保护作用。3.探索AKQ在上述动物和细胞水平减轻CTX毒性的机制,为中医异病同治理论提供实验依据。方法:1.体内（动物）实验1:观察AKQ对CTX所致昆明小鼠毒性反应的影响。（1）昆明小鼠CTX中毒模型的建立:8周龄,体重25±3g的健康昆明小鼠CTX连续4天腹腔注射给药:第1、2天100 mg/kg/d,第3、4天50 mg/kg/d。（2）分组处理及一般状况观察:健康昆明小鼠24只,随机分为3组,每组8只:正常对照组（第1-4天生理盐水0.3 mL/次/d腹腔注射+第1-7天纯水0.3 mL/次/d灌胃）,模型组（第1-4天CTX注射造模+第1-7天纯水灌胃0.3 mL/次/d）,艾可清组（第1-4天CTX注射造模+第1-7天AKQ灌胃1.3 g/kg/d）,实验周期8天,每日观察并记录各组小鼠一般状况及死亡数。艾可清给予小鼠1.3 g/kg/d相当于人临床剂量的9倍。（3）血液及生化指标的测定:实验结束后处死各组小鼠,取全血及血清,血细胞分析仪及生化分析仪检测WBC、RBC、PLT、HGB、LYM、MON、AST、ALT、CRE、CK。（4）主要脏器组织病理学观察:实验结束后处死各组小鼠,取各组小鼠心、肝、脾、肺、肾组织进行HE染色并观察。2.体内（动物）实验2:观察AKQ对CTX中毒小鼠心脏毒性的影响（1）CTX中毒小鼠心脏毒性模型的建立及分组:8周龄,体重25±3 g的健康昆明小鼠50只,随机分为5组,每组10只,CTX连续4天（第8-11天）腹腔注射造模（方案同体内实验1）。动物分组为正常组（第8-11天N.S 0.3 mL/次/d腹腔注射+第1-13天纯水0.3 mL/次/d灌胃）,模型组（第8-11天CTX注射造模+第1-13天纯水灌胃0.3 mL/次/d）,艾可清低剂量组（第8-11天CTX腹腔注射+第1-13天AKQ灌胃0.65 g/kg/d）,艾可清中剂量组（第8-11天CTX腹腔注射+第1-13天AKQ灌胃1.3g/kg/d）,艾可清高剂量组（第8-11天CTX腹腔注射+第1-13天AKQ灌胃2.6 g/kg/d）,实验周期14天,14天后取血清及心脏,进行相关检测。艾可清给予小鼠低、中、高剂量相当于人临床剂量的4.5、9、18倍。（2）心脏指数的测定:各组小鼠取心脏称重,计算心脏指数。（3）心肌酶及氧化指标的测定:各组小鼠取血清检测CK、CK-MB、GSH、SOD、MDA。（4）心脏的组织病理学观察:取各组小鼠心脏组织进行HE染色并观察。（5）心脏组织凋亡检测:Western blot检测各组小鼠心脏组织中Bax及Bcl-2的表达。3.体外（细胞）实验:观察AKQ对ACR诱导的H9c2毒性损伤的影响及机制探索（1）AKQ对H9c2活力影响的观察:AKQ颗粒甲醇提取物,加DMSO溶解,加细胞培养基稀释,配成不同浓度梯度,加入H9c2培养液,共孵育24、48及72小时,CCK8法测定细胞活力。（2）ACR对H9c2 IC50测定:将不同浓度梯度ACR溶液加入H9c2培养液培养,24小时后CCK8法测定细胞活力。（3）AKQ对ACR诱导的H9c2毒性损伤影响的观察:H9c2细胞分5组:对照组（正常培养）,ACR组（ACR 20μmol/L干预培养）,ACR+AKQ低剂量组（ACR+AKQ 20μg/mL）,ACR+AKQ 中剂量组（ACR+AKQ 40 μg/mL）,ACR+AKQ 高剂量组（ACR+AKQ 80 μg/mL）。培养24小时后观察细胞形态,进行CCK8检测、Hochest染色、流式Annexin V-FITC/PI双染及WB检测bax、Caspase3、Caspase9及bcl-2表达。（4）AKQ缓解CTX心脏毒性的网络药理学分析:进行CTX心脏毒性相关疾病靶点及AKQ药物成分治病靶点筛选并映射,构建药物-成分-靶点网络及PPI网络,对靶点进行GO分析和KEGG通路富集分析。（5）网络药理学分析的实验验证:用RT-qPCR及WB技术验证网络药理学分析富集的通路靶点表达水平。（6）AKQ对ACR诱导的H9c2毒性损伤机制的探索:H9c2细胞分4组:对照组（正常培养）,ACR组（ACR20 μmol/L干预培养）,ACR+AKQ组（ACR+AKQ 80μg/mL）,AKQ+LY294002 组（ACR+AKQ 80 μg/mL+LY294002 10 μmol/L）。培养 24小时后RT-qPCR及WB检测相关通路蛋白及凋亡蛋白的表达。4.体内（动物）实验3:AKQ对CTX化疗的荷瘤小鼠心脏毒性的影响及机制研究（1）荷瘤小鼠模型的建立:将密度为1× 107个/mL的S180肉瘤细胞悬液以0.2 mL/只的体积皮下接种于昆明小鼠后颈部。（2）动物分组及处理:将肿瘤体积范围为40-100 mm3的S180荷瘤小鼠24只随机分为3组,每组8只:肿瘤模型对照组（第1-13天纯水0.3 mL/次/d灌胃+第8-11天连续N.S 0.3 mL/次/d腹腔注射）,CTX单独化疗组（第8-11天连续CTX腹腔注射,CTX注射方案同前+第1-13天纯水灌胃0.3mL/次/d）,CTX化疗联合AKQ治疗组（第8-11天CTX连续腹腔注射+第1-13天艾可清2.6g/kg/d灌胃）。实验周期14天,第12天收集新鲜粪便,第14天取血清及心脏,进行后续检测。（3）心肌酶及氧化指标的测定:各组小鼠取血清检测CK、CK-MB、SOD、MDA。（4）心脏组织病理学观察:取各组小鼠心脏组织进行HE染色并观察。（5）心脏凋亡相关蛋白检测:WB检测各组小鼠心脏组织bax及bcl-2。（6）心脏通路蛋白检测:WB及免疫组化检测各组小鼠心脏组织相关通路靶点蛋白表达。（7）荷瘤小鼠瘤体重量测定:实验结束后取各组小鼠瘤体称重。（8）荷瘤小鼠血清代谢组学研究:各组小鼠取血清做GC/MS非靶向代谢组学分析。（9）荷瘤小鼠肠道菌群分析:接取小鼠新鲜未污染粪便做肠道菌群16SrRNA测序分析。结果:1.昆明小鼠腹腔注射环磷酰胺（100 mg/kg/d×2d,50 mg/kg/d×2d）后可见活动减少,畏寒蜷缩,毛发蓬松、竖立,进食减少,体重减轻等明显的中毒症状,加服AKQ后,上述中毒症状减轻,且死亡率较模型组明显下降（P=0.0028）。昆明小鼠予环磷酰胺注射后白细胞、血小板及淋巴细胞可出现显着减少（P<0.001,P<0.001,P<0.01）,而红细胞、血红蛋白及单核细胞无明显变化;AST、ALT及CRE无明显改变,CK出现显着上升（P<0.05）,加服AKQ 口服后,CK上升情况较模型组明显缓解（P<0.05）,其他血液生化指标比较无显着性差异。HE染色显示各组小鼠肝、脾、肺、肾组织病理改变无明显差异;模型组可见明显心肌损伤改变,加服AKQ后心肌病变程度减轻。2.昆明小鼠腹腔注射环磷酰胺（100 mg/kg/d ×2d,50 mg/kg/d×2d）后心脏指数较正常组明显增大（P<0.05）,AKQ低、中、高剂量组心脏指数较模型组均有显着性减小（P<0.05,P<0.01,P<0.01）。模型组CK-MB、MDA较正常组显着升高（P<0.001,P<0.001）,GSH 及 SOD 明显降低（P<0.05,P<0.001）,加服 AKQ 后,AKQ 各剂量组上述指标得到不同程度改善,其中以高剂量组改善最明显,高剂量组CK、CK-MB、MDA较模型组均显着下降（P<0.05,P<0.001,P<0.001）,而GSH及SOD明显上升（P<0.05,P<0.001）。模型组心脏HE染色可见明显心肌损伤改变,艾可清低、中、高剂量组心肌病变程度较模型组依次减轻。与正常组比较,模型组小鼠心脏组织中Bax表达增强,Bcl-2的表达减弱,AKQ各剂量组Bax表达与模型组相比呈剂量依赖性减弱,Bcl-2的表达呈剂量依赖性增强。3.AKQ醇提物在0-80 μg/mL浓度范围呈浓度依赖性促进H9c2细胞的增殖,ACR对H9c2细胞24小时IC50为20.37 μM。ACR作用于H9c2细胞24小时,引起的细胞损伤涉及:形态改变、细胞活力下降、Hochest染色阳性数目增多、流式Annexin V-FITC/PI双阳性细胞比例增加,凋亡蛋白Bax、Caspase3、Caspase9表达增强及抗凋亡蛋白Bcl-2表达减弱。H9c2细胞予AKQ处理后,与模型组相比,可剂量依赖性地改善H9c2细胞损伤形态、增强细胞活力、减少Hochest染色阳性及Annexin V-FITC/PI双阳性细胞比例,抑制Bax、Caspase3、Caspase9表达而增强Bcl-2表达。网络药理学分析结果显示:通过靶点筛选及映射得到192个靶点为AKQ主要成分治疗CTX心脏毒性损伤的作用靶点;通过构建AKQ药物-活性化合物-治病靶点网络图,得到15个关键化合物（包括等槲皮素、木犀草素、山奈酚、丹参酮Ⅱa、柚皮素等）;通过构建PPI网络得到30个核心靶点;GO分析显示靶点涉及的生物学功能主要包括调控细胞增殖/凋亡过程及氧化/炎症反应等。KEGG通路富集分析显示排名前10的信号通路涉及PI3K-AKT、TNF及MAPK通路。RT-qPCR显示上述3条通路关键靶点中的PI3K及AKT在AKQ组中表达较ACR组显着上调（P<0.001）,WB实验也观察到PI3K及AKT总蛋白及磷酸化蛋白水平均显着高于ACR组。AKQ+ACR组加入抑制剂LY294002后,上调的PI3K及AKT mRNA及蛋白水平被逆转;AKQ+ACR组较ACR组中上调的bax、Caspase3、Caspase9及下调的bcl-2同样被逆转。4.以密度为1×107个/mL的S180肉瘤细胞悬液,按0.2mL/只皮下接种于昆明小鼠后颈部,约6天后可成模。CTX单独化疗组CK-MB、MDA较肿瘤模型对照组显着升高（P<0.001,P<0.001）,SOD明显降低（P<0.001）,CTX化疗联合AKQ治疗组CK、CK-MB、MDA较CTX单独化疗组显着下降（P<0.01,P<0.001,P<0.001）,而SOD明显上升（P<0.001）。CTX单独化疗组心脏HE染色可见显着的心肌损伤,CTX化疗联合AKQ治疗组心肌病变程度较CTX单独化疗组明显减轻。与肿瘤模型对照组相比,CTX单独化疗组小鼠心脏组织Bax表达上调,Bcl-2、PI3K及AKT表达下调,加服AKQ后,Bax表达减弱,Bcl-2、PI3K及AKT表达增强。实验结束后,CTX化疗联合AKQ治疗组瘤体重量较单独化疗组显着减轻（P<0.05）。血清代谢组学分析在三组间共鉴定出44个差异代谢产物,AKQ干预能使CTX化疗改变的L-谷氨酸、L-天冬氨酸、柠檬酸、甘氨酸、鸟氨酸等代谢物轮廓向肿瘤模型对照组靠近;CTX联合AKQ治疗后显着增强的代谢通路包括:柠檬酸循环、精氨酸生物合成、丙氨酸天冬氨酸和谷氨酸代谢、乙醛酸和二羧酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、氨酰tRNA生物合成、谷胱甘肽代谢、组氨酸代谢、D-谷氨酰胺与D-谷氨酸代谢。肠道菌群分析显示CTX单独化疗组鞘氨醇单胞菌（Sphingomonadales）、溶杆菌（Lysobacter）相对丰度下调,普雷沃菌9（Prevotella9）上调,CTX 化疗联合 AKQ 治疗后,Sphingomonadales及Lysobacter 丰度上调,Prevotella9丰度下调。CTX单独化疗组中显着下调的p53信号通路、倍半萜生物合成、胆汁分泌及咖啡因代谢等通路,在AKQ干预后重新被显着上调。结论:1.AKQ能改善CTX引起的昆明小鼠中毒症状,显着降低死亡率;AKQ能降低CTX引起的心肌酶异常升高,减轻氧化应激失衡、减少心肌细胞凋亡,改善CTX诱导的心脏病理形态改变。2.AKQ能促进H9c2心肌细胞增殖,激活PI3K/AKT通路而减少ACR诱导的H9c2凋亡。3.荷瘤小鼠CTX化疗可引起心肌酶异常升高、氧化应激失衡、心肌细胞凋亡增加及PI3K/AKT表达下调,联用AKQ能改善上述病变,且能增强CTX抑瘤效果。4.AKQ可调节CTX化疗的荷瘤小鼠L-谷氨酸、L-天冬氨酸、柠檬酸、甘氨酸、鸟氨酸等44种差异代谢物表达,增强TCA循环,精氨酸生物合成,丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢等16条代谢通路功能;上调有益菌（目水平Sphingomonadales、属水平Lysobacter）,下调有害菌（属水平Prevotella 9）丰度,增强肠道菌p53信号通路、胆汁分泌等功能从而发挥减轻CTX心脏毒性的作用。
高强[8]（2021）在《星蒌承气汤治疗急性缺血性卒中痰热腑实证机制研究》文中研究说明急性缺血性脑卒中（Acute Ischemic Stroke,AIS）,即急性脑梗死,中医称缺血性中风,是脑组织因局部的血流循环障碍缺血、缺氧而发生的软化、坏死。目前溶栓是治疗缺血性卒中急性期最快、最有效的方法,但由于适应证严格、时间窗短、出血和再灌注损伤风险高,其临床效果受到限制。基础与临床研究证实,中医药治疗中风独具优势。中医认为痰热腑实证是缺血性中风急性期最为常见的证型,而化痰通腑法代表方星蒌承气汤是治疗中风急性期痰热腑实证的代表性方剂。星蒌承气汤“脑病治肠”、“上病治下”的中医理论与现代医学提出的“菌-肠-脑轴”具有异曲同工之妙。诸多临床试验及系统性综述已证实星蒌承气汤治疗缺血性卒中的确切临床疗效与神经保护作用,但是其效应机制研究尚且不足。因此本文基于网络药理学及肠道微生态理论,深入探讨缺血性中风的肠道微生态机制及化痰通腑法代表方星蒌承气汤治疗中风痰热腑实证的效应机理。目的:基于中医“上病治下”理论与现代医学“菌-肠-脑轴”理论,（1）通过中药网络药理学与分子对接技术全面探讨星蒌承气汤治疗缺血性卒中的多组分、多靶点、多通路机制;（2）明确具有“化痰通腑”作用的星蒌承气汤对急性缺血性中风痰热腑实证小鼠模型的神经保护作用,并验证网络药理学研究的关键靶点与通路;（3）探讨星蒌承气汤对急性缺血性中风痰热腑实证小鼠模型肠道菌群的影响,探讨其治疗中风痰热腑实证“通腑”与“通便”差异的肠道微生态机制;（4）观察星蒌承气汤对伪无菌小鼠急性缺血性中风模型菌-肠-脑轴的影响,验证星蒌承气汤通过直接影响肠道菌群而改善脑卒中预后的假说。方法:（1）借助TCMSP、BATMAN-TCM、ETCM及TCMID等数据库收集星蒌承气汤活性成分及作用靶点,并应用STITCH等对未找到靶点的化合物进行靶点预测。通过6个数据库挖掘缺血性卒中的靶点。通过GO和KEGG富集对交集靶点进行高级功能分析,并用cytoscape3.6.0构建PPI、化合物-靶点及药物-靶点-通路网络。最后进行分子对接验证。（2）雄性C57BL/6小鼠随机分为:假手术（Sham）组、模型（MCAO）组、星蒌承气汤（XCD）组、尼莫地平（Nim）组及舒泰清（PGE）组,通过制备高脂低纤维饮食复合线栓法的小鼠急性缺血性中风痰热腑实证模型,采用神经功能评分、除胶实验、TTC和TUNNEL染色,综合评价星蒌承气汤的神经保护作用,并运用ELISA、W estern blot等技术验证网药关键靶点与通路;（3）雄性C57BL/6小鼠随机分为:Sham组、MCAO组、XCD组、Nim组与PG E组,通过制备高脂低纤维饮食复合线栓法的小鼠急性缺血性中风痰热腑实证模型,采用高通量16srDNA基因测序、代谢组学技术、免疫组化、免疫荧光、ELISA及流式多因子技术分别对肠道菌群、短链脂肪酸（SCFAs）及其受体GPR43、神经-内分泌-免疫途径相关指标（NE及TH、血清MTL、脑IBA-1及GFAP、血清炎症因子）进行分析;（4）雄性C57BL/6小鼠在术前14天服用多种抗生素剔除肠道菌群后,随机分为:伪无菌假手术（ABX-Sham）组、伪无菌模型（ABX-MCAO）组以及伪无菌中药（ABX-XCD）组,通过神经功能评分、除胶实验、TTC染色以及高通量16srDNA基因测序、代谢组学技术、免疫组化、免疫荧光、ELISA及流式多因子技术,观察中药对伪无菌小鼠菌-肠-脑轴相关指标的影响。结果:（1）网络药理学及分子对接结果表明,星蒌承气汤包含51个活性成分及44个治疗缺血性卒中的交集靶点。高级功能分析显示星蒌承气汤抗缺血性卒中的机制与脂多糖介导的信号通路、凋亡过程的调控、炎症反应、内皮屏障的建立以及对脂肪酸的反应有关。星蒌承气汤发挥作用的有10条关键KEGG信号通路。PPI网络分析得到AKT 1,PTGS2,TNF,TP53,CASP3,IL1B等关键靶点。分子对接验证了星蒌承气汤活性成分与关键靶点具有良好的对接能力。（2）星蒌承气汤神经保护作用及对网络药理学关键靶点及通路的影响:①神经功能评分:与MCAO组相比,XCD组及Nim组术后48h及72h Longa评分降低（P<0.05）,PGE组未见变化（P>0.05）。②除胶实验:XCD组和Nim组术后48和72h的接触和去除胶带时间缩短（P<0.05）,PGE组未见变化（P>0.05）。③TTC染色:XCD组梗死面积下降（P<0.05）,Nim组及PGE组未见变化。④TUNNEL:MCAO组梗死区细胞凋亡明显增加,XCD组和Nim组TUNEL阳性染色减少（P<0.05）。⑤网络药理学验证:XCD组及Nim组TNF-α含量具有下降趋势（P>0.05）;XCD组p-AKT、PI3K及NF-κB蛋白表达具有升高趋势。AKT蛋白表达组间未见明显变化（P>0.05）。（3）星蒌承气汤对中风急性期痰热腑实证小鼠菌-肠-脑轴影响:①肠道菌群:与MCAO组相比,XCD组α多样性有升高趋势,Nim组及PGE组无显着变化。β多样性显示MCAO组与Sham组PCoA曲线有显着差异（P<0.05）。MCAO组拟杆与变形杆菌门显着增加,厚壁菌门显着减少;XCD组拟杆菌比例显着降低,疣微菌门显着增加,Nim组变形菌门显着增加,厚壁菌门进一步降低,PGE组菌群组成与MCAO相似,变形杆菌略降低。此外,XCD组Akkermansia比率增加,Nim组Klebsiella增加最为显着,而 PGE 组 Parabacteroides 和Escherichia/Shigella增加较为显着。②SCFAs 及GPR43:MCAO组的SCFAs含量显着降低（P<0.05）,XCD组丁酸含量增加（P<0.05）。XCD组及Nim组GPR43表达显着降低（P<0.05）。③自主神经途径:XCD组NE有下降趋势,PGE组NE有上升趋势（P>0.05）。MCAO组及PGE组TH蛋白表达上升（P<0.05）,XCD组及Nim组TH表达未见显着变化趋势（P>0.05）。④神经内分泌途径:MCAO组MTL显着升高（P<0.05）,PGE组有升高趋势（P>0.05）,XCD组及Nim组MTL显着下降（P<0.05）。⑤免疫途径:MCAO组星形胶质细胞增生、肥大,显着活化,小胶质细胞迅速从“静息态”转变为“激活态”,从梗死周边区域向病变部位募集,而XCD组星形胶质细胞及小胶质细胞活化较MCAO组降低。MCAO 组 TNF-α、IL-17A、IL-22 升高（P<0.05）,而 XCD 和 Nim 组的 IL-10显着升高（P<0.05）,TNF-α、IL-17A 和 IL-22 降低。（4）星蒌承气汤对中风急性期痰热腑实证伪无菌小鼠菌-肠-脑轴影响:①神经保护作用:与ABX-MCAO组相比,ABX-XCD组在Longa评分、除胶实验及TTC染色等方面未见显着变化（P>0.05）。②肠道菌群:ABX-MCAO和ABX-XCD组的α多样性低于ABX-Sham,PCoA分析显示ABX-XCD组肠道菌群的β多样性和组成与AB X-MCAO组相似。相对丰度结果显示,在ABX组中,小鼠的微生物区系均以变形杆菌为特征,这与正常小鼠有显着差异。LEfSe分析显示MCAO组富集了更多的病原体或机会性病原体,包括Bacteroidetes,EscherichiaShigella与Helicobacter,而 XCD富集了Verrucomicrobia和Akkermansia等有益菌群。条件致病菌如Streptococcus,Lact ococcus,Morganella,Klebsiella,Proteobacteria,Enterobacteriaceae 等在 ABX-XCD组富集显着增多。PGE组富集菌群主要有oSelenomonadales、cNegativicutes、gRomboutsia及fPeptostreptococcaceae。③SCFAs 及 GPR43:ABX-XCD 的丙酸显着下降（P<0.05）。ABX-MCAO 组 GPR43 表达显着上调（P<0.05）,ABX-XCD 组 G PR43表达显着降低（P<0.05）。④自主神经途径:ABX-XCD组NE含量未见显着变化（P>0.05）,TH蛋白表达未见显着变化（P>0.05）。⑤神经内分泌途径:ABX-MCAO组MTL升高趋势（P>0.05）,ABX-XCD组MTL未见显着变化（P>0.05）。⑥免疫途径:ABX-XCD组IL-22显着升高（P<0.05）,IL-17A有降低趋势（P>0.05）,余未见显着变化趋势（P>0.05）。ABX-MCAO组星形胶质细胞表达显着升高,小胶质细胞显着活化,ABX-XCD组星形胶质细胞及小胶质细胞活化较ABX-MCAO组有降低趋势。结论:星蒌承气汤对急性缺血性中风痰热腑实证小鼠具有一定神经保护作用,其效应机制具有多成分、多靶点、多通路特点。其对伪无菌小鼠中风模型则未发现确切的脑保护效应,说明其脑保护的部分机制是通过改善肠道微生态实现的。其具体机制包括提高肠道短链脂肪酸,尤其是丁酸含量,增强肠道短链脂肪酸受体GPR43表达,增加血液IL10、减少TNF-α等炎性因子及MTL水平,最终减少梗死区域胶质细胞活化和神经细胞凋亡,从而达到中风脑保护的作用。本研究成果对中风病的临床治疗具有重要的指导意义——对于中风后便秘患者,仅仅“通便”治疗是不够的,需要结合患者的证候特点进行中医药“化痰通腑”治疗,才能取得好的临床效果。
李思怡[9]（2021）在《健脾化瘀解毒法调节NF-κB活性抑制胃“炎-癌”转化细胞迁移机制研究》文中认为背景:根据Correa假说,胃癌发生的病理演变过程中由“慢性萎缩性胃炎→肠上皮化生→异型增生”,最终进展为胃腺癌,以上三个阶段癌变风险较高,因而被统称为胃癌前病变（Gastric precancerous lesions,GPL）。基于此,阻断或延缓GPL进展至胃癌,成为预防胃癌的有效措施。“慢性胃炎—萎缩性胃炎—异型增生—胃癌”被称为“炎—癌”链,其中非可控性炎症在GPL“炎—癌”转变中发挥着重要作用,因此在GPL中应用抗炎治疗显得尤为重要。目前现代医学针对GPL的靶向药物仍是空白,虽然临床上常用药维酶素、幽门螺旋杆菌根除法、COX抑制剂等,在一定程度上能延缓慢性萎缩性胃炎进展,具有防治GPL恶变的作用,但存在服用时间较长、疗效不稳定等缺点,中医药对GPL的治疗具有独特优势,而其对GPL精准靶向防治却未得到总结。因此,本论文以胃“炎—癌”转变为切入点,通过探索健脾化瘀解毒法调节NF-κB信号通路介导的胃“炎—癌”转化细胞迁移,深入探讨GPL发病机制及健脾化瘀解毒方干预甚至逆转胃“炎—癌”转变的效应和分子机制。目的:1.采用对致癌因子最为敏感的C57近交系小鼠Balb/c,利用N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍（MNNG）溶液自由饮水进行造模。通过观察胃黏膜病理组织结构变化、GPL分子标志物的表达（Ki67、p53）及小鼠体重摄食情况,建立、筛选并鉴定胃“炎—癌”转化小鼠模型;2.以课题组前期大量研究的中药复方健脾化瘀解毒方为代表方,探讨其通过抑制NF-κB信号通路对胃“炎—癌”转化炎症的改善作用及深入机制;3.在前期研究健脾化瘀解毒方调控NF-κB活性改善胃“炎—癌”转化小鼠炎症的基础上,通过体内外观察胃“炎—癌”转化小鼠胃黏膜及细胞发生早期迁移情况,从NF-κB 信号通路下游深入探讨健脾化瘀解毒方干预甚至逆转胃“炎—癌”转变的信号转导调控机制。方法:1.从不同造模时间、浓度等因素探索胃“炎—癌”转化细胞模型造模条件,创新该细胞模型造模方法,同时针对胃“炎—癌”转化上皮间质转化（EMT）机制,构建胃癌细胞EMT模型,探索健脾化瘀解毒方对胃癌阶段EMT的干预作用,主要通过CCK8法检测细胞存活率、qPCR法检测EMT相关基因表达及划痕愈合实验观察细胞迁移,明确健脾化瘀解毒法代表方胃痞消对细胞迁移的干预效应;2.在前期健脾化瘀解毒法代表方胃痞消的基础上,结合GPL“虚毒瘀”病机,优化得出健脾化瘀解毒方,通过高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）分析健脾化瘀解毒方主要活性成分,将化合物标准品的保留持续时间和质谱、参考化合物的保留持续时间和离子色谱图与健脾化瘀解毒方匹配进行比较,以鉴定健脾化瘀解毒方中的主要成分,建立质量控制标准;3.通过化学诱变剂构建胃“炎-癌”转化小鼠模型,使用JPHYJD干预后,观察小鼠胃黏膜组织结构变化、检测癌症标志物、炎症因子产生情况、炎性细胞浸润情况、NF-κB信号通路活化情况;4.通过化学诱变剂MNNG在体内外分别构建胃“炎-癌”转化小鼠模型、细胞模型,使用健脾化瘀解毒方干预后,观察小鼠胃黏膜组织结构变化及细胞存活情况、细胞迁移相关蛋白表达情况。结果:1.MNNG诱导GES-1复制构建胃“炎-癌”转化细胞模型,模型组细胞出现形态学上的改变,形态多为梭形、纺锤形,并伴有伪足形成,同时细胞极性丧失、排列紊乱;在分子生物学层面,模型组细胞出现分子标志物表达变化,如Vimentin表达（上皮、间质表型标志物）、MMP2表达上调。2.通过HPLC-MS/MS分析对JPHYJD中的四种代表性组分进行鉴定并定量,结果显示,其主要成分包括三七总皂苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、黄芪甲苷和腺苷。此外,检测三七总皂苷、黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷和腺苷,通过在前体离子的全MS光谱中提取具有最大强度的片段离子来进行定量,发现三七总皂苷和腺苷均为最丰富的化合物。3.H&E染色及免疫组化染色（IHC）结果显示,MNNG可诱导Balb/c小鼠胃黏膜组织出现胃黏膜萎缩、肠上皮化生、炎性细胞浸润和细胞异型增生等胃“炎-癌转化”关键病理改变,胃“炎-癌转化”小鼠模型构建成功,健脾化瘀解毒方可缓解MNNG诱导的包括胃黏膜病理组织结构改变、促炎Th1细胞浸润和胃黏膜上皮组织癌症标志物Ki67、p53 表达。4.Western-blot结果显示健脾化瘀解毒方可逆转MNNG所诱导的NF-κB/IκB-α活化、COX-2、NADPH氧化酶家庭成员NOX2和NOX4蛋白表达的增加,qPCR检测结果显示健脾化瘀解毒方可显着改善MNNG诱导的炎症因子产生（IL-6、TNF-α）,此外,与阳性药维生素B12（VitB12）相比,高剂量的健脾化瘀解毒方具有更强的抗炎活性。5.另外,NF-κB活化诱导产生“炎症因子风暴”,进而诱导胃“炎-癌转化”过程中发生早期细胞迁移的蛋白活化,Western-blot结果MNNG可在体内外诱导早期细胞迁移相关蛋白的活化,如E-cad、N-cad等,而健脾化瘀解毒方预处理可明显抑制这些蛋白的活化。结论:1.GPLCs发生EMT,可能参与胃癌早期转移,健脾化瘀解毒中药WPX可在一定程度上下调EMT相关基因表达,而抑制细胞迁移,但疗效不显着,在此基础上,健脾化瘀解毒中药需进一步进行优化;2.三七总皂苷、黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、腺苷为健脾化瘀解毒方含量较高的四种有效活性成分,其中三七总皂苷和腺苷均为最丰富的化合物,提示以上化合物可视为健脾化瘀解毒方的化学标记物;3.MNNG可在体内外诱导出现胃“炎-癌转化”,本次动物造模选用对致癌因子敏感的Balb/c小鼠进行造模成功,可稳定模拟胃“炎-癌转化”组织病理变化过程;4.健脾化瘀解毒方可以通过在胃黏膜中介导NF-κB引发的“炎症因子风暴”干预胃“炎-癌转化”进程;同时可能通过抑制其级联反应进而抑制细胞迁移,从而发挥控制甚至逆转胃“炎-癌转化”效应的潜能,进而预防胃癌发生。总之,本研究成功构建胃“炎-癌转化”模型小鼠。健脾化瘀解毒方可能通过调控NF-κB信号通路,抑制其活化导致的“炎症因子风暴”级联反应,调控其下游蛋白。从而在干预胃“炎-癌转化”小鼠胃黏膜萎缩、肠上皮化生、异型增生的基础上,干预胃黏膜上皮细胞受MNNG诱导所发生的早期迁移,进而发挥治疗GPL、预防胃癌的作用。
贾文玉[10]（2021）在《基于巨噬细胞亚型分析探讨猪苓多糖对膀胱癌肿瘤微环境的作用》文中进行了进一步梳理目的:在临床样本中探讨膀胱癌肿瘤微环境中M2亚型巨噬细胞与肿瘤分期及恶性程度的关系,通过动物实验及细胞实验探究均一猪苓多糖（HPP）调节肿瘤微环境中肿瘤相关巨噬细胞从而发挥抗膀胱癌作用,在巨噬细胞亚型分析的基础上进一步明确猪苓均一多糖活化巨噬细胞抗肿瘤的免疫分子机制。方法:第一节:膀胱癌组织中M2亚型巨噬细胞浸润与膀胱癌恶性程度的关系研究收集29例确诊为尿路上皮癌患者的基本临床资料（年龄、性别、临床诊断、病理分级）和膀胱病理组织切片,进行免疫组化染色,检测膀胱组织中M2亚型巨噬细胞膜表面分子CD163、CD206及细胞增殖指标Ki-67的表达,分析M2亚型巨噬细胞的浸润程度与膀胱癌的分级、肿瘤细胞恶性程度的关系。第二节:均一猪苓多糖对BBN模型膀胱癌大鼠肿瘤微环境中巨噬细胞的影响收集课题组前期采用BBN膀胱癌模型大鼠进行HPP药效研究的膀胱癌组织石蜡块,取空白组、模型组、HPP处理组及卡介苗处理组,将石蜡组织切片后进行免疫组化染色,检测膀胱癌大鼠肿瘤微环境中巨噬细胞膜表面分子CD163、CD206、CD16、CD86及细胞增殖指标Ki-67的表达情况,探讨HPP干预的膀胱癌大鼠肿瘤微环境中巨噬细胞亚型的变化情况。第三节:均一猪苓多糖活化的巨噬细胞对膀胱癌细胞的直接作用研究将人急性单核细胞白血病细胞THP-1用不同浓度（0,10,20,50,100,200 ng/mL）的佛波酯诱导为巨噬细胞,通过细胞形态、细胞黏附能力的变化及细胞膜表面分子CD14、CD68的表达情况判断出最佳的诱导浓度作为后续实验中的巨噬细胞模型。提取的均一猪苓多糖（HPP）对THP-1来源的巨噬细胞进行干预,采用RT-PCR法研究HPP对巨噬细胞中IL-1β、IL-6、TNF-α以及INOS mRNA表达情况的影响,流式细胞术检测巨噬细胞膜表面分子CD86、CD16、CD40和CD23的表达,ELISA法检测细胞因子IL-1β、TNF-α的表达。HPP干预THP-1来源的巨噬细胞72 H后,更换新鲜培养基,继续培养24H,收集活化的巨噬细胞上清,按照巨噬细胞上清:新鲜培养基1:1的比例处理人膀胱癌细胞系T24及EJ,采用MTT法检测肿瘤细胞24 H和48 H的细胞活力变化,EDU增殖实验检测膀胱癌细胞48 H的增殖情况变化,克隆形成实验检测癌细胞增殖能力和成球能力,流式细胞术检测48 H的细胞周期和细胞凋亡的变化情况。Transwell实验检测细胞迁移能力的改变,Western Blot检测凋亡蛋白、上皮间质转化（EMT）相关蛋白以及通路分子JAK2-STAT5/NF-κB蛋白的表达。JAK2抑制剂AZD1480给予膀胱癌细胞系T24及EJ处理后,检测P-JAK2的表达情况及膀胱癌细胞细胞活力、细胞凋亡的变化情况。第四节:基于亚型分析对HPP活化的巨噬细胞及肿瘤相关巨噬细胞的探讨用THP-1来源的巨噬细胞作为研究对象,给予均一猪苓多糖10 μ g/mL、T24肿瘤细胞上清:新鲜培养基1:1进行处理,培养72 H后收集细胞检测细胞膜表面分子CD209、CD301、CD172 α、CD36、CD163、CD16、CD23 及 CD206 的表达情况。细胞因子的检测是在刺激剂活化巨噬细胞72 H后更换新鲜培养基继续培养24 H,收集细胞上清,采用液相悬浮芯片技术检测 TNF-α、IL-6、IL-10、CCL2、IL-1 β、CCL18、CCL24、CCL22、CXCL9、CCL17、IL-23p40的含量,采用ELISA法检测TGF-β的表达情况。整理数据,根据上述细胞因子及细胞膜分子的表达情况,分析HPP活化巨噬细胞的抗肿瘤作用及肿瘤相关巨噬细胞促进肿瘤进展的机制。结果:第一节:患者的基础资料（年龄、性别）与膀胱癌的浸润程度以及病理分级之间无明显相关性（P>0.05）;M2亚型巨噬细胞表面分子CD163、CD206及细胞增殖指标Ki-67在浸润性膀胱癌中的表达均高于非浸润性膀胱癌（P<0.05）,在高级别膀胱癌中的表达均高于低级别膀胱癌（P<0.05）。CD163、CD206在膀胱癌组织中的浸润程度均与Ki-67的表达呈正相关（rs>0）,与CD206相比较,CD163和Ki-67表现出了更强的相关性（P<0.001）。第二节:与空白组大鼠相比较,BBN膀胱癌模型大鼠肿瘤组织内CD163和CD206的表达明显升高（P<0.05）,CD16和CD86显示出升高的趋势,但无统计学意义。与模型组相比较,BCG组和HPP组的CD163和CD206的表达量均呈现下降趋势,但只在CD163表现出显着性（P<0.05）,CD86和CD16的表达量均表现出来升高的趋势,但未表现出来明显的统计学意义（P>0.05）。模型组BBN膀胱癌大鼠的肿瘤组织中Ki-67的表达量明显高于正常大鼠（P<0.05）,与模型组相比较,BCG和HPP干预后肿瘤组织中Ki-67明显减少（P<0.05）。第三节:HPP在0-100 μg/mL浓度范围内对人单核细胞系THP-1未表现出细胞毒性（P>0.05）;50 ng/mL PMA是THP-1诱导为巨噬细胞的最佳浓度;HPP能诱导THP-1来源的巨噬细胞IL-1 β、IL-6、INOS、TNF-α mRNA的表达升高（P<0.05）、上调细胞表面分子CD86、CD23、CD40、CD16（P<0.05）。HPP活化的巨噬细胞能够抑制人膀胱癌细胞系T24及EJ的细胞活力,并伴有时间依赖性（P<0.05）;抑制人膀胱癌细胞系T24及EJ的克隆形成能力,阻断细胞周期进程,使得细胞周期停滞在G0/G1期,减少肿瘤细胞向S期过度,从而抑制肿瘤增殖（P<0.05）;促进人膀胱癌细胞系T24及EJ细胞凋亡,主要表现为促进晚期凋亡,细胞凋亡时伴有细胞体积的皱缩,并伴有凋亡抑制蛋白Bcl-2水平下降（P<0.05）;抑制人膀胱癌细胞系T24及EJ细胞迁移能力,抑制肿瘤细胞的上皮间质转化相关蛋白N-cadherin、Vimentin,上调E-cadherin的表达。HPP活化的巨噬细胞能够下调人膀胱癌细胞系EJ、T24细胞中通路分子 JAK2-STAT5/NF-κB 的表达（P<0.05）;JAK2 抑制剂 AZD1480 能够抑制 JAK2磷酸化蛋白P-JAK2的表达（P<0.05）、抑制人膀胱癌细胞系T24及EJ的细胞活力,促进细胞凋亡（P<0.05）。第四节:HPP上调细胞因子TNF-α、IL-1 β、IL-23 P40、IL-10及细胞膜受体CD16、CD86、CD23、CD40、CD36 的表达,下调了 CCL2、CCL24 及 CD209、CD301、SIRPα 的表达,对于 TGF-β、IL-6、CCL22、CCL17、CCL18、CXCL9、CD163、CD206 无明显影响;肿瘤细胞上清能够上调巨噬细胞中细胞因子TGF-β、IL-6、IL-10、CCL2、IL-1 β、CCL18、CCL22、CCL24 及细胞膜表面受体 SIRP α、CD36、CD16、CD86、CD209、CD163、CD23 的表达,下调 TNF-α 表达,对于 IL-23、CXCL9、CCL17、CD40、CD206、CD301的表达无明显影响。结论:1、膀胱癌患者肿瘤微环境中M2亚型巨噬细胞的浸润程度与肿瘤的肌层浸润程度、病理分级及恶性程度有关。2、HPP能够下调膀胱癌大鼠肿瘤微环境中M2亚型巨噬细胞的表达,上调M1亚型巨噬细胞的表达,促进肿瘤微环境中M2亚型巨噬细胞向M1亚型极化,并抑制肿瘤细胞的增殖。3、均一猪苓多糖活化的巨噬细胞能够抑制人膀胱癌细胞系T24、EJ的细胞活力及增殖能力,阻断细胞周期,促进细胞凋亡,抑制细胞迁移能力及上皮间质转化,HPP活化的巨噬细胞发挥抗肿瘤作用是通过JAK2-STAT5/NF-κB通路实现的。4、均一猪苓多糖活化的巨噬细胞通过分泌炎症因子杀伤肿瘤细胞,并通过减轻肿瘤微环境中的免疫抑制来发挥抗膀胱癌作用;肿瘤细胞通过诱导TAMs分泌炎症抑制因子及免疫抑制分子诱导免疫系统的失活,从而促进肿瘤的进展。
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 第一节 Hedgehog信号通路研究综述 |
| 一、Hedgehog信号通路传导途径 |
| 二、初级纤毛与Hedgehog信号传导 |
| 三、Hedgehog信号通路与肿瘤发生 |
| 四、Hedgehog通路抑制剂 |
| 第二节 髓母细胞瘤研究综述 |
| 一、髓母细胞瘤流行病学概况 |
| 二、髓母细胞瘤的分子分型 |
| 三、髓母细胞瘤靶向治疗瓶颈 |
| 第三节 中医药治疗脑肿瘤研究综述 |
| 一、脑肿瘤的病因病机 |
| 二、中医药治疗脑肿瘤研究进展 |
| 三、“辛味通络”法治疗脑肿瘤 |
| 第四节 中医药靶向Hh通路研究综述 |
| 一、中医药抑制Hh通路研究进展 |
| 二、土荆皮乙酸抗肿瘤研究进展 |
| 第二章 实验研究 |
| 第一节 实验材料 |
| 一、实验仪器 |
| 二、实验试剂 |
| 三、细胞系 |
| 第二节 实验方法 |
| 一、药物配制 |
| 二、小鼠原代神经元的提取 |
| 三、细胞系培养 |
| 四、原代MB细胞肿瘤球培养 |
| 五、细胞活力检测 |
| 六、克隆形成实验 |
| 七、总蛋白提取 |
| 八、免疫印迹法(Western blotting) |
| 九、流式细胞术 |
| 十、EdU细胞增殖检测 |
| 十一、小分子干扰RNA (siRNA)敲低SMO |
| 十二、GLI-荧光素酶报告基因活性测定 |
| 十三、总RNA提取 |
| 十四、cDNA合成 |
| 十五、荧光定量RT-PCR(qRT-PCR) |
| 十六、分子对接 |
| 十七、质粒载体构建 |
| 十八、慢病毒包装及转染 |
| 十九、细胞热转变分析(Cellular thermal shift assay,CETSA) |
| 二十、BODIPY-cyclopamine竞争结合实验 |
| 二十一、纤毛形成及SMO纤毛定位实验 |
| 二十二、小鼠基因鉴定 |
| 二十三、MB异位移植瘤造模 |
| 二十四、免疫组织化学法 |
| 二十五、免疫荧光 |
| 二十六、H&E染色 |
| 二十七、统计分析 |
| 第三节 实验结果 |
| 一、抗MB细胞生长药物筛选 |
| 二、PAB抑制由Hh信号通路驱动的MB细胞增殖 |
| 三、PAB抑制MB细胞中Hh信号通路活性 |
| 四、PAB直接靶向结合SMO |
| 五、PAB抑制纤毛形成 |
| 六、PAB逆转由SMO突变引起的耐药 |
| 七、PAB在体内抑制Hh信号通路驱动的MB生长 |
| 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校期间发表论文情况 |
| 致谢 |
| 附件 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 第一节 椎间盘的结构与功能 |
| 一、椎间盘的解剖结构 |
| 二、椎间盘的功能特点 |
| 三、椎间盘的营养代谢 |
| 四、椎间盘的生物力学特点 |
| 第二节 椎间盘退变的现代研究进展 |
| 一、椎间盘退变的流行病学 |
| 二、椎间盘退变的机制 |
| 三、椎间盘退变的现代治疗 |
| 四、结语与展望 |
| 第三节 miRNA与椎间盘退变 |
| 一、miRNA概述 |
| 二、miRNA与椎间盘退变 |
| 三、miR-155的生物功能 |
| 四、结语与展望 |
| 第四节 中医对椎间盘退变的认识 |
| 一、中医对椎间盘退变病因病机的认识 |
| 二、中医药治疗椎间盘退变 |
| 三、补肾壮督方与椎间盘退变 |
| 四、结语与展望 |
| 第二章 miR-155-5p在大鼠椎间盘退变中髓核组织的表达情况 |
| 第一节 实验材料 |
| 第二节 实验方法 |
| 一、实验分组 |
| 二、动物造模 |
| 三、采集标本 |
| 四、观察指标检测 |
| 第三节 实验结果 |
| 第四节 讨论 |
| 第三章 miR-155-5p对髓核细胞凋亡的作用机制 |
| 第一节 实验材料 |
| 一、细胞 |
| 二、主要试剂与耗材 |
| 三、主要仪器与设备 |
| 第二节 实验方法 |
| 一、miR-155-5p与Apaf1靶向关系生物信息学预测 |
| 二、细胞实验分组及干预 |
| 三、观察指标检测 |
| 第三节 实验结果 |
| 第四节 讨论 |
| 第四章 补肾壮督方含药血清对髓核细胞线粒体凋亡通路及miR-155-5p的影响 |
| 第一节 实验材料 |
| 一、实验动物 |
| 二、实验用药 |
| 三、主要试剂与耗材 |
| 四、主要仪器与设备 |
| 五、细胞 |
| 第二节 实验方法 |
| 一、制备含药血清 |
| 二、细胞分组干预 |
| 三、观察指标检测 |
| 第三节 实验结果 |
| 第四节 讨论 |
| 第五章 补肾壮督方对大鼠退变髓核组织线粒体凋亡通路及miR-155-5p的影响 |
| 第一节 实验材料 |
| 第二节 实验方法 |
| 一、实验分组 |
| 二、动物造模 |
| 三、中药制备 |
| 四、采集标本 |
| 五、观察指标检测 |
| 第三节 实验结果 |
| 第四节 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校期间发表论文情况 |
| 致谢 |
| 统计学审核证明 |
| 详细摘要 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献概述 |
| 第一节 血脂异常的中医概述 |
| 一、血脂异常的中医病名 |
| 二、血脂异常的中医病因病机 |
| 三、血脂异常的中医证候分布规律 |
| 四、血脂异常的中医治疗 |
| 第二节 血脂异常的西医治疗 |
| 一、生活方式干预 |
| 二、药物治疗 |
| 第三节 茯苓、泽泻单药及对药研究进展 |
| 一、茯苓研究进展 |
| 二、泽泻研究进展 |
| 三、对药“茯苓-泽泻”研究进展 |
| 第四节 AMPK信号通路与脂代谢关系 |
| 第五节 肠道菌群与血脂异常的关系 |
| 一、肠道菌群对宿主脂代谢的影响 |
| 二、肠道菌群与血脂异常的联系机制 |
| 第六节 中医药与肠道菌群的关系 |
| 一、中医“脾胃”与肠道菌群相关性 |
| 二、中药调控肠道菌群改善血脂异常 |
| 第七节 导师团队前期研究基础 |
| 第二章 研究方案 |
| 一、研究目的 |
| 二、研究假说 |
| 三、研究内容 |
| 四、技术路线 |
| 第三章 实验研究 |
| 第一节 对药“茯苓-泽泻”化学成分的定性分析及网络药理学研究 |
| 一、实验材料及设备 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、小结 |
| 第二节 血脂异常痰浊证病证结合动物模型建立与评价 |
| 一、实验材料与仪器 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、小结 |
| 第三节 对药“茯苓-泽泻”对血脂异常痰浊证大鼠的降脂疗效 |
| 一、实验材料与设备 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、小结 |
| 第四节 对药“茯苓-泽泻”对血脂异常痰浊证大鼠AMPK通路的影响 |
| 一、实验材料与设备 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、小结 |
| 第五节 对药“茯苓-泽泻”对血脂异常痰浊证大鼠肠道菌群的影响 |
| 一、实验材料与设备 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、小结 |
| 第四章 讨论 |
| 一、基于中医之“脾”探讨血脂异常痰浊证与AMPK通路及肠道菌群的相关性 |
| 二、对药“茯苓-泽泻”降脂的药效学物质基础及潜在分子机制研究 |
| 三、血脂异常痰浊证病证结合大鼠模型的建立与评价研究 |
| 四、对药“茯苓-泽泻”的降脂疗效研究 |
| 五、对药“茯苓-泽泻”干预血脂异常痰浊证大鼠AMPK通路研究 |
| 六、对药“茯苓-泽泻”调节血脂异常痰浊证大鼠肠菌稳态研究 |
| 七、AMPK信号通路、肠道菌群与血脂异常的相互关系 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校期间发表论文情况、参与课题与获奖情况 |
| 致谢 |
| 附件 |
| 中文详细摘要 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 1.1 中医药相关研究 |
| 1.1.1 祖国医学关于便秘的研究 |
| 1.1.2 祖国医学在肠道微生态方面的进展 |
| 1.1.3 畅幽悠的来源以及符林春教授的学术思想 |
| 1.2 西医学相关研究 |
| 1.2.1 功能性便秘概述 |
| 1.2.2 功能性便秘诊断 |
| 1.2.3 功能性便秘形成原因与机制 |
| 1.2.4 便秘的防治 |
| 1.3 功能性便秘动物模型的相关研究 |
| 1.3.1 功能性便秘动物模型效果评价 |
| 1.3.2 功能性便秘动物模型造模方法 |
| 第二章 畅幽悠治疗功能性便秘的实验研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验药品 |
| 2.1.2 实验动物 |
| 2.1.3 主要试剂耗材 |
| 2.1.4 主要仪器设备 |
| 2.1.5 主要实验试剂的配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 动物分组 |
| 2.2.2 模型的建立 |
| 2.2.3 造模评价方法 |
| 2.2.4 给药方案 |
| 2.2.5 一般情况记录 |
| 2.2.6 样本采集及处理 |
| 2.2.7 提取RNA |
| 2.2.8 mRNA逆转录成cDNA |
| 2.2.9 实时定量PCR(RT-PCR) |
| 2.2.10 Western Blot检测 |
| 2.2.11 病理检测 |
| 2.2.12 免疫组化 |
| 2.2.13 粪便菌群16SrDNA测序分析 |
| 2.2.14 ELISA |
| 2.2.15 短链脂肪酸检测 |
| 2.2.16 统计学方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 一般情况比较 |
| 2.3.2 粪便含水率比较 |
| 2.3.3 墨汁推进试验时间比较 |
| 2.3.4 血清激素ELISA检测 |
| 2.3.5 粪便16SrDNA检测 |
| 2.3.6 粪便短链脂肪酸(SCFA)含量检测 |
| 2.3.7 结肠组织PCR检测 |
| 2.3.8 结肠组织蛋白印迹 |
| 2.3.9 结肠水通道蛋白免疫组化 |
| 2.3.10 结肠组织病理 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 畅幽悠的成分、组方及用量依据 |
| 2.4.2 功能性便秘大鼠模型的造模及评估 |
| 2.4.3 畅幽悠增加粪便含水率机理的探索 |
| 2.4.4 畅幽悠促进肠蠕动机理的探索 |
| 2.4.5 畅幽悠对肠道菌门及物种多样性的影响 |
| 2.5 小结 |
| 2.6 创新点 |
| 2.7 不足与展望 |
| 第三章 畅幽悠治疗功能性便秘的临床研究 |
| 3.1 研究对象 |
| 3.1.1 病例来源 |
| 3.1.2 诊断标准 |
| 3.1.3 纳入标准 |
| 3.1.4排除标准 |
| 3.1.5 剔除或脱落标准 |
| 3.2 研究方法 |
| 3.2.1 病例分组 |
| 3.2.2 干预方案 |
| 3.2.3 观察项目 |
| 3.2.4 不良反应及处理 |
| 3.2.5 疗效评定 |
| 3.2.6 大便16SrDNA检测 |
| 3.2.7 统计方法 |
| 3.3 研究结果 |
| 3.3.1 失访、脱落情况 |
| 3.3.2 治疗前后疗效指标比较 |
| 3.3.3 患者治疗前后大便16SrDNA检测 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 实验用药药量及依据 |
| 3.4.2 治疗前后患者便秘及伴随症状的变化 |
| 3.4.3 治疗前后患者大便16SrDNA检测的变化 |
| 3.5 小结 |
| 3.6 创新点 |
| 3.7 不足与展望 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校期间发表论文情况 |
| 致谢 |
| 统计学审核证明 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一部分 文献研究 |
| 第一节 盐敏感性高血压的现代研究进展 |
| 一. 盐敏感性高血压定义 |
| 二. 盐敏感性高血压的严重性 |
| 三. 盐敏感性高血压的发病机制 |
| 四. 盐敏感性的判定方法及临床特点 |
| 第二节 中医对盐敏感性高血压的认识 |
| 一. 中医古籍对高血压的认识 |
| 二. 中医对盐敏感性高血压的认识 |
| 三. 盐敏感性高血压与脏腑之间的关系 |
| 第三节 丹参酮ⅡA的相关研究进展 |
| 一. 丹参酮ⅡA来源 |
| 二. 丹参酮ⅡA临床研究 |
| 三. 丹参酮ⅡA基础研究 |
| 第四节 血压的调节因素 |
| 一. 交感神经系统活性 |
| 二. PVN与血压调节 |
| 三. 炎症反应与血压调节 |
| 四. 氧化应激与血压调节 |
| 第五节 盐敏感性高血压动物模型现代研究进展 |
| 一. DOCA-salt模型 |
| 二. 感觉损伤性盐敏感性高血压大鼠 |
| 三. Dah1盐敏感性高血压大鼠 |
| 四. 部分肾切除盐敏感性高血压动物模型 |
| 五. DOCA-salt高血压动物模型的研究进展 |
| 第二部分 实验研究 |
| 第一节 中枢给予TNF-α对大鼠PVN神经元炎症介质表达的影响 |
| 一. 实验材料 |
| 二. 实验方法 |
| 三. 实验结果 |
| 四. 讨论 |
| 五. 结论 |
| 第二节 丹参酮IIA对原代神经细胞的保护作用 |
| 一. 实验材料 |
| 二. 实验方法 |
| 三. 实验结果 |
| 四. 讨论 |
| 五. 结论 |
| 第三节 丹参酮ⅡA对DOCA-salt大鼠的保护作用 |
| 一. 实验材料 |
| 二. 实验方法 |
| 三. 实验结果 |
| 四. 讨论 |
| 五. 结论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校发表论文情况 |
| 致谢 |
| 附件 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 1.1 现代医学对慢性肾脏病的研究 |
| 1.1.1 慢性肾脏病的定义与分析 |
| 1.1.2 慢性肾脏病的流行病学 |
| 1.1.3 慢性肾脏病的病因及其病理机制 |
| 1.1.4 慢性肾脏病的治疗 |
| 1.2 中医对慢性肾脏病的研究 |
| 1.2.1 中医学对慢性肾脏病的记载 |
| 1.2.2 中医学对慢性肾脏病的认识 |
| 1.2.3 中医学对慢性肾脏病的治疗 |
| 1.3 慢性肾脏病与肠道微生态 |
| 1.3.1 肠道微生态的生理作用 |
| 1.3.2 肠道微生态与疾病的关系 |
| 1.3.3 肠道微生态与慢性肾脏病 |
| 1.3.4 调节肠道菌群在CKD治疗中的应用 |
| 1.4 AHR与慢性肾脏病 |
| 1.4.1 AhR及其配体 |
| 1.4.2 AhR配体 |
| 1.4.3 激活的AhR加重了肾脏损害 |
| 1.4.4 AhR激活介导CKD患者的各种并发症 |
| 第二章 基于肠道菌群探讨补脾益肾方改善5/6肾切除大鼠肠道屏障延缓肾功能进展的作用机制 |
| 2.1 实验目的 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验动物 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.2.3 实验试剂与耗材 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 药物与试剂 |
| 2.3.2 分组、造模及药物干预 |
| 2.3.3 标本采集 |
| 2.3.4 生化检测 |
| 2.3.5 肾脏及肠道病理损伤的检测 |
| 2.3.6 ELISA检测血清IL-1β、IL-6的水平 |
| 2.3.7 Western-blot评估肠道屏障功能 |
| 2.3.8 肠道菌群分析 |
| 2.3.9 统计学方法 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 补脾益肾方有助于降低蛋白尿及改善肾功能 |
| 2.4.2 补脾益肾方有助于改善肾脏病理损伤 |
| 2.4.3 补脾益肾方有助于降低炎症因子 |
| 2.4.4 补脾益肾方有助于修复肠道屏障 |
| 2.4.5 补脾益肾方有助于调整CKD大鼠的肠道菌群 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 基于非靶向代谢组学探讨补脾益肾方延缓5/6肾切除大鼠肾功能进展的作用机制 |
| 3.1 研究目的 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 实验动物 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.2.3 实验试剂与耗材 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 代谢物提取 |
| 3.3.2 LC-MS/MS分析 |
| 3.3.5 数据预处理和质控 |
| 3.3.6 化合物检测结果和注释 |
| 3.3.7 统计分析及差异代谢物的筛选 |
| 3.3.8 差异代谢物分析 |
| 3.3.9 Western-blot检测肾脏组织AhR信号通路分子的表达情况 |
| 3.3.10 统计学方法 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 数据的质控 |
| 3.4.2 代谢物的检测与鉴定情况 |
| 3.4.3 差异代谢物的筛选和分析 |
| 3.4.4 色氨酸代谢 |
| 3.4.5 肾脏组织AhR信号分子表达情况 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 基于AhR通路探讨补脾益肾方发挥肾保护作用的机制研究 |
| 4.1 实验目的 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 实验细胞 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.2.3 实验试剂与耗材 |
| 4.2.4 主要试剂的配制 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 细胞培养 |
| 4.3.2 倒置显微镜下观察观察不同浓度的ASIV对IS诱导损伤的HK-2细胞的影响。 |
| 4.3.3 流式细胞仪检测细胞凋亡 |
| 4.3.4 ROS试剂盒检测不同浓度的ASIV对IS诱导损伤的HK-2细胞内ROS的影响 |
| 4.3.5 观察ASIV对IS诱导损伤的HK-2细胞线粒体膜电位的影响 |
| 4.3.6 免疫荧光法检测HK-2细胞的AhR表达水平 |
| 4.3.7 Western-blot检测HK-2细胞的AhR表达水平 |
| 4.3.8 分子对接 |
| 4.3.9 敲减AhR基因以明确AhR在IS诱导HK-2细胞损伤的介导作用 |
| 4.3.10 统计学方法 |
| 4.4 结果 |
| 4.4.1 细胞形态 |
| 4.4.2 细胞凋亡结果 |
| 4.4.3 R0S |
| 4.4.4 线粒体膜电位结果 |
| 4.4.5 免疫荧光和WB检测AhR表达的结果 |
| 4.4.6 分子对接结果 |
| 4.4.7 AhR基因沉默以明确AhR在IS诱导HK-2细胞损伤的介导作用 |
| 4.5 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校期间发表论文情况 |
| 致谢 |
| 附件 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 1.1 环磷酰胺诱导心脏毒性的分子机制 |
| 1.2 补肾健脾方对肿瘤化疗增效减毒的实验和临床研究进展 |
| 第二章 艾可清对环磷酰胺中毒小鼠毒副反应的影响 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 药品及试剂 |
| 1.1.3 实验仪器 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 动物分组及处理 |
| 1.2.2 生存曲线分析 |
| 1.2.3 血常规检测 |
| 1.2.4 生化指标检测 |
| 1.2.5 HE染色 |
| 1.2.6 统计学分析 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.3.1 实验动物的一般状况 |
| 1.3.2 生存曲线分析 |
| 1.3.3 AKQ对CTX染毒小鼠血常规的影响 |
| 1.3.4 AKQ对CTX染毒小鼠主要脏器生化指标的影响 |
| 1.3.5 主要脏器HE染色 |
| 1.4 讨论 |
| 第三章 艾可清对环磷酰胺中毒小鼠心脏毒性的影响 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 药品及试剂 |
| 2.1.3 主要耗材 |
| 2.1.4 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 动物分组及处理 |
| 2.2.2 心脏指数计算 |
| 2.2.3 血清心肌酶及氧化指标测定 |
| 2.2.4 心脏组织HE染色 |
| 2.2.5 心肌凋亡相关蛋白免疫印迹 |
| 2.2.6 统计学分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 AKQ对CTX中毒小鼠心脏指数的影响 |
| 2.3.2 AKQ对CTX中毒小鼠心肌酶及氧化指标的影响 |
| 2.3.3 AKQ对CTX中毒小鼠心脏组织病理改变的影响 |
| 2.3.4 AKQ对CTX染毒小鼠心肌凋亡相关蛋白的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 第四章 艾可清对丙烯醛所致心肌细胞损伤的影响及机制探讨 |
| 3.1 药物制备及作用剂量的确定 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.1.3 实验结果 |
| 3.2 AKQ对ACR所致H9C2损伤的影响 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.2.3 实验结果 |
| 3.3 AKQ缓解CTX心脏毒性的网络药理学分析 |
| 3.3.1 材料与方法 |
| 3.3.2 实验结果 |
| 3.4 AKQ缓解ACR心肌细胞毒性的通路靶点验证 |
| 3.4.1 实验材料 |
| 3.4.2 实验方法 |
| 3.4.3 实验结果 |
| 3.5 讨论 |
| 第五章 艾可清对荷瘤小鼠CTX心脏毒性的影响及机制探讨 |
| 4.1 AKQ对荷瘤小鼠CTX心脏毒性的影响 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验方法 |
| 4.1.3 实验结果 |
| 4.2 AKQ对荷瘤小鼠CTX心脏毒性影响的血清代谢组学研究 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.2.3 实验结果 |
| 4.3 AKQ对肉瘤小鼠CTX心脏毒性影响的肠道菌群分析 |
| 4.3.1 实验材料 |
| 4.3.2 实验方法 |
| 4.3.3 实验结果 |
| 4.4 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校期间发表的论文 |
| 致谢 |
| 附件 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 星蒌承气汤药效物质基础及对缺血性卒中神经保护机制研究进展 |
| 1 大黄 |
| 1.1 中医认识 |
| 1.2 化学成分及神经保护作用 |
| 2 胆南星 |
| 2.1 中医认识 |
| 2.2 化学成分及神经保护作用 |
| 3 瓜蒌 |
| 3.1 中医认识 |
| 3.2 化学成分及神经保护作用 |
| 4 羌活 |
| 4.1 中医认识 |
| 4.2 化学成分及神经保护作用 |
| 5 芒硝 |
| 参考文献 |
| 第二章 基于肠道微生态理论的缺血性卒中病因与发病机制研究进展 |
| 1 肠道微生态与肠道微生态失调 |
| 2 菌-肠-脑轴 |
| 3 从肠到脑的上行通路 |
| 4 从脑到肠的下行通路 |
| 5 脑卒中相关危险因素与肠道菌群 |
| 6 卒中并发症的肠道微生态机制 |
| 7 结论 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第二部分 基于网络药理学与分子对接的星蒌承气汤治疗缺血性卒中的机制研究 |
| 1 研究资料 |
| 2 研究方法 |
| 2.1 星蒌承气汤化学活性成分的检索与筛选 |
| 2.2 星蒌承气汤化学成分及缺血性卒中靶点筛选 |
| 2.3 交集基因蛋白互作网络(PPI)分析 |
| 2.4 基因本体论(Gene ontology,GO)功能富集和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析 |
| 2.5 可视化网络构建与分析 |
| 2.6 分子对接 |
| 3 研究结果 |
| 3.1 星蒌承气汤潜在化学活性成分的检索与筛选结果 |
| 3.2 星蒌承气汤活性成分靶点及缺血性卒中靶点预测结果 |
| 3.3 GO富集分析及KEGG代谢通路富集分析结果 |
| 3.4 可视化网络构建与分析 |
| 3.5 分子对接 |
| 4 讨论 |
| 4.1 网络药理学在中医药现代化研究中的应用 |
| 4.2 基于网络药理学方法探讨星蒌承气汤活性成分 |
| 4.3 基于网络药理学方法探讨星蒌承气汤效应机制 |
| 5 小结 |
| 第三部分 实验研究 |
| 实验一 星蒌承气汤对中风急性期痰热腑实证小鼠神经保护作用及网络药理学关键靶点及通路实验验证 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验对象 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验仪器设备与耗材 |
| 1.4 实验药物的配置 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 分组与给药 |
| 2.2 模型制备 |
| 2.3 神经功能评分 |
| 2.4 除胶实验 |
| 2.5 TTC染色 |
| 2.6 取材及处理 |
| 2.7 TUNEL法检测皮层梗死周围细胞凋亡情况 |
| 2.8 脑组织ELISA |
| 2.9 脑组织Western blot |
| 2.10 统计分析 |
| 3 研究结果 |
| 3.1 神经功能评分 |
| 3.2 除胶实验 |
| 3.3 脑梗死体积评价 |
| 3.4 对缺血侧脑组织细胞凋亡的影响 |
| 3.5 星蒌承气汤对缺血侧脑组织TNF-α的影响 |
| 3.6 星蒌承气汤对缺血侧脑组织AKT、p-AKt、PI3K及NF-κB蛋白表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 星萎承气汤是治疗中风病急性期痰热腑实证的具有确切临床疗效的代表方剂 |
| 4.2 化痰通腑法代表方星蒌承气汤脑保护作用及中医理论探讨 |
| 4.3 卒中模型神经功能评分探讨 |
| 4.4 卒中模型行为学选择 |
| 4.5 星蒌承气汤与细胞凋亡 |
| 4.6 网络药理学关键靼点及通路实验验证 |
| 5 小结 |
| 实验二 星蒌承气汤对中风急性期痰热腑实证小鼠菌-肠-脑轴影响 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验对象 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验仪器设备与耗材 |
| 1.4 实验药物的配置 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 分组与给药 |
| 2.2 模型制备 |
| 2.3 取材及处理 |
| 2.4 免疫组化 |
| 2.5 免疫荧光 |
| 2.6 ELISA检测 |
| 2.8 肠道菌群分析 |
| 2.9 盲肠内容物短链脂肪酸(SCFAs)检测 |
| 2.10 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 星蒌承气汤对中风痰热腑实证小鼠肠道菌群的影响 |
| 3.2 星蒌承气汤对中风痰热腑实证小鼠肠道菌群代谢产物短链脂肪酸及短链脂肪酸受体的影响 |
| 3.3 星蒌承气对菌-肠-脑轴神经-内分泌-免疫途径相关指标影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 基于脑肠互动理论探讨化痰通腑法治疗中风病的理论基础 |
| 4.2 星蒌承气汤对短链脂肪酸影响 |
| 4.3 星萎承气汤对菌-肠-脑轴自主神经途径影响 |
| 4.4 星蒌承气汤对菌-肠-脑轴神经内分泌途径影响 |
| 4.5 星萎承气汤对菌-肠-脑轴免疫途径影响 |
| 5 小结 |
| 实验三 星萎承气汤对中风急性期痰热腑实证伪无菌小鼠菌-肠-脑轴影响 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验对象 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验仪器设备与耗材 |
| 1.4 实验药物的配置 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 分组与给药 |
| 2.2 模型制备 |
| 2.3 神经功能评分 |
| 2.4 除胶实验 |
| 2.5 TTC染色 |
| 2.6 取材及处理 |
| 2.7 免疫组化、免疫荧光 |
| 2.8 ELISA检测 |
| 2.9 肠道菌群分析 |
| 2.10 盲肠内容物SCFAs分析 |
| 2.11 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 神经功能评分 |
| 3.2 除胶实验 |
| 3.3 脑梗死体积评价 |
| 3.4 肠道菌群 |
| 3.5 短链脂肪酸 |
| 3.6 星蒌承气汤对伪无菌小鼠菌-肠-脑轴神经-内分泌-免疫途径相关指标影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 伪无菌模型建立及评价 |
| 4.2 肠道菌群是星蒌承气汤发挥作用的重要靶点 |
| 4.3 星蒌承气汤治疗急性期缺血性卒中机制的初步探讨 |
| 5 小结 |
| 结语 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 第一节 胃“炎—癌”转化的机制及研究现状 |
| 一、胃“炎—癌”转化在胃癌进展中发挥重要作用 |
| 二、胃“炎—癌”转化中西医治疗现状 |
| 第二节 NF-κB信号通路与胃“炎—癌”转化及细胞增殖迁移 |
| 一、NF-κB家族及其信号通路 |
| 二、NF-κB信号通路与炎症发生的关系 |
| 三、NF-κB信号通路与肿瘤的发生的关系 |
| 第三节 肿瘤转移与上皮—间质转化 |
| 一、TGF-β/Smads信号通路介导的上皮-间质转化 |
| 二、EMT基因与分子标志物 |
| 第四节 基于胃“炎-癌”转化病理组织学进程的中医精准防治规律研究 |
| 一、中医药以健脾益胃法为主靶向胃黏膜萎缩阶段 |
| 二、中医药以健脾益胃化瘀法为主靶向胃黏膜萎缩伴IM阶段 |
| 三、中医药以健脾化瘀解毒法为主靶向胃黏膜萎缩伴LGIN阶段 |
| 第五节 健脾化瘀解毒法靶向胃“炎—癌”转化关键关节发挥作用 |
| 一、健脾化瘀解毒法靶向“炎-癌”转化环节改善GPL病理组织结构 |
| 二、健脾化瘀解毒法通过有氧糖酵解及自噬凋亡等途径逆转胃“炎-癌”转化 |
| 三、健脾化瘀解毒法通过抑制NF-κB信号通路控制甚至逆转胃“炎-癌”转化 |
| 四、健脾化瘀解毒方是临床治疗胃癌前病变的有效方剂 |
| 第二章 实验研究 |
| 第一节 胃痞消体外抑制GPL模型细胞和胃癌SGC7901上皮-间质转化研究 |
| 一、实验材料与试剂 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 第二节 健脾化瘀解毒方中有效活性成分的分析 |
| 一、实验材料与试剂 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 第三节 健脾化瘀解毒方对胃“炎—癌”转化小鼠病理模型的的干预效应 |
| 一、实验材料与试剂 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 第四节 健脾化瘀解毒方通过抑制NF-κB信号通路逆转胃“炎—癌”转化 |
| 一、实验材料与试剂 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 第五节 健脾化瘀解毒方通过NF-κB信号通路抑制胃癌前病变细胞的早期迁移 |
| 一、实验材料与试剂 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校期间发表论文情况、参与课题与获奖情况 |
| 致谢 |
| 附件 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 第一节 膀胱癌免疫治疗的研究进展 |
| 一、卡介苗的研究进展 |
| 二、免疫检查点抑制剂 |
| 三、小结 |
| 第二节 巨噬细胞作为膀胱癌治疗靶点的研究进展 |
| 一、巨噬细胞的研究进展 |
| 二、巨噬细胞在肿瘤免疫中的作用 |
| 三、肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)对膀胱癌的作用 |
| 四、巨噬细胞作为治疗靶点的抗膀胱癌研究 |
| 五、小结 |
| 第三节 中药多糖免疫调节作用的研究进展 |
| 一、中药多糖的开发与中医理论的渊源 |
| 二、中药多糖的免疫调节作用 |
| 三、中药多糖的免疫调节功能在疾病中的研究进展 |
| 四、小结 |
| 第二章 实验研究 |
| 第一节 膀胱癌组织中M2亚型巨噬细胞浸润程度与膀胱癌恶性程度的关系 |
| 一、材料与方法 |
| 二、统计学分析 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 第二节 均一猪苓多糖对BBN模型膀胱癌大鼠肿瘤微环境中巨噬细胞的影响 |
| 一、材料与方法 |
| 二、统计学分析 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 第三节 均一猪苓多糖活化的巨噬细胞对膀胱癌细胞的直接作用研究 |
| 一、THP-1来源巨噬细胞模型的建立及HPP对巨噬细胞的极化作用 |
| 二、HPP活化的巨噬细胞对于人膀胱癌细胞的直接作用及分子机制研究 |
| 三、讨论 |
| 四、小结 |
| 第四节 基于亚型分析对HPP活化的巨噬细胞及肿瘤相关巨噬细胞的探讨 |
| 一、材料与方法 |
| 二、统计学分析 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校期间发表论文情况、参与课题与获奖情况 |
| 致谢 |
| 附件 |
